FORMAZIONE DEL PATTERN ASSIALE

GENERAZIONE DI MUTANTI

MUTAGENESI CHIMICA MUTAGENESI PER INSERZIONE

MUTAGENESI CHIMICA può essere condotta direttamente sui semi.

MUTAGENI

chimici

radiazioni

esteri dell’acido etilmetansulfonico (EMS)

caffeina, nicotina

UV, raggi X radiazioni

EMS alchila le G la G alchilata si appaia con T invece che con C

Agenti alchilanti

MUTAGENESI PER INSERZIONE: TRASPOSONI , T-DNA

Vengono utilizzati semi maturi, con gli embrioni completamente sviluppati.

Si trattano i semi con il mutageno

Mutazioni a carico di una cellula producono una linea clonale di cellule mutate, durante il successivo sviluppo post-embrionale con il conseguente sviluppo di piante eterozigoti con settori mutanti. (M1)

Solo se i settori mutati includono lo strato L2 del meristema apicale, da cui sarà generata la linea germinale della pianta matura, la mutazione passerà alla successiva progenie. I fiori mutanti produrranno (autofecondazione) il 25% di semi omozigoti riconoscibili per il loro fenotipo aberrante.

MUTAGENESI CHIMICA DEI SEMI

confronto tra mutagenesi chimica e mutagenesi per inserzione

MEDIANTE LA MUTAGENESI PER INSERZIONE

IL GENE VIENE “ETICHETTATO”

(GENE TAGGING), PERMETTEDONE

UNA IDENTIFICAZIONE PIU AGEVOLE

Strategia di isolamento di mutanti

• Analisi dei mutanti Kan resistenti• Propagazione delle piante

T2Analisi in vitro delle plantuleKan resistenti

Ks

KrRaccolta semi T2

Autoimpollinazione

Selezione in serradei trasformanti T1

Raccolta semi T1Trasformazione con

T-DNA

T0

T-DNAgene x gene x

Identificazione delle sequenze fiancheggianti il DNA inserito

PCR inversa

primers

T-DNA o DS

Digestione con EcoRI

Recupero del plasmide

GENE

EcoRIEcoRI

RB LBOri KanR

T-DNA

EcoRI

RB LBpBR322 KanR

EcoRI

T-DNA

RB LBpBR322 KanR

EcoRI

T-DNA

EcoRI

Su terreno selettivo contenente Kanamicina cresceranno solo le colonie che hanno

acquisito il plasmide

Da queste sarà possibile recuperare il plasmide e sequenziarlo

Ligazione

Trasformazione E. coli

Recupero del plasmide

Mutanti MONOPTEROS (MP)

•La mutazione produce piantine che mancano di ipocotile e radice ma che hanno la regione apicale

•Tuttavia la struttura delle regioni apicali non è normale e i tessuti dei cotiledoni sono disorganizzati

•Embrioni dI mutanti mp non formano il procambio nella parte basale dell’embrione globulare, la regione che dà luogo all’ipocotile e alla radice

I DIFETTI COMPAIONO NELLO STADIO DI OTTANTE

STADI DI SVILUPPO DI MONOPTEROS

I mutanti bodenlos e AXR6 hanno un fenotipo simile a monopteros

Funzione del gene MONOPTEROS

(formazione della radice embrionale)

il meristema radicale (cq, columella)in Arabidopsis origina da una singola cellula: l’ipofisi

L’ipofisi si differenzia a partire da una cellula extraembrionale e ciò richiede l’espressione di due geni: MONOPTEROS (MP) e BODENLOS (BD)

I trascritti di MP e BD si accumulano in cellule del proembrione adiacenti alla cellula extraembrionale che si differenzierà in ipofisi

MP e BD sono dei fattori di trascrizione coinvolti nella risposta all’auxina

MP appartiene alla classe dei fattori di trascrizione ARF (ARF5) regolatori positividella risposta a IAA

BD appartiene alla classe delle proteine IAA (IAA12) regolatori negativi della risposta all’auxina

Destino differenziativodelle due cellule del’embrionebicellulare

cellula basale

cellula apicale

Il meristema apicale della radice ha un’origine mista

Regolazione dell’espressione genica da parte dell’auxina

Geni di risposta primaria (geni precoci):

l’espressione è indotta dalla attivazione di fattori di trascrizione già presenti (non è necessaria sintesi proteica)(oppure dalla inattivazione di inibitori della trascrizione preesistenti)

Tali geni codificano per FATTORI DI TRASCRIZIONE i quali determinano l’espressione dei

Geni di risposta secondaria (geni tardivi)

(Per l’espressione di tali geni e quindi per la risposta è necessaria nuova sintesi proteica)

5 classi principali di geni precoci la cui trascrizione è indotta da IAA

1. Proteine AUX/IAA

2. Proteine SAUR3. Proteine GH3

4. Glutatione S-trasferasi5. ACC sintasi

Le proteine AUX/IAA

auxin response factors: ARFauxin responsive elements: TGTCTC

Regolazione dell’ espressione genica da parte dell’auxina

IAA signaling: regolato dalla via del proteosoma /ubiquitina

Via del proteosoma/ubiquitina

E1 enzima attivante l’ubiquitina

E2 enzima coniugante l’ubiquitina

E3 enzima legante l’ubiquitina

IAA: induce la trascrizione dei geni precoci promuovendo la degradazione di repressori AUX/IAA mediata dal PROTEOSOMA

consentendo la formazione di dimeri ARF attivi

Feedback negativo: tra i geni precoci indotti da IAA ci sono le proteine AUX/IAA

TIR1: proteina F-box (F-box N-terminale/LRR C terminale)

E3: 4 subunità = Cullin1/Cdc53 Skp/ASK1 Rbx1/ROC1/Hrt1 F-box

Mutante TIR-1

In Arabidopsis:

23 ARF

28 AUX IAA

La maggior parte delle AUX IAA funzionano come repressori della trascrizionedi geni indotti da IAA

Identificate 8 mutazioni in AUX IAA che influenzano lo sviluppo embrionale

Sono tutte relative a mutazioni di singoli aacidi nel dominio II di degradazionedelle proteine AUX IAA (proteosoma)

Acquisizione di resistenza alla degradazione tramite la via del Proteosoma

BODENLOS (IAA12): il fenotipo dei mutanti assomiglia ai mutanti mp

Codifica per una forma mutata di proteina AUX/IAA (IAA12) (repressore della risposta all’auxina)

La forma mutata è resistente alla degradazione mediata dal proteosoma eindotta dall’auxina che è necessaria per la risposta differenziativa

I mutanti mp e bdl hanno difetti nel piano di divisione dell’ipofisi sebbene le proteinevengano espresse nelle cellule superiori adiacenti

Meccanismo non-cell autonomous

Cell to cell signaling

Modello per la formazione della radice embrionale:

L’auxina si accumula nella ipofisi prima del suo differenziamento

Questo accumulo richiede la localizzazione polare del carrier di efflusso PIN1 nelle cellule adiacenti del proembrione

L’auxina è il segnale generato dall’interazione MP/BD

PIN1 è espresso nelle stesse cellule in cui vengono espressi MP e BD

TGTCTC GUS (or GFP)

The DR5 reporter construct is widely used to monitor auxin

response-level.

DR5 consists of seven repeats of an auxin-response element

(AuxRE) which is a binding site for auxin-responsive transcription

factors (ARFs).

AuxRE

Hours of staining

Auxin-response level increases with exogenous auxin (NAA)

Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., and Guilfoyle, T.J. (1997). Aux/1AA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell 9: 1963-1971.

Gene reporter

MP e BDL agiscono in maniera non-cell autonomous

AUXINA (segnale primario nelle cellule adiacenti l’ipofisi)

Rilascio di un segnale secondario nell’ipofisi

AUXINA? (trattamenti con 2,4 D di bdl inefficaci)

fattori di trascrizione TOM (targets of monopteros)

espressi nellle stesse cellule di MP e BDL:

TOM3 migra nell’ipofisi

MUTANTI AXR6

mostrano lo stesso fenotipo di mp e bdl

AXR6 codifica per CULLIN 1 del complesso E3

Mutanti GNOM

• Piantine omozigoti gnom mancano di radici e cotiledoni

• I difetti nell’embrione appaiono alla prima divisione dello zigote e rimangono per tutta l’embriogenesi

• I mutanti più estremi sono sferici• abolita completamente la polarità assiale

GNOM necessario per la determinazione della polarità assiale

WT

gnom

SVILUPPO DEL MUTANTE gnom

Il fenotipo dei mutanti gnom è simile

a quello dei doppi mutanti mpbdl

Ridotta capacità di risposta all’auxina?

In embrioni di Brassica juncea il fenotipo gnom può esserefenocopiato con inibitori del trasporto di auxina

Funzione del gene GNOM

GNOM codifica per un fattore di scambio GTP/GDP che si associa a piccole proteine G della classe ARF (ARF-GEF)

Le proteine ARF (ADP ribosylation factor) sono coinvolte nella regolazionedel trafficking intracellulare delle vescicole

In Arabidopsis GNOM (EMB30) controlla la localizzazione del carrier per l’auxina PIN1durante l’embriogenesi

Mutazioni gnom aboliscono il trasporto polare dell’auxina nell’embrione

Complessi GEF-ARF

ADP ribosilazione

Formazione di vescicole nel TGN

ARF serve a reclutare proteine di rivestimento sulle vescicole

Modello per il trafficking di proteineIn Arabidospis

I geni GNOM determinano la distribuzione dei carrier di efflusso di IAA

(proteine PIN)

PIN1

TIBA e NPA (inibitori del trasporto di IAA) possono interferire con il riciclo di PIN

The PIN proteins are named for the pin-formed mutant

pin-formed, which has a mutation in the PIN1 gene,

makes some abnormal leaves and then a bare inflorescence.

Galweiler, L., Guan, C., Muller, A., Wisman, E., Mendgen, K., Yephremov, A., and Palme, K. (1998). Regulation of polar auxin transport by AtPIN1 in Arabidopsis vascular tissue. Science 282: 2226 – 2230, reprinted with permission from AAAS.

PIN auxin efflux carriers are encoded by a large gene family with cell-specific expression patterns

Křeček , P., Skůpa , P., Libus, J., Naramoto, S., Tejos, R., Friml J., and Zažímalová, E. (2009) The PIN-FORMED (PIN) protein family of auxin transporters. Genome Biology 10: 249.

PIN

PIN proteins orient asymmetrically in plant cells

Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Dhonukshe, P., et al. (2008). Generation of cell polarity in plants links endocytosis, auxin distribution and cell fate decisions. Nature 456: 962-966. Reproduced with permssion from Dolan, L., et al. (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 119:

71-84.

PIN1 localizes to the lower

surface of root cortex cells

Root Apex

Root Base

PIN1 is responsible for auxin flow from shoot apex to

root apex.

PIN proteins orient differently

PIN2 localizes to the lower surface of root cortex cells and the upper surface of

epidermal cells.

Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Dhonukshe, P., et al. (2008). Generation of cell polarity in plants links endocytosis, auxin distribution and cell fate decisions. Nature 456: 962-966. Reproduced with permssion from Dolan, L., et al. (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 119:

71-84.

PIN2 is functions primarily in the redistribution of

auxin during root gravitropism

The distribution of PIN proteins contributes to the auxin gradients

Křeček , P., Skůpa , P., Libus, J., Naramoto, S., Tejos, R., Friml J., and Zažímalová, E. (2009) The PIN-FORMED (PIN) protein family of auxin transporters. Genome Biology 10: 249.

PIN protein distributions contribute to auxin-mediated patterns

Reproduced with permission from Petrášek, J., and Friml, J. (2009) Auxin transport routes in plant development. Development 136: 2675-2688.

Amongst other things, they specify the location of auxin

maxima necessary for embryonic patterning.

PIN proteins can move very dynamically within cells and tissues

Unlike the more stably-oriented ABCB proteins, PIN proteins can rapidly change their positions within cells.

Reprinted from Heisler, M.G., et al. (2005). Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15: 1899–1911, with permission from Elsevier.

PIN proteins cycle between plasma membrane and endosome

PIN proteins continually cycle between the plasma membrane and endosomal compartments.

endosome

Plasma membrane

Redrawn from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinase-mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21: 3839-3849.

Brefeldin A blocks endocytosis and traps PIN proteins

Brefeldin A (BFA) prevents endosomes from fusing with the plasma membrane, trapping

PIN in the endosomal compartments.

Control BFA treatment

Redrawn and reprinted from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinase-mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21: 3839-3849.

The phosphorylation state of PINs affects their distribution

PIN proteins are phosphorylated by the protein kinase PINOID (PID)

and dephosphorylated by the protein phosphatase PP2A.

P P PP2A

PID

PPPP

Sukumar, P., Edwards, K.S., Rahman, A., DeLong, A., and Muday, G.K. (2009). PINOID kinase regulates root gravitropism through modulation of PIN2-dependent basipetal auxin transport in Arabidopsis. Plant Physiol. 150: 722-735. Redrawn from Kleine-Vehn, J., et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by

PINOID kinase-mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21: 3839-3849.

Control Staurosporine treated

Staurosporine inhibits protein

kinases

ABCB proteins may stabilize PIN proteins within membrane domains

Titapiwatanakun, B., and Murphy, A.S. (2009) Post-transcriptional regulation of auxin transport proteins: cellular trafficking, protein phosphorylation, protein maturation, ubiquitination, and membrane composition. J. Exp. Bot. 2009 60: 1093-1107, by permission of the Society for Expiremental Biology.

ABCB19 Plasma Membrane

protein

Orange = overlap

The ABCB proteins seem to stay in the plasma membrane, unlike the PIN proteins. An interaction between the two transporters may

contribute to stabilizing PINs.

LOCALIZZAZIONE DI PIN1 e PIN7

Stadio precoce

Stadio globulare

IAA

IAA

Localizzazione di PIN1 e PIN7nello stadio precoce globulare e correlazione con la concentrazione di auxina

Localizzazione dell’auxina nel mutante gnom

Mutanti GURKE

Plantule omozigoti gurke sono prive dei cotiledoni mentre rimangono l’ipocotile e la radice

Le plantule assomigliano a dei piccoli cetrioli (gurke)

(pasticcino3)

Funzione del gene GURKE

Il gene GURKE codifica per la acetil-CoA carbossilasi 1 (citosolica)

I mutanti gurke possono essere complementati dall’aggiunta di malonato

Complementazione della mutazione acc1 (gurke like) con malonato

embrioni immaturi di arabidopsis espiantati dalla siliqua e coltivati in vitro

3 mM malonato

Sviluppo di embrioni del mutante pasticcino3 (gurke like) durante la germinazione

complementazione da malonato

1mM malonato

ACCasi: catalizza la formazione di malonil-Coa da Acetil-Coa e CO2

2 forme: citosolica (omodimerica): allungamento acidi grassi >20C plastidiale (eteromerica): sintesi acidi grassi

Biosintesi degli acidi grassi

malonilCoA sintetasi

malonato + CoA

malonilCoA

I VLCFA vengono incorporati negli sfingolipidi

La ACC1 (citosol) serve alla biosintesi degli acidi grassi a lunghissima catena (VLCFA =>20)

Contenuto di acidi grassi di semi di arabidopsis WT e mutanti

Le mutazioni acc1-1; acc1-2; gurke; pas3 sono alleliche

I mutanti hanno un accumulo ridotto di VLCFA nei semi

Nei mammiferi è stato visto che gli sfingolipidi

interagiscono col colesterolo per formare domini raft-

like ed hanno un ruolo nella regolazione della

divisione cellulare

LIPID RAFTS:microdomini di membrana ricchi di colesterolo

Dal 1972 (modello del mosaico fluido) si riteneva che fosfolipidi e proteinefossero simmetricamente distribuiti nelle membrane cellulari

Nel 1988 K Simons (EMBL) e G van Meer (Utrecth) ipotizzarono l’esistenza di microdomini arricchiti in colesterolo, glicolipidi e sfingolipidi

Alcune proteine associate a processi di signaling sembrano localizzarsi preferenzialmente nei lipid rafts

doubly-acylated tyrosine kinases of the Src family

ACILAZIONE

Alcune di queste proteine si associano ai LR solo quando sono nello stato attivato B cell receptors (BCRs), T cell receptors (TCRs)

Mutanti FACKEL:

Le mutazioni nel gene FACKEL determinano la delezione della parte centraledel’asse apicale-basale

Mutanti fackel hanno i cotiledoni uniti direttamente alla radice

Funzione del gene FACKEL (FK):

Codifica per una sterolo C-14 reduttasi

biosintesi degli steroliIn arabidopsis

i livelli di sitosterolocampestrolo, stigmasteroloe brassinolide sono ridottinei mutanti fk

0 10 50 100 mg/ml fenpropimorph

mutante fk

Le mutazioni fk possono essere fenocopiate

dal fenpropimorph, un inibitore della C-14 reduttasi

Mutazioni fk non sono complementate dall’aggiunta di brassinolidi

gli steroli ( CH, ER, ST,) che si accumulano nei mutanti fk responsabili degli effetti?

trattamenti con CH, ER, ST dovrebbero FENOCOPIARE i mutanti fk

Non hanno difetti embrionali pur avendo livelli ridotti di steroli

Mutanti BR sono complementati da BRs Mutanti fackel no

STEROLI

Componenti della membrana cellulare influenzano permeabilità e fluidità della membrana e l’attività di proteine

animali: colesterolopiante: sitosterolo, campestrolo

Precursori degli ormoni steroidei

animali: androgeni, estrogeni, glucocorticoidi

piante: brassinosteroidi

STEROLI ANIMALI

Essenziali per lo sviluppo embrionale

COLESTEROLO

Negli animali evidenze che sia coinvolto in vie di trasduzione del

segnale che controllano la formazione del pattern (Hedgehog (Hh)

transduction pathway: proteine Hh secrete , modificate da colesterolo

promuovono interazioni con altre proteine per la trascrizione dei geni

delle cicline E e D)

Nelle piante PHABULOSA (PHB) è un fattore di trascrizione Leucin –Zipper Homeodomain possiede un domain di binding per steroli/lipidi. E’ implicato nelcontrollo della formazione del pattern radiale nel germoglio

NELLE PIANTE GLI STEROLI POSSONO AVERE UN RUOLO NELL’EMBRIOGENESI?