UNIVERZITET U BEOGRADU

BIOLOŠKI FAKULTET

Doktorska disertacija

Fiziološke i biohemijske karakteristike

vegetativnog i reproduktivnog razvića in vitro

fotoperiodski zavisne biljke

Chenopodium rubrum L.

Mr Aleksandra Mitrović

Beograd, 2007.

U Beogradu, 09.03.207.

Komisija

Prof dr Zlatko Giba, Biološki fakultet

Dr Dušica Janošević, docent, Biološki fakultet

Dr Ksenija Radotić Hadži-Manić, docent, Centar za multidisciplinarne studije Univerzitet

u Beogradu

Prof dr Ljubinka Ćulafić, Biološki fakultet

3

Sadržaj

Skraćenice...................................................................................................................................... 6

Sažetak ............................................................................................................................................... 7

Abstact ................................................................................................................................................ 8

1. UVOD......................................................................................................................... 9

1.1. Biljka Chenopodium rubrum L. .................................................................................................... 9

1. 1. 1. Fotoperiodske karakteristike biljke Chenopodium rubrum L. ........................................... 10

1.2. Aktivnosti antioksidativnih sistema u toku vegetativnog i reproduktivnog razvića.................... 11

1.2.1. Aktivnosti antioksidativnih enzima...................................................................................... 11

1.2.2. Askorbat i glutation ............................................................................................................. 12

1.2.3. Ukupna antioksidativna aktivnost ....................................................................................... 13

1.3. Fotoperiodizam .......................................................................................................................... 13

1.3.1. Merenje vremena u fotoperiodskoj kontroli cvetanja.......................................................... 13

1.3.2. Fitohrom ............................................................................................................................. 15

1.4. Materinski efekti obezbeđuju fenotipsku adaptaciju na lokalne uslove spoljašnje sredine ...... 16

1.4.1. Materinski efekti na karakteristike i klijanje semena .......................................................... 18

1.5. NO signali kod biljaka ................................................................................................................ 19

1.5.1. Biologija NO – eksperimentalni pristupi.............................................................................. 20

1.5.2. Demonstracija i kvantifikacija NO....................................................................................... 20

1.5.3. Uloga NO u rastenju i razviću............................................................................................. 20

1.5.4. NO i hormoni ...................................................................................................................... 22

1.6. Giberelini.................................................................................................................................... 22

2. CILJ RADA .............................................................................................................. 24

3. M

3.3

3.4

ATERIJAL I METODE .......................................................................................... 25

3.1. Gajenje biljaka Chenopodium rubrum u cilju dobijanja semena............................................... 25

3.2. Isklijavanje semena.................................................................................................................... 26

. Gajenje biljaka in vitro................................................................................................................ 27

3.3.1. Hranljive podloge:............................................................................................................... 27

3.3.2. Različiti fotoperiodski režimi na kojima su gajene biljke C. rubrum in vitro....................... 28

3.3.3. Praćenje rastenja, cvetanja i sazrevanja semena.............................................................. 28

. Određivanje aktivnosti antioksidativnih enzima ......................................................................... 29

3.4.1. Ekstrakcije .......................................................................................................................... 29

3.4.2. Određivanje aktivnosti superoksid dismutaza (SOD)......................................................... 29

4

3.4.3. Određivanje aktivnosti peroksidaza (POD) ........................................................................ 29

3.4.4. Određivanje aktivnosti katalaze (CAT)............................................................................... 30

3.5. Određivanje koncentracije proteina ........................................................................................... 31

3.6. Razdvajanje proteina ................................................................................................................. 31

3.7. Glutation..................................................................................................................................... 32

3.8. Askorbat (AA) i dehidroaskorbat (DHA)..................................................................................... 32

3.9. ABTS – test................................................................................................................................ 33

3.10. Statistička obrada podataka .................................................................................................... 34

4. REZULTATI I DISKUSIJA ....................................................................................... 35

in vit

4.1

. 41

ra

7

re . 50

. 50

. 53

razvića C. rubrum in vitro.............................................................................................................. 55

ef

4.2.1

4.2 ......... 71

4.1. Aktivnosti antioksidativnih sistema u toku vegetativne i reproduktivne faze razvića C. rubrum

ro....................................................................................................................................................... 35

.1. Aktivnosti antioksidativnih sistema tokom klijanja semena C. rubrum .................................. 35

4.1.1.1. Klijanje semena C. rubrum .............................................................................................. 36

4.1.1.2. Aktivnosti CAT, POD i SOD tokom klijanja semena C. rubrum ...................................... 36

4.1.1.3. Koncentracije glutationa i askorbata tokom klijanja semena C. rubrum ........................ 39

4.1.1.4. Efekat giberelina na aktivnosti antioksidativnih sistema tokom klijanja C. rubrum .......

4.1.2. Efekat starosti semena Chenopodium rubrum na antioksidativni status semena, klijanje,

stenje i cvetanje ............................................................................................................................. 44

4.1.2.1. Efekat starosti semena na klijanje C. rubrum.................................................................. 44

4.1.2.2. Efekat starosti semena na rastenje i cvetanje C. rubrum................................................ 45

4.1.2.3. Efekat starosti semena C. rubrum na antioksidativni status semena ............................. 4

4.1.3. Ukupna antioksidativna aktivnost i aktivnosti antioksidativnih enzima u toku vegetativnog i

produktivnog razvića C. rubrum in vitro ........................................................................................

4.1.3.1. Efekat različitih fotoperiodskih uslova na rastenje, cvetanje i sazrevanje semena C.

rubrum in vitro..............................................................................................................................

4.1.3.2. Određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti u toku vegetativnog i reproduktivnog

razvića C. rubrum in vitro.............................................................................................................

4.1.3.3. Određivanje aktivnosti antioksidativnih enzima u toku vegetativnog i reproduktivnog

4.2. Efekat fotoperioda na vegetativno i reproduktivno razviće C. rubrum in vitro i materinski

ekat fotoperioda ................................................................................................................................... 62

. Efekat fotoperioda na vegetativno i reproduktivno razviće C.rubrum in vitro ............................ 62

4.2.1.1. Efekat različitih fotoperioda na rastenje C. rubrum in vitro.............................................. 63

4.2.1.2. Efekat različitih fotoperioda na cvetanje C. rubrum in vitro ............................................. 67

4.2.1.3. Efekat različitih fotoperioda na sazrevanje semena C. rubrum in vitro .......................... 68

.2. Materinski efekat fotoperioda.............................................................................................

5

4.2

do

4.2.2.1.4. Materinski efekat fotoperioda na cvetanje i sazrevanje semena C. rubrum in vitro.... 80

............... 85

4.3. E

reprodu

4.3

4.3

4.3

4.3.3.2. Efekat SNP i GA3 na cvetanje C. rubrum in vitro .......................................................... 109

. LITERATURA ........................................................................................................ 115

.2.1. Materinski efekat fotoperioda na broj i masu semena, klijanje, rastenje, cvetanje i

nošenje semena C. rubrum in vitro.............................................................................................. 71

4.2.2.1.1. Materinski efekat fotoperioda na broj i masu semena C. rubrum ................................ 71

4.2.2.1.2. Materinski efekat fotoperioda na klijanje semena C. rubrum ....................................... 74

4.2.2.1.3. Materinski efekat fotoperioda na rastenje C. rubrum in vitro ....................................... 76

4.2.2.2. Materinski efekat fotoperioda na proteine semena C. rubrum ............................

fekat natrijum nitroprusida (SNP) i kalijum cijanida (KCN) u toku vegetativnog i

ktivnog razvića C. rubrum in vitro............................................................................................ 92

.1. Efekat SNP i KCN na klijanje semena C. rubrum................................................................... 93

4.3.1.1. Efekat SNP na klijanje semena C. rubrum ...................................................................... 93

4.3.1.2. Efekat SNP i GA3 na klijanje semena C.rubrum.............................................................. 95

4.3.1.3. Efekat KCN na klijanje semena C. rubrum...................................................................... 96

4.3.1.4. Efekat cPTIO, KCN, i SNP na klijanje C.rubrum. ............................................................ 98

.2. Efekat SNP i KCN na rastenje C. rubrum in vitro ................................................................. 101

4.3.2.1. Efekat SNP na rastenje C. rubrum in vitro .................................................................... 101

4.3.2.2. Efekat SNP i GA3 na rastenje C.rubrum in vitro ............................................................ 103

4.3.2.3. Efekat KCN na rastenje C. rubrum in vitro .................................................................... 104

.3. Efekat SNP i KCN na cvetanje i donošenje semena C. rubrum in vitro .............................. 106

4.3.3.1. Efekat SNP na cvetanje i donošenje semena C. rubrum in vitro .................................. 106

4.3.3.3. Efekat KCN na cvetanje C.rubrum in vitro .................................................................... 110

5. ZAKLJUČCI........................................................................................................... 113

6

Skraćenice

AA askorbat

CAT katalaza

cPTIO karboksi 2-fenil-4,4,4,4,-tetrametilmidazolin-1oksi 3-oksid

DHA dehidroaskorbat

GA giberelna kiselina

GSH redukovani glutation

GSSG oksidovani glutation

KS kontinualna svetlost

POD peroksidaze

ROS reaktivne vrste kiseonika

SNP natrijum nitroprusid

SOD superoksid dismutaze

UAA ukupna antioksidativna aktivnost

6

Sažetak

Chenopodium rubrum L. sel 184 je obligatno kratkodnevna biljka. Kao rano cvetajuća vrsta predstavlja pogodan objekat za ispitivanje ontogeneze in vitro. Biljka cveta in vitro posle 15 dana pod adekvatnim fotoperiodskim režimom, a donosi seme posle 10 nedelja. Praćeni su efekti različitih fotoperioda, azot monoksida (korišćenjem natrijum nitroprusida (SNP) i KCN), i giberelina, na klijanje, rastenje, cvetanje, donošenje semena i antioksidativni status biljaka u različitim fazama vegetativnog i reproduktivnog razvića. Utvrđeni su i materinski efekti različitih fotoperioda na klijanje, rastenje, cvetanje i donošenje semena potomstva.

Tokom klijanja semena dolazi do sekvencijalne ekspresije antioksidativnih sistema. Pred izbijanje radikule catalaza (CAT), superoksid dismutaze (SOD) i dehidroaskorbat (DHA) pokazuju maksimalnu aktivnost, a askorbat (AA) je detektovan samo u to vreme. Maksimalan sadržaj ukupnog glutationa, kao i redukovane (GSH) i oksidovane forme (GSSG) je izmeren u vreme izbijanja radikule, kada se javlja i peroksidazna (POD) aktivnost i raste posle tog perioda. GA3 (160 μM) je suboptimalna za klijanje, indukuje porast aktivnosti CAT i SOD u vreme pred izbijanje radikule, i pad koncentracije AA i DHA, a ne utiče na glutation i POD.

Starost semena utiče na smanjenu klijavost, rastenje i cvetanje, kao i na promenu antioksidativnog statusa semena. Aktivnosti CAT, SOD, kao i sadržaj glutationa su znacajno niži, a “de novo” sinteza proteina počinje kasnije tokom imbibicije starijih semena. GA3 (3 – 30 mM) smanjuje razliku u rastenju i cvetanju između biljaka poreklom od semena različite starosti.

U različitim fazama rastenja i razvića, primećena je promena nivoa antioksidativnih enzima. Najviša CAT aktivnost se može uočiti u vreme cvetanja. Ukupna antioksidativna aktivnost pokazuje obrnut trend promena u toku razvića u odnosu na antioksidativne enzime, što ukazuje da i sadržaj drugih antioksidanata ima ulogu u uklanjanju reaktivnih vrsta kiseonika u procesima razvica C. rubrum.

Biljke C. rubrum odgovaraju na fotoperiod kome su izložene u svim fazama razvića. Fotoperiod kome su biljke izložene u prvih 6 dana života ostavlja trajni efekat na rastenje do kraja ontogeneze, dok na cvetanje i sazrevanje semena ima uticaja i fotoperiod koji zatim sledi.

Majke biljke C. rubrum u semenu ostavljaju informaciju, koja bi između ostalog mogla biti na nivou proteina, o dužinama dana koje su iskusile u toku svog životnog ciklusa. Materinski efekat fotoperioda se proteže kroz čitav životni ciklus potomstva: za klijanje semena i rastenje potomstva, ključni značaj ima fotoperiod kome su majke biljke bile izložene u prvih 6 dana svog života, dok za cvetanje i donošenje semena potomstva, značajniji uticaj ima fotoperiod koji sledi posle indukcije cvetanja majki biljki.

SNP (10 i 50 μM) stimulira klijanje prvog dana i rastenje, dok cvetanje stimulira 10 μM, a više koncentracije odlažu cvetanje. KCN (10 μM) stimulira klijanje 1. dana, 10 – 200 μM nema efekta na izduživanje stabla, a stimulira razviće listova i cvetanje. GA3 (15 mM) stimulira klijanje (1. dana), rastenje i cvetanje. GA3 (15 mM) i SNP (50 μM) pokazuju zbirni stimulatorni efekat na klijanje 1. dana, dok SNP umanjuje stimulatorni efekat giberelina na rastenje i cvetanje.

7

Abstact

Chenopodium rubrum L. sel 184 is a qualitative short-day plant. As an early flowering species, it is a suitable model for onthogenesis studying. Under suitable photoperiodic conditions in vitro, plant flowers after 15 days, and produces seeds after 10 weeks. We investigated the effects of different photoperiods, NO (using sodium ni-tropruside (SNP) and KCN), and gibberellin, on germination, growth, flowering, seed maturation and antioxidative status, all in different phases of vegetative and reproduc-tive development. We determined maternal effect the photoperiod has on seed size, germination, growth, flowering and seed maturation of ofspring. We showed sequential expression of antioxidative systems during seed germi-nation. Prior to radicle protrusion, catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and dehidroascorbate (DHA) showed maximal activity, while presence of ascorbate (AA) was only detected. Radicle protrusion was accompanied with maximal content of total glutatione and GSH, while POD activity appeared and increased after. GA3 (160 μM) had no effect on germination, induced an increase in CAT and SOD activity prior to radicle protrusion and lowered AA and DHA concentrations. It had no effect on glu-tathione and POD activity. Seed ageing lowered germination percentage, growth and flowering and affected changes in antioxidative status of seeds. In old seeds, CAT and SOD activity, as well as glutathione content were significantly lower, and de novo protein synthesis started later during imbibition. GA3 (3 – 30 mM) lowered the difference in growth and flowering between seeds different in age. We showed changes in antioxidative enzymes activities in different phases of development. The highest CAT activity was measured at the time of flowering. Total antioxidative activity showed opposite changes during development as compared to the antioxidative enzymes, suggesting that other antioxidants participate in the reactive oxygen species removal during the C. rubrum development. C. rubrum plants respond to photoperiod in all phases of development. The pho-toperiod the seedling is exposed to during the first 6 days, influences growth during the whole life cycle, while flowering and seed maturation is more sensitive to the photope-riod following flower induction. C. rubrum mother plants relay to their seeds a «message» about the day lengths they experienced during their life cycle. The molecular form of that «message» could, among other, be protein in nature. Maternal effect of photoperiod extends through the whole life cycle of ofsprings: photoperiod during the first 6 days of mother’s life cycle has the key influence on seed germination and ofspring growth, while for flowering and seed maturation, the key influence has the photoperiod their mothers experienced later in life cycles. SNP (10 i 50 μM) stimulates germination and growth, 10 μM stimulates, while higher concentrations delays flowering. KCN (10 μM) stimulates germination, 10 – 200 μM have no effect on stem elongation, while it stimulates leaf growth and flowering. GA3 (15 mM) and SNP (50 μM) showed cumulative stimulatory effect on germination, while SNP lowered stimulative effect of GA3 on growth and flowering.

8

1. Uvod

Ciklus razvića jednogodišnjih biljaka (ontogeneza) započinje klijanjem semena i

završava se obrazovanjem ploda i semena. U ontogenetskom razviću biljke, dva

procesa imaju kardinalni značaj. Prvi je klijanje semena, koje nastupa posle kraćeg ili

dužeg mirovanja semena i nastavlja se rastenjem klijanca i mlade biljke sa svim

vegetativnim organima. Drugi je cvetanje, koje predstavlja početak reproduktivne faze

razvića koja se završava obrazovanjem ploda i semena. Ovi procesi su usklađeni sa

smenom godišnjih doba i završavaju se pre nastupanja sezone koja je za rastenje

nepovoljna, u umerenom klimatskom pojasu, pre zime. Jednogodišnje biljke u zimskom

periodu umiru, ostavljajući seme iz koga će se razviti sledeća generacija.

1.1. Biljka Chenopodium rubrum L.

Chenopodium rubrum L. pripada familiji Chenopodiaceae, rodu Chenopodium.

Familija Chenopodiaceae: Biljke ove familije pripadaju formi skapoznih terofita.

U Srbiji su to isključivo zeljaste biljke, koje često imaju sukulentnu formu. To su

jednogodišnje, dvogodišnje, ili višegodišnje, jednodome, ili dvodome biljke. Listovi su

naizmenični ili naspramni, bez zalistaka. Cvetovi su jednopolni ili dvopolni, trodelni ili

petodelni, složeni u grozdaste cvasti. Listići jednostavnog cvetnog omotača, često su

okriljeni i kasnije otvrdnu. Plod je, po pravilu, suv. U okviru ove familije ima dosta

važnih kulturnih biljaka: industrijskih, furažnih i povrtarskih. Većina vrsta familije

Chenopodiaceae je jestiva. Koriste se mladi listovi i vrhovi izdanaka. Neke vrste su

kultivisane kao povrće (spanać, blitva, cvekla, šećerna repa), dok se u ishrani koriste i

listovi nekih samoniklih lobodnjača. Mladi listovi C. rubrum, takođe su jestivi prokuvani

(Grlić 1986).

Rod Chenopodium: Ovom rodu pripadaju zeljaste, jednogodišnje, ređe

višegodišnje biljke. Listovi su naizmenični, obićno trouglasto rombični i nepravilno

valovitog oboda. Cvetovi su dvopolni, sakupljeni u račvaste bezlisne cvasti. Cvetni

9

omotač je (3-4) 5-delan, njegovi listići su zeljasti, s leđne strane zadebljali i delimično ili

potpuno omotavaju zreli plod. Plod je jednosemena orašica (Slavnić 1972).

Chenopodium rubrum L. (Slika U1) je zeljasta jednogodišnja, jednodoma biljka

sa sposobnošću samooprašivanja. Dostiže visinu do preko pola metra. Stablo je

uspravno, golo, zeleno ili crvenkasto, prosto ili granato. Listovi su debeli, rombični ili

trouglasti, valoviti ili zubčasti po obodu. Cvetne glomerule su sitne, složene u lisnate, ili

bezlisne grozdove, skupljene u zbijene ili rastresite složene cvasti grozdastog tipa. Kod

vršnih cvetova lisnati omotač je sastavljen od 5 slobodnih, a kod bočnih od 3 srasla

lista. Prašnika ima 2-5, žiga 2. Semenka je mrko-crna.

Vrsta je rasprostranjena u Evropi, Maloj i Centralnoj Aziji i Severnoj Americi, u

Srbiji se najčešće sreće u Vojvodini. Raste na tlu bogatom mineralnim solima, najčešće

otvorenim, šljunkovitim i sunčanim mestima sa velikim oscilacijama vlažnosti tla

(Slavnić 1972).

Slika U1: Chenopodium rubrum: Levo – vegetativna biljaka pred cvetanje, Desno – izgled biljke u cvetu, izgled cveta, ploda i semena.

1. 1. 1. Fotoperiodske karakteristike biljke Chenopodium rubrum L.

Različiti ekotipovi jedne iste vrste, mogu se razlikovati po svom fotoperiodskom

odgovoru. Tako je Cumming (1967) okarakterisao 6 različitih ekotipova ove vrste sa

različitih geografskih širina Severne Amerike, izučavajući uticaj fotoperioda i

temperature na cvetanje. Utvrdio je da se selekcija 184 (50 10 N, 105 35 W) na

10

temperaturi od 15 C, ponaša kao obligatno – kvalitativno kratkodnevna biljka, osetljiva

na male promene dužine dana, i sa dobro definisanim kritičnim dužinama noći od 8h.

C. rubrum L. sel. 184, je osetljiva na fotoperiodski stimulus za cvetanje već na

kotiledonarnom stadijumu razvića. Za fotoperiodsku indukciju cvetanja, dovoljno joj je 6

indukcionih ciklusa (Seidlová and Opatrná 1978). U kulturi in vitro u indukcionim

uslovima, cveta već 15 dana posle klijanja (Živanović et al. 1995), pa kao rano

cvetajuća vrsta (Cumming 1961), predstavlja prikladan objekat za izučavanje

ontogeneze.

1.2. Aktivnosti antioksidativnih sistema

u toku vegetativnog i reproduktivnog razvića

1.2.1. Aktivnosti antioksidativnih enzima

Pojava reaktivnih vrsta kiseonika (reactive oxygen species - ROS) u biljnim

ćelijama je povezana sa procesima u toku razvića biljaka, kao i njihovom interakcijom

sa spoljašnjom sredinom (Elstner 1982, Hendry and Crawford 1994). Slobodni radikali

neprekidno oštećuju različite molekulske vrste, a mogu čak i da oštete ćelijske

membrane i organele. Za neke od njih, kao što su H2O2 i O2- se pretpostavlja da imaju

signalnu ulogu (Baker and Orlandini 1995, Lamb and Dixon 1997). ROS se alternativno

proizvode i uklanjaju. Antioksidativni enzimi, superoksid dismutaze (SOD) (štiteći ćelije

od O2-), peroksidaze (POD) i katalaza (CAT) (katališući razlaganje H2O2), su glavne

komponente uključene u uklanjanje ROS (Van Loon 1986, Bowler et al. 1992, Khan

and Panda 2002) i na taj način učestvuju u regulaciji procesa u toku razvića biljaka ili

odgovora biljke na patogene ili abiotički stres.

Katalaza i peroksidaze, metabolišu H2O2 na različite načine (Marinescu et al.

2000), pri čemu različiti metaboločki putevi degradacije H2O2 verovatno odgovaraju

razlikama u metabolizmu biljaka, vezanim za različite faze razvića ili odgovorima na

biotički ili abiotički stres.

Sinteza proteina koji ulazi u sastav CAT je povezana sa fotosintetičkim i

fotorespiratornim putevima (Schmidt et al. 2002). Pošto je pokazano da H2O2 usko

povezan sa velikim brojem hormonski zavisnih procesa u toku razvića (Foyer and

11

Noctor 2003), pretpostavljeno je da kompleksna regulacija CAT na nivou translacije ima

ulogu da ograniči preteranu akumulaciju H2O2 , omogućavajući odvijanje CAT signalnih

funkcija (Luna et al. 2004). Rezultati koji se bave fiziologijom semena pokazuju ulogu

CAT tokom sušenja semena u sprečavanju oksidativnih oštećenja vezanih za

dehidrataciju, pri čemu H2O2 regulliše CAT gensku ekspresiju i transdukciju signala

dehidratacije (Bally et al. 2004). Takođe je pokazano da je i proces klijanja povezan sa

CAT aktivnošću (Bailly et al. 2002). Promena CAT aktivnosti je potvrđena i u procesima

rastenja i razvića (Bailey and McHargue 1943, Matters and Scandalios 1986).

Peroksidaze su najviše istraživani enzimi s obzirom na njihovu zastupljenost u

biljnim tkivima, ali postojanje različitih in vitro supstrata za POD i različitih izoenzima

prestavlja problem za utvrđivanje njihove fiziološke uloge (Marinescu et al. 2000).

Utvrđena je uloga POD u klijanju semena i rastenju klijanaca (Bellani et al. 2002),

rastenju i razviću (Bailey and McHargue 1943, Fielding ang Hall 1978), biosintezi

lignina u ćelijskim zidovima (Bruce and West 1989).

Superoksid dismutaze su grupa metaloenzima koja štiti ćelije od superoksid

radikala (O2-) katališući njegovu dismutaciju do molekularnog O2 i H2O2. Aktivacija O2

se dešava u različitim delovima ćelije (mitohondrije, hloroplasti, mikrozomi, glioksizomi,

peroksizomi, apoplast i citosol), pa su i SOD prisutne u svim tim delovima ćelije. SOD

su svrstane u dve familije. Cu/Zn SOD (uglavnom lokalizovana u citosolu ili

hloroplastima), i MnSOD (u mitohondrijama) i FeSOD (u hloroplastima) (Fridovich

1986). U normalnim uslovima, nastajanje i uklanjanje O2- je u ravnoteži, kako zaštitnim i

reparacionim mehanizmima, tako i mehanizmima koji minimiziraju produkciju slobodnih

radikala pre nego jednostavnim uklanjanjem (Giba et al. 1998). U uslovima stresa, SOD

predstavljaju prvu liniju odbrane od reaktivnih kiseoničnih vrsta (Alcher et al. 2002).

Uloga SOD takođe je utvrđena u procesima klijanja (Gidrol et al. 1994), kao i rastenja i

razvića (Matters and Scandalios 1986, Lall and Nikolova 2003).

1.2.2. Askorbat i glutation

Uklanjanje H2O2 se obavlja i oksido-redukcionim sistemom antioksidativnih

metabolita, askorbata i glutationa (Asada 2006). Glutation i askorbat imaju opštu

zaštitnu ulogu protiv oksidativnog stresa, regulišući redoks ravnotežu u ćeliji (Arigoni

12

1994, May et al. 1998). Pretpostavlja se da odnos askorbinska

kiselina/dehidroaskorbinska kiselina može da zaustavi, ili odloži deobu ćelija (de Pinto

et al. 1999).

1.2.3. Ukupna antioksidativna aktivnost

Merenje ukupne antioksidativne aktivnosti (UAA) predstavlja metod koji ukupnu

antioksidativnu aktivnost posmatra kao globalnu karakteristiku uzorka, nezavisno od

njenog sastava, ili kooperativnih efekata koji mogu postojati između različitih

antioksidanata koji su sastavni deo uzorka. UAA predstavlja kapacitet uzorka svežeg

biljnog materijala za uklanjanje slobodnih radikala (Arnao et al. 1999).

1.3. Fotoperiodizam

Relativna dužina dana i noći u toku 24 časa menja se tokom godine i uslovljava

ritmičnost u mnogim biološkim procesima. To je potpuno predvidiva promena

spoljašnjih faktora, jer se za svaku geografsku širinu zna koliko će dnevno osvetljenje

biti svakog dana tokom godine. Produžavanje, ili skraćivanje dana, otuda predstavljaju

najsigurniji signal živim bićima o tome koje godišnje doba dolazi (Nešković et al. 2003).

Fotoperiodizam je jedan od primera biološkog merenja vremena (Vince-Prue 1975). Za

biljke je od najveće važnosti da cvetaju u vreme koje će im omogućiti da pre zime

donesu plod.

1.3.1. Merenje vremena u fotoperiodskoj kontroli cvetanja

Prema fotoperiodskom odgovoru na cvetanje, biljke su podeljene u tri osnovna

tipa (Vince-Prue 1975):

biljke kratkog dana, koje cvetaju kada je broj časova svetlosti, u okviru 24-

časovnog ciklusa, manji od određene vrednosti (kritična dužina dana).

biljke dugog dana, koje cvetaju kada je broj časova svetlosti, u okviru 24-

časovnog ciklusa, veći od određene vrednosti (kritična dužina dana),

dnevno neutralne biljke, koje cvetaju bez obzira na fotoperiodske uslove.

13

Fotoperiodska klasifikacija biljaka nije zasnovana na konkretnoj dužini dana, već

govori o tome da li će cvetanje biti stimulirano kad se dužina dana smanjuje ili

povećava u odnosu na kritičnu. Preciznije je, zapravo, govoriti o kritičnoj dužini noći, jer

se u toku noći dešavaju značajni procesi vezani za cvetanje.

Kod ovih fotoperiodskih tipova postoje biljke sa obligatnim (kvalitativnim) i biljke

sa fakultativnim (kvantitativnim) odgovorom. Kvalitativne (kratko ili dugodnevne) cvetaju

samo na određenoj kritičnoj dužini dana, dok kod kvantitativno (kratko ili dugodnevnih)

biljaka određena dužina dana promoviše cvetanje, ali nije esencijalna za cvetanje

(Vince-Prue 1975). Ali čak i kod apsolutno fotoperiodski zavisnih vrsta, kritična dužina

dana može biti značajno modifikovana različitm faktorima sredine, na pr. mineralnim

sastavom podloge, temperaturom, svetlosnim fluksom, starošću biljke. Otuda

svrstavanje biljaka u jednu ili drugu grupu odgovora, validno je pod datim setom uslova

(Bernier et al. 1981).

Neke biljke imaju dvostruke fotoperiodske zahteve: dugo-kratkodnevne biljke će

cvetati na kratkom danu, samo ako su prethodno primile dovoljan broj dugih dana (u

jesen), dok će kratko-dugodnevne cvetati na dugom danu, ako su prethodno bile

izložene kratkom danu (u proleće). Mogu se razlikovati još dve grupe biljaka:

intermedijerne, koje će cvetati kada je dužina dana intermedijerna (ni suviše dugačak,

niti suviše kratak dan), i ambifotoperiodske biljke, koje će brzo cvetati na kratkom ili

dugom danu, ali će cvetanje biti odloženo na intermedijernim dužinama dana (Vince-

Prue 1975).

Fotoperiodski zavisne biljke ne moraju sve vreme do cvetanja biti izložene

odgovarajućoj dužini dana. Svaka vrsta zahteva određen broj indukcionih

fotoperiodskih ciklusa, posle čega će procvetati bez obzira na dužinu dana kojoj bude

izložena. Osetljivost biljaka na fotoperiodski stimuslus varira sa starenjem, i obično se

povećava do određenog stepena (Vince-Prue 1975). Biljka C. rubrum je osetljiva na

fotoperiodski stimulus već u fazi razvića kotiledona, kada joj je dovoljno 6 indukcionih

fotoperiodskih ciklusa da bi procvetala (Seidlová and Opatrná 1978). Kod nekih biljaka,

uočeno je oscilovanje osetljivosti na fotoperiodski stimulus za cvetanje u zavisnosti od

starosti biljaka gde je starost izražena brojem listova (Pavlová et al. 1989, Mitrović et al.

2000).

Neke biljke, kako kratkog dana: Pharbitis nil (Bernier et al. 1981), Chenopodium

rubrum (Mitrović et al. 2003), tako i dugog dana: Sinapis, Rudbeckia (Bernier et al.

14

1981), Arabidopsis (Komeda et al. 1992), C. murale (Mitrović et al. 2003) su sposobne

da iniciraju cvetove i u mraku.

Opšte je prihvaćeno da fotoperiodsku draž najefikasnije primaju listovi. A

fitohrom ima funkciju merača dužine noći (Nešković et al. 2003).

1.3.2. Fitohrom

Prisutan je u svim delovima biljke (koren, stablo, list, lisne drške, kotiledoni,

hipokotili, vegetativni pupoljci, cvasti, nezreli plodovi), a najveća mu je koncentracija u

meristemskim tkivima (Smith 1995, Korneef et al. 1998). Fitohrom uzima učešće u

velikom broju procesa u životu biljke (Nešković et al. 2003):

-klijanje semena,

-izduživanje stabla,

-otvaranje apikalnog pupoljka i razviće listova,

-fotosinteza - složen enzimski sistem koji obavlja fotosintezu razvija se pod

zajedničkim dejstvom fitohroma i kriptohroma,

-sinteza antocijana i velikog broja različitih enzima,

-posredovanje u cvetanju i drugim fotoperiodskim pojavama kao i u

uspostavljanju endogenog ritma,

-regulacija aktivnosti jonskih kanala u mnogim ćelijama.

Fitohrom se sintetiše u obliku koji apsorbuje svetlost talasne dužine 660nm (Pr) i

u tom obliku se nalazi u biljkama koje rastu u mraku. Kada se osvetli crvenom

svetlošću, Pr se konvertuje u oblik čiji je maksimum apsorpcije na 730nm (Pfr). Ovaj

oblik započinje biološku reakciju.

crvena svetlost Pr Pfr fiziološki odgovor daleko crvena svetlost

Mrak

Pošto dnevna svetlost obuhvata sve talasne dužine vidljivog dela spektra, oba

oblika fitohroma su neprestano prisutna. Fitohrom neprekidno prelazi iz Pr u Pfr, čime

se akumuliraju i njegovi intermedijeri, čija uloga nije razjašnjena.

Utvrđeno je da postoje dva oblika fitohroma: tip I i tip II (Furuya 1993).

15

Kompleksnim molekularno biološkim istraživanjima, utvrđeno je postojanje familije gena

koja kodira apoproteine fitohroma: PHYA, PHYB, PHYC, PHYD, PHYE (Sharrock and

Quail 1989), mada neke biljke verovatno imaju i neke druge fitohrome. PHYA kodira

sintezu fitohroma tipa I, dok PHY B - E kodiraju fitohrome tipa II. Fitohromi tipa I i tipa II

se međusobno razlikuju po stabilnosti aktivne forme Pfr na svetlosti. Količina fitohroma

tipa I je na svetlosti niska, dok je u mraku, čak 9 puta veća od količine fitohroma tipa II.

Fitohtom tipa II je prisutan i kod zelenih i etioliranih biljaka, ali u manjim količinama.

Osim crvene i daleko crvene svetlosti, i plava svetlost, preko svojih receptora,

kriptohroma i fototropina, ima udela u životu biljaka.

Fitohrom A i B učestvuju u regulaciji morfogenetskih procesa u svim fazama

razvića biljke, od klijanja do cvetanja, ali se njihov relativni značaj menja tokom razvića.

Pretpostavlja se da phyA reguliše odgovore na daleko crvenu svetlost visokog

intenziteta i ima različite uloge tokom životnog ciklusa, dok je phyB odgovoran za

klasične crvena/daleko crvena svetlost reverzibilne reakcije (Smith 1995).

Značaj pojedinih fotoreceptora se može manjati u toku razvića biljke (Terzaghi

and Cashmore 1995). Razjašjavanjem molekularnih, ćelijskih i biohemijskih

mehanizama aktivnosti fitohroma preko velikog broja mutanata A. thaliana, otkrivene su

uloge pojedinačnih fitohroma u regulaciji različitih aspekata razvića biljaka. Različiti

fitohromi istovremeno imaju jasno određene, ali i preklapajuće uloge u fotomorfogenezi

biljaka (Wang and Deng 2002).

Pokazano je da je klijanje A. thaliana pod kontrolom: phyA, phyB i phyE (Hening

et al. 2002). Cvetanje A. Thaliana, kao i pirinča (Takano et al. 2005), je pod kontrolom

phyA, phyB i phyC (Monte et al. 2003). phyA ima vrlo značajnu ulogu u izduživanju

internodija i listova biljaka gajenih na svetlosti (Franklin et al. 2003). Odgovor

izbegavanja senke, koji je povezan sa izduživanjem internodija i petiola, a i sa

cvetanjem, je pod kontrolom phyB, phyD i phyE (Wang and Deng 2002).

1.4. Materinski efekti obezbeđuju fenotipsku adaptaciju

na lokalne uslove spoljašnje sredine

Biljke kao sesilni organizmi, tokom svog života, žive u određenim uslovima

spoljašnje sredine. Ipak, mogu biti izložene različitim uslovima spoljašnje sredine

16

rasejavanjem polena, ili semena, kao i lokalnim promenama sredinskih faktora. Biljke

na variranje faktora spoljašnje sredine odgovaraju fenotipskom plastičnošću. Odgovor

na spoljašnju sredinu može se proširiti i na potomstvo, i to kako odgovorom na

spoljašnju sredinu majčinske, tako i očinske biljke, mada je materinski efekat rašireniji

(Galloway 2005). Osim prezigotskih uticaja spoljašnje sredine, na koje utiču oba

roditelja, rano razviće mlade jedinke (semena) se odvija na matičnoj biljci.

Od adaptivnih materinskih efekata, se očekuje da smanje broj faktora spoljašnje

sredine koji utiču na smanjenje sposobnosti potomstva da preživi. Na primer: mlade

biljke Polygonum persicaria, poreklom od biljaka raslih na podlozi siromašnog

mineralnog sastava, imaju značajno razvijeniji korenov sistem od genetički istih

individua čije su majke biljke rasle na podlogama bogatim nutrijentima (Sultan 1996).

Slično, potomstvo biljaka gajenih u uslovima slabe osvetljenosti, pokazuje znatno

izraženije rastenje stabla u odnosu na potomstvo biljaka raslih u uslovima pune

osvetljenosti (Sultan 1996).

Materinski efekat sredine predstavlja mehanizam kojim majka biljka prilagođava

fenotipove potomstva da poveća “uspeh” u spoljašnjoj sredini kakvu će najverovatnije

iskusiti. U slučaju da se seme raseje u drugačiji habitat, materinski efekat sredine može

smanjiti njegovu sposobnost preživljavanja. Ipak, sposobnost preživljavanja će biti

smanjena samo u jednoj generaciji, jer će odgovor individua na novi habitat indukovati

odgovarajuće materinske efekte za sledeću generaciju (Galloway 2005).

Tri uslova moraju biti zadovoljena za razvoj adaptivnih materinskih efekata

(Donohue 2003): 1. materinski uslovi spoljašnje sredine, moraju da “predviđaju” uslove

sredine potomstva, 2. uslovi spoljašnje sredine kojima su izložene majke biljke, moraju

da povećavaju sposobnost preživljavanja kako potomstva, tako i roditeljske generacije,

3. mora da postoji interakcija između materinskog genotipa i uslova spoljašnje sredine.

Striktno genetičke adaptacije, koje predstavljaju odbrambenu materinsku

strategiju, očekuju se kada su variranja spoljašnje sredine veća od kretanja polena ili

semena. To se može uočiti između populacija sa genetičkim diferencijacijama

označenim kao lokalne adaptacije (Linhart and Grant 1996). Otuda, populacija koja

naseljava heterogenu sredinu, ima ograničenu mogućnost za rasejavanje semena, i

kontinuitet uzoraka faktora spoljašnje sredine između generacija, izabraće strategiju

materinskih efekata sredine da obezbedi fenotipsku adaptaciju na lokalne uslove

spoljašnje sredine (Galloway 2005).

17

Pokazano je da različiti faktori spoljašnje sredine mogu izazvati materinske

efekte na potomstvo. Oni su specifični, njihova ekspresija često zavisi od sredine u

kojoj se potomstvo razvija. Materinski efekat ispoljava se tokom čitavog života

potomstva, a može opstati kroz više generacija (Galloway 2005). Faktori spoljašnje

sredine za koje je uočeno da izazvaju materinski efekat su: mineralni sastav podloge

(Straton 1989), intenzitet svetlosti (Galloway 2005), temperatura (Lacey et al. 1997),

fotoperiod (Cook 1975, Gutterman 1978, Munir et al. 2001), nivo CO2 (Steinger et al.

2000).

1.4.1. Materinski efekti na karakteristike i klijanje semena

Kod većine biljnih vrsta, klijavost semena varira između i unutar populacija, i

između i u okviru individua. Neke od tih varijacija mogu biti ontogenetske, ali je veliki

broj njih fenotipski, uslovljen lokalnim uslovima pod kojima su semena sazrevala. To je

kombinacija mikrosredinskih faktora uslovljenih položajem semena na majci biljci i

abiotičkih faktora sredine (Gutterman 2000). U velikom broju slučajeva zabeležena je

promena klijavosti semena uslovljena promenjenim faktorima sredine u toku razvića i

sazrevanja semena na majci biljci (po Gutterman 2000): dužina dana, temperatura,

roditeljsko fototermalno okruženje, kvalitet svetlosti, nadmorska visina. Fener (1991,

1992) je obradio poznate podatke o efektima sredine na veličinu semena. Utvrđeno je i

da, kod mnogih biljnih vrsta, sudbina sledeće generacije ili generacija, bar što se

klijanja semena tiče, zavisi do izvesne mere, od uslova u kojima sazreva seme na majci

biljci (Datta et al. 1972a, b).

Fenotipski uticaj, uključujući i faktore sredine i materinski efekat, tokom

sazrevanja na klijanje semena, osiguravaju da čak i pod optimalnim uslovima, samo

određena »porcija« populacije semena isklija u toku jedne kiše ili čak sezone.

Očigledan je značaj heteroblastičnosti sa stanovišta preživljavanja vrsta

dispergovanjem klijanja u vremenu i prostoru. Glavno pitanje je da li je to generalni

biohemijski put, ili su to (kod različitih biljnih vrsta) različiti biohemijski putevi (na

odgovarajućem stadijumu sazrevanja) na koje utiču položaj semena na majci biljci i/ili

efekti spoljašnje sredine koji određuju rezlike u klijavosti semena. Može se samo

spekulisati da tokom sazrevanja semena različiti faktori utiču na akumulaciju različitih

relativnih količina materija koje su kasnije uključene u proces klijanja, i da mogu

delovati kroz 3 glavna puta (Gutterman 2000):

18

1. Mogu da dovode do razvića semenog omotača sa različitim stepenom

permeabilnosti, u skladu sa dužinom dana.

2. Te materije mogu uzrokovati akumulaciju inhibitora klijanja u plodu, kao što je

uočeno kod paradajza i nekih drugih plodova.

3. Te materije mogu biti hormoni, na pr. etilen. Takođe i enzimi i druge materije

koje se akumuliraju u embrionima u različitim relativnim količinama u zavisnosti

od uslova sredine pod kojima semena sazrevaju, mogu uticati na klijanje.

Kod nekih vrsta Papilionaceae, dužina dana u vreme sazrevanja semena utiče na

propustljivost semenog omotača za vodu. Takođe je utvrđeno da se efekat dužine dana

transferuje iz listova do semena i utiče na razviće semenog omotača. Biohemija ovog

procesa, nije do sada otkrivena (Gutterman 2000).

Kod nekih biljnih vrsta, efekat faktora sredine, kao što je dužina dana, je različit na

cvetanje i na klijanje. Otuda je moguće da regulacija cvetanja i regulacija klijanja

uključuju različite biohemijske puteve, bez obzira da li su u pitanju biljke sa ili bez

određenih fotoperiodskih zahteva za cvetanje (Gutterman 2000).

1.5. NO signali kod biljaka

U skorije vreme, utvrđeno je da je azot monoksid (NO) ključni signalni molekul

kod biljaka (Neill et al. 2003). NO je mali gasoviti molekul rastvoran u vodi i mastima,

koji se poslednjih godina pokazao kao glavni signalni molekul “drevnog” porekla i svuda

prisutan (Durner et al. 1999). NO je gasoviti slobodni radikal, i može postojati u tri

interkonvertibilna oblika: slobodni radikal (NO), nitrozonium katjon (NO+), nitroxil anion

(NO-) (Stamler et al. 1992, Wojtaszek 2000).

Jednom produkovan, NO može da se kreće iz jedne ćelije u drugu ili između

ćelija. Kao reaktivni slobodni radikal, ima relativno kratko vreme poluživota, reda

veličine nekoliko sekundi (Neill et al. 2003). Brzo reaguje sa O2 dajući NO2, i brzo

degraduje do nitrita i nitrata u vodenom rastvoru, pa je opseg njegovog efekta

ograničen na ćelije u kojima je nastao ili ćelije u neposrednoj blizini. Da bi signalni

molekul bio efikasan, potrebno je da se brzo produkuje po potrebi, da indukuje

definisane efekte u ćeliji, i da brzo i efikasno bude uklonjen kada više nije potreban.

Nekoliko je potencijalnih izvora NO u biljkama i izgleda da je fiziološki značaj

19

svakog od njih za produkciju NO zavistan od vrste, ćelija odnosno tkiva, uslova pod

kojima se biljka gaji. Postoje dokazi da se produkcija NO kod biljaka odvija preko

enzima sličnih NO-sintetazi, nitrat-reduktazi, ili neenzimskih izvora (Neill et al. 2003).

1.5.1. Biologija NO – eksperimentalni pristupi

Egzogena primena NO kod biljaka i indukcija odgovora, naravno, sama po sebi

ne dokazuje da endogeni NO kontroliše određeni razvojni ili fiziološki proces koji se

proučava. NO se primenjuje na biljke i većinu organizama preko NO-donora, molekula

koji će osloboditi NO, nekada tek pošto su uneti u ćeliju. Ovaj pristup je tehnički

jednostavan u poređenju sa primenom gasa. Korišćeni su različiti NO donori, najčešće

natrijum nitroprusid (Stamler et al. 1992). Efekat donora može biti poništen primenom

uklanjača NO, na pr. PTIO (2-fenil-4,4,5,5-tetrametilimidazolin-1oksil 3-oksid) ili cPTIO

(2-(4-karboksifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolin-1-oksil-3-oxide) (Neill et al. 2003).

1.5.2. Demonstracija i kvantifikacija NO

Idealno bi bilo da se NO pouzdano može kvantifikovati na svom mestu delovanja

u ćeliji. Zapravo, NO kvantifikacija je problematična iz više razloga. Slično kao merenje

etilena, NO emisija iz biljaka moze biti praćena gasnom hromatografijom i masenom

spektrometrijom, hemiluminescencijom i korišćenjem fotoakustične spektroskopije (Neill

et al. 2003), EPR spektroskopije (Pagnussat et al. 2002).

Razvijene su NO-senzitivne fluorofore, kao sto je DAF-2DA, ćelijski permeabilni

molekul koji ne fluorescira dok se ne veže za NO pa se može primeniti za utvrđivanje

relativnog intraćelijskog sadržaja NO, korišćenjem fluorescentnog i konfokalnog

mikroskopa. Iako DAF-2DA ne reaguje sa ROS, ima dokaza o nespecifičnoj

fluorescenciji (Kojima et al. 1998).

1.5.3. Uloga NO u rastenju i razviću

Poznato je da biljke emituju NO pod normalnim uslovima rastenja. Međutim, NO

20

može da se akumulira u atmosferi iz različitih izvora, uključujući i industrijsko zagađenje

(Wildt et al. 1997). Štetni efekti NO na fotosintezu su primećeni pre više godina, da bi

zatim bilo uočeno da su efekti NO na rastenje koncentraciono zavisni (Anderson and

Mansfield 1979). Visoke doze (40-80 pphm) inhibiraju rastenje paradajza, dok ga niske

(0-20 pphm) ubrzavaju, što je potvrđeno i za zelenu salatu (Hufton et al. 1996) i grašak

(Leshem and Haramaty 1996).

NO donori su inhibirali rastenje hipokotila i stimulirali de-etiolaciju i povećanje

hlorofila kod krompira, salate i Arabidopsis-a (Beligni and Lamatina 2000). NO je

takođe povećavao sadržaj hlorofila u listovima graška, posebno u stominim ćelijama

zatvaračicama (Leshem et al. 1997). Ima pokazatelja da NO može imati anti-retencione

karakteristike, inhibicijom sinteze etilena (Leshem and Haramaty 1996).

Sazrevanje plodova je proces vezan za starenje promovisan etilenom, koji može

biti zaustavljen NO-om. Pojačana produkcija tokom sazrevanja plodova kao što su

banana i jagoda koincidira sa smanjenom emisijom NO-a. Osim toga, primena NO kod

povrća i voća, takođe odlaže senescenciju i produžava njihov život posle branja

(Leshem and Pinchasov 2000).

NO može da stimulira klijanje semena kod različitih biljnih vrsta. Primena NO

donora ukida dormanciju semena salate, što se poništava u prisustvu PTIO (Beligni

and Lamatina 2000). Efekat NO može objasniti i klijanje dormantnih semena izazvano

dimom koji sadrži azotne okside. Giba i saradnici (1998) su koristili različite NO donore

i odgovarajuće neaktivne komponente da pokažu da je klijanje Paulownia tomentosa

kontrolisano fitohromom, regulisano preko NO. Tako, efekat nitrita (a otuda i NO) na

klijanje ukazuje da je nivo nitrita u zemljištu, faktor koji određuje klijanje semena (po

Neill et al. 2003).

Najnovija istraživanja su, korišćenjem donora CN- (KCN, K3[Fe(CN)6] i

K4Fe(CN)6) pokazala (Bethke et al. 2006) da verovatno i SNP (oslobađanjem CN, a ne

NO) podiže nivo NO u tkivu, tako što inhibira katabolizam NO vezivanjem za citohrom c

oksidazu (enzim odgovoran za metabolizam NO).

Uloga NO utvrđena je i u razviću korena krastavca (Pagnusat et al. 2002).

Tretiranje klijanaca Arabidopsis-a, donorom NO (SNP), ubrzavalo je vegetativni rast, i

odlagalo cvetanje (He et al. 2004) i pokazano je da NO utiče na ekspresiju gena koji

kontrolišu tranziciju u cvetanje.

21

1.5.4. NO i hormoni

U nekim slučajevima NO učestvuje u biološkim procesima koje prvenstveno

kontrolišu signalni molekuli kao što su biljni hormoni (Neill et al. 2003). Hormoni mogu

biti transportovani sa jednog mesta na drugo i tamo indukovati NO sintezu. Takođe,

osetljivost na hormone može se menjati u različitim fazama razvića, ili kao odgovor na

stimulus iz spoljanje sredine, tako da je ćelijama potrebno da budu kompetentne da

odgovore na hormon putem NO sinteze. U oba slučaja, NO sinteza može biti

ograničena na određene target ćelije.

Citokinini indukuju NO sintezu kod kultura ćelija duvana, peršuna i Arabidopsis-a

(Tun et al. 2001). Pokazano je da NO učestvuje u ABA-indukovanom zatvaranju stoma

(Schroeder et al. 2001). Utvrđeno je da je auksinom indukovana sinteza NO u

korenovima krastavca (Pagnusat et al. 2002). He i saradnici (2004) su ukazali da bi NO

mogao da funkcioniše paralelno sa GA u regulaciji cvetanja Arabidopsis thaliana.

1.6. Giberelini

Pokazano je da se giberelini nalaze u svim nižim i višim biljkama. Sinteza

giberelina se u biljkama odvija u tkivima koja rastu, kao što su apikalni delovi stabla,

mladi listovi, korenovi, nezrela semena i plodovi. Naročito su semena mnogih biljaka

aktivna u sintezi giberelina. Sa mesta sinteze, giberelini se transportuju kroz biljku u

svim pravcima, iz korena – transpiracionim tokom, a iz apikalnih delova – floemom.

Giberelini, kao sastavni deo hormonskog kompleksa, ućestvuju u gotovo svim

razvojnim procesima u biljci: klijanje semena, izduživanje stabla, cvetanje,

determinacija pola, rastenje plodova, mirovanje pupoljaka. Efekti po kojima su

najprepoznatljiviji su stimulacija izduživanja stabla i specifičan efekat na sintezu enzima

koji hidrolizuju skrob pri klijanju semena žita (Nešković et al. 2003).

Poznato je ga egzogena primena giberelina može da ukine dormanciju

dormantnih semena, a takođe i da utiče na stimulaciju klijanja nedormantnih (Bewley

and Black 1982). Istovremeno, klijanje fotoblastičnih semena koje je pod kontrolom

fitohroma, dešava se preko stimulacije sinteze giberelina i njihovog oslobađanja iz

22

23

vezanih oblika. U intaktnom semenu, giberelini iz embriona se transportuju u aleuronski

sloj, gde dovode do sinteze α-amilaze i drugih hidrolitičkih enzima, koji u endospermu

hidrolizuju skrob. Produkti hidrolize se, preko skuteluma, vraćaju u embrion koji ih

koristi za rastenje, pre nego što klijanac postane autotrofan.

Giberelini su jedan od osnovnih činilaca u regulaciji rastenja stabla svih biljaka.

Njihov univerzalni efekat je stimulacija izduživanja stabla, posebno kod mutanata sa

skraćenim stablom, kao i u vezi sa cvetanjem dugodnevnih rozetastih biljaka.

Giberelini su predloženi kao deo specifičnog hormonskog kompleksa – florigena,

još sredinom prošlog veka (Chailakhyan 1958). Veliki diverzitet rezultata dobijenih

primenom giberelina u istraživanjima vezanim za cvetanje, Evans i saradnici (1994) su

objasnili različitom osetljivošću različitih biljnih vrsta na različite gibereline, primenjene u

odgovarajuće vreme i u kombinaciji sa odgovarajućim uslovima gajenja. Pretpostavili

su da postoje različiti giberelinski receptori u apeksu za izduživanje stabla i za rane

događaje vezane za tranziciju u cvetanje. Genetičke analize kontrole cvetanja

dugodnevne biljke Arabidopsis thaliana, u poslednjih 15-tak godina, omogućavaju

svrstavanje gena koji učestvuju u kontroli cvetanja u 4 promotivna puta: fotoperiodski,

autonomni, vernalizacijski i giberelinski put (Simpson and Dean 2002, Corbesier and

Coupland 2005).

2. Cilj rada

1. Praćenje aktivnosti antioksidativnih sistema u toku vegetativne i reproduktivne

faze razvića Chenopodium rubrum in vitro.

Praćenje aktivnosti antioksidativnih sistema u toku klijanja semena.

Utvrđivanje antioksidativnog statusa semena različite starosti, i praćenje efekta

starosti semena na klijanje, rastenje i razviće.

Utvrđivanje aktivnosti antioksidativnih enzima i ukupne antioksidativne aktivnosti

u različitim fazama vegetativnog i reproduktivnog razvića C. rubrum in vitro.

2. Praćenje efekta različitih fotoperioda tokom vegetativnog i reproduktivnog

razvića C. rubrum in vitro.

Ispitivanje materinskog efekta fotoperioda na klijanje, rastenje i cvetanje.

Analiza proteina semena u zavisnosti od fotoperioda na kojima su gajene majke

biljke.

3. Ispitivanje efekta SNP i KCN u različitim fazama vegetativnog i reproduktivnog

razvića C. rubrum in vitro, s ciljem da se utvrdi potencijalna uloga NO u ovim

procesima.

Ispitivanje efekta SNP, KCN, cPTIO, GA3 na klijanje, rastenje, cvetanje i

donošenje semena C. rubrum in vitro.

24

3. Materijal i metode

3.1. Gajenje biljaka Chenopodium rubrum

u cilju dobijanja semena

Originalno poreklo semena Chenopodium rubrum L., ecotype 184 je laboratorija

profesora Cumminga (Cumming 1959), a dobijeno je iz Instituta za botaniku u

Frajburgu (1984). Od tada se biljke gaje u stakleniku Instituta za biološka istraživanja

“Siniša Stanković”, kao i u kulturi in vitro, u Laboratoriji za kulturu biljnih ćelija, tkiva i

organa. Biljke su u cilju dobijanja semena, u stakleniku gajene u različitim sezonama

(proleće/leto, jesen/zima), a u kulturi in vitro na 16h/8h fotoperiodu.

Slika M1: C. rubrum a) biljke stare 3 meseca gajene u staklari tokom leta, b) biljke stare 3 meseca gajene u staklari tokom zime, biljke gajene in vitro na 16h/8h fotoperiodu stare 68 dana.

a) c)

b)

Zrelo seme je mehanički čišćeno od pleve prosejavanjem kroz sita različite

gustine. Seme je, do korišćenja, čuvano u frižideru, na temperaturi od 8 ºC.

25

3.2. Isklijavanje semena

Sterilizacija semena:

-Sterilizacija suvog semena u Na-hipohloritu (4 %), 2 minuta,

-Ispiranje sterilnom destilovanom vodom kroz sterilni levak sa filter papirom,

-Prenošenje semena na jednoslojni filter papir u sterilne Petri kutije.

Isklijavanje je vršeno na jednoslojnom filter papiru, u petri kutijama, sa po 5 ml:

-destilovane vode

-rastvora GA3 (160 M, 15 mM)

- rastvora SNP (10, 50, 100, 150, 200 M)

- rastvora KCN (10, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 M)

- rastvora cPTIO (100, 200 μM)

Tabela M1: Isklijavanje semena je vršeno smenom temperaturno/svetlosnog režima:

Vreme (h) 24 h 24 h 24 h 24 h 24 h 24 h 24 h

t (C) 32 C 10 C 32 C

Svetlost/Mrak Mrak Svetlost

Određivanje procenta klijanja vršeno je na uzorcima od po 50 ili 100 semena, a

kao kriterijum je korišćena dužina radikule veća od 2 mm (Schopfer and Plachy 1984).

26

3.3. Gajenje biljaka in vitro

Isklijale biljčice (4 dana stare), sa potpuno razvijenim kotiledonima, postavljane

su na hranljive podloge i gajene pod različitim fotoperiodskim režimima 15, 65, ili 68

dana.

3.3.1. Hranljive podloge:

Podloge za gajenje biljaka sadržale su MS mineralni rastvor (Murashige and

Skoog 1962), saharozu (5%), agar (0.7 %), inozitol (100 mg/l). pH podloge je

podešavan na 5.7 pre sterilizacije.

Tabela M2:

Makroelementi (mg/l) Mikroelementi (mg/l)

NH4NO3 1650 MnSO4 x 4 H2O 22.3

KNO3 1900 ZnSO4 x 7 H2O 8.6

CaCl2 x 2H2O 440 H3BO3 6.2

MgSO4 x 7H2O 370 KJ 0.83

KH2PO4 170 Na2MoO4 0.25

CuSO4 x 5 H2O 0.025

CoCl2 x 6 H2O 0.025

Na2FeEDTA x 2 H2O 37.2

FeSO4 x 7 H2O 27.8

Vitamin B1 0.1

Vitamin B6 0.5

Nikotinska kiselina 0.5

Glicin 2.0

U različitim eksperimentima su korišćeni:

- giberelna kiselina (GA3) (3 mM, 15mM, 30 mM)

- natrijum nitroprusid (SNP) (10, 50, 100, 150 M)

27

28

- kalijum cijanid (KCN) (10, 50, 100, 200,1000 μM)

- karboksi PTIO (cPTIO) (50, 100, 200 μM)

3.3.2. Različiti fotoperiodski režimi na kojima su gajene

biljke C. rubrum in vitro

1. 17 dana kontinualna svtlost (KS) (24h svetlost + 48 dana 14h/10h fotoperiod

2. 65 dana 14h/10h fotoperiod

3. 68 dana KS

4. 68 dana neprekidni mrak (24h mrak)

5. 6 dana 8h/16h fotoperiod + 62 dana 16h/8h fotoperiod

6. 6 dana 14h/10h fotoperiod + 62 dana 16h/8h fotoperiod

7. 68 dana 8h/16h fotoperiod

8. 68 dana 14h/10h fotoperiod

9. 68 dana 16h/8h fotoperiod

10. 15 dana 14h/10h fotoperiod

11. 6 dana 14h/10h fotoperiod + 9 dana 18h/6h fotoperiod.

3.3.3. Praćenje rastenja, cvetanja i sazrevanja semena

Parametri:

- merena je visina biljaka,

- određivan je broj listova,

- određivano je cvetanje (kao kriterijum za cvetanje korišćen je potpuno

formiran cvet),

- određivan je broj biljaka sa sazrelim semenima,

- određivan je broj zrelih semena, i njihova masa nakon mesec dana sušenja,

- određivan je procenat klijanja dobijenih semena.

3.4. Određivanje aktivnosti antioksidativnih enzima

3.4.1. Ekstrakcije

Analizirani su semena, klijanci, i nadzemni deo biljke i koren. Uzorci su

zamrzavani u tečnom azotu, i cuvani na – 70 C, do pocetka ekstrakcija. Cela samena

i/ili /klijanci (dobijeni od 0.05 – 0.5 g suvog semena po uzorku), ili cele biljke bez korena

(0.2g) su sprašivani u tecnom azotu. Zaleđeni prah je dodavan u 2cm3 ekstrakcionog

pufera (0.25 M saharoza, 0.05 M Tris i 1 mM EDTA, pH 7.4). Posle centrifugiranja (15

min na 900 g), supernatant je korišćen za određivane aktivnosti POD, SOD i CAT, kao i

za merenje glutationa.

3.4.2. Određivanje aktivnosti superoksid dismutaza (SOD)

SOD aktivnost je određivana spektrofotometrijski:

a) po Misra and Fridowich (1972): merenjem procenta SOD-indukovane

inhibicije autooksidacije adrenalina na baznom pH, u ukupnoj zapremini od 3 cm3.

Rastvor adrenalina (0.3 mM adrenalina u 0.1M HCl) je pripreman pred merenje. Radna

mešavina: 0.05 M natrijum karbonatnog pufera pH 10.2, 0.1 mM EDTA, 0.1 cm3

rastvora adrenalina i različite količine enzima. Autooksidacija adrenalina je praćena

pomoću spektrofotometra Shimadzu UV’160 (Kyoto, Japan) na 480nm, tokom 10 min

na 26 - 30 C.

b) po McCord and Fridovich (1969) – Citohrom c test: na 550nm, 5min pri 25 C.

Pufer: 50mM kalijum fosfatni pufer pH7.8, 1mM EDTA, 0.02mM NaN3. Elucioni pufer:

kalijum fosfatni pufer pH 7.0 (100 mM). Ksantin 0.5mM (100 μl) + citohrom c 200mM

(50 μl) + ksantin oksidaza (11 μl/ml pufera) (50 μl) + ekstrakt, merenje apsorbancije na

na 550nm, 5min pri 25 C.

3.4.3. Određivanje aktivnosti peroksidaza (POD)

POD aktivnost je određivana spektrofotometrijski (na 470 nm) sa gvajakolom

29

30

kao supstratom u ukupnoj zapremini od 3 cm3. Radni rastvor je sadržao 50 mM

acetatni pufer pH 5.5, 92 mM gvajakol, 18 mM H2O2 i različite količine enzima.

Aktivnost je izračunavan iz ekstincionog koeficijenta za gvajakol 25.5 mM-1cm-1.

Izoelektro fokusiranje solubilnih POD: Solubilni POD izoenzimi su razdvajani

na pH gradijentu od 3 do 9 (korišćenjem 3% rastvora amfolita) na 7.5%

poliakrilamidnom gelu. Izoenzimi su bojeni na gelu sa 0.03 mM 4-hloro-1-naftol i 5 mM

H2O2 u Na-acetatnom puferu pH 5.5 10 min na 25 C.

3.4.4. Određivanje aktivnosti katalaze (CAT)

CAT aktivnost je određivana:

a) korišćenjem Clark polarografske elektrode na 28 C. Ekstrakt semena (0.2

cm3) je dodavan u 0.96 cm3 0.1 M Tris pH7.6 i oslobađanje kiseonika je inicirano sa

0.02 cm3 0.1 M H2O2. Stepen oslobađanja O2 je izračunavan i izražavan kao količina

oslobođenog O2 po minutu i mg proteina.

b) spektrofotometrijski na 240 nm, jedinica (U) definisana kao količina enzima

koja razlaže 1 μmol H2O2 po minuti na 25 C i pH 7.0.

U zapreminu od 3 ml u 100 mM kalijum natrijum fosfatnom pufer pH 7.0 dodaje

se H2O2 da absorbancija bude 0.850 nm, od 10 – 50 μl uzorka i meri se smanjenje

absorbancije na 240nm. Ekstincioni koeficijent za peroksid je 4.32 μM -1cm-1.

3.5. Određivanje koncentracije proteina

Koncentracija proteina je određivana

a) Bradford metodom (1976) sa goveđim serum albuminom kao standardom.

Rastvori:

1. Koncentrovana boja, Comassie brilliant blue G-250 (CBB G-250):

CBB G-250 (100 mg)

95% etanol (50 ml)

H3PO4 (100 ml)

H2O (do 200 ml)

2. Bradford-ov reagens:

Rastvor 1. (100 ml)

H2O (do 500 ml)

Reakciona smesa: 100 μl uzorka rastvorenog u puferu + 5 ml rastvora 2., stoji 5

min. Meri se absorbancija na 595 nm. Standardna prava se pravi sa BSA.

b) Modifikovanom metodom po Lowry et al. (1951):

100 μl ekstrakta se istaloži sa 10 μl 72 % TCA (15 mim), centrifugira se

20 min 10000g, talog se rastvara u 100 μl 0.8 M NaOH.

Lowry rastvor:

1. 2% rastvor Na2CO3 u 0.1 M NaOH (98 ml)

2. 1% rastvor CuSO4 x 5H2O (1 ml)

3. 2% rastvor KNa tartarat (1 ml)

Reakciona smeša: 150 μl Lory rastvora + 10 μl uzorka rastvorenog u NaOH (15

min) + 30 μl folin-ciocaltenovog reagensa (1x razblaženog) (30 min). Merena je

absorbancija na 260 nm. Standardna kriva je rađena sa BSA.

3.6. Razdvajanje proteina

Razdvajanje proteina vršeno je natrijum dodecilsulfat poliakrilamid gel

elektroforezom (SDS-PAGE) po Laemmli – ju (1970):

Analiziran je sastav proteina semena (0.03 g suvih semena, imbibovanih u

mraku 2.5h).

31

Ekstrakcioni pufer: 0.25 M saharoza, 0.05 M Tris, 1 mM EDTA, pH 7.4).

10% akrilamidni gel za razdvajanje (1.5 M Tris HCl pH 8.8, 30% akrilamid, 10%

SDS, 10% amonium persulfat, TEMED).

4% gel za koncentrovanje (1 M Tris-HCl, pH 6.8, 30% akrilamid, 10% SDS, 10%

amonium persulfat, TEMED).

Pufer za elektroforezu: 0.025 M Tris, 0.192 M Gly, 0.1 % SDS pH 8.3.

Pufer za obradu uzorka: 0.0625 M Tris HCl pH 6.8, 10% glicerol, 2% SDS,

0.002% brom fenol plavo, 5% β-ME.

Rastvor boje: 0.1% CBB G-250, 50% metanol, 10% sircetna kiselina.

Rastvor za obezbojavanje gela: 5% metanol, 7% sircetna kiselina.

Relativna vrednost intenziteta traka, određivana je softverskim paketom Image

Master Totallab verzija 1.11.

3.7. Glutation

Glutation je određivan po Griffith-u (1980). Ekstrakt semena je mešan sa duplom

zapreminom 5% 5-sulfosalicilne kiseline i centrifugiran 10 min na 2500 g. Pripremana

su 3 radna rastvora u puferu (125 mM kalijum fosfata, 6.3 mM EDTA, pH 7.5).

Rastvor 1. - 0.3 mM NADPH

Rastvor 2. – 6 mM 5.5-ditio-bis (2-nitrobenzoeva kiselina) (DTNB)

Rastvor 3. - 5 V/cm3 glutation reduktaze.

Za određivane ukupnog glutationa, mešani su 0.7 cm3 rastvora 1., 0.1 cm3

rastvora 2. i 0.2 cm3 ekstrakta. Reakcija je započinjana sa 0.01 cm3 rastvora 3., i

pećena na 30 C merenjem promena absorbancije na 412 nm tokom 2 min. Oksidovani

glutation (GSSG) je određivan derivatizacijom tiol grupe u redukovanom glutationu

(GSH) sa 2-vinilpiridinom u slabo kiselom rastvoru. GSH je određivan preko razlike dve

vrednosti.

3.8. Askorbat (AA) i dehidroaskorbat (DHA)

32

Cela semena i/ili klijanci su zamrzavani u tečnom azotu i ekstrahovani u 1 cm3

5% perhlorne kiseline. Homogenat je centrifugiran 10 min na 12000g i supernatant je

neutralisan sa 5 M kalijum karbonata do pH 5.6. Posle centrifugiranja 2 min na 12000

g, u ekstraktu je mereno opadanje absorbancije na 265 nm (Hewitt and Dickes 1961)

po dodavanju askorbat oksidaze (1U) iz Cucurbita-e (Sigma, St louis, USA) u mešavinu

koja sadrži 0.1 M kalijum fosfatni pufer (pH 5.6) i ekstrakt u ukupnoj zapremini od 3

cm3. DHA je meren kao AA posle redukcije ditiotreitolom (DTT). Reakcija je

započinjana dodavanjem 0.02 cm3 1 mM DTT u mešavinu (0.15 M kalijum fosfatni

pufer pH 7.6 i ekstrakt u ukupnoj zapremini od 3 cm3). AA i DHA koncentracije su

izračunavane korišćenjem koeficijenta absorbancije za askorbat na 262 nm (14.3 mmol-

1 cm-1).

3.9. ABTS – test

Korišćena je metoda po Arnao et al. (1999). Reakciona smesa sadržala je 2mM

ABTS, 15 M vodonik peroksida i 0.25 M HRP u 50 mM fosfatnog pufera (pH 7.5) u

ukupnoj zapremini 1 ml, na temperaturi od 24 - 26 C. Reakcija je praćena na 730 nm,

na UV 2501 PC Shimadzu spektrofotometru do stabilizovanja absorbancije, dobijene

formiranjem ABTS radikala. Tada su dodavane različite količine L-askorbinske kiseline,

ili drugih antioksidanasa, i određivano je smanjenje absorbancije, u vremenu od 130

sekundi, uključujući generisanje ABTS radikala izazvanog peroksidazom. Ukupna

antioksidativna aktivnost je izračunavana kao koncentracija, izražena u ekvivalentima

askorbinske kiseline (mol/l) (standard), koja proizvodi isti antioksidativni efekat kao

ispitivani uzorak.

Korišćena je peroksidaza iz rena (HRP). Koncentracija enzima je određivana

merenjem absorbancije na 430 nm ( = 100 mM-1cm-1). Koncentracija ABTS (2,2-

azino-bis-(3-etil-benztiazolin-6-sulfonic acid), određivana je na osnovu ekstinkcionog

koeficijenta 340nm = 36 mM-1cm-1, a vodonik peroksida 340nm = 43.6 mM-1cm-1 i L-

askorbinske kiseline 340nm = 2.8 mM-1cm-1.

33

34

3.10. Statistička obrada podataka

Dobijeni rezultati analizirani su statističko-grafičkim paketom STATGRAPHICS,

verzija 4.2 (STSC Inc. and Statistical Graphics Corporation, 1985 -1989, USA),

analizom varijanse, procedura ANOVA, uz „multiple range“ testove bazirane na

confidens limitima, na nivou značajnosti p<0.05, ili neparametarskim Mann-Whitney

rang testom iz programskog paketa Axum 5.0 (version for Windows, Lucent

Technologies, USA). Grafička obrada podataka je delimično urađena i korišćenjem

programa Excel iz programskog paketa Microsoft Office 2003.

4. Rezultati i diskusija

4.1. Aktivnosti antioksidativnih sistema u toku

vegetativne i reproduktivne faze razvića

C. rubrum in vitro

Kao što je u uvodu pomenuto, neprekidna produkcija i uklanjanje reaktivnih vrsta

kiseonika (ROS) je, osim kao pojava sa negativnim posledicama (oštećenja ćelijskih

membrana i organela), povezana i sa signalnom ulogom u procesima rastenja i razvića

biljaka (Elstner 1982, Hendry and Crawford 1994). Antioksidativni enzimi, katalaza

(CAT), superoksid dismutaze (SOD) i peroksidaze (POD), učestvuju u uklanjaju

superoksid radikala (O2-) odnosno vodonik peroksida (H2O2) (Van Loon 1986, Bowler et

al. 1992, Khan and Panda 2002), čime učestvuju u regulaciji procesa u toku rastenja i

razvića biljaka ili odgovora na patogene ili abiotički stres. Uloge CAT, SOD i POD

potvrđene su u svim fazama razvića biljaka, od sušenja semena, preko klijanja, do

rastenja i razvića. U uklanjanje H2O2 uključen je i oksido-redukcioni sistem

antioksidativnih metabolita, askorbat i glutation (Asada 2006).

4.1.1. Aktivnosti antioksidativnih sistema tokom

klijanja semena C. rubrum

Klijanje semena započinje imbibicijom, a završava se početkom izduživanja

embrionove osovine, najčešće radikule. U fiziološkom smislu, može se podeliti u tri

faze: imbibiciju (brzo inicijalno usvajanje vode, kao fizički proces karakterističan i za

suva semena), plato fazu (koja podrazumeva male promene sadržaja vode, ali visoku

metaboličku aktivnost) i fazu daljeg povećavanja sadržaja vode i istovremeno probijanje

radikule i rastenje (Giba et al. 2004). Plato faza, kao najznačajnija sa stanovišta

35

regulacije klijanja, uključuje aktivaciju specifičnih enzima u odgovarajuće vreme i

regulaciju njihove aktivnosti (Roberts 1972, Riley 1987).

4.1.1.1. Klijanje semena C. rubrum

Pratili smo klijanje do 4. dana, što predstavlja prvi plato na sigmoidalnoj krivoj

klijanja ovih semena (semena sakupljena sa biljaka gajenih tokom leta, stara 3 godine)

tj. obuhvata deo populacije semena koja najranije klijaju. Do probijanja radikule došlo je

trećeg dana od početka imbibicije, da bi 4. dana klijalo 34% semena.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Kli

jan

je (

%)

Vreme (dani)

*

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10H2O

GA3

1 2 3 4

*

Grafikon R1: Efekat GA3 (160 M) na početne faze klijanja semena C. rubrum; * - zvezdicom označene statistički značajne razlike (p<0.05) procenta klijanja u odnosu na klijanje u vodi trećeg dana.

GA3 (160 M) inhibira klijanje, ali ne značajno (grafikon R1). Kod semena nekih

drugih biljaka (Satureja montana, Potosporum eugenoides, P. tenuifolium, P.

crassifolium), GA3 u istoj koncentraciji, nije imao efekta na klijanje (Moore et al. 1994,

Boscagli and Sette 2001).

4.1.1.2. Aktivnosti CAT, POD i SOD tokom klijanja semena C. rubrum

Sadržaj proteina (grafikon R2), kao i aktivnost CAT, SOD i POD (grafikon R3),

varirali su na sličan način kod semena isklijavanih na vodi i u rastvoru GA3.

36

Koncentracija proteina je rasla tokom imbibicije u destilovanoj vodi, s obzirom da

se proteini u klijajućim semenima sintetišu de novo, kao gradivni i regulatorni materijal

(Roberts 1972). Izoelektroforegram ukupnih proteina takođe pokazuje porast kako

kiselih tako i baznih proteina tokom klijanja (Slika R1), s tim što je promena izraženija

kod kiselih. Trake sa pI oko 4 i 8.8 su prisutne tokom čitavog praćenog perioda, dok se

4. dana klijanja broj proteinskih traka povećava i kod tretiranih i netretiranih

semena/klijanaca. Nove trake se pojavljuju između pI 4.6 i 5.1.

0

2

4

6

8

10

12

14K

on

cen

trac

ija p

rote

ina

[mg

g-1

(d

.w.)

]

o

*

*

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10H2O

GA3

Klijanje (dani)

1 2 3 4

Grafikon R2: Sadržaj

proteina tokom klijanja C. rubrum u destilovanoj H2O ili GA3 (160 M); * - zvezdicom označene statistički značajne razlike (p<0.05) u odnosu na klijanje u vodi prvog dana, o – kružićem označene statistički značajne razlike (p<0.05) u odnosu na klijanje u destilovanoj vodi istog dana.

Kod kontrolnih semena nije bilo značajnog variranja aktivnosti CAT (grafikon R3

a) tokom klijanja, dok je aktivnost SOD opadala (grafikon R3 b). POD aktivnost nije bilo

moguće detektovati spektrofotometrijski tokom prva 2 dana imbibicije (grafikon R3 c).

Izmerena je 3. dana, da bi četvrtog dana došlo do značajnog povećanja POD aktivnosti

kod obe grupe semena (klijalih u vodi i rastvoru GA).

Na zimogramu solubilnih POD, detektiovani su i anjonski i katjonski izoenzimi. Iz

grupe anjonskih POD, izoenzim sa pI vrednošću oko 4, prisutan je tokom sva 4 dana

imbibicije, dok se dva izoenzima sa pI vrednostima oko 4.6 javljaju tek 4. dana.

Katjonski izoenzim sa pI vrednošću oko 8.5 je prisutan sve vreme, dok se izoenzim sa

pI vrednošću oko 8.8 pojavljuje, takođe, 4. dana (Slika R1). Nije uočena razlika između

POD zimograma semena imbibovanih na destilovanoj vodi i onih u rastvoru GA3.

Dobijeni rezultati pokazuju da CAT i SOD pikovi prethode POD maksimalnoj

aktivnosti. CAT i SOD pokazuju maksimalnu aktivnost u vreme pred izbijanje radikule

37

38

(grafikon R3), dok se značajna POD aktivnost uočava posle tog perioda. Gidrol et al.

(1994) je uočio da je pik aktivnosti SOD u ranim fazama imbibicije semena soje praćen

pikovima aktivnosti CAT i POD.

Grafikon R3: Aktivnosti a) CAT, b) SOD i c) POD tokom klijanja C. rubrum u destilovanoj H2O ili GA3 (160 M); * - zvezdicom označene statistički značajne razlike (p<0.05) u odnosu na prvi dan, o – kružićem označene statistički značajne razlike (p<0.05) u odnosu na klijanje u destilovanoj vodi istog dana, za grafikon pod c) * - zvezdicom označena značajna razlika (p<0.05) u odnosu na 3. dan.

spektofotometrijski tokom prva dva dana imbibicije, jedan kiseli i jedan bazni izoenzim

Aktivnost POD pokazuje različitu kinetiku u toku klijanja semena C.rubrum, u

poređenju sa CAT i SOD (grafikon R3). Iako POD aktivnost nije mogla biti detektovana

0

5

10

15

20

25

30

CA

T [

U m

g-1

pro

tein

-1] *

o

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10H2O

GA3

a

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

SO

D

[U m

g-1

pro

tein

-1]

*o

* *

b

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

PO

D [

U m

g-1

pro

tein

-1 ]

**

Klijanje (dani)1 2 3 4

c

je detektovan na zimogromu tokom čitavog perioda klijanja (slika R1 b), zbog veće

osetljivosti ovog metoda u odnosu na spektrofotometrijski metod. Značajno povećanje

aktivnosti POD 4. dana klijanja (grafikon R3 c) odgovara ekspresiji novih izoenzima na

zimogramu (slika R1 b).

Morohashi (2002) je pokazao da se POD aktivnost u semenu paradajza javlja

neposredno pred izbijanje radikule, i značajno raste posle toga. Mitchell and Barrett

(2000) su pronašli 3 tipa POD na zimogramu semena/klijanaca Viola carnuta, koji su se

postepeno pojavljivali tokom klijanja. Schopfer i saradnici (2001), su pokazali da se

tokom klijanja semena rotkve, POD aktivnost javlja sa pojavom radikule i značajno se

pojačava sa razvićem klijanca. I kod Brassica oleracea (Belani et al. 2002), je

pokazano da se POD aktivnost povećava u kasnijim fazama klijanja i ranim fazama

rastenja klijanaca. I naši rezultati pokazuju da se POD izoenzimi postepeno pojavljuju

tokom klijanja semena C.rubrum, i da je povećanje POD aktivnosti posle probijana

radikule povezano sa de novo produkcijom izoenzima.

Slika R1: Izoelektrofokusiranje proteina a) i peroksidaznih izoenzima b) tokom klijanja C.rubrum. Svaka traka sadrži 0.02 cm3 ekstrakta. Slika je sastavljena iz reprezentativnih različitih gelova; (-), (+) – netretirana i GA3 tretirana semena.

4.1.1.3. Koncentracije glutationa i askorbata tokom

klijanja semena C. rubrum

39

U toku prva 2 dana klijanja nije bilo značajnih variranja u koncentracijama GSH,

GSSG i ukupnog glutationa (grafikon R 4), nezavisno od toga da li se klijanje dešavalo

u vodi ili rastvoru GA3. Trećeg dana, došlo je do značajnog porasta sva tri parametra,

praćeno značajnim padom 4. dana (grafikon R4). Preko 80% pula glutationa je prisutno

u redukovanom stanju. Dobijeni rezultati pokazuju da se glutation sistem (grafikon R4)

u klijajućim semenima ponaša drugačije od aktivnosti antioksidativnih enzima (grafikon

R3). Maksimalan sadržaj ukupnog glutationa, kako i njegove oksidovane i redukovane

forme, je izmeren trećeg dana klijanja, kako kod semena klijalih u vodi tako i u rastvoru

GA3, što odgovara vremenu izbijanja radikule.

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

GS

SG

[

mo

l g

-1 (d

.w.)

]

*

*

o

H2O

GA3

a

Grafikon R4: Sadržaj a) GSSG, b) GSH, i c) ukupnog glutationa, tokom klijanja u destilovanoj H2O ili GA3 (160 M); * - zvezdicom označena značajna razlika (p<0.05) u odnosu na prvi dan, o – kružićem označena značajna razlika (p<0.05) u odnosu na klijanje u destilovanoj vodi istog dana.

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

GS

H [

mo

l g

-1 (d

.w.)

]

*

*

*

b

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

Uku

pn

i g

luta

tio

n [

mo

l g

-1 (d

.w.)

]

* *

Klijanje (dani) 1 2 3 4

c

40

Tomasi et al. (2001), takođe je uočio povećanje glutationa tokom prva 24h

klijanja semena bora, što je bilo praćeno njegovim padom. Odnos GSSG/GSH može

biti senzitivan indikator stresa (May et al. 1998). Više koncentracije GSH nego GSSG

tokom klijanja C.rubrum predstavlja indikator visokog antioksidativnog kapaciteta.

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

Ask

orb

at [

mo

l g

-1 (d

.w.)

]

H2O

GA3

a

Grafikon R5: Sadržaj a) askorbata i b) dehidroaskorbata tokom klijanja C. rubrum u destilovanoj H2O ili GA3 (160 M)

Klijanje (dani)

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

Deh

idro

asko

rbat

[

mo

l g

-1 (d

.w.)

]

b

1 2 3 4

Askorbat je detektovan samo 2. dana klijanja, pred izbijanje radikule. DHA je

prisutan sve vreme posmatranog perioda klijanja (grafikon R5). Ni drugi autori nisu

detektovali AA na početku imbibicije, dok je, u početnim fazama klijanja (Tommasi et al.

2001) i neposredno pred izbijanje radikule (Pallanca i Smirnoff 1999), primećen porast

AA koncentracije.

4.1.1.4. Efekat giberelina na aktivnosti antioksidativnih sistema

tokom klijanja C. rubrum

41

Iako GA3 (160 M) nije imao efekta na klijanje (grafikon R1), pokazivao je efekat

na određene antioksidativne parametre, u određenim fazama klijanja. Značajno

povećanje CAT i SOD aktivnosti (grafikon R3 a, b) i odgovarajući pad sadržaja proteina

(grafikon R2) kod semena imbibovanih u rastvoru GA3, drugog dana imbibicije, može

da ukaže na to da ovaj hormon deluje na metabolizam H2O2 i O2- u vreme pred izbijanje

radikule.

Koncentracija proteina u semenima tretiranim sa GA3, je značajno opadala

drugog dana imbibicije, a rasla je 3. i 4. dana (grafikon R2).

Činjenica da nije bilo razlike u POD izoelektroforetskom uzorku između

semena/klijanaca klijalih na vodi i na GA3, pokazuje da GA3 ne utiče na sintezu novih

POD izoenzima (Slika R1). 160 M GA3, je pomerao vreme pojave maksimalne

aktivnosti POD na vremenskoj skali (grafikon R3 c)

Značajno niža koncentracija GSSG kod semena klijalog na GA3, 4. dana klijanja

(grafikon R4) može biti posledica smanjene produkcije slobodno radikalskih vrsta posle

probijanja radikule. GA3 nije pokazao značajan efekat na glutation sistem (grafikon R4),

dok je indukovao opadanje sadržaja AA (grafikon R5 a) i DHA 2. dana klijanja (grafikon

R5 b).

Nema mnogo podataka koji se odnose na efekat GA3 na metabolizam ROS.

Schopfer et al. (2001) je pokazao da je, u slučaju klijanja rotkve, inhibicija produkcije

ROS izazvana tamno crvenom svetlošću i abscisinskom kiselinom, reverzibilna sa GA3.

Bethke et al. (2000) je objavio da su protoplasti aleuronskog sloja ječma tretirani sa

GA3 manje sposobni da metabolišu ROS, dok je Jones (1986) utvrdio da GA3 stimulira

produkciju peroksida u aleuronskom sloju ječma.

Tabela D1: Sekvencijalna ekspresija antioksidativnih sistema tokom klijanja semena C. rubrum.

Pre izbijanja

radikule U vreme izbijanja

radikule Posle izbijanja

radikule CAT maksimum aktivnosti SOD maksimum aktivnosti POD pojava aktivnosti porast aktivnosti AA detektovan

DHA maksimum aktivnosti GSH i GSSG maksimum aktivnosti

42

43

Tokom klijanja semena C. rubrum dolazi do sekvencijalne ekspresije antioksidativnih sistema (tabela D1). Pred izbijanje radikule catalaza (CAT), superoksid dismutaze (SOD) i dehidroaskorbat (DHA) pokazuju maksimalnu aktivnost, a askorbat (AA) je detektovan samo u to vreme. Maksimalan sadrzaj ukupnog glutationa, kao i redukovane (GSH) i oksidovane forme (GSSG) je izmeren u vreme izbijanja radikule, kada se javlja i peroksidazna (POD) aktivnost i raste posle tog perioda.

GA3 (160 μM) je suboptimalna za klijanje, indukuje porast aktivnosti CAT i SOD u vreme pred izbijanje radikule, i pad koncentracije AA i DHA, a ne utiče na glutation i POD aktivnost tokom klijanja C. rubrum.

4.1.2. Efekat starosti semena Chenopodium rubrum na

antioksidativni status semena, klijanje, rastenje i cvetanje

Starenje semena je praćeno gubljenjem vijabilnosti (Maguire 1972), tj.

produžavanjem vremena potrebnog za početak klijanja (Villers 1972). To je spoljašnji,

sumarni pokazatelj nagomilanih promena na hromozoma, membranama, proteinima

(time i enzimskim strukturama), tokom mirovanja semena. Ove promene

prouzrokovane su reaktivnim vrstama kiseonika (Villers 1972, Murthy and Sun 2000,

Schopfer et al. 2001) i posledica su nemogućnosti reparacionih mehanizama da

funkcionišu u suvom semenu (Villers 1972). Odloženo klijanje kod starih semena može

se tumačiti periodom potrebnim za popravke oštećenja nastalih delovanjem ROS

(Villers 1972). Samo klijanje obuhvata aktivaciju specifičnih enzima u vremenu i

regulaciju njihove aktivnosti (Roberts 1972, Riley 1987). Antioksidativni enzimi, SOD,

POD i CAT, i oksido-redukcioni sistem askorbata i glutationa učestvuju u uklanjaju

aktivnih vrsta kiseonika (Van Loon 1986, Bowler et al. 1992, Khan and Panda 2002).

4.1.2.1. Efekat starosti semena na klijanje C. rubrum

Testirana su semena različite starosti: 3 meseca, 3 godine i 12 godina. Procenat

klijanja sedmog dana nije bio značajno niži (65.5 %) kod 3 godine starog semena u

odnosu na (75 %) kod 3 meseca starog semena (grafikon R6), dok je procenat isklijalih

semena starih 12 godina bio svega 4 %. Međutim, klijanje 3 godine starih C. rubrum

semena je bilo odloženo u odnosu na 3 meseca stara semena (33.5 % u odnosu na 67

%, četvrtog dana od početka imbibicije), što potvrđuje smanjivanje vijabilnosti sa

starenjem semena (Torres et al. 1989, Villers 1972). I kod semena Phaseolus vulgaris

je pokazano da usled starenja dolazi do smanjenog procenta klijanja (Machasdo Neto

et al. 2001).

Efekat giberelina: iako su giberelini (GA3, GA4, GA7), obično efikasni u prekidu

dormancije kod velikog broja vrsta, kao i u stimulaciji klijanja kod nedormantnih semena

(Bewley and Black 1982), mi smo pokazali da na klijanje 3 godine starih semena C.

rubrum 160 M GA3 nema efekta (Dučić et al. 2003/4). I kod nekih drugih biljnih vrsta

44

tretman giberelinom nije imao efekta na klijanje (Moore et al. 1994, Boscali et al. 2001,

Jovanović et al. 2005).

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Vreme (dani)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Kli

jan

je (

%)

3 godine stara semena

3 meseca stara semena

* *

*

12 godina stara semena

*

* * * * *

Grafikon R6 : Efekat starosti semena na klijanje C.rubrum; * - statistički značajno (p<0.05) u odnosu na semena stara 3 meseca.

4.1.2.2. Efekat starosti semena na rastenje i cvetanje C. rubrum

Biljke dobijene od semena starog 3 meseca u poređenju sa onima dobijenom od

semena starog 3 godine, značajno su se razlikovale po svim parametrima rastenja, kao

i cvetanju, posle 15 dana gajenja in vitro na 6(14h/10h) + 9(18h/6h) fotoperiodu.

(grafikon R7). Hipokotili kontrolnih biljaka, poreklom od 3 meseca starog semena, bili

su 2.5 puta duži (grafikon R7 a), dužina prve internodije 8 puta veća (grafikon R7 b),

dok je broj listova bio 2 puta veći (grafikon R7 c), u odnosu na biljke poreklom od 3

godine starih semena. Cvetalo je 81 % biljaka poreklom od 3 meseca starog semena u

odnosu na svega 14 % onih koje potiču od 3 godine starog semena (grafikon R7 d).

Slično je primećeno i kod biljke Phaseolus vulgaris, gde je uočena veliko variranje u

efektu mesečeve svetlosti na cvetanje u različitim eksperimentima u kojima je

korišćeno seme sve veće starosti (Kadman-Zahavi and Peiper 1987).

Efekat giberelina: GA3 ima jači stimulatorni efekat na rastenje i cvetanje biljaka

poreklom od 3 godine starog semena nego na biljke poreklom od 3 meseca starog

semena (grafikon R7). GA3 stimulira izduživanje hipokotila (grafikon R7 a) i prve

internodije (grafikon R7 b), i povećava broj listova (grafikon R7 c) biljaka poreklom od 3

godine starog semena, dok kod biljaka poreklom od 3 meseca starog semena stimulira

samo izduživanje prve internodije, bez efekta na ostale parametre rastenja.

45

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Hip

ok

oti

l (m

m)

3 meseca stara semena3 godine stara semena

*

o

o* o

*

o*

a

Grafikon R7: Efekat GA3 na a) dužinu hipokotila, b) dužinu prve internodije, c) broj pravih listova, d) cvetanje, biljaka C.rubrum poreklom od semena starog 3 meseca i 3 godine , gajenih in vitro, na MS podlozi bez šećera;

0

2

4

6

8

10

12

14

16

1.

inte

rno

dij

a (

mm

)

o*

o*

**

o

o

o

b

° - statistički značajno (p<0.05) u odnosu na kontrolu, * - statistički značajno (p<0.05) u odnosu na biljke dobijene od semena starog 3 meseca.

0

1

2

3

4

5

Bro

j li

sto

va

o*

*

**

c

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Cve

tan

je (

%)

0 3 15 30

GA3 (mM )

o

o*

o*

*

*

d

Takođe je uočeno da je razlika u procentu cvetanja biljaka poreklom od semena

različite starosti (grafikon R7d), značajno manja na podlogama sa GA3. Na podlozi sa

15 mM GA3 cveta 68% biljaka dobijenih od 3 godine starog semena i 94% biljaka

46

dobijene od 3 meseca starog semena. Ranije je pokazano da GA3 stimulira cvetanje,

kako kod C.rubrum (Živanović et al. 1995), tako i kod C.murale (Mitrović et al. 2000).

4.1.2.3. Efekat starosti semena C. rubrum na antioksidativni status semena

Kako smo utvrdili značajne razlike u pogledu klijanja semena različite starosti

(grafikon R6), kao i rastenju i cvetanju biljaka poreklom od tih semena (grafikon R7),

pokušali smo da utvrdimo da li su osnove ovih razlika u vezi sa promenama

antioksdativnog statusa semena izazvanog starenjem.

Aktivnosti SOD, POD, i CAT i određivanje glutationa, vršeno je u uzorcima od po

0.5 g suvog semena, starog 3 i 12 godina, posle 2.5h imbibicije u destilovanoj vodi.

Starost semena (godina)

0

2

4

6

8

10

12

Ko

nce

ntr

acija

pro

tein

a [m

g/g

dw

]

3 12

*

Grafikon R8: Sadržaj proteina u semenima C.rubrum različite starosti, posle 2,5h imbibicije; * - statistički značajno (p<0.05) u odnosu na semena stara 3 godine.

Sadržaj proteina, kao i CAT i SOD aktivnost, su bili značajno niži u semenima

starim 12 godina, u odnosu na semena stara 3 godine (Grafik R8, R9). Sadržaj proteina

je viši u mlađim semenima, jer se proteini sintetišu de novo tokom imbibicije (Roberts

1972), što ukazuje da su mlađa semena potentnija, odnosno da količina proteina može

biti pokazatelj starosti semena.

POD aktivnost nije detektovana ni kod mladih ni starih semena, što je u skladu

sa ranijim podacima (Dučić et al. 2003/4), gde je pokazano da je POD aktivnost ispod

nivoa detektovanja u prvih 48 sati imbibicije, a javlja se trećeg dana od početka

imbibicije, neposredno pred izbijanje radikule, što je u vezi sa de novo sintezom

izoenzima.

47

48

Grafikon R9: Aktivnosti katalaze i superoksid dismutaze u semenima C.rubrum različite starosti, posle 2,5h imbibicije; a) izražene na gram suve mase, b) izražene na mg proteina; *- statistički značajno (p<0.05) u odnosu na semena stara 3 godine.

Grafikon R10: Sadržaj glutationa u semenima C.rubrum različite starosti, posle 2,5h imbibicije; * - statistički značajno (p<0.05) u odnosu na 3 godine stara semena.

CAT i SOD aktivnost, izražene, kako na suvu masu (dw), tako i na miligram

proteina (U/mg proteina), pokazuju višu aktivnost u mladim semenima (grafikon R9 a,

b), ukazujući takođe, na veći antioksidativni potencijal mlađih semena. Kada je praćeno

klijanje semena C.rubrum, najveća aktivnost CAT i SOD je primećena u vreme

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

En

zim

ska

ak

tivn

ost

[U

/g d

w]

3 godine stara semena

12 godina stara semena

**

a

0

2

4

6

8

10E

nzi

msk

a a

kti

vno

st [

U/m

g p

rote

ina

]

CAT SOD

* *

b

GSSG + GSH GSSG GSH0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Ko

nc

en

tra

cij

a g

luta

tio

na

[m

ol/g

dw

]

3 godine stara semena

12 godina stara semena

*

*

49

neposredno pred izbijanje radikule (24 – 48h od početka imbibicije) (Dučić et al.

2003/4). Pik SOD aktivnosti, takođe je uočen na početku imbibicije semena soje,

praćen

cije glutationa u prvih

24h imbibicije uočen je i kod semena bora (Tomasi et al. 2001).

, SOD, k

starijeg emena, tj. s obzirom da je njihova osetljivost na GA3 različita, može se pretpostaviti da tokom tarenja semena C. rubrum dolazi do promena u endogenom metabolizmu giberelina.

pikovima aktivnosti CAT i POD (Gidrol et al. 1994).

I koncentracije GSH, GSSG i ukupnog glutationa su bile više kog mladog

semena posle 2.5h imbibicije (grafikon R10). Porast koncentra

Starost semena utiče na antioksidativni potencijal semena, klijanje, rastenje i cvetanje biljaka C. rubrum.

De novo sinteza proteina počinje kasnije tokom imbibicije kod starijih semena. Aktivnosti CATao i sadržaj glutationa su značajno niži kod starijih semena. Dobijeni rezultati pokazuju da

utvrđivanje antioksidativne aktivnosti enzima semena može biti uključena u evaluaciju njegove starosti. S obzirom da GA3 smanjuje razliku u rastenju i cvetanju između biljaka poreklom od mlađeg i s

s

4.1.3. Ukupna antioksidativna aktivnost i

aktivnosti antioksidativnih enzima u toku

vegetativnog i reproduktivnog razvića C. rubrum in vitro

Pretpostavili smo da se nivo antioksidativnih enzima, a samim tim i ukupne

antioksidativne aktivnosti (UAA) menja tokom vegetativnog i reproduktivnog razvića C.

rubrum in vitro.

Za kratkodnevnu biljku C.rubrum, fotoperiod 14h/10h je indukcioni za cvetanje, i

izlaganje svega 6 indukcionih ciklusa u fazi razvića kotiledona je dovoljno da biljke

procvetaju posle 15 dana (Živanović et al. 1995, Mitrović 1998). Kontinualna svetlost

(KS), s druge strane, predstavlja neindukcione uslove. Gajenjem jedne grupe biljaka

neprekidno, 65 dana na indukcionom 14h/10h režimu, a druge grupe prvih 17 dana na

KS, a onda na 14h/10h fotoperiodu, pokušali smo da dovoljno, na vremenskoj skali,

odvojimo faze cvetanja, zametanja semena i sazrevanja semena biljaka iste starosti, da

bismo pokušali da utvrdimo eventualne promene u ukupnoj antioksidativnoj aktivnosti i

sadržaju antioksidativnih enzima vezane za različite faze razvića. Istovremeno, glavni

izvor ROS, pored terminalne oksidacije, je transport elektrona koji se dešava tokom

fotosinteze (Asada 2006) pa se usled gajenja na kontinualnoj svetlosti očekuje

pojačana aktivnost antioksidativnih sistema.

U ovim eksperimentima, korišćena su semena dobijena na biljkama gajenim in

vitro na 16h/8h fotoperiodu, stara godinu dana. Po isklijavanju semena, 4 dana stare

biljčice su postavljane na MS podlogu sa 5% saharoze, bez hormona. Ukupna

antioksidativna aktivnost kao i aktivnosti CAT, POD i SOD, određivani su u uzorcima

(po 0.2 g) stabla sa listovima, korena (uzorci uzimani 17., 37. i 65. dana gajenja) i

semena sazrelih na biljkama (uzorci uzimani 65. dana gajenja).

4.1.3.1. Efekat različitih fotoperiodskih uslova na rastenje,

cvetanje i sazrevanje semena C. rubrum in vitro

Biljke su, pre smrzavanja u tečnom azotu, merene, a rezultati koji se odnose na

visinu, broj pravih listova i broj sazrelih semena, prikazani su na grafikonima R12 –

R14.

50

Fotoperiod 14h/10h je indukcioni za kratkodnevnu biljku C. rubrum. Biljke gajene

na ovom fotoperiodu (grafikon R11) su u vreme prvog uzimanja uzoraka za biohemijske

analize (17. dan) procvetale (100%), dok su biljke koje su prvih 17 dana gajene na KS

ostale vegetativne, a cvetanje (100%) je kod njih registrovano 37. dana kada je

uzimana druga grupa uzoraka (grafikon R11).

0

10

20

30

40

50

60

17 37 65

Vreme (dani)

Vis

ina

(mm

)

14h/10h

17d KS + 14h/10hGrafikon R11: Efekat različitih fotoperiodskih uslova na rastenje C. rubrum in vitro; KS –

kontinualna svetlost, - 100% biljaka cvetalo.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

17 37 65

Vreme (dani)

Bro

j lis

tova

14h/10h

17d KS + 14h/10h

Grafikon R 12: Efekat različitih fotoperiodskih uslova na broj listova C. rubrum gajenih in vitro; KS – kontinualna svetlost.

Interesantno je primetiti da 17. dana, kada bismo to najpre očekivali, nema

razlike u visini biljaka (grafikon R11) gajenih na 14h/10h i na KS, ali je ona uočljiva u

broju pravih listova (grafikon R12). Međutim 37. i 65. dana biljke koje su prvih 17 dana

gajene na KS a potom prebačene na 14h/10h fotoperiod su oko 2 puta više od biljaka

koje su svih 65 dana bile izložene 14h/10h fotoperiodu (grafikon R11, Slika R2). To je

svakako u vezi sa trenutkom prelaska u reproduktivnu fazu (tranzijentno zaustavljanje

rastenja u vreme cvetanja), koji je kod biljaka koje su prvih 17 dana gajene na KS bio

odložen za 17 dana.

51

52

Slika R2: Biljke C. rubrum gajene in vitro, na MS podlozi sa 5% glukoze, gajene pod različitim svetlosnim uslovima; izgled biljaka u vreme uzimanja uzoraka.

17. dan

17 dana na KS

17 dana na 14h/10h

37. dan

37dana na 14h/10h

17 dana na KS + 20 dana na 14h/10h

65. dan

65dana na 14h/10h 17 dana na KS + 48 dana na 14h/10h

Kontinualna svetlost u prvih 17 dana gajenja stimulira razviće listova u odnosu

na 14h/10h fotoperiod (grafikon R12), i ovaj efekat se zadržava i kasnije posle

prebacivanja na 14h/10h fotoperiod.

Dužina dana kojoj su biljke izložene prvih 17 dana ima efekta i na sazrevanje

semena (grafikon R13) i na njhov broj, u odnosu na neprekidno gajenje na 14h/10h

fotoperiodu. Značajno veći broj sazrelih semena je sakupljen 65. dana na biljkama koje

su prvih 17 dana bile izložene neindukcionoj KS, pa prebačene na indukcioni 14h/10h

fotoperiod od onih koje su sve vreme gajene na 14h/10h fotoperiodu (grafikon R13). S

obzirom da su ove biljke indukciju za cvetanje primile tek po prebacivanju na 14h/10h

fotoperiod, pre smo mogli očekivati da je i sazrevanje semena odloženo. Možemo da

zaključimo da je i svetlosni tretman pre indukcije cvetanja bitan za zametanje i

sazrevanje semena, a ne samo dužina dana u vreme ili posle indukcije. Ovo je

razmatrano u sledećem poglavlju (4.2.), a o čemu govori i Cook (1975).

0

1

2

3

4

5

6

17 37 65

Vreme (dani)

Bro

j zre

lih s

emen

a p

o b

iljci 14h/10h

17d KS + 14h/10h

Grafikon R13: Efekat

različitih fotoperiodskih uslova na broj zrelih semena po biljci C. rubrum gajenih in vitro, KS – kontinualna svetlost

4.1.3.2. Određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti u toku

vegetativnog i reproduktivnog razvića C. rubrum in vitro

Ukupna antioksidativna aktivnost (UAA) je parametar koji određuje kapacitet

uzorka svežeg biljnog materijala za uklanjanje slobodnih radikala. Merenje UAA

predstavlja metod koji ukupnu antioksidativnu aktivnost posmatra kao globalnu

karakteristiku uzorka, nezavisno od njenog sastava (Arnao et al. 1999). Čak i kada

bismo znali sve antioksidantne komponente nekog biljnog materijala, to ne bi

neophodno značilo da znamo i njegov antioksidativni kapacitet. Šta više, kooperativni

efekat koji može postojati između različitih antioksidanata, znači da UAA može biti veća

od zbira pojedinačnih antioksidativnih aktivnosti, ili da izolovanje neke pojedinačne

komponente neće davati sveukupnu sliku (Arnao et al. 1999).

Određivali smo ukupnu antioksidativnu aktivnost uzoraka stabla sa listovima,

korena i sazrelih semena sakupljenih na biljkama C. rubrum gajenim in vitro

korišćenjem 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), u različitim

fazama ontogeneze, pod različitim fotoperiodskim uslovima.

53

Stablo sa listovima

0

2

4

6

8

10

17 37 65

Vreme (dani)

UA

A [μ

mo

l ek

v.as

korb

./g F

W]

14h/10h

17d KS + 14h/10h

Grafikon R14: Efekat različitih fotoperiodskih uslova na ukupnu antioksidativnu aktivnost stabla sa listovima C. rubrum gajenih in vitro; KS – kontinualna svetlost.

Najveća UAA stabla sa listovima je izmerena kod biljaka koje su prvih 17 dana

gajene na KS (grafikon R14) i ona je 17. dana preko 2 puta veća od UAA kontrolnih

biljaka koje su gajene na 14h/10h fotoperiodu. Posle prebacivanja ove grupe biljaka,

17. dana na na 14h/10h fotoperiod (37. i 65 dana) UAA opada, i nema razlike u odnosu

na UAA biljaka koje su sve vreme gajene na 14h/10h fotoperiodu. Odnosno, efekat 17

dana kontinualne svetlosti na UAA se, u stablu sa listovima, gubi po prebacivanju na

14h/10h.

Kod biljaka koje su svih 65 dana gajene na 14h/10h fotoperiodu, blagi porast

UAA se uočava 37 dana (grafikon R14), dok nema razlike u UAA vrednostima 17. i 65.

dana. Ovaj porast UAA bi se, možda mogao povezati sa procesima vezanim za

početak sazrevanja semena.

UAA korena C. rubrum gajenih neprekidno na 14h/10h fotoperiodu (grafikon

R15) je najviša 17 dana. Uočavamo pad 37. dana, i porast 65. dana, kada se na

biljkama uočavaju znaci senescencije.

Kod korenova biljaka koje su prvih 17 dana gajene na KS, a onda prebačene na

14h/10h fotoperiod (grafikon R15), uočavamo da UAA raste od 17. do 65. dana.

Takođe uočavamo da KS, kojoj su biljke izlagane (17. dan) dovodi do značajnog

snižavanja UAA korena u odnosu na korenove biljaka gajenih na 14h/10h svetlosnom

režimu. Efekat prvih 17 dana kontinualne svetlosti na UAA se gubi po prebacivanju na

14h/10h i u ekstraktima korenova (grafikon R15).

Sazrela semena sakupljena 65. dana sa biljaka C. rubrum gajenih na 14h/10h

fotoperiodu pokazuju značajno nižu UAA (grafikon R16) u odnosu na semena

54

55

sakupljena sa biljaka koje su prvih 17 dana gajena na KS, pa prebačene na 14h/10h

fotoperiod (grafikon R16). To bi bila potvrda i ranije predpostavke da na sazrevanje

semena značajno utiče i dužina dana pre indukcije cvetanja, a ne samo dužina dana u

vreme i neposredno posle indukcije. Ali se mora uzeti u razmatranje i stepen maturacije

semena na biljkama koje su gajene na ova dva fotoperioda, s obzirom da su Bailly i

saradnici (2004) pokazali visoku aktivnost CAT i nisku POD i SOD aktivnost kod

normalno sazrelih suvih semena, dok je kod nezrelih semena utvrđeno obrnuto.

Grafikon R15: Efekat različitih fotoperiodskih uslova na ukupnu antioksidativnu aktivnost korena C. rubrum gajenih in vitro; KS – kontinualna svetlost

Grafikon R16: Efekat

različitih fotoperiodskih uslova na ukupnu antioksidativnu aktivnost sazrelih semena sakupljesa biljaka C. rubrum gaje

nih nih

S – kontinualna svetlost.

u toku vegetativnog i reproduktivnog razvića C. rubrum in vitro

in vitro; K

4.1.3.3. Određivanje aktivnosti antioksidativnih enzima

Merili smo pojedinačne aktivnosti antioksidativnih enzima, CAT, POD i SOD u

uzorcima stabla sa listovima uzimanim 17., 37. i 65 dana u toku razvića C.rubrum in

Koren

0

1

2

3

4

5

17 37 65

Vreme (dani)

UA

A [

µm

ol e

kv. a

sko

rb./

g F

W] 14h/10h

17d KS + 14h/10h

Seme

0

1

2

3

4

5

6

17 37 65

Vreme (dani)

UA

A [

µm

ol e

kv. a

sko

rb./

g F

W]

14h/10h

17d KS + 14h/10h

56

vitro, gajenih na dva, prethodno opisana, fotoperioda (tokom svih 65 dana na 14h/10h

fotoperiodu ili prvih 17 dana na kontinualnoj svetlosti, a potom još 48 dana na 14h/10h

fotope

žena na miligram proteina (grafikoni R18, 20, 22) nema razlike između

37. i 65

h/10h fotoperiodu, tj. koje

su indu

potom

prebač

enje aktivnosti CAT i POD, dok na

SOD a

riodu).

Analizirajući podatke o aktivnosti CAT (grafikon R17, R18), POD (grafikon R19,

R20) i SOD (grafikon R21, R22) biljaka gajenih neprekidno na indukcionom, 14h/10h

fotoperiodu, uočavamo isti trend promene njihovih aktivnosti od 17. – 65. dana gajenja.

Jasno se uočava pad aktivnosti sva tri enzima 37. dana, što odgovara početku

sazrevanja semena biljaka koje su izložene indukcionom fotoperiodu. 17. dana

registrovana je najviša aktivnost CAT (grafikon R17, R18), POD (grafikon R19, R20) i

SOD (grafikon R21, R22) ovih biljaka, što odgovara punom cvetanju. 65. dana, a što

kod ovih biljaka odgovara završnim fazama sazrevanja semena (Slika R2), aktivnost

(izražena na gram sveže mase) sva 3 enzima raste (grafikoni R17, 19, 21) u odnosu na

37. dan, dok izra

. dana.

CAT aktivnost biljaka koje su prvih 17 dana gajene na KS, a potom prebačene

na 14h/10h fotoperiod (grafikon R17 i R18), pokazuje obrnut trend u odnosu na biljke

gajene neprekidno na 14h/10h fotoperiodu. Blagi porast CAT aktivnosti se uočava 37.

dana (grafikon R18), što kod ovih biljaka odgovara punom cvetanju, koje je odloženo za

17 dana u odnosu na biljke koje su gajene sve vreme na 14

kciju za cvetanje primile još u fazi razvića kotiledona.

CAT aktivnost je najviša u fazi cvetanja: 17. dana kod biljaka gajenih na

indukcionom 14h/10h režimu, odnosno 37. dana kod biljaka koje su posle 17 dana na

KS prebačene na indukcioni režim. Apsolutne vrednosti su međutm značajno različite

(grafikon R18). CAT aktivnosti biljaka koje su prvih 17 dana gajene na KS, a

ene na 14h/10h režim, 17. i 65. dana su vrlo slične (grafikon R17, R18).

Veliku razliku, međutim, uočavamo u aktivnosti CAT i POD 17. dana između

biljaka koje su tih 17 dana gajene na KS i onih na 14h/10h fotoperiodu (grafikoni R17 –

20). Kontinualana svetlost je uticala na značajno sniž

ktivnost KS nije uticala (grafikoni R 17 – 22).

Transport elektrona koji se dešava tokom fotosinteze je glavni izvor ROS (Asada

2006) i usled gajenja na kontinualnoj svetlosti dolazi do pojačane produkcije ROS.

Procházková i Wilhelmová (2004) su pokazale da je sadržaj svih neenzimskih

antioksidanata (β-karotena i askorbata) viši u kotiledonima Phaseolus vulgaris izloženih

57

KS nego kod kontrolnih biljaka (gajenih na 16h/8h fotoperiodu), dok je istovremeno,

aktivnost antioksidativnih enzima bila niža. To odgovara i našim rezultatima: aktivnosti

CAT, POD i SOD (grafikoni R16 – 24) su 17. dana niže kod uzoraka stabla sa listovima

C.rubrum gajenih na KS nego kod biljaka gajenih na 14h/10h fotoperiodu nasuprot UAA

koja na istim uzorcima pokazuje značajno više vrednosti kod biljaka gajenih na KS.

C.

S – kontinualna svetlost

S – kontinualna svetlost

OD i CAT aktivnosti u odnosu na kontrolu, dok na POD aktivnost KS

Grafikon R17: Efekat različitih fotoperiodskih uslova na katalaznu aktivnost (izraženu na gram sveže mase) u stablu i listovimaubrum gajenih in vitro; r

K

Grafikon R18: Efekat različitih fotoperiodskih uslova na katalaznu aktivnost(izraženu na miligram

aproteina) u stablu i listovim. rubrum gajenih in vitro; C

K

Kontinualna svetlost je izazivala ubrzano starenje listova rozete A. thaliana

(Hensel et al.1993). U kotiledonima pasulja Phaseolus vulgaris, sa dobro definisanom

prirodnom senescencijom, Procházková i Wilhelmová (2004) su pokazale opadanje

aktivnosti svih antioksidativnih enzima. Izlaganje kotiledona KS dovodilo je do

značajnog pada S

nije imala efekta.

U vezi sa rezultatima Procházkove i Wilhelmove (2004), treba primetiti da je

udeo kotiledona C.rubrum, koji prirodno podležu senescenciji (mada kotiledoni C.

0

100

200

300

400

500

600

700

17 37 65

Vreme (dani)

CA

T [

U/g

FW

]14h/10h

17d KS + 14h/10h

0

5

10

15

20

25

30

35

CA

T [

U/m

g P

rote

ina]

17 37 65

Vreme (dani)

14h/10h

17d KS + 14h/10h

58

rubrum imaju prilično dug život), čak značajno manji u uzorku biljaka gajenih prvih 17

dana na KS, što vidimo iz odnosa broja pravih listova razvijenih 17. dana na KS i

14h/10h fotoperiodu (grafikon R13) Na Slici R2 vidimo da su kotiledoni zeleni čak i 65.

dana gajenja. To jest pad aktivnosti antioksidativnih enzima izazvan kontinualnom

svetlošću 17. dana nije, ili bar

ne u velikoj meri, izazvan

ubrzanom senescencijom

ova

zraženu na gram sveže ase) u stablu i listovima C.

rubrum gajenih in vitro; S – kontinualna svetlost

(izraženu na iligram proteina) u stablu i

C. rubrum gajenih vitro; KS – kontinualna vetlost.

scu et al. 2000). Razlika u aktivnosti

CAT, POD i SOD je pokazana i u listovima Impatiens flanaganiae u različitim fazama

kotiledona C.rubrum.

Grafikon R19: Efekat različitih fotoperiodskih usla peroksidaznu aktivnost n

(im

K

Grafikon R20: Efekatrazličitih fotoperiodskih uslova na peroksidaznu aktivnost

mlistovima ins

Merenje aktivnosti antioksidativnih enzima u listovima paradajza vršeno je u

različitim fazama razvića (Bailey and McHargue 1943). Pokazano je da aktivnosti CAT i

POD rastu sa sazrevanjem listova, i opadaju sa početkom senescencije. Porast

aktivnosti CAT i POD uočena je i u listovima krastavca od perioda maksimalnog

sazrevanja plodova do kraja plodonošenja (Marine

0

20

40

60

80

100

120

140

17 37 65

Vreme (dani)

PO

D [

U/g

FW

]

14h/10h

17d KS + 14h/10h

0

1

PO

D [

U/m

g P

rote

ina

]

2

3

4

5

6

7

17 37 65

Vreme (dani)

14h/10h

17d KS + 14h/10h

59

razvića

neindikcionoj KS, raste u vreme cvetanja, koje se dešava po

rebacivanju na indukcioni 14h

semen

ksid-dismutaze

ase) u stablu i listovima C. brum gajenih in vitro; S – kontinualna svetlost

ekat

ksid-dismutaze

roteina) u stablu i listovima . rubrum gajenih in vitro; S – kontinualna svetlost.

u odnosu na 14h/10h fotoperiod. Ovo ukazuje da osim CAT, POD i SOD, i sadržaj drugih, enzimskih ili neenzimskih, antioksidanata ima ulogu

u zavisnosti od intenziteta svetlosti kojoj su biljke bile izložene (Lall and

Nikolova 2003).

POD (grafikon 19 i 20) i SOD (grafikon R21 i 22) aktivnosti biljaka koje su prvih

17 dana gajene na KS, pa prebačene na 14h/10h indukcioni režim, pokazuju isti trend –

porast od 17. do 65. dana. Aktivnosti POD i SOD su najniže u vegetativnim biljkama,

posle 17 dana na

p /10h, 37. dana, a najviše su u vreme sazrevanja

a, 65. dana.

Grafikon R21: Efekat različitih fotoperiodskih uslova na aktivnost supero(izraženu na gram sveže mruK

Grafikon R22: Efrazličitih fotoperiodskih uslova na aktivnost supero(izraženu na miligram pCK

Ako uporedimo UAA stabla sa listovima biljaka koje su svih 65 dana gajene na 14h/10h fotoperiodu sa aktivnostima CAT, POD i SOD, vidimo obrnut trend promena od 17. do 65. dana. UAA aste 37r . dana (početak sazrevanja semena), dok je 17. i 65. dana (faza cvetanja i faza sazrevanja

semena) niža. Najviše aktivnosti sva tri antioksidativna enzima (CAT i POD najizraženije) se mogu primetiti u vreme cvetanja, 17. dana, nešto su niže u vreme sazrevanja semena 65. dana, dok su najniže aktivnosti 37. dana, što odgovara početku sazrevanja semena. Kontinualna svetlost (17. dana) utiče na značajno (preko 2 puta) povećanje UAA, i obrnuto, utiče na značajno smanjenje CAT i POD, nešto manje SOD aktivnosti,

0

50

17 37 65

Vreme (dani)

100

150

200

250

300

350

SO

D [

U/g

FW

]

14h/10h

17d KS + 14h/10h

0

17 37 65

Vreme (dani)

2

4

6

8

10

12

14

16

SO

D [

U/m

g P

rote

ina

]

14h/10h

17d KS + 14h/10h

60

u janju ROS, bilo da su vezani za procese razvića C. rubrum, ili da predstavljaju odgovor na spoljašnju sredinu (u našem slučaju na neprekidno osvetljavanje). 37. i 65. dana, kada su obe grupe biljaka gajene na 14h

uklan

/10h fotoperiodu nema značajnih razlika među

CAT aktivnost se može uočiti u vreme cvetanja kod obe grupe biljaka – 17. dana kod iljaka sve vreme gajenih na 14h/10h fotoperiodu, odnosno 37. dana kod biljaka koje su prvih 17 dana

e na KS.

iz njihovih UAA što ukazuje na veći efekat fotoperioda od efekta koji imaju faze razvića na UAA. Slično se ne može uočiti u slučaju aktivnosti CAT, SOD i POD. Najviša bgajen

Rezultati prikazani u ovom poglavlju ukazuju na sledeće zaključke: 1. Predstavljeni rezultati pokazuju sekvencijalnu ekspresiju antioksidativnih

sistema tokom klijanja semena C. rubrum. Pred izbijanje radikule CAT, SOD i DHA pokazuju maksimalnu aktivnost, a AA je detektovan samo u to vreme. Maksimalan sadrzaj ukupnog glutationa, kao i GSH i GSSG je izmeren u vreme izbijanja radikule, kada se javlja i POD aktivnost i raste posle tog perioda.

GA3 (160 μM) inhibira klijanje C. rubrum, ali ne značajno, indukuje porast aktivnosti CAT i SOD u vreme pred izbijanje radikule, i pad koncentracije AA i DHA, a ne utiče na glutation i peroksidaze.

2. Starenje semena utiče na promenu antioksidativnog statusa semena,

smanjenu klijavost, rastenje i cvetanje biljaka C. rubrum. CAT, SOD, kao i sadržaj glutationa su značajno niži, a de novo sinteza proteina počinje kasnije tokom imbibicije starijih semena. Dobijeni rezultati pokazuju da utvrđivanje antioksidativne aktivnosti enzima može biti uključena u evaluaciju starosti semena.

GA3 smanjuje razliku u rastenju i cvetanju između biljaka poreklom od semena različite starosti tj. njihova osetljivost na GA3 je različita, pa se može pretpostaviti da tokom starenja semena C. rubrum dolazi do promena u endogenom metabolizmu giberelina.

3. U različitim fazama rastenja i razvića primećena je promena nivoa antioksidativnih enzima. Kod biljaka gajenih neprekidno na indukcionom 14h/10h fotoperiodu, uočavamo najviše aktivnosti sva tri antioksidativna enzima u vreme cvetanja. Ukupna antioksidativna aktivnost pokazuje obrnut trend promena u toku razvića, što ukazuje da osim CAT, POD i SOD, i sadržaj drugih, enzimskih ili neenzimskih, antioksidanata ima ulogu u uklanjanju ROS u procesima razvića C. rubrum.

Kontinualna svetlost utiče na značajno povećanje UAA, i obrnuto, utiče na značajno smanjenje CAT i POD, nešto manje SOD aktivnosti, u odnosu na 14h/10h fotoperiod. Ovo ukazuje da osim CAT, POD i SOD, i sadržaj drugih antioksidanata ima ulogu u uklanjanju ROS (komplementarno delovanje svih antioksidativnih sistema), u vezi sa procesima koji predstavljaju odgovor na neprekidno osvetljavanje.

Istovremeno, najviša CAT aktivnost se može uočiti u vreme cvetanja, 17. dana kod biljaka sve vreme gajenih na 14h/10h fotoperiodu, odnosno 37. dana kod biljaka koje su prvih 17 dana gajene na KS.

61

4.2. Efekat fotoperioda na vegetativno

i reproduktivno razviće C. rubrum in vitro i

materinski efekat fotoperioda

4.2.1. Efekat fotoperioda na vegetativno i reproduktivno

razviće C.rubrum in vitro

Biljke, kao sesilni organizmi, ne mogu da “izaberu” svoje okruženje i moraju da

modifikuju svoje rastenje i razviće prema spoljašnjoj sredini. Takva plastičnost razvića

uključuje integraciju različitih signala iz spoljašnje sredine, što omogućava biljci da

sinhronizuje svoje rastenje sa sezonskim promenama. Svetlost je jedan od

najznačajnijih signala spoljašnje sredine koji reguliše razviće biljaka. Biljke registruju

kvantitet, kvalitet, periodičnost i smer svetlosti i prema njoj moduliraju mnoge fiziološke

odgovore, od klijanja, preko arhitekture odrasle biljke do reproduktivnog razvića

(Franklin and Whitelam 2004). Kod 22 vrste jednogodišnjih pustinjskih biljaka Izraela,

gajenim na kratkom ili dugom danu, uočena je velika razlika u broju listova pre

cvetanja, obliku listova, načinu grananja, veličini semena, boji semenog omotača,

(Gutterman and Evenari 1972).

Na osnovu ranijih istraživanja, koja su se ticala cvetanja i sa njim vezanog

rastenja (Živanović et al. 1995, Mitrović 1998), gajenja biljaka u staklari u cilju

produkcije semena (Mitrović et al 2002), uočili smo značajan uticaj dužine dana na

izgled i visinu biljaka C. rubrum, kao i značajan uticaj materinskog fotoperioda na

klijanje, rastenje i cvetanje ovih biljaka.

Biljke su gajene na različitim dužinama dana: 0h, 8h, 14h, 16h i 24h, kao i

kombinacijama ovih fotoperioda. U obzir su uzete ispitane karakteristike ove biljke: rano

cvetajuća vrsta (Cumming 1967), sa precizno definisanom kritičnom dužinom noći od

8h (Tsuchiya and Ishiguri 1981), sposobna da primi fotoperiodski stimulus za cvetanje

već u fazi razvića kotiledona kada joj je dovoljno svega 6 indukcionih fotoperiodskih

ciklusa (Seidlová i Opatrná 1978).

Metod kulture in vitro je odabran zbog preciznosti kontrole uslova spoljašnje

62

sredine kao i sastava podloge na kojoj biljke rastu (Scorza 1982). Iz ranijih istraživanja

(Mitrović 1998), odabrana je optimalna podloga za rastenje i cvetanje C. rubrum: MS

mineralna podloga sa 5% saharoze. Korišćena su semena sazrela na 13h/11h

fotoperiodu u staklari, stara 3 godine.Biljčice, dobijene od semena sterilno isklijavanog

u destilovanoj vodi, stare 4 dana, sa potpuno razvijenim kotiledonima, postavljane su

na podloge i izlagane različitim fotoperiodima, pri temperaturi od 25 ºC.

4.2.1.1. Efekat različitih fotoperioda na rastenje C. rubrum in vitro

Sa porastom dužine dana dolazi i do povećanja visine biljaka (grafikon R23). Pri

kraju životnog ciklusa (10. nedelja gajenja), biljke rasle na 24h – časovnom danu

(neindukcioni uslovi za cvetanje C.rubrum) su oko 2 puta više od biljaka gajenih na

16h/8h fotoperiodu, odn. čak oko 7 puta više od biljaka gajenih na 14h/10h fotoperiodu.

To je u skladu sa rezultatima Cook-a (1975), koji je pokazao da su biljke C. rubrum

gajene na 15h/9 fotoperiodu bile više, imale veći broj nodusa i duže internodije u

odnosu na biljke gajene na 12h/12h fotoperiodu. Ranije smo primetili da je rastenje

inhibirano na indukcionom fotoperiodu u odnosu na neindukcioni, kod C. rubrum i C.

murale (Mitrović 1998, Mitrović et al. 2000). Jedino biljke gajene u neprekidnom mraku

(24h mraka) ne prate trend odnosa visine i dužine dana (tj. noći), što je posledica

etioliranosti (grafikon R23).

Povećanje visine biljaka sa porastom dužine dana je još uočljivije na grafikonu

R24, na kome su izdvojene samo visine biljaka koje su svih 10 nedelja gajene na istoj

dužini dana. Može se uočiti i najintenzivnije rastenje na 16h/8h fotoperiodu, što

približno odgovara dužinama dana na kojima C.rubrum raste i donosi seme u prirodi.

Dužina dana u junu i julu je 15h 21min, odn 15h 33min, a krajem avgusta, kada seme

već sazreva, a biljke se suše, 14h 42min.

Takođe je važno primetiti da prvih 6 dana u životu biljke (fotoperiod kome su

tada izložene) ostavlja trajni efekat na njeno rastenje. Vidimo značajnu razliku u visini

biljaka izloženih svih 10 nedelja 14h/10h fotoperiodu i biljaka koje su prvih 6 dana

gajene na ovom fotoperiodu, a posle toga prebačene na 16h/8h fotoperiod (grafikon

R23). To bi se moglo i očekivati, jer su ove dve grupe biljaka samo prvih 6 dana, u

odnosu na 10 nedelja, gajene na istom fotoperiodu. Slično vidimo i za biljke izložene

63

64

svih 10 nedelja 8h/16h fotoperiodu u odnosu na one koje su samo prvih 6 dana gajene

na ovom fotoperiodu, a onda prebačene na 16h/8h fotoperiod. Međutim, čak i veću

razliku u visini (oko 2 puta) vidimo između biljaka koje su prvih 6 dana gajene na

8h/16h ili 14h/10h fotoperiodu, pa onda prebačene na 16h/8h, i biljaka koje su svih 10

nedelja gajene na 16h/8h fotoperiodu (grafikon R23, Slika R3).

Grafikon R23: Efekat različitih fotoperioda na visinu C.rubrum.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Vreme (nedelja)

Vis

ina

(m

m)

24h/0h

16h/8h

6(8h/16h)+16h/8h

6(14h/10h)+16h/8h

14h/10h

8h/16h

0h/24h

1

2

34

56

78

910

814

1624

0

20

40

60

80

100

120

Visina (mm)

Vreme (nedelja)

Dužina dana (h)

Grafikon R24: Efekat dužine dana na visinu C.rubrum. Sa grafikona R23 izdvojeni podaci koji se odnose na biljke koje su neprekidno gajene na istoj dužini dana.

65

Slika R3: Biljke gajene in vitro na različitim fotoperiodima, na kraju 10. nedelje.

– grafikon R27).

8h/16h 14h/10h 16h/8h 6(8h/16h)

+ 16h/8h

6(14h/10h) +

16h/8h 24h svetlost

Uočava se tranzijentno zaustavljanje rastenja

C.rubrum (Opatrná et al. 1980, Ulmann et al. 1980,

Mitrović 1998) u vreme cvetanja (grafikon R27), što je

zavisno od fotoperioda na kome se biljke gaje (grafikon

R23). Što je duži indukcioni dan, kasnije započinje

cvetanje (grafikon R27), a samim tim i tranzijentno

zaustavljanje rastenja vezano za njega (grafikon R23).

Ali, što je dan kraći (8h, pa i 14h), rastenje se posle

cvetanja, skoro potpuno zaustavlja (grafikon R23, Slika

R3). Kako se i moglo očekivati, zaustavljanje rastenja se ne može uočiti jedino na

neindukcionim uslovima gajenja (grafikon R 23), tj. na 24 časovnom danu (biljke nisu

procvetale do 10. nedelje gajenja

Biljci C. rubrum je za indukciju cvetanja dovoljno izlaganje 6 indukcionih

fotoperiodskih ciklusa u fazi razvića kotiledona (Opatrná et al. 1980). Cook (1975) je

utvrdio da zametanje semena (broj i masu semena koja će sazreti) određuje 8 – 13

fotoperiodskih ciklusa kojima je biljaka izložena. Očigledno je (grafikoni R23, 24) da je

to period u zivotu biljke na koji ona odgovara i rastenjem i to kroz čitav životni ciklus.

Praćenjem broja listova koji se razvijaju na biljkama C.rubrum gajenim na

različitim fotoperiodima i kombinacije fotoperioda u prvih 6 dana i ostalih 9 nedelja

života (grafikon R25, 26), možemo uočiti sličan trend porasta broja listova sa

produženjem dana. I Cook (1975) je uočio značajno povećanje broja listova C.rubrum

na 15h danu u odn na 12h dan.

66

Grafikon R25: Efekat različitih fotoperioda na broj listova C.rubrum.

Grafikon R26: Efekat dužine dana na broj pravih listova C.rubrum. Sa grafikona R25 izdvojeni podaci koji se odnose na biljke koje su neprekidno gajene na istoj dužini dana.

Uočavamo i zaustavljanje porasta broja listova sa početkom sazrevanja semena

(grafikon R29). U neprekidnom mraku i na 8h/16h fotoperiodu povećanje broja listova je

zaustavljeno jos po završetku cvetanja, tj. oko treće nedelje života (grafikon R25).

Vrhovi ovih biljaka počinju da se suše oko 7. – 8. nedelje života, a semena se i ne

12

34

56

78

910

8141624

0

5

10

15

20

Broj listova

Vreme (nedelja)

Dužina dana (h)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Vreme (nedelja)

Bro

j li

sto

va

24h/0h

16h/8h

6(8h/16h)+16h/8h

8h/16h0h/24h

14h/10h

6(14h/10h)+16h/8h

67

formiraju (grafikon R29). Na neprekidnoj svetlosti (24h svetlost) nije dolazilo do

cvetanja (grafikon R 27), a i porast broja listova je, manje više, linearan (grafikon R 25,

26).

Visoka korelacija između broja listova i procenta cvetanja, uočena je kod

C.rubrum gajenih u neprekidnom mraku i C.murale gajenih na indukcionim uslovima

(Mitrović 1998, Mitrović et al. 2000).

4.2.1.2. Efekat različitih fotoperioda na cvetanje C. rubrum in vitro

Cvetnje (grafikon R27, 28) se dešava ranije što je indukcioni dan kraći. Kod

biljaka gajenih 68 dana u neprekidnom mraku (dužina dana 0h), cvetovi se javljaju već

posle prve nedelje. Sa produženjem dana odlaže se cvetanje, najkasnije cvetaju biljke

na 16h danu. Važno je primetiti da osim dužine dana u prvih 6 dana, koliko je dovoljno

za indukciju cvetanja C.rubrum (Seidlová i Opatrná 1978, Cumming 1967), na cvetanje

(kao i na rastenje, što smo ranije primetili) ima uticaj i fotoperiod koji zatim sledi.

Grafikon R27: Efekat različitih fotoperioda na cvetanje C.rubrum.

Na primer, ako posmatramo linije koje predstavljaju cvetanje biljaka gajenih svih

10 nedelja na 14h/10h fotoperiodu, biljaka koje su prvih 6 dana gajene na ovom

fotoperiodu, a onda prebačene na 16h/8h fotoperiod i biljaka koje su svih 10 nedelja

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Vreme (nedelja)

Cv

etan

je (

%)

24h/0h

16h/8h

6(14h/10h)+16h/8h

14h/10h

8h/16h

6(8h/16h)+16h/8h

0h/24h

gajene na 16h/8h fotoperiodu, vidimo da prve najranije cvetaju. Prebacivanje posle

prvih 6 dana sa 14h/10h na 16h/8h fotoperiod odlaže cvetanje za nedelju dana, dok

biljke gajene svih 10 nedelja na 16h/8h fotoperiodu cvetaju još nedelju dana kasnije

(grafikon R27).

Slično vidimo i kad uporedimo cvetanje biljaka gajenih neprekidno na 8h/16h

fotoperiodu, onih koje su posle 6 dana na ovom fotoperiodu prebačene na 16h/8

fotoperiod i biljaka gajenih svih 10 nedelja na 16h/8h fotoperiodu (grafikon R27). Biljke

gajene neprekidno na 8h/16h fotoperiodu cvetaju 50% druge nedelje, ali na ovom

fotoperiodu cveta svega 90% biljaka do kraja 10. nedelje. Prebacivanje posle prvih 6

dana sa 8h/16h na 16h/8h fotoperiod stimulira cvetanje druge nedelje, i nadalje, do

100% 6. nedelje. Ove biljke cvetaju (u sličnom procentu) 3 nedelje ranije od biljaka

gajenih neprekidno na 16h/8h fotoperiodu (grafikon R27).

1

3

5

7

9

8141624

0

20

40

60

80

100

Cvetanje (%)

Vreme (nedelja)

Dužina dana (h)

Grafikon R28: Efekat dužine dana na cvetanje C.rubrum. Sa grafikona R27 izdvojeni su podaci koji se odnose na biljke koje su svih 10 nedelja gajene na istoj dužini dana.

4.2.1.3. Efekat različitih fotoperioda na sazrevanje semena

C. rubrum in vitro

Dužina dana pokazuje efekat i na sazrevanje semena C.rubrum in vitro i to kako

na vreme sazrevanja semena (hronološka starost biljke) (grafikon R29), tako i na broj

68

69

sazrelih semena (grafikon R30). Sa povećanjem dužine dana, “ubrzava se” sazrevanje

semena (biljke ranije u toku ontogeneze donose seme), a povećava se i broj sazrelih

semena (grafikon R30). Sazrevanje semena (grafikon R29) dešava se 4 – 5 nedelja po

započinjanju cvetanja (grafikon R27) i slično kao i cvetanje pokazuje odgovor na dužinu

dana u vreme indukcije cvetanja i neposredno posle nje. To možemo videti ako

posmatramo linije koje predstavljaju broj biljaka sa zrelim semenom raslih na

fotoperiodima: 6(8h/16h) + 16h/8h, 6(10h/14h) + 16h/8h i 16h/8h. Najranije dolazi do

sazrevanja semena na biljkama koje su indukciju primile na 8h/16h fotoperiodu i dalje

gajene na 16h/8h (grafikon R29), što je u skladu i sa najranijim cvetanjem (grafikon

R27).

Grafikon R29: Efekat različitih fotoperioda na sazrevanje semena C.rubrum.

Biljke rasle neprekidno na 8h danu, kao i u neprekidnom mraku, ne donose

seme (grafikon R29). Vrhovi ovih biljaka već oko sedme nedelje života počinju da se

suše i na njima ne sazreva seme, dok hipokotili, čak i kotiledoni ostaju zeleni, (Slika

R3). Za razliku od C. rubrum, biljke Centaurium pulchellum, gajene u neprekidnom

mraku in vitro, produkovale su semena, ali ta semena nisu bila vijabilna (Cvetić et al.

2004).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Vreme (nedelja)

Bro

j bilj

ak

a s

a z

relim

sem

en

om

(%

)

6(8h/16h)+16h/8h

16h/8h

6(14h/10h)+16h/8h

14h/10h

8h/16h

0h/24h

70

Sa povećanjem dužine dana, dolazi i do povećanja visine biljaka kao i broja listova, odlaže se cvetanje i biljke ranije donose seme.

Fotoperiod kome su biljke C. rubrum izložene prvih 6 dana (indukcija cvetanja) i fotoperiod koji neposredno zatim sledi (evokacija cvetanja), određuju njihovo rastenje do kraja ontogeneze, cvetanje i sazrevanje semena .

4.2.2. Materinski efekat fotoperioda

Uticaji faktora spoljašnje sredine tokom razvića majke biljke na morfološke i

fiziološke karakteristike semena (potomstvo) koje produkuju (Gutterman and Evenari

1972) u literaturi se nazivaju materinski efekti. Pokazano je da materinske efekte na

potomstvo mogu izazvati: mineralni sastav podloge, intenzitet svetlosti, temperatura,

fotoperiod, nivo CO2 (po Galloway 2005). Materinski efekti su specifični, a njihova

ekspresija često zavisi od sredine u kojoj se potomstvo razvija. Materinski efekat se

ispoljava tokom čitavog života potomstva, a može opstati kroz nekoliko generacija

(Galloway 2005).

Najveći broj istraživanja koja se tiču ispitivanja materinskih efekata različitih

faktora spoljašnje sredine na potomstvo, se tiču materinskih efekata na karakteristike

semena, najviše klijanje (Cook 1975, Bewley and Black 1982, Bertero et al. 1999,

Gutterman 2000), dok je mnogo manje podataka o materinskim efektima različitih

faktora spoljašnje sredine na dalje faze razvića potomstva.

4.2.2.1. Materinski efekat fotoperioda na broj i masu semena,

klijanje, rastenje, cvetanje i donošenje semena

C. rubrum in vitro

4.2.2.1.1. Materinski efekat fotoperioda na broj i masu semena C. rubrum

Različiti fotoperiodi na kojima su gajene biljke pokazuju efekat i na broj semena

sazrelih po biljci (grafikon R30) Najveći broj semena po biljci sazreo je na biljkama

gajenim na najdužem indukcionom fotoperiodu koji smo primenili, 16h/8h, dok je na

14h/10h fotoperiodu sazrelo oko 10 puta manje semena. Ovo je u skladu sa Cook-ovim

(1975) rezultatima značajno veće brojnosti semena sazrelih na 15h/9h fotoperiodu u

odnosu na 12h/12h fotoperiod.

Semena su po sazrevanju (na 10 nedelja starim biljkama) sušena mesec dana

na sobnoj temperaturi i merena. Vidimo (grafikon R31) da masa semena raste sa

povećanjem dužine dana sa 14h na 16h (statistički značajno) na kome su gajene majke

biljke. Takođe masa semena raste i sa dužinom dana u vreme indukcije cvetanja (6

71

ciklusa 8h/16h odn, 14h/10h fotoperioda), i fotoperioda koji neposredno zatim sledi, ali

ne značajno. Na 8h danu, semena nisu sazrevala, te imamo vrlo uzak opseg odnosa

dužina dana i masa semena dobijenih in vitro.

Grafikon R30: Efekat različitih fotoperioda na kojima su sazrevala semena na prosečan broj sazrelih semena po biljci na kraju 10. nedelje in vitro.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

14h/10h 6(8h/16h)+16h/8h 6(14h/10h)+16h/8h 16h/8h

Fotoperiod na kome su gajene majke biljke

Bro

j zre

lih s

emen

a p

o b

iljci

Ne sme se izuzeti iz razmatranja efekat in vitro gajenja biljaka, koji neprekidno

obezbeđuje optimalne uslove mineralnog sastava podloge, temperature, vlažnosti i

osvetljenosti. U prirodi, uz 15h/9h (od maja do avgusta) fotoperiod vezane su i visoke

temperature, i mali sadržaj vlažnosti vazduha. Prosečna masa 100 semena sazrevalih

in vivo na 15h/9h fotoperiodu je oko 4.5 puta manja od onih sazrelih na 16h/8h in vitro.

Bertero i saradnici (1999) su pokazali da je efekat fotoperioda primenjenog pre i posle

zametanja semena C. quinoa na masu semena, bio pod značajnim uticajem

temperature. Temperatura gajenja majki biljki Plantago lanceolata, značajno je uticala

na ukupnu masu semena i masu semenog omotača, iako veća semena ne sadrže veći

endosperm ili embrion. Veća masa semenog omotača verovatno značajno utiče na

klijanje (Lacey et al. 1997).

U ranijim istraživanjima (Mitrović et al. 2002) smo pokazali da su semena

sazrevala na biljkama gajenim in vivo od januara do maja, (dužina dana od 9h do 14h)

malobrojna i oko 4 puta teža od semena sazrevalih na biljkama gajenim od aprila do

72

avgusta (dužina dana od 14h do 15h 33 min). Slično je pokazao i Cook (1975): na

masu semena C.rubrum značajno utiče fotoperiod na kome se odvijaju fotoperiodska

indukcija i evokacija cvetanja. Biljke gajene na 15h/9h fotoperiodu imale su veći broj

manjih semena u odnosu na biljke gajene na 12h/12h fotoperiodu, a davanjem

određenog broja pulseva 15h/9h fotoperioda utvrdio je da je masa semena određena

između 4. i 8. dana razvića.

Grafikon R31: Efekat različitih fotoperioda na kojima su sazrevala semena na

masu semena.

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

14h/10h 8h/16h + 16h/8h 14h/10h + 16h/8h 16h/8h

Fotoperiodi na kojima su gajene majke biljke

Mas

a 10

0 s

emen

a (g

)

Kod kvantitativno kratkodnevne biljke C. quinoa (Bertero et al. 1999) uočeno je

da biljke gajene na KD do zametanja semena donose 4 puta krupnija semena od onih

koje su neprekidno gajene na dugom danu. Takođe, rezultati dobijeni na različitim

vrstama roda Chenopodium (po Bewley and Black 1982) govore u prilog bliske

povezanosti između uslova spoljašnje sredine i razvića semena. Biljke C. amaraticolor,

C. polyspermum i C. album gajene na dugim fotoperiodima produkuju sitna, dormantna

semena sa debelom semenjačom, dok one gajene na kratkim fotoperiodima daju

krupna, manje dormantna semena sa tankom semenjačom. Sve ovo može biti deo

zaštitne strategije rasejavanja semena o kojoj govori Gutterman (2002), utičući na

povećanje šanse vrste da preživi.

U prirodi, Chenopodium rubrum cveta pred jesen, te biljke primaju indukciju na

najdužim fotoperiodima, kada kasni letnji dani postaju kraći, a pošto je utvrđeno da se

veličina i potencijalni broj semena određuju neposredno po iniciranju reproduktivnog

73

razvića, prirodna indukcija ide u pravcu minimiziranja veličine semena i maksimiziranja

brojnosti semena (Cook 1975). Otuda, prirodna selekcija izgleda favorizuje fiziološke

mehanizme koji rade na fiziološki suboptimalnim fotoperiodima, koji maksimizuju

verovatnoću preživljavanja (Cook 1975).

Broj i srednja vrednost mase semena su najznačajniji pokazatelji reproduktivne

sposobnosti jednogodišnjih biljaka (Cook 1975). Adaptivni značaj veličine semena za

svaku vrstu, pokazan je konstantnošću srednje vrednosti mase semena. I u toku našeg

rada, utvrdili smo da masa semena uvek jednako odgovara na uslove gajenja biljaka.

Efekat kompeticije je rešen brojnošću semena, čineći veličinu semena najmanje

plastičnom komponentom (Cook 1975).

4.2.2.1.2. Materinski efekat fotoperioda na klijanje semena C. rubrum

Semena sakupljena sa biljaka, gajenih in vitro na različitim fotoperiodima

(detaljno opisano u poglavlju 4.2.1.), su korišćena za ispitivanje materinskog efekta

fotoperioda na klijanje. Semena su isklijavana sterilno u destilovanoj vodi, a klijanje je

praćeno svakih 24h u toku 4 dana.

Vidimo da razlika u dužini dana od samo 2h (14h i 16h) na kojoj su gajene majke

biljke in vitro i na temperaturi od 25 ºC ima efekta na klijanje semena (grafikon R32).

Semena koja su zametnuta i sazrevala na 16h dugom danu klijaju 22% prvog dana u

odnosu na 10% semena koja su zametnuta i sazrevala na 14h danu, i ta razlika sa

održava u sva 4 dana klijanja, ali 3. i 4. dana nije statistički značajna.

Zanimljivo je uporediti krive klijanja semena sakupljenih sa biljaka koje su prvih 6

dana gajene na 8h/16, a posle toga još 9 nedelja na 16h/8h fotoperiodu i onih koje su

svih 10 nedelja gajene na 16h/8h fotoperiodu (grafikon R32). Kod prvih, uočavamo

linearan porast procenta klijanja u prva 3 dana, bez izdvojenih delova populacije

semena po brzini klijanja, pri cemu je procenat klijanja ovih semena drugog dana 48%,

u odnosu na 35% semena sakupljenih sa biljaka gajenih na 16h/8h. Takođe, ako

uporedimo klijanje semena sakupljenih sa biljaka koje su prvih 6 dana gajene na

14h/10h fotoperiodu, a posle toga još 9 nedelja na 16h/8h, i onih koje su svih 10

nedelja gajene na 14h/10h fotoperiodu, vidimo da su krive njihovog klijanja vrlo slične i

istovremeno značajno različite od krive klijanja semena sakupljenih sa biljaka gajenih

74

75

svih 10 nedelja na 16h/8h fotoperiodu. Odnosno, fotoperiod kome su majke biljke

izložene u prvih 6 dana (u vreme kada su sposobne da prime fooperiodsku indukciju

cvetanja) ima značajno veći uticaj na klijanje na njima sazrelih semena nego fotoperiod

tokom sledećih 9 nedelja. To potvrđuje zaključke Cook (1975) o značajnom uticaju

fotoperioda u vreme cvetanja i neposredno posle toga na karakteristike semena. I

Gutterman and Evenari (1972) je kod 22 vrste jednogodišnjih pustinjskih biljaka Izraela,

gajenim na kratkom ili dugom danu, uočio veliku razliku u veličini semena, boji

semenog omotača, klijanju i dugovečnosti semena.

Grafikon R32: Materinski efekat fotoperioda na klijanje semena. Sa desne strane grafikona označeni fotoperiodi na kojima su gajene majke biljke.

Ranije smo utvrdili (Mitrović et al. 2002) da su semena sazrela u staklari zimi, na

kraćem danu i nižim temperaturama, klijala u značajno većem procentu u odnosu na

semena sazrevala leti na dužem danu i višim temperaturama. Kako smo in vitro, pri

temperaturi od 25 ºC dobili obrnut odnos dužine dana gajenja majki biljki i klijanja

njihovog semena, slično kao i u slučaju mase semena (u poglavlju 4.2.2.1.1.)

zaključujemo da fotoperiod i temperatura kojoj su biljke izložene pokazuju kombinovani

efekat kako na masu semena koja na njima sazrevaju, tako i na klijanje tih semena.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4

Vreme (dani)

Klij

anje

(%

)

16h/8h6(14h/10h)+16h/8h

6(8h/16h)+16h/8h14h/10h

Kod Aegilops ovata (Datta et al. 1972a) semena sazrela na višim temperaturama su

bila lakša i klijala u višem procentu u odnosu na ona sazrela na nižim temperaturama.

Obrnut odnos između klijavosti semena i temperature u vreme njegovog sazrevanja

uočen je kod soje (Keigley and Mullen 1986) i kod Chenopodium album (Karssen

1970).

Gutterman and Evenari (1972) je pisao o zavisnosti vijabilnosti semena od

uslova kojima je biljka izložena u vreme sazrevanja semena, misleći najviše na dužinu

dana, temperaturu i kvalitet svetlosti. Semena Lactuca scariola dobijena od biljaka

premeštenih sa dugog na kratak dan na kraju faze razvića rozete, klijala su značajno

brže od onih sakupljenih sa biljaka koje su ostale na dugom danu (Gutterman and

Evenari 1972). Galloway (2005) je utvrdila korelaciju između vremena cvetanja majke

biljke Campanula americana i vremena klijanja semena.

4.2.2.1.3. Materinski efekat fotoperioda na rastenje C. rubrum in vitro

Četiri dana stare biljke poreklom od semena sazrelog na biljkama gajenim na

različitim fotoperiodima, sa potpuno razvijenim kotiledonima, (posle isklijavanja –

grafikon R32) postavljane su na podloge (MS sa 5% saharoze, bez hormona) i sve

gajene na 14h/10h fotoperiodu, i temperaturi od 25 ºC. Od 2-10 nedelje, praćeni su

visina, broj listova, cvetanje i donošenje semena (na grafikonima R33 - 36

predstavljeno debelim punim linijama). Paralelno su prikazani rezultati dobijeni

praćenjem rastenja materinskih biljaka (tankim isprekidanim linijama) na različitim

fotoperiodima (detaljno prikazano u poglavlju 4.2.1.1. na grafikonima R23 - 29).

Uočavamo značajan efekat materinskog fotoperioda na visinu biljaka (grafikon

R33, slika R4), posebno u kasnijim fazama razvića (7. – 10. nedelja). Tako su biljke

poreklom od semena zametnutog i sazrevalog na 14h/10h fotoperiodu najviše u

odnosu na biljke dobijene od semena sazrevalog na drugim fotoperiodima. Biljke

poreklom od semena sazrelog na majkama biljkama gajenim na 14h/10h fotoperiodu

su, istovremeno, oko 3 puta više (7. i 10. nedelje) od svojih majki (grafikon R33). Majka

biljka gajena na 14h/10h fotoperiodu “predviđa” da će se njeno potomstvo naći na istim

uslovima spoljašnje sredine (fotoperiod 14h/10h). Materinski efekat sredine predstavlja

76

77

mehanizam kojim majka biljka može da prilagodi fenotipove potomstva da povećaju

uspeh u spoljašnjoj sredini kakvu će najverovatnije iskusiti (Galloway 2005).

Slika R4: Materinski efekat različitih fotoperioda na biljke C.rubrum, gajene na 14h/10h fotoperiodu; biljke stare 10 nedelja.

Biljke poreklom od semena sazrelog Biljke poreklom od semena sazrelog na biljkama gajenim na 14h/10h fotoperiodu na biljkama gajenim na 6(14h/10h) + 16h/8h fotoperiodu

Biljke poreklom od semena sazrelog Biljke poreklom od semena sazrelog na biljkama gajenim 16h/8h fotoperiodu na biljkama gajenim na 6(8h/16h) + 16h/8h fotoperiodu

Uočavamo da fotoperiod kome su majke biljke izložene u prvih 6 dana života

(vreme kada su sposobne da prime fotoperiodsku indukciju cvetanja, Seidlová i

Opatrná, 1978) ostavlja značajan efekat na visinu potomstva, i to mnogo veći nego

fotoperiod kome su izložene u 9 nedelja koje zatim slede (grafikon R33). Ako

uporedimo biljke dobijene od semena sazrevalog na majkama biljkama koje su prvih 6

dana bile izložene 14h/10h fotoperiodu, a ostalih 9 nedelja gajene na 16h/8h

fotoperiodu, sa onima koje su svih 10 nedelja gajene na 14h/10h fotoperiodu, vidimo

veliku sličnost (nema statistički značajnih razlika). Dok su biljke dobijene od semena

sazrevalog na biljkama koje su svih 10 nedelja gajene na 16h/8h fotoperiodu značajno

niže (oko 2 puta 7. i 10. nedelje).

Grafikon R33: Materinski efekat različitih fotoperioda na visinu biljaka C.rubrum gajenih na 14h/10h fotoperiodu (prikazano debelim linijama). Isprekidanim tankim linijama prikazane visine majčinskih biljaka koje su gajene na različitim fotoperiodima, i sa kojih su sakupljena semena.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

2 5 7 10

Vreme (nedelja)

Vis

ina

(m

m)

materinski efekat 14h/10hfotoperioda na rastenje na14h/10h fotoperiodu

majke biljke gajene na 14h/10hfotoperiodu

materinski efekat 16h/8hfotoperioda na rastenje na14h/10h fotoperiodu

majke biljke gajene na 16h/8hfotoperiodu

materinski efekat6(8h/16h)+16h/8h fotoperiodana rastenje na 14h/10hfotoperiodumajke biljke gajene na6(8h/16h)+16h/8h fotoperiodu

materinski efekat6(14h/10h)+16h/8h fotoperioda na rastenje na 14h/10hfotoperiodumajke biljke gajene na6(14h/10h)+16h/8h fotoperiodu

Možemo primetiti da su biljke poreklom od semena sazrelog na biljkama koje su

u prvih 6 dana bile izložene 14h/10h fotoperiodu, značajno više od biljaka poreklom od

semena sazrelih na drugim fotoperiodima, bez obzira na fotoperiod koji zatim sledi.

78

Znači da biljke informaciju o dužini dana koju su iskusile u vreme indukcije cvetanja

prenose na potomstvo. Majka biljka predviđa da će se njeno potomstvo naći na

fotoperiodu koji je ona iskusila u toku indukcije cvetanja, što je evoluciono potpuno

opravdano sa stanovišta značaja ove faze razvića za ostavljanje potomstva.

Grafikon R34: Materinski efekat različitih fotoperioda na broj listova biljaka C.rubrum gajenih na 14h/10h fotoperiodu (prikazano debelim linijama). Isprekidanim tankim linijama prikazan broj pravih listova majčinskih biljaka koje su gajene na različitim fotoperiodima, i sa kojih su sakupljena semena.

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

2 5 7 10

Vreme (nedelja)

Bro

j lis

tov

a

materinski efekat 14h/10hfotoperioda na broj listova na14h/10h fotoperiodu

majke biljke gajene na 14h/10hfotoperiodu

materinski efekat 16h/8hfotoperioda na broj listova na14h/10h fotoperiodu

majke biljke gajene na 16h/8hfotoperiodu

materinski efekat6(8h/16h)+16h/8h fotoperiodana broj listova na 14h/10hfotoperiodumajke biljke gajene na6(8h/16h)+16h/8h fotoperiodu

materinski efekat6(14h/10h)+16h/8h fotoperiodana broj listova na 14h/10hfotoperiodumajke biljke gajene na6(14h/10h)+16h/8h fotoperiodu

Treba primetiti još jednu pojavu: na grafikonu R24 vidimo “kičmu” površi koja

odgovara visini biljaka gajenih na 16h/8h fotoperiodu, odnosno, biljke su najviše na

ovom fotoperiodu. Sa daljim produžavanjem dana dolazi do smanjenja visine biljaka.

Na grafikonu R33 vidimo da biljke poreklom od semena zametnutog i sazrevalog na

14h/10h fotoperiodu, kao i 6 dana (14h/10h) + 62 dana na 16h/8h fotoperiodu pokazuju

sličnu krivu rastenja materinskim biljaka gajenim na tom “najboljem” 16h/8h

fotoperiodu. I obrnuto, biljke poreklom od semena koje u toku svog zametanja i

sazrevanja nije “iskusilo” 14h/10h fotoperiod pokazuju slične krive rastenja kao

materinske biljke gajene na “neoptimalnom” 14h/10h fotoperiodu, tj. rastenjem

odgovaraju na fotoperiod kome su izložene. To je još jedan pokazatelj materinskog

79

efekta fotoperioda kojim majka biljka “prilagođava” fenotip potomstva (visinu)

spoljašnjoj sredini (fotoperiodu u našem slučaju) koju će potomstvo iskusiti (Galloway

2005).

Sličan efekat različitih fotoperioda na kome su rasle majke biljke uočava se i na

broj listova biljaka dobijenih iz njihovih semena (grafikon R34, slika R4), mada je nešto

slabije izraženo u odnosu na visinu (grafikon R33). Sličan efekat materinskog

fotoperioda na broj listova, takođe je ranije pokazan (Mitrović et al. 2002).

4.2.2.1.4. Materinski efekat fotoperioda na cvetanje i

sazrevanje semena C. rubrum in vitro

Efekat fotoperioda na kome su cvetale i zametale semena majke biljke se, osim

na rastenje, odražava i na vreme cvetanja potomstva (grafikon R35). Međutim,

materinski efekat fotoperioda na cvetanje je obrnut u odnosu na rastenje (grafikoni

R33, R34). To se moglo i očekivati, s obzirom da je cvetanje po svemu proces suprotan

rastenju. Već je pomenuto da u vreme cvetanja dolazi do tranzijentnog zaustavljanja

rastenja C.rubrum (Opatrná et al. 1980, Ulmann et al. 1980) i da je rastenje u

indukcionim uslovima inhibirano u odnosu na rastenje na neindukcionim (Mitrović

1998). Takođe je u prethodnom poglavlju (4.2.1.) pokazano da sa produženjem dana

dolazi do intenziviranja rastenja i odlaganja cvetanja. Osim toga, iz literature i prakse je

poznato da se cvetanje ubrzava u nepovoljnim uslovima spoljašnje sredine, u cilju

obezbeđivanja potomstva.

U ovom eksperimentu, gde su biljke poreklom od semena sazrevalog na

različitim fotoperiodima sve gajene na 14h/10h fotoperiodu, samo biljke sa materinskim

efektom ovog fotoperioda ne pokazuju razliku u cvetanju u odnosu na cvetanje

materinskih biljaka (grafikon R35). Vidimo da biljke poreklom od semena zametnutog i

sazrevalog na 6 dana (14h/10h) + 16h/8h fotoperiodu cvetaju 50% već druge nedelje u

odnosu na 34% cvetanja biljaka poreklom od semena sazrevalog na biljkama gajenim

svih 10 nedelja na 14h/10h fotoperiodu. Osim toga ove biljke cvetaju u sličnom

procentu kao biljke poreklom od semena sazrevalog na biljkama gajenim 10 nedelja na

16h/8h fotoperiodu. Međutim, biljke poreklom od semena zametnutog i sazrevalog na 6

(8h/16h) + 16h/8h fotoperiodu cvetaju 100% već 2. nedelje gajenja na 14h/10h

80

fotoperiodu. Potomstvo biljaka gajenih na različitim fotoperiodima cveta u značajno

višem procentu na 14h/10h fotoperiodu, u odnosu na cvetanje majki biljki na

fotoperiodima na kojima su bile gajene, kao i u odnosu na biljke poreklom od semena

sazrevalog na 14h/10h fotoperiodu. Potencijalno objašnjenje bi moglo biti da majke

biljke gajene na različitim fotoperiodima nisu “predvidele” da će se njihovo potomstvo

naći na 14h/10 h fotoperiodu, te je on za njih nepovoljan, pa biljke potomci ranije

cvetaju.

Grafikon R35: Materinski efekat različitih fotoperioda na cvetanje biljaka C.rubrum gajenih na 14h/10h fotoperiodu (prikazano debelim linijama). Isprekidanim tankim linijama prikazano cvetanje majčinskih biljaka koje su gajene na različitim fotoperiodima, i sa kojih su sakupljena semena.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2 5 7 10

Vreme (nedelja)

Cv

etan

je (

%)

materinski efekat 14h/10hfotoperioda na cvetanje na14h/10h fotoperiodu

majke biljke gajene na 14h/10hfotoperiodu

materinski efekat 16h/8hfotoperioda na cvetanje na14h/10h fotoperiodu

majke biljke gajene na 16h/8hfotoperiodu

materinski efekat6(8h/16h)+16h/8h fotoperioda nacvetanje na 14h/10h fotoperiodu

majke biljke gajene na6(8h/16h)+16h/8h fotoperiodu

materinski efekat6(14h/10h)+16h/8h fotoperioda nacvetanje na 14h/10h fotoperiodu

majke biljke gajene na6(14h/10h)+16h/8h fotoperiodu

Praćenjem početka sazrevanja semena na 14h/10h fotoperiodu, na biljkama

poreklom od semena sazrelog na različitim fotoperiodima (grafikon R36), vidimo da

najranije (u 5 nedelji) počinje sazrevanje semena na biljkama poreklom od semena

sazrevalog na 16h/8h fotoperiodu. Majke biljke gajene na 16h/8h fotoperiodu su

najkasnije cvetale (grafikon R35) i donosile semena (grafikon R36). Galloway (2005)

govori o mogućnosti da, u slučaju da se seme raseje u drugačiji habitat, materinski

efekat sredine može smanjiti njegovu sposobnost preživljavanja. U ovom slučaju,

81

materinski efekat 16h/8h fotoperioda, nije smanjio mogućnost potomstva da ostavi

seme na 14h/10h fotoperiodu.

Sazrevanje semena na biljkama poreklom od semena sazrevalog na 14h/10h

fotoperiodu je ubrzano u odnosu na majke biljke (grafikon R36). Na kraju 10. nedelje na

100% biljaka sazreva seme, u odnosu na svega 32.5% materinskih biljaka. Majka biljka

“predviđa” da će se njeno potomstvo naći na fotoperiodu (14h/10h) koji je ona iskusila u

toku cvetanja i zametanja semena, čime može da prilagodi fenotipove potomstva da

povećaju uspeh u spoljašnjoj sredini (Galloway 2005), u ovom slučaju da donesu veći

broj semena.

Grafikon R36: Materinski efekat različitih fotoperioda na sazrevanje semena na biljkama C.rubrum gajenih na 14h/10h fotoperiodu (prikazano debelim linijama). Isprekidanim tankim linijama prikazano sazrevanjesemena na majčinskim biljkama koje su gajene na različitim fotoperiodima, i sa kojih su sakupljena semena.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2 5 7 10

Vreme (nedelja)

Bro

j bil

jak

a sa

zre

lim

se

me

no

m

materinski efekat14h/10h fotoperiodana sazrevanje semenana 14h/10hfotoperiodumajke biljke gajene na14h/10h fotoperiodu

materinski efekat16h/8h fotoperioda nasazrevanje semena na14h/10h fotoperiodu

majke biljke gajene na16h/8h fotoperiodu

materinski efekat6(8h/16h)+16h/8hfotoperioda nasazrevanje semena na14h/10h fotoperiodumajke biljke gajene na6(8h/16h)+16h/8hfotoperiodu

materinski efekat6(14h/10h)+16h/8hfotoperioda nasazrevanje semena na14h/10h fotoperiodumajke biljke gajene na6(14h/10h)+16h/8hfotoperiodu

Nema značajnih razlika u sazrevanju semena na biljkama poreklom sa

6(14h/10h) + 16h/8h i 6(8h/16h) + 16h/8h fotoperioda, kao ni sazrevanja semena na

njihovim matičnim biljkama (grafikon R36).

82

U literaturi je primećen materinski efekat mineralnog sastava podloge na

rastenje sve do cvetanja kod biljke Plantago major, a isti se uočavao do treće

generacije (Miao et al. 1991), dok je kod Plantago lanceolata uočen materinski efekat

visokih temperatura na klijanje, i verovatnoću za cvetanje (Lacey and Herr 2000).

Grafikon R37: Materinski efekat različitih fotoperioda na broj sazrelih semena na biljkama C.rubrum gajenih na 14h/10h fotoperiodu (prikazano punim stubićima). Isprekidanim tankim linijama prikazan broj sazrelih semena na majkama biljkama koje su gajene na različitim fotoperiodima..

0

5

10

15

20

25

30

35

40

materinski efekat14h/10h fotoperioda nabroj semena sazrelih

na 14h/10h fotoperiodu

materinski efekat6(8h/16h)+16h/8h

fotoperioda na brojsemena sazrelih

14h/10h fotoperiodu

materinski efekat6(14h/10h)+16h/8hfotoperioda na brojsemena sazrelih na14h/10h fotoperiodu

materinski efekat16h/8h fotoperioda nabroj semena sazrelih

na 14h/10h fotoperiodu

Bro

j saz

relih

sem

ena

po

bilj

ci

Materinski efekat fotoperioda se vidi i na broj sazrelih semena na 14h/10h

fotoperiodu (grafikon R37). Tako je najveći broj semena sazreo na biljkama čije su

majke biljke rasle i donosile seme na istom 14h/10h fotoperiodu. Značajno je manji broj

semena sazreo na biljkama poreklom od semena sa ostala tri fotoperioda. Istovremeno

broj sazrelih semena na biljkama poreklom od semena sa 14h/10h fotoperioda je i

značajno veći od broja semena sazrelih na njihovim majkama biljkama (grafikon R37).

Sasvim obrnuto važi za biljke poreklom sa ostala 3 fotoperioda, a gajene na 14h/10h

fotoperiodu. Broj sazrelih semena na ovim biljkama je bio značajno manji od broja

semena sazrelih na njihovim majkama biljkama koje su gajene na različitim

fotoperiodima (grafikon R37). Najmanje semena (0.39 semena po biljci) sazrelo je na

biljkama poreklom od semena sa 16h/8h fotoperioda.

83

84

Vidimo i potpuno obrnut odnos efekta dužine dana na broj sazrelih semena

namajkama biljkama i materinskog efekta fotoperioda na sazrevanje semena. Najviše

semena sazrevalo je na majkama biljkama gajenim na 16h/8h fotoperiodu, dok je na

14h/10h fotoperiodu najviše semena sazrevalo na biljakama poreklom od semena

sazrevalog na 14h/10h fotoperiodu. Drugim rečima, materinski efekat 14h/10h

fotoperioda se ogleda i u najboljoj “pripremljenosti” biljaka poreklom od semena sa

ovog fotoperioda da ostavi najbrojnije potomstvo, što je u skladu sa pisanjem Galloway

(2005).

Sa povećanjem dužine dana, sa 14h na 16h na kome su gajene majke biljke in vitro na 25 ºC raste i masa semena. Obrnuto je pokazano za mase semena koja su dobijena gajenjem biljaka in vivo, na temperaturi spoljašnje sredine. Možemo pretpostaviti kombinovani efekat fotoperioda i temperature, kojoj su biljke izložene, na masu semena koja na njima sazrevaju.

Materinski efekat fotoperioda proteže se kroz čitav životni ciklus biljke C.rubrum, od klijanja, preko rastenja, do cvetanja i donošenja semena. Za klijanje semena, visinu i broj listova potomstva, ključni značaj ima fotoperiod kome su majke biljke bile izložene u prvih 6 dana svog života (indukcija cvetanja majki biljki), dok za cvetanje i donošenje semena potomstva, značajniji uticaj ima fotoperiod koji sledi posle indukcije cvetanja majki biljki.

Majke biljke C.rubrum u semenu ostavljaju “informaciju” o dužini dana koju su iskusile u toku svog životnog ciklusa, i to je mehanizam kojim majka biljka može da prilagodi fenotipove svog potomstva da poveća svoj uspeh u spoljašnjoj sredini kakvu će najverovatnije iskusiti.

4.2.2.2. Materinski efekat fotoperioda na

proteine semena C. rubrum

Iz rezultata prikazanih u poglavlju 4.2.2. zaključili smo da majke biljke C. rubrum

“informaciju” o fotoperiodima kojima su bile izložene u toku svog životnog ciklusa

ostavljaju u semenu. Za klijanje semena i rastenje potomstva, ključni značaj ima

fotoperiod kome su majke biljke bile izložene u prvih 6 dana svog života, dok za

cvetanje i donošenje semena potomstva, značajniji uticaj ima fotoperiod koji je usledio

posle indukcije cvetanja majki biljki. Pretpostavili smo da bi ta “informacija” mogla biti,

između ostalog, sadržana i vidljiva u kompoziciji ukupnih proteina semena. Da bismo to

proverili, odredili smo ukupne koncentracije proteina (grafikon R 38) u semenima

sakupljenim sa biljaka gajenim na različitim fotoperiodima, i uradili razdvajanje proteina

semena (slika R5) poliakrilamid gel elektroforezom (SDS-PAGE). Koristili smo po 0.03

g suvih semena, imbibovanih u mraku 2.5h. Osim 4 grupe semena koja su dobijena sa

biljaka gajenih na različitim indukcionim fotoperiodima i kombinacijama različitih

fotoperioda (opisano u poglavlju 4.2.1.), u analizu proteina semena uvrstili smo i

semena sakupljena sa biljaka koje su prvih 17 dana gajene na kontinualnoj svetlosti, a

potom prebačene na indukcioni 14h/10h fotoperiod (opisano u poglavlju 4.1.3.1.).

Ukupna koncentracije proteina, u uzorcima semena sakupljenih sa biljaka

gajenih na različitim fotoperiodima, bile su prilično ujednačene (grafikon R38). Najviša

ukupna koncentracija proteina utvrđena je u semenima koja su sakupljena sa biljaka

koje su prvih 17 dana gajene na KS, a potom prebačene na 14h/10h fotoperiod.

Posle SDS –PAGE elektroforeze, na gelu je utvrđeno postojanje ukupno 33

proteinske trake koje su sve prisutne u svim uzorcima semena. 16 od ovih proteina se

ne menjaju u zavisnosti od fotoperioda na kojima rastu majke biljke. Za 17 od njih je

uočena razlika u širini i intenzitetu traka u zavisnosti od fotoperioda na kojima su

gajene majke biljke (slika R5). Možemo pretpostaviti da više od polovine (17 od ukupno

33) proteina semena, finim promenama količine u semenu, predstavljaju “informaciju” o

fotoperiodu majke biljke koju ona, u svom smenu, ostavlja za potomstvo. Da bismo

kvantifikovali ove razlike, odredili smo relativne vrednosti intenziteta ovih 17 proteinskih

traka (grafikon R39).

85

86

Grafikon R38: Efekat različitih fotoperioda na kojima su gajene majke biljke na ukupnu koncentraciju proteina semena.

0

10

20

30

40

50

14h/10h 6(8h/16h)+16h/8h 6(14h/10h)+16h/8h 16h/8h 17KS+14h/10h

Fotoperiodi na kojima su gajene majke biljke

Ko

nc

en

tra

cija

pro

tein

a (

mg

/g d

w)

Slika R5: Efekat različitih fotoperioda na kojima su gajene biljke na razlike u količinama pojedinih proteina semena (na gelu označene samo Rf vrednosti proteinskih traka kod kojih je uočena razlika u širini i intenzitetu u uzorcima semena dobijenim sa biljaka gajenih na različitim fotoperiodima).

Rel

ativ

na

vred

no

st in

ten

zite

ta t

raka

Rf = 0.20

0,00

20.000,00

40.000,00

60.000,00

80.000,00

Rf = 0.44

0,00

20.000,00

40.000,00

60.000,00

80.000,00Rf = 0.41

0,00

50.000,00

100.000,00

150.000,00

200.000,00

250.000,00

300.000,00

350.000,00

400.000,00

450.000,00

Rf = 0.24

0,00

20.000,00

40.000,00

60.000,00

80.000,00

Rf = 0.51

0,00

20.000,00

40.000,00

60.000,00

80.000,00 Rf = 0.58

0,00

50.000,00

100.000,00

150.000,00

200.000,00

250.000,00

300.000,00

350.000,00

400.000,00

450.000,00

Rf = 0.30

0,00

20.000,00

40.000,00

60.000,00

80.000,00

Rf = 0.72

0,00

20.000,00

40.000,00

60.000,00

80.000,00Rf = 0.64

0,00

50.000,00

100.000,00

150.000,00

200.000,00

250.000,00

300.000,00

350.000,00

400.000,00

450.000,00

Rf = 0.33

0,00

20.000,00

40.000,00

60.000,00

80.000,00

Rf = 0.76

0,00

20.000,00

40.000,00

60.000,00

80.000,00

Rf = 0.66

0,00

50.000,00

100.000,00

150.000,00

200.000,00

250.000,00

300.000,00

350.000,00

400.000,00

450.000,00

Rf = 0.36

0,00

20.000,00

40.000,00

60.000,00

80.000,00

Rf = 0.91

0,00

20.000,00

40.000,00

60.000,00

80.000,00

14h/10h 6(8h/16h) +16h/8h

6(14h/10h) +16h/8h

16h/8h 17KS +14h/10h

Rf = 0.80

0,00

50.000,00

100.000,00

150.000,00

200.000,00

250.000,00

300.000,00

350.000,00

400.000,00

450.000,00

Rf = 0.37

0,00

20.000,00

40.000,00

60.000,00

80.000,00

14h/10h 6(8h/16h) +16h/8h

6(14h/10h) +16h/8h

16h/8h 17KS +14h/10h

Rf = 0.83

0,00

50.000,00

100.000,00

150.000,00

200.000,00

250.000,00

300.000,00

350.000,00

400.000,00

450.000,00

14h/10h 6(8h/16h) +16h/8h

6(14h/10h) +16h/8h

16h/8h 17KS +14h/10h

Fotoperiodi na kojima su gajene majke biljke

Grafikon R39: Efekat različitih fotoperioda na kojima su gajene biljke na razlike u količinama pojedinih proteina semena (Izraženo relativnim vrednostima intenziteta traka).

87

Vidimo značajne razlike u relativoj vrednosti intenziteta traka svih 17 proteina

(grafikon R39).

Posmatranjem promena relativnih vrednosti intenziteta ovih 17 proteinskih traka

semena u odnosu na fotoperiode kojima su bile izložene majke biljke u toku svog

životnog ciklusa, primetili smo, i izračunali, njihove korelacije sa dužinama dana kojima

su majke biljke bile izložene u različitim fazama razvića, kao i sa klijanjem tih semena.

Visoke korelacije su uočene za 12 proteinskih traka, a rezultati su predstavljeni u tabeli

R1.

Tabela R1: Korelacije između promena relativnih vrednosti intenziteta 12 proteinskih traka semena (grafikon R 39), i dužina dana kojima su majke biljke bile izložene u različitim fazama razvića, ili klijanja.

Proteinska traka Dužina dana na kojoj su rasle majke biljke Koeficijent korelacije

Rf = 0.58 r = 0.94 Rf = 0.64 r = 0.93 Rf = 0.66

prvih 6 dana: 14h, 8h, 14h, 16h, 24h (grafikon R 39)

r = 0.96 Rf = 0.80 r = 0.97

Rf = 0.83

prvih 12 dana: 14h, (8h + 16h), (10h + 16h), 16h, 24h

(grafikon R 39 ) r = 0.81

Rf = 0.36 između 6 i 17. dana: 14h, 16h, 16h, 16h, 24h

(grafikon R 39 ) r = - 0.95

Rf = 0.30 r = - 0.88 Rf = 0.37

posle 17. dana: 14h, 16h, 16h, 16h, 14h (grafikon R 39 ) r = - 0.90

Klijanje Rf = 0.44 r = 0.85 Rf = 0.51 r = 0.94 Rf = 0.76 r = 0.97 Rf = 0.91

Procenat klijanja 2. dana prve 4 grupe semena (grafikon R 32, 39)

r = 0.99

Na osnovu korelacija koje smo uočili (tabela R 1), vidimo da određeni proteini

semena pokazuju promene koncentracija (promene relativnih vrednosti intenziteta

traka) u zavisnosti od dužina dana kojima su majke biljke bile izložene u određenim

fazama životnog ciklusa, i to:

-proteini semena čije su Rf vrednosti 0.58, 0.64 i 0.66 mogli bi biti sastavni deo

“informacije” o dužini dana kojoj su majke biljke bile izložene u prvih 6 dana,

-proteini čije su Rf vrednosti 0.80 i 0.83 mogli bi biti sastavni deo “informacije” o

dužini dana kojoj su majke biljke bile izložene u prvih 6 dana i neposredno posle toga,

-protein čija je Rf vrednost 0.36 mogao bi biti sastavni deo “informacije” o dužini

88

dana kojoj su majke biljke bile izložene posle 6, a pre 17 dana,

-proteini čije su Rf vrednosti 0.30 i 0.37 mogli bi nositi “informaciju” o dužini dana

posle 17 dana.

Dodatno, promene relativnih vrednosti intenziteta traka proteina semena čije su

Rf vrednosti 0.44, 0.51, 0.76 i 0.91 u zavisnosti od fotoperioda kojima su bile izložene

majke biljke u toku svog životnog ciklusa, pokazuju visoke korelacije sa procentima

klijanja tih semena 2. dana (grafikon R 22). Ovi proteini bi, prema tome, mogli

učestvovati u regulaciji klijanja potomstva, kao jednog od procesa sa najvećim

značajem u ontogenetskom razviću biljke. Istovremeno, klijanje je i prvi proces u toku

ontogeneze potomstva za koji je logično da se dešava “isključivo” pod uticajem

“informacija” koje je u semenu ostavila majka biljka, pre nego što mlada jedinka može i

sopstveno “iskustvo” faktora spoljašnje sredine da “uvrsti” u dalje rastenje i razviće (što

smo pokazali u poglavlju 4.2.2.1.3.). U skladu sa ovim, Mazzaella i saradnici (2005) su

pokazali da se osvetljavanje semena Arabidopsis-a posle 5 dana imbibicije u mraku na

5 ºC, uglavnom preko phyB, prenosi kao informacija o spoljašnjoj sredini kakvu će

klijanac najverovatnije iskusiti. Odnosno, semena Arabidopsis-a, koja zahtevaju

vernalizaciju da bi klijala, mogu da prime informacije iz spoljašnje sredine, i uporede ih

sa “informacijama” koje je u semenu ostavila majka biljka, već posle 5 dana imbibicije.

Možemo, takođe, uočiti da je povećana koncentracija ukupnih proteina u

semenima koja su sakupljena sa biljaka koje su prvih 17 dana gajene na KS (grafikon

R38), a potom prebačene na 14h/10h fotoperiod, posledica povećanih koncentracija

svega 6 proteina čije su Rf vrednosti 0.41, 0.51, 0.58, 0.66, 0.80 i 0.83 (grafikon R 39).

Otuda možemo pretpostaviti da ovih 6 proteina učestvuju u “informaciji”, kako o

neprekidnom osvetljavanju u početnim fazama razvića, tj. prvih 17 dana razvića, tako i

o “odloženoj” indukciji cvetanja za 17 dana u odnosu na ostale 4 grupe semena koje su

sakupljene sa biljaka koje su indukciju za cvetanje primile još u fazi razvića kotoledona

(od prvog dana gajenja na podlogama).

Svi ovi rezultati ukazuju da biljka C. rubrum u semenu ostavlja “kalendar”

promena dužina dana koje je u svojoj ontogenezi iskusila, i da je taj “kalendar”, između

ostalog, vidljiv u relativnoj kompoziciji proteina semena.

Analiza strukture i lokalizacije rezervnih materija semena Chenopodium quinoa

(Prego et al. 1998) pokazala je da su proteinske rezerve lokalizovane uglavnom u

endospermu i embrionu, kao i da je struktura semena vrlo slična ne samo u okviru roda

89

90

Chenopodium, već i u okviru familije Chenopodiaceae.

Analiza proteina semena sakupljenih sa biljaka 20 populacija Chenopodium

incanum, pokazala je veću sličnost proteinskih traka kada su uzorci semena uzimani sa

biljaka bliskih, nego geografski udaljenih, lokaliteta, mada je bilo i izuzetaka (Crawford

1974). Razdvajanjem proteina semena SDS PAGE elektroforezom različitih vrsta roda

Chenopodium (Bhargava et al. 2005), uočena je kako razlika u širinama pojedinih

proteinskih traka, tako čak, i prisustvo odnosno odsustvo pojedinih traka u uzorcima

semena iste vrste, sakupljenih sa udaljenih lokaliteta. Ova istraživanja su sprovedena u

cilju utvrđivanja taksonomskih kategorija i porekla i evolucije kultivisanih biljaka.

U našem slučaju, postojanje svih proteinskih traka (33) u svim uzorcima

semena, je s jedne strane, potvrda genetičke uniformnosti semena koja se umnožavaju

u staklari Instituta poslednjih petnaestak godina, a istovremeno i potvrda da su razlike u

količinama pojedinih proteina semena rezultat različitih fotoperioda kojima su izlagane

biljke sa kojih su semena sakupljana.

Prikazani rezultati mogu biti potvrda na biohemijskom nivou, fiziološki pokazanih materinskih efekata fotoperioda na rastenje i razviće: “informacije” o promenama dužina dana kojima su majke biljke bile izložene u toku svog životnog ciklusa i koju u semenu “ostavljaju” potomstvu, mogle bi, između ostalog, biti proteinske prirode. Visoke korelacije između promena koncentracija nekih proteina semena sa dužinama dana kojima su majke biljke bile izložene u određenim fazama životnog ciklusa, mogu ukazati da “materinski proteinski zapis” predstavlja “kalendar” promena dužina dana u toku života majke biljke.

Rezultati prikazani u ovom poglavlju ukazuju na sledeće zaključke: 1. Biljke Chenopodium rubrum odgovaraju na fotoperiod kome su izložene

u svim fazama razvića: rastenjem, cvetanjem, vremenom sazrevanja semena i brojem sazrelih semena. Sa povećanjem dužine dana, dolazi i do povećanja visine biljaka kao i broja listova, odlaže se cvetanje, biljke ranije u toku ontogeneze donose seme, i povećava se broj sazrelih semena i masa semena.

Fotoperiod kome su biljke C. rubrum izložene prvih 6 dana (indukcija cvetanja) i fotoperiod koji neposredno zatim sledi (evokacija cvetanja) određuje njihovo rastenje do kraja ontogeneze, cvetanje i sazrevanje semena.

2. Majke biljke C.rubrum u semenu ostavljaju “informaciju” o dužinama

dana koju su iskusile u toku svog životnog ciklusa, i to je mehanizam kojim majka biljka može da prilagodi fenotipove potomstva da poveća uspeh u spoljašnjoj sredini kakvu će najverovatnije iskusiti. Materinski efekat fotoperoda se kod biljaka C. rubrum proteže kroz čitav životni ciklus potomstva.

Za klijanje semena, visinu i broj listova potomstva, ključni značaj ima fotoperiod kome su majke biljke bile izložene u prvih 6 dana svog života, dok za cvetanje i donošenje semena potomstva, značajniji uticaj ima fotoperiod koji sledi posle indukcije cvetanja majki biljki.

“Informacije” o promenama dužina dana (i njihovom redosledu), kojima su majke biljke bile izložene u toku svog životnog ciklusa i koju u semenu “ostavljaju” potomstvu, mogli bi biti, između ostalog, na nivou proteina.

91

4.3. Efekat natrijum nitroprusida (SNP) i

kalijum cijanida (KCN) u toku vegetativnog

i reproduktivnog razvića C. rubrum in vitro

Utvrđeno je da NO, kao ključni signalni molekul kod biljaka (Neill et al. 2003),

stimulira klijanje kod različitih biljnih vrsta (Giba et al. 1998, Beligni and Lamatina 2000,

Neill et al. 2003), u zavisnosti od koncentracije inhibira ili stimulira rastenje (Stamler et

al. 1992), odlaže senescenciju (Leshem and Pinchasov 2000), odlaže cvetanje u korist

rastenja (He et al., 2004). Sva ova i mnoga druga istraživanja podržavaju ideju da je

NO “do it all” molekul (Delledonne 2005) koji ima suštinsku ulogu tokom čitavog života

biljke. Uticaj NO na biljke i većinu organizama se ispituje primenom NO-donora, a

najčešće se koristi natrijum nitroprusid (SNP).

Bethke i saradnici (2006) su pokazali da kako SNP, tako i KCN, kalijum

fericijanid (K3[Fe(CN)6]) i kalijum ferocijanid (K4Fe(CN)6) smanjuju dormanciju A.

thaliana, generišući CN-. Osim toga, efekti CN-, nitrita i nitrata na smanjivanje ili

ukidanje dormancije bili su sprečeni “sakupljačem” NO c-PTIO. Takođe, su pokazali da

je količina oslobođenog NO gasa iz SNP vrlo mala, te da efekat SNP potiče od gasa

CN. Pretpostavili su da primena cijanida može imati za rezultat povišen unutarćelijski

nivo NO interagujući sa enzimima koji vrše detoksikaciju NO (Bethke et al. 2006).

Kod biljaka je pokazana signalna uloga NO i u hormonskim i odbrambenim

odgovorima. Guo i saradnici (2003) su utvrdil da se produkcija NO u vrhovima

korenova klijanaca A. thaliana značajno povećava u ABA tretiranim korenovima. ABA

takođe pojačava sintezu NO u stomama i dovodi do njihovog zatvaranja (Neil et al.

2002). Pagnussat i saradnici (2002) su pokazali da NO posreduje u auksinskoj kontroli

formiranja adventivnih korenova krastavca. Pokazano je i da NO ima suprotan efekat

etilenu, tj. da sprečava sazrevanje plodova jagode i avokada (Leshem and Pinchasov

2000). Citokinin, kao hormon koji inhibira senescenciju, stimulira produkciju NO (Tun et

al 2001). Međutim, pretpostavljeno je da giberelini i NO u regulaciji klijanja pšenice

učestvuju nezavisnim putevima (Zhang et al. 2005).

92

4.3.1. Efekat SNP i KCN na klijanje semena C. rubrum

Prvi otkriveni fenomen vezan za NO kod biljaka, bio je stimulacija klijanja

indukovana svetlošću, iako je delovanje nitrita i nitrata na stimulaciju klijanja poznata

još od početka 20. veka. Jedinjenja, kao SNP, promovišu klijanje posebno

fotoblastičnih semena, povećavajući njihovu osetljivost na svetlost. Ali i nefotoblastična

(Sisymbrium officinale, Karssen and Hilhorst 1992), i čak ni ona koja normalno ne

dolaze u kontakt sa zemljištem bogatim nitratima (familija Gentianaceae, Grubišić et al.

1995) odgovaraju na SNP. Takođe je pokazano da SNP, ili drugi NO donori, utiču na

phy A specifičnu indukciju klijanja A. thaliana (Batak et al. 2002).

Osetljivost dormantnih semena na azotne okside može da objasni promotivni

efekat dima, koji se razvija usled požara, na klijanje i to kao ekstremni slučaj

generalnog mehanizma kojim ekosistemi regulišu vreme i dinamiku klijanja različitih

vrsta u vezi sa sezonskim promenama spoljašnje sredine. Prenosioci ovih informacija

su azotni oksidi. Oni se u zemljištu nalaze kao gasovi u tragovima i pružaju informaciju

kako o nivou nitrata u zemljištu, tako i o mikrobialnoj aktivnosti, što je u vezi sa

sezonskim i klimatskim promenama spoljašnje sredine koju će klijanci iskusiti (Giba et

al. 2004).

4.3.1.1. Efekat SNP na klijanje semena C. rubrum

Da bismo ispitali efekat NO na klijanje C.rubrum, koristili smo NO donor SNP (10

– 200 μM).

U testovima klijanja korišćena su dva stoka semena, stara 3-4 godine,

sakupljena na dve dužine dana. Jedan stok je sakupljen na 13h danu (masa 100

semena = 0.0262 0.0011 g), a drugi na 14h danu (masa 100 semena = 0,0314

0.0005 g). Dužina dana u vreme cvetanja i zametanja ovih semena nije registrovana.

Pošto su uočene razlike u klijanju ovih semena, rezultati su posebno predstavljeni na

grafikonu R40 A) i B).

SNP stimulira klijanje semena C.rubrum sazrelog na 13h/11h fotoperiodu, u

nižim koncentracijama (10 i 50 μM) i to samo u najranijim fazama klijanja (1. dan

klijanja), dok 150 μM SNP inhibira klijanje, takođe samo 1. dana klijanja, a taj efekat se

93

gubi do 4. dana klijanja (grafikon R40 A). Maksimalna stimulacija klijanja Paulownia

tomentosa (Giba et al. 2004) bila je postignuta sa 10-3 M SNP, dok je Bethke et al.

(2005) pokazao da para SNP (100 i 200 μM) stimulira klijanje i ukida dormanciju

Arabidopsis thaliana. Takođe je pokazano da SNP (do 200 μM) stimulira klijanje Sueda

salsa (familija Chenopodiaceae) (Li et al. 2005).

Grafikon R40: Efekat SNP (0 – 200 μM) na klijanje semena C.rubrum sazrelog na A) 13h/11h fotoperiodu starog 3 godine i B) -14h/10h fotoperiodu, starog 4 godine.

A)

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4

Vreme (dani)

Klij

anje

(%

)

Kontrola

SNP10

SNP 50

SNP100

SNP150

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4

Vreme (dani)

Klij

anje

(%

)

Kontrola

SNP 10

SNP 50

SNP 100

SNP 200

B)

94

Interesantno je primetiti da je efekat SNP na klijanje C. rubrum značajno manje

izražen (nema statistički značajnih razlika) kada je seme sazrelo na 14h/10h

fotoperiodu (grafikon R40 B). U prilog prethodnom poglavlju (4.2.2.1.2.) koje govori o

materinskom efektu fotoperioda, na kljanje, vidimo da semena sazrela na 14h/10h

fotoperiodu (grafikon R40 B) imaju drugačiju krivu klijanja (posmatramo klijanje

kontrolnih semena) u odnosu na semena sazrela na 13h/11h fotoperiodu (grafikon R40

A), ali da pokazuju i drugačiju osetljivost na SNP. U prva dva dana klijanja, kontrolna

semena sazrela na 14h/10h fotoperiodu klijaju svega 9 %, odn 15% (grafikon R40 B),

za razliku od semena sazrelih na 13h/9h fotoperiodu koja za isto vreme klijaju 35 %,

odn, čak 81 % (grafikon R40 A). Trećeg i četvrtog dana klijanja, ova se razlika gubi,

kada je u oba slučaja klijanje je blizu 100 % (grafikon R40 A, B).

Ranije su spomenuti podaci iz literature koji govore o razlici u veličini semena,

debljini semenjače, klijanju kada semena sazrevaju na kratkom, ili dugom danu

(Bewley and Black 1982, Bertero et al. 1999, Gutterman and Evenari 1972, Gutterman

2000, Gutterman 2002, Cook 1975, Mitrović et al. 2002). U našem slučaju, reč je o

razlici u dužini dana od samo 1h (13h, tj. 14h), tj. 1 mesec dana u sejanju, tj. kasnije i

sakupljanju semena. Ali bismo mogli pretpostaviti da kombinacija dužine dana i

specifične temperature u vreme zametanja i sazrevanja semena, može da dovede do

razlike i u debljini semenog omotača, što može da dovede i do sporijeg klijanja semena

sazrelih na 14h/10h fotoperiodu (grafikon R40 B), a takođe i do razlike u permeabilnosti

semenjače za SNP. Dodatno, ova semena se razlikuju i po starosti ( 3, odnosno 4

godine)

4.3.1.2. Efekat SNP i GA3 na klijanje semena C.rubrum

Za GA je pokazano da, najverovatnije, nema aditivni efekat sa NO na rane faze

klijanje pšenice (prvih 12 časova) i da bi ova dva molekula mogla da funkcionišu u

različitim signalnim kaskadama (Zhang et al. 2005). Pretpostavljeno je da bi NO mogao

da deluje kao rani stimulator β-amilaze da inicira klijanje, dok GA igra ključnu ulogu u

kasnijim fazama klijanja. Jovanović i saradnici (2005) su pokazali da nitrit giberelne

kiseline gubi svoju giberelinsku aktivnost posle nitrozilacije i stimulira klijanje P.

tomentoza i Stellaria media preko NO puta, kao i druga jedinjenja koja oslobađaju NO.

95

Iz rezultata prikazanih u poglavlju 4.3.1.1. smo odabrali koncentraciju od 50 μM

SNP (grafikon R40 A), a za 15 mM GA3 je ranije pokazano da ima najveći efekat na

rastenje i cvetanje C.rubrum (Mitrović 1998). Klijanje je praćeno svaka 24h tokom 4

dana u destilovanoj vodi, GA3 (15 mM GA3) i/ili SNP (50 M).

Pokazali smo (Dučić et al. 2003/4) da 160 M GA3 nema efekta na klijanje

C.rubrum. Ali koncentracija od 15 mM, koja je stimulirala rastenje i cvetanje C.rubrum

in vitro (Mitrović 1998) stimulira i klijanje u prva dva dana (grafikon R41). Pokazano je

da 50 M SNP stimulira klijanje, ali je 1. dana očigledan slab zbirni stimulatorni efekat

GA3 i SNP (grafikon R41). Ovaj efekat se kasnije u toku klijanja gubi. Trećeg i četvrtog

dana klijanja postignut je maksimalan procenat klijanja bez obzira na tretman (96 –

98%).

Grafikon R41: Efekat SNP (50 M) i/ili GA3 (15 mM) na klijanje semena C.rubrum sazrelog na 13h/11h fotoperiodu, starog 3 godine.

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4

Vreme (dani)

Kli

jan

je (

%) Kontrola

GA

SNP

GA+SNP

4.3.1.3. Efekat KCN na klijanje semena C. rubrum

Kao i u slučaju ispitivanja klijanja na SNP-u (grafikon R40), i ovde smo koristili

dva stoka semena, stara 3-4 godine, sazrela/sakupljena na dve dužine dana: 13h i 14h,

pa su zbog uočenih razlika rezultati su posebno predstavljeni na grafikonu R42 A) i B).

96

Vidimo da semena sazrela na 14h/10h (grafikon R42 A) fotoperiodu imaju

drugačiju krivu klijanja (posmatramo klijanje kontrolnih semena) u odnosu na semena

sazrela na 13h/11 fotoperiodu (grafikon R42 B), kao i da su procenti isklijalih semena 3

i 4. dana klijanja veći kod onih sazrelih na 13h/11h fotoperiodu.

Grafikon R42: Efekat KCN (10 – 1000 μM) na klijanje semena C.rubrum sazrelog na A) 13h/11h fotoperiodu i B) sazrelog na 14h/10h fotoperiodu, starog 3 godine.

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4

Vreme (dani)

Klij

anje

(%

)

Kontrola

KCN 200

KCN400

KCN 800

A)

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4

Vreme (dani)

Klij

anje

(%

) Kontrola

KCN 10

KCN 50

KCN 100

KCN 200

KCN 1000

B)

KCN (10 μM) stimulira klijanje prvog dana (grafikon R42 B), dok taj efekat

nestaje kasnije u toku klijanja. Više koncentracije KCN (100 - 1000 μM) inhibiraju

klijanje. Klijanje na 1000 μM KCN započinje tek 3. dana (grafikon R42 B), dok 4. dana

97

98

ova koncentracija stimulira klijanje.

Slično kao i na grafikonu R40 A) i B) koji pokazuju klijanje na SNP-u semena

sazrelih na različitim fotoperiodima, i na grafikonima R42 A) i B) koji pokazuju klijanje

na KCN, uočavamo različitu osetljivost semena sazrelih na dužinama dana od 13h i

14h na KCN. KCN (200 μM) inhibira klijanje semena, sazrelog na 13h/11h fotoperiodu,

prvog dana (30%) u odnosu na kontrolu (39%) (grafikon R40 A), dok ista koncentracija

KCN u slučaju semena sazrelog na 14h/10h fotoperiodu (grafikon R42 B), čak odlaže

početak klijanja na 2. dan.

Ako uporedimo efekte SNP (grafikon R40 B) i KCN (grafikon R42 B) na klijanje

C. rubrum, možemo da uočimo da je stimulatorni efekat 10 μM KCN više izražen nego

stimulatorni efekat iste koncentracije SNP.

4.3.1.4. Efekat cPTIO, KCN, i SNP na klijanje C.rubrum.

Već je pomenuto da egzogena primena NO kod biljaka i indukcija odgovora,

naravno sama po sebi ne dokazuje da endogeni NO utiče na određeni razvojni ili

fiziološki proces koji se proučava. Da bi se obezbedio pouzdan dokaz za ulogu NO,

korisno je pokazati da efekat donora NO može biti poništen primenom »uklanjača« NO,

kao što je PTIO (2-fenil-4,4,4,4-tetrametilimidazolin-1oksil 3-oksid) ili cPTIO

(karboksiPTIO) (Neill et al. 2003).

Grafikon R43: Efekat cPTIO (100 – 200 μM) na klijanje semena C.rubrum. Semena sazrela na 13h/11h fotoperiodu, starog 3 godine.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Klij

anje

(%

)

1 2 3 4

Vreme (dani)

Kontrola

cPTIO 100

cPTIO 200

Da bismo ispitali efekat “uklanjača” NO na klijanje C.rubrum , koristili smo cPTIO

(100 – 200 μM). (grafikon R43). Inhibicija klijanja izazvana cPTIO je daleko jače

izražena u ranijim fazama klijanja, tj u prva dva dana (grafikon R43), dok se 3. i 4. dana

gubi (nema statistički značajnih razlika). Pri tome nema statistički značajne razlike u

inhibiciji klijanja koju izaziva 200 μM i 100 μM cPTIO. To bi moglo da bude u skladu sa

podacima Zhang i saradnika (2005) koji su pokazali da NO kontroliše rane faze klijanja

pšenice (prvih 12 h), najverovatnije kao rani stimulator β-amilaze koja inicira klijanje. U

našem slučaju možemo pretpostaviti da su početne faze klijanja, kontrolisane

endogenim NO, inhibirane prisustvom cPTIO. Prvog dana klijanja inhibicija izazvana sa

100 μM cPTIO je oko 50%, dok 3. i 4. dana, kada je već postignut maksimum klijanja,

semena tretirana cPTIO “sustižu” kontrolna semena.

Grafikon R44: Efekat cPTIO (50 μM), KCN (50 μM) i SNP (50 μM) na klijanje semna C.rubrum. Semena sazrela na 14h/10h fotoperiodu, starog 4 godine.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4

Vreme (dani)

Klij

anje

(%

)

KCN

KCN + cPTIO

SNP

SNP + cPTIO

cPTIO srazmerno primenjenoj koncentraciji, pojačavao je dormanciju semena A.

thaliana, dok nije uticao na klijanje nedormantnih semena (Bethke et al. 2006). Bethke i

saradnici (2006) su pokazali da efekat SNP na ukidanje dormancije semena A. thaliana

može biti poništen dodavanjem iste koncentracije cPTIO, i da dalje povećavanje

99

100

koncentracije cPTIO nema efekta.

S obzirom da smo se odlučili za koncentraciju od 50 μM SNP, pa i KCN kao

najefektivnije u većini praćenih procesa, pokušali smo da pokažemo i zajednički efekat

cPTIO (50 μM) sa SNP ili KCN (grafikon R44).

Vidimo (grafikon R44) da cPTIO (50 μM) kada se nađe u medijumu za klijanje C.

rubrum zajedno sa KCN (50 μM), čak stimulira klijanje u odnosu na klijanje na KCN. Na

suprot tome, cPTIO (50 μM) zajedno u medijumu za klijanje sa SNP (50 μM), inhibira

klijanje u odnosu na klijanje na SNP-u, što je u skladu sa rezultatima Bethke et al

(2006). Oni su na semenu Arabidopsis thaliana pokazali da i SNP i CN i nitriti dovode

do povećanja količine NO, koja onda reaguje sa cPTIO i smanjuje njihov efekat na

klijanje.

SNP (10 i 50 μM) stimulira klijanje semena C.rubrum u najranijim fazama (1. dan). I GA3 (15 mM) i SNP (50 M) stimuliraju najranije faze klijanja. Prvog dana klijanja, očigledan je

zbirni stimulatorni efekat GA3 i SNP, ali se on, kasnije u toku klijanja, gubi. KCN (10 μM) stimulira klijanje C. rubrum u ranim fazama klijanja (prvog dana).

Veći stimulatorni efekat na klijanje C. rubrum pokazuje KCN (10 μM) u odnosu SNP (u istoj koncentraciji)

cPTIO (100 i 200 μM) inhibira klijanje C. rubrum u ranijim fazama klijanja (u prva dva dana). cPTIO (50 μM) zajedno u medijumu za klijanje sa SNP (50 μM), inhibira klijanje u odnosu na klijanje na SNP-u, nasuprot tome, čak stimulira klijanje u odnosu na klijanje na KCN.

4.3.2. Efekat SNP i KCN na rastenje C. rubrum in vitro

4.3.2.1. Efekat SNP na rastenje C. rubrum in vitro

Po sterilnom isklijavanju semena, biljčice (4 dana stare) su postavljane na MS

podlogu sa 5% saharoze i različitim koncentracijama SNP (10 – 150 μM) i gajene 10

nedelja na indukcionom 14h/10h fotoperiodu.

Niže koncentracije SNP (10 i 50 μM) stimuliraju izduživanje stabla u prve tri

nedelje, ali se taj efekat gubi u kasnijim fazama razvića (grafikon R45). 100 i 150 μM

SNP inhibira izduživanje u odnosu na kontrolu, kroz čitav životni ciklus C.rubrum.

Stimulacija rastenja izazvana SNP (do 100 μM) pokazana je kod Arabidopsis-a, dok su

više koncentracije bile inhibitorne (He et al. 2004).

Grafikon R45: Efekat SNP (0 – 150 μM) na visinu stabla C.rubrum in vitro na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu. Biljke poreklom od semena sazrelog na 16h/8h fotoperiodu in vitro, starog 2 godine.

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7 8 10

Vreme (nedelja)

Vis

ina

(mm

)

Kontrola

SNP 10

SNP 50

SNP 100

SNP 150

Uočavamo i tranzijentno zaustavljanje rastenja (grafikon R45) u vreme cvetanja

(grafikon R48) u 3. i 4. nedelji i kod kontrolnih biljaka i onih gajenih na SNP (10 i 50

μM). tj. ono je pomereno na 4. i 5. nedelju, kao i cvetanje (grafikon R42 i grafikon R48),

kod biljaka gajenih na 100 i 150 μM SNP. Odloženo cvetanje biljaka tretiranih SNP (10

– 100 μM) pokazano je i kod Arabidopsis thaliana (He et al. 2004).

101

Grafikon R46: Efekat SNP (10 – 150 μM) na broj pravih listova C.rubrum in vitro na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu.

0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4 5 6 7 8 10

Vreme (nedelja)

Bro

j p

ravi

h li

sto

va

Kontrola

SNP 10

SNP 50

SNP 100

SNP150

Slika R5: Efekat SNP (10 – 150 M) na rastenje, cvetanje i sazrevanje semena C.rubrum gajenih in vitro na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu, posle 10 nedelja gajenja.

Kontrola SNP

10 M SNP

50 M SNP

100 M SNP

150 M

Kao i u slučaju izduživanja stabla, niže koncentracije SNP (10 i 50 μM)

stimuliraju formiranje listova (grafikon R 46), ali samo u prve dve nedelje, što je takođe

u skladu sa podacima He i saradnika (2004), dok više koncentracije SNP (100 i 150

μM) inhibiraju pojavu listova sve do 7. - 8. nedelje razvića, kada se taj efekat gubi.

102

4.3.2.2. Efekat SNP i GA3 na rastenje C.rubrum in vitro

Biljčice su posle sterilnog isklijavanja postavljane na MS podloge sa 5 %

saharoze i SNP (50 M) i/ili GA3 (15 mM) i gajene na indukcionom 14h/10h fotoperiodu.

Grafikon R47: Efekat SNP (50 M) i/ili GA3 (15 mM) na rastenje C.rubrum in vitro na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu. Biljke gajene od semena sazrelog na 13h/11h fotoperiodu, starog 3 godine.

0

5

10

15

20

25

30

1 2 4

Vreme (nedelja)

Vis

ina

(mm

)

Kontrola

GA

SNP

GA + SNP

Grafikon R48: Efekat SNP (50 M) i/ili GA3 (15 mM) na broj pravih listova C.rubrum, gajenih in vitro na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu.

0

1

2

3

4

5

6

7

1 2 4

Vreme (nedelja)

Bro

j pra

vih

list

ova

Kontrola

GA

SNP

GA + SNP

103

Kao što je i u poglavlju 4.3.2.1. pokazano SNP (50 M) ima stimulatorni efekat

na izduživanje stabla C. rubrum (grafikon R47). Slično je ranije pokazano (Živanović et

al. 1995, Mitrović 1998, Mitrović et al. 2005) i za GA3 (15 mM), međutim na grafikonu

R47 vidimo da SNP “umanjuje” stimulatorni efekat giberelina na izduživanje stabla.

Tačnije, SNP (50 M) i GA3 (15 mM) zajedno u podlozi, stimuliraju izduživanje u

odnosu na kontrolu (2. i 4. nedelje), ali kao srednja vrednost pojedinačnih efekata SNP

i GA3. Vrlo sličan efekat SNP (50 M) i GA3 (15 mM) može se videti i na razviće listova

(grafikon R48).

4.3.2.3. Efekat KCN na rastenje C. rubrum in vitro

Da bismo uporedili efekte SNP i KCN na rastenje i cvetanje, kao što smo

prethodno uradili za klijanje, biljčice sa potpuno razvijenim kotiledonima, stare 4-5

dana, postavljali smo na MS podloge sa 5% saharoze i KCN (10 – 1000μM). Posle 15

dana gajenja, merili smo visinu biljaka (grafikon R49), broj pravih listova (grafikon R50)

i određivali smo procenat procvetalih biljaka (grafikon R51).

Vidimo da KCN (10 – 200 μM) nema značajan efekat na rastenje stabla

(grafikon R49), dok jedino 1000 μM KCN deluje inhibitorno. Na grafikonu R45 na kome

je prikazan efekat SNP na rastenje i vidimo da SNP stimulira rastenje u nižim

koncentracijama (10 i 50 μM), dok su više koncentracije (do 150 μM) inhibitorne.

Možemo zaključiti da KCN i SNP nemaju slične efekte na klijanje semena i na procese

daljeg rastenja C. rubrum.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 10 50 100 200 1000

KCN (μM)

Vis

ina

(mm

)

Grafikon R49:

Efekat KCN (10 – 1000 μM) na rastenje C.rubrum gajenim in vitro na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu, 15 dana. Biljke gajene od semena sazrelog na 14h/10h fotoperiodu, starog 3 godine.

104

105

KCN u svim testiranim koncentracijama značajno stimulira razviće listova

(grafikon R50, Slika R6), što se takođe ne podudara sa podacima za efekat SNP na

razviće listova (grafikon R46) gde vidimo da samo 10 μM SNP stimulira razviće listova

posle dve nedelje gajenja in vitro.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 10 50 100 200 1000

KCN (μM)

Bro

j pra

vih

lis

tov

a

Grafikon R50: Efekat KCN (10 – 1000 μM) na broj pravih listova C.rubrum gajenim in vitro na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu, 15 dana.

Slika R6: Efekat KCN (10 – 1000 μM) na rastenje C.rubrum in vitro na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu.

SNP (10 i 50 μM) stimulira izduživanje stabla i rastenje listova C.rubrum u prve dve nedelje razvića, dok SNP (100 i 150 μM) deluju inhibitorno. Od 5 – 10 nedelje razvića, sve primenjene koncentracije SNP (10 – 150 μM) deluju inhibitorno na rastenje.

I SNP (50 M) i GA3 (15 mM) stimuliraju izduživanje stabla i razviće listova C. rubrum, ali je stimulatorni efekat GA3 izraženiji. Kada se nađu zajedno u podlozi, SNP “umanjuje” stimulatorni efekat giberelina.

KCN (10 – 200 μM) nema značajan efekat na rastenje stabla C. rubrum, dok 1000 μM KCN deluje inhibitorno. KCN (10 – 1000 μM) stimulira razviće listova C. rubrum.

4.3.3. Efekat SNP i KCN na cvetanje i donošenje semena

C. rubrum in vitro

4.3.3.1. Efekat SNP na cvetanje i donošenje semena C. rubrum in vitro

Zivot cvetnica je podeljen u dve odvojene faze: prvu vegetativnu u kojoj

meristem produkuje listove za kojom sledi druga – reproduktivna u kojoj meristem

produkuje cvetove. Genetičkim istraživanjima je utvrđeno da je prelazak iz vegetativne

u reproduktivnu fazu razvića kod Arabidopsis-a (Simpson and Dean 2002) kontrolisan

signalima iz spoljašnje sredine (fotoperiodom i vernalizacijom) i internim signalima,

(autonomnom i giberelinskom kontrolom).

Grafikon R51: Efekat SNP (10 – 150 μM) na cvetanje C.rubrum in vitro na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu. Biljke poreklom od semena sazrelog na 16h/8h fotoperiodu in vitro, starog 2 godine.

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7 8 10

Vreme (nedelja)

Cve

tan

je (

%)

Kontrola

SNP 10

SNP 50

SNP 100

SNP 150

Pokazano je da NO učestvuje u fotoperiodskoj i autonomnoj kontroli cvetanja, tj

može da integriše egzogene i endogene signale time što je nastajanje NO kako

kontrolisano spoljšnjim stimulusima tako se on i konstitutivno sintetiše (He et al 2004).

Tako se informacije iz spoljašnje sredine i “uputstva” iz same biljke sustiču u jednoj

tački – regulaciji nivoa NO, koji prenosi te signale na mrežu procesa koji dovode do

tranzicije u cvetanje, a regulisani su na nivou transkripcije. Time je obezbeđen

106

jedinstven nivo regulacije cvetanja. Pokazano je da egzogena primena SNP na klijance

Arabidopsis thaliana dovodil do odlaganja cvetanja i pojačanog vegetativnog rastenja

(He et al. 2004) i dati su farmakološki, fiziološki, molekularni i genetički dokazi da NO

vrši represiju i fotoperiodskog i autonomnog puta koji dovode do cvetanja. Iako je za

više gena utvrđeno da su pod regulacijom i svetlosti i NO-a, pretpostavljeno je da je

primarna uloga NO u prevođenju svetlosnog signala, dok je njegov efekat na cvetanje

posredan (He et al. 2004).

Grafikon R52: Efekat SNP (0 – 150 μM) na donošenje semena C.rubrum in vitro na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu.

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 10

Vreme (nedelja)

Bro

j bil

jaka

sa

zrel

im s

emen

om

(%

)

Kontrola

SNP 10

SNP 50

SNP 100

SNP150

Slično kao i rastenje, samo 10 μM SNP stimulira cvetanje (grafikon R51), pa

druge nedelje na ovoj podlozi cveta 33% biljaka u odnosu na svega 4% kontrolnih. Više

koncentracije SNP (100 i 150 μM) inhibiraju cvetanje. Na podlozi sa 100 μM SNP

cvetanje je uočeno 3. nedelje, a na 150 μM tek 6. nedelje razvića. Vidimo da SNP (100

μM i 150 μM) odlažu cvetanje. U 7. nedelji i na podlozi sa 100 μM SNP cveta 100%

biljaka, a na 150 μM SNP svega 12.5% biljaka, što je u skladu sa podacima He et al.

(2004).

Sazrevanje semena (grafikon R52) započinje 4-5 nedelja posle početka cvetanja

(grafikon R51) u slučaju kontrolnih biljaka. Možemo primetiti da SNP (50 i 100 μM)

“ubrzavaju” sazrevanje semena. Takođe vidimo (grafikon R52) da je najveći broj biljaka

107

108

sa zrelim semenom 8. i 10. nedelje upravo na 50 μM SNP.

4.3.3.2. Efekat SNP i GA3 na cvetanje C. rubrum in vitro

Kako je već spomenuto, Simpson i Dean (2002) su pokazali da je tranzicija u

cvetanje kod Arabidopsis-a kontrolisana fotoperiodom i vernalizacijom, kao faktorima

spoljašnje sredine i autonomnom i giberelinskom kontrolom kao internim mehanizma

biljke. He i saradnici su pokazali da je nivo NO u biljci kontrolisan fotoperiodom i

autonomnim signalima, a povišenje nivoa NO funkcioniše u smislu odlaganja cvetanja

(He et al. 2004). S druge strane, Kulikowska-Gulewska i saradnici (2000) su

pretpostavili da giberelini igraju značajnu ulogu u fitohromski kontrolisanim procesima

koji dovode do cvetanja. Prema tome veza između NO i GA u kontroli cvetanja, mogla

bi se pretpostaviti na nivou fotoperiodske kontrole.

Grafikon R53: Efekat SNP (50 M) i/ili GA3 (5mg/l) na cvetanje C.rubrum in vitro na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu. Biljke gajene od semena sazrelog na 13h/11h fotoperiodu, starog 3 godine.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 4

Vreme (nedelja)

Cve

tan

je (

%)

Kontrola

GA

SNP

GA + SNP

SNP (50 M) odlaže cvetanje (grafikon R53). Cvetanje se na podlozi sa SNP

javlja tek u drugoj nedelji gajenja, kada na kontrolnoj podlozi cveta već 54 % biljaka.

GA3 (15 mM) značajno stimulira cvetanje u prve dve nedelje gajenja. 80%, biljaka na

podlozi sa GA3 cveta u odnosu na svega 10% biljaka na kontrolnoj podlozi, na kraju

prve nedelje, dok cvetanje nije uočeno na podlozi sa SNP (50 M). SNP u podlozi

zajedno sa GA3 umanjuje stimulatorni efekat giberelina, i ovaj efekat se uočava tokom

109

110

sve 4 nedelje gajenja (grafikon R53). He et al. (2004) je ukazao da bi NO mogao da

funkcioniše paralelno sa GA u regulaciji cvetanja: GA je promovisao cvetanje kod nox1

Arabidopsis-a (mutant sa povišenim endogenim nivoom NO i patuljastim fenotipom), ali

nije mogao da revertuje patuljasti fenotip.

Naši podaci su u skladu sa gore navedenom literaturom, jer SNP kao donor

egzogenog NO odlaže/inhibira cvetanje C. rubrum in vitro, na indukcionom fotoperiodu,

GA3 stimulira cvetanje, što je i ranije pokazano (Mitrović 1998), dok ova dva jedinjenja

kada se nađu zajedno u podlozi “sabiraju” svoja inhibitorna odn. stimulatorna dejstva.

Na osnovu navedene literature (Simpson and Dean 2002, Kulikowska-Gulewska et al.

2000) i naših podataka, možda bismo mogli pretpostaviti da NO put regulacije cvetanja

(preko fotoperioda i autonomnimne kontrole) i giberelinski put (takođe povezan sa

fotoperiodom) nisu povezani.

4.3.3.3. Efekat KCN na cvetanje C.rubrum in vitro

Uočili smo da samo 10 μM SNP stimulira cvetanje (grafikon R51), dok više

koncentracije (do 150 μM) odlažu ili inhibiraju cvetanje što je u skladu sa podacima He i

saradnika (2004) na A. thaliana. KCN nema sličan efekat sa SNP ni na cvetanje, pošto

vidimo (grafikon R54) da 10 – 200 μM KCN blago stimulira cvetanje, dok samo 1000

μM KCN inhibira cvetanje.

Grafikon R54:

Efekat KCN (10 – 1000 μM) na cvetanje C.rubrum gajenim in vitrna MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu, 1dana. Biljke gajene od semena sazrelog na 14h/10h fotoperiodu starog 3

o

5

godine.

Tanaka i saradnici (1983) su pokazali da fericijanid, ferocijanid i KCN mogu

indukovati cvetanje kod kratkodnevne biljke Lemna paucinostata in vitro i to pod

0

20

40

60

80

100

0 10 50 100 200 1000

KCN (μM)

Cve

tan

je (

%)

111

neprekidnom svetlošću. Kombinovanjem pokrovki od gaze i stakla, indukcije kratkim

danom i dodavanjem KOH, zaključili su da raspadanjem fericijanida, ferocijanida i KCN

nastaje HCN koji je odgovoran za idukciju cvetanja L. paucinostata.

SNP (10 μM) stimulira cvetanje C. rubrum, dok više koncentracije SNP (100 μM 150 μM) odlažu cvetanje.

SNP (50 i 100 μM) ubrzava sazreanje semena C. rubrum. SNP (50 M) odlaže cvetanje, dok GA3 (15 mM) značajno stimulira cvetanje. Kada se nađu

zajedno u podlozi, SNP umanjuje stimulatorni efekat giberelina na cvetanje. KCN (10 – 200 μM) stimulira cvetanje C. rubrum, dok samo 1000 μM KCN inhibira cvetanje.

Rezultati prikazani u ovom poglavlju ukazuju na sledeće zaključke: SNP i KCN, pokazuju različite efekte na klijanje, rastenje i cvetanje C.rubrum (tabela D2).

Klijanje: 10 i 50 μM SNP stimulira klijanje 1. dana, dok 10 μM KCN stimuliraju klijanje 1. dana. cPTIO ne ukida stimulaciju klijanja izazvanu KCN, već je čak i pojačava. Rastenje: 10 i 50 μM SNP stimulira izduživanje stabla i razviće listova u prve dve nedelje, dok 10-200 μM KCN nema efekta na izduživanje stabla, a stimulira razviće listova. Cvetanje: 10 μM SNP stimulira cvetanje, dok 50-150 μM odlaže. KCN (10-200 μM) stimulira cvetanje.

Pokazali smo da NO (SNP) i GA3 imaju efekta na klijanje, rastenje i cvetanje C. rubrum, ali na osnovu podataka dobijenih njihovim zajedničkim prisustvom u podlozi, možemo pretpostaviti da je njihova uloga u ovim procesima nezavisna, ili ako su na istom transdukcionom putu, njihovo mesto aktivnosti je veoma udaljeno.

Tabela D2: Efekti SNP i KCN na klijanje, rastenje, cvetanje i sazrevanje semena C.rubrum.

SNP KCN

SNP

(10-150 μM) GA3

(15 mM)

GA3 (15 mM) +

SNP (50 μM)

cPTIO (50 μM) +

SNP (50 μM)

KCN (10-1000 μM)

cPTIO (50 μM) +

KCN (50 μM)

cPTIO (50 μM)

klijanje 10 i 50 μM stimulira 1. dana

stimulira 1. dana

zbirni stimulatorni

efekat 1. dana

cPTIO inhibira u odnosu na SNP

1.-4. dana

10 μM stimulira 1. dana

cPTIO stimulira u odn na KCN

inhibira 1. i 2. dana

visina _

10-200 μM nema efekta,

1000 μM inhibira

_ _ Rastenje

Broj listova

10 i 50 μM stimulira

1. i 2. nedelje. 100 i 150 μM

inhibira. _ stimulira _ _

Cvetanje

10 μM stimulira,

50-150 μM odlaže

stimulira

SNP umanjuje stimulatorni

efekat GA3

_ 10-200 μM stimulira

_ _

Sazrevanje semena

50-150 μM ubrzava

_ _ _ _ _ _

112

5. Zaključci

1

Tokom klijanja semena C.rubrum dolazi do sekvencijalne ekspresije

antioksidativnih sistema. Pred izbijanje radikule catalaza (CAT), superoksid

dismutaze (SOD) i dehidroaskorbat (DHA) pokazuju maksimalnu aktivnost, a askorbat

(AA) je detektovan samo u to vreme. Maksimalan sadrzaj ukupnog glutationa, kao i

redukovane (GSH) i oksidovane forme (GSSG) je izmeren u vreme izbijanja radikule,

kada se javlja i peroksidazna (POD) aktivnost i raste posle tog perioda.

GA3 (160 μM) ne utiče na klijanje C. rubrum, indukuje porast aktivnosti CAT i

SOD u vreme pred izbijanje radikule, i pad koncentracije AA i DHA, a ne utiče na

glutation i peroksidaze.

Starenje semena utiče na smanjenu klijavost, rastenje i cvetanje biljaka C.

rubrum i na promenu antioksidativnog statusa semena. CAT, SOD, kao i sadržaj

glutationa su značajno niži, a de novo sinteza proteina počinje kasnije tokom imbibicije

starijuh semena. Dobijeni rezultati pokazuju da utvrđivanje aktivnosti antioksidativnih

enzima može biti uključeno u evaluaciju starosti semena.

GA3 smanjuje razliku u rastenju i cvetanju između biljaka poreklom od semena,

različite starosti tj. njihova osetljivost na GA3 je različita, pa se može pretpostaviti da

tokom starenja semena C. rubrum dolazi do promena u endogenom metabolizmu

giberelina.

U različitim fazama rastenja i razvića primećena je promena nivoa

antioksidativnih enzima. Najviša CAT aktivnost se može uočiti u vreme cvetanja.

Ukupna antioksidativna aktivnost pokazuje obrnut trend promena u toku razvića u

odnosu na antioksidativne enzime, sto ukazuje da i sadržaj drugih antioksidanata ima

ulogu u uklanjanju reaktivnih vrsta kiseonika u procesima razvića C. rubrum.

2.

Biljke Chenopodium rubrum odgovaraju na fotoperiod kome su izložene u

svim fazama razvića: rastenjem, cvetanjem, vremenom sazrevanja semena i

brojem sazrelih semena. Sa povećanjem dužine dana, dolazi i do povećanja visine

113

114

biljaka kao i broja listova, odlaže se cvetanje, biljke ranije u toku ontogeneze donose

seme, i povećava se broj sazrelih semena i masa semena.

Rastenje do kraja ontogeneze, cvetanje i sazrevanje semena C. rubrum,

određeni su fotoperiodom koji su biljke iskusile u vreme indukcije i evokacije cvetanja.,

odnosno, rastenje i reproduktivno razviće C. rubrum, osetljivo je na fotoperiod tokom

tačno određenog i kratkog vremena u odnosu na trajanje njihovog životnog ciklusa.

Majke biljke C. rubrum u semenu ostavljaju „informaciju“, koja bi između

ostalog mogla biti na nivou proteina, o dužinama dana koje su iskusile u toku

svog životnog ciklusa i to je mehanizam kojim majka biljka može da prilagodi

fenotipove potomstva da poveća uspeh u spoljašnjoj sredini kakvu će najverovatnije

iskusiti.

Materinski efekat fotoperoda se kod biljaka C. rubrum proteže kroz čitav

životni ciklus potomstva: za klijanje semena i rastenje potomstva, ključni znacaj ima

fotoperiod kome su majke biljke bile izložene u prvih 6 dana svog života, dok za

cvetanje i donošenje semena potomstva, značajniji uticaj ima fotoperiod koji sledi posle

indukcije cvetanja majki biljki.

3.

SNP i KCN, pokazuju različite efekte na klijanje, rastenje i cvetanje

C.rubrum.

Klijanje: 10 i 50 μM SNP stimulira klijanje 1. dana, dok samo 10 μM KCN

stimulira klijanje 1. dana. cPTIO ne ukida stimulaciju izazvanu KCN, već je čak i

pojačava.

Rastenje: 10 i 50 μM SNP stimulira izduživanje stabla i razviće listova u prve

dve nedelje, dok 10-200 μM KCN nema efekta na izduživanje stabla, a stimulira razviće

listova.

Cvetanje: 10 μM SNP stimulira cvetanje, dok 50-150 μM odlaže. KCN (10-200

μM) stimulira cvetanje.

NO (SNP) i GA3 imaju efekta na klijanje, rastenje i cvetanje C. rubrum, ali na

osnovu podataka dobijenih njihovim zajedničkim prisustvom u podlozi, možemo

pretpostaviti da je njihova uloga u ovim procesima nezavisna, ili ako su na istom

transdukcionom putu, njihovo mesto aktivnosti je veoma udaljeno.

6. Literatura

Alcher, R.G., Erturk, N., Heath, L.S. (2002) Role of superoxide dismutases (SODs) in

controlling oxidative stress in plants. J. Exp. Bot. 53: 1331-1341.

Anderson, L., Mansfield, T.A. (1979) The effects of nitric oxide pollution on the growth

of tomato. Environ. Pollution 20: 113-121.

Arigoni, O. (1994) Ascorbate system in plant development. J. Biomembranes 26: 407-

419.

Asada, K. (2006) Production and scavenging of reactive oxigen species in chloroplasts

and their functions. Plant Physiol. 141: 391-396.

Arnao, M.B., Cano, A., Acosta, M. (1999) Methods to measure the antioxidant activity in

plant material. A comparative discussion. – Free Rad. Res. 32: 89-96,.

Baker, C.J., Orlandi, E.W. (1995) Active oxygen in plant patogenesis. Annu. Rev.

Phytopatol. 33: 299-321.

Bailly, C., Bogatek-Leszczynska, R, Come, D., Corbineau, F. (2002) Changes in

activities of antioxidant enzymes and lioxygenase during growth of sunflower

seedlings from seeds of different vigour. Seed Sci. Res. 12: 47-55.

Bailly, C., Leymarie, J., Lehner, A., Rousseau, Come, D., Corbineau, F. (2004)

Catalase activity and expression in developing sunflower seeds as related to

drying. J. Exp. Bot. 55(396):475-483.

Bailey, L.F., McHargue, J.S. (1943) Enzyme activity in tomato fruits and leaves at

different stages of development. Amer. J. Bot. 30(10): 763-766.

Batak, I., Dević, M., Giba, Z., Grubišić, D., Poff, K.L., Konjević, R. (2002) The effects of

potasium nitrate and NO donors on phytochrome A- and phytochrome B-specific

induced germination of Arabidopsis thaliana seeds. Seed Sci. Res. 12: 253-259.

Beligni, M.V. and Lamatina, L. (2000) Nitric oxide stimulates seed germination and

deetiolation, and inhibits hypocotyl elongation, three light-inducible responses in

115

plants. Planta 210: 215-221.

Bellani, L.M., Guarnier, M., Scialabba, A. (2002) Differences in the activity and

distribution of peroxidases from three different portions of germinating Brassica

oleracea seeds. Physiol. Plant. 114:102-108.

Bernier, G., Kinet, J-M., Sachs, R.M. (1981) The physiology of flowering. CRC Press,

Inc. Boca Raton, Florida.

Bertero, H.D., King, R.W. and Hall, A.J. (1999) Photoperiod-sensitive development

phases in quinoa (Chenopodium quinoa Willd.). Field Crops Res. 60, 231-243.

Bethke, P.C., Fath, A., Jones, R.L. (2000) Programmed cell death of barley aleurone

protoplasts: evidence of involvment ofreactive oxygen species. In: Plant Biology

2000. Abstract No.535. Amer.ican Society of plant biologists, San Diego.

Bethke, P.C., Libourel, I.G.L., Jones R.L. (2006) Nitric oxide reduces seed dormancy in

Arabidopsis. J. Exp. Bot. 57(3): 517-526.

Bewley J.D., Black, M. (1982) Viability, Dormancy, and Environmental control. In:

Physiology and Biochemistry of Seeds in Relation to Germination, vol. 2,

Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp. 60-199. Springer-Verlag Berlin

Heidelberg New York.

Bhargava, A., Rana, T.S., Shukla, S., Ohri, D. (2005) Seed protein elecrophoresis of

some cultivated and wild species of Chenopodium. Biol.Plant. 49: 505-511.

Boscagli, A., Sette, B. (2001) Seed germination enhancement in Satureia montana L.

ssp montana. Seed Sci. Technol. 29: 347-355.

Bowler, C., Van Montagu, M., Inzé, D. (1992) Superoxide dismutase and stress

tolerance. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant mol. Biol. 43: 83-116.

Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram

quantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding. – Annu.l

Biochem. 72: 248-254.

Bruce, R.J., West, C.A. (1989) Elicitation of lignin biosinthesis and isoperoxidase

activity by pectic fragments in suspension culture of castor bean. Plant Physiol.

91: 889-897.

116

Chailakhyan, M.Kh. (1958) Hormonale Faktoren des Pflanzenblühens. Biol. Zbl. 77:

641-662.

Cook, R.E. (1975) The photoindidtive control of seed weight in Chenopodium rubrum L.

Amer. J. Bot. 62: 427-431.

Corbesier, L., Coupland, G. (2005) Photoperiodic flowering of Arabidopsis: interating

genetic and physiological approaches to characterization of the floral stimulus.

Plant cell and Environ. 28: 54-66.

Crawford, D.J. (1974) Variation in the seed proteins of Chenopodium incanum. Bulletin

of the Torrery Botanical Club 101: 72-77.

Cumming, B.G. (1959) Extreme sensitivity of germination and photoperiodic reaction in

the genus Chenopodium (Toutn.) L. Nature 184: 1044-1045.

Cumming, B.G. (1961) Early flowering plants. In: Methods in developmental biology.

Ed. F.H. Will and N.K. Wesselss, Thomas Y. Cromwel, New York, 277-299.

Cumming, B.G. (1967) Early flowering plants. In: F.H. Will and N.K. Wesselss, Thomas

Y. Cromwell, (eds.), Methods in developmental biology, 277-299, New York.

Cvetić, T., Budimir, S., Grubišić, D. (2004) In vitro flowering of dark-grown Centaurium

pulchellum. Arch. Biol. Sci., Belgrade 56: 21-22.

Datta, S.C., Evenari, M. and Gutterman, Y. (1972a) Photoperiodic and temperature

responses of plants derived from the various heteroblastic caryopses of Aegilops

L. J. Indian Bot. Soc. 50 A, 546 – 559.

Datta, S.C., Gutterman, Y Evenari, M. (1972b) The influence of the origin of the mother

plant on yeald and germination of their caryopses in Aegilops ovata L. Planta 105,

155 – 164.

de Pinto, M.C., Francais, D., de Gara, L. (1999) The redox state of the ascorbate-

dehidroascorbate pair as a specific sensor of cell division in tobacco BY-2 cells.

Protoplasma 209: 90-97.

Delledonne, M. (2005) NO news is good news for plants. Currenr opinions in Plant

Biology 8: 390-396.

Donohue, K. (2003) Setting the stage: Phenotipic plasticity as habitat selection.

International J. Plant Sci. 164: 79-92.

117

Dučić, T., Lirić-Rajlić, I., Mitrović, A., Radotić, K. (2003/4) Expression of antioxidant

systems in Chenopodium rubrum seed germination. Biol. Plant. 47: 527-533.

Durner, J., Gow, A.J., Stamler, J.S., Glazebrook, J. (1999) Ancient origins of nitric oxide

signaling in biological systems. Proceedings of the National Academy of

Sciences, USA 96: 14206-14207.

Elstner, E.F. (1982) Oxygen activation and oxygen toxicity. Annu.Rev. Plant Physiol.

33: 73-96.

Evans, L.T., King, R.W., Mander, L.N., Pharis, R.P. (1994) The relative significance for

stem elongation and flowering in Lolium temulentum of 3β-hydroxilation of

gibberellins. Planta 192: 130-136.

Fielding, J.L., Hall, J.L. (1978) A biochemical and cytochemical study of peroxidase

activity in roots of Pisum sativum. II.Distribution of enzymes in relation to root

development. J. Exp. Bot.29: 983-991.

Foyer, C.H., Noctor, G. (2003) Redox sensing and signaling associated with reactive

oxygen in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria. Physiol. Plant. 119: 355-

364.

Franklin, K.A., Praekelt, U., Stoddart, W. M., Billingham, O. E., Halliday, K. J.,

Whitelam, G.C. (2003) Phytochromes B, D, and E Act Redundantly to Control

Multiple Physiological Responses in Arabidopsis. Plant Physiol. 131: 1340–1346.

Franklin, K.A., Whitelam, G.C. (2004) Light signals, phytochromes and cross-talk with

other environmental cues. J. Exp. Bot. 55(395): 271-276.

Fridovich, I. (1986) Superoxide dismutases. Adv. Enzymol. 41: 35-97.

Furuya, M. (1993) Phytochromes: their molecular species, gene families and functions.

Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol.Bol. 44: 617-645.

Galloway, L.F. (2005) Maternal effects provide phenotipic adaptation to local

environmental conditions. New Phytologist 166: 93-100.

Giba, Z.,Todorović, S., Grubišić, D., Konjević, R. (1998) Occurrence and regulatory

roles of superoxide anion radical and nitric oxide in plants. Jugoslav Physiol.

Pharmacol. Acta 34: 447-461.

118

Giba, Z., Grubišić, D., Konjević, R. (2004) Nitric oxide and seed germination. In: Nitric

Oxide Signaling in Higher Plants. Eds. Jose R. Magalhaes, Rana P. Singh and

Leonidas P. Pasos, Studium Press, LLC, Houston, USA, pp. 239-275.

Gidrol, X., Lin, W.S., Degousee, N., Yip, S.F., Kush, A. (1994) Accumulation of reactive

oxigen species and oxidation of cytokinin in germinating soybeen seeds. Eur. J.

Biochem. 224: 21-28.

Griffith OW. (1980) Determination of glutathione disulphide using glutathione reductase

and 2-vinylpyridine. Anal. Biochem. 106: 207–212

Grlić, Lj. (1986) Enciklopedija samoniklog jestivog bilja. August Cesarec Zagreb, 102–

105.

Grubišić, D., Giba, Z., Konjević, R. (1995) Seed germination of Gentiana cruciata L.

Bulletin de l'Institut et du Jardin Botanique de l'Université de Belgrade 29: 93-100.

Gutterman, Y., Evenari, M. (1972) The influence of day length on seed coat colour, an

index of water permeability of the desert annual Ononis sicula Guss. J. Ecol. 60,

713 – 719.

Gutterman, Y. (1978) Germinability of seeds as a function of the maternal environment.

Acta Hort. 83: 49-56.

Gutterman, Y. (2000) Maternal effects on seeds during development. In: CABI

Publishing ed. Seeds: The ecology of regeneration in plant communities. 2nd ed.

M.Fenner, Wallingford, Oxon. pp. 59-84.

Gutterman, Y. (2002) Survival adaptations and strategies of annuals occurring in the

Judean and Negev deserts of Israel. Israel J. Plant Sci. 50: 165-175.

He, Y., Tang, R.H., Hao, Y., Stevans, R.D., Cook, C.W., Ahn, S.M., Jing, L., Yang, Z.,

Chen, L., Guo, F., Fiorani, F., Jackson, R.B., Crawford, N.M., Pei, Z.M. (2004)

Nitric oxide represses the Arabidopsis floral transition. Science 305: 1968-1971.

Hendry, G.A.F., Crawford, R.M.M. (1994) Oxigen and envirnmental stress in plants –

an overview. Proc.roy. Soc. Edinbourgh 102B: 1-10.

Hening, L., Stoddart, W.M., Dieterie, M., Whitelam, G.C., Schafer, E. (2002)

Phytochrome E contols light-induced germination of Arabidopsis. Plant Physiol.

128: 194-200.

119

Hensel, L.L., Grbic, V., Baumgarten, D.A., Bleecker, A.B. (1993) Developmental and

age-related processes that influence the longevity and senescence of

photosynthetic tissues in Arabidopsis. Plant cell 5: 553-564.

Hewitt, E.J., Dickes, G.J. (1961) Spectrophotometric measurements on ascorbic acid

and their use for the estimation of ascorbic acid and dehydroascorbic acid in plant

tissues. Biochem. J. 78: 384-391.

Hufton, C.A., Besford, R.T., Welburn, A.R. (1996) Effects of NO (+NO2) pollution on

growth, nitrate reeuctase activities and associated protein contents in glasshouse

lettuce grown hydroponically in winter CO2 enrichment. New Phytologist 133: 495-

501.

Jones, R.L. (1986) Gibberellic acid and auxin influence the secretion of peroxidase. In:

Greppin, H., Penel, C., Gaspar, T. (ed.): Molecular and Physiological Aspects of

Plant Peroxidases. University of Geneva, Geneva, 295-308.

Jovanović, V., Giba, Z., Đoković, D., Milosavljević, S., Grubišić, D., Konjević, R. (2005)

Gibberellic acid nitrite stimulates germination of two species of light requiring

seeds via the nitric oxide pathway. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1048: 476-481.

Kadman-Zahavi, A., Peiper, D. (1987) Effects of moonlight on flower induction in

Pharbitis nil, using a single dark period. – Ann. Bot. 60: 621-623.

Karssen, C.M. (1970) The light promoted germination of the seeds of Chenopodium

album L. III.Effect of the photoperiod during growth and development of the plants

on the dormancy of the produced seeds. Acta Botanica Neerlandica 19, 81 – 94.

Karssen, C.M., Hilhorst, H.W.M. (1992) Seeds: The ecology of regeneration in plant

communities. CAB International, Wallingford. Ed. Fenner, M., pp. 327-348.

Keigley, P.J. and Mullen, R.E. (1986) Changes in soybean seed quality from high

temperatures during seed fill and maturation. Crop Science 26, 1212 – 1216.

Khan, M.H., Panda, S.K. (2002) Induction of oxidative stress in roots of Oryza sativa L.

in response to salt stress. Biol.Plant. 45: 625-627.

Kojima, H., Nakatsubo, N., Kikuchi, K., Kawahara, S., Kirino, Y., Nagoshi, H., Harata,

Y., Nagano, T. (1998) Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent

indicators: diaminofluoresceins. Analitical Chemistry 70: 2446-2453.

120

Komeda, Y., Araki, T., Tsukaya, H., Takahashi, T., Naito, S. (1992) Study of flowering

using late-flowering mutants of Arasbidopsis thaliana, with emphasis on flowering

in darkness. FNL 13: 44-47.

Korneef, M., Alonso-Blanco, C., Peeters, A.J-M., Soppe, W. (1998) Genetic control of

flowering time in Arabidopsis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 345-

370.

Kulikowska-Gulewska, H., Majewska, M., Kopcewicz, J. (2000) Gibberellins in the

contol of photoperiodic flower transition in Pharbitis nil. Physiol. Plant. 108: 202-

207.

Lacey, E.P., Smith, S., Case, A.L. (1997) Parental effects on seed mass: seed coat but

not embryo/endosperm effects. Am. J. Bot. 84(11): 1617.

Lacey, E.P., Herr, D. (2000) Parental effects in Plantago lanceolata L. III Measuring parental

temperature effects in the field. Evolution Int. J. Org. Evol. 54(4): 1207-1217.

Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during assembly of head of

bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

Lall, N., Nikolova, R.V. (2003) Developmental changes of superoxide dismutase, peroxidase

and catalase isoenzyme profiles in leaves of Impatiens flanaganiae Hemsl. Associated

with variations in light intensity. South African J. Bot. 68: 518-524.

Lamb, C., Dixon, R.A. (1997) The oxidative burst in plant disease resistance. Annu.

Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 251-275.

Leshem, Y.Y., Haramaty, E. (1996) The characterisation and contrasting effects of the

nitric oxide free radical in vegetative stress and senescence of Pisum sativum

Linn foliage. J. Plant Physiol. 148: 258-263.

Leshem, Y.Y., Haramaty, E., Iluz, D., Malik, Z., Sofer, Y., Roitman, L., Leshem, Y.

(1997) Effect of stress nitric oxide (NO): interaction between chlorophyll

fluorescence, galactolipid fluidity and lipoxygenase activity. Plant Physiol.

Biochem. 35: 573-579.

Leshem, Y.Y. and Pinchasov, Y. (2000) Non-invasive photoacoustic spectroscopic

determination of relative endogenous nitric oxide and ethylene content

stoichiometry during the ripening of strawberries Fragaria anannasa (Duch.) and

121

avocados Persea americana (Mill.). J. Exp. Bot. 51: 1471-1473.

Li, W., Liu, X., Khan, M.A., Yamaguchi, S. (2005) The effect of plant growth regulators,

nitric oxide, nitrate, nitrite and light on the germination of dimorphic seeds of

Sueda salsa under saline conditions. J. Plant Res. 118: 207-214.

Linhart, X.B., Grant, M.C. (1996) Evolutionary significance of local genetic

differentiation in plants. Ann. Rev. Ecol. Systematics 27: 237-277.

Luna, C.M., Pastori, G.M., Driscoll, S., Groten, C., Bernard, S. (2004) Drough controls

on H2O2 accumulation, catalase (CAT) activity and CAT gene expression in

wheat. J. Exp. Bot. 56: 417-423.

Monte, E., Alonso, J.M., Ecker, J.R., Zhang, Y., Li, X., Young, J., Austin-Phillips, S.,

Quail, P.H. (2003) Isolation and characterization of phyC mutants in Arabidopsis

reveals complex crosstalk between phytochrome signaling pathways. Plant Cell

15: 1962-1980.

Machasdo Neto, N.B., Custodio, C.C., Takaki, M. (2001) Evaluation of naturally and

artificially aged seeds of Phaseolus vulgaris L. Seed Sci. Technol. 29: 137-149.

Maguire, J.D. (1972) Physiological disorders in germinating seeds induced by the

environment. In: W. Heydecker Ed. Seed ecology. Proceedings of the nineteenth

Easter school in agricultural science, University of Nottingham, Butterworths,

London. pp. 289-310.

Marinescu, G., Badea, E., Babeanu, C., Glodeanu, E. (2000) Peroxidase system

activity in leaves of cucumber plants as marker of growth stimulant treatment.

Plant peroxidase newsletter 14: 78-85.

Matters,G.L., Scandalios, J.G. (1986) Effect of elevated temperature on catalase and

superoxid dismutase during maize development. Differentiation 30:190-196.

May, M.J., Vernoux, T., Leaver, C., van Montagu, M., Inze, D. (1998) Glutathione

homeostasis in plants: implications for environmental sensing and plant

development. J. exp. Bot. 49: 649-667.

Mazzaella, M.A., Arana, M.V., Staneloni, R.J., Perelman, S., Rodriguez Batiller, M.J.,

Muschetti, J., Cerdan, P.D., Chen, K., Sanchez R., A., Zhu, T., Chory, J., Casal, J.

122

(2005) Phytochromr control of the Arabidopsis transcriptome anticipates seedling

exposure to light. The Plant Cell 17: 2507-2516.

Miao, S.L., Bazzaz, F.A., Primack, R.B. (1991) Persistance of maternal nutrient effects

in Plantago major: the third generation. Ecology 72: 1634-1642.

Mitchell, W.C., Barrett, S.H. (2000) Expression of peroxidase and glucose-6-phosphate

dehydrogenase isozymes in Viola cornuta L. during seed germination. Plant

Peroxidase Newsletter 15: 23-32.

Misra, H.P., Fridowich, I. (1972) The role of superoxide-anion in the autooxidation of

epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. – J. biol. Chem. 247:

3170-3175,.

Mitrović, A. (1998) Cvetanje kratkodnevne biljke Chenopodium rubrum L. i dugodnevne

biljke Chenopodium murale L. u kulturi in vitro, Magistarska teza, Biološki fakultet,

Univerzitet u Beogradu.

Mitrović, A., Živanović, B., Ćulafić, Lj. (2000) The effects of photoperiod, glucose and

gibberellic acid on growth in vitro and flowering of Chenopodium murale. Biol.

Plant. 43: 173-177.

Mitrović, A., Živanović, B., Ćulafić, Lj. (2002) Maternal effect on Chenopodium rubrum

L. seeds: seed size, germination, growth and flowering in vitro. Ekologija, Vol. 37,

No, 1-2, 53-58.

Mitrović, A., Živanović, B., Ćulafić, Lj. (2003) Effect of darkness on growth and

flowering of Chenopodium rubrum and C. murale plants in vitro. Biol. Plant. 46(3),

471-474.

Mitrović, A., Dučić, T., Lirić-Rajlić, I., Radotić, K., Živanović, B. (2005) Changes in

Chenopodium rubrum seeds aging. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1048, 505-508.

Moore, S., Banister, P., Jameson, P.E. (1994) The effect of low temperatures on seed

germination of some New Zealand species of Pittosporum. New Zeal. J. Bot. 32:

483-485.

Munir, J., Dorn, L.A., Donohue, K., Schmitt, J. (2001) The effect of maternal

photoperiod on seasonal dormancy in Arabidopsis thaliana (Brasicaceae). Amer.

J. Bot. 88(7): 1240-1249.

123

Murashige, T., Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with

tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.

Murthy, U.M.N., Sun, W.Q. (2000) Protein modification by Amadori and Maillard

reactions during seed storage: roles of sugar hydrolysis and lipid peroxidation. J.

Exp. Bot. 51, No. 348, 1221-1228.

Neill, S.J., Desikan, R., Hancock, J.T. (2003) Nitric oxide signalling in plants. New

Phytologist 159: 11-35.

Nešković, M, Konjević, R., Ćulafić Lj. (2003) Fiziologija biljaka. NNK-International. 473-

525.

Opatrná, J., Ullmann, J., Pavlová, L., Krekule, J. (1980) Changes in organ growth of

Chenopodium rubrum due to suboptimal and multiple photoperiodic cucles with

and without flowering effect. Biol. Plant. 22: 454-464.

Pagnussat, G.C., Simontacchi, M., Puntarulo, S., Lamatina, L. (2002) Nitric oxide is

required for root organogenesis. Plant Physiol. 129: 954-956.

Pallanca, J.E., Smirnoff, N. (1999) Ascorbic acid metabolism in pea seedlings. A

comparison of D-glucosone, L-sorbosone, and L-galactono-1,4-lactone as

ascorbate precursors. Plant Physiol. 120: 453-462.

Pavlová, L., Součkova, D., Ullmann, J., Krekule, J. (1989) The transition to reproductive

phase in Chenopodium murale L. ecotype 197 – early flowering long-day plant.

Biol. Plant. 31(5): 386-391.

Prego, I., Maldonado, S., Otegui, M. (1998) Seed structure and localization of reserves

in Chenopodium quinoa. Ann. Bot. 82: 481-488.

Procházková, D., Wilhelmová, N. (2004) Changes in antioksidative protection in bean

cotyledons during natural and continuous irradiation-accelerated senescence.

Biol. Plant. 48: 33-39.

Riley, J.M. (1987) Gibberellic acid for fruit set and seed germination. California rare

Fruit Growers J. 19: 10-12.

Roberts, E.H. (1972) Oxidative processes and the control of seed germination. In:

Heydecker, W. (ed.): Seed Ecology. 189-218, Butterworts, London.

124

Schmidt, M., Dehne, S., Feirabend, J. (2002) Post-transcriptional mechanisms control

catalase synthesis during its light-induced turnover in rye leaves through the

availability of the hemin cofactor and reversible changes of the translation

efficiency of mRNA. The Plant J. 31: 601-613.

Schopfer, P., Plachy, C. (1984) Control of seed germination by abscisic acid: II Effect of

embryo water uptake in Brassica napus L. – Plant Physiol. 76: 155-160.

Schopfer, P., Plachy, C., Frahry, G. (2001) Release of reactive oxygen intermediates

(superoxide radicals, hydrogen peroxide, and hydroxyl radicals) and peroxidase in

germinating radish seeds controlled by light, gibberellin, and ascorbic acid. Plant

Physiol. 125: 1591-1602.

Schroeder, J.I., Allen, G.J., Hugouvieux, V., Kwak, J.M., Waner, D. (2001) Guard cell

signal transduction. Ann. Rev. pPant Physiol. Plant. mol. Biol. 52: 627-658.

Scorza, R. (1982) In vitro flowering. Hort. Rev. 4: 106-127.

Seidlová, F., Opatrná, J. (1978) Change of growth correlation in the shoot meristem as

the cause of dependance of flowering. Z. Planzenphysiol. 89: 377-392.

Sharrock, R.A., Quail, P.H. (1989) Novel phytochrome sequences in Arabidopsis

thaliana: Structure, evolution and differential expression of a plant regulatory

photoreceptor family. Genes Dev. 3: 1745-1757.

Simpson, G.G., Dean, C. (2002) Arabidopsis thaliana, the Rosetta stone of flowering

time? Science 296: 285-289.

Slavnić, Ž. (1972) Flora SR Srbije III, Srpska Akademija nauka i umetnosti, Odelenje

prirodno-matematičkih nauka, Beograd, 10-53.

Smith, H. (1995) Physiological and ecological function within the phytochrome family.

Ann. Rev. Physiol. Plant Mol. Biol. 46: 289-315.

Stamler, J.S., Singer, D.J., Loscalzo, J. (1992) Biochemistry of nitric oxide and its

redox-activated forms. Science 258:1898-1902.

Steinger, T., Gall, R., Schmid, B. (2000) Maternal and direct effects of elevated CO2 on

seed provisioning, germination and seedling growth in Bromus erectus. Oecologia

123: 475-480.

125

Straton, D.A. (1989) Competition prolongs expression of matenal effects in seedlings of

Erigeron annuus (Asteraceae). Amer. J. Bot 76(11): 1646-1653.

Sultan, S.E. 1996 Phenotipic plasticity for offsšring traits in Polygonum persicaria.

Ecology 77: 1791-1807.

Takano, M., Inagaki, N., Xie, X., Yuzurihara, N., Hihara, F., Ishizuka, T., Yano, M.,

Nishimura, M., Miyao, A., Hirochika, H., Shinomura, T. (2005) Distinct and

cooperative functions of phytochromes A, B, and C in the control of deetiolation

and flowering in rice. Plant Cell 17: 3311-3325.

Tanaka, O., Cleland, C.F., Ben-Tal, Y. (1983) Effect of fericijanide, ferocijanide and

KCN on growth and flowering in the short-day plant Lemna paucicostata 6746.

Plant and Cell Physiol. 24 (4): 705-711.

Terzaghi, W.B., Cashmore, A.R. (1995) Light regulated transcription. Annu. Rev. Plant

Ohysiol. Plant Mol. Biol. 46: 445-474.

Tomasi, F., Paciolla, C. de Pinto, M.C., de Gara, L. (2001) A comparative study of

glutathione and ascorbate metabolism during germination of Pinus pinea L.

seeds. J. exp. Bot. 52: 1647-1654.

Torres, M., Munoz, F., Cases, A., Ortega, T. (1989) Effect of age on the viability of

fennel seeds from cultivated plants. Acta Hort. 253: 113-120.

Tsuchiya, T., Ishiguri, Y. (1981) Role of the quality of light in the photoperiodic flowering

responce in four latitudinal ecotypes of Chenopodium rubrum L. Plant and Cell

Physiol. 22(3): 525-532.

Tun, N.N., Holk, A., Scherer G.F.E. (2001) Rapid increase of NO release in plant cell

cultures induced by cytokinin. FEBS Letters 509: 174-176.

Ullmann, J., Opatrna, J., Krekule, J., Pavlova, L. (1980) The Changes in the Growth

Pattern of Organs of Chenopodium rubrum Photoperiodicaly Induced to

Flowering. Biol. Plant. 22: 374-383.

Van Loon, L.C. (1986) The significance of changees in peroxidase in diseased plants.

In: Greppin, H., Penel, C., Gaspar, T. (ed.): Molecular and Physiological Aspects

of Plant Peroxidases. Pp. 405-418. University of Geneva, Geneva.

126

127

Villers, T. (1972) Ageing and the longevity of seeds in field conditions. In: W.

Heydecker Ed. Seed Ecology, Proceedings of the nineteenth Easter school in

agricultural science, University of Nottingham, Butterworths, London pp. 266-285.

Vince-Prue, D. (1975) Photoperiodism in plants. McGraw-Hill Book Company (UK)

Limited.

Wang, H, Deng, X.W. (2002) Phytochrome signaling mechanism. The Arabidopsis

Book. 2002 Amer. Soc. Plant Biol., 1-28.

Wildt J., Kley, D., Rockel, P., Segschneider, H.J. (1997) Emision of NO from several

higher plant species. J. geophysical Res. 102: 5919-5927.

Wojtaszek, P. (2000) Nitric oxide in plants: to NO or not to. Phytochemistry 54: 1-4.

Zhang, H., Shen, W.B., Zhang, W., Hu, L.L. (2005) A rapid response of β-amylase to

nitric oxide but not gibberellin in wheat seeds during the early stage of

germination. Planta 220: 708-716.

Živanović, B., Ćulafić, Lj., Filipović, A. (1995) The effects of hormones and saccharides

on growth and flowering of green and herbicides-treated Chenopodium rubrum L.

plants. Biol. Plant. 37: 257-264.