FIZIOLOŠKI ODGOVORI VELEBITSKE DEGENIJE, Degenia ...botanickivrt.biol.pmf.hr/wp-content/uploads/2017/07/027_phd-Stamenkovic.pdf · 2009. godine izložene insolaciji na vanjskim pokusnim

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU PRIRODOSLOVNO-MATEMATIČKI FAKULTET

BIOLOŠKI ODSJEK

Vanja Stamenkovid

FIZIOLOŠKI ODGOVORI VELEBITSKE DEGENIJE, Degenia velebitica (Degen) Hayek

NA UV ZRAČENJE

DOKTORSKA DISERTACIJA

Zagreb, 2012.

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Vanja Stamenkovid

FIZIOLOŠKI ODGOVORI VELEBITSKE DEGENIJE, Degenia velebitica (Degen) Hayek

NA UV ZRAČENJE

Doktorska disertacija predložena Biološkom odsjeku

Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja akademskog stupnja

doktora prirodnih znanosti biologije

Zagreb, 2012.

ii

Ova doktorska disertacija izrađena je u Botaničkom zavodu Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu pod vodstvom doc. dr. sc. Mirte Tkalec, u sklopu Sveučilišnog poslijediplomskog studija prirodnih znanosti pri Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.

iii

Zahvaljujem Vrtlaricama u Botaničkom vrtu Biološkog odsjeka PMF-a na uzgoju i brizi za više od 2000 mojih pokusnih biljaka kroz tri godine pokusa. Kolegama iz uprave Botaničkog vrta, ing. Darku Mihelju, dr. sc. Sanji Kovačid, prof. Dubravki Sandev i Ružici Topid na svesrdnoj podršci i razumijevanju za moja česta izbivanja tijekom provođenja pokusa i laboratorijskog rada, a voditeljici Vrta, mr. sc. Biserki Juretid i na financijskoj potpori u svim fazama izrade ove disertacije. Prijateljima i kolegama Antunu, Sandru, Saši, Ivani, Sari, Zorani i Mladenu na ugodnom druženju, podršci i prijateljstvu. Dr. sc. Hrvoju Posilovidu s Geološko-paleontološkog zavoda Geološkog odsjeka PMF-a na fantastičnim SEM mikrografijama lista velebitske degenije. Inžinjerki Luciji Horvat sa Zavoda za molekularnu biologiju Instituta Ruđer Boškovid na velikoj pomodi u istraživanju lokalizacije flavonoida putem konfokalnog laserskog pretražnog mikroskopa. Dr. sc. Hrvoju Fulgosiju sa Zavoda za molekularnu biologiju Instituta Ruđer Boškovid na darovanim antitijelima proteina fotosintetskog aparata. Kolegicama sa Zavoda za molekularnu biologiju Biološkog odsjeka PMF-a, doc. dr. sc. Nataši Bauer i dr. sc. Petri Peharec na savjetima, dijeljenju iskustava, posuđenim kemikalijama i pomodi pri mikroskopiranju, a dr. sc. Petri Cvjetko na uloženom trudu i vremenu tijekom izrade komet-testa. Kolegi dr. sc. Saši Likidu s Botaničkog zavoda Biološkog odsjeka PMF-a na praktičnim savjetima, poticajnim raspravama i posuđenim standardima flavonoida. Svim kolegicama iz laboratorija za biljnu fiziologiju Botaničkog zavoda Biološkog odsjeka PMF-a na praktičnim savjetima, pomodi i strpljenju tijekom mojega višegodišnjeg rada u njihovom laboratoriju. Naročito zahvaljujem doc. dr. sc. Željki Vidakovid-Cifrek na korisnim informacijama i nesebičnoj i uvijek spremnoj pomodi u tumačenju rezultata i izboru literature, a prof. dr. sc. Branki Pevalek-Kozlina na velikoj i stalno prisutnoj podršci koju mi je izravno i posredno pružala još od izrade diplomskog rada i mojeg zaposlenja u Vrtu. Mentorici, doc. dr. sc. Mirti Tkalec, na … svemu! Iskreno joj zahvaljujem na pravom mentorstvu koje je iskazala istinskim interesom i vođenjem kroz izazovnu problematiku kojom se još nitko nije bavio u Zavodu. Zahvalan sam joj na praktičnom laboratorijskom znanju i metodologiji koje je usadila u moje, ponekad nespretne ruke, na vremenu i trudu u isprobavanju i usavršavanju novih metoda, na konstruktivnim i stimulirajudim raspravama kojima me usmjerila na znanstvenu radoznalost i kritičko razmišljanje, na odlučnosti kojom je ispravljala moja odugovlačenja i brzopletosti, na preciznom i marljivom pregledavanju mojih rukopisa… na prijateljstvu. Mojim mališankama Emi i Dori na bezuvjetnoj ljubavi i razumijevanju za moja izbivanja. Mojoj dragoj Sanji na ljubavi, neupitnoj podršci, beskonačnom strpljenju, mnogim obavezama koje je obavljala bez moje pomodi, razumijevanju, ali i povremenom „oštrijem” ohrabrivanju.

U Zagrebu, 2012.

iv

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu Doktorska disertacija Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek

FIZIOLOŠKI ODGOVORI VELEBITSKE DEGENIJE, Degenia velebitica (Degen) Hayek NA UV ZRAČENJE

Vanja Stamenkovid

Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet, Biološki odsjek

Rooseveltov trg 6, Zagreb

Velebitska degenija Degenia velebitica (Degen) Hayek , najpoznatiji i jedan od najznačajnijih predstavnika hrvatske endemične flore, je heliofit i kserofit visoko specijaliziran za preživljavanje u ekstremnim životnim uvjetima s izrazitim sunčevim zračenjem. U ovome radu istraženi su učinci sunčevog UV zračenja na biljke uzgojene u ambijentu sa smanjenim UV zračenjem. Biljke su u srpnju 2009. godine izložene insolaciji na vanjskim pokusnim plohama i tijekom 988 sati pokusa primile su

ukupnu dozu UV zračenja od 32,5 MJ m-2. UV stres je izazvao povedanje koncentracije H2O2 te prouzročio oštedenja lipida i proteina, osobito nakon primljene doze od 6,7 MJ m-2, što ukazuje na oksidacijski stres, ali je nakon dugotrajne izloženosti primijeden oporavak. UV zračenje nije izazvalo ni strukturna ni funkcionalna oštedenja fotosintetskog aparata jer nisu uočene promjene u akumulaciji proteina D1 i RuBisCO, kao ni u optimalnom i efektivnom prinosu te fotokemijskom i nefotokemijskom gašenju fluorescencije klorofila a in vivo. Naprotiv, povedana akumulacija proteina LHCII i povedanje koncentracije pomodnih pigmenata karotenoida te klorofila b ukazuju na aklimatizaciju velebitske degenije tijekom UV stresa. UV zračenje je također potaknulo aktivnosti askorbat peroksidaze, katalaze, superoksid dismutaze i peroksidaza, što upuduje na ulogu tih enzima u obrani od oksidacijskog stresa. U listovima velebitske degenije utvrđena su tri aglikona flavonoida – kvercetin, kempferol i izoramnetin. Izlaganje biljaka sunčevom UV zračenju izazvalo je značajno povedanje koncentracija kvercetina i izoramnetina pa se ti spojevi i njihovi derivati mogu smatrati važnim neenzimskim antioksidansima i UV-filtrima. Flavonoidi su lokalizirani u šupljinama epidermskih trihoma, vakuolama i staničnim stijenkama epidermskih stanica te u području stijenke, plazmaleme i citosola stanica mezofila s abaksijakne i adaksijalne strane lista. Istraživanje dnevnih i sezonskih promjena kod vedine navedenih fizioloških parametara potvrdilo je otpornost velebitske degenije na jaku ljetnu insolaciju. Izrazita aktivacija antioksidacijskih enzima zimi upuduju na njihovu važnu ulogu u toleranciji na niske i smrzavajude temperature. Ukupni rezultati pokazali su da velebitska degenija ima izrazito razvijene fiziološke zaštitne mehanizme kojima se štiti od sunčeva UV zračenja te da se biljke izložene UV stresu uspješno aklimatiziraju povedanom sunčevom zračenju. (146 stranica, 65 slika, 6 tablica, 295 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski) Rad je pohranjen u Nacionalnoj i sveučilišnoj knjižnici, Ulica Hrvatske bratske zajednice 4, Zagreb Ključne riječi: velebitska degenija, Degenia velebitica, UV zračenje, antioksidacijski enzimi, flavonoidi,

fotosintetski aparat, sezonska varijabilnost, oksidacijski stres Mentor: doc. dr. sc. Mirta Tkalec Ocjenjivači: izv. prof. dr. sc. Kroata Hazler-Pilepid doc. dr. sc. Mirta Tkalec doc. dr. sc. Renata Šoštarid Rad prihvaden:

v

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb Doctoral Thesis Faculty of Science Division of Biology

PHYSIOLOGICAL RESPONSES OF Degenia velebitica (Degen) Hayek TO UV STRESS

Vanja Stamenkovid

University of Zagreb, Faculty of Science, Division of Biology Rooseveltov trg 6, Zagreb

Degenia velebitica (Degen) Hayek, most famous and one of the most prominent representatives of Croatian endemic flora, is a heliophyte highly specialised in surviving strenuous life conditions with pronounced insolation. The objective of this thesis was to investigate the effects of solar UV radiation on plants grown in field under plastic films that strongly reduced UV. Plants were exposed to sunlight in July 2009 and have received 32,5 MJ m-2 of UV radiation during 988 hours of exposure. UV stress increased

levels of H2O2 as well as damage to lipids and proteins, especially after 6,7 MJ m-2 of UV received. This indicated oxidative stress, but after long-term exposure recovery of plants was noticed. UV radiation did not cause either structural nor functional damage to photosynthetic apparatus, because there were no changes observed in accumulation of proteins D1 and RuBisCO, as well as photosystem II efficiency, photochemical and non-photochemical quenching of chlorophyll a fluorescence in vivo. Rather, increased accumulation of protein LHCII as well as concentrations of accessory pigments carotenoids and chlorophyll b showed that UV induced protective mechanisms of acclimation. Activities of antioxidative enzymes ascorbate peroxidase, catalase, superoxid dismutase and peroxidases were also increased by UV stress, but no new isoforms were synthesised. Three flavonoid aglycones were detected in Velebit degenia leaves – quercetin, kaempferol and isorhamnetin. During exposure to solar UV, concentrations of quercetin and isorhamnetin increased significantly, therefore those compounds and their derivatives are considered as important nonenzymatic antioxidants and UV-absorbers. Flavonoids were localised in the channels of the epidermal trichoms, vacuoles and cell walls of epidermal cells, as well as peripheral parts of spongy and palisade cells on both the abaxial and adaxial sides of the leaves. Investigation of daily and seasonal changes in most of the aforementioned physiological parameters confirmed resistance of the Velebit degenia to high summer insolation. Strong activation of antioxidative enzymes in winter indicated their role in acclimation and tolerance to freezing temperatures. The results obtained in this experiment suggest that the Velebit degenia possesses well-developed physiological protective mechanisms against solar UV radiation and can successfully acclimate to increased UV. (146 pages, 65 figures, 6 tables, 295 references, original in Croatian) Thesis deposited in the National and University Library, Ulica Hrvatske bratske zajednice 4, Zagreb Key words: Degenia, UV, antioxidative enzymes, flavonoid, photosynthetic apparatus,

seasonal variability, oxidative stress Supervisor: Asst. Prof. Mirta Tkalec Rewievers: Ass. Prof. Kroata Hazler-Pilepid Asst. Prof. Mirta Tkalec Asst. Prof. Renata Šoštarid Thesis accepted:

vi

SADRŽAJ

1. UVOD……………………………………………………………………………………………………………………………………. 1 Hipoteze i ciljevi istraživanja…………………………………………………………………………………. 2

2. LITERATURNI PREGLED………………………………………………………………………………………………………….. 5

2.1. Velebitska degenija………………………………………………………………………………………………………… 5 2.1.1. Otkride i imenovanje……………………………………………………………………………………………….. 5 2.1.2. Opis vrste………………………………………………………………………………………………………………… 6 2.1.3. Ekologija i zaštita…………………………………………………………………………………………………….. 7

2.2. Ultraljubičasto (UV) zračenje………………………………………………………………………………………….. 9 2.2.1. Značaj UV zračenja za život na Zemlji………………………………………………………………………. 9 2.2.2. UV zračenje kao stresni čimbenik kod biljaka…………………………………………………………… 11

2.3. Učinci UV zračenja na biljni organizam………………………………………………………………………...... 12 2.3.1. Izravni negativni učinci na biljnu stanicu…………………………………………………………………. 13

Učinci na biomolekule…………………………………………………………………………………………… 13 Učinci na membrane……………………………………………………………………………………………… 14 Učinci na fotosintetski aparat i fotosintezu……………………………………………………………. 15

2.3.2. Posredni negativni učinci na biljnu stanicu………………………………………………………………. 16 Najvažniji ROS i mehanizmi nastanka u biljnim stanicama……………………………………. 17 Izvori ROS u biljnim stanicama………………………………………………………………………………. 18 Učinak ROS na molekulu DNA, proteine i lipide……………………………………………………... 18

2.4. Zaštita od UV zračenja……………………………………………………………………………………………………. 20 2.4.1. Adaptivni odgovor biljke na UV zračenje…………………………………………………………………. 21 2.4.2. Zaštitne strukture……………………………………………………………………………………………………. 22 2.4.3. Zaštitni mehanizmi………………………………………………………………………………………………….. 23

Antioksidacijski enzimi………………………………………………………………………………………..... 23 Antioksidacijski (neenzimski) spojevi……………………………………………………………………… 24 Enzimski mehanizmi popravaka…………………………………………………………………………….. 25

3. MATERIJALI I METODE………………………………………………………………………………………………………….. 27

3.1. Materijali…………………………………………………………………………………………………………………….... 27 3.1.1. Uzgoj, tretman i sabiranje biljnog materijala…………………………………………………………... 27

Preduzgoj pokusnih biljaka……………………………………………………………………………………. 27 Uzgoj na pokusnim plohama…………………………………………………………………………………. 28 Uzorkovanje i pohrana biljnog materijala……………………………………………………………... 30

3.1.2. Sunčevo UV zračenje i temperatura zraka……………………………………………………………….. 31 Mjerenje sunčevog UV zračenja i izračun doza zračenja………………………………………... 31 Sezonske promjene sunčevog UV zračenja…………………………………………………………….. 32 Mjerenje temperature zraka…………………………………………………………………………………. 33

3.1.3. Kemikalije……………………………………………………………………………………………………………….. 34 3.2. Metode………………………………………………………………………………………………………………………….. 35

3.2.1. Određivanje koncentracije vodikovog peroksida……………………………………………………… 35 3.2.2. Određivanje stupnja lipidne peroksidacije…………………………………………………………….... 35 3.2.3. Određivanje oksidacijskog oštedenja proteina…………………………………………………………. 36 3.2.4. Analiza proteina fotosintetskog aparata……………………………………………………………….... 37

Ekstrakcija ukupnih staničnih (topivih) i membranskih proteina……………………………. 37 Određivanje koncentracije proteina………………………………………………………………………. 37 Razdvajanje proteina SDS PAG elektroforezom……………………………………………………… 37 Prijenos proteina na nitroceuloznu membranu i imunodetekcija proteina RuBisCO, D1 i LHCII…………………………………………………………………………………. 38 Bojanje gelova srebrom………………………………………………………………………………………… 38

3.2.5. Određivanje sadržaja fotosintetskih pigmenata………………………………………………………. 39 Ekstrakcija pigmenata…………………………………………………………………………………………... 39

vii

Tekudinska kromatografija visoke djelotvornosti (HPLC)…………………………………........ 39 3.2.6. Fluorescencija klorofila a in vivo……………………………………………………………………………… 40 3.2.7. Određivanje aktivnosti antioksidacijskih enzima……………………………………………………… 40

Priprema enzimskih ekstrakata……………………………………………………………………………… 40 Određivanje aktivnosti katalaze (CAT), askorbat peroksidaze (APX) i gvajakol peroksidaze (POD)…………………………………………………………………………………... 41 Određivanje aktivnosti superoksid dismutaze (SOD)……………………………………………... 42

3.2.8. Određivanje sastava izoformi antioksidacijskih enzima…………………………………………… 43 Razdvajanje proteina elektroforezom u nativnim uvjetima……………………………………. 43 Bojanje i prikaz izoenzima u gelu…………………………………………………………………………… 43

3.2.9. Osnovna građa lisnih tkiva……………………………………………………………………………………… 44 Opde karakteristike lisnih tkiva……………………………………………………………………………... 44 Morfologija i raspored epidermalnih trihoma……………………………………………………….. 44

3.2.10. Lokalizacija flavonoida u lisnim tkivima…………………………………………………………………. 44 Lokalizacija flavonoida epifluorescencijskim mikroskopom (EFM)…………………………. 44 Lokalizacija flavonoida konfokalnim laserskim pretražnim mikroskopom (CLSM)….. 45

3.2.11. Sadržaj flavonoida…………………………………………………………………………………………………. 45 Ekstrakcija flavonoida i priprema uzoraka…………………………………………………………….. 45 Određivanje sadržaja flavonoida pomodu HPLC…………………………………………………….. 46

3.3. Statistička obrada podataka…………………………………………………………………………………………… 46 4. REZULTATI…………………………………………………………………………………………………………………………….. 47

4.1. Doze UV zračenja…………………………………………………………………………………………………………… 47 4.2. Učinci UV zračenja…………………………………………………………………………………………………………. 48

4.2.1. Koncentracija vodikovog peroksida…………………………………………………………………………. 48 4.2.2. Stupanj lipidne peroksidacije…………………………………………………………………………………... 49 4.2.3. Oksidacijsko oštedenje proteina…………………………………………………………………………...... 49 4.2.4. Ekspresija proteina fotosintetskog aparata RuBisCO, D1 i LHCII……………………………… 50

Protein RuBisCO……………………………………………………………………………………………………. 50 Protein D1……………………………………………………………………………………………………………… 51 Protein LHCII…………………………………………………………………………………………………………. 51

4.2.5. Sastav i koncentracija pigmenata fotosintetskog aparata………………………………………… 53 Karotenoidi……………………………………………………………………………………………………………. 53 Klorofili…………………………………………………………………………………………………………………. 56

4.2.6. Fluorescencija klorofila a in vivo……………………………………………………………………………… 58 Optimalni i efektivni prinos fluorescencije – efikasnost fotosistema II…………………… 58 Fotokemijsko i nefotokemijsko gašenje fluorescencije…………………………………………… 59

4.2.7. Aktivnosti i sastav izoformi antioksidacijskih enzima……………………………………………….. 60 Askorbat peroksidaza………………………………………………………………………………………….… 60 Katalaza………………………………………………………………………………………………………………… 60 Gvajakol / pirogalol peroksidaza…………………………………………………………………………… 61 Superoksid dismutaza……………………………………………………………………………………………. 63

4.2.8. Sadržaj flavonoida…………………………………………………………………………………………………… 64 Koncentracija kvercetina, kempferola i izoramnetina……………………………………………. 65

4.3. Sezonske promjene istraživanih fizioloških parametara………………………………………………… 67 4.3.1. Koncentracija vodikovog peroksida………………………………………………………………………… 67 4.3.2. Stupanj lipidne peroksidacije…………………………………………………………………………………… 67 4.3.3. Oksidacijsko oštedenje proteina………………………………………………………………………………. 68 4.3.4. Ekspresija proteina fotosintetskog aparata RuBisCO, D1 i LHCII………………………………. 69

Protein RuBisCO……………………………………………………………………………………………………. 69 Protein D1……………………………………………………………………………………………………………… 69 Protein LHCII…………………………………………………………………………………………………………. 70

viii

4.3.5. Sadržaj fotosintetskih pigmenata…………………………………………………………………………….. 71 Karotenoidi……………………………………………………………………………………………………………. 71 Klorofili…………………………………………………………………………………………………………………. 74

4.3.6. Fluorescencija klorofila a in vivo……………………………………………………………………………… 75 4.3.7. Aktivnost i sastav izoformi antioksidacijskih enzima………………………………………………… 76

Askorbat peroksidaza……………………………………………………………………………………………. 76 Katalaza………………………………………………………………………………………………………………… 77 Gvajakol / pirogalol peroksidaza…………………………………………………………………………… 78 Superoksid dismutaza………………………………………………………………............................... 79

4.3.8. Sadržaj flavonoida…………………………………………………………………………………………………… 80 4.4. Građa lista, lokalizacija flavonoida i odnos koncentracija flavonoida

u dlakama, listovima i cvjetnim pupovima……………………………………………………………………. 82 4.4.1. Osnovna građa lisnih tkiva………………………………………………………………………………………. 82

Opde karakteristike lisnih tkiva……………………………………………………………………………… 82 Morfologija i raspored epidermalnih trihoma……………………………………………………….. 83

4.4.2. Lokalizacija flavonoida…………………………………………………………………………………………….. 85 Lokalizacija flavonoida epifluorescencijskim mikroskopom (EFM)………………………… 85 Lokalizacija flavonoida konfokalnim laserskim pretražnim mikroskopom (CLSM)… 88

4.4.3. Koncentracija flavonoida u dlakama, listovima i cvjetnim pupovima……………………… 90 5. RASPRAVA…………………………………………………………………………………………………………………………… 93

5.1. UV zračenje…………………………………………………………………………………………………………………… 93 5.1.1. Doze UV zračenja…………………………………………………………………………………………………….. 93

5.2. Učinci UV zračenja………………………………………………………………………………………………………… 94 5.2.1. Pokazatelji oksidacijskog stresa……………………………………………………………………………….. 94 5.2.2. Fotosintetski aparat………………………………………………………………………………………………… 97 5.2.3. Enzimski antioksidacijski sustav…………………………………………………………………………....... 105 5.2.4. Koncentracija flavonoida…………………………………………………………………………………………. 108

5.3. Sezonske promjene istraživanih fizioloških parametara………………………………………………… 111 5.3.1. Pokazatelji oksidacijskog stresa

i antioksidacijski enzimi............................................................................................... 111 5.3.2. Fotosintetski aparat………………………………………………………………………………………………… 114 5.3.3. Koncentracije flavonoida………………………………………………………………………………………... 115

5.4. Morfološko-anatomske značajke lista i lokalizacija flavonoida……………………………………….. 116 5.4.1. Osnovna građa lista……………………………………………………………………………………………...... 117 5.4.2. Lokalizacija i koncentracija flavonoida u pojedinim dijelovima biljke………………………. 117

6. ZAKLJUČCI……………………………………………………………………………………………………………………………. 123 7. LITERATURA………………………………………………………………………………………………………………………….. 127 8. ŽIVOTOPIS………………………………………………………………………………………………………………………....... 143

ix

Popis kratica korištenih u disertaciji ABA apscizinska kiselina (Abscisic acid)

APS amonijev persulfat (Ammonium persulfate)

BCIP/NBT 5-bromo-4-kloro-3-indolilfosfat / nitrotetrazolijsko modrilo

BSA albumin iz goveđeg seruma (Bovine serum albumin)

CLSM konfokalni laserski pretražni mikroskop

(Confocal laser scanning microscope)

CPD ciklobutanski pirimidinski dimer (Cyclobutane pyrimidine dimer)

DTT ditiotreitol

EDTA etilendiamintetraoctena kiselina (Ethylenediaminetetraacetic acid)

EFM epifluorescencijski mikroskop (Epifluorescence microscope)

Fv/Fm efektivni prinos fluorescencije klorofila a

ΔF/F'm optimalni prinos fluorescencije klorofila a

HPLC tekudinska kromatografija visoke djelotvornosti

(High performance liquid chromatography)

HSP proteini toplotnog šoka (Heath stress proteins)

IAA indol-3-octena kiselina (Indole-3-acetic acid)

LHC II kompleks za prikupljanje svjetlosti fotosistema II (Light harvesting complex II)

NPQ nefotokemijsko gašenje fluorescencije klorofila a (Non-photochemical quenching)

NR otopina 2-amino-etil-difenilborne kiseline u etanolu (Naturstoff reagens)

NBT nitrotetrazolijsko klorid modrilo (Nitrotetrazolium blue chloride)

OEC kompleks za fotooksidaciju vode (Oxygen evolving complex)

PAR fotosintetski aktivno zračenje (Photosynthetically active radiation)

PBS natrij-kalij fosfatni pufer (Phosphate buffered saline)

PPFD gustoda svjetlosnog toka (Photosynthetic photon flux density)

PQ fotokemijsko gašenje fluorescencije klorofila a (Photochemical quenching)

PSI/II fotosistem I/II (Photosystem I/II)

PUFA polinezasidena masna kiselina (Polyunsaturated fatty acid)

PVP polivinilpirolidon

ROS reaktivni oblici kisika (Reactive oxygen species)

RuBisCO ribuloza-1,5-disfosfat-karboksilaza-oksigenaza

SDS natrijev dodecil sulfat (Sodium dodecyl sulphate, SLS: Sodium lauryle sulphate)

SEM pretražni elektronski mikroskop (Scanning electron microscope)

TEMED tetrametiletilendiamin (Tetramethylethylenediamine)

TGA privremeni zastoj u rastu (Transient growth arrest)

Tris tris (hidroksimetil) aminometan, TRIS ili THAM

UV ultraljubičasto zračenje (Ultraviolet)

http://en.wikipedia.org/wiki/Pyrimidine_dimers#Cyclobutane_photodimers

x

SI kratice, izrazi i pojmovi korišteni u disertaciji

Fizičke veličine i jedinice u ovome radu iskazane su prema Međunarodnom sustavu mjernih jedinica, SI (Système international d'unités). Iako SI sustav jedinica preporučuje izražavanje molarne koncentracije u [mol m-3], koncentracije kemikalija korištenih u pokusima izražene su uvriježenim kraticama molarnosti, npr. M, mM, µM. HRVATSKI I MEĐUNARODNI IZRAZI

U radu sam koristio dostupne hrvatske nazive za uređaje i laboratorijski pribor, uz uvriježene međunarodne kratice. Npr. uz opdepoznatu međunarodnu (englesku) kraticu SEM (Scanning electron microscope), koju nisam prevodio, koristio sam hrvatski naziv pretražni elektronski mikroskop. Pojedine međunarodne pojmove, poput DNA i protein, nisam prevodio. POJAM KONCENTRACIJA u prikazima rezultata Jedinica koja iskazuje masu određene tvari ili sastavnice u ukupnoj masi smjese, izvedena je SI jedinica i naziva se „masenim omjerom” (engl. mass fraction). Bududi da se u pokusima biljne fiziologije određena tvar iz biljnog tkiva određene mase ekstrahira odgovarajudim otapalom, može se smatrati da konačni rezultat predstavlja dio masene koncentracije smjese (masa tvari ekstrahirana u određenom volumenu otapala). Stoga se u radovima mnogih istaknutih domadih i stranih časopisa kod prikazivanja takvih rezultata redovito koristi pojednostavljeni izraz „koncentracija”, a takav stav zauzet je i u ovome radu. Pojam „sadržaj” koristio sam isključivo pri opisivanju i kvantitete (količina) i kvalitete (sastav) tvari, npr. kod fotosintetskih pigmenata.

1. UVOD

Fiziološki odgovori velebitske degenije, Degenia velebitica (Degen) Hayek, na UV zračenje Uvod

1

Velebitska degenija, Degenia velebitica (Degen) Hayek, je vrsta našeg jedinog

monotipskog roda, koji pripada porodici krstašica (Brassicaceae). To je hrvatska

stenoendemična vrsta s prirodnim populacijama na južnom i srednjem Velebitu te na Kapeli, na

nadmorskim visinama do 1300 metara. Velebitska degenija je heliofit koji raste na

vapnenjačkim točilima i u pukotinama stijena izloženim intenzivnoj ljetnoj insolaciji. Zbog

nadmorske visine i kamenite podloge visoke reflektancije, staništa velebitske degenije izložena

su izrazitoj insolaciji, naročito ultraljubičastom (UV) zračenju. Zimi je sunčevo zračenje

smanjeno, ali je velebitska degenija izložena niskim temperaturama i oštrim vjetrovima.

Ekstremni životni uvjeti definiraju vrlo specifičnu ekološku nišu te vrste, kao i njezine

anatomsko-morfološke prilagodbe (Stevanovid i Vujnovid 1990). Stoga je velebitska degenija

posebna ne samo u taksonomskom smislu te kao stenoendem, ved i kao visokospecijalizirana

planinska vrsta s brojnim prilagodbama i mehanizmima koji joj omogudavaju preživljavanje u

surovim životnim uvjetima.

UV zračenje čini tek oko 9 % sunčevog zračenja koje dopire do površine Zemlje, ali ima

brojne negativne učinke na glavne stanične biomolekule poput DNA, proteina i lipida, što se

odražava na stanice, tkiva, organizme i čitave ekosisteme. Opsežna istraživanja štetnosti UV

zračenja, posebice onog srednjih valnih duljina (UVB zračenje), započinju početkom 80-ih

godina prošlog stoljeda, kad je uočeno smanjenje debljine ozonskog omotača iznad Antarktike i

stvaranje tzv. „ozonske rupe”, što je povezano s povišenjem koncentracije antropogenih plinova

klorofluorougljika (Farman i sur. 1985). U tim istraživanjima, koja su uglavnom bila provođena

izlaganjem biljaka povišenom UVB zračenju u laboratorijskim uvjetima, utvrđeni su izravni i

posredni učinci UV zračenja na biomolekule, stanične strukture i fiziološke procese, odnosno

identificirana su oštedenja i utvrđeni mehanizmi nastanka oštedenja (Davies 2000; Hollósy 2002;

Gill i Tuteja 2010).

Izravno, UV zračenje uzrokuje oksidaciju molekula DNA (Caldwell i sur. 1998),

aminokiselina (Khoroshilova i sur. 1990), proteina (Choi i Roh 2003) i lipida (Møller i sur. 2007),

što vodi njihovoj smanjenoj funkcionalnosti ili potpunoj inaktivaciji. Oštedenja biomolekula i

gotovo svih staničnih struktura, posebice membrana organela (Murphy i Wilson 1982; Gupta i

sur. 2008) te fotosintetskog aparata (Allen i sur. 1998; Larkum i sur. 2001), UV zračenje uzrokuje

i posredno jer dovodi do pojačanog stvaranja reaktivnih oblika kisika (ROS), visokoenergetskih,

kratko živudih i toksičnih molekula poput superoksidnog aniona, hidroksilnog radikala i

vodikovog peroksida. U stanicama se održava ravnoteža između tih pro-oksidanasa i

antioksidanasa poput antioksidacijskih enzima i neenzimskih antioksidacijskih spojeva.

Poremedaj ravnoteže u korist ROS vodi brojnim oštedenima i fiziološkim poremedajima, a takvo

stanje naziva se oksidacijskim stresom (Sies i Cadenas 1985).

Biljka se od povišenog UV zračenja, koje predstavlja stres, nastoji zaštititi na razne

načine. U obrani od UV zračenja sudjeluju zaštitne strukture epiderme, poput zadebljanja

kutikule, epikutikularnih voskova i epidermskih trihoma (dlaka), koje djelomično odbijaju

zračenje (Caldwell i sur. 1983; Holmes i Keiller 2002), a vedim dijelom ga apsorbiraju pomodu

ekstratilakoidnih pigmenata, tzv. „UV-filtara” (Karabourniotis i sur. 1998; Tattini i sur. 2007;

Solovchenko i Merzlyak 2008; Agati i sur. 2009). Najznačajnijim UV-filtrima smatraju se fenolni

spojevi, posebice flavonoidi i fenolne kisline, koji se u epidermi nalaze u visokim

koncentracijama i služe kao atenuatori, prigušivači UV zračenja (Agati i Tattini 2010).


2

Zaštitni mehanizmi od UV zračenja koje nije odbijeno ili atenuirano u epidermi uključuju

enzimske i neenzimske procese (Davies 2000; Hollósy 2002; Gill i Tuteja 2010). UV zračenje koje

prodre do osjetljivih fotosintetizirajudih tkiva mogu opet apsorbirati UV-filtri, naročito

flavonoidi, koji osim u epidermi mogu biti lokalizirani u vakuolama i kloroplastima (Agati i sur.

2007) te staničnoj jezgri (Feucht i sur. 2004). S obzirom na to da UV zračenje dovodi do

pojačanog stvaranja ROS, najvažnijim zaštitnim sustavom smatraju se antioksidacijski

mehanizmi u kojima sudjeluju enzimi za uklanjanje ROS, npr. superoksid dismutaza, katalaza i

askorbat peroksidaza, te neenzimski spojevi koji i sami izravno uklanjaju radikale, služe kao

enzimski kofaktori ili apsorbiraju i odvode suvišak svjetlosne energije, od kojih su najvažniji

askorbat, glutation i karotenoidi. Ovdje možemo ubrojiti i ved spomenute flavonoide koji osim

atenuacije imaju i antioksidacijske sposobnosti vezanja i neutraliziranja nekih radikala (Agati i

Tattini 2010). Bududi da preostali dio UV zračenja može dovesti do oštedenja molekule DNA,

proteina i lipida, za stanicu su od iznimne važnosti i procesi popravaka nastalih oštedenja,

naročito fotoreaktivacijski popravci molekula DNA te popravci lipida i proteina.

Hipoteze i ciljevi istraživanja

UV zračenje je jedan od najizraženijih stresnih čimbenika na staništima velebitske

degenije. U obrani od štetnih učinaka tog zračenja ključnu ulogu imaju fiziološki mehanizmi koji

kod te biljne vrste do sada nisu istraživani. Stoga sam u ovome radu istražio fiziološke odgovore

velebitske degenije na UV zračenje. Pokuse sam proveo na biljkama koje su, nakon rasta u

uvjetima sa smanjenim UV zračenjem, naglo izložene suncu (prirodnom UV zračenju). Dobivene

rezultate usporedio sam s rezultatima u biljaka stalno uzgajanih u uvjetima smanjenog kao i u

onih uzgajanih u uvjetima prirodnog UV zračenja.

U istraživanju utjecaja UV zračenja na velebitsku degeniju polazim od hipoteze da je ta

biljka visokospecijalizirani heliofit i kserofit prilagođen svjetlosnim uvjetima s intenzivnim UV

zračenjem Sunca te posjeduje razvijene morfološko-anatomske i fiziološke mehanizme zaštite

od UV stresa. Međutim, naglo izlaganje biljaka suncu koje nisu prilagođene UV zračenju može

izazvati oksidacijski stres i oštedenja biomolekula poput proteina i lipida, odnosno važnih

staničnih komponenti poput membrana i fotosintetskog aparata. Pojavu oksidacijskog stresa i

oštedenja staničnih struktura istražio sam određivanjem koncentracije vodikovog peroksida,

malondialdehida i proteinskih karbonila. Također sam istražio funkciju i moguda oštedenja

fotosintetskog aparata određivanjem ekspresije proteina RuBisCO, D1 i LHCII, sadržaja

fotosintetskih pigmenata te fluorescencijom klorofila a in vivo.

Kao odgovor na UV stres biljka može pojačati aktivnost enzimskih i neenzimskih

mehanizama zaštite, među kojima su izuzetno važni antioksidacijski enzimi i flavonoidi. Stoga

sam istražio sastav i aktivnosti antioksidacijskih enzima katalaze, askorbat peroksidaze,

gvajakol/pirogalol peroksidaze i superoksid dismutaze.


3

Bududi da flavonoidi djeluju i kao UV-filtri i antioksidansi, mogu se nalaziti u epidermi, ali

i epidermskim trihomima (dlakama) te u mezofilnim stanicama. Zbog toga sam lokalizirao

flavonoide u lisnim tkivima i istražio njihov sastav te promjene koncentracije nakon naglog

izlaganja pokusnih biljka UV stresu.

Intenzitet insolacije mijenja se tijekom dana i tijekom godine, što utječe na fiziološke

procese u biljkama. Stoga sam istražio dnevne i sezonske promjene u vrijednostima navedenih

fizioloških parametara kod dvogodišnjih biljaka koje su trajno uzgajane na pokusnoj plohi

izloženoj svim vanjskim uvjetima atmosfere i insolacije. Rezultati mogu ukazati na utjecaj drugih

abiotičkih čimbenika, poput niskih (jesenskih i zimskih) temperatura, na fiziološke odgovore

velebitske degenije.

Rezultati istraživanja mogu doprinijeti boljem razumijevanju mehanizama zaštite od UV

zračenja u heliofita poput velebitske degenije. Istraživanje enzimskih i neenzimskih

antioksidacijskih mehanizama pokazat de osjetljivost odnosno otpornost te biljke na stres

izazvan UV zračenjem te njenu sposobnost prilagodbe i oporavka, što može ukazati na ekološku

otpornost vrste.

2. LITERATURNI PREGLED

Fiziološki odgovori velebitske degenije, Degenia velebitica (Degen) Hayek na UV zračenje Literaturni pregled

5

2.1. Velebitska degenija

Velebitska degenija, Degenia velebitica (Degen) Hayek, smatra se najznamenitijom

biljnom vrstom hrvatske flore. Takva posebnost ponajprije je posljedica njezinog jedinstvenog

taksonomskog položaja, jer je to vrsta našeg jedinog monotipskog roda. Također, velebitska

degenija je stenoendem – svojta rasprostranjena na vrlo uskom području, tj. arealu, samo

unutar granica Hrvatske (Nikolid 2009.). Karakterističnim i uresnim izgledom listova, cvjetova i

plodova, velebitska degenija dobro je poznata vrtlarima amaterima, ali i profesionalnim

uzgajivačima, stručnjacima te znanstvenicima-botaničarima diljem svijeta.

Zbog tih odlika, velebitsku degeniju često nazivamo glavnim predstavnikom bogate

nacionalne flore i simbolom naših planina. U eko-fiziološkom smislu, fascinantna je široka

ekološka amplituda velebitske degenije i njezina prilagodba surovom planinskom staništu,

kojega karakteriziraju niske zimske temperature te ljetna žega, suša i pojačana insolacija. Za

uspješan rast i razvoj u takvoj ekološkoj niši potrebne su razne morfološke, anatomske i

fiziološke prilagodbe te mehanizmi zaštite i popravaka, dio kojih je istraživan u ovome radu.

2.1.1. Otkride i imenovanje

Velebitsku degeniju je kao nepoznatu svojtu prvi uočio Dr. Arpad Degen, istaknuti

mađarski botaničar, prilikom planinarenja i botaničkog istraživanja po Velebitu u srpnju 1907.

godine. Sa svojim suputnicima istraživao je teško pristupačne i slabo poznate kukove oko

Šugarske Dulibe na središnjem Velebitu, kada je na točilima Miljkovida kruga uočio zanimljivu

busenastu biljku s plodovima. Inače izvrsnom poznavatelju balkanske flore, Degenu je odmah

bilo jasno da se radi o nekoj nepoznatoj i neopisanoj vrsti za koju je smatrao da pripada rodu

gromotulja (Alyssum) ili gromotuljka (Vesicaria) iz porodice krstašica (Brassicaceae). U svom

herbaru privremeno ju je označio kao velebitsku gromotulju ili gromotuljku, Alyssum

velebiticum, odnosno Vesicaria velebitica.

Po povratku na sveučilište u Peštu, sakupljene uzorke pomno je proučio, usporedivši ih

sa svim poznatim predstavnicima spomenutih rodova, ali i drugim rodovima plemena

gromotulja (tribus Alysseae) koje rastu u Europi i zapadnoj Aziji. Rezultati komparativne

morfometrije doveli su ga do zaključka da se doista radi o potpuno novoj vrsti koja ne može

pripadati niti jednom do tada na našem kontinentu opisanom rodu plemena gromotulja. Iako je

bio izvrstan botaničar, Degen nije dovoljno dobro poznavao porodicu Brassicaceae te je na

temelju morfološko-anatomskih sličnosti s drugim vrstama istoga plemena pomalo brzopleto

zaključio da novootkrivena velebitska vrsta pripada endemičnom rodu Lesquerella iz Sjeverne

Amerike, što je objavio 1909. u članku pod nazivom „O otkridu predstavnika Lesquerella na

Velebitu” (Degen 1909), slika 1.


6

Slika 1. Precizan Degenov crtež novootkrivene biljke, objavljen u

članku 1909. godine (danas glavni motiv naslovnice časopisa Acta Botanica Croatica).

Degen neobičnu, malu eksklavu tog roda u Europi objašnjava tezom da je velebitska

gromotulja stara paleogenska vrsta koja je do nas stigla prije više desetaka (možda i stotina)

tisuda godina, dok su američko i europsko tlo još bili povezani. Ta je tvrdnja bila samo

pretpostavka i nije se temeljila na tadašnjim saznanjima iz područja biljne geografije i evolucije,

što to je uočio i ispravio ved idude godine August Hayek, jedan od najboljih botaničara tog doba.

Hayek je još bolje poznavao balkansku floru od Degena, a bio je i jedan od najvrsnijih stručnjaka

za porodicu krstašica, naročito rod gromotulja. I sam je proučio sakupljene uzorke i zaključio da

se radi o potpuno novoj svojti u europskoj flori, nikako pripadniku rodova Alyssum ili

Lesquerella, ved novom rodu i vrsti koju je, u čast svom kolegi i otkrivaču, nazvao Degenia

velebitica (Hayek 1910).

2.1.2. Opis vrste

Velebitska degenija po morfologiji je tipični pripadnik porodice Brassicaceae (Trinajstid

1985): raste kao niska, gusto busenasta (jastučasta) biljka čiji su vegetativni dijelovi srebrnkasto

sive boje (slika 2A), kojom je osobito dobro prikrivena na prirodnom staništu pa ju je teško

uočiti izvan razdoblja cvjetanja. Razgranjeni trajni podanak nosi brojne sterilne i fertilne izbojke.

Sterilni izbojci su kratki, s rozetom uskocrtastih listova koji su gusto obrasli trihomima, tj.

dlakama (slika 2C). Fertilni, do 10 cm visoki izbojci su nerazgranati, s gusto zbijenim listovima i

terminalnim cvatom (slika 2B) od nekoliko relativno velikih cvjetova (do 1 cm) intenzivno žute

boje (Domac 1993).


7

Pojedinu biljku resi mnoštvo takvih cvjetova ved od travnja (Šilid 1984), ovisno o

nadmorskoj visini i klimatskim prilikama, a u srpnju ju krase plodovi karakterističnog izgleda –

elipsoidne, mješinasto nadute komuščice, zbog zvjezdastih dlaka također srebrnasto-sive boje

(slika 2D). Zriobom, plod se otvara s dva zaklopca i oslobađa dvije plosnate sjemenke koje se

drže placente (slika 2E).

Slika 2. Velebitska degenija: habitus biljke (A), cvjetovi (B), listovi gusto obrasli

dlakama (C), zreli plodovi (D) i sjemenke (E).

2.1.3. Ekologija i zaštita

Velebitska degenija raste na vapnenjačkim točilima i u pukotinama stijena (Horvat 1930,

1931) koji su ljeti izloženi intenzivnoj insolaciji, a zimi vjetrovima zbog kojih najčešde manjka

trajna, zaštitna pokrivenost snijegom. Njezina staništa također karakteriziraju trajna isušivanja i

neuravnotežen režim vode te izuzetno male količine tla. Takvi ekstremni uvjeti definiraju

ekološku nišu te vrste, kao i njezine specifične anatomsko-morfološke prilagodbe. Među

najvažnijima su kseromorfna i heliomorfna građa listova i stabljike: gusti obraštaj

jednostaničnim zvjezdastim dlakama, kompaktan mezofil listova, razvijeno vaskularno tkivo,

brojne male puči te kratki i zadebljali internodiji stabljike, dobro razvijeni središnji provodni

elementi ksilema i izuzetno razgranat i dugačak korijen (Stevanovid i Vujnovid 1990).

Sve te prilagodbe omogudavaju velebitskoj degeniji preživljavanje u vrlo uskoj i

jednoličnoj ekološkoj niši s nepovoljnim hidro-morfološkim karakteristikama.


8

Velebitska degenija nastanjuje lokalitete Prekinuto brdo i Šugarska duliba na Velebitu

(Degen 1909; Kušan 1963; Strgar 1979; Trinajstid 1985), a od 1999. poznat je još i lokalitet

Tomišina draga na Velikoj Kapeli (Matijevid i sur. 1999). U sklopu projekta „Očuvanje krških

ekoloških sustava” (Karst Ecosystems Conservation – KEC) utvrđena je rasprostranjenost te

svojte na ukupno 4,8 ha s procijenjenih 37000 primjeraka (Šegulja i sur. 2005).

Obzirom na malobrojnost populacija i pretpostavku da se broj jedinki smanjuje otkako je

svojta prvi puta pronađena i opisana, velebitska degenija zaštidena je zakonskim aktima na

nacionalnoj i svjetskoj razini: u Crvenoj knjizi vaskularne flore Hrvatske ima status ugrožene

svojte (Šegulja i sur. 2005), od 1964. je zaštidena Zakonom o zaštiti prirode na svim prirodnim

staništima (NN 26/64), a od 2004. je zaštidena i Pravilnikom o sakupljanju samoniklih biljaka u

svrhu prerade, trgovine i drugog prometa (Anonymous 2004). Strategijom i akcijskim planom

zaštite biološke i krajobrazne raznolikosti Republike Hrvatske (NSAP) predviđena je izrada i

provedba akcijskog plana zaštite velebitske degenije (Kutle 1999). Velebitska degenija je

uključena kao osjetljiva vrsta (vulnerable, VU) u europsku (Anonymous 1991) i svjetsku Crvenu

listu (Walter i Gillett 1998). Svi lokaliteti na kojima rastu populacije velebitske degenije uvršteni

su među Botanički važna područja Hrvatske (Alegro i sur. 2010), a ona je jedna od malobrojnih

svojti naše flore koja zadovoljava sva tri kriterija utvrđivanja tih područja na europskoj razini

(ugroženost, endemičnost i važnost staništa).

Osim pasivne zaštite zakonskim aktima i izravne zaštite prirodnih populacija u okvirima

granica Nacionalnog parka Sjeverni Velebit te Parka prirode Velebit, stvoreni su uvjeti i za ex

situ programe zaštite uvođenjem svojte u kulturu in vitro (Pevalek-Kozlina i sur. 1999). No,

aklimatizacija vedeg broja tako uzgojenih biljaka na vanjske uvjete atmosfere u praksi se

pokazala problematičnom pa uzgoj velebitske degenije mikropropagacijom nije proveden. S

druge strane, zbog velikog postotka klijavosti sjemenki velebitske degenije (Naumovski 2005),

klasičan uzgoj pokazao se isplativim te je postao osnova za ex situ zaštitu te svojte u sklopu

Programa zaštite hrvatskih endemičnih biljnih svojti putem licenciranog uzgoja i prodaje u

Botaničkom vrtu Biološkog odsjeka Prirodoslovno-matematičkog fakulteta u Zagrebu

(Stamenkovid 2009; Stamenkovid 2010; Stamenkovid i sur. 2010).

Na temelju istraživanja genetičke raznolikosti populacija velebitske degenije (Mate

2009), predložene su i dodatne mjere zaštite, poput nadziranja i aktivne zaštite svih prirodnih

populacija, povremenog pradenja genetičke raznolikosti te uspostavljanja banke gena.

Nedavna molekularna istraživanja filogenije tribusa Alysseae, kojemu pripada i rod

Degenia, potvrdila su posebni taksonomski položaj te endemične svojte (Rešetnik 2011). U

istome radu također je potvrđen visok stupanj srodnosti velebitske degenije s trobridim

sjedcem, Fibigia triquetra (DC.) Boiss. ex Prantl, koji je ved ranije utvrđen na temelju

karakterističnih, zajedničkih morfoloških obilježja (Hayek 1910; Kušan 1963).

Spomenuta istraživanja ukazuju na važnost i vrijednost velebitske degenije u

nacionalnim, ali i svjetskim okvirima. Nažalost, još uvijek izostaju istraživanja ekologije i ukupne

biljne biologije te svojte, koja mogu biti od velikog značaja za aktivniji, dinamičniji pristup

očuvanja prirodnih populacija. U tom smislu, poseban značaj imala bi upravo istraživanja u

području fiziologije stresa, koja bi mogla ukazati na uzroke smanjivanja broja primjeraka u

populacijama te predložiti konkretne mehanizme zaštite.


9

2.2. Ultraljubičasto (UV) zračenje

2.2.1. Značaj UV zračenja za život na Zemlji

Ultraljubičasto zračenje ili ultraljubičasta svjetlost (UV zračenje) je elektromagnetsko

zračenje s valnim duljinama manjim od onih koje ima vidljiva svjetlost, a vedim od onih koje

imaju X-zrake, tj. u rasponu od 10 do 400 nm, odnosno energije fotona od 3 do 124 eV.

Elektromagnetski spektar UV zračenja se prema rasponu valnih duljina i pripadajudih energija

dijeli na deset osnovnih podkategorija, koje su navedene u tablici 1 (ISO-DIS-21348).

Do Zemlje dopiru tri osnovne kategorije UV zračenja. Ultraljubičasto A ili dugovalno

područje (UVA), s rasponom valnih duljina od 400 do 315 nm, čini 6,3 % ukupne dolazne

insolacije i uglavnom nema štetnog učinka na žive organizme. Ultraljubičasto B ili srednjevalno

područje (UVB), s rasponom valnih duljina od 315 do 280 nm, čini tek oko 1,5 % ukupnog

spektra, ali može imati čitav niz negativnih učinaka na biljke i životinje. Ultraljubičasto C ili

kratkovalno područje (UVC), s valnim duljinama od 280 do 100 nm, je izrazito štetno za žive

organizme, ali u normalnim okolnostima ne dopire do površine Zemlje.

UV zračenje je u vedem dijelu spektra neionizirajude, s iznimkom valnih duljina iznad 150

nm koje se u potpunosti apsorbiraju u gornjim dijelovima atmosfere. Sunce danas emitira valne

duljine u područjima UVA, UVB i UVC, i to je tek oko 9 % njegove ukupne energije zračenja.

Zemljin ozonski omotač odbija i apsorbira 97-99 % ukupno prispjelog sunčevog UV zračenja. Od

UV zračenja koje dospijeva do površine Zemlje oko 97 % je UVA, tek 1-3 % UVB, dok se UVC

zračenje u potpunosti apsorbira u donjim slojevima stratosfere i odgovorno je za stvaranje

molekula ozona (Hockberger 2002).

Sunčevo UV zračenje imalo je ključnu ulogu u evoluciji biljaka, a posredno i ukupnog

života na našem planetu. Pretpostavlja se da je sunčevo UV zračenje u Zemljinoj prošlosti, prije

oko 3,8 milijardi godina, bilo čak 10 000 puta jače od današnjeg. Ta visoka količina zračenja

Tablica 1. Podjela elektromagnetskog spektra ultraljubičastog zračenja prema valnim duljinama i energijama fotona, sukladno međunarodnom standardu (ISO-DIS-21348).

naziv kratica valna duljina (nm) energija fotona (eV)

UV dugovalno područje UVA 400-315 3,10-3,94

Blisko UV NUV 400-300 3,10-4,13

UV srednjevalno područje UVB 315-280 3,91-4,43

Srednje UV MUV 300-200 4,13-6,20

UV kratkovalno područje UVC 280-100 4,43-12,4

Daleko UV FUV 200-122 6,20-10,02

Vakuumsko UV VUV 200-100 6,20-12,4

Duboko UV LUV 100-88 12,4-14,1

Super UV SUV 150-10 8,28-124

Ekstremno UV EUV 121-10 10,2-124


10

utjecala je na stvaranje i gomilanje ozona u prebiološkoj paleoatmosferi (Canuto i sur. 1982),

što je uvjetovalo smanjeni utjecaj štetnih UV zraka kratkog i srednjeg vala i time omogudilo

evoluciju odvedenijih životnih oblika i početak života na kopnu (Lowry i sur. 1980). Prvim

kopnenim biljkama smatraju se primitivne mahovine, koje su najvjerojatnije evoluirale od

kopnenih, slatkovodnih zelenih algi, čije srodnike danas nalazimo u skupini parožina,

Charophyceae (Kenrick i Crane 1997; Mishler i sur. 1994). Još uvijek vrlo visoke vrijednosti UVB

zračenja tijekom paleozoika utjecale su na evoluciju i polimerizaciju kako jednostavnih

aromatskih amino-kiselina, koje su primitivnim kopnenim zelenim algama služile kao

apsorbirajudi filtri UVB zračenja, tako i odvedenijih fenolnih spojeva – fenolnih kiselina i

polifenola. Ti su spojevi preuzeli čitav niz uloga, od smanjivanja utjecaja štetnog UVB zračenja,

obrane od patogenih mikroorganizama, provođenja različitih signala, privlačenja oprašivača

(fenolne kiseline i flavonoidi), do obrane od predatora (tanini) te mehaničke potpore i vodnog

transporta (lignin). Neki od navedenih spojeva, nadasve flavonoidi, danas se intenzivno

proučavaju kao nezamjenjiva sastavnica mehanizama obrane od UV zračenja (Rozema i sur.

1997).

Iako je danas poznato da su se količina UVB zračenja na površini Zemlje, koncentracija

kisika u atmosferi i debljina ozonskog omotača mijenjali tijekom biološke povijesti Zemlje

(Rozema i sur. 2002), toj problematici počela se posvedivati velika pažnja tek osamdesetih

godina prošlog stoljeda. Tada je uočeno smanjenje debljine ozonskog omotača iznad Antarktike

i stvaranje tzv. ozonske rupe, što je povezano s povišenjem koncentracije antropogenih plinova

klorofluorougljika (Farman i sur. 1985). Redovita mjerenja debljine ozonskog omotača od

1980-ih godina upudivala su na 0,5 %-tno sniženje koncentracije ozona na svim zemljopisnim

širinama, s iznimkom ekvatorskog pojasa, i 5 %-tni porast UVB zračenja na Zemlji (WMO 2003).

Od 1995. zamijedeno je značajno smanjenje debljine ozonskog omotača iznad Arktika, što je

povezano s rastom temperature u donjim slojevima atmosfere, kao posljedica pojačanog efekta

staklenika posljednjih desetljeda 20. stoljeda (Shindell i sur. 1998; Rex i sur. 2004).

Takva saznanja potaknula su niz istraživanja učinaka povišenog UVB i UVA zračenja na

životinjske i biljne organizme, ali i proučavanje mehanizama zaštite i popravaka od molekularne

i stanične razine do specifičnih ekoloških prilagodbi. Projekcije i modeli smanjenja debljine

ozonskog omotača i porasta UV zračenja za Zemlji ukazivali su na mogude teške posljedice na

život na Zemlji, što je rezultiralo povedanjem javne svijesti i formiranjem međunarodne povelje

o očuvanju ozonskog omotača, tzv. Monteralskog sporazuma iz 1987. (Montreal Protocol 1987).

Povelja i legislativne odluke 196 zemalja potpisnica imaju za cilj postupno gašenje i zabranu

proizvodnje kemijskih tvari dokazano štetnog djelovanja na ozon U međuvremenu su

ustanovljene vede promjene u koncentracijama ozona iznad područja Sjeverne Amerike, Azije,

Australije i Europe (Jonson i sur. 2005), iako je od 1990-ih uočeno sniženje koncentracija štetnih

tvari poput klorofluorougljika (WMO 2003).

U posljednjih devet godina uočena je stabilizacija koncentracije ozona u atmosferi iznad

vedeg dijela planeta, a istraživanja Mädera i sur. (2010) i Eyringa i sur. (2010) taj oporavak

povezuju s pozitivnim učincima Montrealskog sporazuma. Međutim, istodobno je uočen stalan

rast površine ozonske rupe iznad Antarktike. Tako kontradiktorni podaci bacaju novo svjetlo na

metodologiju proučavanja i mjerenja koncentracije ozona u ozonskom sloju atmosfere. U

novijim revizijama dosadašnjih modela istraživanja (Weatherhead i Andersen 2006; Crutzen i


11

Oppenheimer 2007) ukazuje se na potrebe šireg pristupa, zbog čitavog niza međusobno

povezanih čimbenika koji mogu utjecati na stanje ozona u atmosferi, poput koncentracija

ugljikovog dioksida, vodene pare, metana i dušikovog oksida, tzv. stakleničkih plinova. Za

povedanje emisija tih plinova odgovorna je povedana poljoprivredna djelatnost, ali i vulkanska

aktivnost. Osim koncentracije stakleničkih plinova, na debljinu ozonskog omotača velik utjecaj

imaju i dinamika atmosfere te zračna strujanja i globalna kretanja temperature. Povezanost

aktivnosti Sunca, tj. pojave sunčevih pjega s promjenama koncentracije ozona u atmosferi ved

je prije utvrđena (Zerefos i sur. 1997). Na temelju tih saznanja danas je nemogude procijeniti u

kojoj su mjeri Montrealski sporazum i pad emisija klorofluorougljika i sličnih spojeva doprinijeli

recentnoj stagnaciji ili čak blagom oporavku ozonskog sloja iznad vedeg dijela Zemlje, ali se

smatra da s očekivanim znatnijim sniženjem koncentracija klorofluorougljika u atmosferi do

2050. godine nede dodi do popravka ozonskog omotača na razinu prije 1980-ih (Weatherhead i

Andersen 2006).

Od velikog je značaja javna rasprava na međunarodnoj razini i novi sporazumi regulacije

emisija stakleničkih plinova, koji se smatraju glavnim „krivcem” globalnog zatopljenja u 21.

stoljedu, a posredno, zbog rasta temperature, i „krivcem” za promjene u visini tropopauze

atmosfere te daljnjeg sniženja koncentracije atmosferskog ozona. Najvažnija takva povelja je

Sporazum iz Kyota (Kyoto Protocol 1997), povelja Okvirne konvencije Ujedinjenih naroda

otvorena za potpisivanje u Kyotu 1997. Protokol je stupio na snagu 2005. nakon što ga je

ratificirala Ruska federacija i tim je ostvaren potpis najmanje 55 % svjetskih zagađivača, tj.

proizvođača stakleničkih plinova poput ugljikovog dioksida, metana, dušikovog oksida,

fluoriranih ugljikovodika itd.

Iako za sada nije mogude predvidjeti budude stanje ozonskog sloja, a s tim u vezi i

intenzitet UV zračenja na Zemlji, sigurno je da de ono izravno ili posredno biti glavna odrednica

u opstanku ili nestanku brojnih biljnih i životinjskih vrsta, posebice onih visokospecijaliziranih za

uske ekološke niše koje su nastanili.

2.2.2. UV zračenje kao stresni čimbenik kod biljaka

Nakon naglih negativnih promjena u debljini stratosferskog ozonskog omotača, koje su

prvi puta primijedene krajem 1970.-ih, istraživanja su bila usmjerena na neposredne učinke tih

promjena na mnoge organizme pa tako i na biljke. U mnogim istraživanjima, poput onoga

Rozeme i sur. (1997), dokazano je da povedano UVB zračenje nije samo okolišni stresni

čimbenik, ved izravno i posredno uzrokuje razne morfološke i kemijske promjene kod biljaka. Te

promjene mogu imati ključan utjecaj na sastav biljnih zajednica u ekosistemu (Caldwell i sur.

1998). Prema istraživanjima Mandronicha (1992) čak i najmanje promjene stanja Zemljinog

ozonskog omotača mogu uzrokovati značajan porast biološki učinkovitog UV zračenja. To se

nadasve odnosi na UVB zračenje, jer 1 %-tno sniženje koncentracije ozona uzrokuje povedanje

UVB zračenja na Zemlji za 1,3-1,8 %, dok UVA zračenje u potpunosti prolazi kroz atmosferu i na

njega ozonski omotač ne utječe. Iz tih razloga predmet glavnine istraživanja bili su učinci

povedanog UVB zračenja na biljke. No neki najnoviji znanstveni doprinosi govore i o učincima

UVA zračenja, poput povišene koncentracije fotosintetskih pigmenata, UV-apsorbirajudih


12

flavonoida (Helsper i sur. 2003) i oštedenja fotosintetskog aparata (Turcsányi i Vass 2000).

Povedana sunčeva aktivnost može dovesti do povedanja ukupnog UV zračenja pa tako i UVA

zračenja, a upravo zato što nesmetano prolazi kroz atmosferu, štetne posljedice povedanja UVA

zračenja mogu biti značajne. Tako na primjer Holm-Hansen i sur. (1993) u proučavanju učinaka

zračenja valnih duljina od 290 do 400 nm na antarktički fitoplankton navode da je polovica

oštedenja uzrokovana upravo UVA zračenjem. U recentnim revizijama (Caldwell i sur 1998;

Hollósy 2002; Piri i sur. 2011) istraživanja UV zračenja na biljke iz 80-ih i 90-ih godina prošlog

stoljeda, koja su uglavnom bila temeljena na konceptu dozračivanja biljaka UVB lampama u

laboratorijskim uvjetima, skrede se pozornost na važnost terenskih istraživanja in situ ili na

vanjskim pokusnim plohama, gdje je dostupan čitav spektar sunčeva zračenja, a prati se utjecaj

povedanog UVB, UVA, ali i fotosintetski aktivnog zračenja (PAR).

Staništa velebitske degenije (smirena točila, kamenjari i pukotine stijena) stalno su

izložena intenzivnoj insolaciji, koja je pojačana zbog nadmorske visine, velikog broja vedrih

dana, refleksije UV i vidljivog zračenja od karbonatne podloge itd. U takvim uvjetima biljke su

izložene povedanim razinama UV zračenja, koje može imati negativne učinke na njihov rast i

razvitak. Pretpostavka je da visokospecijalizirane planinske vrste poput velebitske degenije

imaju brojne prilagodbe za obranu od UV zračenja, što im omoguduje preživljavanje u takvim

uvjetima stresa. UV zračenje mogude je jednostavno kontrolirati upotrebom UV filtrirajudih

folija, čak i na vanjskim pokusnim plohama. Stoga je istraživanje utjecaja UV zračenja kao

stresnog čimbenika na fiziološke procese velebitske degenije i utvrđivanje zaštitnih

mehanizama od UV zračenja bilo logičan izbor.

2.3. Učinci UV zračenja na biljni organizam

Povedano UV zračenje može, izravno ili posredno, izazvati oštedenja staničnih struktura

i poremedaje u biokemijskim procesima u stanici. Izravni štetni učinci na najznačajnije

biomolekule, nukleinske kiseline, aminokiseline i proteine, lipide, regulatore rasta i biljne

pigmente posljedica su apsorpcije energije UV zračenja. Zbog promjena u strukturi tih molekula

dolazi do oštedenja i disfunkcionalnosti staničnih membrana, fotosintetskog aparata te

opdenito promjena u građi stanice.

Spomenute molekule i stanične strukture ugrožene su i posredno uslijed oksidacijskog

stresa, tj. u uvjetima povišenih koncentracija reaktivnih oblika kisika i slobodnih radikala (ROS)

do kojih dolazi tijekom izlaganja UV zračenju. Štoviše, smatra se da vedinu oštedenja uzrokuju

upravo te molekule.

Brojne promjene na staničnoj i ostalim razinama ne moraju biti uzrokovane izravnim ili

posrednim oštedenjima, nego i regulacijskim procesima u sklopu adaptacijskog odgovora biljke,

koji se javlja u uvjetima manjih doza ozračenja (Caldwell i sur. 1998). Iako još nije u potpunosti

razjašnjeno na koji način biljne stanice „bilježe” povedanje UV zračenja i na koji način se taj

signal provodi, poznato je da ono utječe na gensku ekspresiju. Izravni i posredni učinci UV

zračenja na biljni organizam sažeti su na slici 3.


13

Slika 3. Izravni i posredni učinci UV zračenja na biljni organizam.

2.3.1. Izravni negativni učinci UV zračenja na biljnu stanicu

Učinci UV zračenja na biomolekule

Molekula DNA se smatra najosjetljivijom na UVB zračenje od staničnih biomolekula jer

samo jedan foton može prouzročiti oštedenja te molekule (Caldwell i sur. 1998). Apsorpcija UVB

zračenja dovodi do fototransformacije molekule DNA i stvaranja različitih fotoprodukata, od

kojih su najvažniji ciklobutanski pirimidinski dimeri (CPD) i pirimidin (6-4) pirimidinonski dimeri

(Cadet i sur. 1992). Gotovo 75 % ukupnih oštedenja molekula DNA su u obliku CPD (Pang i Hays

1991), ali su mogudi i lomovi lanaca DNA, delecije i insercije parova baza. Oštedenja molekule

DNA mogu uzrokovati mutacije tijekom replikacije (Jiang i Taylor 1993).

Aromatske aminokiseline fenilalanin, triptofan i tirozin te histidin, cistin i cistein

apsorbiraju UVB zračenje, što uzrokuje snažnu apsorpciju proteina pri 280 nm. UV zračenje

može uzrokovati oštedenje tirozina i triptofana (Khoroshilova i sur. 1990) ili fotooksidaciju

tirozina (Creed 1984). Iako cistein slabije apsorbira u UVB području, vede doze zračenja mogu

uzrokovati fotolizu i pucanje disulfidnih grupa i mostova, koji su izuzetno važni za tercijarnu

strukturu mnogih proteina (Creed 1984). Fotoliza aminokiselina i disulfidnih mostova dovodi do

izravne inaktivacije proteina, ukoliko do oštedenja dolazi u aktivnom mjestu (Prinsze i sur.

1990). Postoje dokazi i da čitavi protein može apsorbirati UV zračenje, a energija se prenosi do

aminokiselina u aktivnim mjestima enzima, npr. ribuloze-1,5-difosfat-karboksilaze-oksigenaze


14

(RuBisCO), RuBisCO aktivaze (Strid i sur. 1990; Choi i Roh 2003) i violaksantin de-epoksidaze

(Pfündel i sur. 1992). UV zračenje također je uzrokovalo promjene u dužini mikrotubula u

protoplastima vrste Petunia hybrida (Staxén i sur. 1993), koje su korelirane s promjenama u

trajanju staničnog ciklusa.

UV zračenje može uzrokovati fotokemijsku modifikaciju lipida koji sadrže izolirane ili

konjugirane dvostruke veze, ali oštedenja fosfo i gliko-lipida kao glavnih sastavnica staničnih

membrana, događaju se uglavnom u prisustvu kisika, tj. posrednim djelovanjem ROS (Kramer i

sur. 1991), što je detaljnije opisano u sljededem potpoglavlju.

Promjene u rastu, razvitku i cvjetanju biljke primijedene nakon izlaganja UV zračenju

mogu biti posljedica promjene u građi ili koncentraciji regulatora rasta. Fotolitička degradacija

indol-3-octene kiseline (IAA) dokazana je u klijanaca suncokreta izloženih povedanom UVB

zračenju (Ros i Tevini 1995), što je mogudi uzrok usporene ili zaustavljene elongacije stanica. S

druge strane, UV zračenje uzrokovalo je prekomjernu sintezu i povišenje koncentracije

giberelina u klijancima krastavca (Ballaré i sur. 1991) i etilena u klijanaca suncokreta (Ros i

Tevini 1995) te listovima duhana (Nara i Takeuchi 2002).

Učinak UV zračenja na pigmente fotosintetskog aparata istraživan je kod različitih vrsta i

ovisi o samoj vrsti i uvjetima pokusa. Visoke doze UV zračenja mogu oštetiti molekule

pigmenata, što dovodi do gubitka fotosintetskog kapaciteta biljke (Strid i sur. 1990; Jordan i sur.

1994). Zabilježene su promjene u omjerima koncentracija klorofila, u smislu sniženog omjera

koncentracija klorofila a i klorofila b (Smith i sur. 2000) i obratno, sniženog omjera

koncentracije klorofila b i klorofila a (Pfündel i sur. 1992; Marwood i Greenberg 1996; Barsig i

Malz 2000; Juozaitytė i sur. 2007). Iako nema pravilnosti u promjenama tih odnosa, prihvadeno

je mišljenje da nepromijenjena ili povišena koncentracija klorofila ukazuje na toleranciju biljke

na UV zračenje, dok sniženje koncentracija tih pigmenata upuduje na osjetljivost biljke na UV

zračenje. Zaštitni pigmenti poput karotenoida manje su osjetljivi na UV zračenje i njihove

koncentracije, nakon izlaganja UV stresu, ostaju nepromijenjene ili blago rastu (Barsig i Malz

2000; Carletti i sur. 2003; Liu i sur. 2005).

Učinci UV zračenja na membrane

Izravnim djelovanjem na proteine ili posredno, peroksidacijom lipida uslijed

oksidacijskog stresa, UV zračenje može narušiti strukturni integritet i funkcionalnost membrana

u stanici. Istraživanja su uglavnom usmjerena na promjene u transportu kroz membrane pa je

tako otkriveno da visoke doze UV zračenja uzrokuju oštedenja u dvosloju fosfolipida i pojačan

gubitak molekula iz stanice (Murphy i Wilson 1982), a izlaganje nižim dozama zračenja dovodi

do poremedaja u radu membranskih kanala i crpki. Oštedenja plazmatske membrane

(plazmaleme) uzrokom su gubitka kalijevih iona iz stanice, depolarizacije staničnog električnog

potencijala, sinteze vodikovog peroksida itd. (Strid i sur. 1990). Tilakoidne membrane

kloroplasta također su vrlo osjetljive na UV zračenje, koje uzrokuje promjene u broju, rasporedu

i građi grana i stroma tilakoida, povedanu ionsku propusnost tilakoida (Hollósy 2002) te

promjene u sastavu masnih kiselina lipida i strukturi proteinskih kompleksa (Gupta i sur. 2008).


15

Učinci UV zračenja na fotosintetski aparat i fotosintezu

Od čitavog niza molekula i struktura u stanici čini se da je upravo fotosintetski aparat

najosjetljiviji na UV zračenje, a eventualna oštedenja značajno doprinose ukupnim negativnim

učincima UV zračenja na biljni organizam. Ukratko su ved navedeni izravni učinci UV zračenja na

molekule pigmenata i tilakoidne membrane kloroplasta kao građevne sastavnice fotosintetskog

aparata, no UV zračenje negativno djeluje ponajprije na prijenos elektrona u procesima

fotosinteze.

Brojna istraživanja učinaka UV zračenja na fotosintetski aparat ukazuju na manju

osjetljivost fotosistema I (PSI), npr. u obliku inhibicije cikličke fosforilacije (Pang i Hays 1991) i

smanjenja broja oksidiranih molekula klorofila u reakcijskim centrima (Renger i sur. 1982), što

nije uzrokovalo vede poremedaje u procesu fotosinteze.

Na UV zračenje puno je osjetljiviji PSII, vjerojatno jer taj fotosistem, za razliku od PSI,

posjeduje vrlo osjetljivi metalo-proteinski kompleks za fotooksidaciju vode (Oxygen evolving

complex, OEC). Za takvu tvrdnju posebno su indikativna istraživanja anoksigenih fotosintetskih

purpurnih „ne-sumpornih” bakterija. Reakcijski centri tih bakterija, u građi i funkcioniranju

homologni PSII, ali koji ne sadrže OEC (Turcsányi i Vass 1998), vrlo su otporni na UVB zračenje

(Tandori i sur. 1996). Jezgru OEC čine ioni mangana koji kataliziraju oksidaciju vode. Ti su ioni

vezani za strukturni D1 protein putem manje proteinske jedinice veličine 33 kDa, važne za

održavanje pravilne katalitičke konformacije čitavog OEC. UV zračenje najvjerojatnije uzrokuje

oštedenja te proteinske podjedinice, zbog čega dolazi do promjene konformacije proteina i

inaktivacije OEC. Mogude je i izravno oštedenje veznih mjesta proteina sa sličnim posljedicama

oštedenja čitavog kompleksa. Ta oštedenja vidljiva su npr. u usporenom rastu varijabilne

fluorescencije (Kulandaivelu i Noorudeen 1983) i promjeni kinetike redoks reakcija (Larkum i

sur. 2001). Osim spomenutih sastavnica OEC, jaku apsorpciju u UV području pokazuju i drugi

prenositelji elektrona u PSII, naročito kinoni i tirozinski ostaci proteina D1 (Melis i sur. 1992;

Jansen i sur. 1998). Nadalje, opisana su UV zračenjem uzrokovana oštedenja proteina D1 (Trebst

i Depka 1990; Friso i sur. 1995) i D2 (Friso i sur. 1994), koji čine okosnicu reakcijskih centara

PSII. U puno manjoj mjeri može dodi i do oštedenja citokrom b6f-kompleksa, odgovornog za

prijenos elektrona između dva fotosistema (Strid i sur. 1990).

Jedna od osnovnih sastavnica PSII je proteinski kompleks za prikupljanje svjetlosti

(Light-harvesting complex, LHCII), koji ima važnu ulogu u apsorpciji svjetlosti i prijenosu

energije do reakcijskih centara, ali i građevnoj organizaciji tilakoida. U pokusima in vitro na

izoliranim tilakoidama kontinuirano UV zračenje uzrokovalo je prekid u funkcionalnoj vezi

između LHCII i PSII zbog smanjenja transkripcije cab gena koji kodiraju sintezu proteina CP43 i

CP47, važnih za vezanje molekula klorofila a/b (Jordan i sur. 1991; Jordan i sur. 1994).

Pojedini autori smatraju da bi UV zračenjem izazvana inhibicija rada fotosintetskog

aparata u čitavim listovima (in vivo) u najvedoj mjeri mogla biti posljedica promjena u

koncentraciji i aktivnosti enzima RuBisCO (Allen i sur. 1997; Allen i sur. 1998). RuBisCO je enzim

koji sudjeluje u prvim reakcijama Calvinovog ciklusa i jedan je od najrasprostranjenijih pa i

najvažnijih enzima na Zemlji. Pojačano UV zračenje uzrokuje smanjenje aktivnosti tog enzima

(Strid i sur. 1990), što je korelirano sa sniženjem koncentracija mRNA tog enzima i sniženjem

koncentracija obiju proteinskih podjedinica (14 kDa i 55 kDa) koje ga čine (Jordan i sur. 1992).


16

Slično sniženje koncentracije i smanjenje aktivnosti opisano je i za enzim ATP-sintetazu, koji je

uklopljen u membrane grana-tilakoida (Zhang i sur. 1994), a koji katalizira fosforilaciju molekula

ADP-a, koristedi kao pokretačku silu protonski gradijent iz lumena tilakoida u stromu

kloroplasta.

Do poremedaja u procesima fotosinteze može dodi i indirektno, zbog UV zračenjem

izazvanog zatvaranja puči i smanjene izmjene dišnih plinova te anatomskih promjena u

listovima (Hollósy 2002).

2.3.2. Posredni negativni učinci UV zračenja na biljnu stanicu

Smatra se da UV zračenje ima najjači izravni učinak na molekule DNA i neke proteine, no

najvedi dio oštedenja u stanici posljedica su povišenih koncentracija reaktivnih oblika kisika

(Reactive oxygen species, ROS). ROS su visokoenergetske, kratko živude i toksične molekule

aktiviranog kisika koji su svojevrsni intermedijeri u procesu redukcije molekularnog kisika u

vodu (Caldwell i sur. 1998; Hollósy 2002; Gill i Tuteja 2010). Najznačajnijim ROS smatraju se

singletni kisik (1O2), superoksidni anion (O2·-), vodikov peroksid (H2O2) i hidroksilni radikal (OH·).

ROS su postali dijelom fizioloških procesa u stanicama još prije 2,7 milijardi godina, u

počecima evolucije fotosintetskih organizama, koju je pratilo nagomilavanje molekularnog

kisika u atmosferi (Halliwell 2006). Kisik je isprva bio otrovni nusprodukt fotosinteze vodenih

fotoautotrofa, zatim i kopnenih organizama, a kasnije u evoluciji imat de nezaobilaznu ulogu u

životu obligatnih aerobnih organizama, bududi da se enzimskom redukcijom kisika iz hrane

mogu crpiti velike količine energije. Unatoč takvoj adaptivnoj evoluciji i važnosti kisika za živi

svijet, ostaje činjenica da je kisik vrlo otrovan i opasan element, a ta dilema istovremene

otrovnosti i korisnosti nazvana je „paradoksom kisika” (Davies 1995).

ROS se stalno stvaraju kao nusprodukt raznih metaboličkih procesa u nekoliko staničnih

kompartimenata, od kojih su najznačajniji kloroplasti, mitohondriji i peroksisomi. U stanju

stanične homeostaze, višak ROS uspješno se uklanja putem enzimskih i neenzimskih

antioksidacijskih mehanizama (Foyer i Noctor 2005). Pri ravnotežnim koncentracijama ROS

imaju značajnu ulogu u održavanju redoks ravnoteže u stanici i kao signalne molekule u

biosintezi stanične stijenke (Foyer 2002). No, to ravnotežno stanje može biti poremedeno

brojnim biotičkim i abiotičkim stresnim čimbenicima, poput povedanog UV zračenja. Stresni

čimbenik uzrokuje izravna oštedenja staničnih struktura ili funkcionalne poremedaje u staničnim

kompartimentima, što izaziva povedano stvaranje ROS i/ili negativno djeluje na sastavnice

antioksidacijskog sustava. Stanje stanice u kojem je koncentracija ROS premašila kapacitet

mehanizama za uklanjanje tih staničnih otrova, odnosno „poremedaj u ravnoteži prooksidanasa

i antioksidanasa, u korist prooksidanasa” Helmut Sies 1985. godine nazvao je oksidacijskim

stresom (Sies i Cadenas 1985; Sies 1997). Pojam oksidacijskog stresa danas je proširen i

podrazumijeva ne samo disbalans u koncentracijama ROS i antioksidanasa u stanici, ved i

poremedaje u regulaciji i kontroli redoks reakcija te oštedenja biomolekula i glavnih građevnih

dijelova stanice (Gill i Tuteja 2010).


17

Najvažniji ROS i mehanizmi nastanka u biljnim stanicama

Zbog bioenergijskih reakcija koje se odvijaju tijekom fotosinteze, stalnog prisustva

molekula kisika, količine receptora svjetlosne energije te koncentracije polinezasidenih masnih

kiselina u ovojnici kloroplasta, smatra se da su biljke podložnije stanju oksidacijskog stresa, u

usporedbi s ostalim organizmima. Molekularni kisik nalazi se u tripletnom stanju, odnosno

posjeduje dva nesparena elektrona paralelnih spinova, i stoga je relativno stabilna molekula

koja ne reagira s vedinom organskih molekula u stanici. No, zbog dva nesparena elektrona on je

također i biradikal, koji se lako aktivira apsorpcijom energije (divalentna redukcija) ili

primanjem elektrona (monovalentna redukcija). U kompleksima za prikupljanje svjetlosti (LHC)

kojima je narušena struktura, zaštitni karotenoidni pigmenti nisu u stanju učinkovito odvoditi

suvišak apsorbirane svjetlosne energije s pobuđenih molekula klorofila reakcijskih centara

(nefotokemijsko gašenje). To je uzrokom stvaranja tripletnog stanja molekule klorofila, koja

suvišak energije prenosi na spin jednog od dva elektrona molekularnog kisika (divalentna

redukcija), čime nastaje singletni kisik. Singletni kisik (1O2) jaki je oksidans koji može oksidirati

čitav niz biomolekula u stanici i smatra se glavnim uzročnikom inaktivacije PSII u uvjetima jakog

svjetlosnog stresa, što može potaknuti staničnu smrt (Krieger-Liszkay i sur. 2008).

Tijekom svjetlosnih reakcija fotosinteze molekularni kisik, zbog opteredenja

transportnog lanca elektrona PSI, može poslužiti kao akceptor elektrona, pri čemu nastaje

superoksidni radikal (O2·-). Tok elektrona najčešde je preusmjeren s feredoksina, koji izravno

reducira molekularni kisik (monovalentna redukcija) u tzv. Mehlerovoj reakciji. „Višak”

elektrona u transportnom lancu elektrona može biti posljedica nesrazmjera stvaranja krajnjeg

produkta svjetlosnih reakcija, NADPH, i brzine njegove oksidacije u reakcijama strome (Elstner

1991). Superoksidni radikal može spontano ili katalitički, uz pomod enzima superoksid

dismutaze, dismutirati (primajudi elektron i dva protona) u vodikov peroksid.

Vodikov peroksid (H2O2) najstabilniji je od svih ROS i u ravnotežnom stanju sudjeluje kao

signalna molekula u nizu regulatornih procesa, poput poticanja tolerancije na razne biotičke i

abiotičke stresove, te fizioloških procesa kao što su senescencija, fotorespiracija, otvaranje puči

i opdenito rast i razvitak biljnog organizma (Gill i Tuteja 2010). Povišena koncentracija H2O2

izaziva jaku peroksidaciju lipida tilakoida i ovojnice kloroplasta te ostala oštedenja (Elstner

1991), a vodi čak i ka smrti stanice (Quan i sur. 2008). Nagomilavanje superoskidnog radikala

dovodi do stvaranja reaktivnijih oblika, poput hidroksilnog radikala (OH·).

Hidroksilni radikali nastaju u tzv. Haber-Weissovoj i Fentonovoj reakciji, u kojima

superoksidni radikal donira elektron ionu Fe3+ pri čemu nastaje Fe2+, a koji zatim reducira

vodikov peroksid. Hidroksilni radikal najjači je oksidans s najvedom toksičnosti za stanicu od svih

ROS. Zbog neselektivnosti i reaktivnosti teško difundira kroz stanicu, a potencijalno može

reagirati sa svim biomolekulama i strukturama stanice, poput DNA, lipida, proteina i membrana.

Kako u stanicama nema mehanizma za eliminaciju tog radikala, povišena koncentracija izaziva

smrt stanice (Vranova i sur. 2002; Halliwell 2006).

Pri niskim vrijednostima pH moguda je i protonacija superoksidnog radikala, čime

nastaje vrlo snažan reducens, perhidroksilni radikal (HO2·), no pri fiziološkim vrijednostima pH

njegove su koncentracije gotovo beznačajne.


18

Izvori ROS u biljnim stanicama

Najvedim izvorom ROS u biljnoj stanici smatraju se kloroplasti (Mano 2002; Mittler i sur.

2004), zbog stalnog stvaranja molekularnog kisika koji se lako aktivira u superoksidni radikal ili

singletni kisik. Kao što sam naveo, glavna mjesta nastanka ROS u kloroplastu su LHC (pretvorba

O2 u 1O2) i transportni lanci elektrona u PS i PS (monovalentna redukcija O2 u O2·-). Do

stvaranja u O2·- može dodi i u kompleksu za fotooksidaciju vode PS , a H2O2 nastaje u

peroksisomima kao nusprodukt niza reakcija tijekom fotorespiracije.

Peroksisomi, male stanične vezikule obavijene jednostrukom membranom, mogu se

smatrati glavnim oksidacijskim središtem stanice te u normalnom metaboličkom stanju važnim

izvorom ne samo H2O2, ved i O2·- (npr. u oksidaciji ksantina i hipoksantina do mokradne kiseline

pomodu ksantin-oksidaze, Corpas i sur. 2001).

Uz kloroplaste i peroksisome, najznačajniji izvor ROS u biljnoj stanici su mitohondriji.

Mitohondriji, organeli u kojima se odvija stanično disanje, također posjeduju transportni lanac

elektrona, čije sastavnice mogu reducirati molekularni kisik do superoksidnog radikala. U 1-5 %

mitohondrijske potrošnje kisika, dismutacijom superoksidnog radikala nastaje H2O2 (Møller

2001), a daljnjim reakcijama hidroksilni radikal koji uzrokuje oštedenja mitohondrijske ovojnice i

ostalih dijelova stanice (Møller i sur. 2007). Osim navedenih organela, ROS u manjoj mjeri

nastaju i u ostalim staničnim kompartimentima, kao što su apoplast, endoplazmatski retikulum,

glioksisomi i citoplazma.

Učinak ROS na molekulu DNA, proteine i lipide

Osim izravno, UV zračenje na biomolekule u stanici djeluje i posredno, uzrokujudi stanje

oksidacijskog stresa i povišenu koncentraciju ROS. Najvažnijima se smatraju oštedenja DNA,

lipida i proteina. Molekula DNA podložna je ne samo izravnom djelovanju UV zraka, ved i

„spontanim” oštedenjima koja izazivaju ROS. Najreaktivniji radikal, OH·, uzrokuje oštedenja

purinskih i pirimidinskih baza te deoksiriboze, dok singletni kisik uglavnom ošteduje guanin.

Uslijed tih oštedenja dolazi do lomova lanca DNA, stvaranja dimera, delecije i modifikacije baza,

što ima razne daljnje negativne fiziološke učinke (Tuteja i sur. 2001).

Smatra se da su najveda i najznačajnija oštedenja u živoj stanici posljedica peroksidacije

lipida. Lipidna peroksidacija često se uzima kao glavni pokazatelj oksidacijskog stresa i razine

oštedenja membrana. Do peroksidacije lipida dolazi kad koncentracija ROS u stanici premaši

ravnotežne vrijednosti do te mjere da mehanizmi za uklanjanje nisu u stanju dovoljno brzo

ukloniti njihov suvišak. Slijedi narušavanje fizioloških procesa u stanici i pogoršanje

oksidacijskog stresa kroz stvaranje lipidnih radikala (Montillet i sur. 2005). Peroksidaciji su

najviše podložne polinezasidene masne kiseline („polyunsaturated fatty acids”, PUFA) linolna i

linolenska kiselina, koje su najzastupljenije u sastavu galaktolipida tilakoidnih membrana,

odnosno fosfolipida svih ostalih staničnih membrana. Nakon „napada” singletnog kisika ili

hidroksilnog radikala te kiseline se transformiraju i stvaraju složenu smjesu lipidnih radikala.

Sam proces peroksidacije odvija se u tri koraka: (1) inicijacija, (2) propagacija i (3) terminacija.

Tijekom inicijacije ROS oduzima atom vodika acilnom lancu nezasidene masne kiseline u sastavu


19

PUFA, čime nastaje radikal masne kiseline (lipidni alkilni radikal). U aerobnim uvjetima, lipidni

radikal reagira s tripletnim (molekularnim) kisikom i tvori lipidni peroksidni radikal, koji dalje

propagira lančanu reakciju peroksidacije, oduzimajudi atome vodika susjednim masnim

kiselinama, čime nastaje lipidni hidroperoksidni radikal. Posljednji je vrlo nestabilan i u

prisustvu željeza ili drugih metalnih katalizatora stupa u Fentonovu reakciju, čime nastaju lipidni

aloksiradikali. U lančanoj reakciji izazvanoj oštedenjem samo jedne masne kiseline, nastaju

brojne molekule raznih radikala koji „šire” oštedenja duž membrane. Proces završava kad

nastali radikali međusobno reagiraju i stvaraju stabilnije spojeve poput malondialdehida, raznih

alkana i alkohola, koji se uzimaju kao indikatori peroksidacije lipida, odnosno oštedenja

membrana i oksidacijskog stresa (Davies 2000). Produkti raspada navedenih spojeva, posebice

aldehida, mogu u daljnjim reakcijama konjugirati s molekulama DNA i proteinima, mijenjajudi

im strukturu i funkciju. Posljedice peroksidacije membranskih lipida su smanjena membranska

fluidnost, promjena u organizaciji fosfolipidnog dvosloja, povedana propusnost za ione koji

inače ne ulaze u stanicu, a koji mogu uzrokovati oštedenja membranskih proteina, proteinskih

kanala, staničnih receptora, enzima itd.

Osim oštedenja lipida, značajna su i oksidacijska oštedenja staničnih proteina.

Oksidacijom proteina podrazumijeva se kovalentna modifikacija koju inducira ROS ili neki

produkt oksidacijskog stresa, a koja je ireverzibilne prirode, s iznimkom nekoliko aminokiselina

koje sadrže sumpor. ROS izravno oksidiraju proteine koji sadrže aminokiseline sa sumporom, a

najpodložnije su cistein i metionin. Aktivirani kisik može ukloniti vodikov atom iz cisteinskih

ostataka, formirajudi tiolni radikal koji s drugim takvim radikalom formira disulfidni most

(Hancock i sur. 2006). U alternativnom putu, kisik se može vezati za metioninski ostatak tvoredi

metionin sulfoksidni derivat (Sadanandom i sur. 2000). Najčešdom ireverzibilnom modifikacijom

proteina smatra se karbonilacija. Oksidativna karbonilacija je složeni proces koji je uglavnom

usmjeren na aminokiseline prolin, treonin, lizin i arginin, a vjerojatno uključuje metalnim ionom

kataliziranu aktivaciju vodikovog peroksida u reaktivniju molekulu ROS putem Fenton-ove

reakcije. Nastali superoksidni ili hidroksidni radikal u stanju je oksidirati aminokiselinske ostatke

proteina (Stadtman 1986), čime nastaju proteinski karbonilni derivati. Ti su derivati relativno

stabilne molekule koje trajno mijenjaju građu i funkciju važnim proteinima pa je karbonilacija

proteina jedan od najčešdih markera oksidacijskog stresa.

Iako su povišene koncentracije proteinskih karbonila i oksidiranih produkata PUFA, kao i

različitih ROS neosporno povezane sa stanjem oksidacijskog stresa i oštedenjima u stanici,

novija istraživanja pokazuju da su neki od tih spojeva uključeni u brojne regulacijske procese,

što potvrđuje dvostruku prirodu korisnosti, odnosno štetnosti ROS za živu stanicu. Biljke su kroz

evoluciju uspjele savladati toksičnost ROS razvijajudi mehanizme za njihovo uklanjanje, a zatim

su ih počele iskorištavati kao signalne molekule u procesima rasta i razvitka biljke. U stanicama

se precizno kontrolira stvaranje i uklanjanje ROS, čime upravlja složeni regulacijski sustav

sastavljen od receptora, signalnih molekula poput H2O2 i gena, zajednički nazivanih ROS gene

network (Mittler i sur. 2004). Neki produkti oksidacije proteina i masnih kiselina služe kao

sekundarne signalne molekule, koje su uključene u navedeni sustav regulacije ili pak potiču

prepoznavanje oštedenih biomolekula i njihovo odstranjivanje pomodu proteolitičkih enzima

(Møller i sur. 2007). S obzirom na dvostruku ulogu ROS i produkata njihova djelovanja na

biomolekule, osim pojma „oksidacijski stres” za stanje poremedene homeostaze, predlaže se i


20

pojam „oksidacijska signalizacija” za ravnotežno stanje ROS u stanici (Møller i sur. 2007).

Ukoliko je djelovanje stresnog čimbenika iznenadno, a njegovo trajanje i jačina nadilaze sve

zaštitne antioksidacijske mehanizme i mehanizme popravka, umjesto oporavka može dodi do

programirane smrti stanice, čime se žrtvuju najoštedeniji dijelovi tkiva u korist neoštedenih. U

najtežim slučajevima dolazi do nekroze stanica, značajnih oštedenja tkiva i ugibanja čitavog

organizma (Davies 2000; Møller i sur. 2007). Uloge ROS u fiziološkim procesima u ravnotežnom

stanju i u stanju stresa sažete su na slici 4.

Slika 4. Odnosi između sinteze ROS te njihovog uklanjanja, modifikacije, signalizacije i oštedivanja dijelova stanice u A) ravnotežnom stanju i B) stanju stresa (modificirano prema Møller i sur. 2007).

2.4. Zaštita od UV zračenja

Preduvjet za učinak UV zraka na biokemijske i fiziološke procese je njihovo prodiranje do

stanica i ciljnih molekula koje mogu apsorbirati energiju zračenja. Obzirom da su biljke sesilni

organizmi i ne mogu se skloniti od UV zračenja, morale su razviti čitav niz prilagodbi i načina

obrane od UV zračenja, ali i drugih stresnih čimbenika.

Biljke pri umjerenom i postupno rastudem UV stresu prilagodbom nastoje osigurati

dovoljnu koncentraciju zaštitnih spojeva kako bi se izbjegla veda oštedenja i stanje oksidacijskog

stresa. U tom smislu govorimo o adaptivnom odgovoru biljke na UV stres putem pojačane

regulacije (Davies 2000, Mittler i sur. 2004).

Prodiranje suviška sunčeva zračenja u manjem se dijelu ublažava zaštitnim strukturama

na površini listova koje odbijaju (reflektiraju) i upijaju, tj. prigušuju (atenuiraju) zračenje. Te

strukture naročito su svojstvene heliofitima i sklerofitima poput velebitske degenije.

Vedi dio zračenja ipak prodire u lisna tkiva i djeluje na neki od opisanih načina na

biomolekule i stanične strukture, bilo izravno ili posredno putem ROS u stanju oksidacijskog

stresa. U stanicama se nastoji održati ravnotežno stanje prigušivanjem UV zračenja i pojačanim


21

uklanjanjem viška ROS, u čemu sudjeluju enzimski i neenzimski mehanizmi zaštite. U ranim

istraživanjima učinka UV zračenja na žive organizme antioksidacijski sustav stanice smatrao se

jedinom i glavnom obranom od mogudih oštedenja izazvanih povišenim koncentracijama ROS.

No, pokusi u laboratorijskim uvjetima pokazali su da brzina nastajanja oštedenja vitalnih

dijelova stanice nadilazi pretpostavljene mehanzime zaštite i dovodi do smrti organizma. Na

temelju tih opažanja pretpostavljeno je, a zatim i dokazano, postojanje važnih mehanizama

popravaka.

2.4.1. Adaptivni odgovor biljke na UV zračenje

Na prirodnim staništima umjerenog klimatskog pojasa životni uvjeti nisu stalni, ved

postoje promjene u kvaliteti i kvantiteti pojedinih abiotičkih i biotičkih čimbenika. UV zračenje

oscilira tijekom godine, od vrlo niskog intenziteta zimi do izrazito visokog ljeti, a biljke kroz

stalnu prilagodbu fizioloških i metaboličkih procesa nastoje osigurati dovoljnu koncentraciju

zaštitnih spojeva kako bi se izbjegla veda oštedenja i stanje oksidacijskog stresa. Prilagodba se

stvara poticanjem kaskadnih reakcija unutar vrlo preciznog regulacijskog sustava, koje započinju

primanjem i prenošenjem stresnog signala (Frohnmeyer i Staiger 2003), a završavaju

ekspresijom ciljnih gena, odnosno sintezom zaštitnih spojeva. Takav adaptacijski odgovor biljke

na UV stres putem potaknute sinteze zaštitnih spojeva može se smatrati „prvom linijom” zaštite

od UV zračenja (Davies 2000).

S obzirom da se u procesu odgovora na različite vrste stresnih čimbenika koriste

zajednički signalni putevi i molekule, npr. poput H2O2, izlaganje jednom stresnom čimbeniku

potiče stvaranje otpornosti na druge stresne čimbenike (Pastori i Foyer 2002). Takav fiziološki

odgovor primijeden je u mnogim ranijim pokusima, npr. vodni stres potaknuo je otpornost na

niske temperature kod riže (Takahashi i sur. 1994), a solni stres inducira otpornost na hladnodu

u klijanaca krumpira i špinata (Keller i Steffen 1995). Umjerenim stresom izazvana tolerancija na

različite vrste i stupnjeve stresa, odnosno višestruka otpornost, nazvana je kros-tolerancijom

(Sabehat i sur. 1998). Mogude je da biljke koje rastu na staništima s velikim rasponima

vrijednosti abiotičkih čimbenika poput temperature, dostupnosti vode, zračenja Sunca itd.,

imaju razvijene mehanizme višestruke otpornosti kako bi se uspješno „obranile“ od negativnog

učinka ekstremnih vrijednosti tih čimbenika.

Adaptivnim odgovorima biljke na UV zračenje pripada i tzv. prolazno zaustavljanje rasta

(Transient growt arrest, TGA). Naime, jedan od najštetnijih izravnih učinaka UV zračenja jest

onaj na molekulu DNA koja je posebice ranjiva tijekom podjele stanice, kad je zbog replikacije

razmotana i bez zaštite histonskih proteina. Biljka pomodu specifičnih UV receptora stalno

prima informaciju o razini zračenja iz okoline te je u slučaju povedanja tog zračenja u

mogudnosti zaštititi svoja najvažnija tvorna tkiva. Prva reakcija na UV stres je djelomičan ili

potpuni prestanak aktivnosti u meristemskim tkivima, što je posljedica ranog odgovora

mitotske stanice na stres. U stanju TGA molekula DNA je u visoko kondenziranom obliku,

zaštidena histonskim i nehistonskim proteinima, replikacija je zaustavljena, a transkripcija i

translacija se obavljaju samo za nekoliko „stresnih” gena. Iako mehanizmi zaustavljanja


22

replikacije i sam proces TGA nisu posve jasni, poznato je da u njima sudjeluju odgovarajudi geni,

histoni i enzimi kromatin-oblikujude ATP-aze (Mlynárová i sur. 2007).

2.4.2. Zaštitne strukture

Zaštitne strukture nalaze se na površini biljnih organa, uglavnom listova, ali i

modificiranih stabljika (npr. kod kaktusa i mlječika). One su sastavni dio epiderme, a uključuju

razne trihome (dlake), zadebljanja kutikule te kutikularne voskove. Prodor UV zračenja do

osjetljivijih stanica, poput stanica mezofila lista, značajno je smanjen pomodu zaštitnih

struktura. Atenuacija UV zračenja pomodu zaštitnih struktura odvija se na dva načina; kod

vedine biljaka manji dio zračenja odbija se od spomenutih epidermskih struktura (refleksija UV

zračenja) pa govorimo o fizičkoj ili optičkoj atenuaciji, a vedi dio apsorbiraju odgovarajudi

ekstratilakoidni pigmenti, dakle kemijski atenuatori, koji se često nazivaju „UV filtrima”

(Caldwell i sur. 1983). Ti UV filtri lokalizirani su u gotovo svim lisnim tkivima i dijelovima stanice i

predstavljaju jedan od zaštitnih mehanizama, ali se njihova atenuacijska svojstva uglavnom

pripisuju epidermi, stoga su opisani o ovome potpoglavlju.

Odbijanje UV zračenja manje je istraživano od svojstava apsorpcije, vjerojatno zbog

činjenice da vedina biljaka koje su do sada proučavane pokazuje UV reflektanciju manju od 10 %

(Robberecht i sur. 1980), iako pojedine specijalizirane biljke mogu reflektirati čak do 70 %

upadnog UV zračenja (Caldwell i sur. 1983). Prema istraživanju na 45 različitih vrsta (Holmes i

Keiller 2002) vidljivo je da visok postotak reflektancije UV zračenja uzrokuje sloj epikutikularnih

vosokova na površini debelih, kožastih listova, dok dlakavi listovi slabije odbijaju zračenje u UV

području (do 12 %), a bolje u PAR području (do 18 %). Reflektancija UV zračenja kod dlakavih

listova ovisi o tipu dlake i samoj vrsti, a ukazuje na različiti stupanj prilagodbe i specijaliziranosti

biljke.

Dok u atenuaciji UV i PAR zračenja reflektancija ima manju ulogu, apsorpcija pomodu

specijaliziranih „prigušnih” molekula, koncentriranih u epidermi, ali i stanicama mezofila, puno

je značajnija. Do danas su utvrđene četiri skupine spojeva koje služe kao prigušni,

fotoprotektivni pigmenti: aminokiselinama nalik mikosporini (MAA) kod algi i cijanobakterija,

alkaloidi betalaini, karotenoidi i fenoli, od kojih su najvažniji fenolne kiseline, flavonoli i

antocijanini (Solovchenko i Merzlyak 2008).

Fenoli, sekundarni metaboliti raznolike strukture i različitih zaštitnih uloga u biljnom

organizmu, smatraju se najvažnijim UV filtrima kod viših biljaka. Visoke koncentracije tih

spojeva nađene su u listovima biljaka izloženih povišenom UV zračenju, u staničnim stijenkama i

vakuolama epidermalnih stanica (Agati i sur. 2009), mrtvim i žljezdastim epidermskim

trihomima (Tattini i sur. 2007), ali i u vakuolama stanica mezofila (Agati i sur. 2009),

kloroplastima (Agati i sur. 2007) i staničnoj jezgri (Feucht i sur. 2004). U osnovnoj strukturi

fenola nalazi se jedan ili više aromatskih prstenova (C6) na koji je vezana hidroksilna skupina (ili

više njih). Aromatski prsten odgovoran je za jaku apsorpciju u UVB području, a u apsorpcijskom

spektru (a. s.) svih fenola taj maksimum nalazi se na oko 280 nm. Drugi pik u a. s. nalazi se u

području 300-360 nm, a maksimum ovisi o samom spoju. Najznačajnijim fenolnim UV filtrima

smatraju se flavonoidi, i to flavonoli poput glikozida kvercetina, kempferola i luteolina, te


23

derivati fenolne cimetne kiseline, tzv. hidroksicinamati. Ti spojevi prisutni su u topivom obliku u

staničnim vakuolama, a netopivi oblici mogu biti „otopljeni” u lipidnim komponentama

membrana ili kovalentno i nekovalentno vezani za stanične stijenke (Karabourniotis i sur. 1998;

Tattini i sur. 2007; Agati i sur. 2009). Nova saznanja o sintezi i lokalizaciji flavonoida u lisnim

tkivima upuduju na njihovu važnu antioksidacijsku ulogu u fotoprotekciji stanice ne samo od UV,

ved i PAR svjetlosnog stresa (Agati i Tattini 2010).

2.4.3. Zaštitni mehanizmi

Zaštitni spojevi kojima se biljka brani od učinaka UV zračenja su enzimi ili neenzimski

spojevi, pa se načelno govori o enzimskim i neenzimskim sastavnicama zaštite od UV zračenja ili

enzimskim i neenzimskim mehanizmima zaštite, odnosno odgovorima na UV zračenje.

Najvažniji procesi zaštite od UV zračenja uključuju atenuaciju UV zračenja pomodu ved

spomenutih UV filtara (Karabourniotis i sur. 1998; Tattini i sur. 2007; Agati i sur. 2009; Agati i

Tattini 2010), uklanjanje ROS putem antioksidacijskih enzima (Davies 2000; Agrawal 2007; Gao i

Zhang 2008; Gill i Tuteja 2010) i neenzimskih spojeva (Hollósy 2002; Solovchenko i Merzlyak

2008) te mehanizme popravaka nastalih oštedenja (Hollósy 2002; Davies 2000).

Antioksidacijski enzimi

Antioksidacijske enzime nalazimo u svim stanicama aerobnih eukariota i oni se smatraju

najvažnijim čistačima ROS u stanici (Sies 1997).

Kao najvažniji antioksidacijski enzim u vedini objavljenih istraživanja navodi se

superoksid dismutaza (SOD), metaloenzim prisutan u svim staničnim kompartimentima

aerobnih organizama, koji katalizira dismutaciju dva superoksidna radikala u vodikov peroksid i

vodu (Asada i sur. 1973; Gill i Tuteja 2010). Tijekom evolucije razvila su se tri osnovna tipa SOD

koji se razlikuju po metalnim kofaktorima na aktivnim mjestima i po lokalizaciji unutar stanice:

Fe-SOD, Mn-SOD i Cu/Zn-SOD (Asada i sur. 1973). Otrovni produkt rada SOD je vodikov

peroksid, koji zahtijeva daljnju detoksikaciju i uklanjanje iz stanice.

Za uklanjanje vodikovog peroksida najvažniji su enzimi katalaze i peroksidaze. Katalaze

(CAT) su tetramerni enzimi koji sadrže prostetsku skupinu hem, a izravno kataliziraju

dismutaciju H2O2 na vodu i kisik. S obzirom na to da katalaze imaju visok afinitet za molekulu

H2O2, tj. jedna molekula katalaze može dismutirati oko 6 milijuna molekula H2O2 u minuti,

smatra ih se nezamjenjivima u detoksikaciji stanice tijekom oksidacijskog stresa (Gill i Tuteja

2010). Katalaze su uglavnom lokalizirane u peroksisomima i glioksisomima, gdje razlažu vodikov

peroksid nastao β-oksidacijom masnih kiselina, fotorespiracijom i katabolizmom purina.

Katalaze su vrlo osjetljive na svjetlost i u homeostatskom stanju stanice postoji ravnoteža

između fotoinaktivacije te propadanja molekula katalaze i popravaka te de novo sinteze.

Povedana aktivnost katalaza može biti indikator stresa i pojačane regulacije, ali djelovanje

stresnih čimbenika koji ometaju sintezu proteina, poput povišene temperature ili visoke


24

koncentracije teških metala i soli, može uzrokovati smanjenu aktivnost tog enzima (Hertwig i

sur. 1992; Perl-Treves i Perl 2002).

Peroksidaze (okisidoreduktaze vodikovog peroksida) su monomerni hem enzimi koji

kataliziraju oksidaciju određenih tvari u stanici, koristedi pritom H2O2 ili organski peroksid kao

supstrat (primatelj elektrona). Velik broj izoenzima peroksidaza nalazi se u različitim dijelovima

stanice te imaju različita obilježja i uloge, a svima im je svojstven još vedi afinitet prema H2O2 u

usporedbi s katalazama. Obzirom na fiziološke uloge i supstratnu specifičnost, razlikuju se dvije

skupine peroksidaza (Asada 1992). Skupini nespecifičnih peroksidaza pripadaju gvajakol i

pirogalol peroksidaza, koje H2O2 koriste u različitim oksidacijskim procesima, a kao donore

elektrona preferiraju aromatske spojeve poput gvajakola i pirogalola. Ti enzimi sudeluju u

razgradnji indol-3-octene kiseline (IAA) i imaju važnu ulogu u biosintezi lignina, zacjeljivanju

rana, obrani od patogena i uklanjanju otrovnih spojeva peroksida. Drugoj skupini pripadaju

važni antioksidansi askorbat peroksidaza (APX) i glutation peroksidaza (GPX), koji kataliziraju

redukciju H2O2 te lipidnog hidroperoksida, kao supstrat koristedi neenzimske antioksidanse

askorbat (ASH) odnosno glutation (GSH). APX je najvažniji enzim za detoksikaciju H2O2 u

kloroplastima i citosolu, ali se nalazi i u peroksisomima, glioksiomima i mitohondrijima (Gill i

Tuteja 2010). Redukcija H2O2 putem APX je primarna reakcija važnog askorbat-glutationskog

ciklusa ili tzv. Foyer-Halliwel-Asada ciklusa, u kojem sudjeluju još tri važna enzima:

monodehidroksiaskorbat reduktaza (MDAR), dehidroksiaskorbat reduktaza (DHAR) i glutation

reduktaza (GR).

Antioksidacijski neenzimski spojevi

Antioksidacijsku ulogu imaju i pojedini spojevi malih molekulskih masa koji čine

neenzimsku komponentu uklanjanja ROS iz stanice. Osim spomenutog askorbata i glutationa,

važni antioksidansi su i prolin, α-tokoferol, karotenoidi i flavonoidi (Gill i Tuteja 2010).

Askorbat, askorbinska kiselina ili vitamin C najzastupljeniji je topivi antioksidans koji se

nalazi u gotovo svim staničnim kompartimentima i tkivima. Osim sudjelovanja u

askorbat-glutationskom ciklusu, važan je kao enzimski kofaktor u ksantinskom ciklusu,

mehanizmu odvođenja suviška energije u fotosistemima u obliku topline, a sudjeluje i u sintezi

oksalata i tartarata, obnovi antioksidansa α-tokoferola, regulaciji stanične diobe itd.

Prolin je aminokiselina čije je uloga prvenstveno osmolitičke prirode, jer se njegovim

nakupljanjem u stanicama snizuje vodni potencijal i omoguduje upijanje vode iz tla, ali je

također važan antioksidans koji neutralizira singletni kisik i hidroksilne radikale, štiti membrane

i lipide od štetnih učinaka kod visokih koncentracija anorganskih iona te visokih temperatura.

α-tokoferol ili vitamin E lokaliziran je u tilakoidama kloroplasta, gdje sudjeluje u uklanjanju

radikala poput singletnog kisika, a tu antioksidacijsku sposobnost ima zbog tri metilne skupine u

svojoj molekularnoj strukturi. Doniranjem kationa vodika lipidnom radikalu može prekinuti

lančanu reakciju peroksidacije lipida.

Karotenoidi, lipofilni biljni pigmenti smješteni u plastidima fotosintetskih i

nefotosintetskih biljnih tkiva, imaju nekoliko zaštitnih uloga: u fotosistemima preuzimaju

suvišak energije s molekula klorofila i sprečavaju formiranje singletnog kisika, sudjeluju u


25

ksantofilskom ciklusu otpuštanja suviška energije kao topline kroz reverzibilnu pretvorbu

violaksantina u zeaksantin, vežu produkte lipidne peroksidacije i time mogu prekinuti lančanu

reakciju, ili pojačavaju djelovanje α-tokoferola u istim reakcijama.

Flavonoidima se pripisuje čitav niz zaštitnih i ostalih uloga, poput spomenute apsorpcije

suviška zračenja u UV i PAR područjima, ali i obrane od herbivora i patogena, pigmentacije

cvjetova i plodova, klijanja polena, sudjelovanje u prenošenju raznih signala itd. U recentnijim

istraživanjima dokazano je antioksidacijsko djelovanje flavonoida i njihova sposobnost

uklanjanja ROS izravno (Pourcel i sur. 2006) ili posredno, kelacijom iona metala (Smyk i sur.

2008) i smanjivanjem aktivnosti ksantin oksidaze, enzima odgovornog za stvaranje

superoksidnog radikala (Nguyen i sur. 2006).

Enzimski mehanizmi popravaka

Mehanizmi popravaka svrstavaju se, kao i antioksidacijski enzimi, u enzimske

mehanizme zaštite, iako se obično izdvajaju kao zasebi procesi kojima se nastoje ukloniti manja

ili veda oštedenja vitalnih biomolekula (Davies 2000; Hollósy 2002). Ti procesi popravaka mogu

se podijeliti na izravne popravke oštedenih biomolekula i posredne popravke, koji uključuju

procese prepoznavanja, izdvajanja i uklanjanja oštedenja te de novo sintezu i zamjenu oštedenih

(dijelova) molekula.

Procesi izravnih popravaka do sada su utvrđeni za nekoliko oksidiranih biomolekula, a

mehanizmi nisu posve razjašnjeni. UV zračenje uzrokuje oksidaciju aminokiselina, a kod onih

koje sadrže sumpor dolazi do stvaranja inter- i intramolekularnih disulfidnih mostova, što za

posljedicu ima smanjenu funkcionalnost ili potpunu inaktivaciju proteina. Ta oksidacijska

oštedenja djelomično su podložna popravcima (re-redukciji) pomodu enzima disulfid reduktaze i

metionin-sulfoksid reduktaze.

Najvažnijim izravnim popravkom može se smatrati prereplikacijski fotoreaktivacijski

popravak molekule DNA putem enzima fotoliaze (Pang i Hays 1991). Fotoliaza, koristedi energiju

vidljive svjetlosti kratkih valnih duljina, cijepa pirimidinske i ciklobutanske dimere baza u

molekuli DNA, nastale djelovanjem UV zračenja.

Osim fotoreaktivacijski, oštedenja na molekuli DNA popravljaju se i posredno,

ekscizijskim i rekombinacijskim mehanizmima koji uključuju enzime endo- i egzonukleaze.

Oksidirani proteini uglavnom nisu podložni popravcima, ved ih uklanjaju i prerađuju enzimi

proteaze, a oksidacija membranskih lipida također predstavlja trajno i nepopravljivo oštedenje,

koje uklanjaju enzimi poput fosfolipaze A2 i glutation peroksidaze. Nakon uklanjanja oštedenja,

slijedi de novo sinteza dijela ili čitave biomolekule te ugradnja na odgovarajude mjesto.

Zaštita ili obrana biljnog organizma od UV zračenja sažeta je u tablici 2.


26

Tablica 2. Obrana biljnog organizma od UV zračenja putem adaptivnog odgovora na stres, zaštitnim strukturama i zaštitnim enzimskim i neenzimskim mehanizmima.

Vrsta zaštite Sastavnica Mehanizam

ADAPTIVNI ODGOVORI

regulacijski sustav pojačana regulacija sinteza zaštitnih tvari, kros-tolerancija

DNA, histoni privremeni zastoj u rastu (TGA)

ZAŠTITNE STRUKTURE

epidermske modifikacije (kutikula, trihomi, voskovi…)

fizička (optička) refleksija UV zračenja i kemijska atenuacija (apsorpcija) UV zračenja

ZAŠTITNI MEHANIZMI

UV filtri apsorpcija UV zračenja

antioksidansi → enzimi (SOD, CAT, PAX, GR…) → neenzimske tvari (askorbat, glutation,

α-tokoferol, karotenoidi, flavonoidi…)

uklanjanje ROS

enzimski popravci → izravni popravci (fotoliaza, disulfid

reduktaza…) → posredni popravci (endo- i

egzonukleaze, proteosom, glutation peroksidaza…)

popravci reverzibilnih oštedenja biomolekula ili prepoznavanje i uklanjanje ireverzibilnih oštedenja te de novo sinteza

3. MATERIJALI I METODE

Fiziološki odgovori velebitske degenije, Degenia velebitica (Degen) Hayek na UV zračenje Materijal i metode

27

3.1. Materijali

3.1.1. Uzgoj, tretman i sabiranje biljnog materijala

U pokusima sam koristio čitave listove odraslih primjeraka velebitske degenije uzgojene

na vanjskim pokusnim plohama u Botaničkom vrtu Biološkog odsjeka PMF-a. Izbor „klasičnog”

pristupa u uzgoju (ex vitro) odgovara izboru ispitivanog stresnog čimbenika (prirodno sunčevo

UV zračenje) te nastojanju da vanjski uvjeti uzgoja što više odražavaju uvjete kakvi vladaju na

prirodnim staništima. Pokusne biljke uzgajane su na pokusnim plohama izloženim svim uvjetima

vanjske atmosfere, bez posebne zaštite tijekom ljetnih (sjenila) i zimskih mjeseci (zaštita od

hladnode), ali su zbog načina sadnje redovito zalijevane, kako bi se uklonio utjecaj vodnog

stresa.

Preduzgoj pokusnih biljaka

Zrele plodove (komuščice) velebitske degenije sakupio sam u lipnju i srpnju 2006. i 2007.

od matične populacije u trajnoj kulturi Botaničkog vrta. Biljke u matičnoj populaciji potječu od

sjemena sakupljenog prije desetak godina na prirodnim staništima, a u matičnom su klijalištu

izložene unakrsnom oprašivanju te se spontano razmnožavaju samousijavanjem i vegetativno,

nadzemnim vriježama. Klijalište čini ploha od oko 3 m2, ispunjena mješavinom ilovaste pjeskulje

i vapnenačke sipine, ograđene niskim betonskim zidom. Plodove sam nakon sabiranja u

papirnate vredice zbog dozrijevanja uskladištio na suhom i sjenovitom mjestu dva tjedna, nakon

čega sam probrao otpale sjemenke, pazedi na podjednakost u obliku, veličini i boji. Sjemenke

sam pohranio u papirnatim vredicama u sobnim uvjetima, do početka sjetve u rujnu.

Dozrele sjemenke sijane su površinski u drvene kutije, na mješavinu za klijanje

Klasmann TS1 (Klasmann-Deilmann GmbH, Njemačka), naknadno posipane malom količinom

sitnog kvarcnog pijeska te dobro zalivene rošenjem. Kutije su smještene u staklenik sa stalnim

uvjetima temperature i vlage ( 25 °C, 70 % relativne vlažnosti zraka) te je pradeno klijanje

sjemenki kroz mjesec dana.

Nakon klijanja i razvijanja, po tri klijanca visine 2-3 cm presađena su u plastične lončide

promjera 10 cm, ispunjene mješavinom supstrata za klijanje i vapnenačke sipine u omjeru 6:4.

Presađeni klijanci ostavljeni su u toplom stakleniku radi prilagodbe još tjedan dana, a potom su

premješteni u hladni staklenik (temperature 10-15 °C), na osvijetljeno mjesto sjeverne

ekspozicije bez izravnog sunčevog svjetla, kako bi se smanjio utjecaj UV zračenja. Jačina

zračenja je zbog takvog položaja te apsorbirajudeg svojstva stakla izrazito niska i iznosi

0,002-0,01 mW cm-2, što sam potvrdio prijenosnim UV metrom YK-35UV (Lutron Electronic

Enterprise Co. Ltd., Tajvan), pa se njegov utjecaj na biljke u preduzgoju može smatrati

zanemarivim.

Klijanci su u hladnom stakleniku uzgajani 20-30 dana, do pojave barem dva para pravih

listova te jačanja stabljike, nakon čega su mlade biljke smještene u vanjska klijališta radi

prezimljavanja ili su izravno posađene na pokusne plohe.

Fiziološki odgovori velebitske degenije, Degenia velebitica (Degen) Hayek na UV zračenje Materijali i metode

28

Uzgoj na pokusnim plohama

Dio biljaka uzgojen je na opisani način krajem 2007. godine, a nakon prezimljavanja u

vanjskim klijalištima 20 najrazvijenijih primjeraka zasađeno je krajem ožujka 2008. izravno na

pokusnu plohu za potrebe ispitivanja sezonskih promjena odabranih fizioloških pokazatelja,

nazvane „godišnji uzorak”. Pokusnu plohu činilo je klijalište površine 6 m2 ispunjeno

mješavinom listovke i vapnenačke sipine. Biljke su zasađene na jednakim razmacima (oko 30

cm) kako bi se mogli razviti cjeloviti i pravilni „buseni”. U klijalištu smještenom između zgrada

staklenika izravna sunčeva svjetlost dostupna je vedi dio dana (iznimka su kasnopopodnevni i

večernji sati od proljeda do jeseni te jutarnji i popodnevni sati od kasne jeseni do ranog proljeda

zbog položaja Sunca i zasjene okolnih zgrada). Biljke su tijekom uzgoja čitavo vrijeme izložene

vanjskim uvjetima atmosfere i insolacije te osim redovitog rošenja nad njima nije provođena

posebna briga kao npr. prihrana, tretiranje insekticidima, sjenjenje tijekom ljeta ili zaštita od

mraza i snijega (slika 5).

Slika 5. Razvijeni primjerci velebitske degenije u cvatu u klijalištu

„godišnjeg uzorka” 2011. godine.

Najvedi broj pokusnih biljaka (350 lončida s oko 1000 biljaka) uzgojen je tijekom rujna

2008. i zasađen u listopadu iste godine na pokusnu plohu za uzorkovanje u pokusu utjecaja

sunčevog UV zračenja na velebitsku degeniju, nazvanu „UV uzorak”. Zbog velikog broja

pokusnih biljaka i manjka odgovarajudeg osunčanog prostora u Botaničkom vrtu, biljke nisu

mogle biti posađene izravno u tlo kao kod „godišnjeg uzorka”. Stoga je izrađeno drveno

klijalište s uzdignutim stranicama visine 40 cm, koje je smješteno na terasi vrtlarskog objekta na

mjestu najizloženijem suncu i bez zasjene okolnih objekata. Stranice klijališta (okvir) postavljene


29

su na obrub od opeke i ispunjene mješavinom supstrata za klijanje (Klasmann TS1) s dodatkom

vapnenačke sipine. Lončidi s mladim biljkama usađeni su izravno u supstrat, u zbijenim

redovima. Uzdignuto klijalište omogudilo je odgovarajudu drenažu i normalan razvoj biljaka

nakon prokorjenjivanja iz lončida.

Klijalište je podijeljeno na tri osnovna dijela: prva dva odjeljka ograđena su bočnim

staklenim stjenkama te pokretnim staklenim poklopcima, dok je tredi odjeljak ostao neograđen.

Stakleni poklopci su sprijeda položeni i učvršdeni na rubu okvira klijališta u razini supstrata, a

straga na drvene držače visine 120 cm. Na taj način čine kosinu prema jugu i pružaju

odgovarajudu zaštitu od sunčevih UV zraka tijekom ljeta. Sjevernu stranu klijališta zimi je štitila

tek tanka drvena ploča s mnoštvom odušaka, koja je početkom ljeta uklonjena radi boljeg

prozračivanja. Sve staklene površine presvučene su prozirnom poliesterskom UV reflektivnom

folijom LLumar SCL SR PS4 (Llumar, Solutia Performance Ltd., SAD) debljine 100 m s učinkom

refleksije oko 99 % ukupnog UV zračenja i 90 % transmisije vidljivog spektra (slika 6).

Slika 6. Pokusno klijalište („UV uzorak”) s mladim biljkama u

odjeljcima zaštidenim od UV zračenja pomodu

reflektivne folije na staklenim plohama.

Biljke su u prva dva odjeljka bile izložene djelomičnoj insolaciji, zaštidene od UV zračenja

staklom presvučenim UV reflektivnom folijom (dalje u tekstu: UV folija). Međutim, zaštita nije

bila potpuna zbog svojstava UV folije i same reflektivne prirode sunčevog UV zračenja pa su do

početka uzorkovanja i tijekom pokusa biljke primile manju dozu UV zračenja, što je detaljnije

opisano u poglavlju 3.1.2. Biljke u tredem odjeljku bile su u potpunosti izložene insolaciji. Za

početak pokusa određena je druga polovica srpnja, kad je intenzitet UV zračenja najjači (prema

podacima Državnog hidrometeorološkog zavoda).


30

Tada je dio biljaka koje su do nultog dana pokusa rasle zaštidene od UV zračenja (drugi

dio klijališta), naglo izložen insolaciji uklanjanjem zaštitnih stakala s UV folijom. Te su biljke od

trenutka sađenja u zaštideni dio klijališta do početka pokusa (trenutka izlaganja prirodnoj

insolaciji) primile određenu dozu UV zračenja, ali su zatim naglo izložene vedim vrijednostima

UV ozračenja, pa je taj početak izlaganja stresnom čimbeniku označen nultim satom izlaganja

suncu i vrijednošdu primljene doze od 0 MJ m-2.

Uzorkovanje i pohrana biljnog materijala

S pokusnih biljaka ubirao sam zelene, zdrave listove najizloženije suncu (s gornjih

dijelova busena usmjerenih jugu), po mogudnosti iz sredine rozete (ružice), izbjegavajudi

najstarije i najmlađe, tek razvijene listove. Ovakav način sabiranja bio je nemogud u jesen i zimi

zbog stanja mirovanja biljke i male količine listova, pa sam sabrao čitave rozete. Listove sam

sabirao u 6-8 replika, pri čemu sam radi sakupljanja dovoljne količine materijala za jednu repliku

koristio listove s najmanje tri zasebne jedinke („sample pooling”). Listove sam sabirao u

označene plastične vredice sa zatvaračem, koje sam po sabiranju držao na ledu.

Kod „godišnjeg uzorka” odmah po sabiranju sam odvagnuo unaprijed određene mase

svježih listova te ih pohranio u ledenici na -20 °C. Kod „UV uzorka” odvage svježih listova

pohranio sam u ledenici na -80 °C. Sav smrznuti materijal namijenjen istraživanju pomodu

tekudinske kromatografije visoke djelotvornosti (HPLC) naknadno je liofiliziran u liofilizatoru

CHRIST ALPHA 1-2 (Christ, Njemačka) na -64 °C i pri tlaku od 0,025 mbar tijekom 24 sata.

Dobiveno osušeno biljno tkivo usitnjeno je uz dodatak tekudeg dušika u prah i pohranjeno na

-80 °C.

Za „godišnji uzorak” listove sam ubirao za vrijeme sunčanih dana tijekom četiri godišnja

doba, uzimajudi u obzir mjesečne temperaturne prosjeke za razdoblje od 2004. do 2009. te

izbjegavajudi neuobičajene temperaturne ekstreme za pojedino doba; Zimi sam uzorkovao pri

dnevnim temperaturama od oko -3 °C te negativnim nodnim temperaturama do -7 °C

(14. siječnja 2009.); u proljede sam ubirao listove prije cvjetanja, pri dnevnim temperaturama

do 16 °C i nodnima oko +13 °C (28. ožujka 2009.); ljeti pri dnevnim temperaturama do 35 °C i

nodnima oko 20 °C (23. kolovoza 2009.), a za jesensko uzorkovanje odabrao sam dane s

prosječnim maksimalnim dnevnim temperaturama oko +10 °C te pozitivnim nodnim

temperaturama (12. studenog 2009.). Uzorkovao sam tri puta dnevno, u 8, 13 i 20 sati, radi

istraživanja razlika u vrijednostima ispitivanih pokazatelja tijekom dana.

Na pokusnim plohama „UV uzorka” listove sam počeo sabirati u drugoj polovici srpnja

2009. u 8 sati (nulti dan i sat izlaganja), kada sam biljke iz drugog dijela klijališta, koje su do tada

rasle u uvjetima minimalnog utjecaja UV zračenja, naglo izložio prirodnoj insolaciji uklanjanjem

zaštitnih stakala s UV folijom. Sabrao sam listove biljaka iz prvog dijela klijališta u kojemu su

biljke bile zaštidene od UV zračenja sve do kraja trajanja pokusa (negativna kontrolna skupina,

UV –), listove biljaka naglo izloženih UV stresu (pokusna skupina, UV stres) te listove biljaka iz

tredeg dijela klijališta koje su čitavo vrijeme izložene prirodnoj insolaciji (pozitivna kontrolna

skupina, UV +). Uzorke pojedinih skupina sabirao sam nultog dana (0, 5 i 12 sati), sedmog (173

sata) i četrdesetprvog dana (988 sati) nakon izlaganja suncu pokusne skupine (tablica 3).


31

Tablica 3. Raspored uzorkovanja i trajanja izlaganja suncu kod pojedinih pokusnih skupina velebitske degenije („UV uzorak”).

dan uzorkovanja (izlaganja) doba dana

(h) sati

izlaganja uzorkovana skupina

0. dan (22. srpnja 2009.)

8 0 UV – UV stres UV +



7. dan (29. srpnja 2009.) 13 173 UV – UV stres

41. dan (1. rujna 2009.) 13 988 UV – UV stres UV +

* Sadržaj flavonoida dodatno sam istražio na uzorcima sakupljenim tredeg dana u 13 sati,

tj. 77 sati nakon izlaganja suncu skupine UV stres.

3.1.2. Sunčevo UV zračenje i temperatura zraka

Mjerenje sunčevog UV zračenja i izračun doza zračenja

Za potrebe izračuna doza UV zračenja koje su biljke „UV uzorka” primile tijekom 41 dana

pokusa koristio sam podatke satnih prosječnih doza ukupnog UV zračenja (UVA+B) koje je

zabilježila mjerna postaja „Zagreb-1” (mjerna postaja Ministarstva zaštite okoliša i prostornog

uređenja), smještena na križanju Miramarske ceste i Ulice grada Vukovara, oko 600 metara

udaljenosti od pokusnih ploha u Botaničkom vrtu Biološkog odsjeka PMF-a (podaci dobiveni

ljubaznošdu gđe Sandre Krmpotid, MZOPU).

UV osjetnik mjerne postaje, vezan na uređaj za prikupljanje podataka („data logger”),

bilježi svake sekunde UV iradijanciju ili ozračenje (dalje u tekstu ozračenje) - trenutačnu snagu

UV zračenja pristiglu na jedinicu površine, izraženu u jedinicama mW cm-2 (W m-2). Tako česta

mjerenja potrebna su zbog stalne promjene u snazi sunčevog zračenja koje dopire do površine

Zemlje, a ovisi o trenutačnom stanju atmosfere. Prosjek ozračenja zabilježen za svaki sat

tijekom dana (24 sata) automatski se iskazuje kao prosječna 1-satna doza UV zračenja, zvana još

i UV ozračenost ili radijativna izloženost (dalje u tekstu doza zračenja) - energija UV zračenja

pristigla na jedinicu površine u sat vremena, izražena u J m-2. Podatke mjerne postaje (slika 7)

koristio sam zbog nemogudnosti postavljanja vlastitog sustava za prikupljanje podataka UV

zračenja na pokusnim plohama, a pod pretpostavkom da se zbog male udaljenosti postaje od

pokusnih ploha te slične izloženosti suncu vrijednosti ozračenja bitno ne razlikuju. Iskoristivost

podataka koje je prikupila mjerna postaja potvrdio sam usporedbom s vlastitim izmjerama

trenutačnog (sekundnog) ozračenja (tablica 4), koje sam pri uzorkovanju biljnog materijala i

tijekom pokusa (svaka tri dana) očitavao prijenosnim UV metrom YK-35UV (Lutron Electronic

Enterprise Co., Tajvan). Ozračenja sam očitavao polažudi osjetnik UV metra uz desetak biljaka i

usmjeravajudi ga prema Suncu, kod svih skupina (UV –, UV stres, UV +). Usporedba podataka

vlastitih izmjera s onima koje je prikupila mjerna postaja pokazala je visoku razinu podudarnosti

od 98 % i potvrdila mogudnost preciznog izračuna doza zračenja.


32

Doze UV zračenja koje su velebitske degenije u „UV pokusu” primile od trenutka

izlaganja suncu biljaka pokusne skupine UV stres, što je označeno kao nulti dan pokusa i nulta

doza zračenja, do kraja pokusa nakon 41 dan tj. 988 sati zračenja izračunao sam zbrajajudi

prosječne 1-satne doze koje je za razdoblje od 22. srpnja do 1. rujna 2009. zabilježila mjerna

postaja.

Posebnu pozornost posvetio sam izmjerama ozračenja ispod UV folije, kako bih utvrdio

učinkovitost UV folije u zaštiti biljaka od UV zračenja (biljke skupine UV –). Ozračenja ispod UV

folije ovisila su o promjenama sunčeva ozračenja tijekom dana i bila su najmanja u

kasno-popodnevnim i večernjim satima te ujutro, a najveda sredinom dana (tablica 4).

Vrijednosti UV ozračenja koja sam izmjerio kod biljaka skupine UV – usporedio sam s

vrijednostima izmjerenih kod biljaka na suncu (UV +) i regresijskom analizom utvrdio jednadžbu

potencijskog, gotovo kvadratnog tipa koja je najbolje opisivala odnos ovisnosti izmjera ispod UV

folije o izmjerama na suncu. Dijeledi prosječne 1-satne doze zračenja izražene u kJ m-2, koje je

zabilježila mjerna postaja, s vremenskim intervalom (3,6) izračunao sam prosječne 1-satne

vrijednosti ozračenja koje sam zatim korigirao (interpolirao) putem utvrđene potencijske

jednadžbe, kako bih dobio vrijednosti ozračenja ispod UV folije za čitavo razdoblje trajanja

pokusa. Vrijednosti ozračenja ispod UV folije preračunao sam ponovo u prosječne 1-satne doze

zračenja, a njihovim zbrajanjem izračunao sam ukupne doze zračenja kojima su tijekom pokusa

bile izložene biljke skupine UV –. Dobivene rezultate za doze zračenja koje su biljke primile

tijekom pokusa prikazao sam u poglavlju 4.1. Rezultata.

Sezonske promjene sunčevog UV zračenja

Vrijednosti ozračenja također sam mjerio na određene datume u četiri godišnja doba

2009. godine pri uzorkovanju biljnog materijala iz „godišnjeg uzorka” (tablica 5) te ih potvrdio

izmjerama koje je tijekom iste godine zabilježila mjerna postaja „Zagreb-1”.

Tablica 4. Očitanja ozračenja kod svih skupina „UV uzorka” tijekom 41 dan trajanja pokusa.

ozračenje (W m-2

)

datum vrijeme 8.00 h 13.00 h 20.00 h

UV – UV + UV stres



22. srpnja 2009. 0,8 15,5 6 41,8 0,05 1,0

25. srpnja 2009. 0,8 15,3 5,5 40,5 0 0,7

29. srpnja 2009. 0,7 11,2 2 32,1 0 0,5

2. kolovoza 2009. 0,7 12,1 3,5 36,0 0,01 0,7

6. kolovoza 2009. 0,3 7,1 2 30,1 0,04 0,9

10. kolovoza 2009. 0,7 11,1 2 31,1 0 0,5

14. kolovoza 2009. 0,3 7,2 2 30,2 0,01 0,6

18. kolovoza 2009. 0,4 8,9 2,1 33,7 0 0,3

22. kolovoza 2009. 0,4 8,1 1,6 25,4 0 0,3

26. kolovoza 2009. 0,4 8,1 2,1 33,0 0 0,1

1. rujan 2009. 0,7 12,5 0,8 15 0 0,1


33

Tablica 5. Očitanja ozračenja (W m-2) prilikom sabiranja biljnog materijala iz „godišnjeg uzorka”.

vrijeme uzorkovanja 8.00 h 13.00 h 20.00 h

14. siječnja 2009. 0 7 0

28. ožujka 2009. 1 12 0

23. kolovoza 2009. 8 37 0,7

12. studenog 2009. 0,5 12 0

Prosječne 1-satne vrijednosti ozračenja, izražene u W m-2, tijekom čitave 2009. godine

izračunao sam iz 1-satnih doza zračenja koje je zabilježila mjerna postaja (slika 7). Prema tim

podacima, vrijednosti 1-satnih ozračenja Sunca u 2009. godini kredu se od 0 W m-2 tijekom nodi

do najviše 45,2 W m-2 u lipnju. Najviše dnevne vrijednosti ozračenja za vrijeme zimskih mjeseci,

od studenog do ožujka, su male, od 5 do 15 W m-2, a postupno rastu tijekom proljeda, odnosno

padaju tijekom jeseni. Vrijednosti ozračenja su najvede sredinom dana od lipnja do kolovoza

(40-45 W m-2).

Slika 7. Prosječne 1-satne vrijednosti ozračenja tijekom 12 mjeseci 2009. godine

izračunate iz podataka mjerne postaje „Zagreb-1”, MZOPU.

Mjerenje temperature zraka

Temperaturu zraka mjerio sam pomodu živinog termometra, polažudi ga na odabrani

busen velebitske degenije (kod svake pokusne skupine „UV uzorka” i kod „godišnjeg uzorka”)

prije početka uzorkovanja i očitavajudi vrijednost nakon 20-30 minuta.

Vrijednosti temperatura zraka bile su povedane u odjeljcima pokrivenim staklom s UV folijom

(skupine UV – i UV stres), za 2 °C u jutarnjim satima odnosno za 5 °C u podne (srpanj).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

siječanj veljača ožujak travanj svibanj lipanj srpanj kolovoz rujan listopad studeni prosinac

Ozr

ačen

je(W

m-2

)

MJESEC


34

Temperature zraka koje sam zabilježio pri uzorkovanju biljnog materijala iz

„godišnjeg uzorka” odgovarale su unaprijed odabranim opdim karakteristikama: smrzavajude ili

ledene temperature zraka zabilježene su zimi; hladne, nesmrzavajude tj. studene temperature u

jesen; svježe tijekom proljeda, a visoke ljeti. Očitanja temperatura zraka prilikom uzorkovanja

navedene su u tablici 6. Izmjere sam potvrdio usporedivši ih s podacima za isto razdoblje

mjerne postaje „Zagreb-1”.

Tablica 6. Očitanja temperatura zraka prilikom sabiranja biljnog materijala „UV uzorka” i

„godišnjeg uzorka”.

temperatura zraka (°C)

datum uzorkovanja 8.00 h 13.00 h 20.00 h

„UV uzorak”




22. srpnja 2009. 23 21 38 33 33 30

25. srpnja 2009. 29 25

29. srpnja 2009. 34 30

1. rujna 2009. 29 26

„godišnji uzorak”

14. siječnja 2009. -7 -3 -4

28. ožujka 2009. 9 15 13

30. srpnja 2009. 21 30 29

12. studenog 2009. 2 10 7

3.1.3. Kemikalije

Kemikalije korištene u ovom istraživanju bile su analitičke čistode (p. a.), a otapala za

kromatografiju visoke djelotvornosti (metanol, etil-acetat, aceton i acetonitril) HPLC čistode.

Vedina standardnih kemikalija kupljena je od proizvođača laboratorijskih kemikalija Kemika

(Hrvatska).

Sljedede kemikalije kupljene su od proizvođača Sigma-Aldrich (Njemačka): natrijev

dodecil sulfat (SDS), tetrametiletilendiamin (TEMED), boja Coomassie Brilliant Blue G-250,

polietilen glikol sorbitan monolaurat (Tween 20), srebrov nitrat, riboflavin, gvajakol, 2-amino

etil difenilborna kiselina, 5-bromo-4-kloro-3-indolilfosfat/nitrotetrazolijsko modrilo (BCIP/NBT),

nitrotetrazolijsko modrilo (NBT), standard kvercetina, standard proteina albumina iz goveđeg

seruma (BSA) i sekundarno protutijelo (antikunidji IgG) vezano za alkalnu fosfatazu.

Primarna poliklonalna protutijela anti-Lhcb2 („LHCII type II chlorophyll a/b binding

protein“), anti-PsbA (D1 protein fotosistema II) i anti-RbcL (velika podjedinica RuBisCO) bila su

od proizvođača Agrisera (Švedska). Standardi izoramnetina i kempferola bili su od proizvođača

Fluka (Njemačka), a proteinski markeri poznatih molekularnih masa „Page ruler prestained

protein ladder“ te „Unstained protein molecular weight marker“ proizvođača Fermentas (SAD).

Standardi biljnih pigmenata (klorofil a i b, neoksantin, anteraksantin, violaksantin, lutein i -

karoten) bili su od proizvođača DHI (Danska).

4. REZULTATI

Fiziološki odgovori velebitske degenije, Degenia velebitica (Degen) Hayek na UV zračenje Rezultati

47

S obzirom na to da sam u svojem radu želio istražiti utjecaj prirodnog UV zračenja na

velebitsku degeniju, morao sam izračunati količine zračenja koje su biljke primile tijekom

pokusa, što je detaljno opisano u poglavlju Materijali i metode, a rezultate izračuna primljenih

doza zračenja u MJ m-2 iznosim ovdje u prvom poglavlju.

Nakon toga opisujem rezultate dobivene u istraživanju učinaka UV zračenja (UV stres) na

biljke uzgajane u uvjetima smanjenog sunčevog UV zračenja, koje su zatim naglo izložene

prirodnoj insolaciji sa znatno vedim vrijednostima ozračenja (skupina UV stres), u usporedbi s

biljkama koje su trajno rasle u uvjetima sa smanjenim UV ozračenjem (negativna kontrolna

skupina, UV –) i biljkama stalno izloženim suncu (pozitivna kontrolna skupina, UV +). Slijede

rezultati dobiveni u istraživanju sezonskih promjena pojedinih fizioloških parametara.

U posebnom potpoglavlju opisujem anatomsku građu lista, morfologiju i raspored

epidermskih trihoma (dlaka) te lokalizaciju flavonoida u tkivima lista.

4.1. Doze UV zračenja

Biljke skupine UV stres u prvih pet sati pokusa primile su dozu UV zračenja od 0,52

MJ m-2, nakon 12 sati ukupno 1,03 MJ m-2, do 77. sata izlaganja 3,3 MJ m-2, do 173. sata

izlaganja 6,7 MJ m-2, a do kraja pokusa (988 sati izlaganja) ukupno 32,5 MJ m-2 (slika 8).

Biljke ispod UV folije (skupina UV –) u prvih pet sati primile su dozu zračenja od 0,06

MJ m-2, nakon 12 sati ukupno 0,11 MJ m-2, do 77. sata izlaganja 0,36 MJ m-2, a do 173. sata

izlaganja 0,71 MJ m-2. Do kraja pokusa (988 sati), biljke skupine UV – primile su dozu zračenja

od 3 MJ m-2, tj. 11 puta manju dozu zračenja u odnosu na skupinu UV stres (slika 8).

Slika 8. Doze UV zračenja koje su biljke skupine UV stres i UV – primile tijekom 988 sati (40 dana) izlaganja suncu, od srpnja do rujna 2009. godine.

0

5

10

15

20

25

30

35

0 5 12 77 173 988

Do

za U

V z

rače

nja

(MJ

m-2

)

Trajanje izlaganja (sati)

UV stres

UV –


48

4.2. Učinci UV zračenja

Učinke zračenja istražio sam na biljkama skupine UV stres u trenutku izlaganja suncu,

što u tekstu nazivam „nultom dozom zračenja”, te nakon doza zračenja od 0,52; 1,03; 6,7 i

32,5 MJ m-2. Sadržaj flavonoida dodatno sam istražio i nakon doze zračenja od 3,3 MJ m-2,

odnosno nakon 77 sati izlaganja.

Na slikama sam najprije prikazao rezultate za biljke skupine UV stres prema rastudoj dozi

UV zračenja koju su primile od trenutka izlaganja suncu do kraja pokusa (988 sati) tj. od 0

MJ m-2 do 32,5 MJ m-2. Rezultati koji se odnose na biljke skupina UV – i UV + prikazani su kao

srednja aritmetička vrijednost izmjera tijekom cijelog trajanja pokusa.

4.2.1. Koncentracija vodikovog peroksida

U biljkama koje su cijelo vrijeme pokusa rasle na suncu (UV +) koncentracija vodikovog

peroksida (slika 9) bila je neznatno viša u odnosu na onu u biljkama koje su rasle ispod UV folije

(UV –). U biljkama skupine UV – koncentracija vodikovog peroksida bila je slična vrijednosti

izmjerenoj u biljkama skupine UV stres na početku pokusa (kod nulte doze zračenja).

U biljkama skupine UV stres koncentracija vodikovog peroksida se nakon ozračenosti od

0,52 i 1,03 MJ m-2 značajno snizila u odnosu na vrijednost izmjerenu kod nulte doze zračenja, ali

nije bila značajno različita od vrijednosti izmjerene za skupinu UV –. Međutim, nakon primljene

doze od 6,7 MJ m-2 koncentracija vodikovog peroksida je značajno porasla u odnosu na

vrijednost izmjerenu kod nulte doze zračenja, a bila je viša i u usporedbi s vrijednosti izmjerenoj

u biljkama skupine UV +. Nakon dugotrajnog izlaganja suncu, odnosno ozračenosti od 32,5 MJ

m-2, koncentracija vodikovog peroksida u biljkama skupine UV stres snizila se do vrijednosti

zabilježene na početku pokusa.

Slika 9. Koncentracija vodikovog peroksida u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

bc c

a

b bc

b

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 0,52 1,03 6,7 32,5

Ko

nce

ntr

acija

H2O

2(

mo

l gsv

.t.-1

)

Doza zračenja (MJ m-2)

UV stres

UV –

UV +


49

4.2.2. Stupanj lipidne peroksidacije

U biljkama skupine UV – koncentracija malondialdehida (MDA) bila je povišena u odnosu

na koncentraciju u biljakama skupine UV +, ali razlika nije bila statistički značajna (slika 10). U

biljkama skupine UV – koncentracija malondialdehida nije bila značajno različita u odnosu na

vrijednost izmjerenu kod nulte doze zračenja.

U biljkama skupine UV stres koncentracija malondialdehida značajno je porasla ved

nakon ozračenosti od 0,52 MJ m-2, kada je bila značajno viša i u usporedbi s koncentracijom

izmjerenoj u biljkama skupine UV +. Nakon ozračenja od 1,03 MJ m-2 koncentracija MDA snizila

se na razinu početne vrijednosti, a nakon doze zračenja od 6,7 MJ m-2 bila je oko 1,5 puta viša

od početne vrijednosti. Koncentracija MDA bila je značajno povišena i nakon dugotrajnog

izlaganja suncu, odnosno doze zračenja od 32,5 MJ m-2, u odnosu na početak pokusa i

koncentraciju u biljkama skupine UV +. Međutim, bila je značajno niža u odnosu na vrijednost

izmjerenu nakon izlaganja zračenju od 6,7 MJ m-2.

Slika 10. Koncentracija malondieldehida (MDA) u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

4.2.3. Oksidacijsko oštedenje proteina

U biljkama skupine UV – koncentracija proteinskih karbonila (slika 11) bila je neznatno

viša u odnosu na onu kod biljaka skupine UV +. Također, nije bilo značajne razlike u

koncentraciji karbonila u biljkama skupine UV – u odnosu na vrijednost izmjerenu kod nulte

doze zračenja.

U biljkama skupine UV stres koncentracija karbonila se nakon izlaganja zračenju od 0,52

i 1,03 MJ m-2 neznatno snizila u odnosu na početnu vrijednost, a nakon izlaganja dozi zračenja

c

b

c

a

b

cc

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 0,52 1,03 6,7 32,5

Konc

entr

acija

MD

A (n

mol

g sv

. t-1

)


UV stres

UV –

UV +


50

od 6,7 MJ m-2 značajno je porasla gotovo 2,5 puta u odnosu na početnu vrijednost te dva puta u

odnosu na koncentraciju kod biljaka skupine UV +. Iako se koncentracija karbonila nakon

dugotrajnog izlaganja suncu (doza zračenja od 32,5 MJ m-2) snizila u odnosu na dozu od 6,7

MJ m-2, ostala je značajno viša u usporedbi s početnom vrijednošdu kod nulte doze i s onom u

biljkama skupine UV +.

Slika 11. Koncentracija proteinskih karbonila u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

4.2.4. Ekspresija proteina fotosintetskog aparata RuBisCO, D1 i LHCII

U ekstraktima topivih i membranskih proteina iz listova velebitske degenije odredio sam

ekspresiju odabranih proteina koji su važne sastavnice fotosintetskog aparata: enzima

ribuloza 1,5-bisfosfat karboksilaza oksigenaza (RuBisCO, velika podjedinica), proteina D1 i

proteina LHCII.

Protein RuBisCO

Na membranama nije bilo razlike u intenzitetima imunosignala proteina RuBisCO

(slika 12), što je potvrdila i naknadna analiza računalnim programom. Ekspresija proteina

RuBisCO bila je podjednaka u biljkama skupine UV – i u onima skupine UV +. Također nije bilo

promjene u ekspresiji ovog proteina tijekom izlaganja biljaka UV stresu (skupina UV stres).

cd cdd

a

b

cc

0

5

10

15

20

25

30

0 0,52 1,03 6,7 32,5Ko

nce

ntr

acija

kar

bo

nila

(n

mo

l mg p

-1)

Doza zračenja (MJm-2)

UV stres

UV –

UV +


51

A

B

Slika 12. Ekspresija proteina RuBisCO u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Prikazani su intenziteti imunosignala (A), dobiveni analizom proteinskih vrpci vizualiziranih imunodetekcijom na nitroceluloznoj membrani (B). Na membrani je naznačen biljeg molekularne mase u kDa. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni istim slovima međusobno se statistički značajno ne razlikuju.

Protein D1

Imunosignali proteina D1 (slika 13) bili su slabije izraženi u odnosu na imunosignale

ostalih istraživanih proteina. Nakon obrade proteinskih vrpci računalnim programom ImageJ,

imunosignali su bili uočljiviji, ali je kvantifikacijom u istom programu utvrđeno da ne postoje

značajne razlike u ekspresiji ovog proteina kod svih istraživanih skupina biljaka.

Protein LHCII

Razlike u intenzitetima imunosignala proteina LHCII (slika 14) bile su dobro uočljive na

membranama, a naknadna analiza računalnim programom potvrdila je značajne promjene u

ekspresiji tog proteina kod pojedinih skupina biljaka.

Intenzitet imunosignala bio je 2,5 puta vedi kod biljaka skupine UV + u odnosu na

intenzitet kod biljaka skupine UV –. Nije primijedena razlika u intenzitetima imunosignala kod

biljaka skupine UV – u odnosu na biljke skupine UV stres na početku pokusa. Kod biljaka skupine

UV stres intenzitet imunosignala proteina LHCII neznatno se povedao nakon doze zračenja od

0,52 MJ m-2, ali je ved nakon doze od 1,03 MJ m-2 bio dva puta vedi u odnosu na početnu

vrijednost. Najvedi intenzitet imunosignala utvrđen je nakon doze zračenja od 6,7 MJ m-2, kada

je bio čak 3,5 puta vedi od početnog, a također i značajno vedi od intenziteta imunosignala kod

biljaka skupine UV +. Nakon dugotrajnog rasta na suncu i ozračenosti od 32,5 MJ m-2, u biljkama

skupine UV stres intenzitet imunosignala proteina LHCII ostao je više od 3 puta vedi od

početnog, ali ne značajno vedi u odnosu na onaj kod biljaka skupine UV +.

a aa

a a a a

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,52 1,03 6,7 32,5

Inte

nzi

tet

imu

no

sig

na

la


RbcL

UV stres

UV –

UV+


52

A

B

Slika 13. Ekspresija proteina D1 u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Prikazani su intenziteti imunosignala (A) dobiveni analizom proteinskih vrpci vizualiziranih imunodetekcijom na nitroceluloznoj membrani (B). Na membrani je naznačen biljeg molekularne mase u kDa. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni istim slovima međusobno se statistički značajno ne razlikuju.

A

B

Slika 14. Ekspresija proteina LHCII u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Prikazani su intenziteti imunosignala (A) dobiveni analizom proteinskih vrpci vizualiziranih imunodetekcijom na nitroceluloznoj membrani (B). Na membrani je naznačen biljeg molekularne mase u kDa. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

a a a aa

a a

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,52 1,03 6,7 32,5

Inte

nzi

tet

imu

no

sig

na

la


D1

UV stres

UV –

UV+

d d

c

aab

d

b

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 0,52 1,03 6,7 32,5

Inte

nzi

tet

imu

no

sig

na

la


LHCII

UV stres

UV –

UV+


53

4.2.5. Sastav i koncentracija pigmenata fotosintetskog aparata

Karotenoidi

U listovima velebitske degenije uzgajanih na suncu (UV +) od utvrđenih ksantofila

najzastupljeniji je bio lutein, violaksantina je bilo oko četiri puta manje, a neoksantina i

anteraksantina 8 odnosno 10 puta manje od luteina (slike 15, 16, 17 i 18 skupine UV +). Od

karotena je utvrđen β-karoten, kojega je bilo oko 2,5 puta manje od luteina (slika 19).

Koncentracije svih utvrđenih ksantofila bile su značajno vede u biljkama skupine UV +, u odnosu

na koncentracije izmjerene u biljkama skupine UV – te u odnosu na one u biljkama skupine UV

stres na početni dan izlaganja suncu (nulta doza zračenja). Iako je β-karotena bilo više u

biljkama skupine UV + u odnosu na biljke skupine UV – i biljke skupine UV stres na početku

pokusa, te razlike nisu bile statistički značajne.

Koncentracija neoksantina (slika 15) udvostručila se u biljkama skupine UV stres ved

nakon primljene doze od 0,52 MJ m-2, a dodatno je porasla nakon doze od 1,03 MJ m-2. Te su

koncentracije neoksantina bile statistički značajno vede čak i u odnosu na koncentracije

utvrđene kod biljaka koje su trajno rasle na suncu (UV +). Nakon izlaganja dozi zračenja od 6,7

MJ m-2 koncentracija neoksantina značajno se snizila u odnosu na prethodne, a na kraju pokusa

i primljene doze zračenja od 32,5 MJ m-2 bila je podjednaka onoj s početka pokusa.

Slika 15. Koncentracija neoksantina u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Koncentracija violaksantina (slika 16) također je bila značajno povišena (oko dva puta)

kod biljaka skupine UV stres nakon početnog izlaganja suncu i primljene doze od 0,52 MJ m-2.

Nakon doze zračenja od 1,03 MJ m-2 ta je koncentracija dosegla dva puta vedu vrijednost od

početne, a bila je značajno viša i od koncentracije utvrđene kod biljaka skupine UV +. Nakon

ozračenosti od 6,7 MJ m-2 utvrđeno je neznatno sniženje koncentracije violaksantina, a nakon

dugotrajnog izlaganja suncu (32,5 MJ m-2) koncentracija se snizila na razinu početne vrijednosti

pri nultoj dozi zračenja.

c

aa

b

c c

b

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 0,52 1,03 6,7 32,5Ko

nce

ntr

acija

ne

oks

anti

na

(µg

g s.t

.-1)


UV stres

UV –

UV+


54

Slika 16. Koncentracija violaksantina u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja

biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Koncentracija anteraksantina (slika 17) u biljkama skupine UV stres ved nakon

ozračenosti od 0,52 MJ m-2 bila je gotovo trostruko povišena u odnosu na početnu vrijednost, a

zatim se, nakon doze zračenja od 1,03 MJ m-2, snizila. Najviša koncentracija anteraksantina

utvrđena je nakon doze zračenja od 6,7 MJ m-2, kada je bila značajno viša i u odnosu na

koncentraciju kod biljaka skupine UV +. Nakon dugotrajnog izlaganja (32,5 MJ m-2)

koncentracija anteraksantina ostala je značajno viša od početne vrijednosti pri nultoj dozi te

podjednaka koncentraciji utvrđenoj u biljaka skupine UV +.

Slika 17. Koncentracija anteraksantina u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja

biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

c

aba

ab

c

c

b

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

0 0,52 1,03 6,7 32,5Ko

nce

ntr

acija

vio

laks

anti

na

(µg

g s.t

.-1)


UV stres

UV –

UV+

c

ab

b

a

b

c

b

0

10

20

30

40

50

60

0 0,52 1,03 6,7 32,5Ko

nce

ntr

acija

an

tera

ksan

tin

a(µ

g g s

.t.-1

)


UV stres

UV –

UV+


55

Značajno povišenje koncentracije luteina od oko 1,5 puta u odnosu na početnu

vrijednost (slika 18), izmjeren je u biljkama skupine UV stres ved nakon ozračenosti od

0,52 MJ m-2, a slične vrijednosti bile su utvrđene i nakon doza zračenja od 1,03 i 6,7 MJ m-2.

Nakon izlaganja zračenju od 32,5 MJ m-2 koncentracija luteina bila je značajno viša od početne

vrijednosti pri nultoj dozi, a podjednaka koncentraciji utvrđenoj u biljaka skupine UV +.

Slika 18. Koncentracija luteina u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Nakon izlaganja zračenju, koncentracija β-karotena (slika 19) u biljkama skupine UV stres

porasla je u odnosu na početnu vrijednost i bila je značajno povišena nakon doza zračenja od

1,03 MJ m-2 i 6,7 MJ m-2. Nakon dugotrajnog izlaganja suncu bila je približno jednaka početnoj

vrijednosti kao i vrijednostima izmjerenim kod biljaka UV – i UV +.

Slika 19. Koncentracija β-karotena u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka

skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

c

a a a

b

c

b

0

100

200

300

400

500

600

700

0 0,52 1,03 6,7 32,5

Ko

nce

ntr

acija

lute

ina

(µg

g s.t

.-1)


UV stres

UV –

UV+

c

abc

aab

bcc

abc

0

50

100

150

200

250

300

0 0,52 1,03 6,7 32,5

Ko

nce

ntr

acija

β-k

aro

ten

a (µ

g g s

.t.-1

)


UV stres

UV –

UV+


56

Klorofili

U listovima biljaka uzgajanih na suncu bilo je oko dva puta više klorofila a od klorofila b

(slike 20 i 21, skupina UV +).

Koncentracija klorofila a bila je viša u biljkama koje su cijelo vrijeme pokusa rasle na

suncu (UV +) u odnosu na koncentraciju kod biljaka koje su rasle ispod UV folije (UV –), ali se

vrijednosti nisu statistički značajno razlikovale (slika 20). Također nije bilo značajne razlike u

koncentraciji klorofila a kod biljaka skupine UV – u odnosu na vrijednost izmjerenu kod biljaka

skupine UV stres na početku pokusa (0 MJ m-2). Međutim, nakon izlaganja biljaka zračenju

koncentracija klorofila a značajno je porasla ved nakon ozračenosti od 0,52 MJ m-2, a slična

vrijednost utvrđena je i nakon doze zračenja od 1,03 MJ m-2. Nakon ozračenosti od 6,7 MJ m-2

koncentracija klorofila a se neznatno snizila, a nakon dugotrajnog izlaganja suncu (32,5 MJ m-2)

snizila se na razinu izmjerenu pri nultoj dozi zračenja.

Slika 20. Koncentracija klorofila a u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Koncentracija klorofila b bila je značajno viša u biljkama skupine UV + u odnosu na biljke

skupine UV – (slika 21). Nije bilo značajne razlike u koncentraciji klorofila b između biljaka

skupine UV – i biljaka skupine UV stres odmah nakon uklanjanja UV folije (0 MJ m-2).

Nakon izlaganja zračenju od 0,52 MJ m-2, koncentracija klorofila b bila je gotovo

dvostruko viša u odnosu na početnu vrijednost, a slične vrijednosti izmjerene su i nakon

ozračenosti od 1,03 MJ m-2 i 6,7 MJ m-2. Sve tri navedene vrijednosti bile su značajno vede i u

odnosu na vrijednost utvrđenu kod biljaka skupine UV +.

Na kraju pokusa (doza zračenja od 32,5 MJ m-2), koncentracija klorofila b značajno se

snizila u usporedbi s vrijednostima izmjerenim kod nižih doza zračenja, ali je ostala značajno

povišena u odnosu na početnu koncentraciju utvrđenu kod nulte doze zračenja.

bc

a aab

abcc

abc

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 0,52 1,03 6,7 32,5

Ko

nce

ntr

acija

klo

rofi

la a

(mg

g s.t

.-1)


UV stres

UV –

UV+


57

Slika 21. Koncentracija klorofila b u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Nije bilo značajne razlike u omjeru koncentracija klorofila a i klorofila b (slika 22) između

biljaka skupina UV – i UV +, iako je ta vrijednost bila malo manja kod biljaka skupine UV +.

Nagli UV stres izazvao je značajno smanjenje omjera koncentracija klorofila a/b u

biljkama skupine UV stres ved nakon doze zračenja od 0,52 MJ m-2, a zatim se postupno

povedavao i nakon dugotrajnog izlaganja suncu bio podjednak vrijednosti kod biljaka skupine

UV +.

Slika 22. Omjer koncentracija klorofila a i klorofila b u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati

izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

d

a aa

c

d

b

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 0,52 1,03 6,7 32,5

Ko

nce

ntr

acija

klo

rofi

lab

(mg

g s.t

.-1)


UV stres

UV –

UV+

a

b b bab

ab

ab

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 0,52 1,03 6,7 32,5

klor

ofil

a/b

Doza zračenja (Mj m2)

UV stres

UV –

UV+


58

4.2.6. Fluorescencija klorofila a in vivo

Optimalni i efektivni prinos fluorescencije – efikasnost fotosistema II

Prosječna vrijednost optimalnog prinosa fluorescencije (slika 23 A) iznosila je 0,77 kod

biljaka koje su stalno rasle na suncu (UV +), a podjednaka vrijednost (0,74) utvrđena je i kod

biljaka koje su rasle ispod UV folije (UV –). Kod biljaka skupine UV stres primjetan je vrlo mali

porast vrijednosti optimalnog prinosa fluorescencije od početnih 0,733 do 0,773 kod primljene

doze od 10,3 MJ m-2 nakon čega je slijedilo smanjenje na razinu početne vrijednosti. Razlike u

navedenim vrijednostima nisu bile statistički značajne.

Sličan obrazac u odnosima među vrijednostima utvrđen je i za efektivni prinos

fluorescencije (slika 23 B). U listovima biljaka negativne (UV –) i pozitivne (UV +) kontrolne

skupine te su vrijednosti iznosile 0,594 odnosno 0,6. Kod biljaka skupine UV stres nakon

izlaganja suncu utvrđene su vrijednosti u rasponu od 0,575 do 0,6. Vrijednosti utvrđene kod

svih navedenih skupina nisu se statistički značajno razlikovale.

A

B

Slika 23. Optimalni (A) i efektivni (B) prinos fluorescencije u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni istim slovima međusobno se statistički značajno ne razlikuju.

aa a a a a a

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 0,52 1,03 6,7 32,5

F v/F

m


UV stres

UV-

UV+

aa a

a aa a

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 0,52 1,03 6,7 32,5

ΔF

/ F'

m


UV stres

UV-

UV+


59

Fotokemijsko i nefotokemijsko gašenje fluorescencije

Vrijednosti fotokemijskog gašenja (PQ) fluorescencije bile su podjednake u biljaka

skupina UV +, UV – i UV stres (slika 24 A) i iznosile su od 0,929 do 0,94.

Vrijednost nefotokemijskog gašenja (NPQ) fluorescencije iznosila je 0,799 kod biljaka

koje su stalno rasle na suncu (UV +) i 0,558 kod biljaka skupine UV –, a razlika je bila statistički

značajna (slika 24 B). Kod biljaka naglo izloženih suncu (UV stres), vrijednosti NPQ kretale su se

od 0,566 do 0,656 i među njima nije bilo značajne razlike, kao ni u odnosu na vrijednost kod

biljaka skupine UV –, ali su sve bile statistički značajno niže u odnosu na vrijednost kod biljaka

skupine UV +.

A

B

Slika 24. Fotokemijsko (A) i nefotokemijsko (B) gašenje fluorescencije u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni istim slovima međusobno se statistički značajno ne razlikuju.

a a a a a a a

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,52 1,03 6,7 32,5

PQ


UV stres

UV-

UV+

bb b

b b

b

a

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 0,52 1,03 6,7 32,5

NP

Q


UV stres

UV-

UV+


60

4.2.7. Aktivnosti i sastav izoformi antioksidacijskih enzima

Aktivnost askorbat peroksidaze

Specifična aktivnost askorbat peroksidaze (APX) bila je statistički značajno veda u

biljkama koje su trajno rasle na suncu (UV +) u odnosu na biljke koje su rasle ispod UV folije

(UV –). Nije bilo značajne razlike u aktivnostima APX kod biljaka skupine UV – naspram biljaka

skupine UV stres neposredno nakon izlaganja suncu, pri nultoj dozi zračenja (slika 25).

U biljaka skupine UV stres specifična aktivnost APX gotovo se udvostručila nakon doze

zračenja od 0,52 MJ m-2, kada je bila značajno veda i od aktivnosti izmjerene kod biljaka

skupine UV +. Nakon ozračenosti od 1,03 MJ m-2 aktivnost APX smanjila se i bila značajno veda

od početne, a jednaka aktivnosti kod biljaka skupine UV +. Nakon doze zračenja od 6,7 MJ m-2,

kao i nakon dugotrajnog izlaganja suncu, aktivnosti APX bile su podjednake početnoj vrijednosti.

Slika 25. Specifična aktivnost askorbat peroksidaze (APX) u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Aktivnost i sastav izoenzima katalaze

Specifična aktivnost katalaze (CAT) bila je značajno veda u biljkama skupine UV + u

odnosu na aktivnost utvrđenu kod biljaka skupine UV – (slika 26 A). Kod biljaka skupine UV – i

biljaka skupine UV stres pri nultoj dozi zračenja nije bilo značajne razlike u aktivnostima CAT.

Aktivnost CAT kod biljaka skupine UV stres bila je značajno povedana nakon primljene

doze od 0,52 MJ m-2, ali se kod doze zračenja od 1,03 MJ m-2 ponovo smanjila do početne

vrijednosti. Nakon primljene doze od 6,7 MJ m-2 katalazna aktivnost bila je ponovo značajno

povedana u odnosu na početak pokusa, a dodatno je bila povedana i nakon dugotrajnog

izlaganja suncu.

c

a

b

cc

c

b

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 0,52 1,03 6,7 32,5

Spe

cifi

čna

akti

vno

st A

PX

(m

ol m

in-1

mg p

-1)


UV stres

UV -

UV +


61

Na elektroforetskoj slici (slika 26 B) uočen je samo jedan izoenzim katalaze (CAT1).

Opdenito, aktivnost izoenzima u gelu odgovarao je spektrofotometrijskim izmjerama aktivnosti

enzima. Razlika u intenzitetima vrpci između biljaka skupine UV – i UV + bila je dobro uočljiva.

Najjači intenzitet CAT1 bio je kod biljaka skupine UV stres kod primljene doze od 0,52 MJ m-2.

Također je vidljiv pojačan intenzitet izoenzima kod doza zračenja od 6,7 te 32,5 MJ m-2.

A

B

Slika 26. Specifična aktivnost (A) i sastav izoenzima (B) katalaze (CAT) u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Aktivnost i sastav izoenzima gvajakol / pirogalol peroksidaze

Kao i kod prethodno opisanih enzima, utvrđena je značajno veda specifična aktivnost

gvajakol peroksidaze (POD) u biljkama koje su rasle na suncu (UV +) u odnosu na aktivnost kod

biljaka koje su rasle u uvjetima sa smanjenim UV zračenjem (UV –), slika 27 A. Također, nije bilo

razlike u aktivnostima tog enzima kod biljaka skupine UV – u usporedbi s biljkama skupine UV

stres na početku pokusa (0 MJ m-2). Kod biljaka skupine UV stres nakon izlaganja suncu i doza

zračenja od 0,52, 1,03 i 6,7 MJ m-2 aktivnosti POD statistički se nisu razlikovale od početne

vrijednosti pri nultoj dozi zračenja. Nakon dugotrajnog izlaganja suncu, u biljkama UV stres

specifična aktivnost POD bila je 1,6 puta značajno veda od početne i podjednaka aktivnosti kod

biljaka skupine UV +.

b

a

b

a

a

b

a

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 0,52 1,03 6,7 32,5

Spe

cifi

čna

akti

vno

st C

AT

(nm

ol m

in-1

mg p

-1 )


UV stres

UV -

UV +


62

Prikazi izoenzima u gelovima bojanih gvajakolom ili pirogalolom kao supstratima

peroksidaze bili su jednaki, ali su proteinske vrpce bile jasnije istaknute u gelovima bojanih

pirogalolom, pa su stoga oni prikazani. Aktivnost izoenzima u gelu uglavnom se podudarala sa

spektrofotometrijskim izmjerama aktivnosti enzima (slika 27 B).

U gelovima su uočena tri dobro vidljiva izoenzima pirogalol peroksidaze, nazvana prema

rastudoj pokretljivosti u smjeru anode POD1, POD2 i POD3. Kod biljaka skupine UV – izoenzimi

su bili slabije izraženi, posebice POD3. Sličan je rezultat dobiven i za biljke skupine UV stres

odmah nakon izlaganja suncu, pri nultoj dozi zračenja. Kod biljaka skupine UV + bio je jako

izražen POD2 i malo manje POD3, dok je POD1 bio slabo izražen.

Kod biljaka skupine UV stres, nakon izlaganja suncu i doza zračenja od 0,52 i 1,03 MJ m-2

intenzitet vrpci spomenutih izoenzima bio je nešto slabiji u odnosu na onaj kod nulte doze

zračenja. Međutim, nakon primljene doze od 6,7 MJ m-2, intenzitet sva tri izoenzima bio je

pojačan. Nakon dugotrajnog izlaganja suncu, tj. doze zračenja od 32,5 MJ m-2, jako izraženi bili

su POD2 i POD3, dok je POD1 bio slabije izražen, što odgovara rezultatima dobivenima kod

biljaka skupine UV +.

A

B

Slika 27. Specifična aktivnost gvajakol peroksidaze (A) i sastav izoenzima pirogalol peroksidaze (B) u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

b b

b

b

a

b

a

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 0,52 1,03 6,7 32,5

Spec

ifič

na

akti

vno

st P

OD

(μm

ol

min

-1 m

gp

-1 )


UV stres

UV -

UV +


63

Aktivnost i sastav izoenzima superoksid dismutaze

Specifična aktivnost superoksid dismutaze (SOD) bila je značajno veda kod biljaka

skupine UV + u odnosu na aktivnost tog enzima kod biljaka skupine UV – (slika 28 A). Aktivnost

SOD kod biljaka skupine UV – bila je podjednaka vrijednosti izmjerenoj kod skupine UV stres na

početku pokusa, pri nultoj dozi zračenja.

Kod biljaka skupine UV stres primijeden je značajan porast specifične aktivnosti SOD u

odnosu na početnu, nakon doza zračenja od 0,52; 6,7 i 32,5 MJ m-2.

U gelovima su uočena najmanje četiri izoenzima superoksid dismutaze, nazvanih prema

rastudoj pokretljivosti u smjeru anode SOD1, SOD2, SOD3 i SOD4 (slika 28 B). Najjače su bili

izraženi SOD1 i SOD2, dok su SOD3 i SOD4 bili slabije izraženi. Intenziteti svih izoenzima bili su

nešto izraženiji kod biljaka skupine UV +. Kod biljaka izloženih suncu (UV stres) nije uočena veda

razlika u intenzitetima izoenzima.

A

B

Slika 28. Specifična aktivnost (A) i sastav izoenzima (B) superoksid dismutaze (SOD) u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

b

a

ab

a

a

b

a

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 0,52 1,03 6,7 32,5

Spe

cifi

čna

akti

vno

st S

OD

(US

OD

mg- p

-1)


UV stres

UV -

UV +


64

4.2.8. Sadržaj flavonoida

Preliminarni sadržaj fenolnih spojeva iz listova velebitske degenije istražio sam pomodu

tekudinske kromatografije visoke djelotvornosti (HPLC) u 80 %-tnim (v/v) metanolnim

ekstraktima liofiliziranih listova. Razdvajanje fenolnih spojeva pradeno je istovremeno na 280

nm, gdje su apsorpcijski maksimumi vedine fenolnih kiselina, te na 374 nm, gdje su apsorpcijski

makismumi benzenskih prstenova aglikona flavonoida. Na kromatogramima je bio vidljiv vedi

broj pikova (Slika 29 A i B).

A

B

Slika 29. HPLC kromatogrami metanolnog ekstrakta listova velebitske degenije, pradeni na 280 nm (A) i 374 nm (B). Na kromatogramima su vidljivi spojevi (pikovi) koji predstavljaju različite fenole.

Zbog nemogudnosti identifikacije flavonoida u njihovim glikozidnim oblicima,

ekstrahirane flavonoide hidrolizirao sam koristedi 5 M HCl. U listovima velebitske degenije

utvrdio sam tri različita aglikona flavonoida: kvercetin, kempferol i izoramnetin (Slika 30).

Slika 30. HPLC kromatogram kiselog metanolnog ekstrakta listova velebitske degenije praden na 374 nm. Pikovi označeni na kromatogramu predstavljaju aglikone flavonoida: kvercetin (Q), kempferol (K), izoramnetin (IR).


65

Koncentracija kvercetina, kempferola i izoramnetina

U listovima biljaka koje su trajno rasle na suncu (skupina UV +) koncentracija kvercetina

iznosila je u prosjeku 1,95 mg gs.t.-1. Kempferola je bilo 3,8 puta manje, u prosjeku 0,5 mg gs.t.

-1,

a izoramnetina oko 5 puta manje od kvercetina, tj. 0,37 mg gs.t.-1 (slike 31, 32 i 33).

Koncentracija kvercetina (slika 31) bila je dvostruko viša u biljkama skupine UV + u

odnosu na koncentraciju kod biljaka koje su rasle ispod UV folije (UV –). Između biljaka skupine

UV – i biljaka izloženih suncu (skupina UV stres) na početku pokusa pri nultoj dozi zračenja, nije

bilo značajne razlike u koncentraciji kvercetina. U biljaka skupine UV stres koncentracija

kvercetina značajno se povisila tek nakon doze zračenja od 3,3 MJ m-2 i bila je 1,5 puta viša od

početne vrijednosti pri nultoj dozi zračenja. Dva puta vede vrijednosti zabilježene su nakon

izlaganja zračenju od 6,7 MJ m-2, a nakon dugotrajnog izlaganja koncentracija je bila 2,2 puta

viša u odnosu na početnu i podjednaka koncentraciji kod biljaka skupine UV +.

Slika 31. Koncentracija kvercetina u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Koncentracija kempferola (slika 32) u biljkama skupine UV + bila je značajno viša u

odnosu na koncentraciju u biljaka skupine UV –. Između biljaka skupine UV – i biljaka skupine

UV stres na početku pokusa, pri nultoj dozi zračenja, nije bilo značajne razlike u koncentraciji

kempferola. Kod biljaka skupine UV stres koncentracija kempferola neznatno se povisila nakon

doza zračenja od 3,3; 6,7 i 32,5 MJ m-2, ali to nisu bili statistički značajne promjene u odnosu na

početnu vrijednost i onu izmjerenu kod biljaka skupine UV –.

d d d

c

ba

d

a

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,52 1,03 3,3 6,7 32,5

Ko

nce

ntr

aci

ja k

verc

eti

na

(mg

gs.

t.-1

)


UV stres

UV -

UV +


66

Slika 32. Koncentracija kempferola u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Koncentracija izoramnetina (slika 33) bila je čak četiri puta viša u biljaka koje su trajno

rasle na suncu (UV +) u odnosu na koncentraciju kod biljaka skupine UV –. Nije bilo razlike u

koncentraciji izoramnetina u biljaka skupine UV stres na početku izlaganja, u odnosu na

koncentraciju kod biljaka skupine UV –.

Koncentracija izoramnetina u biljkama izloženih suncu (UV stres) neznatno se povisila

nakon doze zračenja od 3,3 MJ m-2, a nakon doze od 6,7 MJ m-2 bila je značajno, 3,6 puta viša od

početne vrijednosti pri nultoj dozi zračenja i podjednaka koncentraciji izmjerenoj u biljaka

skupine UV +. Nakon dugotrajnog izlaganja suncu, koncentracija izoramnetina bila je čak pet

puta viša od početne. Ta vrijednost bila je viša i u odnosu na vrijednost izmjerenu kod biljaka

skupine UV +, ali nije nađena statistički značajna razlika.

Slika 33. Koncentracija izoramnetina u listovima velebitske degenije tijekom 988 sati izlaganja biljaka skupine UV stres suncu i primljenih doza UV zračenja od 0; 0,52; 1,03; 6,7 i 32,5 MJ m-2, te u listovima biljaka negativne (UV –) odnosno pozitivne (UV +) kontrolne skupine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

bc bcc

abbc abc

bc

a

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,52 1,03 3,3 6,7 32,5

Ko

nce

ntr

aci

ja k

em

pfe

rola

(mg

gs.

t.-1

)


UV stres

UV -

UV +

c c c

c

b

a

c

ab

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 0,52 1,03 3,3 6,7 32,5

Ko

nce

ntr

aci

ja iz

ora

mn

eti

na

(mg

gs.

t.-1

)


UV stres

UV -

UV +


67

4.3. Sezonske promjene istraživanih fizioloških parametara

Sezonske i dnevne promjene fizioloških parametara kod velebitske degenije istražio sam

na biljkama koje su rasle u klijalištu „godišnjeg uzorka”, izložene vanjskim uvjetima atmosfere

od početka sadnje. Listove sam sabirao u jutarnjim (8 sati), podnevnim (13 sati) i večernjim (20

sati) satima odabranog zimskog, proljetnog, ljetnog i jesenskog dana 2009. godine.

4.3.1. Koncentracija vodikovog peroksida

Najviše vrijednosti vodikovog peroksida izmjerene su zimi i ujesen (s izuzetkom jutra), a

najniže u proljede i ljeto ujutro (slika 34). U proljede je koncentracija vodikovog peroksida bila

značajno viša sredinom dana i navečer u odnosu na jutro. Iako je koncentracija navečer bila viša

od nego u podne, razlika nije bila statistički značajna. Isti obrazac bio je vidljiv i ljeti te ujesen,

osim što je ujesen koncentracija navečer bila neznatno niža u odnosu na koncentraciju u podne.

Zimi su koncentracije vodikovog peroksida tijekom dana bile podjednake.

Slika 34. Promjene koncentracije vodikovog peroksida u listovima velebitske degenije sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

4.3.2. Stupanj lipidne peroksidacije

Najviše dnevne koncentracije malondialdehida (MDA) uglavnom se nisu značajno

razlikovale tijekom godine. Najviša vrijednost MDA izmjerena je zimi ujutro, ali su statistički

slične vrijednosti izmjerene i zimi navečer, u proljede navečer i ljeti u podne (slika 35). Najniže

vrijednosti zabilježene su ljeti navečer i ujesen ujutro. U proljede je koncentracija MDA tijekom

dana bila u porastu. Koncentracija ujutro bila je značajno niža od koncentracija u podne i

navečer, koje se nisu značajno razlikovale. Ljeti je bio vidljiv neznatan porast koncentracije od

jutra do podneva, dok je večernja koncentracija bila značajno niža. Ujesen je promjena

koncentracija tijekom dana bila istovjetna proljetnoj, iako su vrijednosti bile malo manje. Zimi je

koncentracija MDA bila najviša ujutro, a sredinom dana značajno se snizila. Navečer bila je

nešto viša od one u podne, a nešto niža od koncentracije ujutro.

e e

b

a

dbc

a a

cd

b

aa

0

1

2

3

4

5

6

Proljede Ljeto Jesen Zima

Ko

nce

ntr

aci

ja H

2O

2(

mo

l gsv

.t.-1

)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h


68

Slika 35. Promjene koncentracije malondialdehida (MDA) u listovima velebitske degenije sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

4.3.3. Oksidacijsko oštedenje proteina

Najviša koncentracija proteinskih karbonila izmjerena je zimi navečer kada je vrijednost

bila uglavnom dva puta viša od ostalih sezonskih vrijednosti. Tijekom proljeda, ljeta i jeseni

izmjerene su podjednako niske koncentracije proteinskih karbonila (slika 36), uz iznimku

značajno povišene koncentracije izmjerene ljeti u podne. Koncentracije proteinskih karbonila u

proljede bile su podjednake tijekom dana. Ljeti su jutarnja i večernja koncentracija bile

podjednake, dok je podnevna bila značajno povišena. Ujesen također nije bilo značajne razlike u

koncentraciji karbonila tijekom dana. Zimi je koncentracija proteinskih karbonila bila najniža

ujutro, značajno povišena sredinom dana te značajno najviša navečer.

Slika 36. Promjene koncentracije proteinskih karbonila u listovima velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

cbc

d

a

bcab

c c

ab

d

bc abc

0

5

10

15

20

25

30

35

40


Ko

nce

ntr

acij

a M

DA

(nm

ol g

sv. t

.-1)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h

de de

e

cd

de

bc

e

b

de dede

a

0

5

10

15

20

25


Ko

nce

ntr

acija

kar

bo

nila

(n

mo

l mg

p-1

)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h


69

4.3.4. Ekspresija proteina fotosintetskog aparata RuBisCO, D1 i LHCII

Nakon analize ekspresije navedenih proteina pomodu programa ImageJ, nije nađena

značajna razlika između izmjerenih intenziteta imunosignala tijekom dana, stoga ti podaci nisu

prikazani.

Protein RuBisCO

Ekspresija proteina RuBisCO (slika 37) bila je najveda u proljede, a smanjivala se tijekom

godine. Primijedeno smanjenje intenziteta u ljeto i jesen nije bilo značajno, dok je zimi bilo

značajno manje u odnosu na ostala godišnja doba.

A

B

Slika 37. Promjene ekspresije proteina RuBisCO u listovima velebitske degenije, sabranih odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Prikazani su intenziteti imunosignala (A) dobiveni analizom proteinskih vrpci vizualiziranih imunodetekcijom na nitroceluloznoj membrani (B). Na membrani je naznačen biljeg molekularne mase u kDa. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Protein D1

Ekspresija proteina D1 (slika 38) bila je najveda u proljede i ljeti, a ujesen neznatno

manja. Najmanja ekspresija proteina D1 bila je zimi, i to značajno manja od ekspresije u

proljede, ljeto i ujesen.

aa

a

b

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Inte

nzi

tet

imu

no

sign

ala

Godišnje doba

RBcL


70

A

B

Slika 38. Promjene ekspresije proteina D1 u listovima velebitske degenije, sabranih odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Prikazani su intenziteti imunosignala (A) dobiveni analizom proteinskih vrpci vizualiziranih imunodetekcijom na nitroceluloznoj membrani (B). Na membrani je naznačen biljeg molekularne mase u kDa. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Protein LHCII

Kod proteina LHCII (slika 39) ekspresija se smanjivala od proljeda prema zimi. Nije

nađena statistički značajna razlika između ekspresije u proljede, ljeto i jesen, a intenzitet

imunosignala bio je značajno najniži zimi, kada je bio gotovo dva puta manji od proljetnog i

značajno manji u usporedbi s intenzitetima izmjerenim ljeti i ujesen.

A

B

Slika 39. Promjene ekspresije proteina LHCII u listovima velebitske degenije, sabranih odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Prikazani su intenziteti imunosignala (A) dobiveni analizom proteinskih vrpci vizualiziranih imunodetekcijom na nitroceluloznoj membrani (B). Na membrani je naznačen biljeg molekularne mase u kDa. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

a aa

b

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Inte

nzi

tet

imu

no

sig

na

la

Godišnje doba

D1

aa

a

b

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Inte

nzit

et im

unos

igna

la

Godišnje doba

LHCII


71

4.3.5. Sadržaj fotosintetskih pigmenata

Karotenoidi

Koncentracija neoksantina (slika 40) bila je najviša ljeti, osobito u podne i navečer, a niža

u ostala godišnja doba, s time da je najniža bila u proljede navečer.

U proljede se koncentracija neoksantina snižavala tijekom dana, pa je značajno niža bila

navečer. Ljeti je koncentracija bila najniža ujutro, a značajno viša izmjerena je u podne i večer.

Ujesen ujutro i u podne izmjerene su podjednake koncentracije neoksantina, a navečer

značajno viša vrijednost. Zimi je najniža koncentracija izmjerena u podne, dok su ujutro i podne

bile podjednake, ali razlike nisu bile statistički značajne.

Slika 40. Promjene koncentracije neoksantina u listovima velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Koncentracije violaksantina (slika 41) bile su najviše ljeti, čak tri puta više od onih ujesen

i oko dva puta više od koncentracija izmjerenih u proljede i zimi. Najniže vrijednosti izmjerene

su ujesen te zimi u podne. U proljede se koncentracija tijekom dana snižavala, a razlike su bile

statistički značajne.

Dnevne koncentracije ljeti bile su podjednake, kao i dnevne koncentracije ujesen. Zimi je

najviša koncentracija violaksantina izmjerena ujutro, a u podne je bila čak dva puta niža.

Koncentracija navečer bila je malo niža od one ujutro, ali je ta razlika bila značajna.

c

b

d

cc

a

dc

e

a

cc

0

10

20

30

40

50

60

70


Ko

nce

ntr

acija

ne

oks

anti

na

(µg

g s.t

.-1)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h


72

Slika 41. Promjene koncentracije violaksantina u listovima velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Koncentracije anteraksantina (slika 42) bile su najvede ljeti, čak četiri puta više od

koncentracija izmjerenih tijekom drugih godišnjih doba. Najniže vrijednosti izmjerene su u

proljede.

U proljede je koncentracija anteraksantina bila podjednaka ujutro i navečer, a nešto

povišena u podne. Dnevne koncentracije ljeti bile su podjednake, a značajno se tijekom dana

nisu mijenjale i ujesen te zimi.

Slika 42. Promjene koncentracije anteraksantina u listovima velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Koncentracije luteina bile su značajno više ljeti (slika 43), a najviša vrijednost je

izmjerena ljeti u podne. U ostala godišnja doba vrijednosti su bile niže, s time da su najniže

vrijednosti izmjerene u proljede navečer i ujesen ujutro.

Koncentracija luteina u proljede bila je podjednaka ujutro i u podne, a navečer značajno

niža. Ljeti su se koncentracije luteina značajno razlikovale tijekom dana: najviša je izmjerena u

b

a

ef

cc

a

f efe

a

f

d

0

20

40

60

80

100

120

140


Ko

nce

ntr

acija

vio

laks

anti

na

(µg

g s.t

.-1)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h

d

a

bcdbc

bcd

a

cdbc

d

a

cd

b

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90


Ko

nce

ntr

aci

ja a

nte

rak

san

tin

a(µ

g g

s.t.

-1)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h


73

podne, a najniža navečer. Ujesen je koncentracija luteina rasla tijekom dana pa je tako najniža

bila ujutro, značajno viša u podne, a najviša navečer. Zimi je koncentracija ujutro i navečer bila

podjednako visoka, a u podne značajno niža.

Slika 43. Promjene koncentracije luteina u listovima velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Koncentracije β-karotena bile su najmanje dva puta više ljeti u odnosu na one izmjerene

u ostala godišnja doba (slika 44). Najniže vrijednosti izmjerene su u proljede navečer i ujesen.

U proljede je koncentracija β-karotena bila najviša ujutro, a zatim se značajno snižavala tijekom

dana. Najviša koncentracija β-karotena ljeti izmjerena je u podne, ujutro je bila malo niža, a

navečer značajno niža u odnosu na prethodne. Ujesen su koncentracije β-karotena bile

podjednake tijekom dana. Zimi je koncentracija β-karotena bila značajno najviša navečer, a

značajno najniža u podne.

Slika 44. Promjene koncentracije β-karotena u listovima velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0.05).

d

b

g

dd

a

f fg

c

ed

0

100

200

300

400

500

600


Ko

nce

ntr

acija

lute

ina

(µg

gs.

t.-1

)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h

d

a

g

d

ef

a

fge

g

b

g

c

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200


Ko

nce

ntr

acija

β-k

aro

ten

a (µ

g g s

.t.-1

)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h


74

Klorofili

Koncentracija klorofila a bila je najviša ljeti ujutro i navečer, a najmanja vrijednost

izmjerena je zimi u podne (slika 45). U proljede je koncentracija klorofila a bila najviša u podne,

značajno niža ujutro, a najniža navečer. Ljeti je koncentracija klorofila a bila podjednako visoka

ujutro i u podne, a značajno niža navečer. Ujesen je najviša vrijednost izmjerena u podne, a

najniža ujutro. Zimi je najviša koncentracija klorofila a bila ujutro, značajno niža navečer, a

najniža u podne. Najviša koncentracija klorofila b izmjerena je ljeti ujutro i u podne, a najniža

vrijednost izmjerena je zimi u podne (slika 46). U proljede je najviša koncentracija klorofila b

izmjerena u podne, nešto niža ujutro, a značajno niža navečer. Ljeti je koncentracija bila

podjednako visoka ujutro i u podne, dok je navečer bila značajno niža. Ujesen je koncentracija

klorofila b bila najviša u podne, malo niža navečer, a značajno najniža ujutro. Zimi je najviša

koncentracija izmjerena ujutro, značajno niža navečer, a najniža u podne.

Slika 45. Promjene koncentracije klorofila a u listovima velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Slika 46. Promjene koncentracije klorofila b u listovima velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

c

a

f f

ba

d

hg

b

e

g

0

1

2

3

4

5

6

7


Ko

nce

ntr

acija

klo

rofi

la a

(mg

g s.t

.-1)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h

bc

a

dd

b

a

bc

fe

bcc

e

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3


Ko

nce

ntr

acij

a kl

oro

fila

b(m

g g

s.t.

-1)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h


75

4.3.6. Fluorescencija klorofila a in vivo

Optimalni prinos fluorescencije nije se značajnije mijenjao tijekom godine (Slika 47 A), a

iznosio je od 0,73 do 0,78. Također nije bilo značajnih razlika dnevnih vrijednosti u pojedinim

godišnjim dobima, s iznimkom vrijednosti izmjerene ljeti u podne, koja je bila značajno manja

od vrijednosti ujutro.

Efektivni prinos fluorescencije (Slika 47 B) bio je podjednak ljeti, ujesen i zimi, s

vrijednostima od 0,54 do 0,6, a značajno najmanje vrijednosti zabilježene su u proljede ujutro i

podne (0,47 i 0,44). Dnevne vrijednosti efektivnog prinosa fluorescencije nisu se međusobno

značajno razlikovale u svim godišnjim dobima.

A

B

Slika 47. Promjene optimalnog (A) i efektivnog (B) prinosa fluorescencije u listovima velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Fotokemijsko gašenje fluorescencije (PQ) bilo je podjednako tijekom godine, od 0,9 do

0,95, no vrijednosti izmjerene zimi u podne i navečer bile su značajno manje od vedine ostalih

tijekom sezone (slika 48 A). Između dnevnih vrijednosti kod svih godišnjih doba nije bilo

statistički značajne razlike.

ab a abc abcabc c bc bcab abc ab abc

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9


F v/F

m 8 h

13 h

20 h

cab

a a

c

ab a abbc

a aab

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7


ΔF

/ F'

m 8 h

13 h

20 h


76

Nefotokemijsko gašenje fluorescencije (NPQ) bilo je najvede u proljede (1,1-1,25) i ljeti

ujutro (1,03), a ostale vrijednosti tijekom godine bile su značajno manje, od 0,46 do 0,61 (slika

48 B). U proljede se NPQ smanjivalo tijekom dana, ali nije bilo značajne razlike. Ljeti se isticala

velika vrijednost NPQ ujutro, koje je bilo čak 2,2 puta vede od izmjera u podne i navečer. Ujesen

su vrijednosti NPQ bile podjednake, a zimi je bilo uočljivo neznatno smanjenje u podne.

A

B

Slika 48. Promjene fotokemijskog (A) i nefotokemijskog (B) gašenja fluorescencije u listovima velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

4.3.7. Aktivnost i sastav izoformi antioksidacijskih enzima

Askorbat peroksidaza

Specifična aktivnost enzima askorbat peroksidaze (APX) bila je najveda zimi: oko šest

puta veda od onih ujesen, a čak 60 puta veda od vrijednosti izmjerenih ljeti. U proljede je bila

izrazito mala i zbog toga nemjerljiva (slika 49). Nije bilo značajne razlike u aktivnosti APX tijekom

dana ljeti i ujesen. Zimi je najveda aktivnost tog enzima izmjerena ujutro, a značajno najmanja u

podne, dok se vrijednost izmjerena navečer nije značajno razlikovala.

Zbog male aktivnosti u proljede i ljeti, vizualizacija tog enzima u gelu nije bila

odgovarajude kvalitete i stoga nije prikazana.

ab ab ab bca ab bc cab ab ab c

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


PQ 8 h

13 h

20 h

a

b

c c

ab

cc c

ab

c cc

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4


NPQ

8 h

13 h

20 h


77

Slika 49. Promjena specifične aktivnosti askorbat peroksidaze (APX) u listovima velebitske degenije,

sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Katalaza

Specifična aktivnost katalaze (CAT) bila je najveda zimi: čak do 15 puta veda od aktivnosti

u proljede i ljeto te osam puta veda od aktivnosti ujesen (Slika 50 A). Vrijednosti izmjerene

ujesen bile su neznatno više od onih u proljede i ljeto. Također, nije bilo statistički značajne

razlike u aktivnostima tijekom dana, u svim godišnjim dobima. Na elektroforetskoj slici (slika

50 B) uočen je jedan izoenzim katalaze, koji sam označio oznakom CAT1. Intenzitet vrpci

tijekom godine uglavnom je odgovarao spektrofotometrijskim izmjerama. Najvedi intenzitet

CAT1 bio je vidljiv u zimskim uzorcima, a slabiji ujesenskim. Proteinske vrpce proljetnih i ljetnih

uzoraka bile su slabo izražene.

A

B

Slika 50. Promjene specifične aktivnosti (A) i sastava izoenzima (B) katalaze (CAT) u listovima velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

d

cd

a

d

cd

b

d

c

ab

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4


Spe

cifi

čna

akt

ivn

ost

AP

X

(m

ol m

in-1

mg p

-1)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h

b bb

a

b b

b

a

b bb

a

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180


Spec

ifič

na

akti

vno

st C

AT

(nm

ol m

in-1

mg

p-1

)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h


78

Gvajakol / pirogalol peroksidaza

Specifična aktivnost gvajakol peroksidaze (POD) bila je najveda zimi navečer, a najmanja

ljeti (slika 51 A). Značajne razlike u dnevnim kretanjima POD utvrđene su samo zimi: najmanja je

bila ujutro, znatno veda u podne i najveda navečer.

Na elektroforetskoj slici vidljivo je ukupno pet izoenzima pirogalol peroksidaze

(Slika 51 B), koje sam označio oznakama POD1, POD2, POD3, POD4 i POD5, prema rastudoj

pokretljivosti u smjeru anode. Intenzitet proteinskih vrpci u gelu odgovarao je

spektrofotometrijskim izmjerama: najslabijeg intenziteta su bile vrpce ljetnog, a najizraženije

vrpce zimskog uzorka. U proljede su bili slabije vidljivi POD1 i POD2, a izraženiji je bio POD3.

Ljeti su prethodno navedeni izoenzimi bili vrlo slabo izraženi. Ujesen su također bili

vidljivi izoenzimi POD1, POD2 i POD3, s time da su POD2 i POD3 bili jače izraženi. U zimskom

uzorku pojavila su se dva nova izoenzima: POD4 i POD5. Sve izoforme bile su slabije izražene

ujutro, jače u podne i najjače navečer.

A

B

Slika 51. Promjene specifične aktivnosti gvajakol peroksidaze (A) i sastava izoenzima pirogalol peroksidaze (B) u listovima velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

effg

cdec

ef

fg

cd

b

de

fg

cd

a

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5


Spe

cifi

čna

akti

vno

st P

OD

(μm

ol m

in-1

mgp

-1)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h


79

Superoksid dismutaza

Sezonske promjene aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) bile su slične promjenama

aktivnosti gvajakol peroksidaze: aktivnost je bila najveda zimi, osobito navečer, dok je najmanja

vrijednost izmjerena ljeti (slika 52 A).

U proljede i ljeto nije bilo značajne razlike u dnevnim kretanjima aktivnosti. Ujesen

navečer je vrijednost SOD bila značajno povedana u odnosu na jutro i podne. Zimi je najmanja

aktivnost SOD bila ujutro, znatno povedana u podne, a najveda navečer.

U gelovima su uočena ukupno četiri izoenzima superoksid dismutaze koje sam označio

oznakama SOD1, SOD2, SOD3 i SOD4, prema rastudoj pokretljivosti u smjeru anode (slika 52 B).

U svim uzorcima najjače su bili izraženi SOD1 i SOD2, dok su SOD3 i SOD4 bili izraženi samo

ujesenskom i zimskom uzorku. Intenziteti vrpci svih izoenzima bili su izraženiji ujesen i zimi.

A

B

Slika 52. Promjene specifične aktivnosti (A) i sastava izoenzima superoksid dismutaze (SOD) u listovima velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

cd

f

ef

c

d

efe

b

d

ef

d

a

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90


Spe

cifi

čna

akti

vno

st S

OD

(USO

Dm

g p-1

)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h


80

4.3.8. Sadržaj flavonoida

Koncentracija kvercetina u listovima degenije bila je najviša ljeti, a značajno niža u ostala

godišnja doba (slika 53). Koncentracija se nije značajno mijenjala tijekom dana, osim u ljetnom

uzorku, kada je značajno niža vrijednost izmjerena u podne.

Slika 53. Promjene koncentracije kvercetina iz listova velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

Koncentracija kempferola smanjivala se od najvede vrijednosti izmjerene u proljede

ujutro, do najmanjih vrijednosti zimi (slika 54). U proljede je koncentracija kempferola bila

najviša ujutro, značajno niža u podne i najniža navečer. Ljeti je koncentracija bila podjednaka

ujutro i podne, a neznatno snižena navečer. Ujesen je koncentracija bila slična ujutro i navečer,

a u podne malo niža. Zimi su tijekom dana koncentracije kempferola bile podjednake.

Slika 54. Promjene koncentracije kempferola iz listova velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

c

a

cddcd

b

cd cdcd

a

dcd

0

0,5

1

1,5

2

2,5


Ko

nce

ntr

aci

ja k

verc

eti

na

(mg

gs.

t.-1

)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h

a

bc

cd

e

b bc

d

e

dbcd

d

e

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8


Ko

nce

ntr

aci

ja k

em

pfe

rola

(mg

gs.

t.-1

)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h


81

Koncentracije izoramnetina bile su tijekom godine u značajnom porastu, od najnižih u

proljede do najviših zimi (slika 55).

U proljede je koncentracija bila jednaka ujutro i navečer, a značajno povišena u podne.

Ljeti i ujesen se koncentracije izoramnetina nisu značajno mijenjale tijekom dana, a zimi ujutro

je koncentracija bila značajno viša od onih u podne i navečer.

Slika 55. Promjene koncentracije izoramnetina iz listova velebitske degenije, sabranih ujutro (8 h), u podne (13 h) i navečer (20 h) odabranog dana u proljede, ljeto, jesen i zimu 2009. godine. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

g

e

cd

a

f

e

cb

g

e

d

b

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Ko

nce

ntr

aci

ja iz

ora

mn

eti

na

(mg

gs.

t.-1

)

Godišnje doba

8 h

13 h

20 h


82

4.4. Građa lista, lokalizacija flavonoida i odnos koncentracija flavonoida u dlakama, listovima

i cvjetnim pupovima

4.4.1. Osnovna građa lisnih tkiva

Opde karakteristike lisnih tkiva

Usko crtasti listovi velebitske degenije razmjerno su debeli, između 400 i 600 µm.

Adaksijalna i abaksijalna plojka lista prekrivene su gustim pokrovom jednostaničnih epidermskih

trihoma – dlaka (slika 56 A). Dlake se sastoje od kratkog drška i brojnih ogranaka na vršnom

dijelu. Obasjane vanjskim izvorom svjetlosti, zbog refleksije se čine bijele, dok su u prolaznom

svjetlu prozirne. Stanična stijenka razvijenih dlaka izrazito je zadebljala, dok unutrašnjost stalka

i ogranaka čini šupljina bez uočljivih staničnih struktura, ali s vidljivim kapljičnim uklopinama

(slika 56 B, C i D). Ispod sloja pokrovnih dlaka nalazi se jedan sloj epidermskih stanica umjereno

zadebljalih staničnih stijenki (slika 56 C). Kutikula je slabo razvijena i tanka. Brojne puči nalaze se

s obje strane lista, smještene u ravnini s epidermalnim stanicama (slika 56 C). U epidermi su

vidljive povedane stanice zadebljalih stijenki – bazalne epidermske stanice iz kojih se razvijaju

jednostanične dlake (slika 56 D).

Slika 56. Svjetlosne mikrografije lista velebitske degenije: vrh lista pokriven dlakama (A), izolirana dlaka (B), poprečni prerez ruba lista (C) i uvedani detalj drška dlake (D). Na mikrografijama su označene pojedine stanice i dijelovi stanica: d – dlaka, od –ogranak dlake, dd – držak dlake, st – stanična stijenka dlake, e – epiderma, bs – bazalna epidermska stanica dlake, u – uklopine u lumenu dlake i p – puči.


83

Mezofil lista (slika 57) diferenciran je u vrlo dobro razvijen palisadni parenhim (pp) i

slabije razvijen spužvasti parenhim (sp). List je izobilateralnog tipa s tri sloja izduženih

(valjkastih) stanica palisadnog parenhima s adaksijalne i dva sloja palisadnih stanica s

abaksijalne strane.

Spužvasti parenhim je reduciran i ograničen na središnji dio lista, a čini ga nekoliko

slojeva malih, okruglastih stanica. Stanice mezofila, naročito palisadne stanice, jako su zbijene

pa su međustanični prostori teško uočljivi. U središnjem dijelu lista nalazi se središnja provodna

žila (ž), površinom veda od ostalih žila koje su vidljive u sredini plojke na bočnim dijelovima lista.

Morfologija i raspored epidermalnih trihoma

Epidermske trihome, tj. dlake koje gusto prekrivaju sve nadzemne vegetativne dijelove

velebitske degenije, dodatno sam promatrao pretražnim elektronskim mikroskopom (SEM).

Odredio sam njihov oblik, veličinu i raspored na površini listova. Također sam odredio kemijski

sastav u odabranoj točki na površini dlake.

Dlake su gusto raspoređene na adaksijanoj i abaksijalnoj strani plojke te poput oklopa

obavijaju zelene dijelove lista (slika 58 A). Na površini listova vidljivi su samo zvjezdasto

razgranjeni ogranci dlaka koji su isprepleteni i postavljeni u najmanje dva sloja (slika 58 B).

Slika 57. Svjetlosna mikrografija poprečnog prereza lista velebitske degenije: d – dlaka, pp – palisadni parenhim, sp – spužvasti parenhim, ž – središnja provodna žila.


84

Dlake su dendritičkog tipa, sastavljene od kratkog drška kojim su pričvršdene za

epidermu, a koji na vršnom dijelu nosi tijelo dlake. Tijelo dlake čini zadebljalo središte iz kojega

se zrakasto širi desetak ogranaka razdijeljenih u najčešde dva (rjeđe tri) dugačka vrha.

Vrhovi ogranaka su ravni i sasvim malo savijeni prema epidermi (slike 58 B i C). Dlake na

rubnim dijelovima listova imaju savijene bočne ogranke koji prate oblik epiderme (slika 58 D).

Promjer gornjeg, razgranatog dijela dlake u pravilu je vrlo velik, čak 400 µm, pa su dlake na

površini listova vidljive čak i golim okom.

Slika 58. Elektronska pretražna mikrografija epidermalnih trihoma velebitske degenije: vrh lista (A), detalj površine lista (B), dlaka promatrana bočno (C) i poprečni prerez lista (D).

Adaksijalna površina ogranaka je tuberkulatna – prekrivena brojnim malim, izduljenim

kvržicama (slika 59 A, t) dužine do 10 µm, dok je abaksijalna površina okrenuta prema epidermi

glatka (slika 59 B i C).

Dršci dlaka su kratki, visine od 30 do 40 µm i promjera u bazi oko 20 µm. Na

mikrografijama drška dlake s bazalne (pričvrsne) strane vidljiva je zadebljala, lignificirana

stanična stijenka i šupljina, koja je kod različitih dlaka i u pojedinim dijelovima manje

(slika 59 B, d) ili više ispunjena (slika 59 C, d) staničnim ostacima.

Na pojedinim dlakama bili su vidljivi istaloženi kristali kalcijevog karbonata nebiogenog

porijekla (slika 59 B, k). Spektrometrijska analiza s točkom mjerenja na površinskom dijelu dlake

pokazala je visok udio kisika (49,87 %), ugljika (38,08 %) i kalcija (12,04 %).


85

Slika 59. Elektronska pretražna mikrografija dlaka velebitske degenije: tuberkulatna adaksijalna površina ogranka dlake (A), držak dlake s abaksijalne strane (B) i bazalni dio drška dlake (C). Na mikrografijama su istaknute pojedine strukture: t – tuberkul ili kvržica, d – držak dlake i k – kristali kalcijevog karbonata.

4.4.2. Lokalizacija flavonoida

Lokalizacija flavonoida epifluorescencijskim mikroskopom (EFM)

Epifluorescencijskim mikroskopom promatrao sam autofluorescenciju lisnih tkiva

velebitske degenije na srednje debelim poprečnim i plošnim prerezima pri ekscitaciji UV svjetlom

( exc = 330-385 nm). Prereze sam nakon toga tretirao fluorescencijskom bojom za histokemijsku

vizualizaciju flavonoida – otopinom 2-amino-etil difenil borne kiseline (Naturstoff reagens, NR) i

promatrao žutozelenu fluorescenciju koja je indikator lokalizacije flavonoida. Također sam

promatrao pojačanu fluorescenciju zelene boje nakon alkalizacije prereza otopinom amonijevog

hidroksida. U rezultatima su prikazani prerezi prije i nakon tretmana s NR te pojedini detalji

sekundarne fluorescencije flavonoida nakon tretmana uzorka s NR, odnosno pojačane

fluorescencije nakon alkalizacije s amonijevim hidroksidom.

Na mikrografijama netretiranih preparata (slika 60 A) bila je vidljiva autofluorescencija

pojedinih stanica i struktura: zadebljale stanične stijenke dlaka fluorescirale su svijetloplavo, a

kutikula i zadebljale stijenke epidermskih stanica zelenkastoplavo, kao i provodni elementi

ksilema žila. U stanicama mezofila bila je uočljiva velika središnja vakuola, kojih je sadržaj

fluorescirao plavoljubičasto. U rubnim dijelovima stanica, poredani uz stijenke, bili su vidljivi

kloroplasti koji su fluorescirali crveno zbog primarne fluorescencije klorofila.

Nakon kratkotrajne inkubacije prereza u NR (slika 60 B) došlo je do pojave sekundarne,

žute do žutozelene fluorescencije, koja ukazuje na lokalizaciju flavonoidnih spojeva. Intenzivna

fluorescencija odmah je bila vidljiva u pojedinim epidermskim stanicama, a slabija u perifernim

dijelovima stanica mezofila. Nakon tro-minutne inkubacije NR je prožeo sva tkiva s obje strane

lista i bila je vidljiva intenzivna, ali nejednako raspoređena žuta fluorescencija epiderme i slabija

fluorescencija stanica palisadnog parenhima (Slika 60 C).


86

Slika 60. Histokemijska vizualizacija flavonoida u poprečnim prerezima lista velebitske degenije epifluorescencijskim mikroskopom. Na mikrografijama je prikazana autofluorescencija lisnih tkiva prereza prije tretmana (A) i sekundarna fluorescencija tkiva istog prereza nakon 1-minutne inkubacije (B) te 3-minutne

inkubacije (C) s NR, pri exc = 330-385 nm. Žuta fluorescencija ukazuje na lokalizaciju flavonoida. Na mikrografijama su istaknute pojedine strukture: d – dlaka, e – epiderma i pp – palisadni parenhim.

Pri vedem povedanju prereza lista s adaksijalne strane, prije tretmana s NR (slika 61 A)

bila je dobro uočljiva autofluorescencija staničnih struktura: svijetloplava debelih staničnih

stijenki dlaka, plavkastozelena kutikule i vanjske stijenke epidermskih stanica te zelena

staničnih stijenki palisadnih stanica. U palisadnim stanicama bila je vidljiva crvena fluorescencija

kloroplasta te plavoljubičasta fluorescencija vakuola. Sadržaj epidermskih stanica, koje nemaju

kloroplaste, fluorescirao je plavoljubičasto.

Nakon 3-minutne inkubacije s NR došlo je do pojave sekundarne žute fluorescencije

flavonoida (slika 61 B). Najintenzivnije su fluorescirale stijenke epidermskih stanica, ali i

vakuolarni sadržaj pojedinih stanica, vjerojatno stanica zapornica puči. Nasuprot tome, kod

palisadnog parenhima žuta fluorescencija primijedena je samo u perifernim dijelovima stanica

koji odgovaraju staničnoj stijenki, plazmalemi ili citosolu. Vakuolarni sadržaj i dalje je

fluorescirao plavoljubičastom bojom, a nepromijenjena je ostala i crvena fluorescencija klorofila

u kloroplastima.

U dlakama je do promjene u fluorescenciji došlo tek nakon dulje (7-minutne) inkubacije

s NR, vjerojatno zbog težeg prodiranja reagensa u lumene dlaka, koje su za epidermu

pričvršdene pomodu epidermske bazalne stanice. Prije tretmana s NR bila je dobro uočljiva

samo svijetloplava autofluorescencija zadebljalih staničnih stijenki dlaka i nešto tamnija boja na

mjestima šupljina u dršcima i bočnim ograncima (slika 61 A i B). Nakon prodiranja NR, središnji

dijelovi drška i ogranaka dlaka fluorescirali su žudkastozeleno (slika 61 C), a debele stijenke

plavo.


87

Slika 61. Histokemijska vizualizacija flavonoida u poprečnom i plošnom prerezu lista velebitske degenije epifluorescencijskim mikroskopom. Na mikrografijama je prikazana autofluorescencija dlaka, epiderme i gornjih slojeva palisadnog parenhima netretiranog prereza (A), sekundarna fluorescencija tkiva istog prereza nakon 3-minutne inkubacije (B) i sekundarna fluorescencija dlake nakon 7-minutne

inkubacije (C) s NR, pri exc = 330-385 nm. Žuta fluorescencija ukazuje na lokalizaciju flavonoida. Na mikrografijama su istaknute pojedine strukture: d – dlaka, k – kutikula, e – epiderma i pp – palisadni parenhim.

Dodatno sam promatrao tanke plošne prereze listova koji su sadržavali samo pokrovne

epidermalne stanice i puči (slika 62 A). Nakon dvominutne inkubacije s NR bila je vidljiva žuta

sekundarna fluorescencija stijenki pokrovnih stanica poligonalnog oblika i gotovo nezamjetna

fluorescencija njihovih vakuolarnih sadržaja. Najintenzivnije su fluorescirale stanice zapornice

puči, koje su jednolično fluorescirale u svim svojim dijelovima.

Na poprečnom prerezu lista inkubiranom dvije minute u otopini amonijevog hidroksida

(Slika 62 B) došlo je do pojačane, zelene fluorescencije flavonoida. Njihova lokalizacija

odgovarala je djelomično prerezima tretiranim s NR: najintenzivnije su fluorescirale epidermske

stanice, ali je osim fluorescencije staničnih stijenki bila vidljiva i intenzivna fluorescencija

vakuolarnog sadržaja gotovo svih stanica. Također su fluorescirale stanice gornjih slojeva

palisadnog parenhima u području stanične stijenke, plazmaleme ili citosola, naročito s

adaksijalne strane lista.


88

Slika 62. Histokemijska vizualizacija flavonoida u plošnom i poprečnom prerezu lista velebitske

degenije epifluorescencijskim mikroskopom. Na mikrografijama je prikazana sekundarna, žuta fluorescencija stanica zapornica puči i pokrovnih stanica nakon 2-minutne inkubacije s NR (A) i inducirana zelena fluorescencija epidermskih i palisadnih stanica nakon dvo-

minutne inkubacije s otopinom amonijevog hidroksida (B), pri exc = 330-385 nm. Na mikrografijama su istaknute pojedine strukture: z – stanica zapornice puči, k – epidermalna stanica, e – epiderma i pp – palisadni parenhim.

Lokalizacija flavonoida konfokalnim laserskim pretražnim mikroskopom (CLSM)

Lokalizaciju flavonoida u lisnim tkivima velebitske degenije također sam istražio pomodu

CLSM, koristedi srednje debele poprečne i plošne prereze listova, inkubirane dvije do pet minuta

s NR. Prerezi su najprije ekscitirani na 514 nm i snimana je autofluorescencija klorofila u

području 670-750 nm koja je vizualizirana u pseudo-crvenoj boji (slika 63 I). Zatim je izvršena

ekscitacija pri 488 nm, a sekundarna fluorescencija flavonoida, pradena u području 560-600 nm,

vizualizirana je u pseudo-zelenoj boji (slika 63 II). Preklapanjem slika dvaju navedenih kanala

dobivena je slika 63 III.

Na prerezima je sekundarna fluorescencija flavonoida bila vidljiva nakon dvije minute

inkubacije s NR, a signal se tijekom vremena promatranja pojačavao. Bila je uočljiva intenzivnija

fluorescencija vanjskog dijela stanične stijenke epiderme u području kutikule (slika 63 A-III, s) i

vrlo slaba fluorescencija u unutrašnjosti epidermskih stanica, dok same zadebljale stijenke

epidermskih stanica nisu fluorescirale (slika 63 A-III, e). Najintenzivniji signal davale su stanice

zapornice puči, a nije bilo razlike u fluorescenciji pojedinih dijelova stanice (slika 63 A-III, p).

Palisadne stanice nejednako su fluorescirale, što je posljedica nejednake debljine

prereza i različite dubine prodiranja lasera, ali je opdenito sekundarna fluorescencija flavonoida

bila vidljiva u svim slojevima palisadnog parenhima, nešto intenzivnije s adaksijalne strane lista

(podaci nisu prikazani). Palisadne stanice bile su promijenjenog oblika zbog plazmolize, do koje

je došlo zbog inkubacije s NR, kao i zbog uvjeta mikroskopiranja. U stanicama su bili jasno

raspoznatljivi kloroplasti (slika 63 B-I, B-III k) smješteni oko velike, središnje vakuole

(slika 63 B-III, v). Sekundarna fluorescencija flavonoida bila je vidljiva u perifernom području

stanica između kloroplasta i stanične stijenke (slika 63 B-II, B-III c). Istovremeno, u vakuolama

nije zamijedena značajna fluorescencija (slika 63 B-II, B-III v).


89

Slika 63. Histokemijska vizualizacija flavonoida u poprečnom prerezu (A) i pojedinim palisadnim stanicama (B) te plošnom prerezu (C) lista velebitske degenije putem konfokalne laserske pretražne mikroskopije, nakon dvominutne inkubacije s NR. Mikrografije prikazuju autofluorescenciju klorofila u kloroplastima u pseudo-crvenoj boji (I) i sekundarnu fluorescenciju flavonoida u pseudo-zelenoj boji (II). Slike III dobivene su preklapanjem prethodnih dviju mikrografija. Na slikama su naznačene vanjska epidermska stanična stijenka s kutikulom (s), epiderma (e), stanice zapornice puči (p), citoplazma (c),

vakuola (v), kloroplasti (k), nepravilno ( ) i pravilno (¤) prerezane stanice.

Pojedine stanice u poprečnom prerezu bile su nepravilno prerezane pa im je bio vidljiv

dio vanjske plohe, što indicira kružni oblik kloroplasta i raspored uz staničnu membranu

(slika 62 B-I, *). Kod tih stanica bila je između kloroplasta dobro uočljiva plošna sekundarna

fluorescencija flavonoida (slika 63 B-II, *). No kod stanica koje su bile pravilno prerezane i na

njima nije bio vidljiv dio vanjske plohe, što indiciraju kloroplasti bočno poredani između

stanične stijenke i vakuole u jednome sloju (slika 63 B-I, ¤), bila je primjetljiva tek slaba


90

sekundarna fluorescencija (slika 63 B-II, ¤). Ovakvo zapažanje potvrdio je i plošni prerez na

kojemu su bile vidljive vrlo pravilno prerezane palisadne stanice kružnog oblika, s bočno

poredanim kloroplastima (slika 63 C-I, ¤) i bez sekundarne fluorescencije flavonoida

(slika 63 C- I, ¤), nasuprot nejednako prerezanim stanicama nepravilnog oblika s različitima

položajima kloroplasta (slika 63 C-I, *) i vidljivom plošnom sekundarnom fluorescencijom

flavonoida (slika 63 C-II, *).

Sekundarna fluorescencija flavonoida utvrđena je i u unutrašnjosti drška i ogranaka

dendritičkih dlaka koje su sastrugane s površine listova te inkubirane s NR tijekom 5-6 minuta.

Dulje vrijeme potrebno za detekciju sekundarne fluorescencije flavonoida u dlakama vjerojatno

je posljedica sporijeg prodiranja reagensa u unutrašnjost dlake. Najintenzivniji signal bio je

vidljiv u području drška te početnim, širim dijelovima kanala ogranaka (slika 64).

Slika 64. Histokemijska vizualizacija flavonoida u dlakama velebitske degenije konfokalnim laserskim pretražnim mikroskopom, nakon 5-minutne inkubacije s NR. Mikrografije prikazuju dlaku u svijetlom vidnom polju (A) i sekundarnu fluorescenciju flavonoida u unutrašnjosti dlake u pseudo-zelenoj boji (B). Slika B dobivena je preklapanjem sedam zasebnih mikrografija koje su nastale pretraživanjem preparata na različitim

dubinama („skeniranjem”).

4.4.3. Koncentracija flavonoida u dlakama, listovima i cvjetnim pupovima

Koncentraciju kvercetina, kempferola i izoramnetina odredio sam pomodu HPLC-a u

ekstraktima dlaka (epitelnih trihoma) i ekstraktima listova s kojih je uklonjena vedina dlaka

(„detrihomiziranih listova”). Cilj mi je bio dodatno istražiti lokalizaciju utvrđenih aglikona

flavonoida u tkivima lista, posebice potvrditi njihovu prisutnost u dlakama, na temelju podataka

dobivenih histokemijskom vizualizacijom pomodu epifluorescencijskog i laserskog pretražnog

mikroskopa. Također sam usporedio koncentracije aglikona flavonoida iz ekstrakta čitavih

listova s onima iz ekstrakta cvjetnih pupova, sabranih prije cvjetanja u rano proljede, pod

pretpostavkom da su koncentracije flavonoida u cvjetovima drugačije u odnosu na one u tkivima

lista.


91

Koncentracija kvercetina u ekstraktu dlaka bila je čak šest puta viša u odnosu na onu u

ekstraktu listova s kojih su uklonjene dlake (slika 65 A). Također, ekstrakt dlaka sadržavao je tri

puta više kempferola i 2,8 puta više izoramnetina u odnosu na ekstrakt detrihomiziranih listova.

Razlike koncentracija aglikona flavonoida između ekstrakta dlaka i detrihomiziranih listova bile

su statistički značajne.

U cvjetnim pupovima je koncentracija izoramnetina bila čak 35 puta viša u odnosu na

onu u listovima (Slika 65 B). Izoramnetin je u cvjetnim pupovima bio dominantni flavonoid, čija

je koncentracija bila značajno (oko četiri puta) viša naspram koncentracija kvercetina i

kempferola.

A

B

Slika 65. Sadržaj kvercetina, kempferola i izoramnetina u dlakama i listovima bez dlaka (A) te čitavim listovima i cvjetnim pupovima (B) velebitske degenije. Cvjetni pupovi uzorkovani su u ožujku, a listovi u srpnju 2009. Na stupcima je označena standardna pogreška. Stupci označeni različitim slovima međusobno se statistički značajno razlikuju (P ≤ 0,05).

a

b

ccd d

0

0,5

1

1,5

2

2,5

kvercetin kempferol izoramnetin

Konc

entr

acij

a (m

g g s

v.t.

-1)

aglikon flavonoida

dlake

list bez dlaka

bbc

a

bc

c c0

2

4

6

8

10

12

14

16

kvercetin kempferol izoramnetin

Ko

nce

ntr

acija

(mg

gsv

.t.-1

)

aglikon flavonoida

cvjetni pupovi

čitavi list

5. RASPRAVA

Fiziološki odgovori velebitske degenije, Degenia velebitica (Degen) Hayek na UV zračenje Rasprava

93

5.1. UV zračenje

Učinci UV zračenja na biljne organizme istražuju se od kasnih 70-ih godina dvadesetog

stoljeda, a pokusi su isprva provođeni isključivo u laboratorijskim uvjetima s nerealnim

odnosima UVA, UVB i PAR zračenja (Rozema i sur. 1997; Searles i sur. 2001). Takav pristup je

napušten ili ispravljen u pokusima na vanjskim plohama, korištenjem UV lampi za dodatno

ozračivanje pokusnih biljaka s ciljem simulacije povedanog UV zračenja kao posljedice sniženja

koncentracije atmosferskog ozona, ili korištenjem posebnih folija za propuštanje ili refleksiju

određenih valnih duljina sunčevog spektra. U posljednjih desetak godina na terenskim

istraživanjima utjecaja UV zračenja na ekosisteme, naročito u arktičkim i subarktičkim

područjima, uočene su promjenama u sastavu zajednica, kruženju tvari, hranidbenim lancima

itd. (Caldwell i sur. 1998; Rozema i sur. 2005).

Ekološku nišu velebitske degenijeoblikuju tri osnovna čimbenika: mala količina oborina i

dostupnost vode, temperaturne oscilacije i pojačana insolacija. Voda je u krškim područjima,

unatoč očitom pomanjkanju na površini, dostupna u podzemlju u velikim količinama (Riđanovid

1993; Gereš 2007). Biljke poput velebitske degenije tome su se prilagodile morfološki i

anatomski, sklerofitskom građom nadzemnih dijelova i razvijenim, dugačkim korijenom

(Stevanovid i Vujnovid 1990). Temperature na staništima velebitske degenije osciliraju od

prosječnih -5 °C zimi do ljetnih +37 °C, i više, zbog akumulacije topline u vapnencima i

dolomitima. Ta dva abiotička čimbenika u dugoročnim pokusnim uvjetima teško je kontrolirati i

regulirati bez sofisticiranih i skupih uređaja, uz dodatni problem nužnosti uzgoja biljaka na

vanjskim pokusnim plohama zbog potrebe za kvalitetnim osvjetljenjem. Insolacija, a naročito

UV zračenje kao dio ukupnog zračenja Sunca, na staništima velebitske degenije pojačana je

zbog nadmorske visine, jake refleksije od gole kamenite podloge i pomanjkanja zasjene, brojnih

vedrih dana tijekom godine itd. Biljke poput velebitske degenije, izrazitih kserofitskih i

heliofitskih značajki, imaju čitav niz morfoloških, anatomskih, fenoloških, ekoloških, pa i

fizioloških prilagodbi kojima se uspješno brane od jakog zračenja Sunca. Za razliku od prethodno

spomenutih abiotičkih čimbenika, UV zračenjem Sunca jednostavnije je manipulirati na

vanjskim pokusnim plohama upotrebom UV folija, a dostupan je i velik broj uređaja za izmjeru

UV zračenja, kao i podaci nekoliko mjernih postaja u Zagrebu. Izbor UV zračenja kao stresnog

čimbenika u ovom istraživanju također je u skladu s problematikom koja je posljednjih

dvadesetak godina u središtu znanstvenog interesa – utjecajem klimatskih promjena na

opstanak najugroženijih i rijetkih vrsta poput velebitske degenije te opdenito na živi svijet na

Zemlji.

5.1.1. Doze UV zračenja

U istraživanju utjecaja sunčevog UV zračenja na velebitsku degeniju koristio sam biljke

uzgajane na vanjskim pokusnim plohama izloženih suncu. Dio biljaka rastao je u uvjetima

smanjenog utjecaja UV zračenja, u odjeljcima koji su bili zaštideni poliesterskom UV

reflektivnom folijom. Folija je imala atestirano svojstvo refleksije oko 99 % sunčevog UV

zračenja, no redovita mjerenja ozračenja prilikom uzorkovanja pokazala su da atenuacija UV


94

zračenja varira ovisno o dobu dana, odnosno o intenzitetu sunčevog UV zračenja; u jutarnjim i

večernjim satima u odjeljcima je ozračenje bilo na razini oko 5 % UV zračenja Sunca, a sredinom

dana najviše do 14 %. Povedana ozračenost u odjeljku vjerojatno je bila posljedica reflektivne

prirode UV zraka koje su u odjeljak mogle prodirati sa sjeverne strane, s koje nije bio zaštiden

folijom zbog potrebe provjetravanja. Dio ovih biljaka uzgojenih ispod UV folije naglo je izložen

suncu i UV stresu tijekom srpnja, a do kraja pokusa u rujnu, nakon 988 dana izlaganja, te su

biljke primile oko 11 puta vedu dozu UV zračenja od biljaka koje su trajno rasle ispod UV folije,

pa možemo redi da su bile izložene UV stresu.

Pokus je postavljen sa svrhom stvaranja naglog UV stresa, koristedi tzv. ambijentalno UV

zračenje, tj. prirodno UV zračenje Sunca, ali također u realnim uvjetima što se tiče kvalitete i

kvantitete vidljivog dijela sunčevog zračenja (PAR), čija je energija (gustoda svjetlosnog toka,

PPFD) dostupna biljkama svih skupina u srpnju sredinom dana iznosila 2300-2500 µmol m-2s-1.

Nagli UV stres u listovima pokusnih biljaka može izazvati manja ili veda oštedenja

staničnih struktura i oksidacijski stres te potaknuti zaštitne mehanizme i adaptivne odgovore

povedanjem sinteze zaštitnih spojeva. Ovisno o odnosu razine oštedenja i kapaciteta zaštitnih te

popravnih mehanizama, može dodi do smrti ili oporavka stanica, tkiva i čitave biljke, a to govori

o mogudnostima preživljavanja prirodnih populacija. S ekološkog gledišta, scenarij naglog

deseterostrukog povedanja UV zračenja na prirodnim staništima velebitske degenije malo je

vjerojatan. Međutim, zaraštavanje staništa drugim biljkama može znatno promijeniti kvalitetu i

kvantitetu upadnog UV zračenja (Xenopoulos i Schindler 2001), a mjera zaštite prirodnih

populacija uklanjanjem agresivnih biljaka (Kutle 1999) koje zarastaju staništa mogao bi imati

učinak izlaganja velebitske degenije naglom, pojačanom UV zračenju.

5.2. Učinci UV zračenja

5.2.1. Pokazatelji oksidacijskog stresa

UV zračenje uzrokuje oštedenja glavnih biomolekula i struktura u stanici izravno

fotolitički ili posredno uzrokujudi oksidacijski stres, tj. dovodedi do povišenih koncentracija

reaktivnih oblika kisika i slobodnih radikala (ROS). Pojavu oksidacijskog stresa u listovima

velebitske degenije, koje su nakon uzgoja u uvjetima s manjim UV zračenjem naglo izložene

prirodnoj insolaciji, utvrdio sam određivanjem koncentracije vodikovog peroksida (H2O2) kao

jednog od najzastupljenijih ROS u stanici, koncentracije malondialdehida (MDA) kao pokazatelja

oštedenja lipida, odnosno staničnih membrana te proteinskih karbonila koji nastaju uslijed

oksidacijskog oštedenja proteina u stanici.

U ravnotežnom stanju stanice H2O2 ima mnogobrojne uloge, npr. u regulaciji redoks

reakcija, otvaranju i zatvaranju puči, produženom rastu stanica, adaptivnom odgovoru na stres

itd. Međutim, povišena koncentracija H2O2 jedan je od prvih odgovora biljnog organizma na UV

zračenje i može se smatrati biomarkerom oksidacijskog stresa (Cheeseman 2007).

Vodikov peroksid ali opdenito i ostali ROS, fundamentalna su činjenica života u aerobnim

uvjetima (Møller 2001). Vodikov peroksid nastaje zbog poremedaja u prijenosu elektrona u


95

kloroplastima i mitohondrijima, koji su česta posljedica učinka UV zračenja na biljnu stanicu, u

Mehlerovoj reakciji, ali i zbog aktivnost pojedinih enzima, poput peroksidaza i superoksid

dismutaze, koji H2O2 stvaraju izravno ili putem reaktivnijih intermedijera.

Koncentracija H2O2 u listovima velebitske degenije bila je neznačajno povišena kod

biljaka koje su trajno uzgajane na suncu (skupina UV +) u odnosu na biljke koje su rasle ispod UV

folije s manjim UV zračenjem (skupina UV –). Takav rezultat je očekivan, bududi da su se biljke

obje skupine tijekom preduzgoja od zime do ljeta postupno prilagođavale uvjetima uzgoja i

odgovarajudem zračenju Sunca. Koncentracija H2O2 u listovima biljaka navedenih kontrolnih

skupina iznosila je oko 3 µmol gsv.t.-1, a iako su za ovaj pokus važniji odnosi koncentracija H2O2

između pokusnih skupina, sam rezultat je u skladu s nedavnim istraživanjem Cheesemana

(2006), koji usporedbom koncentracija H2O2 iz listova šest različitih biljnih vrsta prilagođenih

životu u ekstremnim uvjetima, kao ravnotežne koncentracije navodi vrijednosti od 1 do 5

µmol gsv.t.-1. Niska koncentracija H2O2 kod biljaka prilagođenih esktremnim staništima može biti

posljedica male stope stvaranja tog ROS u stanicama i/ili vrlo efikasnih sustava za njihovo

uklanjanje (Cheeseman 2007). Nakon izlaganja biljaka uzgajanih ispod UV folije (skupina

UV stres) prirodnoj insolaciji, koncentracija H2O2 se u prvih 12 sati (nakon doze zračenja od 1,03

MJ m-2) malo, ali značajno snizila. Značajnost tog prvotnog smanjenja koncentracije H2O2 za oko

16 % u odnosu na vrijednost prije izlaganja može se upitno tumačiti, bududi da ta vrijednost nije

bila značajno različita od prosječne koncentracije H2O2 kod biljaka skupine UV –. No, također je

mogude da je na pojačano i brzo sniženje koncentracije H2O2 utjecalo povedanje aktivnosti

enzima askorbat perksidaze i katalaze, primijedeno u listovima velebitske degenije nakon

izlaganja UV stresu. Slično, prolazno sniženje koncentracije H2O2 zabilježeno je kod učinka

deseterostrukog svjetlosnog stresa na uročnjak, koje se podudaralo s jakom aktivacijom jednog

izoenzima askorbat peroksidaze (Karpinski i sur. 1997) i postupnog toplotnog stresa na

termotolerantne kultivare graška (Chakraborty i Pradhan 2010). Međutim, u listovima

velebitske degenije sedmog dana izlaganja, odnosno nakon doze zračenja od 6,7 MJ m-2,

koncentracija H2O2 je porasla za 40 % u odnosu na početnu, te za 25 % u usporedbi s

koncentracijom kod biljaka skupine UV +. To povišenje koncentracije H2O2 mogudi je pokazatelj

štetnog učinka UV stresa na stanice, tj. pojave oksidacijskog stresa i utvrđeno je kod različitih

biljnih vrsta izloženih pojačanom UV zračenju, npr. kod vučjeg trna (Yang i sur. 2005), uročnjaka

(Kalbina i Strid 2006; Gao i Zhang 2008), soje (Xu i sur. 2008), kotiledona krastavca (Rybus-Zając

i Kubiś 2010) i riže (Fedina i sur. 2010).

Nakon dugotrajnog izlaganja suncu koncentracija H2O2 u listovima biljaka skupine

UV stres snizila se te je bila podjednaka vrijednosti prije izlaganja i slična onoj kod biljaka

skupine UV +, što se može pripisati adaptivnom odgovoru biljaka na UV stres i povedanoj

aktivnosti i/ili sintezi antioksidacijskih enzima. Slični rezultati, odnosno sniženje koncentracije

H2O2 nakon dosegnute maksimalne vrijednosti, primjedeno je petog dana pojačanog UV

zračenja kod kotiledona krastavca (Rybus-Zając i Kubiś 2010), te u dva kultivara graha (He i sur.

2004).

UV zračenje, dakle, uzrokuje povišenje koncentracije ROS u stanicama, a u slučaju da se

premaše kapaciteti mehanizama za njihovo uklanjanje, dovodi i do posrednih oštedenja lipida

staničnih membrana, najčešde u procesu peroksidacije lipida, koje se smatra najopasnijim od

svih oštedenja u živim stanicama (Gill i Tuteja 2010). Lipidni peroksidi su izrazito reaktivne i


96

nestabilne molekule od kojih u nizu reakcija nastaju stabilniji nusprodukti, poput

malondialdehida (MDA), koji se stoga često koristi kao pokazatelj oštedenja lipida i membrana u

stanicama (Hollósy 2002).

U listovima velebitske degenije nije pronađena značajna razlika između koncentracija

MDA kod biljaka skupine UV + i UV –, iako je bila malo viša kod biljaka koje su rasle ispod UV

folije (UV –), što ukazuje na to da su biljke koje rastu u prirodnim uvjetima dobro prilagođene

zračenju Sunca. Međutim, izlaganje biljaka koje su rasle ispod UV folije suncu izazvalo je

značajno povišenje koncentracije MDA ved nakon primljene doze od 0,52 MJ m-2, tj. nakon pet

sati izlaganja. Najveda izmjerena koncentracija MDA, nakon doze od 6,7 MJ m-2, bila je oko 55 %

viša od početne, što se podudara s povišenom koncentracijom H2O2 kod iste doze zračenja.

Koncentracija MDA ostala je značajno povišena i nakon dugotrajnog izlaganja suncu, u odnosu

na koncentraciju u biljkama skupina UV – i UV +. Taj rezultat ukazuje na oksidacijski stres i UV

zračenjem izazvana oštedenja membrana u stanicama listova velebitske degenije naglo izloženih

UV stresu, što je bilo i za očekivati s obzirom na ved spomenute učinke UV zračenja. Povišena

koncentracija MDA nakon izlaganja biljaka UV stresu može biti posljedica povišene

koncentracije određenih ROS koji nisu utvrđivani u ovome istraživanju. Umjereno, ali značajno

povišenje koncentracije MDA uočeno je kod klijanca kineske smreke koji su bili izloženi

30 %-tnom povedanju UVB zračenja u odnosu na sunčevo (Yao i Liu 2007). Tattini i sur. (2005)

uočili su 30 %-tno povišenje koncentracije MDA kod zelenike koja je nakon uzgoja u sjeni s 15 %

insolacije izložena suncu. Zelenika je, poput velebitske degenije, heliofit prilagođen uvjetima s

izraženom insolacijom. Suprotno tome, u istome pokusu kod kaline koja nije heliofit, povišenje

koncentracije MDA nakon izlaganja suncu bilo više od 100 %. Također u istraživanjima na

vanjskim pokusnim plohama, pojačano UV zračenje izazvalo je značajno povedanje lipidne

peroksidacije kod pasjeg trna (Yang i sur. 2005).

Osim oštedenja membrana, UV zračenje uzrokuje i oštedenja proteina, izravno u procesu

fotooksidacije aromatskih aminokiselina, ali najčešde posredno, u nepovratnom procesu

karbonilacije proteina (Møller i sur. 2007). Ustanovljeno je da je UV stres izazvao čak trostruki

porast koncentracije proteinskih karbonila iz tilakoidnih membrana graha (Shi i sur. 2005), a

umjereno povišenje koncentracije karbonila u listovima uročnjaka bilo je proporcionalno

porastu jačine UV zračenja (Landry i sur. 1995).

U listovima velebitske degenije nije bilo razlike u koncentraciji proteinskih karbonila

između skupina UV + i UV – što se slaže s rezultatima peroksidacije lipida (koncentracije MDA) i

potvrđuje prilagođenost velebitske degenije sunčevom zračenju. Nakon izlaganja biljaka

skupine UV stres suncu koncentracija karbonila isprva se neznatno snizila, a nakon doze od 6,7

MJ m-2 bila je više nego dvostruko viša u odnosu na početnu. Bududi da je sličan odgovor

dobiven i za koncentraciju H2O2, mogude je da upravo taj ROS sudjeluje u fotooksidacijskom

oštedenju proteina. Međutim, nakon dugotrajnog izlaganja suncu koncentracija karbonila, iako

se smanjila u odnosu na najvedu izmjerenu, ostala je značajno viša u odnosu na početnu te na

onu kod kontrolnih skupina. Takav odgovor poklapa se s rezultatima dobivenim za MDA, a

suprotan je onima za H2O2. Evidentno je da je nagli UV stres u pokusnim biljkama izazvao

oksidacijski stres i oštedenje proteina, ali i da dugotrajno izlaganje suncu dovodi do adaptacije i

djelomičnog oporavka biljaka. U zanimljivom istraživanju učinka vidljivog i UV zračenja na


97

kalinu, Guidi i sur. (2011) uočili su značajno višu koncentraciju proteinskih karbonila u biljkama

koje su uzgajane u sjeni s UV zračenjem, u odnosu na biljke koje su uzgajane u sjeni bez UV

zračenja. Također, nije bilo značajne razlike u koncentraciji karbonila u biljkama koje su

uzgajane na suncu sa ili bez UV zračenja.

Bududi da nije bilo značajne razlike u koncentracijama H2O2, MDA i proteinskih karbonila

u listovima velebitske degenije kod biljaka skupine UV + u odnosu na koncentracije kod biljaka

skupine UV –, može se zaključiti da su biljke te skupine tijekom dugotrajnog uzgoja u uvjetima

prirodne insolacije imale dobro razvijene mehanizme obrane kako bi izbjegle stanje

oksidacijskog stresa. U ved spomenutim istraživanjima Guidi i sur. (2011) također nisu nađene

razlike u koncentracijama MDA i proteinskih karbonila u listovima kaline uzgajane na suncu sa ili

bez UV zračenja pa autori smatraju da intenzivna vidljiva svjetlost (PAR) može dovesti do

fizioloških prilagodbi koje sprečavaju stvaranje ROS te se snižava njihova koncentracija.

Međutim, naglo izlaganje jedinki velebitske degenije koje su rasle ispod UV folije povedanom

zračenju Sunca izazvalo je u njihovim listovima oksidacijski stres, što je vidljivo iz značajnog

povišenja koncentracija H2O2, MDA i proteinskih karbonila. Obrazac promjene koncentracije

H2O2 i proteinskih karbonila kod biljaka skupine UV stres bio je vrlo sličan: tijekom početnog UV

stresa (do doze zračenja od 1,03 MJ m-2) nije zabilježena veda promjena koncentracija, ali su

nakon doze zračenja od 6,7 MJ m-2 značajno povišene u odnosu na početnu. S druge strane,

koncentracija MDA značajno se povisila ved nakon doze zračenja od 0,52 MJ m-2, a također je

bila najveda nakon doze zračenja od 6,7 MJ m-2. Takav rezultat ukazuje na mogudnost da nagli

UV stres i manje doze zračenja isprva uzrokuju povišenje koncentracije i nekih ROS reaktivnijih

od H2O2, koji odmah uzrokuju peroksidaciju lipida, što je slično zaključcima Xu i sur. (2008) u

istraživanju učinaka sunčevog UV zračenja na antioksidacijski sustav kod soje. Bududi da se

koncentracija H2O2 nakon dugotrajnog stresa vratila na početnu razinu, a da su se oštedenja

lipida i proteina smanjila, može se zaključiti da je došlo do aktivacije zaštitnih mehanizama, što

je i dokazano u ovom radu povedanom aktivnošdu antioksidacijskih enzima i povišenom

koncentracijom flavonoida, koji su doprinijeli oporavku biljaka i polaganoj aklimatizaciji na

povedano sunčevo zračenje.

5.2.2. Fotosintetski aparat

Unatoč razlikama u učinku UV zračenja na fotosintezu kod različitih biljnih svojti,

fotosintetski aparat se smatra jednom od glavnih struktura u biljnoj stanici u smislu osjetljivosti

na UV zračenje i jednim od glavnih izvora ROS u stanju oksidacijskog stresa (Hollósy 2002).

Učinak UV zračenja na fotosintetski aparat u stanicama listova velebitske degenije utvrdio sam

istraživanjem promjena u ekspresiji strukturnih proteina D1 i LHC te enzima

ribuloza 1,5-bisfosfat karboksilaza oksigenaza (RuBisCO), kao i promjena koncentracija

fotosintetskih pigmenata te efikasnosti fotosintetskog aparata na temelju fluorescencije

klorofila a.


98

Fotosistem (PS ) je multifunkcionalni proteinsko-pigmentski kompleks koji je usidren

u tilakoidnim membranama kloroplasta, a čine ga tri osnovna proteinska kompleksa: antenski

kompleks, reakcijsko središte i kompleks za fotooksidaciju vode (Yakushevska i sur. 2001).

Glavna funkcija PS je fotolitičko cijepanje vode na protone i molekularni kisik te prijenos

oslobođenih elektrona na pokretne molekule plastokinona. Okosnicu reakcijskog središta PS

čini heterodimer hidrofobnih proteina nazvanih D1 i D2, koji vežu različite kofaktore važne za

prijenos elektrona unutar PS : klorofile primarnog donora elektrona P-680, molekule

β-karotena, plastokinona, feofitina itd. (Rhee 2001).

U listovima velebitske degenije nije bilo razlike u razini proteina D1 između biljaka koje

su rasle na suncu u odnosu na one ispod UV folije. Do promjene u razini tog proteina nije došlo

ni u biljkama skupine UV stres. Rezultati su bili neočekivani s obzirom na to da se fotosistem

(PS ) i protein D1 smatraju najosjetljivijim dijelom fotosintetskog aparata (Vass i sur. 2005). U

mnogim pokusima koji su temeljeni na ozračivanju listova ili izoliranih tilakoida UV lampama u

laboratorijskim pokusima (Trebst i Depka 1990; Friso i sur. 1994) primijedeno je sniženje

koncentracije proteina D1 zbog njegove degradacije ili smanjene sinteze. Također je

primijedeno da pojačano UVB zračenje uzrokuje oštedenja proteina D1 u izoliranim tilakoidama

kloroplasta i u listovima špinata i kukuruza in vivo (Barbato i sur. 1995). U prirodnim uvjetima uz

određenu količinu UV zračenja prisutna je i vidljiva svjetlost, koja pri visokim intenzitetima

također može uzrokovati fotoinhibicijska oštedenja PS zbog negativnog učinka na sintezu

proteina D1 (Nishiyama i sur. 2011). U istraživanima uloge vidljive svjetlosti u oporavku PS

ječma i uročnjaka nakon izlaganja UV zračenju, utvrđeno je da metabolizam proteina D1

predstavlja složeni proces te ovisi o kvaliteti i kvantiteti dostupne svjetlosti (Bergo i sur. 2003).

Pokazalo se da intenzivna vidljiva svjetlost može posredno uzrokovati oksidacijsko oštedenje

proteina D1, dok UV zračenje izravno fotolitički uzrokuje njegovu fragmentaciju. Istodobno,

male količine bijele svjetlosti dovoljne su za poticanje proteolitičke aktivnosti enzima proteaze

koja uklanja fragmente proteina D1, te za poticanje sinteze novih molekula i u tom smislu

popravak PS . Dakle, mogude je da u listovima velebitske degenije UV stres nije izazvao

značajne promjene u ekspresiji proteina D1 jer su biljke uzgajane i prilagođene uvjetima

prirodnog PAR, koje može potaknuti fotoprotektivne mehanizme popravka. Slično tome,

neznatna inaktivacija proteina D1 uočena je u mladih listova prilagođenih jakom svjetlu kod

tropske vrste Anacardium excelsum (Thiele i sur. 1997).

Stalne promjene u kvaliteti i kvantiteti sunčeva zračenja (svjetlosti) utječu na procese

fotosinteze pa je biljkama potreban niz adaptivnih i zaštitnih mehanizama koji de osigurati

normalno funkcioniranje fotosintetskog aparata. Na molekularnoj razini ključnu regulacijsku

ulogu ima antenski kompleks PS koji je odgovoran za apsorpciju svjetlosne energije, ali i

kontrolu količine energije „dostavljene” reakcijskom centru PS (Ruban 2009). Kompleks za

prikupljanje svjetlosti (Light harvesting complex, LHC) predstavlja vanjsku komponentu

antenskog kompleksa PS . Glavnu proteinsku strukturu LHC čine LHCb proteini koji vežu

45-60 % molekula klorofila, a u tilakoidama se nalaze kao heterotrimerni kompleksi sastavljeni

od proteina kodiranih genima Lhcb1, Lhcb2 i Lhcb3 (Kühlbrandt 1994). Svaki od apoproteina

trimera na sebe vezuje 14 molekula klorofila (osam molekula klorofila a i šest molekula

klorofila b), dvije molekule luteina i molekulu neoksantina (Liu i sur. 2004). U imunodetekciji


99

proteina LHC fotosintetskog aparata velebitske degenije korištena su antitijela na proteine

Lhcb2, koji su najčešdi proteini u sklopu trimera pa sukladno tome ekspresija tog apoproteina

predstavlja ekspresiju proteina LHC Protein LHC ima važnu ulogu u brzoj prilagodbi biljke na

promjenjive uvjete umjerenog osvjetljenja, kada se tzv. promjenom stanja („state transitions”)

stalno održava energetska ravnoteža između PS i PS . Proces uključuje fosforilaciju i odvajanje

pojedinih kompleksa LHC , redukciju veličine antenskog kompleksa PS i migraciju fosfo-LHC

do PS (Ruban 2009). No, taj proces je važan adaptivni mehanizam kod biljaka sjene i ne

uključuje promjene u ukupnoj koncentraciji pigmenata i proteina. LHC ima važnu ulogu i u

dugoročnim, odnosno sporijim fotoprotektivnim mehanizmima jer sudjeluje u rasipanju suviška

apsorbirane svjetlosne energije u obliku topline unutar LHC , što se manifestira u

nefotokemijskom gašenju fluorescencije klorofila a („non-photochemical quenching”, NPQ). U

tom procesu osim proteina kompleksa za prikupljanje svjetlosti sudjeluju i karotenoidi, naročito

oni koji sudjeluju u tzv. ksantofilskom ciklusu: violaksantin, anteraksantin i zeaksantin.

U listovima velebitske degenije skupine UV + akumulacija proteina LHC bila je čak 2,5

puta veda u odnosu na ekspresiju kod biljaka UV –. Kod biljaka skupine UV stres ved nakon doze

zračenja od 1,03 MJ m-2 primijeden je značajan porast ekspresije proteina LHC , koja je nakon

doze zračenja od 6,7 MJ m-2 bila gotovo 3,5 puta veda, da bi se nakon dugotrajnog izlaganja

suncu malo smanjila. U vedini istraživanja koja su se bavila učincima promjene kvantitete i

kvalitete osvjetljenja na fotosintetski aparat zabilježeno je sniženje koncentracije proteina LHC

proporcionalno rastu intenziteta svjetlosti (Walters 2005; Ruban 2009) i redukcija veličine

antenskih kompleksa nakon dugotrajnog izlaganja biljke intenzivnoj svjetlosti, čime se smanjuje

količina apsorbirane svjetlosti i sprečava fotoinhibicija (Anderson i sur. 1995). U tim i sličnim

radovima uglavnom su korištene modelne biljke poput uročnjaka, duhana i žitarica, koje su

izlagane različitim intenzitetima bijele svjetlosti, od potpune zasjene do intenzivnog osvjetljenja,

a nedostaju podaci o učinku ambijentalnog (sunčevog) UV zračenja na biljke prilagođene jakim

svjetlosnim uvjetima kao što je to slučaj u ovom istraživanju. Nedavno su Saito i sur. (2010)

utvrdili da je kod divljeg tipa ječma, dugotrajno uzgajanog u uvjetima deficijencije željeza, bila

pojačana ekspresija gena kodirajudih za proteine LHC , što je potaknulo reorganizaciju

antenskih kompleksa i uvjetovalo pojačani NPQ. Takav adaptivni odgovor u uvjetima stresa

zaštitio je biljku od fotoinhibicije. U slučaju velebitske degenije sve su pokusne skupine bile

izložene uvjetima s istim visokim intenzitetom vidljive svjetlosti, kojima je heliofit poput

velebitske degenije potpuno prilagođen, a ekspresija proteina LHC bila je značajno manja u

biljkama koje su rasle izložene manjem ukupnom zračenju, odnosno u uvjetima s manjim UV

zračenjem sunca. Izlaganje biljaka skupine UV – suncu djelovalo je u smjeru povedanja

ekspresije proteina LHC , koji je nakon dugotrajnog izlaganja ostao na „prirodnoj” razini, kakva

je utvrđena kod biljaka skupine UV +. Stoga je mogude da porast akumulacije proteina LHC

predstavlja adaptaciju velebitske degenije kojom izbjegava negativne učinke naglog povedanja

intenziteta sunčeva zračenja.

Proteini antenskih kompleksa i reakcijskih središta fotosistema čine svojevrsni kostur na

koji su vezane najvažnije molekule za sam proces fotosinteze – pigmenti. Kod viših biljaka u


100

kloroplastima nalazimo klorofil a i b koji imaju osnovnu ulogu u apsorpciji i prijenosu svjetlosne

energije, ali su važni i za organizaciju pravilnog sklapanja fotosintetskog aparata.

U listovima velebitske degenije koncentracija klorofila, osobito klorofila b, bila je viša u

listovima skupine UV + u odnosu na koncentraciju kod biljaka skupine UV –. Izlaganje suncu

izazvalo je malo povišenje koncentracije klorofila a te dvostruko povišenje koncentracije

klorofila b u listovima skupine UV stres. Omjer koncentracija klorofila a i b (klor. a/b) često se

koristi kao indikator veličine vanjskog dijela antenskog kompleksa, dakle kompleksa za

sakupljanje svjetlosti (LHC), bududi da unutarnji dijelovi antenskog kompleksa, kao i reakcijska

središta, sadrže samo klorofil a (Murchie i Horton 1998). Sve pokusne skupine velebitske

degenije uzgajane su u jednakim uvjetima intenziteta PAR i vjerojatno zbog toga nije bilo

značajne razlike u omjeru klor. a/b između biljaka skupina UV – i UV +, iako je ta vrijednost bila

nešto manja kod biljaka skupine UV +. Nagli UV stres izazvao je značajno smanjenje omjera klor.

a/b u biljkama skupine UV stres zbog povišenja koncentracije klorofila b, što također ukazuje na

povedanje LHC fotosistema, a slaže se i s primijedenom akumulacijom LHCII proteina.

Postupnom prilagodbom tijekom dugotrajnog izlaganja suncu omjer se postupno povedavao, tj.

primijedena je aklimatizacija biljaka vjerojatno zbog postupnog smanjenja veličine LHC, koji je

na kraju izlaganja podjednak veličini kod biljaka skupine UV +. Za razliku od dobivenih rezultata,

u vedini istraživanja učinaka pojačanog intenziteta svjetlosti na biljke prilagođene sjeni, kao i u

istraživanjima učinaka pojačanog UVB zračenja na sastav fotosintetskih pigmenata kod različitih

biljnih vrsta, najčešde je utvrđeno povedanje omjera koncentracije klorofila a i b. To je

posljedica prilagodbe jakoj svjetlosti tijekom koje dolazi do sniženja koncentracije klorofila b, tj.

smanjenja veličine antenskih kompleksa, kako bi se izbjegla fotoinhibicija (Krause i sur. 2004) ili

posljedica poremedaja u sintezi klorofila a (Choi i Roh 2003). Međutim, u pokusu Krausea i sur.

(2007), kod dviju vrsta tropskih stabala uzgajanih na suncu sa ili bez UV zračenja nije nađena

razlika u omjeru klorofila a i b.

Osim klorofila, u fotosintetskom aparatu prisutni su i karotenodi (ksantofili i karoteni),

koji u manjoj mjeri služe sakupljanju svjetlosne energije, bududi da proširuju akcijski spektar

fotosinteze, a neophodni su u zaštiti od fotooksidacijskih procesa. Violaksantin, anteraksantin i

zeaksantin (VAZ) važni su sudionici ksantofilskog ciklusa i mehanizma rasipanja suviška

apsorbirane svjetlosne energije u obliku topline. Lutein, neoksantin i β-karoten imaju glavnu

ulogu, osim stabilizacije antenskog kompleksa, u gašenju (uklanjanju, deenergizaciji) tripletnog

klorofila (Peterman i sur. 1997) i singletnog kisika (Havaux i sur. 2000). Tripletni klorofil nastaje

u antenskim kompleksima ili reakcijskim središtima zbog nedostatnog rasipanja suviška

ekscitona, a singletni kisik je produkt reakcije tripletnog klorofila s molekularnim kisikom.

Iz listova velebitske degenije uspješno su ekstrahirani violaksantin i anteraksantin, ali ne

i zeaksantin, koji je ostao nerazdvojen i zamaskiran vedim pikom luteina. Violaksantina je bilo

oko dva, a anteraksantina oko 2,5 puta više u listovima biljaka skupine UV + u odnosu na biljke

skupine UV –. Izlaganje suncu je u biljkama skupine UV stres generalno izazvalo snažan i

značajan porast koncentracije oba pigmenta. Nakon dugotrajnog izlaganja suncu koncentracija

violaksantina snizila se na vrijednosti slične na početku izlaganja, dok je koncentracija

anteraksantina ostala povišena u odnosu na početnu i istovjetna onoj kod biljaka skupine UV +.

Ksantofilski ciklus ključan je za fotoprotektivni mehanizam rasipanja suviška aposorbirane

svjetlosti u obliku topline (Demming-Adams 1990). U uvjetima jake svjetlosti dolazi do


101

zakiseljavanja tilakoidnog lumena, što aktivira enzim violaksantin de-epoksidazu, koji katalizira

pretvorbu violaksantina u anteraksantin i zatim u zeaksantin. Zeaksantin s proteinima

antenskog kompleksa suvišak ekscitona rasipa u obliku topline (Demming-Adams 1990; Bassi i

Caffari 2000), ali je također dokazano da ima i antioksidacijske sposobnosti i štiti lipidnu

komponentu tilakoida od peroksidacije (Havaux i sur. 2007). Porast količine pigmenata

ksantofilskog ciklusa u procesu aklimatizacije intenzivnoj sunčevoj svjetlosti opisan je u klijanaca

nekoliko tropskih stabala (Krause i sur. 2004), no nije nađena razlika između koncentracije tih

pigmenata u mladicama dvaju tropskih stabala koje su rasle na suncu sa ili bez UV zračenja

(Krause i sur. 2007). Bolink i sur. (2001) su utvrdili značajan porast koncentracije karotenoida u

listovima graška izloženim jakoj svjetlosti nakon predtretmana s pojačanim UVB zračenjem,

kojemu je pripisana potencijalna pozitivna uloga u povedavanju fotoprotektivnih sposobnosti

biljke. Prema postojedim modelima, na NPQ, odnosno na rasipanje suvišne ekscitacijske

energije u obliku topline, utječu samo oni ksantofili koji su vezani unutar

proteinsko-pigmentskog antenskog kompleksa za prikupljanje svjetlosti (Gilmore 2001). Broj

veznih mjesta za molekule VAZ u proteinskom kompleksu je ograničen pa dio ukupne količine

VAZ mora biti slobodan u membranama kloroplasta (Anderson i sur. 2001). Takvu sugestiju

potvrđuje istraživanje zeaksantin-deficijentnog mutanta uročnjaka u kojem je dokazano da je

tek mala količina zeaksantina dovoljna za postizanje maksimalnog kapaciteta zeaksantin

ovisnog NPQ (Pogson i sur. 1998). Također nije utvrđena jednostavna ovisnost NPQ i količine

zeaksantina usred povedanja ukupne količine VAZ kod mutanta jednostanične zelene alge vrste

Chlamydomonas reinhardtii otpornog na jaku svjetlost (Förster i sur. 2001). Imajudi na umu

spomenutu ulogu zeaksantina u zaštiti tilakoidnih membrana od lipidne peroksidacije (Havaux i

sur. 2000), povišenje koncentracije VAZ moglo bi imati osnovnu antioksidacijsku ulogu tijekom

izlaganja biljke svjetlosnom stresu. Iako je uvriježeno mišljenje da se biljke fiziološki prilagođuju

velikim oscilacijama sunčeva zračenja povišenjem koncentracije VAZ, ono ovisi i o uvjetima

kojima je biljka bila izložena prije samog svjetlosnog stresa. Takav zaključak potvrđen je u

istraživanju kinetike prilagodbe koncentracije pigmenata VAZ pojačanom osvjetljenju u

listovima lipe i trepetljike (Niinemets i sur. 2004). U listovima trepetljike iz gornjih slojeva

krošnje, koji su dobro prilagođeni jakoj svjetlosti, nakon dodatnog osvjetljavanja došlo je do

značajnog povišenja koncentracije VAZ, dok je u listovima lipe iz zasjenjenih dijelova krošnje to

povišenje bilo značajno manje. Razlike u aklimatizaciji listova trepetljike i lipe mogude je

povezati s različitim veličinama njihovih antenskih kompleksa i brzinom obnavljanja proteina

fotosistema (Niinemets i sur. 2004). Zanimljivo je da proteini LHC također sadrže vezna mjesta

za molekule ksantofila koje ne sudjeluju u apsorpciji svjetlosti, nego vjerojatno povedavaju

ukupnu količinu violaksantina brzo dostupnog za de-epoksidaciju, čime se povedava

antioksidacijski kapacitet i potiče NPQ (Caffari i sur. 2001). U tom smislu razvijeniji antenski

sustav PS , poglavito LHC , mogao bi vezati vedi broj molekula pomodnih pigmenata i na taj

način osigurati bolju zaštitu fotosistema u uvjetima jakog osvjetljenja. Sama uloga proteinskih

trimera LHC u mehanizmu rasipanja topline nije u potpunosti razjašnjena, ali pojedina

istraživanja ukazuju na njihovu važnost za sam mehanizam. Npr. Elrad i sur. (2002) su

uspoređivali divlji tip jednostanične zelene alge vrste Chlamydomonas reinhardtii s mutantom

npq5. Mutant alge posjeduje iste fotoprotektivne mehanizme kao i divlji tip, ali je osjetljiviji na

fotoinhibiciju te ima značajno smanjen NPQ i za jednu tredinu manje trimera LHC u antenskom


102

kompleksu zbog nefunkcionalnog gena Lhcbm1, koji kodira za jedan od polipeptida trimera. Na

temelju tih podataka vidljivo je da proteini LHC sudjeluju u procesu rasipanja topline i imaju

značajnu ulogu u fotoprotekciji.

Osim spomenutih, koncentracije ksantofila luteina i neoksantina također su bile

značajno više u biljkama skupine UV + u odnosu na koncentracije kod biljaka skupine UV –, a

izlaganje suncu izazvalo je značajno povišenje koncentracija u biljkama skupine UV stres. Lutein,

koji je u listovima velebitske degenije bio najzastupljeniji karotenoid, osim prikupljanja svjetlosti

ima važnu ulogu u pravilnom sklapanju podjedinica PS i održavanje stabilnosti antenskog

kompleksa. U lutein-deficijentnih mutanata uročnjaka vezna mjesta na proteinima antenskog

kompleksa donekle su bila popunjena molekulama VAZ, ali takav ksantofilski sastav mutanta

nije pružio dovoljno dobru kombinaciju stabilizacije, fleksibilnosti i funkcionalnosti antenskog

kompleksa, što je bilo vidljivo u značajnom smanjenju NPQ (Lokstein i sur. 2002). Najvažnijom

fotoprotektivnom ulogom luteina smatra se stabilizacija tripletnog klorofila te ograničeno

sudjelovanje u NPQ (Jahns i Holzwarth 2011). Također, lutein sudjeluje u tzv.

lutein-epoksidskom ciklusu u kojemu se lutein-epoksid na jakoj svjetlosti pretvara u lutein, a

uloga tog ciklusa u fotoprotekciji slična je violaksantinskom ciklusu (Bungard i sur. 1999).

Povišenje koncentracije luteina nakon izlaganja pojačanom UV zračenju primjedeno je u

mnogim istraživanjima, npr. kod graška (Bolink i sur. 2001), zelenih kultivara salate (Caldwell i

Britz 2006) i kod bukve (Láposi i sur. 2009). Neoksantinu se također pripisuju uloge u stabilizaciji

tripletnog klorofila i singletnog kisika (Jahns i Holzwarth 2011) te antioksidacijske sposobnosti

(Dall’Osto i sur. 2007), a nedavno je predložen model u kojemu je upravo neoksantin ključan

„prekidač” koji u uvjetima jakog svjetlosnog stresa utječe na promjenu konformacije LHC ,

čime se omoguduje NPQ (Ruban i sur. 2007). Povišena koncentracija neoksantina uzrokovana

jakim svjetlosnim stresom nakon predtretmana UVB zračenjem uočena je kod graška (Bolink i

sur. 2001), dok u listovima dviju vrsta tropskih stabala uzgajanih na suncu sa ili bez UV zračenja

nije uočena razlika u koncentracijama (Krause i sur. 2007).

Za razliku od ksantofila, koncentracija β-karotena u listovima velebitske degenije

uzgajane na suncu bila je neznatno viša u odnosu na koncentraciju u listovima biljaka ispod UV

folije. Značajno povišene koncentracije u odnosu na početnu kod biljaka skupine UV stres,

utvrđene su nakon doza zračenja od 1,03 i 6,7 MJ m-2, ali iste nisu bile značajno više od

koncentracije kod biljaka skupine UV +. Dakle, UV stres nije izazvao jednako brzo i veliko

povišenje koncentracije tog karotenoida u usporedbi s ksantofilima, što se poklapa s činjenicom

da je β-karoten vezan isključivo za reakcijska središta i središnje dijelove antenskih komplekasa

fotosistema, a nije prisutan u kompleksima za prikupljanje svjetlosti (Trebst 2003). Najvažnija

uloga β-karotena je stabilizacija singletnog kisika, čime se osigurava veda stabilnost antenskog

kompleksa, a posebice štite strukturni proteini reakcijskih središta D1 i D2 (Telfer 2002).

Značajno povišenje koncentracije β-karotena naspram α-karotenu utvrđeno je u procesu

aklimatizacije listova sjene dviju tropskih vrsta stabala izravnoj sunčevoj svjetlosti (Krause i sur.

1999).

Enzim RuBisCO, jedan od najvažnijih enzima u procesu fotosinteze, katalizira vezanje

atmosferskog CO2 u prvim reakcijama Calvinovog ciklusa, odnosno karboksilaciju i oksigenaciju

šedera ribuloze-1,5-bisfosfata (Bowes i Ogren 1972). Katalitička sposobnost enzima RuBisCO je

relativno mala pa je to najvjerojatniji razlog njegove velike zastupljenosti, od oko 50 % ukupne


103

količine proteina strome kloroplasta. RuBisCO je protein koji se u biljnoj stanici stalno obnavlja

u ciklusu sinteze i degradacije, a nije posve jasno je li učinak UV zračenja na koncentraciju tog

proteina posljedica smanjene sinteze ili pojačane degradacije (Takeuchi i sur. 2002). UV

zračenje može izravno fotolitički oštetiti molekulu RuBisCO ili posredno putem ROS u stanju

oksidacijskog stresa (Vass i sur. 2005). Povišena koncentracija nekih ROS poput H2O2, koji u

stanju stresa služe kao signalne molekule, također može inhibitorno djelovati na transkripciju

gena RbcL i RbcS koji kodiraju za polipeptide velike i male podjedinice proteina RuBisCO, zbog

čega dolazi do zastoja u sintezi i sniženju koncentracije enzima (Macherness i sur. 1999). Takav

negativan učinak UV zračenja na koncentraciju i/ili aktivnost enzima RuBisCO opisan je kod

mnogih biljaka, npr. soje i graška (Vu i sur. 1984), krastavca (Caldwell 1993) i repice (Allen i sur.

1997; Keiller i sur. 2003). Takeuchi i sur. (2002) utvrdili su negativan učinak pojačanog UV

zračenja na sintezu i količinu proteina RuBisCO u listovima kultivara riže „Norin 1”, ali ne i u

listovima UV-tolerantnog kultivara „Sashaniki”. Osjetljivosti kultivara „Norin 1” na UV zračenje

pripisuju specifičnoj supresiji biosinteze molekula RuBisCO nakon faze transkripcije. Kod

velebitske degenije nije primijedena razlika u ekspresiji enzima RuBisCO između biljaka koje su

rasle na suncu i biljaka ispod UV folije, a nije bilo promjene u ekspresiji tog proteina ni u

listovima biljaka skupine UV stres. Taj rezultat je u skladu s postojanom ekspresijom proteina

D1 i povedanjem ekspresije proteina LHC , koja pokazuje da UV zračenje nije uzrokovalo

strukturna oštedenja fotosintetskog aparata te da je velebitska degenija, kao izraziti heliofit,

prilagođena životnim uvjetima s visokim intenzitetom osvjetljenja.

U uvjetima jakog intenziteta osvjetljenja dio svjetlosne energije koju je apsorbirao LHC

koristi se za fotokemijske reakcije fotosinteze, a dio neiskorištene energije ekscitona mora se iz

PS „odstraniti” kako bi se spriječila fotooksidacijska oštedenja. Suvišak energije emitira se

putem nefotokemijskih reakcija, najčešde u obliku topline, ili kao fluorescencija (Schreiber i sur.

1994). Dinamika fotokemijskih i nefotokemijskih reakcija utječe na promjene u intenzitetu

fluorescencije, pa se in vivo mjerenjem fluorescencije klorofila a može ispitati učinkovitost PS .

UV zračenjem uzrokovano smanjenje optimalnog prinosa fluorescencije može poslužiti

kao indikator fotoinhibicije koju potiče poremedeni prijenos elektrona u stresnim uvjetima, a

tijekom koje često dolazi do oštedenja proteina D1, što je npr. utvrđeno u kultivara repice

(Olsson i sur. 1999). U listovima velebitske degenije nije utvrđena razlika u optimalnom (Fv/Fm)

i efektivnom (ΔF/F'm) prinosu fluorescencije između biljaka skupina UV + i UV –, a također nije

bilo promjene u vrijednostima tih parametara kod biljaka skupine UV stres nakon izlaganja

suncu, što se poklapa i s očuvanošdu D1 proteina. U novijim istraživanjima utjecaja UV zračenja

na biljke koristi se pristup uzgoja biljaka na vanjskim pokusnim plohama izloženima „realnim”

uvjetima sunčeva zračenja, a rezultati ukazuju na to da fiziološke promjene ne ovise samo o

dozi UV zračenja, ved i intenzitetu PAR, odnosno o kvaliteti i kvantiteti ukupnog sunčevog

zračenja kojemu je biljka izložena (Paul i Gwynn-Jones 2003). Izlaganje povedanom UVB

zračenju u uvjetima visokog intenziteta osvjetljenja nije uzrokovalo promjene u Fv/Fm i ΔF/F'm

kod graška (Nogues i sur. 1995) i repice (Allen i sur. 1997). Suprotno tome, vrlo malo povedanje

UVB zračenja izazvalo je u uvjetima slabog osvjetljenja značajno oštedenje proteina D1 i D2 te

smanjenu učinkovitost PS (Booij-James i sur. 2000). Istraživanje Bolink i sur. (2001) pokazalo je


104

da predtretman s UVB zračenjem smanjuje fotoinhibiciju izazvanu visokim intenzitetom vidljive

svjetlosti kod graška i graha. Naime, smanjen Fv/Fm je u listovima pokusnih biljaka nakon

izlaganja intenzivnoj bijeloj svjetlosti bilo puno blaže i sporije u uzorcima prethodno tretiranima

UVB zračenjem. Ti rezultati u skladu su s rezultatima istraživanja učinkovitosti fotokemije PS u

listovima velebitske degenije, bududi da su sve skupine za vrijeme pokusa rasle u jednakim

uvjetima jakog osvjetljenja. Biljke koje su rasle ispod UV folije bile su izložene značajno

smanjenom sunčevom UV zračenju, a nagli UV stres kod tih biljaka nije izazvao ni strukturne ni

funkcionalne poremedaje u PS , što je vidljivo iz postojanosti vrijednosti Fv/Fm i ΔF/F'm.

Fotokemijsko gašenje fluorescencije (PQ) bilo je podjednako kod svih pokusnih skupina

velebitske degenije, što odgovara rezultatima ΔF/F'm i ukazuje na to da UV zračenje nije

utjecalo na broj otvorenih (oksidiranih) reakcijskih centara PS , tj. da nije bilo negativnog

učinka UV zračenja na količinu apsorbirane energije koja se koristi u fotokemijskim reakcijama.

S druge strane, nefotokemijsko gašenje fluorescencije (NPQ) bilo je značajno vede u biljkama

skupine UV + u odnosu na biljke skupine UV –. Iako je kod biljaka skupine UV stres s rastudom

dozom primljenog UV zračenja bio vidljiv trend povedanja NPQ, nije utvrđena statistički

značajna razlika između tih vrijednosti u odnosu na početnu. Mogude je da je takav rezultat

posljedica otežanog in vivo mjerenja fluorescencije klorofila a na izrazito uskim listovima

velebitske degenije. Također, listovi su prekriveni gustim pokrovom mrtvih epidermskih

trihoma (dlaka) koje mogu utjecati na kvalitetu prikupljenog fluorescencijskog signala. Unatoč

tome, značajno vedi NPQ kod biljaka koje su rasle na suncu u odnosu na biljke ispod UV folije, uz

nepromjenjive vrijednosti Fv/Fm i ΔF/F'm, ukazuje na potaknutu fotoprotekciju izazvanu

povedanim UV zračenjem. Slično ovim rezultatima, značajno vedi NPQ nađen je u listovima

kaline izložene prirodnom sunčevom zračenju, u odnosu na NPQ u listovima biljaka na suncu

bez UV zračenja (Guidi i sur. 2011).

Svi navedeni rezultati ukazuju da UV stres nije izazvao izravna ili fotoinhibicijska

oštedenja fotosintetskog aparata u listovima velebitske degenije. Nisu otkrivena strukturna

oštedenja PS , što je vidljivo iz postojane ekspresije proteina D1, niti su utvrđeni funkcionalni

poremedaji, s obzirom na to da UV zračenje nije imalo učinka na ekspresiju enzima RuBisCO.

Značajan porast ekspresije proteina LHC , strukturnog proteina vanjskog dijela antenskog

kompleksa PS , podudara se sa značajnim povišenjem koncentracije svih karotenoida, kojih je

najvažnija uloga zaštitne prirode, bududi da ti pigmenti sudjeluju u stabilizaciji i efikasnom

funkcioniranju PS , uklanjanju singletnog kisika, stabilizaciji tripletnog klorofila te pojačanoj

fotoprotekciji putem NPQ. S time je u skladu i značajno smanjenje omjera koncentracija

klorofila a i b zbog povišenja koncentracije klorofila b, koji prema novijim istraživanjima ima

značajnu ulogu ne samo u pravilnom sklapanju i stabilizaciji LHC, ved i regulaciji veličine

antenskog kompleksa (Tanaka i Tanaka 2000). Sve navedeno ukazuje na povedanje LHC

antenskih komplesa PS u listovima biljaka skupine UV stres, a bududi da je UV stres u listovima

uzrokovao oštedenja lipida i proteina, mogude je da je povedanje LHC specifični mehanizam

kojim biljka prilagođena uvjetima jakog intenziteta vidljive svjetlosti nastoji zaštititi svoj

fotosintetski aparat od oštedenja uslijed UV zračenja. Također je izgledno da ambijentalna

količina UV zračenja u uvjetima jakog intenziteta vidljive svjetlosti, kojima je velebitska degenija


105

prilagođena, ima stimulativni učinak na fotoprotektivne mehanizme, što se očituje u

povedanom LHC.

Da UV zračenje nije imalo negativne učinke na građu i funkcioniranje PS potvrđeno je

nepromijenjenim vrijednostima Fv/Fm, ΔF/F'm i PQ, a značajno vedi NPQ kod biljaka na suncu u

odnosu na biljke ispod UV folije može se objasniti višom koncentracijom dvaju utvrđenih

pigmenata violaksantinskog ciklusa. Iako na temelju dobivenih rezultata nije sa sigurnošdu

mogude tumačiti mehanizme fotoprotekcije, jasno je da je UV zračenje potaknulo te

mehanizme, a nije uzrokovalo fotoinhibiciju. To se može smatrati odrazom visokog stupnja

prilagodbe i specijalizacije velebitske degenije rigoroznim uvjetima insolacije koji karakteriziraju

njezinu ekološku nišu. Iz pregleda literature vidljivo je da je fotosintetski aparat svojom građom

izuzetno prilagodljiv stalnim promjenama ekoloških čimbenika, nadasve kvaliteti i kvantiteti

svjetlosti (tj. ukupnom zračenju), a promjene u njegovoj građi i funkcionalnosti razlikuju se od

vrste do vrste. Kao jedna od dugoročnih prilagodbi intenzivnom PAR navodi se smanjenje

antenskih kompleksa u fotosistemima, što je u suprotnosti s rezultatima dobivenim u pokusu s

velebitskom degenijom. No, treba naglasiti da je takav mehanizam opisivan jedino u

slučajevima aklimatizacije biljaka sjene vedim intenzitetima PAR, a ne i aklimatizaciji heliofita na

povedano sunčevo UV zračenje. Također, postoje istraživanja koja ukazuju da UV zračenje u

uvjetima jakog intenziteta PAR može imati stimulativni učinak na koncentraciju zaštitnih

sastavnica fotosistema, tj. pomodne pigmente, što ide u prilog navedenom mogudem

mehanizmu fotoprotekcije fotosintetskog aparata kod velebitske degenije.

5.2.3. Enzimski antioksidacijski sustav

UV stresom izazvane povišene koncentracije ROS mogu prouzročiti oksidacijska

oštedenja važnih biomolekula i struktura u biljnoj stanici, stoga je u tom stanju potaknuto

djelovanje staničnog antioksidacijskog sustava, naročito pojačana aktivnost antioksidacijskih

enzima koji uklanjaju suvišak ROS iz stanice (Hollósy 2002). Stoga sam u listovima velebitske

degenije istražio aktivnost i sastav izoformi askorbat peroksidaze (APX), katalaze (CAT),

peroksidaza (POD) i superoksid dismutaze (SOD).

Specifične aktivnosti svih istraživanih antioksidacijskih enzima bile su značajno vede u

listovima biljaka skupine UV + u odnosu na aktivnosti kod biljaka skupine UV –. Zanimljivo je da

tu značajnu razliku u aktivnostima enzima ne prati značajna razlika u koncentracijama H2O2,

MDA i proteinskih karbonila, što potvrđuje da biljke obiju skupina nisu bile u stanju

oksidacijskog stresa. Značajno povedana aktivnost antioksidacijskih enzima kod biljaka skupine

UV +, kao i prije spomenuta povišena koncentracija zaštitnih pigmenata karotenoida i klorofila b

upuduju na povedanu razinu obrane od vedeg zračenja kojemu su te biljke bile kontinuirano

izložene u odnosu na biljke skupine UV –. Povedana aktivnost antioksidacijskih enzima kod

biljaka skupine UV + vjerojatno je odgovorna za efikasno uklanjanje ROS i stoga kod tih biljaka

nije utvrđen oksidacijski stres u odnosu na biljke skupine UV –. S dobivenim rezultatima donekle

se slažu i rezultati dobiveni u istraživanjima kaline uzgajane na suncu sa ili bez UV zračenja, u

listovima koje nije bilo značajne razlike u aktivnostima enzima CAT i APX, dok je aktivnost SOD

bila značajno veda u uvjetima s UV zračenjem (Guidi i sur. 2011).


106

Izlaganje biljaka skupine UV stres suncu potaknulo je aktivnosti svih antioksidacijskih

enzima, iako postotak povedanja aktivnosti kao i brzina odgovora na stres prema rastudoj dozi

UV zračenja nisu bili jednaki. Usporedno povedanje aktivnosti antioksidacijskih enzima poput

APX, CAT i SOD kao odgovor na određeni stresni čimbenik okoliša primijeden je u vedini

istraživanja i ukazuje na ko-regulaciju antioksidanasa koji uklanjanju ROS (Shigeoka i sur. 2002).

Aktivnost APX gotovo se udvostručila ved nakon doze zračenja od 0,52 MJ m-2, a zatim se

počela smanjivati pa je nakon primljene doze od 6,7 MJ m-2, kao i nakon dugotrajnog izlaganja

suncu, bila podjednaka aktivnosti izmjerenoj pri nultoj dozi zračenja i onoj kod biljaka skupine

UV –. Obrazac promjene aktivnosti CAT i SOD u listovima biljaka UV stres bio je donekle sličan.

Tako je aktivnost CAT porasla u odnosu na početnu nakon doze zračenja od 0,52 MJ m-2 za oko

50 %, a SOD za oko 60 %. Aktivnost oba enzima je bila snižena i slična početnoj nakon doze

zračenja od 1,03 MJ m-2, a nakon doza zračenja od 6,7 i 32,5 MJ m-2 bila je značajno veda od

početne i slična aktivnosti kod biljaka skupine UV +. Aktivnost POD u biljkama skupine UV stres

nije se značajno mijenjala sve do kraja izlaganja suncu, kad je bila značajno veda od početne i

podjednaka aktivnosti kod biljaka skupine UV +. Navedene razlike u potaknutim aktivnostima

antioksidacijskih enzima mogu biti pokazatelj njihovih različitih uloga u detoksikaciji stanice od

ROS u uvjetima UV stresa.

Askorbat peroksidaza je prisutna u stanicama viših biljaka u najmanje pet različitih

izoformi (Shigeoka i sur. 2002) lokaliziranih u citosolu (cAPX), membranama mikrotijela (mAPX),

mitohondrijima te tilakoidama (tAPX) i stromi (sAPX) kloroplasta (chlAPX). Nejednako povedanje

količine transkripata glavnih izoenzima APX u listovima špinata izloženih različitim stresnim

čimbenicima (Yoshimura i sur. 2000) pokazalo je da su geni za chlAPX i mAPX konstantno

eksprimirani što utječe na vrlo brzu i efikasnu detoksikaciju H2O2 u normalnim i stresnim

uvjetima, dok se genska ekspresija za cAPX mijenja ovisno u promjenama u okolišu, rezultirajudi

zaštitom staničnih kompartimenata od oksidacijskih oštedenja. Zbog male aktivnosti, u

ekstraktima listova velebitske degenije nisam uspio postidi vizualizaciju izoenzimima APX

odgovarajude kvalitete, a stoga ni eventualne promjene u sastavu izoformi tog enzima.

Međutim, jako i naglo povedanje aktivnosti APX u listovima velebitske degenije odmah nakon

izlaganja UV stresu podudara se s izmjerenom sniženom koncentracijom H2O2 i u skladu je s

ulogom APX u odgovoru na povedanje intenziteta stresnog čimbenika. Naime, bududi da je APX

enzim s visokim afinitetom, ali relativno niskim kapacitetom za H2O2 (u usporedbi s CAT),

smatra se da ima primarnu ulogu u aklimatizaciji biljnog organizma na stalne promjene

intenziteta stresnih (okolišnih) čimbenika, tj. povedanje aktivnosti APX je prvi i brzi odgovor na

stres, važan kod nižih koncentracija H2O2 (Mittler i sur. 2004). Stoga je mogude da je UV stres u

listovima velebitske degenije isprva izazvao tek blago povišenje koncentracije H2O2, što je

snažno potaknulo aktivnost APX. Takvo značajno povedanje aktivnosti APX opisano je kod

mnogih biljaka izloženih dodatnim izvorima umjetnog UV zračenja, npr. kod ječma (Mazza i sur.

1999), heljde (Jovanovid i sur. 2006), soje (Xu i sur. 2008), paprike (Mahdavian i sur. 2008) i

rotkvice (Singh i sur. 2010). Međutim, daljnje povedanje doze UV zračenja izazvalo je smanjenje

aktivnosti APX i značajno nakupljanje H2O2 u listovima velebitske degenije, što se može povezati

s malim kapacitetom APX za uklanjanje vedih koncentracija H2O2 (de Pinto i sur. 2006). Također

valja napomenuti da iako APX koristi H2O2 kao supstrat, iznadravnotežna koncentracija tog ROS


107

može biti uzrok izravne oksidacije proteina, a time i inhibicije aktivnost enzima APX (Hiner i sur.

2000).

Smanjena aktivnost APX pri vedim dozama zračenja i akumulacija H2O2 podudarala se s

istovremenim značajnim povedanjem aktivnosti katalaze (CAT), koja za razliku od APX ima puno

vedi kapacitet, ali manji afinitet prema H2O2 (Mittler 2004). Stoga se može zaključiti da je

upravo katalaza najvažnija za uklanjanje znatno povedane, stresne količine H2O2 iz listova

velebitske degenije. Značajno povedana aktivnost CAT ved nakon doze od 0,52 MJ m-2 potvrđuje

njezinu ulogu kao jednog od dva najvažnija enzima koji uklanjaju H2O2 iz stanice. Na

elektroforetskoj slici bio je dobro uočljiv samo jedan izoenzim katalaze, iako je kod mnogih

biljaka utvrđeno do tri različite molekularne forme tog enzima s različitom lokalizacijom u

biljnoj stanici (Scandalios i sur. 1997). UV zračenje može nejednako djelovati na ekspresiju gena

Cat1, Cat2 i Cat3, kao npr. kod jedne vrste duhana, gdje je UVB zračenje uzrokovalo smanjenu

ekspresiju Cat1, umjereno povedanu ekspresiju Cat3 i jako povedanje ekspresije Cat2 (Willekens

i sur. 1994). Povedana aktivnost katalaze kao odgovor na UV stres zapažena je u velikom broju

istraživanja, u laboratorijskim i vanjskim uvjetima, npr. u listovima ječma (Mazza i sur. 1999),

graška i pšenice (Alexieva i sur. 2001), kotiledonima suncokreta (Costa i sur. 2002), listovima

heljde (Jovanovid i sur. 2006), askorbat-deficijentnog mutanta uročnjaka (Gao i Zhang 2008),

paprike (Mahdavian i sur. 2008), soje (Xu i sur. 2008) i kotiledonima krastavca (Rybus-Zając i

Kubiś 2010).

Promjeni aktivnosti CAT u listovima velebitske degenije skupine UV stres bila je vrlo

slična promjena aktivnosti SOD: aktivnost tog enzima također se značajno povedala odmah

nakon izlaganja biljaka suncu, a najveda je bila nakon vedih doza zračenja. Promjene aktivnosti

SOD kao odgovor na UV zračenje, opisane u recentnim radovima, ne ukazuju na jedinstveni

odgovor pa se aktivnost SOD povedala nakon dodatnog UVB zračenja u listovima soje (Prasad i

sur. 2005), topole (Ren i sur. 2006), pšenice i graha (Agrawal i Rathore 2007), graška i pšenice

(Alexieva i sur. 2001), nije se mijenjala kod ječma (Mazza i sur. 1999) i heljde (Jovanovid i sur.

2006), a smanjila se u kotiledonima suncokreta (Costa i sur. 2002). SOD katalizira dismutaciju

superoksidnog radikala (O2-) u stabilniji vodikov peroksid pa se smatra prvom linijom obrane

tijekom oksidacijskog stresa. Stvaranje superoksidnog aniona vezano je za sva mjesta u stanici

gdje postoji lanac prijenosa elektrona pa je i SOD prisutan u gotovo svim staničnim

kompartimentima (Alscher i sur. 2002). Najviše izmjerene koncentracije H2O2 kod velebitske

degenije, u listovima skupine UV stres pri dozi zračenja od 6,7 i 32,5 MJ m-2, podudaraju se s

najvedom izmjerenom aktivnosti SOD, što ukazuje na to da vede ukupno zračenje potiče

stvaranje superoksidnog radikala. Promjena aktivnost SOD donekle se podudarala s

promjenama oštedenja lipida (koncentracija MDA), što može ukazivati na povišenje

koncentracije H2O2 i njegovog sudjelovanja u procesu peroksidacije lipida. U listovima svih

pokusnih skupina utvrđena su četiri izoenzima SOD, od kojih su najjače bili eksprimirani SOD1 i

SOD2, dok su ostali bili slabo uočljivi. Različite izoenzimske forme SOD lokalizirane su u

različitim dijelovima stanice, a UV zračenje može potaknuti pojačanu sintezu pojedinih izoformi

(Rao i sur. 1996), što nije primijedeno kod velebitske degenije.

Aktivnost peroksidaza (POD) je kod biljaka skupine UV stres bila značajno povedana u

odnosu na početnu vrijednost tek nakon dugotrajnog izlaganja suncu, kad je bila podjednaka

aktivnosti izmjerenoj kod biljaka skupine UV +. Utvrđena su tri izoenzima POD koji su bili


108

prisutni kod svih pokusnih skupina, a primijedena je pojačana ekspresija izoenzima POD2 i POD3

kod biljaka koje su bile izložene jačem ukupnom zračenju (biljke skupine UV + i biljke skupine

UV stres nakon dugotrajnog izlaganja suncu). Peroksidaze su oksidoreduktaze koje kao krajnjeg

primatelja elektrona koriste H2O2, ali osim uklanjanja tog ROS, također mogu sudjelovati u

oksidacijskim i hidroksilnim ciklusima u kojima nastaju superoksidni i hidroksilni radikal

(Passardi i sur. 2005). Stoga u biljnoj stanici POD imaju čitav niz različitih uloga, od regulacije

ravnoteže između proširenja i unakrsnog povezivanja staničnih stijenki, lignifikacije,

suberinizacije, akumulacije teških metala zbog potaknute polimerizacije polifenola, uklanjanja

otrovnih spojeva i stvaranja ROS tijekom ranjavanja i napada patogena do nodulacije,

mikorizacije i senescencije (Passardi i sur. 2005). Zbog brojnih i vrlo različitih uloga, peroksidaze

se smatraju multifunkcionalnim enzimima koje velikim brojem vrsno-specifičnih izoformi u bilo

kojem trenutku stoje na raspolaganju biljnoj stanici u fiziološkim procesima vezanima za rast i

razvitak, ali i procesima aklimatizacije u uvjetima stresa.

Povedana aktivnost POD u listovima velebitske degenije tek nakon dugotrajnog izlaganja

suncu, koja se podudarala s povišenjem koncentracije H2O2 i ostalih antioksidacijskih enzima,

može ukazivati na sudjelovanje POD u uklanjanju vedih količina H2O2. Također, mogude je da je

povedana aktivnost POD povezana s povedanjem biosinteze lignina, bududi da kod velebitske

degenije tijekom prve i druge godine razvitka dolazi do lignifikacije staničnih stijenki u donjim

dijelovima stabljike (Stevanovid i Vujnovid 1990). Poznato je da UV zračenje potiče aktivnost

POD i sintezu polifenola poput lignina, koji se akumuliraju u epidermskim stanicama oko

trihoma (dlaka) te kao UV-apsorbirajudi filteri imaju ulogu u zaštiti od pojačanog zračenja, što je

dokazano kod kotiledona krastavca (Yamasaki i sur. 2010). Slično kao kod velebitske degenije,

„kasno” povedanje aktivnosti POD izazvano UV zračenjem utvrđeno je u listovima kultivara

rotkvice (Singh i sur. 2010) i tri različita kultivara soje (Xu i sur. 2008), a trenutačno ili postupno

povedanje aktivnosti POD u klijancima heljde (Jovanovid i sur. 2006), listovima vrste

Heptacodium miconioides (Liu i sur. 2006) i graška (Alexieva i sur. 2001).

5.2.4. Koncentracija flavonoida

Flavonoidi, najraznovrsnija i najveda skupina biljnih sekundarnih metabolita, imaju

mnoge uloge u prilagodbi biljke na promjenjive životne uvjete, od sudjelovanja u regulaciji rasta

i razvitka, aktivnog antioksidacijskog djelovanja i uklanjanja ROS iz stanice do atenuacije štetnog

UV zračenja (Agati i Tattini 2010). U listovima velebitske degenije odredio sam najvažnije

aglikone flavonoida te istražio učinak UV zračenja na promjene njihovih koncentracija.

U metanolnim ekstraktima listova velebitske degenije utvrđeno je oko desetak različitih

fenolnih spojeva. Kromatogrami pradeni na 280 nm, gdje se nalaze apsorpcijski maksimumi

vedine fenolnih kiselina, te na 374 nm, gdje maksimalno apsorbiraju benzenski prsteni

flavonoida, razlikovali su se uglavnom po veličini, ne i broju detektiranih spojeva (pikova)

podudarnih u vremenima retencije. Zbog toga, a bududi da pri usporedbi i rekromatografiji

metanolnih ekstrakata listova sa standardima nekoliko najčešdih fenolnih kiselina (npr.

feruličnom, cimetnom, kavinom i kumarinskom) nisu nađene podudarnosti, mogude je da


109

glavninu fenolnih spojeva u listovima velebitske degenije čine razni glikozidi flavonoida ili

njihovi aglikoni vezani za stanične stijenke. Zbog nemogudnosti identifikacije flavonoida u

njihovim glikozidnim oblicima, u ekstraktima sam proveo kiselu hidrolizu tijekom koje su

oslobođena tri najznačajnija aglikona flavonoida: kvercetin, kempferol i izoramnetin.

U dosadašnjim sistematsko-taksonomskim i ostalim istraživanjima sadržaja flavonoida u

biljkama nekoliko rodova iz porodice Brassicaceae utvrđeno je više desetaka različitih

flavonoida. Durkeet i Harborne (1973) su u listovima i cvjetovima vrsta roda Brassica utvrdili

glikozide kempferola i izoramnetina, a kod vrste roda Sinapis također i glikozide kvercetina.

Derivati kvercetina i kempferola utvrđeni su kao najznačajniji flavonoidi u listovima uročnjaka

(Sheahan i Cheong 1998). Onyilagha i sur. (2003) istražili su sadržaje derivata flavonola (skupina

flavonoida s 3-hidroksiflavonskim kosturom) u 27 različitih svojti iz rodova Camelina, Crambe,

Thlaspi, Sinapis i Brassica te su osim spomenutih najznačajnijih kvercetinskih, izoramnetinskih i

kempferolskih derivata, utvrdili i derivate apigenina i luteolina.

U listovima velebitske degenije koncentracije sva tri aglikona flavonoida bile su značajno

više kod biljaka skupine UV + u odnosu na koncentracije kod biljaka skupine UV –, s time da je

najmanja značajna razlika utvrđena za kempferol (<25 %), kod kvercetina je bila oko 100 %, a

najveda kod izoramnetina, veda od 350 %. Značajno više koncentracije aglikona u biljkama

skupine UV +, osobito kvercetina i izoramnetina, mogu se objasniti aklimatizacijom biljaka na

insolaciju s ambijentalnim UV zračenjem, bududi da to zračenje pojačava biosintezu flavonoida

(Harborne i Williams 2000). U listovima kaline koje je rasla na suncu utvrđena je dvostruko viša

koncentracija ukupnih flavonoida, u odnosu na koncentraciju u biljkama koje su rasle na suncu

bez UV zračenja (Guidi i sur. 2011).

U listovima biljaka skupine UV stres nakon izlaganja suncu došlo je do značajnog

povišenja koncentracije kvercetina, ali tek nakon doze zračenja od 3,3 MJ m-2, a koncentracija

se i dalje značajno povisivala do kraja pokusa kad je bila jednaka onoj kod biljaka skupine UV +.

Koncentracija izoramnetina bila je značajno povišena u odnosu na početnu nakon doze zračenja

od 6,7 MJ m-2, a nakon dugotrajnog izlaganja suncu bila je malo viša i od one kod biljaka skupine

UV +. Suprotno tim rezultatima, koncentracija kempferola nije se značajno mijenjala u listovima

biljaka skupine UV stres tijekom izlaganja suncu.

Dobiveni rezultati podudaraju se s mnogim objavljenim istraživanjima učinka UV

zračenja na sadržaj flavonoida u biljnim stanicama, posebice na selektivnu indukciju biosinteze

flavonoida koji imaju različite antioksidacijske sposobnosti. Naime, zbog posjedovanja dodatne

hidroksilne skupine na B-prstenu flavonoidnog kostura (tzv. orto-dihidroksilna supstitucija ili

kateholna struktura), dihidroksi-B-supstituirani flavonoli i flavoni poput derivata kvercetina i

luteolina imaju jaka antioksidacijska svojstva, za razliku od monohidroksi-B-supstituiranih

flavonoida, poput kempferola i apigenina, koji imaju samo jednu hidroksilnu skupinu.

Orto-dihidroksi (kateholna) struktura B-prstena kvercetina odgovorna je za povedanu stabilnost

oksidirane molekule flavonoida, tzv. ariloksi radikala (Van Acker i sur. 1996), koja nastaje u

procesu izravne redukcije lipidnog hidroperoksida ili H2O2 s molekulom flavonoida. Posredna

antioksidacijska svojstva flavonoida s kateholnom strukturom uključuju sprečavanje stvaranja

ROS putem kelacije iona prelaznih metala, koji su potrebni za odvijanje ROS-generirajude

Fentonove reakcije (Smyk i sur. 2008) te supresiju aktivnosti enzima ksantin-deepoksidaze, koja

je odgovorna za stvaranje superoksidnog aniona (Nguyen i sur. 2006).


110

Značajno povišenje koncentracije dihidroksi-B-supstituiranih flavonoida u odnosu na

koncentraciju monohidroksi- B-supstituiranih flavonoida utvrđeno je kod mnogih biljaka nakon

izlaganja svjetlosnom i UV stresu. Tako je UVB zračenje uzrokovalo povedanje omjera

koncentracije kvercetina i kempferola kod divljeg tipa i u različitim kultivarima petunije (Ryan i

sur. 1998) te omjera koncentracije luteolina i apigenina kod zdenčare (Markham i sur. 1998).

Izlaganje luka vlasca dodatnom UVB i PAR zračenju značajno je povisilo koncentracije kvercetina

i izoramnetina, a vrlo malo kempferola (Nitz i sur. 2004). Značajno povišenje koncentracija

glikozida kvercetina i luteolina te sniženje koncentracije glikozida apigenina u mezofilu listova

kaline i zelenike izloženih UV stresu bili su u korelaciji s intenzitetom oksidacijskih oštedenja

(Tattini i sur. 2005). Slično tome, glikozidi kvercetina i luteolina akumulirali su se u vakuolama

stanica mezofila lista kaline izloženih jakom suncu sa, ali i bez UV zračenja (Agati i sur. 2009).

Zanimljivo je da, iako je kateholna struktura od presudnog značaja za jake antioksidacijske

sposobnosti dihidroksi-B-supstituiranih flavonoida, ona značajno ne mijenja njihova UV-

apsorbirajuda svojstva u odnosu na monohidroksi-B-supstituirane strukture (Agati i Tattini

2010). Vedina UV-upijajudih flavonoida apsorbira u širem području UV spektra, ali im se

apsorpcijski maksimumi ne nalaze u području 280-315 nm, ved uglavnom iznad 335 nm, što ih

čini slabijim atenuatorima UVB i jačim atenuatorima UVA zračenja u odnosu na ostale

fenolpropanoide (Harborne i Williams 2000). Najbolja UVB atenuatorska svojstva imaju derivati

hidroksicimetne fenolne kiseline, tzv. hidroksicinamati poput kumarinske, kafeinske i ferulične

kiseline, čiji se apsorpcijski maksimumi nalaze u području 310-325 nm (Harborne i Williams

2000; Tattini i sur. 2004). Međutim, UV zračenje, kao i intenzivno PAR zračenje uzrokuje jako

povišenje koncentracija flavonoida u odnosu na koncentraciju hidroksicinamata (Agati i sur.

2002; Kotilainen 2008), a flavonoidi čak u potpunosti mogu zamijeniti jake UV-aposrbirajude

derivate hidroksicimetne kiseline tijekom razvitka lista izloženog UVA i UVB zračenju (Burchard i

sur. 2000). Nađeno je da UV zračenje potiče sintezu flavonoida, ali ne i hidroksicinamata u

žljezdastim dlakama listova zelenike (Agati i sur. 2002) te listovima breze i johe (Kotilainen i sur.

2008), a to je utvrđeno i u listovima kaline izložene intenzivnom PAR zračenju bez UV spektra

(Agati i sur. 2009). Navedeni rezultati, da UV zračenje i PAR potiču sintezu flavonoida s

kateholnom strukturom u odnosu na monohidroksi-B-supstituirane flavonoide, kao i u odnosu

na jake UV-upijajude hidroksicinamate, ukazuju na mogudnost da je atenuacija UV zračenja

samo jedna u nizu uloga koje flavonoidi imaju u fotoprotekciji biljne stanice. Vjerojatno je da

flavonoidi akumulirani tijekom UV i PAR stresa dodatno povedavaju atenuaciju suvišnog

zračenja, ali i antioksidacijske sposobnosti stanice kojom se ona odupire oksidacijskom stresu.

Te dvije bitno različite uloge flavonoida ovise i o lokalizaciji u biljnim tkivima, bududi da njihova

antioksidacijska uloga može dodi do izražaja samo ukoliko se nalaze u blizini stvaranja ROS,

dakle u membranama, citoplazmi i vakuolama stanica. Iako navedena istraživanja ukazuju na

važnu antioksidacijsku ulogu flavonoida u stanju oksidacijskog stresa, za takve tvrdnje još uvijek

nema dokaza u smislu korelacije povišenja njihovih koncentracija s odgovarajudim

prostorno-vremenskim povišenjem koncentracija njihovih oksidiranih produkata, koje je zbog

nestabilnosti pri različitim pH vrijednostima u različitim staničnim kompartimentima teško

histokemijski i analitički detektirati (Agati i Tattini 2010). Međutim, u istraživanjima

antioksidacijskih sposobnosti pojedinih flavonoida in vitro i in vivo dokazana su izravna i

posredna antioksidacijska svojstva flavonoida s kateholnom strukturom. Tako je npr. za jedan


111

glikozid izoramnetina izoliranog iz caklenjače (Kong i sur. 2009) utvrđena korelacija povišenja

koncentracije tog flavonoida i, između ostalog, sniženja koncentracije ROS, povišenja

koncentracije glutamata i aktivnosti antioksidacijskih enzima superoksid dismutaze, katalaze i

glutation reduktaze.

S obzirom na značajne razlike u koncentracijama sva tri aglikona flavonoida u listovima

biljaka koje su rasle na suncu u odnosu na biljke koje su rasle ispod UV folije i bududi da je naglo

izlaganje povedanom UV zračenju kod biljaka skupine UV stres izazvalo izrazitu akumulaciju

kvercetina i izoramnetina, a ne i „slabog” antioksidansa kempferola, mogude je da flavonoidi u

stanicama listova velebitske degenije osim UV-upijajude imaju i važnu antioksidacijsku ulogu. Ta

uloga vidljiva je u vremenskom podudaranju povišenja koncentracija kvercetina i izoramnetina

u listovima biljaka skupine UV stres s najvedim utvrđenim intenzitetom oksidacijskog stresa,

izmjerenim putem koncentracija H2O2, MDA i proteinskih karbonila.

5.3. Sezonske promjene istraživanih fizioloških parametara

Sezonske i dnevne promjene vrijednosti fizioloških parametara navedenih u UV pokusu

također sam istražio i u godišnjem pokusu, tj. na biljkama koje su uzgajane na trajnoj pokusnoj

plohi izloženoj prirodnim promjenama atmosferskih uvjeta kroz godinu dana. Rezultate

sezonskih promjena koristio sam za usporedbu s rezultatima UV uzorka, ali i utvrđivanje

utjecaja drugih abiotičkih čimbenika na fiziološke odgovore velebitske degenije, poput visokih ili

niskih temperatura.

5.3.1. Pokazatelji oksidacijskog stresa i antioksidacijski enzimi

Koncentracija H2O2 u listovima velebitske degenije mijenjala se tijekom godine, od

najniže tijekom proljeda i ljeta do značajno najviše zimi, kad je u odnosu na proljetnu bila

povišena u prosjeku za oko 80 %. Povišenje koncentracije H2O2 tijekom godine podudara se sa

smanjenjem temperature, bududi da se intenzitet drugih potencijalnih stresnih čimbenika, UV

zračenja i vidljive svjetlosti, smanjuje prema zimskim mjesecima. Kao što je ved rečeno, vodikov

peroksid je jedan od najstabilnijih ROS, ali i „višenamjenska” molekula s nezamjenjivim ulogama

u signalizaciji, regulaciji metaboličkih i redoks procesa u stanicama, odgovorima na stres te

razvoju i razvitku biljke. Iako je povišenje koncentracije H2O2 utvrđeno tijekom hladnog i

smrzavajudeg stresa u nekih biljaka, npr. raži (Prasad i sur. 1994) te osjetljivih i tolerantnih

kultivara ječma (Dai i sur. 2009), komparativna analiza sezonske varijabilnosti koncentracije

H2O2 u listovima 18 biljnih vrsta uzgajanih u prirodnim uvjetima (Cheeseman 2009) nije

pokazala korelaciju između povišenja koncentracije H2O2 i pokazatelja svjetlosnog,

temperaturnog ili vodnog stresa. Dnevne i sezonske promjene koncentracije H2O2 u biljkama

koje rastu u „prirodnim” uvjetima i postupno se aklimatiziraju na promjenjive abiotičke

čimbenike na njihovim staništima vjerojatno su odraz fenoloških promjena, koje ukazuju na

ulogu H2O2 u produljenom rastu stanica, lignifikaciji staničnih stijenki, unakrsnom povezivanju

stanica i senescenciji (Cheeseman 2009). Mogude je da je povišena koncentracija H2O2 u


112

listovima velebitske degenije zimi posljedica smrzavajudih temperatura, ali ona također može

biti odraz feno-fizioloških promjena povezanih s propadanjem dijela listova rozete, koji ne

otpadaju s vršnih dijelova stabljika ved štite najmlađe listove i apikalne meristeme.

Koncentracija MDA u listovima velebitske degenije generalno se nije značajno mijenjala

tijekom godine. U dnevnim promjenama koncentracije uočena je zanimljiva podudarnost

između proljetnog i jesenskog uzorka, kad su manje izražene razlike u temperaturi tijekom

dana. Ljeti je najviša koncentracija utvrđena u podne, što se podudara s najvedim intenzitetom

insolacije, dok je zimi u podne utvrđena značajno najniža koncentracija MDA. Iako je teško

suditi na temelju malog broja dnevnih i sezonskih izmjera i broja bioloških replika, mogude je da

je za značajno povedana oštedenja staničnih lipida ljeti u podne odgovorna pojačana insolacija

(visoka temperatura i zračenje Sunca), a zimi ujutro i navečer smrzavajuda temperatura. Te

pretpostavke u skladu su s utvrđenim značajnim povišenjem koncentracije MDA u listovima

trske uslijed visoke temperature (Velikova i Loreto 2005) te povedanjem lipidne peroksidacije

izazvane smrzavajudim temperaturama u korijenju nekoliko planinskih vrsta trava (Zhou i Zhao

2004) i listovima dviju zimzelenih vrsta rododendrona (Wang i sur. 2009).

Razina oksidacijskih oštedenja proteina u listovima velebitske degenije generalno se nije

značajno razlikovala u proljede, ljeto i jesen, no isticala se značajno povedana vrijednost

izmjerena ljeti u podne. Zimi je uočeno značajno povišenje koncentracije proteinskih karbonila

od jutra prema večeri, kad je bila značajno viša od svih sezonskih izmjera. Kao i kod lipidne

peroksidacije, u proljede i jesen su koncentracije proteinskih karbonila bile podjednake, a

povedane su bile ljeti u podne i zimi u podne i navečer, što ukazuje na mogudu ulogu visoke

temperature i zračenja ljeti te smrzavajude temperature zimi u povedanom oštedenju proteina.

Oštedenja proteina izazvana visokim i niskim temperaturama utvrđena su kod različitih biljaka,

a temperaturni stres različito utječe na ekspresiju gena i sintezu pojedinih proteina u stanicama,

bududi da visoke temperature najčešde induciraju sintezu proteina toplotnog šoka (Heat shock

proteins, HSP), dok je pri niskim i smrzavajudim temperaturama pojačana sinteza

antioksidacijskih enzima (Neilson i sur. 2010).

Sezonska varijabilnost aktivnosti antioksidacijskih enzima u listovima velebitske degenije

bila je izrazito naglašena, od manjih aktivnosti u proljede i ljeto, povedane ujesen i jako

povedane zimi. Aktivnost APX zimi bila je čak 60 puta veda od aktivnosti ljeti i oko 3,5 puta veda

nego ujesen, a aktivnost CAT je bila oko 15 puta izraženija zimi u odnosu na ljeto te oko 7,5 puta

veda od one ujesen, s time da nisu uočene značajne dnevne promjene aktivnosti u svim

sezonskim uzorcima. Nešto manje razlike utvrđene su i kod ostalih enzima, no kod njih je

utvrđeno i značajno dnevno povedanje aktivnosti u zimskom uzorku, od manje ujutro do

najvede navečer. Tako je aktivnost POD bila veda u proljede u odnosu na ljeto, ujesen malo veda

nego u proljede, a zimi navečer oko dva puta veda u odnosu na izmjere ujesen. Utvrđeno je

ukupno pet izoformi POD, ali su izoforme POD4 i POD5 bile vidljive samo u zimskom uzorku.

Sezonske i dnevne promjene aktivnosti enzima SOD podudarale su se s promjenama POD, s

najmanjim izmjerenim vrijednostima ljeti, a najvedima zimi navečer. Od ukupno četiri utvrđena

izoenzima SOD1 i SOD2 bili su prisutni u svim uzorcima, a SOD3 i SOD4 samo ujesenskim i

zimskim.

Aklimatizacija niskim i smrzavajudim temperaturama je vrlo složeni proces koji uključuje

brojne fiziološke i metaboličke promjene, a u njemu sudjeluje niz različitih biomolekula. Izrazito


113

pojačana ekspresija gena koji kodiraju za antioksidacijske enzime, tj. povišena koncentracija i

povedana aktivnost enzima odgovornih za uklanjanje suviška ROS iz stanice, utvrđena je kod

mnogih biljaka izloženih niskim ili smrzavajudim temperaturama, što se smatra važnim

mehanizmom sprečavanja oksidacijskog stresa kod biljaka tolerantnih na hladnodu

(Thomashow 1999; Neilson i sur. 2010). Povedane aktivnosti enzima APX, CAT, SOD i POD

tijekom smrzavajudih temperatura opisane su npr. kod topole (Luo i sur. 2007), ječma (Dai i sur.

2009) i dvije vrste rododendrona (Wang i sur. 2009). Izrazito povedana aktivnost APX i CAT u

listovima velebitske degenije zimi ukazuje na njihovu vrlo važnu ulogu u uklanjanju H2O2 i

doprinosu u toleranciji te biljke na smrzavajude temperature. Također, značajno povišenje

koncentracije H2O2 zimi u odnosu na koncentracije u proljede i ljeti u skladu je s povedanjem

aktivnosti enzima koji uklanjaju taj ROS.

Dvije nove izoforme enzima SOD, utvrđene ujesen i zimi, mogu se povezati s

aklimatizacijom na nisku temperaturu, odnosno razvijenom tolerancijom na smrzavajude

temperature. Povedanje aktivnosti SOD povezano je s tolerancijom na niske temperature kod

nekih biljaka, npr. kod krastavca (Kuk i sur. 2003), a kod špinata je u procesu aklimatizacije na

hladnodu pri pojačanom intenzitetu svjetlosti utvrđena indukcija novih izoenzima SOD (Schöner

i Krause 1990). Povedana aktivnost SOD kod velebitske degenije u proljede mogla bi se objasniti

slabije razvijenim fotosintetskim aparatom u mladim listovima, a ujesen zbog utjecaja niskih

temperatura. Zanimljivo je da je aktivnosti enzima POD, osim jakog povedanja zimi, također bila

izražena i u proljede i jesen. Poznato je da su peroksidaze multifunkcionalni enzimi koji u

„suradnji” s također multifunkcionalnim vodikovim peroksidom sudjeluju u mnogim procesima,

a imaju izuzetno važnu ulogu u staničnom rastu, odnosno elongaciji stanica (Passardi i sur.

2005). Stoga se pojačana aktivnost POD u listovima velebitske degenije u proljede može

objasniti sudjelovanjem tog enzima u procesima rasta i razvitka novih izbojaka i listova nakon

zimskog perioda mirovanja. Tijekom višegodišnjeg uzgoja velebitske degenije na pokusnim

plohama u Botaničkom vrtu PMF-a primijeden je i intenzivni kasno-ljetni rast i razvoj novih

listova. To je (praktično, ali ne i znanstveno) povezano s oporavkom biljke nakon iscrpljenosti

cvjetanjem i stvaranjem plodova u proljede te nakon inhibirajudih ljetnih visokih temperatura i

jakog sunčevog zračenja, a također je i u skladu s proljetnim i jesenskim rastom karakterističnim

za biljke sredozemnih područja (Orshan 1989). S druge strane, mogude je da je povedana

aktivnost POD ujesenskom uzorku koji je sabran u studenome, u odnosu na manje ljetne

vrijednosti, rezultat postupne aklimatizacije biljaka na niske jesenske temperature. Takvi

rezultati su indikativni, ali bi za potvrdu predloženih uloga POD bio potreban vedi broj

mjesečnih mjerenja tijekom nekoliko sezona. Zimi se aktivnost POD povedala od jutra do večeri

za oko 2,5 puta pa je glavna uloga POD zimi vjerojatno uklanjanje povišene koncentracije H2O2.

To potvrđuje pojava dviju novih izoformi tog enzima, koje vjerojatno doprinose ukupnom

povedanju aktivnosti POD uslijed vrlo niskih temperatura. Slično povedanje aktivnosti POD

povezano s hladnim stresom u stanju mirovanja i s prekidom dormancije prije početka

vegetacije utvrđeno je u pupovima breskve (Citadin i sur. 2002) i pistacije (Zahra i sur. 2009).

Na temelju značajno povišene koncentracije H2O2 u listovima velebitske degenije ujesen

i zimi, neznačajne promjene koncentracije MDA tijekom godine i značajno povišene

koncentracije proteinskih karbonila zimi u podne i navečer, može se pretpostaviti da je

velebitska degenija osjetljivija na niske i smrzavajude temperature, u odnosu na pojačanu


114

insolaciju ljeti. Višestruko povedana aktivnost APX i CAT zimi ukazuje na njihovu ulogu glavnih

„čistača” suviška H2O2 u stanicama i sudjelovanja u mehanizmu povedanja tolerancije biljke na

hladnodu. U obrani staničnih struktura od posljedica oksidacijskog stresa izazvanog

smrzavajudim temperaturama do izražaja su također došle pojačane aktivnosti enzima POD i

SOD, kod kojih su ujesen i zimi utvrđene nove izoenzimske forme.

Navedeni rezultati ukazuju na to da je velebitska degenija, kao trajnica koja zimi

zadržava dio zelenih listova, umjereno osjetljiva na niske i smrzavajude temperature te da

aklimatizacija na niske temperature uključuje značajnu aktivaciju antioksidacijskih enzima.

5.3.2. Fotosintetski aparat

Ekspresija proteina RuBisCO, LHC i D1 umjereno se smanjivala od proljeda prema zimi,

iako je značajno niža bila jedino u zimskom uzorku. Koncentracije pomodnih pigmenata bile su

izrazito povišene ljeti, naročito koncentracije violaksantina i anteraksantina, ali se nisu

generalno razlikovale u proljetnim, jesenskim i zimskim uzorcima. Koncentracije klorofila bile su

također najviše ljeti, podjednake u proljede i jesen, a značajno snižene zimi. Obrazac promjene

koncentracija klorofila a i b bio je podjednak, zbog čega nije bilo promjene u omjeru njihovih

koncentracija (podatak nije iskazan). Koncentracije pigmenta različito su se mijenjale tijekom

dana u pojedinim sezonskim uzorcima i uglavnom nisu jednako odražavale promjene abiotskih

čimbenika poput temperature i sunčeva zračenja.

Mjerenjem fluorescencije klorofila a utvrđeno je da nema promjene u funkcionalnosti

PS tijekom sezone, bududi da nije bilo značajnih promjena u optimalnom prinosu

fluorescencije (Fv/Fm). Efektivni prinos fluorescencije (ΔF/F'm) bio je malo, ali značajno niži u

proljede u odnosu na ostale sezonske izmjere. Fotokemijsko gašenje fluorescencije (PQ) nije se

značajno razlikovalo tijekom sezone, a nefotokemijsko gašenje (NPQ) bilo je dvostruko vede u

proljede u odnosu na ostale sezonske izmjere. Proljetno mjerenje je iz tehničkih razloga

obavljeno tek sredinom lipnja, nakon cvjetanja i stvaranja plodova, kad su ujedno očitane i

ekstremne vrijednosti sunčevog UV zračenja (prema izmjerama UV ozračenja mjerne postaje

„Zagreb-1” u lipnju 2009.). Stoga te izmjere ne odražavaju realno „proljetno” fiziološko stanje

biljaka, a rezultati se ne mogu uspoređivati ni s koncentracijom pigmenata ni ekspresijom

proteina u proljetnom uzorku sabranom u ožujku. Stres izazvan iscrpljenošdu biljaka nakon

cvjetanja i stvaranja plodova te povedanim zračenjem Sunca vjerojatno je uzrokovao prolazne i

manje poremedaje u funkcioniranju PS . To se očitovalo u smanjenom efektivnom prinosu

fluorescencije, a suvišak apsorbirane energije koji nije mogao biti iskorišten u fotokemijskim

reakcijama oslobođen je u obliku topline, što je vidljivo iz povedane vrijednosti NPQ. Značajno

smanjenje ΔF/F'm i povedanje NPQ korelirano s povedanjem intenziteta svjetlosti primijedeno je

kod salate uzgajane u tropskim uvjetima (He i Lee 2004).

S obzirom na to da je u ljetnom uzorku velebitske degenije (skupljenom u kolovozu)

ekspresija proteina fotosintetskog aparata bila najveda u usporedbi s ostalim sezonskim

izmjerama (korištena je kao maksimalna relativna vrijednost u prikazu rezultata) te da rezultati

flourescencije klorofila a nisu ukazivali na funkcionalne promjene, može se zaključiti da su su

biljke u lipnju doživjele privremeni kratkotrajni stres koji se vjerojatno nije odrazio na


115

strukturna oštedenja fotosistema. Također, koncentracije pomodnih pigmenata u ljetnom

uzorku bile su značajno najviše u usporedbi s ostalim sezonskim izmjerama, što može biti

posljedica intenzivnog kasno-ljetnog rasta novih listova. Bududi da su biljke sredozemnih

područja, posebice sredozemnih planina, zimi često izložene smrzavajudim temperaturama, a

ljeti jakoj insolaciji i suši, povoljni uvjeti rasta i razvitka nastupaju u proljede i kasno ljeto te

jesen (De Lillis i Fontanella 1992). Stoga vrhunac cvjetanja, stvaranja plodova i rasta mnoge

sredozemne biljne zajednice dosižu tijekom ranog proljeda, s dodatnom fenofazom rasta krajem

ljeta (Orshan 1989), što je u skladu s opaženim fenološkim osobitostima velebitske degenije.

Povišenje koncentracije pomodnih pigmenata, klorofila i proteina LHC vjerojatno ima ulogu u

zaštiti fotosintetskog aparata od ljetne insolacije, što je detaljno raspravljano u pokusu

vezanom za UV stres.

Zanimljivo je da se izmjerene zimske vrijednosti Fv/Fm i ΔF/F'm te PQ i NPQ nisu

razlikovale od onih u ljeto i jesen, što potvrđuje toleranciju velebitske degenije na smrzavajude

temperature i ukazuje na izostanak fotoinhibicije, koju vazdazelene biljke za vrijeme vedrih

zimskih dana izbjegavaju razvijanjem različitih mehanizama za rasipanje suviška apsorbirane

svjetlosti (Huner i sur. 1998). To je u skladu sa značajno sniženom koncentracijom violaksantina

kod velebitske degenije zimi u podne i govori o mogudoj dinamici određenih mehanizama koji

toj biljci služe u ublažavanju fotoinhibicije. U ovome slučaju, dvostruko niža koncentracija

violaksantina zimi u podne u odnosu na koncentraciju ujutro i navečer može se tumačiti

visokom razinom deepoksidacije, odnosno konverzijom u zeaksantin koji ima ključnu ulogu u

toplinskom rasipanju suviška apsorbirane svjetlosne energije. Proces reverzne deepoksidacije

(ksantofilski ciklus) odvija se u vrlo kratkom vremenskom razdoblju, mjerljivom u minutama i

satima, te predstavlja važan način obrane fotosistema u uvjetima jakog svjetlosnog stresa kod

mnogih zimzelenih biljaka (Huner i sur. 1998). To je u slučaju velebitske degenije samo

pretpostavka, bududi da zeaksantin nije razdvojen u ekstraktima pigmenata.

Ekspresija proteina D1, PS i RuBisCO bile su značajno najmanje u zimskom uzorku, kao i

koncentracije klorofila a i b, što je u skladu s rezultatima drugih istraživanja, npr. kod bijelog

bora (Ottander i sur. 1995). Smanjena ekspresija fotosintetskih proteina i glavnih pigmenata

moguda je npr. zbog manjeg broja kloroplasta u stanicama ili zbog strukturnih promjena u

unutrašnjoj građi kloroplasta izazvanih niskim i smrzavajudim temperaturama (Stefanowska i

sur. 2002).

Iako navedeni rezultati okvirno ukazuju na utjecaj pojedinih fenoloških promjena kao i

promjena u kvaliteti i kvantiteti sunčeva zračenja na strukturu i funkcioniranje fotosintetskog

aparata velebitske degenije tijekom godine, za utvrđivanje jasnije korelacije potrebna su

detaljnija istraživanja s vedim (češdim) brojem dnevnih i mjesečnih uzorkovanja.

5.3.3. Koncentracije flavonoida

Koncentracije tri utvrđena aglikona flavonoida u listovima velebitske degenije različito

su se mijenjale tijekom sezone. Koncentracija kvercetina bila je podjednaka u proljede, jesen i

zimu te malo, ali značajno, povišena ljeti. Najviša koncentracija kempferola zabilježena je u

proljede ujutro, ali je, generalno gledano, bila slična u proljede, ljeto i jesen, a značajno


116

najmanja zimi. Koncentracija izoramnetina bila je tijekom godine u linearnom porastu, od

značajno najniže u proljede do osam puta najviše zimi. Dnevne promjene koncentracija bile su

različite i nejednake između pojedinih flavonoida te uglavnom statistički neznačajne.

Kao što sam ved spomenuo, derivati kvercetina imaju značajnu ulogu u atenuaciji, tj.

upijanju suviška UV zračenja, a utvrđeni su kao najznačajniji i najzastupljeniji flavonoidi kod

mnogih svojti iz porodice Brassicaceae, uz također važne derivate luteolina, kempferola i

izoramnetina (Durkeet i Harborne 1973; Sheahan i Cheong 1998; Onyilagha i sur. 2003). Bududi

da je koncentracija kvercetina u listovima velebitske degenije bila značajno povišena samo u

ljetnom uzorku, nasluduje se važnost njegovih derivata, najvjerojatnije glikozida, kao UV-filtera

koji apsorbiraju pojačano UV zračenje ljeti i time štite stanice mezofila. Suprotno povišenoj

koncentraciji kvercetina ljeti, prosječna koncentracija kempferola u proljede, ljeti i ujesen nije se

značajno razlikovala, a zimi je bila značajno snižena u odnosu na prethodne. S obzirom na to da

kempferol kao monohidroksi-B-supstituirani flavonoid ima slabija antioksidacijska svojstva od

kvercetina i izoramnetina koji su dihidroksi-B-supstituirani flavonoidi (Van Acker i sur. 1996;

Agati i sur. 2009), mogude je da njegovi derivati, prisutni u stalnoj koncentraciji u listovima

velebitske degenije tijekom fotosintetski najaktivnijih mjeseci u godini, služe ponajviše kao

UV-filtri. Derivati kvercetina, kojih su koncentracije povišene u vrijeme najjačeg sunčevog

zračenja, osim atenuacije UV zračenja vjerojatno dodatno štite stanice od UV i svjetlosnog

stresa kao jaki antioksidansi.

Snažan linearni porast koncentracije izoramnetina od proljeda prema zimi, kad je bila

oko osam puta viša u odnosu na vrijednosti u proljede, ukazuje na mogudnost da derivati

izoramnetina kao jaki antioksidansi sudjeluju u mehanizmima tolerancije velebitske degenije na

smrzavajude temperature, što je utvrđeno kod drugih biljaka. Npr. značajno povišene

koncentracije derivata izoramnetina, kvercetina i luteolina u listovima soje nakon tretmana s

niskom temperaturom doprinijele su ukupnoj antioksidacijskoj aktivnosti, što ukazuje na

njihovo sudjelovanje u toleranciji na niske i smrzavajude temperature. Zanimljivo je da je u

čitavim cvjetnim pupovima velebitske degenije u proljede koncentracija izoramnetina bila čak

12 puta viša u odnosu na koncentraciju u listovima zimi i čak 35 puta viša od koncentracije u

listovima ljeti, što se može tumačiti u svjetlu pojačane zaštite generativnih dijelova biljaka od

posljedica mogudeg iznenadnog pada temperatura ili mraza u rano proljede. Također je moguda

uloga derivata izoramnetina u privlačenju oprašivača, bududi da je potvrđeno da jedan glikozid

izoramnetina u cvjetovima poljske repe kao UV-apsorbirajuda boja ukazuje na položaj nektarija

(Sasaki i Takahashi 2002). Navedene hipoteze mogude je dodatno istražiti utvrđivanjem sadržaja

flavonoida, posebice koncentracije izoramnetina, u pojedinim dijelovima cvjetnih pupova i

cvjetova velebitske degenije.

5.4. Morfološko-anatomske značajke lista i lokalizacija flavonoida

5.4.1. Osnovna građa lista

Velebitska degenija je biljka s kseromorfnim i heliomorfnim obilježljima, koja su uočljiva

ved u samom grmolikom, polukuglastom ili jastučastom habitusu, veličini čitave biljke i bijeloj


117

boji listova (Stevanovid i Vujnovid 1990). Uskocrtaste i relativno debele listove velebitske

degenije gusto prekrivaju epidermski trihomi (dlake), koji čine svojevrsni „oklop”. Listovi su

izolateralni (ekvifacijalni) i amfistomatski, a te anatomske značajke tipične su za mnoge

kserofite i heliofite, odnosno biljke prilagođene životu na sušnim i izrazito osunčanim staništima

(Fahn i Cutler 1992).

Promatranjem površine listova pomodu svjetlosnog mikroskopa i SEM utvrdio sam da su

dlake, koje inače prekrivaju sve vegetativne dijelove velebitske degenije, osobito gusto

raspoređene na površini listova. Razvijene dlake su dendritičkog tipa, sastavljene od drška i

vršnog dijela s dihotomski razgranjenim ograncima ili zrakama. Jednostanične su i vjerojatno

mrtve, bududi da u šupljinama drška i tijela dlake nisam zamijetio stanične organele, što sam

potvrdio i bojanjem vitalnom bojom neutralnim crvenilom. Na takvo stanje ukazuje i njihova

srebrnkasto-bijela boja, koja je posljedica ispunjenosti unutrašnjih prostora zrakom te refleksije

svjetlosti. Razgranjena tijela dlaka međusobno se ispreplidu i čine jedan, a ponegdje i dva

zaštitna sloja, kroz koje se ne nazire epiderma lisne plojke. Slična morfološko-anatomska

obilježja dendritičnih dlaka utvrđena su i kod pojedinih svojti iz 11 rodova tribusa Alysseae

(Ančev i Goranova 2006), koja se koriste u klasifikaciji unutar porodice Brassicaceae. Dlake

velebitske degenije imaju zadebljale, lignificirane stijenke (Stevanovid i Vujnovid 1990), a

točkastom spektrometrijskom analizom na adaksijalnoj strani utvrđen je visok postotak kisika,

ugljika i kalcija, što upuduje na prisutnost kalcijevog karbonata, vjerojatno istaloženog iz

vodovodne vode koja je korištena u sustavu rošenja biljaka na pokusnom klijalištu gdje su

uzgojene. Kseromorfna i heliomorfna anatomska građa listova i dlaka velebitske degenije odraz

su prilagođenosti specifičnoj ekološkoj niši koju definira velik raspon temperatura tijekom

godine, trajna suša i pojačano sunčevo zračenje ljeti te česti vjetrovi tijekom hladnijih dijelova

godine. Podjednaka obilježja u građi listova i dlaka utvrđena su i kod trobridog sjedca

(Damjanovid i Stevanovid 1993), također endemične vrste iz porodice Brassicaceae, što dodatno

ukazuje na visok stupanj srodnosti s velebitskom degenijom, nedavno potvrđen u molekularnim

istraživanjima filogenetskih odnosa tribusa Alysseae (Rešetnik 2011).

5.4.2. Lokalizacija i koncentracija flavonoida u pojedinim dijelovima biljke

Pojedini fenolni spojevi autofluoresciraju (primarna fluorescencija) kad su ekscitirani UV

svjetlom određene valne duljine. Intenzivna žuta sekundarna fluorescencija primijedena u

središnjim šupljinama dlaka na EFM pri ekscitaciji prereza s UV svjetlom nakon dulje (sedam i

više minuta) inkubacije u Naturstoff reagensu (NR) dokaz je prisutnosti flavonoida u tim

strukturama. Naime NR, odnosno 2-amino-etil-difenilborna kiselina otopljena u etanolu, je

fluorescencijska boja koja s flavonoidima stvara specifične adukte u kojih su

apsorpcijsko-emisijski spektri pomaknuti prema vedim valnim duljinama (tzv. batokromski

pomak). Posljedica tog batokromskog pomaka je sekundarna fluorescencija flavonoida žute do

žutozelene boje.

U vedini istraživanja lokalizacije flavonoida u živim biljnim tkivima pomodu NR,

najprikladnije vrijeme inkubacije uzoraka bilo je od 1,5 minuta (Tattini i sur. 2000) do najviše 5

minuta (Hutzler i sur. 1998; Agati i sur. 2009). Dulje vrijeme inkubacije dlaka velebitske degenije


118

do pojave sekundarne fluorescencije može se objasniti otežanim prodiranjem NR u središnje

šupljine dlaka, bududi da su one čvrsto prirasle bazalnim stanicama za epidermu, a šupljine

djelomično ispunjene staničnim ostacima. Isto je utvrđeno i kod izoliranih svježih dlaka

promatranih na CLSM pri ekscitaciji plavim svjetlom. Potrebno vrijeme inkubacije u NR prije

pojave sekundarne fluorescencije u šupljinama dlaka promatrane s CLSM bilo je malo krade u

odnosu na tretman čitavih prereza promatranih na EFM, vjerojatno stga što su dlake bile

izolirane, a šupljine u dršcima dlaka dostupnije reagensu. Potvrda lokalizacije flavonoida u

unutrašnjosti dlaka velebitske degenije od velike je važnosti, s obzirom na to da se one smatraju

jednom od najizrazitijih morfoloških značajki te biljke kao kserofita i heliofita te im se pripisuje

važna uloga u zaštiti osjetljivih struktura lista od intenzivnog zračenja, pregrijavanja i gubitka

vode transpiracijom (Stevanovid i Vujnovid 1990; Damjanovid i Stevanovid 1993).

Poznato je da obične dlake, tj. ne-žljezdasti trihomi, mogu sadržavati različite flavonoide.

U ne-žljezdastim dlakama listova hrasta crnike utvrđeni su metilirani glikozidi kempferola, a

važnost dlaka u obrani od UV zračenja dokazana je temeljem značajno smanjene efikasnosti

PS u detrihomiziranim listovima u odnosu na efikasnost PS u čitavim listovima (Skaltsa i

sur. 1994). Derivati glikozida kempferola također su utvrđeni u dendritičkim dlakama listova

bijelog bušina, u kojima im je izmjerena sposobnost apsorpcije UVB i UVA zračenja (Tattini i sur.

2006). U dlakama listova masline utvrđen je aglikonski kvercetin i jedan glikozid kvercetina, dok

ih u listovima, u kojima je utvrđen vedi broj različitih flavonoida ali u značajno nižim

koncentracijama u odnosu na dlake, nema (Liakopoulos i sur. 2006). Kod masline je također

utvrđena korelacija gustode dlaka na listovima te koncentracije UV-upijajudih flavonoida s

različitim položajem listova u odnosu na intenzitet sunčevog UV zračenja u podne (Liakoura i

sur. 1997). Tako je najveda gustoda dlaka i najviša koncentracija flavonoida utvrđena kod listova

južne ekspozicije i vanjskog dijela krošnje, dakle najizloženijih suncu, što potvrđuje hipotezu

važnosti dlaka u obrani od UV zračenja kod biljaka s heliomorfnim i kseromorfnim značajkama.

U istome radu također je istražen UV-upijajudi kapacitet dendritičkih dlaka listova planinske

vrste divizme. Bududi da listovi divizme rastu u rozeti, vanjski dijelovi gornje plojke listova

izloženi su suncu, a unutarnji su zasjenjeni listovima iznad (listovima superimpoziranog

pršljena). Iako nije utvrđena razlika u gustodi dlaka i koncentraciji flavonoida u ta dva dijela lista,

dlake na vanjskom, suncu izloženom dijelu listova imale su značajno vedi UV-upijajudi kapacitet,

što je povezano s primijedenom sintezom novih vrsta flavonoida. Važnost „dlakavosti” u obrani

divizme od UVB zračenja Sunca dokazana je u pokusu uzgoja biljaka s čitavim i detrihomiziranim

listovima na suncu te u uvjetima s uklonjenim UVB ili ukupnim UV zračenjem (Manetas 2003).

Efikasnost PS bila je značajno narušena u detrihomiziranim listovima uzgajanim na suncu, no

taj negativni učinak u potpunosti je nestao nakon uklanjanja UVB zračenja pomodu UV

apsorbirajude folije.

U velebitske degenije, usporedbom koncentracije flavonoida u ekstraktima

detrihomiziranih listova s koncentracijom u ekstraktima dlaka, utvrđeno je da se u dlakama

nalazi oko šest puta više kvercetina, tri puta više kempferola i 2,8 puta više izoramnetina u

odnosu na „gole” listove. Zbog otežanog uklanjanja dlaka s površine krhkih listova, u

ekstraktima dlaka bio je mogud i manji doprinos epidermskih stanica. No, može se tvrditi da je

koncentracija flavonoida, bilo njihovih aglikona ili glikozidnih derivata, a naročito kvercetina,

značajno viša u dlakama u odnosu na ostala tkiva lista. Zanimljivo je i da je omjer koncentracije


119

kvercetina, kempferola i izoramnetina, dobiven dijeljenjem koncentracija s koncentracijom

kvercetina, u ekstraktima dlaka bio 1:0,28:0,18, a u ekstraktima čitavih listova (u nezavisnom

UV pokusu) 1:0,25:0,19 što potvrđuje najvedi doprinos dlaka u ukupnoj koncentraciji aglikona

flavonoida čitavih listova. Povišenje koncentracija kvercetina i izoramnetina utvrđeno u

listovima izloženim UV stresu vjerojatno je odraz povedane sinteze tih jakih antioksidanasa u

živim stanicama epiderme i mezofila lista, bududi da je mogudnost akumulacije tih spojeva u

odumrle dlake malo vjerojatna.

U poprečnim prerezima lista velebitske degenije promatranim s EFM također je

primijedena intenzivna žuta fluorescencija flavonoida, ved nakon kratkotrajne inkubacije u NR.

Najintenzivnije su fluorescirale pojedine čitave epidermske stanice, vjerojatno stanice zapornice

puči. Nazirala se i manje intenzivna i nejednaka fluorescencija ostalih epidermskih stanica,

najviše u područjima njihovih stijenki, ali ne i vakuola, kao kod stanica zapornica. Promatranjem

plošnih prereza inkubiranih u NR potvrđena je jaka fluorescencija flavonoida u vakuolama

zapornica, dok su pokrovne epidermske stanice fluorescirale u području stijenke, plazmaleme ili

citosola. Nejednaka i jača fluorescencija epiderme na poprečnom u odnosu na plošni prerez

vjerojatno je posljedica njegove debljine i kumulativnog efekta fluorescencije više slojeva

stanica. Naime, plošni prerez je nastao „guljenjem” epiderme s lista te je sadržavao 1-2 sloja

stanica i davao precizniju sliku lokalizacije flavonoida. Opažanja lokalizacije flavonoida u

epidermi, na poprečnim prerezima promatranim s CLSM nakon inkubacije u NR, bila su slična

prethodno opisnima: intenzivno su fluorescirale čitave stanice zapornice puči i vanjske stijenke

epidermskih stanica, dok je u vakuolama epidermskih stanica bila zamjetna vrlo slaba

fluorescencija gotovo zanemarivog intenziteta.

U uročnjaka akumulacija flavonoida utvrđena je u citoplazmi, ali ne i vakuolama stanica

korijena inkubiranih s NR (Sheahan i sur. 1998). Autori sugeriraju da je NR u neutralnom obliku

kisela boja koja se nakon prolaska kroz plazmalemu deprotonira, zbog čega više ne može prodi

kroz plazmalemu, a zatim se akumulira i selektivno veže za flavonoide u citoplazmi. Istodobno,

zbog suprotnog pH gradijenta NR ne može prodrijeti kroz tonoplast i vezati se za vakuolarne

flavonoide. U teoriji, za bojanje vakuolarnog sadržaja, tj. vakuolarnih flavonoida, potrebna je

bazična boja, što je prije potvrđeno u lokalizaciji vakuolarnih flavonoida peršuna pomodu CLSM

(Schmelzer i sur. 1988). U tom je pokusu kao pobuđivač sekundarne fluorescencije korištena

0,05 %-tna otopina amonijaka, koja je izazvala zelenu fluorescenciju flavonoida ekscitiranih UV

svjetlom.

Na poprečnim prerezima lista velebitske degenije tretiranim vodenom otopinom

amonijaka i promatranim na EFM pri ekscitaciji UV svjetlom bila je vidljiva intenzivna zelena

fluorescencija gotovo svih stanica epiderme, uključujudi i vakuole, a ne samo stanica zapornica.

Poznato je da jedino dihidroksi-B-supstituirani flavonoidi, poput derivata kvercetina i

izoramnetina, nakon tretmana s NR stvaraju adukte koji intenzivno fluoresciraju kad su

ekscitirani s plavim svjetlom (Agati i sur. 2009) dok glikozidi kempferola, koji je

monohidroksi-B-supstituirani flavonoid, intenzivno fluoresciraju jedino u lužnatim otopinama

(Hutzler i sur. 1998). Stoga se može zaključiti da su u vakuolama epidermskih stanica listova

velebitske degenije najprisutniji derivati kempferola. Moguda je također i prisutnost kvercetina i

izoramnetina, ali u znatno manjim količinama, bududi da su njihovi prinosi fluorescenciji


120

vakuola epidermskih stanica nakon tretmana s NR bili zanemarivi. Slično ovim zapažanjima, u

vakuolama stanica zapornica graška utvrđeni su glikozidi kempferola i kvercetina (Weissenböck

i sur. 1986).

Promatranje stanica mezofila lista na EFM nakon inkubacije prereza u NR ili alkalizacije

vodenom otopinom amonijaka davalo je slične rezultate. Tako je kod palisadnih stanica

intenzivna fluorescencija bila ograničena samo na periferne dijelove stanica u području stanične

stijenke i plazmatske membrane ili citoplazme, dok vakuole nisu fluorescirale. Fluorescirale su

palisadne stanice s obje strane lista, ali intenzivnije prvi sloj palisadnih stanica s adaksijalne

strane.

Posebno zanimljiva bila je fluorescencija palisadnih stanica promatrana s CLSM u

NR-inkubiranim poprečnim i plošnim prerezima. U pravilno prerezanim stanicama, koje su od

ostalih stanica vidljivo odudarale rasporedom bočno poredanih kloroplasta ledastog oblika uz

rub stanične stijenke i oko velike središnje vakuole, fluorescencija je bila jedva zamjetna. Kod

nepravilno prerezanih stanica bila je vidljiva fluorescencija plošnih dijelova ili čak čitavih bočnih

ploha u netaknutim stanicama, a površine kloroplasta su bile kružne, bududi da su ledastog

oblika i u čitavim stanicama njihove plohe paralelne su s plohama stanice. Na temelju razlika u

fluorescencijama pravilno i nepravilno prerezanih stanica može se zaključiti da se flavonoidi

nalaze u vrlo tankom sloju u perifernim dijelovima stanica, što odgovara položaju stanične

stijenke ili plazmatske membrane. Naime, smatra se da su flavonoidi „otopljeni” u staničnom

okružju, bududi da fluoresciraju kad su konjugirani sa sastavnicama stanične stijenke,

„otopljeni” u lipidnom dvosloju ili nekovalentno vezani za proteine (Agati i sur. 2009). No s

obzirom na to da intenzitet fluorescencije u palisadnim stanicama velebitske degenije nije bio

jednoliko raspoređen oko kloroplasta, ne može se isključiti ni moguda lokalizacija flavonoida u

citoplazmi, u kojoj se vjerojatno sintetiziraju (Kitamura 2006). Agati i sur. (2009) utvrdili su

akumulaciju flavonoida u vakuolama mezofilnih stanica kaline koristedi metodu ubrizgavanja NR

u list pomodu medicinske injekcije, što je izazvalo mehanički pritisak na tonoplast i omogudilo

prodiranje NR u vakuole. Međutim, vakuole palisadnih stanica velebitske degenije nisu

fluorescirale nakon inkubacije u NR, ali niti na alkaliziranim prerezima, pa se može pretpostaviti

da problem nije u ulasku NR u vakuole, nego da u njima flavonoidi nisu prisutni u značajnijim

koncentracijama.

U prerezima promatranim s EMF također je primijedena svijetloplava autofluorescencija

zadebljalih stijenki dlaka, zadebljalih staničnih stijenki epidermskih stanica i kutikule, kao i

provodnih elemenata ksilema u žilama (posljednja nije vidljiva na prikazanim mikrografijama),

koja je inače karakteristična za UV-ekscitirane polifenolne spojeve poput lignina (Sylvester i sur.

1991).

Na temelju prethodnih usporedbi i obrazloženja može se zaključiti da su u listovima

velebitske degenije flavonoidi kvercetin i izoramnetin, ili njihovi derivati, najzastupljeniji u

šupljinama dlaka, u području stanične stijenke, plazmaleme ili citosola epidermskih stanica i

stanicama stapornicama puči, te u području stanične stijenke, plazmaleme ili citosola stanica

mezofila, naročito vanjskih slojeva palisadnih stanica s obje strane lista. Kempferol i/ili njegovi

derivati prisutni su u vakuolama epidermskih stanica i stanicama zapornica puči. Bududi da se


121

koncentracija kempferola nije značajno mijenjala u listovima velebitske degenije nakon

izlaganja biljaka UV stresu, kao ni u biljkama sezonskog uzorka od proljeda do jeseni, a s

obzirom na njegove slabije antioksidacijske sposobnosti kao monohidroksi-B-supstituiranog

flavonoida, mogude je da prisutnost derivata tog spoja u vakuolama epidermskih stanica

ukazuje na važnu UV-upijajudu ulogu tih spojeva, ali i same epiderme koja obavija stanice

mezofila. Kvercetin i izoramnetin, čije su se koncentracije značajno povisile u listovima biljaka

izloženih UV stresu, vjerojatno imaju ulogu jakih UV-filtera u neživim strukturama poput dlaka,

ali i jakih antioksidanasa u stanicama epiderme i mezofila.

6. ZAKLJUČCI

Fiziološki odgovori velebitske degenije, Degenia velebitica (Degen) Hayek na UV zračenje Zaključci

123

Na temelju rezultata istraživanih fizioloških odgovora velebitske degenije na sunčevo UV

zračenje i sezonskih promjena u pojedinim fiziološkim parametrima, zaključujem sljedeće:

Biljke negativne kontrolne skupine (UV –), koje su čitavo vrijeme uzgajane na vanjskoj

pokusnoj plohi ispod UV reflektirajude folije, primile su tijekom 988 sati pokusa ukupno 3

MJ m-2 sunčeva UV zračenja. Biljke pokusne skupine (UV stres) naglo izložene suncu uklanjanjem

UV folije, tijekom pokusa su primile ukupnu dozu od 32,5 MJ m-2 sunčeva UV zračenja, što je

oko 11 puta veda doza zračenja od biljaka skupine UV –.

Naglo izlaganje sunčevu UV zračenju uzrokovalo je u listovima velebitske degenije

oksidacijski stres te oštedenja lipida i proteina, bududi da su se koncentracije vodikovog

peroksida, malondialdehida i proteinskih karbonila značajno povisile, naročito nakon primljene

doze od 6,7 MJ m-2. Nakon dugotrajnog izlaganja suncu primijedeno je sniženje koncentracija

pokazatelja oksidacijskog stresa, što ukazuje na postupni oporavak i aklimatizaciju.

UV stres nije uzrokovao ni strukturna oštedenja ni poremedaj u funkcioniranju

fotosintetskog aparata u listovima izloženih biljaka. Nije bilo promjene u ekspresiji proteina D1 i

enzima RuBisCO, a primijedeno je značajno povedanje ekspresije proteina LHC . U listovima

izloženih biljaka također je došlo do trenutačnog i značajnog povišenja koncentracija

fotosintetskih pigmenata, naročito pomodnih karotenoida neoksantina, violaksantina,

anteraksantina, luteina i β-karotena. Koncentracija klorofila b također se značajno povisila u

odnosu na neznatno povišenje koncentracije klorofila a, što je rezultiralo značajno smanjenim

omjerom njihovih koncentracija. Mjerenjem fluorescencije klorofila a in vivo nisu utvrđene

promjene u funkcionalnosti i efikasnosti PS , bududi da se vrijednosti optimalnog i efektivnog

prinosa te fotokemijskog i nefotokemijskog gašenje fluorescencije nisu značajno mijenjale kod

izloženih biljaka.

Navedeni rezultati ukazuju na to da povedanje vanjskog dijela kompleksa za prikupljanje

svjetlosti fotosistema II sudjeluje u fotoprotekciji i aklimatizaciji fotosintetskog aparata na UV

zračenje.

UV stres je u izloženim biljkama snažno potaknuo aktivnost antioksidacijskih enzima.

Povedanje aktivnosti peroksidaza, katalaze i superoksid dismutaze, enzima s velikim

kapacitetima za uklanjanje H2O2 odnosno superoksidnog radikala, vremenski se podudaralo s

povišenim koncentracijama H2O2, MDA i proteinskih karbonila. To istodobno ukazuje na


124

oksidacijski stres, osobito nakon doze zračenja od 6,7 MJ m-2, ali i na povedanje ukupnog

kapaciteta enzimskog antioksidacijskog sustava što pridonosi aklimatizaciji na sunčevo UV

zračenje.

U listovima velebitske degenije utvrđena su tri glavna aglikona flavonoida: kvercetin,

kempferol i izoramnetin. Kvercetina je u listovima biljaka koje su rasle na suncu bilo oko 1,95

mg gs.t.-1, kempferola 0,5 mg gs.t.

-1, a izoramnetina 0,37 mg gs.t.-1. Koncentracija kvercetina u

listovima izloženih biljaka značajno se povisila ved nakon doze zračenja od 3,3 MJ m-2, a nakon

dugotrajnog izlaganja suncu bila je dva puta viša od početne. Značajno povišena koncentracija

izoramnetina utvrđena je nakon doze od 6,7 MJ m-2, a nakon dugotrajnog izlaganja suncu bila je

čak pet puta viša od početne. Koncentracija kempferola nije se značajno mijenjala u listovima

izloženih biljaka.

Listovi velebitske degenije su izobilateralnog i amfistomatskog tipa te posjeduju

kseromorfne i heliomorfne morfološko-anatomske značajke, među kojima je izrazito važna

pokrivenost jednostaničnim, odumrlim epidermskim trihomima (dlakama) dendritičkog tipa.

Flavonoidi su histokemijski lokalizirani u šupljinama epidermskih trihoma, u području

stanične stijenke, plazmaleme ili citosola i vakuolama epidermskih stanica i stanica zapornica

puči te u područjima stanične stijenke, plazmaleme i citosola, ali ne i u vakuolama stanica

mezofila.

Koncentracija kvercetina bila je šest, kempferola tri, a izoramnetina 2,8 puta viša u

dlakama svježih listova u odnosu na koncentraciju u detrihomiziranim listovima biljaka

uzgajanih na suncu, što ukazuje na fiziološku ulogu dlaka i flavonoida u obrani od sunčeva UV

zračenja.

Usporedba rezultata svih istraživanih pokazatelja kod biljaka koje su uzgajane ispod UV

reflektirajude folije i onih koje su cijelo vrijeme rasle izložene suncu potvrđuje da je velebitska

degenija dobro prilagođena prirodnom sunčevom zračenju, jer nisu nađena oštedenja važnih

makromolekula kao ni smanjenje fotosintetske sposobnosti. Povišena koncentracija kvercetina i

izoramnetina te povedanje vanjskog dijela kompleksa za prikupljanje svjetlosti fotosistema II u

listovima biljaka izloženih suncu ukazuje na njihovu mogudu ulogu u fotoprotekciji i

aklimatizaciji.

Istraživanje sezonskih promjena također je potvrdilo prilagođenost velebitske degenije

prirodnoj insolaciji, a pokazalo da ujesen i zimi dolazi do povišenja koncentracije H2O2 i


125

proteinskih karbonila u listovima velebitske degenije. Povedana aktivnost antioksidacijskih

enzima, ali i povišena koncentracija izoramnetina, korelirala je sa sniženjem temperatura zraka,

što govori o njihovom sudjelovanju u mehanizmima tolerancije kod velebitske degenije na niske

i smrzavajude temperature.

Velebitska degenija izraziti je heliofit i kserofit koji, osim morfološko-anatomskih,

posjeduje i razvijene fiziološke prilagodbe, nadasve enzimske i neenzimske antioksidacijske

mehanizme zaštite od sunčevog UV zračenja, ali i smrzavajudih temperatura. Naročita važnost u

zaštiti listova od jakog sunčevog zračenja može se pripisati epidermskim trihomima, tj. dlakama

koje gusto prekrivaju sve vegetativne dijelove biljke, odnosno flavonoidima kao UV-filtrima koji

su prisutni u svim lisnim tkivima, s najvišomm koncentracijom upravo u unutrašnjosti dlaka.

7. LITERATURA

Fiziološki odgovori velebitske degenije, Degenia velebitica (Degen) Hayek na UV zračenje Citirana literatura

127

Aebi H (1984) Catalase in vitro. Methods Enzymol 105: 121-126

Agati G, Galardi C, Gravano E, Romani A, Tattini M (2002) Flavonoid distribution in tissues of Phillyrea latifolia as estimated by microspectrofluorometry and multispectral fluorescence microimaging. Photochem Photobiol 76: 350-360

Agati G, Matteini P, Goti A, Tattini M (2007) Chloroplast-located flavonoids can scavenge singlet oxygen. New Phytol 174: 77-89

Agati G, Stefano G, Biricolti S, Tattini M (2009) Mesophyll distribution of antioxidant flavonoids in Ligustrum vulgare leaves under contrasting sunlight irradiance. Ann Bot 104: 853-861

Agati G, Tattini M (2010) Multiple functional roles of flavonoids in photoprotection. New Phytol 186: 786-793

Agrawal SB (2007) Increased antioxidant activity in Cassia seedlings under UV-B radiation. Biol Plant 51: 157-160

Agrawal SB, Rathore D (2007) Changes in oxidative stress defense system in wheat (Triticum aestivum L.) and mung bean (Vigna radiata L.) cultivars grown with and without mineral nutrients and irradiated by supplemental ultraviolet-B. Environ Exp Bot 59: 21-33

Alegro i sur. (2010) Botanički važna područja Hrvatske. Prirodoslovno-matematički fakultet i „Školska knjiga”, Zagreb

Alexieva V, Sergiev I, Mapelli S, Karanov E (2001) The effect of drought and ultraviolet radiation on growth and stress markers in pea and wheat. Plant Cell Environ 24: 1337-1344

Allen DJ, McKee IF, Farage PK, Baker NR (1997) Analysis of the limitation to CO2 assimilation on exposure of leaves of two Brassica napus cultivars to UV-B. Plant Cell Environ 20: 633-640

Allen DJ, Nogués S, Baker NR (1998) Ozone depletion and increased UV-B radiation: is there a real threat to photosynthesis? J Exp Bot 49: 1775-1788

Ančev M, Goranova V (2006) Trichome morphology of eleven genera of the tribe Alysseae (Brassicaceae) occuring in Bulgaria. Willdenowia 36: 193-204

Alscher RG, N Erturk, Heath LS (2002) Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants. J Exp Biol 53: 1331-1341

Anderson JM, Chow WS, Park YI (1995) The grand design of photosynthesis: Acclimation of the photosynthetic apparatus to environmental cues. Photosynth Res 46: 129-39

Anderson JM, Chow WS, Park Y-I, Franklin LA, Robinson SP-A, van Hasselt PR (2001) Response of Tradescantia albiflora to growth irradiance: change versus changeability. Photosynth Res 67: 103-112

Anonymus (1991) European Red List of Globally Threatened Animals and Plants, and recommendations on its application as adopted by the Economic Commission for Europe at its forty-sixth session (1991) by decision D (46). United Nations Publication, New York

Anonymus (2004) Pravilnik o sakupljanju samoniklih biljaka u svrhu prerade, trgovine i drugog prometa. Narodne novine 100/04

Asada K (1992) Ascorbate peroxidase. A hydrogen peroxide scavenging enzyme in plants. Physiol Plant 85: 235-241

Asada K, Urano M, Takahashi M (1973) Subcellular location of superoxide dismutase in spinach leaves and preparation and properties of crystalline spinach superoxide dismutase. Eur J Biochem 36: 257-66

Ballaré CL, Barnes PW, Kendrick RE (1991) Photomorphogenic effects of UV-B radiation on hypocotyl elongation in wild-type and stable-phytochrome-deficient mutant seedlings of cucumber. Physiol Plantarum 83: 652-658


128

Barbato R, Frizzo A, Friso G, Rigoni F, Giacometti GM (1995) Degradation of the D1 protein of Photosystem-II reaction centre by ultraviolet-B radiation requires the presence of functional manganese on the donor side. Eur J Biochem 227: 723-729

Barsig M, Malz R (2000) Fine structure, carbohydrates and photosynthetic pigments of sugar maize leaves under UV-B radiation. Environ Exp Bot 43: 121-30

Bassi R, Caffari S (2000) Lhc proteins and the regulation of photosynthetic light harvesting function by xanthophylls. Photosynth Res 64: 243-256

Beauchamp C, Fridovich I (1971) A mechanism for the production of ethylene from methional. The generation of the hydroxyl radical by xanthine oxidase. J Biol Chem 245: 4641-4646

Bergo E, Segalla A, Giacometti GM, Tarantino D, Soave C, Andreucci F, Barbato R (2003) Role of visible light in the recovery of photosystem II structure and function from ultraviolet-B stress in higher plants. J Exp Bot 54: 1665-1673

Blokhina O, Virolainen E, Fagerstedt KV (2003) Antioxidants, oxidative damage and oxygen depravation stress: A review. Ann Bot 91: 179-194

Blum H, Beier H, Gross HJ (1987) Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis 8: 93-99

Bolink EM, Schalkwijk IV, Posthumus F, Van Hasselt PR (2001) Growth under UV-B radiation increases tolerance to high light stress in pea and bean plants. Plant Ecol 154: 149-156

Booij-James IS, Dube SK, Jansen MAK, Edelman M, Mattoo AK (2000) Ultraviolet-B radiation impacts light-mediated turnover of the photosystem II reaction center heterodimer in Arabidopsis mutants altered in phenolic metabolism. Plant Physiol 124: 1275-1283

Bowes G, Ogren WL (1972) Oxygen inhibition and other properties of soybean ribulose 1,5-diphosphate carboxylase. J Biol Chem 247: 2171-2176

Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254

Bungard RA, Ruban AV, Hibberd JM, Press MC, Horton P, Scholes JD (1999) Unusual carotenoid composition and a new type of xanthophyll cycle in plants. Proc Natl Acad Sci USA 96: 1135-1139

Burchard P, Bilger W, Weissenböck G (2000) Contribution of hydroxycinnamates and flavonoids to epidermal shielding of UV-A and UV-B radiation in developing rye primary leaves as assessed by ultraviolet-induced chlorophyll fluorescence measurements. Plant Cell Environ 23: 1373-1380

Cadet J, Anselmino C, Douki T, Voituriez L (1992) New trends in photobiology: photochemistry of nucleic acids in cells. J Photochem Photobiol B 15: 277-298

Caffarri S, Croce R, Breton J, Bassi R (2001) The major antenna complex of photosystem II has a xanthophyll binding site not involved in light harvesting. J Biol Chem 38: 35924-35933

Caldwell CR (1993). Ultraviolet-induced photodegradation of cucumber microsomal and soluble protein tryptophanyl residues in vitro. Plant Physiol 101: 947-953

Caldwell CR, Britz S (2006) Effect of supplemental ultraviolet radiation on the carotenoid and chlorophyll composition of green house-grown leaf lettuce (Lactuca sativa L.) cultivars. J Food Compos Anal 19: 637-644

Caldwell MM, Björn LO, Bornmann JF, Flint SD, Kuladaivelu G, Teramura AH, Teveni M (1998) Effects of increased solar ultraviolet radiation on terrestrial ecosystems. Photochem Photobiol B 46: 40-52

Caldwell MM, Robberecht R, Flint SD (1983) Internal filters: prospects for UV-acclimation in higher plants. Physiol Plantarum 58: 445-450

Canuto VM, Levine JS, Augustsson TR, Imhoff CL (1982) UV radiation from the young Sun and oxygen and ozone levels in the prebiological palaeoatmosphere. Nature 296: 816-820


129

Carletti P, Masi A, Wonish A, Grill D, Tausz M, Ferretti M (2003) Changes in antioxidant and pigment pool dimensions in UV-B irradiated maize seedlings. Environ Exp Bot 39: 177-185

Chakraborty U, Pradhan D (2010) Biochemical responses of Lentil (Lens culinaris Medik.) to elevated temperature stress. Res J Pharmaceut Biol Chem Sci 1 (3): 575-585

Chance B, Maehly SK (1955) Assay of catalase and peroxidases. Methods Enzymol 2: 764-775

Cheeseman JM (2006) Hydrogen peroxide concentrations in leaves under natural conditions. J Exp Bot 57: 2435-2444

Cheeseman JM (2007) Hydrogen peroxide and plant stress: A challenging relationship. Plant Stress 1(1): 4-15

Cheeseman JM (2009) Seasonal patterns of leaf H2O2 content: reflections of leaf phenology, or environmental stress? Funct Plant Biol 36: 721-731

Choi BY, Roh KS (2003) UV-B radiation affects chlorophyll and activation of rubisco by rubisco activase in Canavalia ensiformis L. leaves. J Plant Biol 46 (2): 117-121

Citadin I, Raseir MCB, Augustin E, Herter FG (2002) Relationship of peroxidase, 6-phosphogluconate dehidrogenase and phosphoglucoisomerase to endodormancy phase peach. Acta Hort 562: 451-457

Corpas FJ, Barroso JB, del Río LA (2001) Peroxisomes as a source of reactive oxygen species and nitric oxide signal molecules in plant cells. Trends Plant Sci 6: 145-150

Costa H, Gallego SM, Tomaro ML (2002) Effects of UV-B radiation on antioxidant defense system in sunflower cotyledons. Plant Sci 162 (6): 939- 945

Creed D (1984) The photophysics and photochemistry of the near-UV apsorbing amino acids-III. Cystein and its simple derivatives. Photochem Photobiol 39: 577-583

Crutzen PJ, Oppenheimer M (2007) Learning about ozone depletion. Climatic Change 89: 143-154

Dai F, Huang Y, Zhou M, Zhang G (2009) The influence of cold acclimation on antioxidative enzymes and antioxidants in sensitive and tolerant barley cultivars. Biol Plant 53: 257-262

Dall'Osto L, Cazzaniga S, North E, Marion-Poll A, Bassi R (2007) The Arabidopsis aba4-1 mutant reveals a specific function for neoxanthin in protection against photooxidative stress. Plant Cell 19: 1048-1064

Damjanovid O, Stevanovid B (1993) Morpho-anatomical adaptations of endemic species Fibigia triquetra (DC.) Boiss. (Brassicaceae). Bull Inst Jard Bot Univ Beograd 24/25: 9-19

Davies KJA (1995) Oxidative stress: the paradox of aerobic life. Biochem Soc Symp 61: 1-31

Davies KJA (2000) Oxidative stress, antioxidant defenses, and damage removal, repair, and replacement systems. IUBMB Life 50: 279-289

De Lillis M, Fontanella A (1992) Comparative phenology and growth in different species of the Mediterranean maquis of central Italy. Vegetatio 99/100: 83-96

Degen A (1909) A Lesquerella nemzetseg egyik kepvisolejenek a Velebit hegysegben toertent feldfedezeseroel. Magy Bot Lapok 8: 3-24

Demming-Adams B (1990) Carotenoids and photoprotection in plants. A role for Xanthophyll zeaxanthin. Biochem Biophys Acta 1020: 1-24

Domac R (1993) Degenia velebitica. U: Tutin i sur. (ur.) Flora Europaea, 2nd

Edition Vol. 1, Cambridge University Press, New York, 359

Durkeet AB, Harborne JB (1973) Flavonol glycosides in Brassica and Sinapis. Phytochemistry 12: 1085-1089

Elrad D, Niyogi KK, Grossman AR (2002) A major light-harvesting polypeptide of photosystem II functions in thermal dissipation. Plant Cell 14: 1801-1816


130

Elstner EF (1991) Mechanisms of oxygen activation in different compartments of plant cells. U: Pell EJ, Steffen KL (ur.) Active oxygen/oxidative stress and plant metabolism. American Soc Plant Physiol, Rockville, 13-25

Eyring V, Cionni I, Lamarque JF, Akiyoshi H, Bodeker GE, Charlton-Perez AJ, Frith SM, Gettelman A, Kinnison DE, Nakamura T, Oman LD, Pawson S, Yamashita Y (2010) Sensitivity of 21st century stratospheric ozone to greenhouse gas scenarios. Geophys Res Lett 37: 1-7

Fahn A, Cutler FD (1992) Xerophytes. Encyclopedia of Plant Anatomy, Vol. 3. Gebrüder Bornträger, Berlin, Stuttgart

Farman JC, Gardiner BG, Shanklin JD (1985) Large losses of total ozone in Antarctica reveal seasonal ClOx/NOx interaction. Nature 315: 207-210

Fedina I, Hidema J, Velitchkova M, Georgieva K, Nedeva D (2010) UV-B induced stress responses in three rice cultivars. Biol Plant 54: 571-574

Feucht W, Treutter D, Polster J (2004) Flavanol binding of nuclei from tree species. Plant Cell Rep 22: 430-436

Förster B, Osmond CB, Boynton JE (2001) Very high light resistant mutants of Chlamydomonas reinhardtii: responses of Photosystem II, nonphotochemical quenching and xanthophyll pigments to light and CO2. Photosynth Res 67: 5-15

Foyer CH (2002) The contribution of photosynthetic oxygen metabolism to oxidative stress in plants. U: Inzé D, Van Montag M (ur.) Oxidative Stress in Plants. Taylor & Francis, London, 33-68

Foyer CH, Noctor G (2005) Redox homeostis and antioxidant signaling: a metabolic interface between stress perception and physiological responses. Plant Cell 17: 1866-1875

Friso G, Barbato R, Giacometti GM, Barber J (1994) Degradation of D2 protein due to UV-B irradiation in the reaction centre of photosystem II. FEBS Lett. 339: 217-221

Friso G, Vass I, Spetea C, Barber J, Barbato R (1995) UB-B induced degradation of the D1 protein in isolated reaction centres of photosystem II. Biochim Biophys Acta 1231: 41-46

Frohnmeyer H, Staiger D (2003) Ultraviolet-B radiation-mediated responses in plants. Balancing damage and protection. Plant Physiol 133: 1420-1428

Gao Q, Zhang L (2008) Ultraviolet-B-induced oxidative stress and antioxidant defense system responses in ascorbate deficient vtc 1 mutants of Arabidopsis thaliana. J Plant Physiol 165 (12): 138-148

Gereš D (2007) Vodni resursi i navodnjavanje u priobalju i krškom zaleđu Hrvatske. U: Ožanid i sur. Priručnik za hidrotehničke melioracije: Vodnogospodarski aspekti razvoja navodnjavanja u priobalju i krškom zaleđu Hrvatske 3 (III). Građevinski fakultet Sveučilišta u Rijeci, Rijeka, 23-68

Giannopolitis CN, Ries SK (1977) Superoxide Dismutase I-occurance in higher plants. Plant Physiol 59: 309-314

Gichner T, Menke M, Stavreva DA, Schubert I (2000) Maleic hydrazide induces genotoxic effects but no DNA dmage detectable by the comet assay in tobacco and field beans. Mutagen 15: 385-389

Gill SS, Tuteja N (2010) Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiol Biochem 48: 909-930

Gilmore AM (2001) Xanthophyll cycle-dependent nonphotochemical quenching in Photosystem II: Mechanistic insights gained from Arabidopsis thaliana L. mutants that lack violaxanthin deepoxidase activity and/or lutein. Photosynth Res 67: 89-101

Guidi L, Degl’Innocenti E, Remorini D, Biricolti S, Fini A, Ferrini F, Nicese FP, Massimiliano Tattini M (2011) The impact of UV-radiation on the physiology and biochemistry of Ligustrum vulgare exposed to different visible-light irradiance. Environ Exp Bot 70: 88-95

Gupta R, Bhadauriya P, Chauhan VS, Bisen PS (2008) Impact of UV-B radiation on thylakoid membrane and fatty acid profile of Spirulina platensis. Curr Microbiol 56 (2): 156-61


131

Halliwell B (2006) Reactive species and antioxidants: redox biology is a fundamental theme of aerobic life. Plant Physiol 141: 312-322

Hancock J, Desikan R, Harrison J, Bright J, Hooley R, Neill S (2006) Doing the unexpected: proteins involved in hydrogen peroxide perception. J Exp Bot 57: 1711-1718

Harborne JB, Williams CA (2000) Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry 55: 481-504

Havaux M, Bonfils JP, Lutz C, Niyogi KK (2000) Photodamage of the photosynthetic apparatus and its dependence on the leaf developmental stage in the npq1 Arabidopsis mutant deficient in the xanthophyll cycle enzyme violaxanthin de-epoxidase. Plant Physiol 124: 273-284

Havaux M, Dall'osto L, Bassi R (2007) Zeaxanthin has enhanced antioxidant capacity with respect to all other xanthophylls in Arabidopsis leaves and functions independent of binding to PSII antennae. Plant Physiol 145: 1506-1520

Hayek A (1910) Die systematische Stellung von Lesquerella velebitica Degen. Oesterr Bot Z 60: 89-93

He JM, Lee SK (2004) Photosynthetic utilization of radiant energy by temperate lettucegrown under natural tropical conditionwith manipulation of root-zone temperature. Photosynthetica 42(3): 457-463

He JM, She XP, Meng ZN, Zhao WM (2004) Reduction of Rubisco amount by UV-B radiation is related to increased H2O2 content in leaves of mung bean seedlings. J Plant Physiol Mol Biol 30 (3): 291-296

Heath RL, Packer L (1968) Photoperoxidation in isolated chloroplasts. I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Arch Biochem Biophys 125: 189-198

Helsper JPFG, Ric de Vos CH, Mass FM, Jonker HH, van der Broeck HC, Jordi W, Pot CS, Kleizer LCP, Schapendonk AHCM (2003) Response of selected antioxidants and pigments in tissues of Rosa hybrida and Fuchsia hybrida to supplemental UV-A exposure. Physiol Plantarum 117: 171-178

Hertwig B, Steb P, Feierabend J (1992) Light dependence of catalase synthesis and degradation in leaves and the influence of interferring stress conditions. Plant Physiol 100: 1547-1553

Hiner ANP, Rodriguez-Lopez JN, Arnao MB, Raven EL, Garcia-Canovas F, Acosta M (2000) Kinetic study of the inactivation of ascorbate peroxidase by hydrogen peroxide. Biochem J 348: 321-328

Hockberger PE (2002) A history of ultraviolet photobiology for humans, animals and microorganisms. Photochem Photobiol 76 (6): 561-579

Hollósy F (2002) Effects of ultraviolet radiation on plant cells. Micron 33: 179-197

Holmes MG, Keiller DR (2002) Effects of pubescence and waxes on the reflectance of leaves in the ultraviolet and photosynthetic wavebands: a comparison of a range of species. Plant Cell Environ 25: 85-9

Holm-Hansen O, Helbling EW, Lubin S (1993) Ultraviolet radiation in Antarctica: inhibition of Primary production. Photochem Photobiol 58: 567-570

Horvat I (1930) Vegetacijske studije o hrvatskim planinama. Zadruge na planinskim goletima. Rad JAZU 238: 1-96

Horvat I (1931) Vegetacijske studije o hrvatskim planinama II. Zadruge na planinskim stijenama i točilima. Rad JAZU 241: 147-206

Huner NPA, Öquist G, Sarhan F (1998) Energy balance and acclimation to light and cold. Trends Plant Sci 3: 224-230

Hutzler P, Fischbach R, Heller W, Jungblut T, Reuber S, Schmitz R, Veit M, Weissenböck G, Schnitzler J (1998) Tissue localization of phenolic compounds in plants by confocal laser scanning microscopy. J Exp Bot 49: 953-965

ISO-DIS-21348: Process for Determining Solar Irradiances

Jahns P, Holzwarth AR (2011) The Role of the xanthophyll cycle and of lutein in photoprotection of hotosystem II. Biochim Biophys Acta [E-pub ahead of print, PMID: 21565154]

http://www.bioone.org/doi/abs/10.1562/0031-8655%282002%29076%3C0561%3AAHOUPF%3E2.0.CO%3B2


132

Jansen MAK, Gaba V, Greenberg BM (1998) Higher plants and UV-B radiation: balancing damage, repair and acclimation. Trends Plant Sci 3: 131-135

Jiang N, Taylor JS (1993) In vivo evidence that UV-B induced C→T mutations at dipyrimidine sites could result from the replicative bypass of cys-syn cyclobutane dimers or their deamination products. Biochemistry 32: 472-481

Jonson JE, Simpson D, Fagerli H, Solberg S (2005) Can we explain the trends in European ozone levels? Atmos Chem Phys Discuss 5: 5957-5985

Jordan BR, Chow WS, Strid A, Anderson JM (1991) Reduction in cab and psbA RNA transcripts in response to supplementary ultraviolet-B radiation. FEBS Lett 284: 5-8

Jordan BR, He J, Chow WS, Anderson JM (1992) Changes in mRNA levels and polypeptide subunits of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase in response to supplementary ultraviolet-B radiation. Plant Cell Environ 15: 91-98

Jordan BR, James PE, Strid Å, Anthony RG (1994) The effect of ultraviolet-B radiation on gene expression and pigment composition in etiolated and green pea leaf tissue: UV-B induced changes are gene-specific and dependant upon the development stage. Plant Cell Environ 17: 45-54

Jovanovid Z, Miloševid J, Radovid S (2006) Antioxidative enzymes in the response of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) to ultraviolet B radiation. J Agric Food Chem 54: 9472-9478

Juozaitytė R, Ramaškevičienė A, Sliesaravičius A, Brazaityte A, Duchovskis P, Burbulis N (2007) Growth and physiological features of pea (Pisum sativum L.) of different morphotypes under ozone exposure. Biologija 53(3): 71-74

Kalbina I, Strid Å (2006) Supplementary ultraviolet-B irradiation reveals differences in stress responses between Arabidopsis thaliana ecotypes. Plant Cell Environ 29: 754-763

Karabourniotis G, Kofidis G, Fasseas C, Liakoura V, Drossopoulos M (1998) Polyphenol deposition in leaf hairs of Olea europaea (Oleaceae) and Quercux ilex (Fagaceae). Am J Bot 85: 1007-1012

Karpinski S, Escobar C, Karpinska B, Creissen G, Mullineaux PM (1997) Photosynthetic electron transport regulates the expression of cytosolic ascorbate peroxidase genes in Arabidopsis during excess light stress. Plant Cell 9: 627-640

Keiller DR, Mackerness SA-H, Holmes MG (2003) The action of a range of supplementary ultraviolet (UV) wavelengths on photosynthesis in Brassica napus L. in the natural environment: effects on PSII, CO2 assimilation and level of chloroplast proteins. Photosyn Res 75: 139-150

Keller E, Steffen KL (1995) Increased chilling tolerance and altered carbon metabolism in tomato leaves following application of mechanical stress. Physiol Plantarum 93: 519-525

Kenrick P, Crane PR (1997) The origin and early evolution of plants on land. Science 389: 33-39

Khoroshilova EV, Repeyev YA, Nikogosyan DN (1990) UV photolysis of aromatic amino acids and related dipeptides and tripeptides. J Photochem Photobiol 7: 159-172

Kitamura S (2006) Transport of flavonoids: from cytosolic synthesis to vacuolar accumulation. U: Grotewold E (ed.) Science of flavonoids. Springer, New York, 123-146

Kong CS, Kim JA, Qian ZJ, Kim YA, Lee JI, Kim SK, Nam TJ, Seo Y (2009) Protective effect of isorhamnetin 3-О-β-d-glucopyranoside from Salicornia herbacea against oxidation-induced cell damage. Food Chem Toxicol 47(8): 1914-1920

Kotilainen T, Tegelberg R, Julkunen-Tiitto R, Lindfors A, Aphalo PJ (2008) Metabolite specific effects of solar UV-A and UV-B on alder and birch leaf phenolics. Global Change Biol 14: 1-11

Kramer GF, Norman HA, Krizek DT, Mirecki RM (1991) Influence of UV-B radiation on polyamines, lipid peroxidation and membrane lipids in cucumber. Phytochem 30: 2101-2108.


133

Krause GH, Grube E, Koroleva OY, Barth C, Winter K (2004) Do mature shade leaves of tropical tree seedlings acclimate to high sunlight and UV radiation? Funct Plant Biol 31: 743-756

Krause GH, Jahns P, Virgo A, García M, Aranda J, Wellmann E and Winter K (2007) Photoprotection, photosynthesis and growth of tropical tree seedlings under near-ambient and strongly reduced solar ultraviolet-B radiation. J Plant Physiol 164: 1311-1322

Krause GH, Schmude C, Garden H, Koroleva OY, Winter K (1999) Effects of solar ultraviolet radiation on the potential efficiency of photosystem II in leaves of tropical plants. Plant Physiol 121: 1349-1358

Krieger-Liszkay A, Fufezan C, Trebst A (2008) Singlet oxygen production in photosystem II and related protection mechanism. Photosynth Res 98: 551-564

Kuk YI,Lee JH, Kim HY, Chung SJ, Chung GC, Guh JO, Lee HJ, Burgos NR (2003) Relationships of Cold Acclimation and Antioxidative Enzymes with Chilling Tolerance in Cucumber (Cucumis sativus L.). J Amer Soc Hort Sci 128: 661-666

Kühlbrandt W (1994) Structure and function of the plant light-harvesting complex, LHC-II. Curr Opin Struct Biol 4: 519-528

Kulandaivelu G, Noorudeen AM (1983) Comparative study of the action of ultraviolet-C and utraviolet-B radiation on photosynthetic electron transport. Physiol Plant 58: 389-394

Kušan F (1963) Über die Lebensverhaeltnisse der endemischen arz Degenia velebitica (Deg.) Hay. auf dem Velebit in Kroatien. Infor Hort Bot Pharm Univ 2: 21-26

Kutle A (1999) Pregled stanja biološke i krajobrazne raznolikosti Hrvatske sa strategijom i akcijskim planovima zaštite. Državna uprava za zaštitu prirode i okoliša, Zagreb

Kyoto Protocol to the United nations framework convention on climate change (1997) Retreived 25 September 2011. http://unfccc.int/resource/docs/convkp/kpeng.html

Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685

Landry LG, Chapple CC, Last RL (1995) Arabidopsis mutants lacking phenolic sunscreens exhibit enhanced ultraviolet-B injury and oxidative damage. Plant Physiol 109: 1159 -1166

Láposi R, Veres S, Lakatos G, Olah V, Fieldsend A, Meszaros I (2009) Responses of leaf traits of European beech (Fagus sylvatica L.) saplings to supplemental UV-B radiation and UV-B exclusion. Agr Forest Meteorl 149 (5): 745-755

Larkum AWD, Karge M, Reifarth F, Eckert H-J, Post A, Renger G (2001) Effect of monochromatic UV-B radiation on electron transfer reactions of photosystem II. Photosynth Res 68: 49-60

Levine RL, Garland D, Oliver CN, Amici A, Climent I, Lenz AG, Ahn BW, Shaltiel S, Stadtman ER (1990) Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Methods Enzymol 186: 464-478

Liakopoulos G, Stavrianakou S, Karabourniotis G (2006) Trichome layers versus dehaired lamina of Olea europaea leaves: differences in flavonoid distribution, UV-absorbing capacity, and wax yield. Environ Exp Bot 55: 294-304

Liakoura V, Stefanou M, Manetas Y, Cholevas C, Karabourniotis G (1997) Trichome density and its UV-B protective potential are affected by shading and leaf position on the canopy. Environ Exp Bot 38(3): 223-229

Liu LX, Xu SM, Woo KC (2005) Solar UV-B radiation on growth, photosynthesis and xanthophylls cycle in tropical acacias and eucalyptus. Environ Exp Bot 54 (2): 121-130

Liu P, Yang Y, Xu G, Hao C (2006) Physiological response of rare and endangered Seven-Son-Flower to light stress under habitat fragmentation. Environ Exp Bot 57: 32- 40

Liu Z, Yan H, Wang K, Kuang T, Zhang J, Gui L, An X, Chang W (2004) Crystal structure of spinach major light-harvesting complex at 2.72 Å resolution. Nature 428: 287-292


134

Lokstein H, Tian L, Polle JEW, DellaPenna D (2002) Xanthophyll biosynthetic mutants of Arabidopsis thaliana: altered nonphotochemical quenching of chlorophyll fluorescence is due to changes in photosystem II antenna size and stability. Biochim Biophys Acta 1553: 309-319

Lowry B, Lee D, Hebaut C (1980) The origin od land plants: a new look at an old problem. Taxon 29: 189-197

Luo L, Lin S, Zheng H, Lei Y, Zhang Q, Zang Z (2007) The role of antioxidant system in freezing acclimation-induced freezing resistance of Populus suaveolens cuttings. Forestry Stud Chi 9: 107-113

Macherness SAH, Jordan BR, Thomas B (1999) Reactive oxygen species in the regulation of photosynthetic genes by ultraviolet-B radiation (UV-B: 280-320) in green and etiolated buds of pea (Pisum sativum L.). Photochem Photobiol 48: 180-188

Mäder JA, Staehelin J, Peter T, Brunner D, Rieder HE, Stahel WA (2010) Evidence for the effectiveness of the Montreal Protocol to protect the ozone layer. Atmos Chem Phys Discuss 10: 19005-19029

Mahdavian K, Ghorbanli M, Kalantari KM (2008) The effects of ultraviolet radiation on some antioxidant compounds and enzymes in Capsicum annuum L. Turk J Bot 32: 129-134

Mandronich S (1992) Implications of Recent Atmospheric Ozone Measurements for Biologically Active Ultraviolet Radiation Reaching the Earth's Surface. Geophys Res Lett 19: 37-40

Manetas Y (2003) The importance of being hairy: the adverse effects of hair removal on stem photosynthesis of Verbascum speciosum are due to solar UV-B radiation. New Phytol 158: 503-508

Mano J (2002) Early events in environmental stresses in plants - Induction mechanisms of oxidative stress. U: Van Montagu M, Inzé D (ur.) Oxidative stress in plants. Taylor & Francis, London, 217-245

Markham KR, Ryan KG, Bloor SJ, Mitchell KA (1998) An increase in luteolin: apigenin ratio in Marchantia polymorpha on UV-B enhancement. Phytochemistry 48: 791-794

Marwood CA, Greenberg BM (1996) Effect of supplementary UV-B radiation on chlorophyll synthesis and accumulation of photosystems during chloroplast development in Spirodela oligorrhiza. Photochem Photobiol 64: 664-670

Mate A (2009) Genetička raznolikost velebitske degenije. Doktorska disertacija. Zagreb: Prirodoslovno-matematički fakultet

Matijevid M, Mihelj D, Plazibat M, Randid M (1999) A new locality of the species Degenia velebitica (Degen) Hayek (Brassicaceae) in Croatia. Nat Croat 8 (2): 147-154

Mazza CA, Battissta D, Zima AM, Szwarcberg-Bracchitta M, Giordano CV, Acevedo A, Scopel AL, Ballaré CL (1999) The effects of solar ultraviolet-B radiation on the growth and yield of barley are accompanied by increased DNA damage and antioxidant responses. Plant Cell Environ 22: 61 -70

Melis A, Nemson JA, Harrison MA (1992) Damage to functional components and partial degradation of photosystem II reaction center proteins upon chloroplast exposure to ultraviolet-B radiation. Biochim Biophys Acta 1100: 312-320

Michel H, Deisenhofer J (1988) Relevance of the photosynthetic reaction center from purple bacteria to the structure of photosystem II. Biochemistry 27: 1-7

Mishler BD, Lewis LA, Buchheim MA, Renzaglia KS, Garbary DJ, Charles CF, Zechman FW, Kantz TS, Chapman RL (1994) Phylogenetic Relationships of the „Green Algae” and „Bryophytes”. Ann Mo Bot Gard 81 (3): 451-483

Mittler R, Vanderauwera S, Gollery M, Van Breusegem F (2004) Reactive oxygen gene network of plants. Trends Plant Sci 9: 490-498

Mittler R, Zilinskas BA (1993) Detection of ascorbate peroxidase activity in native gels by inhibition of the ascorbate dependent reduction of nitroblue tetrazolium. Anal Biochem 212: 540-546

Mlynárová L, Nap JP, Bisseling T (2007) The SWI/SNF chromatin-remodeling gene AtCHR12 mediates temporary growth arrest in Arabidopsis thaliana upon perceiving environmental stress. Plant J 51: 874-885


135

Montillet JL, Chamnongpol S, Rustérucci C, Dat J, van de Cotte B, Agnel JP, Battesti C, Inzé D, Van Breusegem F, Triantaphylides C (2005) Fatty acid hydroperoxides and H2O2 in the execution of hypersensitive cell death in tobacco leaves. Plant Physiol 138: 1516-1526

Møller IM (2001) Plant mitochondria and oxidative stress: electron transport, NADPH turnover and metabolism of reactive oxygen species. Annu Rev Plant Physiol Mol Biol 52: 561-591

Møller IM, Jensen PE, Hansson A (2007) Oxidative modifications to cellular components in plants. Annu Rev Plant Biol 58: 459-481

Montreal Protocol on Substances that Deplete the Ozone Layer (1987) Retreived 30 September 2011. http://ozone.unep.org/new_site/en/Treaties/treaty_text.php?treatyID=2

Mukherjee SP, Choudhouri MA (1983) Implications of water stress-induced changes in the levels of endogenous ascorbic acid and hydrogen peroxide in Vigna seedlings. Physiol Plant 58: 166-170

Murchie EH, Horton P (1998) Contrasting patterns of photosynthetic acclimation to the light environment are dependent on the differential expression of the responses to altered irradiance and spectral quality. Plant Cell Environ 21: 139-148

Murphy TM, Wilson C (1982) The UV-stimulated K+ efflux from rose cells. Plant Physiol 70: 709-713

Nakano Y, Asada K (1981) Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol 22: 867-880

Nara A, Takeuchi Y (2002) Ethylene evolution from tobacco leaves irradiated with UV-B. J Plant Res 115: 247-253

Naumovski D (2005) Germination ecology of seeds of endemic species Degenia velebitica (Degen) Hayek (Brassicaceae). Acta Bot Croat 64: 323-330

Neilson KA, Gammulla CG, Mirzaei M, Imin N, Haynes PA (2010) Proteomic analysis of temperature stress in plants. Proteomics 10: 828-845

Nguyen MTT, Awale S, Tezuka Y, Ueda JY, Tran QL, Kadota S (2006) Xanthine oxidase inhibitors from the flowers of Chrysanthemum sinense. Planta Med 72: 46-51

Niinemets Ü, Kull O, Tenhunen JD (2004) Within canopy variation in the rate of development of photosynthetic capacity is proportional to integrated quantum flux density in temperate deciduous trees. Plant Cell Environ 27: 293-313

Nikolid T (2009) Flora Hrvatske, Endemizam *skripta+. http://hirc.botanic.hr

Nishiyama Y, Allakhverdiev SI, Murata N (2011) Protein synthesis is the primary target of reactive oxygen species in the photoinhibition of photosystem II. Physiol Plant 142(1): 35-46

Nitz GM, Grubmüller E, Schnitzler WH (2004) Differential flavonoid response to par and UV-B light in chive (Allium schoenoprasum L.) Acta Hort 659: 825-830

Nogués S, Allen DJ, Morrison JIL, Baker NR, (1995) Ultraviolet-B radiation effects on water relations, leaf development and photosynthesis in droughted pea plants. Plant Physiol 117: 173-181

Olsson LC, Fraysse L, Bornman JF (1999) Influence of high light and UV-B radiation on photosynthesis and D1 turnover in atrazinetolerant and sensitive cultivars of Brassica napus. J Exp Bot 51 (343): 265-274

Onyilagha J, Bala A, Hallett R, Gruber M, Soroka S, Westcott N (2003) Leaf flavonoids of the cruciferous species, Camelina sativa, Crambe spp., Thlaspi arvense and several other genera of the family Brassicaceae. Biochem Syst Ecol 31: 1309-1322

Orshan G (ur.) (1989) Plant pheno-morphological studies in Mediterranean type ecosystems. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht

Ottander C, Campbell D, Öquist G (1995) Seasonal changes in photosystem II organisation and pigment composition of Pinus sylvestris. Planta 197: 176-183


136

Pang Q, Hays JB (1991) UV-B-inducible and temperature sensitive photoreactivation of cyclobutane pyrimidine dimers in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol 95: 536-543

Passardi F, Cosio C, Penel C, Dunand C (2005) Peroxidases have more functions than a Swiss army knife. Plant Cell Rep 24: 255-265

Pastori GM, Foyer CH (2002) Common components, networks and pathways of cross-tolerance to stress. The central role of ‘redox’ and abscisic-acid-mediated controls. Plant Physiol 129: 460-468

Paul ND, Gwynn-Jones D (2003) Ecological roles of solar UV radiation: towards an integrated approach. Trends Ecol Evol 18: 48-55

Perl-Treves R, Perl A (2002) Oxidative stress: an introduction. U: Van Montagu M, Inzé D. Oxidative stress in plants (ur.) Taylor & Francis, London, 1-32

Peterman EJG, Gradinaru CC, Calkoen F, Borst JC, van Grondelle R, van Amerongen H (1997) Xanthophylls in light-harvesting complex II of higher plants: Light harvesting and triplet quenching. Biochemistry 36: 12208-12215

Pevalek-Kozlina B, Pavlica M, Vujevid M (1999) Micropropagation of Degenia velebitica (Deg.) Hay., a Croatian endemic plant species. Phyton 39: 293-296

Pfeifhofer HW (1989) On the pigment content of Norway spruce needles infected with Chrysomyxa rhodendendri, and the carotenoids of the fungus Aeciospores. Eur J Forest Pathol 19: 363-369

Pfündel EE, Pan RS, Dilley RA (1992) Inhibition of violaxanthin deepoxidation by ultraviolet-B radiation in isolated chloroplasts and intact leaves. Plant Physiol 98: 1372-1380

de Pinto MC, Paradiso A, Leonetti P, De Gara L (2006) Hydrogen peroxide, nitric oxide and cytosolic ascorbate peroxidase at the crossroad between defence and cell death. Plant J 48: 784-795

Piri E, Babaeian M, Tavassoli A, Esmaeilian Y (2011) Effects of UV irradiation on plants. Afr J Microbiol Res 5: 1710-1716

Pogson BJ, Niyogi KK, Björkman O, DellaPenna D (1998) Altered xanthophyll compositions adversely affect chlorophyll accumulation and nonphotochemical quenching in Arabidopsis mutants. Proc Natl Acad Sci USA 95: 13324-13329

Pourcel L, Routabol J-M, Cheynier V, Lepiniec L, Debaujon I (2006) Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions. Trends Plant Sci. 12: 29-36

Prasad SM, Dwivedi R, Zeeshan M (2005) Growth, photosynthetic electron transport, and antioxidant responses of young soybean seedlings to simultaneous exposure of nickel and UV-B stress. Photosynthetica 43: 177-185

Prasad TK, Anderson MD, Martin BA, Stewart CR (1994) Evidence for chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and a regulatory role for hydrogen peroxide. Plant Cell 6: 65-74

Prinsze C, Dubbelman TM, Van Steveninck J (1990) Protein damage, induced by small amounts of photodynamically generated singlet oxygen or hydroxyl radicals. Biochim Biophys Acta 1038: 152-157

Quan LJ, Zhang B, Shi WW, Li HY (2008) Hydrogen peroxide in plants: a versatile molecule of the reactive oxygen species network. J Integrat Plant Biol 50: 2-18

Rao MV, Palijyath G, Ormrod DP (1996) Ultraviolet-B- and ozone-induced biochemical changes in antioxidant enzymes of Arabidopsis thaliana. Plant Physiol 110: 125-136

Ren J, Yao Y, Yang Y, Korpelainen H, Junttila O, Li C (2006) Growth and physiological responses to supplemental UV-B radiation of two contrasting poplar species. Tree Physiol 26: 665- 672

Renger G, Graber P, Dohnt G, Hagemann R, Weiss W, Voss R (1982) The effect of UV irradiation on primary processes of photosynthesis. U: Bauer H, Caldwell MM, Tevini M, Worrest RC (ur.) Biological Effects of UV-B Radiation. Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung mbH, München, 110-116


137

Rešetnik I (2011) Molekularna filogenija tribusa Alyseae (Brassicaceae). Doktorska disertacija. Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb

Rex M, Salawitch RJ, von der Gathen P, Harri, NRP, Chipperfield MP, Naujokat B (2004) Arctic ozone loss and climate change. Geophys Res Lett 31 http://dx.doi.org/10.1029/2003GL018844

Rhee K (2001) Photosystem II: the solid structural era. Annu Rev Biophys Biomol Struct 30: 307-328

Riđanovid J (1993) Hidrogeografija. II. izmijenjeno i dopunjeno izdanje. Školska knjiga, Zagreb, 215 str.

Robberecht R, Caldwell MM, Billings WD (1980) Leaf ultraviolet optical properties along a latitudinal gradient in the arctic-alpine life zone. Ecology 61: 612-619

Ros J, Tevini M (1995) Interaction of UV-B radiation and IAA during growth of seedling and hypocotyl segments of sunflower. J Plant Physiol 146: 295-302

Rozema J, Boelen P, Blokker P (2005) Depletion of stratospheric ozone over the Antarctic and Arctic: responses of plants of polar terrestrial ecosystems to enhanced UV-B, an overview. Environ Poll 137: 428-442

Rozema J, Staaij J, Björn LO, Caldwell M (1997) UV-B as an environmental factor in plant life: stress and regulation. Tree 12 (1): 22-28

Rozema J, van Geel B, Björn LO, Lean J, Madronich S (2002) Paleoclimate: Toward solving the UV puzzle. Science 296: 1621-1622

Ruban AV (2009) Plants in light. Commun Integr Biol 2 (1): 50-55

Ruban AV, Berera R, Ilioaia C, van Stokkum IH, Kennis JT, Pascal AA, van Amerongen H, Robert B, Horton P, van Grondelle R (2007) Identification of a mechanism of photoprotective energy dissipation in higher plants. Nature 450: 575-578

Ryan KG, Markham KR, Bloor SJ, Bradley JM, Mitchell KA, Jordan BR (1998) UV-B radiation induces increase in quercetin: kaempferol ratio in wild-type and transgenic lines of Petunia. Photochem Photobiol 68: 323-330

Rybus-Zając M, Kubiś J (2010) Effect of UV-B radiation on antyoxidative enzymes activity in cucumber cotyledons. Acta Biol Cracov Bot 52 (2): 97-102

Sabehat A, Weiss D, Lurie S (1998) Heat shock proteins and cross-tolerance in plants. Physiol Plant 103(3): 437-441

Sadanandom A, Poghosyan Z, Fairbairn DJ, Murphy DJ (2000) Differential regulation of plastidial and cytosolic isoforms of peptides methionine sulfoxide reductase in Arabidopsis. Plant Physiol 123: 1299-1309

Saito A, Iino T, Sonoike K, Miwa E, Higuchi K (2010) Remodeling of the Major Light-Harvesting Antenna Protein of PSII Protects the Young Leaves of Barley (Hordeum vulgare L.) from Photoinhibition under Prolonged Iron Deficiency. Plant Cell Physiol 51(12): 2013-2030

Sasaki K, Takahashi T (2002) A flavonoid from Brassica rapa flower as the UV-absorbing nectar guide. Phytochemistry 61 (3): 339-343

Scandalios JG, Guan L, Polidoros AN (1997) Catalases in plants: gene structure, properties, regulation and expression. U: Scandalios JG (ed.) Oxidative stress and the molecular biology of antioxidants defenses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 343-406

Schmelzer E, Jahnen W, Hahlbrock K (1988) In situ localization of light-induced chalcone synthase mRNA, chalcone synthase and flavonoid endproducts in epidermal cells of parsley leaves. P Natl Acad Sci USA 85: 2989-2993

Schnitzler JP, Jungblut TP, Heller W, Kofferlein M, Hutzler P, Heinzmann U, Schmelzer E, Ernst D, Langebartels C, Sandermann HJr (1996) Tissue localisation of UV-B-screening pigments and of chalcone synthase mRNA in needles of Scots pine seedlings. New Phytol 32: 247-258


138

Schöner S, Krause GH (1990) Protective systems against active oxygen species in spinach: response to cold acclimation in excess light. Planta 180: 383-389

Schreiber U, Bilger W, Neubauer C (1994) Chlorophyll fluorescence as a nonintrusive indicator for rapid assessment of in vivo photosynthesis. Ecol Stud 100: 49-70

Searles PS, Flint SD, Caldwell MM (2001) A meta-analysis of plant field studies simulating stratospheric ozone depletion. Oecologia 127: 1-10

Sheahan JJ, Cheong H (1998) The colorless flavonoids of Arabidopsis thaliana (Brassicaceae): II. Flavonoid 3′ hydroxylation and lipid peroxidation. Am J Bot 85: 476-480

Sheahan JJ, Cheong H, Rechnitz GA (1998) The colorless flavonoids of Arabidopsis thaliana (Brassicaceae). I. A model system to study the orthodihydroxy structure. Am J Bot 85: 467-475

Shi S, Wang G, Wang Y, Zhang L, Zhang L (2005) Protective effect of nitric oxide against oxidative stress under ultraviolet-B radiation. Nitric Oxide 13: 1-9

Shigeoka S, Ishikawa T, Tamoi M, Miyagawa Y, Takeda T, Yabuta Y, and Yoshimura K (2002) Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes. J Exp Bot 53: 1305-1319

Shindell DT, Rind D, Lonergan P (1998) Increased polar stratospheric ozone losses and delayed recovery owing to increasing greenhouse-gas concentrations. Nature 392: 589- 592

Sies H (1997) Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Exp Physiol 82: 291-295

Sies H, Cadenas E (1985) Oxidative stress: damage to intact cells and organs. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 311: 617-631

Singh A, Sarkar A, Singh S, Agrawal SB (2010) Investigation of supplemental ultraviolet-B induced changes in anti-oxidative defense system and leaf proteome level in radish (Raphanus sativus L. cv. Truthful) plant: an insight to plant defense response under higher oxidative stress. Protoplasma 245: 75-83

Skaltsa H, Verykokidou E, Harvala C, Karabourniotis G, Manetas Y (1994) UV-B protective potential and flavonoid content of leaf hairs of Quercus ilex. Phytochemistry 37: 987-990

Smirnoff N (1995) Antioxidant systems and plant response to the environment. U: Smirnoff N. (ed.) Environment and plant metabolism: Flexibility and acclimation. Bios Scientific Publishers, Oxford, 217-243

Smith JL, Burritt DJ, Bannister P (2000) Shoot dry weight, chlorophyll and UV-B-absorbing compounds as indicators of plant’s sensitivity to UV-B radiation. Ann Bot 86: 1057-1063

Smyk B, Pliszka B, Drabent R (2008) Interaction between cyanidin 3-O-glucoside and Cu(II) ions. Food Chem 107: 1616-1622

Solovchenko A, Merzlyak M (2008) Screening of visible and UV radiation as a photoprotective mechanism in plants. Rus J Plant Physiol 55 (6): 719 -737

Stadtman ER (1986) Oxidation of proteins by mixed-function oxidation systems: implication in protein turnover, aging and neutrophil function. Trends Biochem Sci 11: 11-12

Stamenkovid V (2009) Velebitska degenija. Vrtovi i parkovi 1: 12-21

Stamenkovid V (2010) Uzgoj velebitske degenije. Vrtovi i parkovi 2: 24-27

Stamenkovid V, Kovačid S, Juretid B, Mihelj D (2010) Program zaštite ex-situ hrvatskih endemičnih biljnih svojti u Botaničkom vrtu Biološkog odsjeka PMF-a (Zagreb). U: Jasprica N, Pandža M, Milovid M (ur.) Knjiga sažetaka, 180-181. Tredi hrvatski botanički kongres, Jezera (otok Murter), 24.-26. rujna 2010

Staxén L, Bergounioux C, Bornman JF (1993) Effect of ultraviolet radiation on cell division and microtubule organization in Petunia hybrida protoplasts. Protoplasma 173: 70-76

Stefanowska M, Kuras M, Kacperska A (2002) Low temperature-induced modifications in cell ultrastructure and localization of phenolics in winter oilseed rape (Brassica napus L. var. oleifera L.) leaves. Ann Bot 90: 637-645


139

Stevanovid B, Vujnovid K (1990) Morpho-anatomical adaptations of the endemic species Degenia velebitica (Degen) Hayek. Feddes Repert 101: 385-389

Strgar V (1979) Trying to censerve the rare and endangered Degenia. Survival or Extinction. Royal Botanical gardens Kew, Whitstabe Litho Printers Ltd., London

Strid Å, Chow WS, Anderson JM (1990) Effects of supplementary ultraviolet-B radiation on photosynthesis in Pisum sativum. Biochim Biophys Acta 1020: 260-268

Sylvester, AW, Cande WZ and M. Freeling (1991) Developmental morphology of maize leaves using UV light-induced autofluorescence of cell wall compounds. Maize Genet Coop News Lett 65: 34-35

Šegulja N, Nikolid T, Palkovid M (2005) Degenia velebitica (Degen) Hayek. U: Nikolid T, Topid J (ur.) Crvena knjiga vaskularne flore Republike Hrvatske. Kategorije EX, RE, CR, EN i VU. Ministarstvo kulture, Državni zavod za zaštitu prirode, Zagreb, 310-311

Šilid Č (1984) Endemične biljke. Svjetlost, Sarajevo.

Takahashi R, Joshee N, Kitagawa Y (1994) Induction of chilling resistance by water stress, and cDNA sequence analysis and expression of water stress-regulated genes in rice. Plant Mol Biol 26(1): 339-352

Takeuchi A, Yamaguchi T, Hidema J, Strid A, Kumagai T (2002). Changes in synthesis and degradation of Rubisco and LHCII with leaf age in rice (Oryza sativa L.) growing under supplementary UV-B radiation. Plant Cell Environ 25: 695-706

Tanaka R, Tanaka A (2000) Chlorophyll b is not just an accessory pigment but a regulator of the photosynthetic antenna. Porphyrins 9: 240-245

Tandori J, Máté Z, Vass I, Maróti P (1996) The reaction centre of the purple bacterium Rhodopseudomonas sphaeroides R-26 is highly resistant against UV-B radiation. Photosynth Res 50: 171- 179

Tattini M, Gravano E, Pinelli P, Mulinacci N, Romani A (2000) Flavonoids accumulate in leaves and glandular trichomes of Phillyrea latifolia exposed to excess solar radiation. New Phytol 148: 69-77

Tattini M, Galardi C, Pinelli P, Massai R, Rumorini D, Agati G (2004) Differential accumulation of flavonoids and hydroxycinnamates in leaves of Ligustrum vulgare under excess light and drought stress. New Phytol 163: 547-561

Tattini M, Guidi L, Morassi-Bonzi L, Pinelli P, Remorini D, Degl'Innocenti E, Giordano C, Massai R, Agati G (2005) On the role of flavonoids in the integrated mechanisms of response of Ligustrum vulgare and Phillyrea latifolia to high solar radiation. New Phytol 167: 457-470

Tattini M, Matteini P, Saracini E, Traversi ML, Agati G (2007) Morphology and biochemistry of non-glandular trichomes in Cistus salvifolius L. leaves growing in extreme habitats of the Mediterranean basin. Plant Biol 9: 411-419

Telfer A (2002) What is β-carotene doing in the photosystem II reaction centre? Phil Trans R Soc B 357: 1431-1440

Teramura AH, Sullivan JH (1994) Effects of UV-B radiation on photosynthesis and growth of terrestrial plants. Photosynth Res 39: 463-473

Thiele A, Winter K, Krause GH (1997) Low inactivation of D1 protein of photosystem II in young canopy leaves of Anacardium excelsum under high-light stress. J Plant Physiol 151: 286-292

Thomashow MF (1999) Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50: 571-599

Trebst A (2003) Function of ß-Carotene and Tocopherol in Photosystem II. Z Naturforsch 58c: 609-620

Trebst A, Depka B (1990) Degradation of the D1 protein subunit of photosystem II in isolated thylakoids by UV light. Z Naturforsch 45c: 742-750


140

Trinajstid I (1985) Velebitska degenija - Degenia velebitica, dragulj hrvatske flore. Priroda, svibanj/lipanj: 292-293

Turcsányi E, Vass I (2000) Inhibition of photosynthetic electron transport by UV-A radiation targets the photosystem II complex. Photochem Photobiol 72: 513-520

Tuteja N, Singh MB, Misra MK, Bhalla PL, Tuteja R (2001) Molecular mechanisms of DNA damage and repair: progress in plants. Crit Rev Biochem Mol Biol 36: 337-397

Van Acker SABE, van den Berg D-J, Tromp MNJL, Griffioen DH, van Bennekom WP, van der Vijgh WJF, Bast A (1996) Structural Aspects of Antioxidant Activity of Flavonoids. Free Radic Biol Med 20: 331-342

Vass I, Szilard A, Sicora C (2005) Adverse effects of UV-B light on the structure and function of the photosynthetic apparatus. U: Pessarakli M (ur.) Handbook of photosynthesis, 2

nd ed. Marcel Dekker Inc,

New York, 827-843

Velikova V, Loreto F (2005) On the relationship between isoprene emission and thermotolerance in Phragmites australis leaves exposed to high temperatures and during the recovery from a heat stress. Plant Cell Environ 28: 318-327

Vranova E, Atichartpongkul S, Villarroel R, Montagu MV, Inze D, Camp WV (2002) Comprehensive analysis of gene expression in Nicotiana tabacum leaves acclimated to oxidative stress. P Natl Acad Sci USA 99: 870-875

Vu CV, Allen LH, Garrard LA (1984) Effects of UV-B radiation (280-320 nm) on ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase in pea and soybean. Environ Exp Bot 24: 131-143

Walter KS, Gillett HJ ur. (1998) IUCN Red List of Threatened Plants. IUCN, Gland

Walters RG (2005) Towards an understanding of photosynthetic acclimation. J Exp Bot 56: 435-447

Wang X, Peng Y, Singer JW, Fessehaie A, Krebs SL, Arora R (2009) Seasonal changes in photosynthesis, antioxidant systems and ELIP expression in a thermonastic and non-thermonastic Rhododendron species: A comparison of photoprotective strategies in overwintering plants. Plant Sci 177: 607-617

Weatherhead EC, Andersen SB (2006) The search for signs of recovery of the ozone layer. Nature 441: 39-45

Weissenböck G, Hedrich R, Sachs G (1986) Secondary phenolic products in isolated guard cell, epidermal cell and mesophyll cell protoplasts from pea (Pisum sativum L.) leaves: Distribution and determination. Protoplasma 134: 141-148

Willekens H, Camp WV, Montagu MV, Inze D, Langebartels C, Sandermann HJR (1994) Ozone, sulfur dioxide, and ultraviolet B have similar effects on mRNA accumulation of antioxidant genes in Nicotiana plumbaginifolia L. Plant Physiol 106: 1007-1014

Woodbury W, Spencer AK, Stahmann MA (1971) An improved procedure using ferricyanide for detecting catalase isoenzymes. Anal Biochem 44: 301-305

World Meteorological Organization (2003) Scientific assessment of ozone depletion. Global ozone research and monitoring project. Report 47: 498

Xenopoulos MA, Schindler DW (2001) Physical factors determining ultraviolet radiation flux into ecosystems. U: Cockell CS, Blaustein AR (ur.) Ecosystems, Evolution, and Ultraviolet Radiation. Springer, New York, 36-62

Xu C, Natarajan S, Sullivan JH (2008) Impact of solar ultraviolet-B radiation on the antioxidant defense system in soybean lines differing in flavonoid contents. Environ Exp Bot 63: 39-48

Yakushevska AE, Jensen PE, Keegstra W, van Roon H, Scheller HV, Boekema EJ, Dekker JP (2001) Supermolecular organization of photosystem II and its associated light-harvesting antenna in Arabidopsis thaliana. Eur J Biochem 268: 6020-6028

Yamasaki S, Shimada E, Kuwano T, Kawano T, Noguchi N (2010) Continuous UV-B Irradiation Induces Endoreduplication and Peroxidase Activity in Epidermal Cells Surrounding Trichomes on Cucumber Cotyledons. J Radiat Res 51: 187-196


141

Yang H, Zhao Z, Qiang W, An L, Xu S, Wang X (2004) Effects of enhanced UV-B radiation on the hormonal content of vegetative and reproductive tissues of two tomato cultivars and their relationships with reproductive characteristics. Plant Growth Regul 43: 251-258

Yang Y, Yao Y, Xu G, Li C (2005) Growth and physiological responses to drought and elevated ultraviolet-B in two contrasting populations of Hippophae rhamnoides. Physiol Plant 124: 431-440

Yao X, Liu Q (2007) Changes in photosynthesis and antioxidant defenses of Picea asperata seedlings to enhanced ultraviolet-B and to nitrogen supply. Physiol Plant 129: 364-374

Yoshimura K, Yabuta Y, Ishikawa T, Shigeoka S (2000) Expression of spinach ascorbate peroxidase isoenzymes in response to oxidative stresses. Plant Physiol 123: 223-234

Zahra P, Majid R, Amin B (2009) Seasonal changes of peroxidase, polyphenol oxidase enzyme activity and phenol content during and after rest in pistachio (Pistacia vera L.) flower buds. World Applied Sci J 6: 1193-1199

Zerefos CS, Tourpali K, Bojkov BR, Balis DS, Rognerud B, Isaksen ISA (1997) Solar activity-total column ozone relationships: observations and model results with heterogeneous chemistry. J Geophys Res 102: 1561-1569

Zhang J, Hu X, Henkow L, Jordan BR, Strid Å (1994) The effects of ultraviolet-B radiation on the CF0F1-ATPase. Biochim Biophys Acta 1185: 295-302

Zhou R, Zhao H (2004) Seasonal pattern of antioxidant enzyme system in the roots of perennial forage grasses grown in alpine habitat, related to freezing tolerance. Physiol Plant 121: 399-408

8. ŽIVOTOPIS

ŽIVOTOPIS

143

Vanja Stamenkovid Marulidev trg 8, Zagreb [email protected]

Kratki životopis

Zaposlenje:

2009. - danas viši stručni suradnik u znanosti i visokom obrazovanju (pri Botaničkom vrtu Biološkog odsjeka Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu)

2003. - 2009. stručni suradnik u Botaničkom vrtu Biološkog odsjeka Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu

Školovanje:

2008. odobren upis na III. godinu doktorskog studija, smjer ekologija 2004. poslijediplomski studij prirodnih znanosti, smjer ekologija 2002. diplomirao na temu „Razmnožavanje samoborske gromotulje, Allyssum

montanum L. subsp. pluscanescens (Raim. ex Baumgartner) Trpin u uvjetima in vitro” (voditeljica prof. dr. Branka Pevalek-Kozlina)

1997. - 2002. dodiplomski studij Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu (smjer diplomirani inžinjer biologije - ekologije)

1993. - 1997. Opda gimnazija Karlovac 1985. - 1993. osnovna škola (Zagreb, Karlovac)

1979. rođen u Kutini

Članstva: Hrvatsko botaničko društvo, Alpsko-dinarsko društvo za istraživanje vegetacije,

Društvo prijatelja cvijeda i zelenila. 2008 - 2010. - Tajnik Hrvatskog botaničkog društva Oženjen, kderi Ema i Dora

Popis radova (CROSBI, 2. siječnja 2012.) (objavljeno: 1 autorska knjiga, 1 urednička knjiga, 1 znanstveni članak SCI, 1 kongresno priopdenje u zborniku s međunarodnom recenzijom, 9 kongresnih priopdenja, 25 stručnih radova i članaka, 9 izložbi)

Autorske knjige Kovačid, Sanja; Nikolid, Toni; Ruščid, Mirko; Milovid, Milenko; Stamenkovid, Vanja; Mihelj, Darko; Jasprica, Nenad; Bogdanovid, Sandro; Topid, Jasenka. Flora jadranske obale i otoka - 250 najčešdih vrsta. Zagreb. Školska knjiga, Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta, 2008 (monografija).

Uredničke knjige

Knjižica sažetaka Simpozija s međunarodnim sudjelovanjem "Botanički vrtovi i arboretumi Hrvatske" / Kovačid, Sanja; Stamenkovid, Vanja (ur.). Zagreb : Hrvatsko botaničko društvo, Sekcija botaničkih vrtova i arboretuma, 2011 (zbornik).

http://bib.irb.hr/prikazi-rad?&rad=204276




144

Znanstveni radovi u časopisima koje citira CC/SCI/SCIE Stamenkovid, V., Prolid, M., Pevalek-Kozlina, B., 2003: Micropropagation of Alyssum montanum L. subsp. pluscanescens (Raim. ex Baumgartner) Trpin, a Croatian endemic plant species. Period biol, Vol 105, No 3: 199-358.

Kongresna priopdenja (sažeci) u ostalim časopisima Juretid, Biserka; Kovačid, Sanja; Mihelj, Darko; Stamenkovid, Vanja. Promotion of ex-situ conservation and education in Botanical garden of the Faculty of science in Zagreb. Fifth European Botanical Gardens Congress (EUROGARD5) "Botanical gardens in the age of climate change" : Book of abstracts ; u: Ulmus. Helsinki, 2009. 113-113 Sažeci u zbornicima skupova

1. Stamenkovid, V., Prolid, M., Pevalek-Kozlina, B., 2003: Micropropagation of Alyssum montanum L. subsp. pluscanescens (Raim. ex Baumgartner) Trpin, endangered stenoendemic species. Book of abstracts, 359, 3rd International Balkan Botanical Congress “Plant Resources in Creation of New Values”, Sarajevo, May 18-24 2003.

2. Stamenkovid, V., 2004: Botanical Garden of the Division of Biology, Faculty of Science at the Zagreb University, Croatia: 115th anniversary. Proceedings of the International Conference, suppl., International Conference ‘Living in Harmony: Botanical Gardens and Society’, Tver, September 19-22 2004

3. Stamenkovid, V., 2004: Ex situ conservation of rare and endemic plant species through micropropagation. Proceedings of the International Conference, suppl., International Conference ‘Living in Harmony: Botanical Gardens and Society’, Tver, September 19-22 2004.

4. Naumovski D., Stamenkovid, V., 2004: Ex situ conservation of some Croatian endemic plant species through micropropagation (Zaštita ex situ nekih hrvatskih stenoendemičnih biljnih vrsta putem mikropropagacije). Knjiga sažetaka,139. Prvi hrvatski botanički simpozij, Zagreb, 30. rujna - 3. listopada 2004.

5. Stamenkovid, V., Naumovski, D., 2005: Ex situ Conservation of Dianthus giganteus D'Urv subsp. croaticus (Borbas) Tutin through micropropagation. Knjižica sažetaka, 8-9. Trideseti simpozij Istočnoalpsko-dinarskog društva za proučavanje vegetacije. Zagreb, 4-6. srpnja 2005.

6. Stamenkovid, V., Tkalec, M., Jelenčid, B., Pevalek-Kozlina, B., 2007: Micropropagation and antioxidative enzyme activity of Campanula tommasiniana C. Koch. Book of abstracts, 5th International Conference “Propagation of Ornamental Plants”, Sofia, Bulgaria, 5-8 September 2007.

7. Kovačid, S., Juretid, B., Mihelj, D., Stamenkovid, V., 2010: Novi sredozemni kamenjar u Botaničkom vrtu PMF-a (Zagreb). Poster-sekcija. Knjiga sažetaka, 112-113. Tredi hrvatski botanički kongres, Jezera (otok Murter), 24.-26. rujna 2010.

8. Stamenkovid, V., Kovačid, S., Juretid, B., Mihelj, D., 2010: Program zaštite ex-situ hrvatskih endemičnih biljnih svojti u Botaničkom vrtu Biološkog odsjeka PMF-a (Zagreb). Poster-sekcija. Knjiga sažetaka, 180-181. Tredi hrvatski botanički kongres, Jezera (otok Murter), 24.-26. rujna 2010.

9. Mihelj, Darko; Kovačid, Sanja; Stamenkovid, Vanja; Juretid, Biserka. Botanički vrt PMF-a u Zagrebu - dio zaštidene "Zelene potkove". Knjižica sažetaka Simpozija s međunarodnim sudjelovanjem "Botanički vrtovi i arboretumi hrvatske" / Kovačid, Sanja ; Stamenkovid, Vanja (ur.). Zagreb : Hrvatsko botaničko društvo, 2011. 27-28



ŽIVOTOPIS

145

Stručni radovi i članci 1. Stamenkovid, V., 2003: Novi Mali vodič kroz Botanički vrt Prirodoslovno-matematičkog

fakulteta Sveučilišta u Zagrebu. Priroda 95(930): 33-35. 2. Stamenkovid, V., 2004: Arbutus unedo L. (Ericaceae) – Strawberry tree. Delect. sem. Hort. bot.

Univ. Zag. anni 2003: 61 3. Stamenkovid, V., 2004: Kamelije. Moj cvijet 1(1): 33-35 4. Stamenkovid, V., 2005: Volemija (Wollemia nobilis) u Botaničkom vrtu Sveučilišta u Beču.

Priroda 95(931): 48-49. 5. Stamenkovid, V., 2006: Kivi – biljka, ne ptica.Večernji list, 26. siječnja 2006. Podlistak

'Vodnjak': 30-31. 6. Brazda, M., Stamenkovid, V., 2006: Čaj. Meridijani101 (06) – prilog-knjižica. 7. Stamenkovid, V., 2004: Drvenasto bilje (poster). Izložba povodom 115. godišnjice utemeljenja

Botaničkog vrta PMF-a. Zagreb, kolovoz-rujan 2004. 8. Stamenkovid, V., 2007: Kako to čine Portugalci. Priroda 97(956): 35-38 9. Stamenkovid, V., 2007: Obnova izložbenog paviljona Botaničkog vrta

Prirodoslovno-matematičkog fakulteta, Sveučilišta Zagrebu. Priroda 97(956): 35-38 10. Juretid, B., Kovačid, S., Mihelj, D., Stamenkovid, V. (2007): Botanički vrt, CD - vodič na

hrvatskom, engleskom i njemačkom jeziku. Izdavač Botanički zavod s Botaničkim vrtom, Biološki odsjek, Prirodoslovno-matematički fakultet, Sveučilište u Zagrebu

11. Stamenkovid, V., 2007: Nove Web stranice Botaničkog vrta PMFa: design, izrada i održavanje: http://hirc.botanic.hr/vrt/hrv/naslovna%20strana.htm

12. Juretid, B., Kovačid, S., Mihelj, D., Stamenkovid, V., 2007: Radovi na obnovi Velebitskog botaničkog vrta od 2001. do 2007. Poster. Stručni skup i izložba povodom obilježavanja 40.-te obljetnice osnutka Velebitskog botaničkog vrta. Zagreb, 20. studenog 2007.

13. Stamenkovid, V., 2005-2007: Stručni, informativni, dvojezični opisi drvenastih biljaka iz zbirke Botaničkog vrta PMFa (info-stalci u arboretumu Vrta): 'Biljno carstvo i nazivlje biljaka', 'Cedrovi', 'Davidia involucrata var. vilmoriniana' , 'Fagus sylvatica', 'Ginkgo biloba', 'Hrastovi', 'Magnolije', 'Metasequoia glyptostroboides', 'Parrotia persica', 'Platane', 'Tisulje', 'Sequoia sempervirens', 'Sequoiadendron giganteum', 'Sekvoje', 'Taxsus baccata', 'Taxodium distichum', 'Osmanthus heterophyllus', 'Acca sellowiana', 'Pittosporum tobira cv. Variegata', 'Osteomeles schwerinae'.

14. Stamenkovid, V., 2008: Velebitska degenija – naša najpoznatija endemična biljka, web stranice Botaničkog vrta PMF-a

15. Stamenkovid, V., 2008: Program zaštite endemičnih biljnih vrsta, velebitska degenija. Deplijan povodom prodajne izložbe.

16. Kovačid, S., Nikolid, T., 2008: Flora jadranske obale i otoka - 250 najčešdih vrsta. Zagreb. IZRADA KAZALA. Školska knjiga, Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta, 2008.

17. Stamenkovid, V., 2009: Velebitska degenija. Vrtovi i parkovi 1: 12-21 18. Stamenkovid, V., 2009: Park prirode Blidinje – putopis botaničara po Čvrsnici. Vrtovi i parkovi

1: 64-68 19. Stamenkovid, V., 2009: Platane. Vrtovi i parkovi 1: 72-74 20. Stamenkovid, V., 2010: Uzgoj velebitske degenije. Vrtovi i parkovi 2: 24-27 21. Stamenkovid, V., 2010: Taxus baccata. Vrtovi i parkovi 2: 45-47 22. Stamenkovid, V., 2010: Park prirode Blidinje – putopis botaničara po Čabulji. Vrtovi i parkovi 2:

84-87 23. Stamenkovid, V., 2010: Mamutovac. Vrtovi i parkovi 3: 18-24 24. Kovačid, S., Stamenkovid, V., 2010: Dubrovačka zečina. Vrtovi i parkovi 3: 84-86 25. Kovačid, Sanja; Stamenkovid, Vanja. First national week of Croatian botanical gardens and

arboreta (May 30-June 4, 2011). Acta botanica Croatica. 70 (2011) , 2: 315-319

http://hirc.botanic.hr/vrt/hrv/naslovna%20strana.htm




146

Izložbe (autor i koautor) 1. Juretid, B., Kovačid, S., Stamenkovid, V., Mihelj, D., 2007. Povijest Botaničkog vrata PMF-a i

izložbenog paviljona. Izložba, 2007. 2. Stamenkovid, V., Mihelj, D., Kovačid, S., Juretid, B., 2008: Degenia velebitica. Izložba. Paviljon

Botaničkog vrta PMF-a, Zagreb, 12. travnja – 10. svibnja 2008. 3. Juretid, B., Kovačid, S., Stamenkovid, V., Mihelj, D., 2008. Otisci: prst, šapa, list... Izložba.

Paviljon Botaničkog vrta PMF-a, Zagreb, 14. svibnja – 1. srpnja 2008. 4. Kovačid, S., Mihelj, D., Naumovski, D., Stamenkovid, V., Juretid, B., 2008. Deus creavit, Linnaeus

disposuit ! - Život i djelo Carla Linneausa i njegovih učenika. Paviljon Botaničkog vrta PMF-a, Zagreb, 3. srpnja – 8. rujna 2008.

5. Juretid, B., Kovačid, S., Naumovski, D., Stamenkovid, V., 2009. Retrospektiva izložbi iz 2008. Paviljon Botaničkog vrta PMF-a, Zagreb, 5. travnja - 5. kolovoza 2009.

6. Juretid, B., Kovačid, S., Mihelj, D., Naumovski, D., Stamenkovid, V., 2009. 120 godina Botaničkog vrta PMF-a. Paviljon Botaničkog vrta PMF-a, Zagreb, 5. kolovoza - 1. studenog 2009.

7. Stamenkovid, V., Mihelj, D., Kovačid, S., Juretid, B., 2010: Botanički vrtovi i arboretumi Hrvatske – čuvari zbirki živih biljaka. Paviljon Botaničkog vrta PMF-a, Zagreb, 12. rujna - 15. listopada 2010.

8. Juretid, Biserka; Kovačid, Sanja; Mihelj, Darko; Sandev, Dubravka; Stamenkovid, Vanja. Tjedan botaničkih vrtova i arboretuma Hrvatske, 2011.

9. Sandev, Dubravka; Mihelj, Darko; Kovačid, Sanja; Stamenkovid, Vanja; Juretid, Biserka. "Čudesna šuma", 2011.

Studijski boravci i službena putovanja Stručno usavršavanje u Botaničkom vrtu i muzeju Berlin Dahlem (BGBM), 3. - 25. rujna 2004.

Vođenje diplomskih radova (suvoditelj) Hortikulturalno planiranje zelenih površina PMF-a na Horvatovcu / završni rad - preddiplomski studij. Zagreb : Prirodoslovno-matematički fakultet, 23.09. 2010., 38 str. Voditelj: Šoštarid, Renata Ostalo

Medijska priopdenja i gostovanja 2004-2007.: Dobro jutro Hrvatska, Briljanteen, Maja, Život uživo, Radio Sljeme, internet portal Index.hr, Pola ure kulture...

Predavanja u Društvu prijatelja cvijeda i zelenila, Zagreb, 2005-7.: Drvede i grmlje, Kamelije, Botanički vrt Berlin Dahlem, Park prirode Blidinje.

Suradnik za pitanja iz botanike na projektu Biološkog društva «E-škola biologije»

Vođenje radionice “Botaničke mikroskopske vježbe” za Županijsko stručno vijede učitelja prirode i biologije. OŠ “Sesvete”, 4. prosinca 2006.




Documents

FIZIOLOŠKI ODGOVORI VELEBITSKE DEGENIJE, Degenia ...botanickivrt.biol.pmf.hr/wp-content/uploads/2017/07/027_phd-Stamenkovic.pdf · 2009. godine izložene insolaciji na vanjskim pokusnim