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Herbstsemester 2013
Analytische Chemie(für Biol. / Pharm. Wiss.)
Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophore se)
Dr. Martin Pabst
ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Pabst , mar [email protected]
HCI D323
http://www.analytik.ethz.ch/
Herbstsemester 2013 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid. Dr. Martin Pabst | [email protected] 2
DETEKTOREN
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Flüssigchromatographie (LC)Detektoren
Trennsäule
Detektor
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1. UV/VIS-Detektor (ultraviolet/visible)
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Signal: Extinktion von Eluent + Analyt
Grundlinie: Extinktion des Eluenten (oft automatisch abgezogen)
Prinzip: Messung der optischen Transmission (wie bei einem UV/VIS-Spektrometer)
UV: 190 bis 400 nm
VIS: 400 (violett) bis 800 nm (rot)
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UV/VIS-Detektor
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d
I0
IProbe
Lich
tinte
nsitä
Abstand
Lich
tinte
nsitä
t
= lgI0
I= ε λ( ) c d
Lambert-Beersches Gesetz
E
E .... Extinktion
ε .... Extinktionskoeffizient
c .... Konzentration
d .... Schichtdicke
• Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion
• Geringes Volumen der Messzelle zur Verhinderung zusätzlicher Peakverbreiterung(‘extra column effects’)
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UV/VIS-Detektor
6
d
I0
IProbe
Lich
tinte
nsitä
Abstand
Lich
tinte
nsitä
t
• Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion
• Geringes Volumen der Messzelle zur Verhinderung zusätzlicher Peakverbreiterung(‘extra column effects’)
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Varianten des UV/VIS-Detektor
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• Festwellenlängengeräte(z.B. Hg-Dampflampe mit λ = 254 nm)
• Geräte mit variabler Wellenlängeneinstellung
• Dioden array detektoren (DAD)
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UV/VIS-Detektor
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mit variabler Wellenlängeneinstellung
Lichtquellen: Deuteriumlampe (λ = 190-370 nm) und/oderWolfram-Halogenlampe (λ = 370-800 nm)
Wellenlänge wählbar mittels eines Monochromators (z.B. Prisma + Spalt)
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UV/VIS-Detektor
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Diodenarraydetektor (DAD)
Polychromatische Anregung (Deuteriumlampe und/oder Wolfram-Halogenlampe)
Zu jedem Zeitpunkt wird das ganze Spektrum von einem Diodenarray erfasst.
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UV/VIS-Detektor
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Der UV/VIS-Detektor erfasst nur Analyten, die ausreichend UV-Strahlung bzw. sichtbares Licht (VIS) absorbieren.
Bei kleinen Wellenlängen um 200 nm absorbieren viele Substanzen, meist aber auch der Eluent. Das Absorbptionsmaximum des Analyten soll längerwelligals die Eluentabsorption sein.
UV/VIS-aktiv:
• (polyzyklische) Aromaten, konjugierte Doppelbindungssysteme
• Doppel- und Mehrfachbindungen
• Carbonylgruppen C=O
• –Br, –I
R R R
......
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2. Brechungsindexdetektor(refractive index detector = RID)
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Signal: Brechungsindex-Änderungim Vergleich zum Eluenten
Prinzip: DurchflussrefraktometerMessung der Änderung von Brechungswinkeln
- Vielseitig, da praktisch jeder Analyt den Brechungs index ändert, aber unspezifisch
- Empfindlichkeit bei vielen Analyten um 2–3 Grössenordnungen schlechter als bei UV/VIS-Detektion. Nicht kompatibel mit Gradientenelution .
- Verwendung: Zuckerbestimmung in Wein
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Verdampfungs-Lichtstreudetektor(evaporative light scattering detector = ELSD)
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Signal: Intensität des an festen Analytpartikeln gestreuten Lichts
Prinzip: Eluent + Analyt werden fein vernebelt. Lösungsmittel verdampft
Das an den festen Analytpartikelngestreute Laserlicht wird von einem Photodetektor erfasst
Universeller Detektor
Siedepunkt Eluent < Siedepunkt Analyten
Kompatibel mit Gradientenelution
Inkompatibel mit salzhaltigen Eluenten
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Fluoreszenz-Detektor
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I f ∝ I0 ⋅ Φ ⋅ ε λAnregung( ) ⋅ c ⋅ d
If .... Fluoreszenzintensität
Φ ... Quantenausbeute
ε .... Extinktionskoeffizient
c .... Konzentration
d .... Schichtdicke
Im Gegensatz zu UV/VIS:
Signal(Photodiode) = 0 bei c = 0Signal ∝ I0
λEmission ≥ λAnregung (Rotverschiebung)
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Fluoreszenz-Detektor
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Signal: Fluoreszenzintensität
Prinzip: Anregung mit einer definierten Wellenlänge (Lichtfilter 1)
Detektion meist im 90°-Winkel der rot verschobenen (Lichtfilter 2) Fluoreszenzstrahlung
Sehr empfindlich(Faktor 100–1000 besser als UV/VIS)
Nicht universell – abhängig von der chemischen Natur der Analyten
Nur fluoreszierende Analyten (z.B. polyzyklische Aromaten), alternativ: Derivatisierung
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3.Massendetektoren
http://www.dgms-online.de/dgms1/Wissen/Das-ist-MS/massenspektrometer.php?navid=43
Um Analyten mit Massenspektrometern zu detektieren, muss man dieAnalytenmoleküle vorher ionisieren! = IONENQUELLE
ESI = Electrospray ionizationEI = Electron impact ionizationCI = Chemical IonisationMALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (Selten an LC gekoppelt)
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ESI produziert„Pseudo-
Molekülionen“[M+H]+
• Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt
• Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisions-zelle möglich (z.B. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TOF-MS)
• Massenselektive Detektion(sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert)
• Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich
• ESI: v.a. für Moleküle mit protonierbaren oder deprotonierbaren funktionellen Gruppen
LC-ESI-MS(ESI = electrospray ionization)
Ausgang der Trennsäule
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LC-APCI-MS(APCI = atmospheric pressure chemical ionization)
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• Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt
• Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisions-zelle möglich (z.B. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TOF-MS)
• Massenselektive Detektion(sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert)
• Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich
• APCI: auch für kleine Moleküle ohne polare funktionelle Gruppen gut geeignet
Ausgang der Trennsäule
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Vergleich: LC-Detektoren (HPLC oder LC)
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Detektor Empfindlichkeit Linearbereich Analyten
UV/VIS + +++ UV- und VIS-Absorber
RID – – + universeller Detektor
ELSD o ++ universeller Detektor
Fluoreszenz +++ +++ Fluorophore
Elektrochemisch ++ / +++ ++ reduzier- und oxidierbareAnalyten
MS + / +++ + / ++ universeller Detektor+ massenselektive Detektion+ Massenspektren zur
Strukturaufklärung
Ausführlichere Tabelle in: Cammann, Instrumentelle Analytische Chemie
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Derivatisierung
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Derivatisierung: � Wenn Analyten nicht oder mit ungenügender Empfindlichkeit durch einen bestimmten Detektor erfasst werden können.
� Umsetzung z.B. mit Fluorophoren oder starken UV-Absorbern
NH3C CH3
SO O
Cl
H2N R+- HCl
NH3C CH3
SO O
HN
R
Fluoreszenzz.B. primäre Amine
5-(N,N-Dimethylamino)-
naphthalin-1-sulfonylchlorid
= Dansylchlorid
Blau-blaugrünfluoreszierende
Sulfonamide
NO2
NO2
NH
NH2
R1 R2
O+
- H2O
NO2
NO2
NH
N
R2
R1
UV/VISz.B. Aldehyde und Ketone
2,4-Dinitrophenyl-hydrazin
= DNPH
DNP-Hydrazone
max ≈ 360 nm
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Beispiele:HPLC-Trennungen
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Anwendungsbeispiele HPLC
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Trennung von Pestiziden
Säule: C18 (RP)Eluenten: Wasser –
Acetonitril55%:45%
Flussrate: 1 mL/min
Detektor UV = 225 nm
1. Benfuresate2. Dymron3. Iprodione4. Pyrazoxyfen5. Tebufenozide6. Iprodione Metabolite7. Pencycuron
t (min)
O
CH3H3C
OS
O
O
H3C
NH
O
N
Cl
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Anwendungsbeispiele HPLC
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t
Trennung von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAHs)
Säule: C18 (RP)Eluenten: (A) Wasser
(B) Acetonitril
Gradient:0–10 min 48% A, 52% B16 min 20% A, 80% B21 min 0% A, 100% B28 min 0% A, 100% B30 min 48% A, 52% B30 min stop
Flussrate: 1 ml/min
Detektor UV = 260 nm
(Minuten)
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Anwendungsbeispiele HPLC
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HPLC-Trennung vonSerotonin-Wiederaufnahmehemmern(Antidepressiva)
Stationäre Phase: Cyanopropyl-Kieselgel
Mobile Phase: Wasser (Phosphatpuffer, pH 7) – Acetonitril40%:60%
Flussrate: 1 ml/min
Detektor: UV, = 230 nm
Uracil
Verunreinigung
Fluvoxamin
Sertralin
Fluoxetin
NH
NH
O
O
CF3
N
O
H2N O
HN
H3C
H
HCl
Cl
CF3
OHN
Schlechte Retention der teilweise protonierten Amine auf RP-18-Phase,gute Trennung auf Cyanopropyl-Phase
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Vergleich: LC-Detektoren (HPLC oder LC)
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Detektor Empfindlichkeit Analyten
UV/VIS + UV- und VIS-Absorber
Fluoreszenz +++ Fluorophore
MS + / +++ universeller Detektormassenselektive DetektionMSn (Fragmentierung) zur Strukturaufklärung
Fluorescein
FITC fluorescin-Iso thiocyanate
Emission beihöherer
Wellenlänge!
Derivatisierung: Markieren von Analyten mit UV- oder fluoreszenzaktiven Molekülen:
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UV Detektor … Detektoren sind selektiv
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HPLC-Analyse von Olivenölproben. UV-Detektion bei zwei Wellenlängen .DAD = Diode Array Detektor
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UV und RI Detektor
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Untersuchung einer Bierprobe
Kombination von 2 Detektoren
(1) Brechungsindexdetektor (RI):
universell: erfasst alle Analyten
(2) UV/VIS-Detektor (280 nm):
für einige Analyten empfindlicher als RI
J. Chromatograph. Sci. 39 (2001) 235
Peak 9: 5-HydroxymethylfurfuralPeak 8: Ethanol
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Massendetektoren
http://www.dgms-online.de/dgms1/Wissen/Das-ist-MS/massenspektrometer.php?navid=43
Um Analyten mit Massenspektrometern analysieren zu k önnen, muss mandiese vorher ionisieren = IONENQUELLE
ESI = Electrospray ionizationEI = Electron impakt ionizationCI = Chemical Ionization
MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (selten mit Trenntechnik gekoppelt)
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Massendetektoren „2 Spuren“
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Trennung von Metaboliten aus tierischen Zellen
(CHO)
Säule: Porous Graphitized Carbon(PGC)
Eluenten: Wasser /Acetonitril
Flussrate: 5 uL/min
Detektor ESI-MS
1. ATP (506)2. ADP (426)3. AMP (346)
All (M-H)-
"Chromatogram"TIC = total ion current
Massenspur
1
2
3
1
2
3
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Massendetektoren „Analyten getrennt betrachtbar“
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Trennung von Metaboliten aus tierischen Zellen
(CHO)
Säule: PGC
Eluenten: Wasser /Acetonitril
Flussrate: 5 µl/min
Detektor ESI-MS
1. ATP (506)2. ADP (426)3. AMP (346)
All (M-H)-
ChromatogramTIC = total ion current
1
23
1
2
3
SIM = single ion monitoring
m/z = 506
m/z = 426
m/z = 346
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Anwendungsbeispiele HPLC
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HPLC-MS-Trennung von Triglyceriden
A) Gesamtionenstrom(total ion current = TIC)
B) Single ion monitoring = SIM
Masse 1
Masse 2
Masse 3
Masse 4
TIC
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Anwendungsbeispiele HPLC
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Analyse der Probe ohne vorhergehende Trenntechnik o ft auch bei MS nicht möglich.
Chromatographie trotz Massenselektiven Detektor meis t notwendig/sinnvoll!
� Zu viele Analyten mit den gleichen oder ähnlichenMassen (isobare Analyten)
� Schlechte Ionisierung durch Hintergrundsubstanzender Probe (Salze, kleine polare Analyten....)
Hunderte Analytenin einem kleinem Massenbereich
Identifizierung nicht mehrmöglich!
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Anwendungsbeispiele HPLC
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m/z = 342.2
m/z = 400.1
m/z = 404.0
m/z = 384.1
m/z = 331.0
m/z = 332.1
m/z = 706.4
m/z = 657.4
HPLC-ESI-MS-Trennung von Mykotoxinen (Giftstoffe au s Schimmelpilzen)
Säule: C18 (RP)
Eluent:Wasser (+ NH4OAc)+ Acetonitril
Aflatoxin B1