From the Chromosomal Loops From the Chromosomal Loops and the Scaffold to the Classic and the Scaffold to the Classic

Bands of Metaphase Bands of Metaphase ChromosomesChromosomes

Y. Saitoh & U. K. LaemmliY. Saitoh & U. K. Laemmli

Cold Spring Harbor Symposia on Quantititive BiologyCold Spring Harbor Symposia on Quantititive BiologyVol 83, 1993Vol 83, 1993

LoopsLoops da Cromatina da Cromatina

O estudo da estrutura dos cromossomos:O estudo da estrutura dos cromossomos:

Microscopia ótica: muito grosseiraMicroscopia ótica: muito grosseira Microscopia eletrônica: muito detalhadaMicroscopia eletrônica: muito detalhada Métodos bioquímicos: interferências destrutivasMétodos bioquímicos: interferências destrutivas

Em seu estado original, os cromossomos Em seu estado original, os cromossomos aparentam ser apenas estruturas cilíndricas, aparentam ser apenas estruturas cilíndricas, preenchidos homogeneamente com fibras preenchidos homogeneamente com fibras nucleoprotéicas.nucleoprotéicas.

Microscopia ÓticaMicroscopia Ótica Microscopia EletrônicaMicroscopia Eletrônica

LoopsLoops da Cromatina da Cromatina

A noção de que ocorrem A noção de que ocorrem loopsloops na na cromatina a cada 100 Kb em média, é cromatina a cada 100 Kb em média, é bastante sólida.bastante sólida.

Esta organização foi descoberta em Esta organização foi descoberta em cromossomos metafásicos sem proteínas e cromossomos metafásicos sem proteínas e histonas, que foram removidas com histonas, que foram removidas com poliânions de sulfato de dextran e poliânions de sulfato de dextran e heparina; com intuito de desenovela-los.heparina; com intuito de desenovela-los.

LoopsLoops da Cromatina da Cromatina

Os princípios da organização em Os princípios da organização em loopsloops foram foram comprovados com técnicas de:comprovados com técnicas de:

Seções cromossômicas finasSeções cromossômicas finas Espalhamento dos cromossomosEspalhamento dos cromossomos Imunoflorescência com anticorpos contra Imunoflorescência com anticorpos contra

Topoisomerase IITopoisomerase II

LoopsLoops da Cromatina da Cromatina

Em cromossomos distendidos por exposição a Em cromossomos distendidos por exposição a baixas concentrações de sal ou pela retirada baixas concentrações de sal ou pela retirada parcial de H1, os parcial de H1, os loopsloops são observados como são observados como halos periféricos, devido a:halos periféricos, devido a:

Distensão das fibras da cromatina Distensão das fibras da cromatina Desespiralização longitudinal das bases que Desespiralização longitudinal das bases que

compõe o compõe o looploop

Proteínas formam uma Proteínas formam uma armação ou armação ou scaffoldscaffold

Alças de DNA são Alças de DNA são ligadas pela baseligadas pela base

SAR = SAR = scaffold scaffold attachment regionattachment region

DNA rico em AT com DNA rico em AT com sítios para Topo IIsítios para Topo II

LoopsLoops da Cromatina da Cromatina

A base dos A base dos loopsloops de cromossomos nativos é de cromossomos nativos é uma região longitudinal e hetrocromática uma região longitudinal e hetrocromática denominada de denominada de scaffoldscaffold..

Com base no modelo Com base no modelo LoopLoop / / Scaffold Scaffold poderiam poderiam ser identificadas proteínas específicas do ser identificadas proteínas específicas do scaffoldscaffold e de regiões associadas a ele, como as e de regiões associadas a ele, como as SARs.SARs.

Topoisomerase II e SARsTopoisomerase II e SARs

A SC1 (A SC1 (Scaffold Scaffold 1) é a principal proteína do 1) é a principal proteína do scaffoldscaffold e foi identificada como uma e foi identificada como uma topoisomerase II. topoisomerase II.

Essa proteína se liga seletivamente as SARs e Essa proteína se liga seletivamente as SARs e está envolvida com o final da condensação está envolvida com o final da condensação cromossômica.cromossômica.

Topoisomerase II e SARsTopoisomerase II e SARs

As SRAs são os possíveis constituintes da base As SRAs são os possíveis constituintes da base dos dos loopsloops da cromatina e são regiões ricas em da cromatina e são regiões ricas em AT (cerca de 65 %).AT (cerca de 65 %).

Proteínas que se ligam seletivamente as SRAs:Proteínas que se ligam seletivamente as SRAs:

Histona H1Histona H1 HMG I Y - High Mobility ProteinHMG I Y - High Mobility Protein ARBDARBD

Bandas CromossômicasBandas Cromossômicas

São variações na estrutura longitudinal das cromátides que são São variações na estrutura longitudinal das cromátides que são reveladas por diferentes técnicas de coloração.reveladas por diferentes técnicas de coloração.

Classicamente os cromossomos parecem ser construídos por Classicamente os cromossomos parecem ser construídos por discos empilhados, e cada disco difere de seu vizinho por:discos empilhados, e cada disco difere de seu vizinho por:

Densidade gênicaDensidade gênica Tempo de replicaçãoTempo de replicação Composição de basesComposição de bases Conteúdo de sequências repetitivasConteúdo de sequências repetitivas Conformação da cromatinaConformação da cromatina

Bandas CromossômicasBandas Cromossômicas

Os principais padrões de bandamento Os principais padrões de bandamento cromossômico são:cromossômico são:

Banda CBanda C - Heterocromatina centromérica, contendo DNA - Heterocromatina centromérica, contendo DNA

satélite e praticamente nenhum gene.satélite e praticamente nenhum gene.

Banda GBanda G - Composta por bandas de hetrocromatina - Composta por bandas de hetrocromatina

facultativa, de replicação tardia e ricas em AT.facultativa, de replicação tardia e ricas em AT.

Banda QBanda Q - Feita com quinacrina, cora também regiões - Feita com quinacrina, cora também regiões

ricas em AT, revelando um padrão semelhante as bandas C.ricas em AT, revelando um padrão semelhante as bandas C.

Esquerda: Padrão de bandamento G de alta resolução em prometáfase do cromossomo 1 do Muntjac. As sub-bandas estão coradas em preto.

Direita: Coloração com Daunonicina do mesmo cromossomo mostrando a relação 1:1 das regiões ricas em AT para as sub-bandas em preto

Bandas CromossômicasBandas Cromossômicas

Apenas 20% dos genes humanos mapeados Apenas 20% dos genes humanos mapeados encontram-se em regiões de banda Q e G; e encontram-se em regiões de banda Q e G; e em sua maioria são em sua maioria são housekeepinghousekeeping..

A heterocromatina facultativa corada pela A heterocromatina facultativa corada pela banda Q é responsável pelo silenciamento de banda Q é responsável pelo silenciamento de genes tecido-específicos.genes tecido-específicos.

Bandas CromossômicasBandas Cromossômicas As bandas R possuem um padrão reverso ao As bandas R possuem um padrão reverso ao

encontrado nas bandas Q e G, coram regiões ricas em encontrado nas bandas Q e G, coram regiões ricas em GC e se replicam na fase S.GC e se replicam na fase S.

A maioria dos genes selvagens expressos estão A maioria dos genes selvagens expressos estão localizados em bandas R.localizados em bandas R.

As bandas G / Q são cerca de 3.2 % mais ricas em AT As bandas G / Q são cerca de 3.2 % mais ricas em AT do que as bandas R. Esta pequena diferença não do que as bandas R. Esta pequena diferença não poderia explicar os padrões de fluorescência com poderia explicar os padrões de fluorescência com Daunomicina. Assim, a única opção seria uma alta Daunomicina. Assim, a única opção seria uma alta organização cromossômica.organização cromossômica.

Tudo é uma questão de Tudo é uma questão de como “ver”...como “ver”...

Durante a corrida não se vêem as equipesDurante a corrida não se vêem as equipes

Última volta - Última volta - SprintadorSprintador da da eeqquuiipepe é conduzido é conduzido

Então, não seria uma questão de Então, não seria uma questão de corar os cromossomos, mas sim corar os cromossomos, mas sim

de ver????de ver????

?

Modelo de Loops/Scaffold de Modelo de Loops/Scaffold de Cromossomos NativosCromossomos Nativos

Este modelo dita que as fibras das cromátides contêm Este modelo dita que as fibras das cromátides contêm uma região central, longitudinal denominada corda uma região central, longitudinal denominada corda AT e dois AT e dois loopsloops diferentes: diferentes:

O O LoopLoop Q, que é menor e possui orientação longitudinal Q, que é menor e possui orientação longitudinal O O LoopLoop R, que é maior e possui orientação radial R, que é maior e possui orientação radial

Na corda AT, um sinal ótico é emitido por corantes Na corda AT, um sinal ótico é emitido por corantes com alta afinidade por AT, pois nesta região estão as com alta afinidade por AT, pois nesta região estão as SARs.SARs.

A coloração com Daunonicina cora de amarelo as regiões ricas em A coloração com Daunonicina cora de amarelo as regiões ricas em AT e a YOYO/MG cora de verde os AT e a YOYO/MG cora de verde os LoopsLoops Q e R. Q e R.

Modelo de Loops/Scaffold de Modelo de Loops/Scaffold de Cromossomos NativosCromossomos Nativos

A construção das bandas R pode ser A construção das bandas R pode ser representada por este modelo como um representada por este modelo como um scaffoldscaffold central circundado por central circundado por loopsloops periféricos. periféricos.

O O scaffoldscaffold seria organizado assim: fortemente seria organizado assim: fortemente espiralizado na região de heterocromatina das espiralizado na região de heterocromatina das bandas Q e longitudinalmente desespiralizado bandas Q e longitudinalmente desespiralizado nas regiões de banda R.nas regiões de banda R.

Bandas Q e RBandas Q e R

As bandas Q se originam da estriação cruzada das As bandas Q se originam da estriação cruzada das cordas AT e podem ser evidenciadas por corantes que cordas AT e podem ser evidenciadas por corantes que se ligam a regiões ricas em AT.se ligam a regiões ricas em AT.

As bandas R ocupam uma posição mais central nas As bandas R ocupam uma posição mais central nas cordas AT.cordas AT.

A complementaridade entre estas bandas é uma A complementaridade entre estas bandas é uma conseqüência direta da estrutura diferenciada das conseqüência direta da estrutura diferenciada das cordas AT.cordas AT.

Bandas Q e RBandas Q e R

A estrutura dos cromossomos metafásicos A estrutura dos cromossomos metafásicos considerada neste modelo combina com a considerada neste modelo combina com a Citogenética clássica e com os estudos bioquímicos.Citogenética clássica e com os estudos bioquímicos.

As bandas Q são muito raras ou ausentes nos As bandas Q são muito raras ou ausentes nos invertebrados, nos vertebrados inferiores, como as invertebrados, nos vertebrados inferiores, como as serpentes e nas plantas. Isto pode ser explicado pela serpentes e nas plantas. Isto pode ser explicado pela ausência de diferenciação no ausência de diferenciação no scaffoldscaffold, culminando , culminando

numa coloração homogênea.numa coloração homogênea.

Detecção da Base dos Detecção da Base dos LoopsLoops Foi detectada utilizando tanto anticorpos contra Foi detectada utilizando tanto anticorpos contra

proteínas do proteínas do scaffoldscaffold, quanto fluorocromos altamente , quanto fluorocromos altamente específicos para AT, como a Daunonicina e o específicos para AT, como a Daunonicina e o Giemsa.Giemsa.

A Dauno cora bandas Q e sabe-se que o DNA precisa A Dauno cora bandas Q e sabe-se que o DNA precisa ser composto por mais de 65 % de AT para que ela ser composto por mais de 65 % de AT para que ela floresça.floresça.

Assim se as SARs estivessem realmente organizadas Assim se as SARs estivessem realmente organizadas no no scaffoldscaffold, um sinal forte seria observado com este , um sinal forte seria observado com este tipo de coloraçãotipo de coloração..

Detecção do Corpo dos Detecção do Corpo dos LoopsLoops

O corante YOYO é um fluorocromo que cora O corante YOYO é um fluorocromo que cora todotodo o o looploop da cromatina. da cromatina.

Para se corar o corpo de Para se corar o corpo de loop,loop, o YOYO é o YOYO é associado a MG, que inibe a emissão das associado a MG, que inibe a emissão das SARs.SARs.

a) Esquema de protocolos de coloração seletiva para a base ou a) Esquema de protocolos de coloração seletiva para a base ou corpo dos loops da cromatinacorpo dos loops da cromatina

b) Simulação da coloração utilizando um líquido opaco no qual foi b) Simulação da coloração utilizando um líquido opaco no qual foi emergida uma molaemergida uma mola.

Complementaridade entre as BandasComplementaridade entre as Bandas

Um cromossomo exposto a YOYO se cora Um cromossomo exposto a YOYO se cora homogeneamente, o que implicaria:homogeneamente, o que implicaria:

Baixa concentração de DNA nas bandas R Baixa concentração de DNA nas bandas R Cromatina mais abertaCromatina mais aberta

Comparando as colorações feitas com Comparando as colorações feitas com YOYO/MG e Dauno, observa-se um padrão YOYO/MG e Dauno, observa-se um padrão complementar nas bandas Rcomplementar nas bandas R

aa) Comparação entre as colorações YOYO, YOYO/MG e Dauno) Comparação entre as colorações YOYO, YOYO/MG e Dauno

b) Confocal mostrando bandas Q e R de telômeros. Nas bandas R positivas para b) Confocal mostrando bandas Q e R de telômeros. Nas bandas R positivas para YOYO/MG observam-se YOYO/MG observam-se puffspuffs nas regiões ricas em AT. nas regiões ricas em AT.

a) O cromossomo 1 do Muntjac é corado em vermelho pela Dauno cromossomo 1 do Muntjac é corado em vermelho pela Dauno (cora cordas AT) e em azul pelo YOYO/MG (cora (cora cordas AT) e em azul pelo YOYO/MG (cora loopsloops Q e R). Q e R).

b) Em maior aumento são mostrados os braços longos dos mesmos b) Em maior aumento são mostrados os braços longos dos mesmos cromossomos. As regiões de cromossomos. As regiões de overlapoverlap se coram de branco. se coram de branco.

Complementaridade nas sub-bandasComplementaridade nas sub-bandas

A complementaridade perfeita entre as bandas A complementaridade perfeita entre as bandas R e Q é conseqüência direta do R e Q é conseqüência direta do foldingfolding diferencial das cordas AT. Este mesmo padrão diferencial das cordas AT. Este mesmo padrão pode ser observado nas sub-bandaspode ser observado nas sub-bandas

Tomando como exemplo um cromossomo Tomando como exemplo um cromossomo visto sob microscopia confocal, a banda Q4 visto sob microscopia confocal, a banda Q4 possui 4 sub-bandas que podem ser observadas possui 4 sub-bandas que podem ser observadas em outras colorações.em outras colorações.

Topo II e SARsTopo II e SARs

Topo II imunolocaliza o Topo II imunolocaliza o scaffoldscaffold de de cromossomos nativos, pois se liga cromossomos nativos, pois se liga especificamente a seqüências SARs através especificamente a seqüências SARs através de ligações cooperativas.de ligações cooperativas.

As SARs também possuem sítios para a As SARs também possuem sítios para a proteína HMG IY, que se liga proteína HMG IY, que se liga preferencialmente a repetições de A.preferencialmente a repetições de A.

Identificação do Identificação do scaffoldscaffold nativo por imunofluorescência. Os cromossomos foram nativo por imunofluorescência. Os cromossomos foram imunocorados com Topo II e Topo II + Dauno. Topo II cora SARs e cordas AT, imunocorados com Topo II e Topo II + Dauno. Topo II cora SARs e cordas AT,

resultando num padrão de bandas Q e revela um sinal mais central nas bandas Rresultando num padrão de bandas Q e revela um sinal mais central nas bandas R ..

O Scaffold de Cromossomos Desespiralizados é Giemsa Positivo