FICHERO VIRTUAL(COMPLETO) Daniel Efrain Hernandez Gutierrez 136689

7/21/2019 FICHERO VIRTUAL(COMPLETO) Daniel Efrain Hernandez Gutierrez 136689

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Técnicas de DN

recombinante

Fichero virtual

Alumno: Daniel Efraín HernándezGutiérrez

Docente: M.C. Patricia Islas Salinas

Materia: Biología Molecular

Matrícula: 1!!"#

Programa: Médico Ciru$ano



Técnicas de DNA

recombinante.

% &artir de los a'os () se desarrollaron las *erra+ientas de la ,iología +olec

ingeniería genética o lo -ue se *a lla+ado técnicas del %D reco+,inante.

&ri+eras eta&as se esta,a tra,a$ando so,re la &osi,ilidad de +ani&ular los genes/ e

% 2enerlos aislados.

B %+&lificarlos/ en el sentido de tener +uc*as co&ias de la +is+a secuencia.

C Conocer la secuencia e3acta/ es decir el orden de las ,ases de esos genes.

D 4na 5ez aislado &oderlo e3&resar fuera de su localizaci6n natural.



7a técnica del %D reco+,inante se usa en estudios de la

e3&resi6n génica/ en la regulaci6n de síntesis de &roteínas 8 &

escala co+o la Insulina/ en el desarrollo de organis+os tran

a+&lificaci6n del %D. 4na técnica i+&ortante 8 de las +ás &

PC9/ reacci6n de cadena de la &oli+erasa/ la cual es rá&ida 8

de %D 8 a&ro5ec*a la re&licaci6n. :1) :11 :1



Manejo de muestras biológicaara el diagnóstico molecular



Manejo de muestras biológicas ara e

diagnóstico molecular.

7as deno+inadas técnicas +oleculares de diagn6stico se están incor&orando al es

*erra+ientas &ro&ias de la +icro,iología clínica/ co+o una o&ci6n -ue sal5a las dif

de detecci6n de +icroorganis+os no culti5a,les o de difícil;lento desarrollo <in 5itro

5enta$a frente a las técnicas ,asadas en el culti5o. Se de,e seleccionar el ti&o de ,

criterios de selecci6n 8 el al+acena+iento/ se de,e e5itar una conta+inaci6n cruza

la eta&a &re>analítica/ analítica 8 &ost>analítica. : :# :1?



Normas ara el manejo.

N!"MA !#icial Me$icana N!M%&'(%)*!+%,,A-%.&&./ Protecci6n a+,iental > Salud a+,ienta

,iol6gico>infecciosos > Clasificaci6n 8 es&ecificaciones de +ane$o. %l +argen un sello con el Esc

Estados 4nidos Me3icanos.> Secretaría de Medio %+,iente 8 9ecursos aturales.

0M+%&&--: Para la recolecci6n de e5idencias tanto ,iol6gicas co+o de +ateriales en general -ue s

de,erán usar0

9eci&ientes

@eringas

Eti-uetado 8 al+acena+iento

"esiduos Peligrosos 1iológico%0n#ecciosos 2"P103: Para -ue un residuo sea 9PBI de,e

infecciosos. 7a nor+a se'ala co+o agente ,iol6gico>infeccioso cual-uier organis+o -ue sea ca&az

:( :" :1A



0nstrumental 4 e5uios b6sicos ara

e$tracción 4 manejo.

El &uesto de tra,a$o de,e de estar li+&io 8 ordenado. El +aterial necesario debe &re&ararse

e+&ezar a tra,a$ar 8 colocarse de for+a adecuada &ara -ue se facilite su utilizaci6n así se

accidentes 8 se +ini+izará el riesgo de conta+inaci6n.

Mesas de laboratorio 4 #regadero

Para &oner los +ateriales 8 el

e-ui&o -ue se 5a a utilizar durante

una &ráctica.



7itrinas 4 armarios

Para guardar

di5ersos &roductos

8 +aterial.

Mechero 1unsen

Para calentar 8 esterilizar

+uestras.



)stu#a de incubac

Es una cá+

controlada

+icroorganis+o

facilitar el

+icroorganis+o

6&ti+a de creci

Frigorí#ico o c6maras re#rigeradas.

Se utilizan &ara conser5ar tanto

+ateriales co+o +icroorganis+os.

*ongeladores

Se utilizan &ara la conser5aci6n de reacti5

a te+&eraturas inferiores a )C/ llegando a

8radillas

Para sostener los

tu,os de ensa8o.



*entrí#uga

%&arato -ue &er+ite la se&ara

los distintos co+&onentes.

Desioni9ador de agua

Para el interca+,io i6nico.

*ontador de colonias

Es un a&arato -ue +ediante la

ilu+inaci6n de la &laca 8 una lu&a/ nos

&er+ite o,ser5ar con +a8or nitidez.

Microscoio ótico Para +irar o,$etos &e-ue'os.

*6maras de seguridad biológica.

Pro&orcionan una ,arrera de &rotecci6n.



1a:os termost6ticos

Son reci&ientes -ue contienen agua 8

un siste+a de regulaci6n de la

te+&eratura. Se utilizan &ara

ate+&erar +edios de culti5o o incluso

&ara incu,ar culti5os de

+icroorganis+os.

;arras de anaerobios

9eci&ientes -ue se usan

&ara conseguir una

at+6sfera li,re de o3ígeno.

Asas de siembra

Se utilizan &ara se+,rar. Pueden

ser +etálicas o de &lástico.

<%Metros

Para +edir el P* de

las sustancias.

Material #ungible

Placas de Petri

9eci&ientes &ara la &re&araci6n de

+edios de culti5o s6lidos.

Balanzas0 Para &esar

+uestras.



Pietas autom6ticas

Se utilizan &ara &i&etear &e-ue'as

cantidades de lí-uidos.

Asas acodadas

Se utilizan &ara la e3tensi6n de

+icroorganis+os so,re la

su&erficie de un +edio de culti5o

en &laca Petri.

Portas 4 cubres

Para realizar las o,ser5aciones

al +icrosco&io.

Tubos con medio lí5uido

Tubos con medio sólido

%+,os sir5en &ara identificar

,acterias.

Pietas de vidrio

Para dar 5ol+enes

e3actos.



*ucharas 4 es6tulas

Se utilizan &ara &esar +uestras o +

de culti5o.

Autoclave

Para esterilizar con cinta

testigo.

<orno de Pasteur

%cta &rinci&al+ente desnaturalizando las &roteínas

8 secundaria+ente o3idando los co+&uestos

celulares.

7asos de reciitado

Poner algn +aterial o

sustancia.

:1

:?



=Normas de bioseguridad.>

7a Bioseguridad son el con$unto de nor+as 8 &rocedi+ientos -ue garantizan el c

de los factores de riesgo/ la &re5enci6n de i+&actos noci5os 8 el res&eto de los l

&er+isi,les/ sin atentar contra la salud de las &ersonas -ue la,oran 8 garantiza -

&roducto de los +is+os no atente contra la salud de la co+unidad en general/ ni c

el a+,iente. 7as nor+as de ,ioseguridad están destinadas a reducir el riesg

trans+isi6n de +icroorganis+os de fuentes reconocidas o no reconocidas de infe

en Ser5icios de Salud.



Se de,e to+ar en cuanta la5arse las +anos/ no tener el ca,ello suelto/

la5arse las +anos/ usar guates/ no fu+ar/ &rotecci6n ocular/ ta&a,ocas

&rotecci6n cor&oral/ +aterial desec*a,le/ +aterial de curaciones 8

li+&ieza diaria.

7le5an a ca,o el Manual de organis+os 5i5os e infecciosos

Mane$o de -uí+icos/ drogas 8 *or+onas

Protecci6n a+,iental : :! :1 :1!



Fichero virtual art

Alumno: Daniel Efraín Herná

Gutiérrez

Docente: M.C. Patricia Islas

Materia: Biología Molecular

Matrícula: 1!!"#

Programa: Médico Ciru$ano

Técnicas de DNA recombina



Extracción de ácidos nucl



a) Concepto de extracción de ADN

7a e3tracci6n 8 &urificaci6n de ácidos nucleicos constitu8e la &ri+ara eta&a de la +a8oría de los

+olecular 8 de todas las técnicas de reco+,inaci6n de %D. En este caso/ los +étodos de e3tr

o,tener ácidos nucleicos &urificados a &artir de di5ersas fuentes &ara des&ués realizar análisis

+odificaciones genéticas +ediante la reacci6n en cadena de la &oli+erasa :PC9. 7a calidad 8

ácidos nucleicos son dos de los ele+entos +ás i+&ortantes en ese ti&o de análisis. Si se desea

nucleicos +u8 &urificados/ -ue no contengan conta+inantes in*i,idores/ es &reciso a&licar +éto

adecuados. 7os conta+inantes ca&aces de in*i,ir el análisis PC9 se enu+eran. Con o,$eto de

negati5os de,idos a la &resencia de in*i,idores de la PC9 en la +uestra/ se reco+ienda 5i5a+

e3&eri+ento de control de la in*i,ici6n de la PC9/ -ue suele *acerse +ediante PC9 es&ecífica :eucariotas o cloro&lastos o de la es&ecie. :1(



b) Etapas de extracción. Lisis de la membrana celular:

2al co+o se *a +encionado anterior+ente/ la &ri+era eta&a de la e3tracci6n del %D es la rotucelular 8 nuclear/ &ara lo cual la +uestra *o+ogeneizada se trata &ri+ero con el ta+&6n de e3tr

ED2%/ 2ris>HCl 8 C2%B. 2odas las +e+,ranas ,iol6gicas &resentan la +is+a estructura genera

+oléculas de lí&idos 8 de &roteínas/ unidas &or interacciones no co5alentes.



b) Etapas de extracción.

las +oléculas li&ídicas están ordenadas en una do,le ca&a continua/ en la -ue las +oléculas &

Fdisueltas. 7as +oléculas li&ídicas están for+adas &or e3tre+os *idr6filos/ deno+inados Fca,

*idr6fo,os/ deno+inados Fcolas. En este +étodo/ el detergente :C2%B contenido en el ta+&6

&ro5oca la lisis de la +e+,rana. Dado -ue la co+&osici6n de los lí&idos 8 del detergente es si+

C2%B del ta+&6n de e3tracci6n ca&tura los lí&idos -ue integran la +e+,rana celular 8 nuclear.



Se li,era el %D gen6+ico cuando el detergente ca&tura los lí&idos 8 las &roteínas al entrar en

celular 8 el ta+&6n de e3tracci6n con C2%B. Con una concentraci6n salina :aCl deter+inada/

un co+&le$o insolu,le con los ácidos nucleicos. El ED2% es un co+&onente -uelante/ -ue se un

otros +etales. El +agnesio es un cofactor de la deso3irri,onucleasa. %l unir el +agnesio al ED2

deso3irri,onucleasa &resente dis+inu8e. El 2ris>HCl confiere a la soluci6n la ca&acidad de a+o

inferior o su&erior da'a el %D. Es i+&ortante se'alar -ue/ co+o los ácidos nucleicos se degra

fase de la &urificaci6n/ de,e reducirse al +íni+o el tie+&o transcurrido entre la *o+ogeneizaci6

adici6n de la soluci6n ta+&6n con C2%B. 4na 5ez -ue se *an roto las +e+,ranas de la célula 8:co+o los -ue se encuentran alrededor de las +itocondrias 8 los cloro&lastos/ se &urifica el %D




E3tracci6n0

En esta eta&a/ se se&aran los co+&le$os for+ados &or los ácidos nucleicos 8 el C2%B de los &olisacár

fen6licos/ las &roteínas 8 los de+ás lisados celulares disueltos en la soluci6n acuosa. Es es&ecial+en

los &olisacáridos 8 los co+&uestos fen6licos/ &ues &ueden in*i,ir nu+erosas reacciones enzi+áticas.

*i&o salinas/ los conta+inantes de los co+&le$os de ácidos nucleicos no &reci&itan 8 &ueden eli+inars

acuosa con clorofor+o. El clorofor+o desnaturaliza las &roteínas 8 facilita la se&araci6n de las fases a

fase acuosa suele constituir la fase su&erior. o o,stante/ si dic*a fase es densa de,ido a la concentr

fase inferior. %de+ás/ si el &H de la soluci6n acuosa no se *a e-uili,rado de,ida+ente/ los ácidos nuc

re&artirse en la fase orgánica. Si es &reciso/ la e3tracci6n con clorofor+o se realizará dos o tres 5eces

&or co+&leto las i+&urezas de la ca&a acuosa. Para &erfeccionar la e3tracci6n de los ácidos nucleicos

la fase orgánica con una soluci6n acuosa/ -ue se a'ade a continuaci6n al e3tracto anterior. 4na 5ez &de ácidos nucleicos/ &uede &rocederse a la &reci&itaci6n/ lti+a eta&a del &rocedi+iento.

:1(




Preci&itaci6n0

En esta lti+a eta&a se se&aran los ácidos nucleicos del detergente/ &ara lo cual la soluci6n ac

se trata &ri+ero con una soluci6n de &reci&itaci6n co+&uesta &or una +ezcla de C2%B 8 aCl e

concentraci6n ele5ada. 4na alta concentraci6n salina es necesaria &ara -ue se for+e un &reci&

de ácidos nucleicos. Puede ser &referi,le e+&lear acetato de sodio en lugar de aCl &or su ca&

ta+&6n. En estas condiciones/ el detergente/ -ue es +ás solu,le en alco*ol -ue en agua/ &ued

eli+inarse &or la5ado/ +ientras -ue los ácidos nucleicos &reci&itan. El &osterior trata+iento con

al () &er+ite una +a8or &urificaci6n o eluci6n de los ácidos nucleicos de la sal residual.:1(






d) Mtodos para la extracción Mtodo o protocolo !radicional:

"eparación de prote#nas $ l#pidos

En esta eta&a se se&ara el %D de las &roteínas 8 lí&idos +ediante sol5entes orgánicos 8 ciclosutiliza la fuerte tendencia *idrofílica de los gru&os fosfato &ara se&ararlos en +edios acuosos/ +

&roteínas 8 los lí&idos se se&aran en sol5entes orgánicos. 7a fase acuosa 8 la orgánica se se&a

lo -ue&er+ite aislar al %D. 7os sol5entes -ue se usan frecuente+ente son el fenol/el clorofor+

isoa+ílico. Estos reacti5os conta+inan fácil+ente el %D/ &or lo -ue se de,e e5itar acarrearlos

&urificaci6n. :1#



%recipitación del ADN

Des&ués de -ue son eli+inados los lí&idos 8 las &roteínas/ se recu&era el %D. Para ello/ se adetanol 8 soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o a+onio -ue se unen a los gru

fosfato/ esta +ezcla reduce las fuerzas re&ulsi5as entre las cadenas 8 &er+ite -ue el %D se &

so,re sí +is+o *aciéndolo insolu,le. 4n &aso de centrifugaci6n &er+ite -ue el %D &er+anezc

fondo del tu,o +ientras -ue el etanol es desec*ado. restos de etanol se eli+inan con un la5ado

etanol al () 8 el re+anente se eli+ina &or e5a&oraci6n. :1#

d) Mtodos para la extracción



&edisolución del ADN

4na 5ez -ue se *a eli+inado el etanol/ el &aso siguiente es *idratar el %D &ara +antenerlo en

soluci6n. En el caso de e+&lear agua/ el &H de,e ser de ( &ara &er+itir la redisoluci6n co+&let %D 8 e5itar una *idr6lisis acida. Cuando se utiliza una soluci6n a+ortiguadora/ es &referi,le ut

una soluci6n de 2ris>HCl a 1)+M 8 ED2% a ).1M a un &H de ".) &ara al+acenar el +aterial. Cu

se está disol5iendo el %D es i+&ortante e5itar el &i&eteo 8 la agitaci6n agresi5a &ues se &uede

frag+entar +oléculas de alto &eso +olecular. 4na o&ci6n -ue e5ita la frag+entaci6n consiste e

incu,ar a ?? C el %D/ 1 a A *oras con agitaci6n sua5e.:1#




Mtodo o protocolo Comercial:

'nión del ADN a la matri( inoránica $ la*ado:

En el caso del Jit con +e+,rana de sílice/ en algunos casos a la +ezcla de lisis se le a'ade la soluci6

tiene un &H es&ecífico. %ntes de &asar la soluci6n de lisis a tra5és de la colu+na/ se adiciona etanol a

eli+inando la ca&a *idratante del %D 8 e3&oniendo sus gru&os fosfato/ facilitando con ello la adsorci6

a la +e+,rana cargada &ositi5a+ente. 7os lí&idos 8 &roteínas no son afines a la +e+,rana 8 se eli+in

la soluci6n de la5ado 8 un ciclo de centrifugaci6n/ +ientras -ue el +aterial genético &er+anece unido

El Jit con &erlas +agnéticas ade+ás de utilizar soluciones a &H es&ecíficos/ utiliza un i+án o +agneto

&erlas &ara se&ararlas de las soluciones en las -ue se encuentran sus&endidas. En este caso/ se a'ad

de lisis una soluci6n a+ortiguadora a &H ácido -ue &er+ite cargar &ositi5a+ente a las &erlas/ fa5oreci

%D. 7as &roteínas 8 lí&idos tienen ,a$a afinidad &or las &erlas 8 son eli+inados con soluciones de la5

fisiol6gico. 7as &erlas son retenidas en la &ared del +icro tu,o con el +agneto/ +ientras -ue la soluci6

conta+inantes se eli+inan &or &i&eteo.

:1#




&ecuperación del ADN de la matri(:

En los Jits es necesario li,erar al %D de la +atriz/. 7a +e+,rana 8 el %D se des*idra

soluciones de la5ado 8 ciclos de centrifugaci6n/ des&ués se reco+ienda centrifugar nue

colu+na &ara e5a&orar el etanol 8 eli+inar el e3ceso de las soluciones. Posterior+ente

agua o soluci6n a+ortiguadora al centro de la +e+,rana/ se es&era a -ue el %D se *

centrifuga &ara recu&erarlo de la +atriz 8 re sus&enderlo. En el &rotocolo de &erlas +agutiliza una solucion ,asica de 2ris>HCl 1) +M a &H ".? &ara neutralizar la carga de las &

se se&ara de las &erlas 8 transfiere a otro tu,o/ +ientras -ue las &erlas continan siend

&or el +agneto. :1#







EN+,MA" -'E MD,/,CANAC,D" N'CLE,C"



7as enzi+as de restricci6n se deno+inan con tres o cuatro letras -ue corres&onden a la &ri+era+icroorganis+o de &rocedencia/8 a las dos o tres &ri+eras letras de la es&ecie del organis+o d

:e$e+&lo0 S+a0 Serratia +arcescens . El n+ero se'ala el orden cronol6gico de descu,ri+ient

esa estir&e. Casi todas las secuencias nucleotídicas reconocidas &or las endonucleasas de rest

de si+etría i+&ro&io ,inario/ esto es/ la lectura de la secuencia en a+,as direcciones es la +is

no+,re de &alíndro+os. 7a rotura se &roduce en a+,as *e,ras de %D siendo esta si+étrica r

:A)

En(imas 0ue modifican ácidos nucle




Endonucleasas de restricción0

Son enzi+as -ue *idrolizan los ácidos nucleicos ro+&iendo enlaces internucleotídicos del inter

endonucleasas de restricci6n son enzi+as &roducidas &rinci&al+ente &or ,acterias -ue *idroliz

del es-ueleto de %D de do,le *e,ra en secuencias es&ecíficas. 7as endonucleasas de restricc

+ás tiles en los +étodos de +ani&ulaci6n del %D de,ido a su es&ecificidad de secuencia a,s

secuencia concreta del ácido nucleico/ tanto &ara la reacci6n de uni6n co+o &ara la de ru&tura

de la cadena &ueden &roducir e3tre+os co*esi5os :esto &er+itirá al frag+ento generado unirse

distinta &rocedencia -ue *a8a sido generado &or la +is+a endonucleasa de restricci6n o e3tre



%olimerasas: Son enzi+as ca&aces de sintetizar %D o %9 <in 5itro=. 7a +a8oría de estas enzi+as re-uiere

sintetizan una +olécula co+&le+entaria al +olde. 7as &oli+erasas utilizadas con +a8or frecue

&oli+erasa I de E. coli/ el frag+ento de KlenoL/ transcri&tasa in5ersa :utiliza co+o +olde %9

%D/ la %D &oli+erasa del ,acteriofago 2(/ %9 &oli+erasa de los ,acteriofagos SP!/ 2( 8 2

:enzi+a e+&leada en la reacci6n en cadena de la &oli+erasa o PC9. 7a +a8oría de las &oli+e

&e-ue'o ce,ador o &ri+er co+&le+entario al %D +olde &ara iniciar la &oli+erizaci6n a &artir d

transferasa ter+inal es una &oli+erasa -ue no re-uiere +olde 8 -ue a'ade nucle6tidos e3clusi5

de las cadenas &ree3istentes. 2odas ellas re-uieren MgA. :A)




7igasas :une e3tre+os de %D &rotu,erantes o ro+os/

Nosfatasas :eli+inan el fosfato de la regi6n ?O de los ácidos nucleicos/

uinasas :incor&oran fosfatos en el e3tre+o ?O -ue *an de$ado las fosfatasas




1ectores recombinantes:



a) Concepto eneral

Molécula de %D circular &e-ue'a -ue no for+a &arte del cro+oso+a &rinci&al del %D

de la ,acteria. :A1

4na +olécula de %D -ue &uede estar &resente en el cito&las+a en for+a inde&en

incor&orada al cro+oso+a ,acteriano. :AA



b) Concepto de plásmido $ su obtenc

7os &lás+idos son frag+entos e3tra cro+os6+icos de ácidos nucleicos :%D o %9 -ue a&arecen en el cito&las+a de algun

5aria,le aun-ue +enor -ue el cro+oso+a &rinci&al. Cada ,acteria &uede tener uno o 5arios a la 5ez. 7os &lás+idos tienen un

&uede ser lineal/ circular o con estructura s&er enrollada. El control de la re&licaci6n del &lás+ido de&ende del ti&o de &lás+idre&licaci6n está aco&lada con la re&licaci6n del cro+oso+a ,acteriano 8 &lás+idos cu8a re&licaci6n no está relacionada con la

genes -ue &ortan los &lás+idos es 5ariado/ tratándose general+ente de genes -ue a&ortan 5enta$as ada&tati5as a la ,acteria

resistencia a anti,i6ticos/ genes de &roducci6n de sustancias t63icas &ara otras ,acterias o genes -ue codifican enzi+as tiles

-uí+icas. 7os &lás+idos se &ueden clasificar siguiendo distintos criterios. 4no de estos criterios es el ti&o de genes -ue &ortan

&lás+idos con genes de degradaci6n de sustancias/ el gru&o de &lás+idos con genes de fertilidad/ el -ue &orta genes de 5irul

genes de resistencia. 7os &lás+idos son *erra+ientas +u8 tiles en ingeniería genética &ara la transfor+aci6n génica 8 la +a

&rocariotas 8 eucariotas. 7os &lás+idos e+&leados en ingeniería genética se lla+an 5ectores. Son +u8 tiles &ara sintetizar en

de interés/ co+o la insulina o los anti,i6ticos/ +ediante un &rocedi+iento conocido co+o transfor+aci6n. El &roceso de transfo

selecci6n de un &lás+ido adecuado/ en el -ue se introducen los genes -ue se -uieren e3&resar con &rotocolos es&ecíficos -ue

D% ligasa. Posterior+ente se transfor+a un ti&o de ,acteria con el &lás+ido +odificado 8 se seleccionan las ,acterias transfo

sustancias deseadas. Estas ,acterias se culti5an en siste+as de t i&o ,iorreactores &ara su creci+iento en grandes cantidades

&lás+idos con características -ue &er+itan seleccionar las ,acterias transfor+adas en un +edio de culti5o co+o &or e$e+&lo &

resistencia a anti,i6ticos o con genes de enzi+as -ue sinteticen co+&uestos coloreados. %un-ue los &lás+idos no &ueden sin

se transfieren con dificultad de una célula a otra se *a *i&otetizado -ue &odrían ser los &recursores de los &ri+eros 5irus.:A



c) !ipos de plásmidos

E3iste una a+&lia 5ariedad de &lás+idos. 7os &lás+idos ,acterianos son de +uc*os ti&os distintograndes rasgos &ode+os clasificarlos atendiendo a di5ersos caracteres0

1. Segn -ue sean autotrans+isi,les &or con$ugaci6n o no0

a &lás+idos con$ugati5os

, &lás+idos no>con$ugati5os. Dentro de esta categoría se inclu8en0

i. &lás+idos no +o5iliza,les

I. &lás+idos +o5iliza,les &or otros -ue sí son con$ugati5os.

:A



A. Segn el ti&o de fenoti&os -ue codifican :8 de$ando a&arte a los &lás+idos crí&ticos/ de los -ue se descono

fenotí&ica0

a Plás+idos 9/ -ue codifican una o +ás resistencias a drogas :anti,i6ticos 8;o resistencia a +etales &esados.

, Plás+idos ,acteriocinogénicos/ -ue codifican alguna ,acteriocina 8 si+ultánea+ente confieren in+unidad frente a es

,acteria -ue lo &osee. Dentro de ellos/ de los +ás estudiados son los &lás+idos Col/ -ue &roducen colicinas :,acterio

c Plás+idos de 5irulencia/ -ue codifican funciones relacionadas con la 5irulencia en +uc*as ,acterias &at6genas. Por e

i. Plás+ido de la to3ina tetánica en Clostridiu+ tetani.

ii. Plás+ido de la to3ina del ántra3 en Bacillus ant*racis.

iii. Plás+idos -ue codifican factores de colonizaci6n :&ara la in5asi6n de los te$idos de su *os&edador.

d Plás+idos de ce&as de Pseudo+onas/ -ue confieren rutas +eta,6licas ca&aces de utilizar co+o fuentes de car,ono

-ue otros organis+os no &ueden cata,olizar0

i. &lás+idos QC2 :degradaci6n del octano

ii. &lás+idos 2Q7;R7 :degradaci6n del tolueno 8 3ileno

iii. &lás+idos %N :degradaci6n del naftaleno/ etc


:A



e Plás+idos de ce&as de 9*izo,iu+ res&onsa,les de funciones relacionadas con el esta,leci+iento de las si+,iosis fi$adoras de nitr6ge

n6dulos radicales de las legu+inosas :&S8+ 8 otros ti&os.

f Plás+idos 2i 8 9i de %gro,acteriu+/ res&onsa,les de la &roducci6n de tu+ores en nu+erosas &lantas dicotiled6neas.

g e3isten igual+ente &lás+idos -ue codifican +ás de un ti&o de fenoti&os0 &. e$./ &lás+idos -ue su+inistran resistencia a anti,i6ticos 8 c

5irulencia.

. Plás+idos segn el gru&o de inco+&ati,ilidad. 9ecordar la definici6n de inco+&ati,ilidad entre &lás+idos -ue se dio o&ortuna+ente/ 8

este fen6+eno0 dos &lás+idos son inco+&ati,les :no &ueden &er+anecer esta,le+ente en la +is+a célula &or-ue co+&arten un +is

de re&licaci6n 8 segregaci6n de las co&ias. Co+o se sa,e/ los &lás+idos se &ueden clasificar segn su &ertenencia a un +is+o gru&o

inco+&ati,ilidad.

a %sí &. e$./ el &lás+ido N &ertenece al lla+ado gru&o IncNI.

, 7os &lás+idos 91 8 91))/ de resistencia a anti,i6ticos/ &ertenecen al gru&o IncNII.

) Q,sér5ese -ue dos &lás+idos con$ugati5os &ertenecientes a gru&os de inco+&ati,ilidad diferentes &ueden &oseer regiones tra se+e$a

de &elos se3uales &arecidos. Esto es &recisa+ente lo -ue ocurre con el N co+&arado con el 91 o el 91)).


:A



d) Bacteriófao Lambda

Se trata de un 5irus co+&le$o de %D lineal ,icatenario. 7os e3tre+os de su +aterial genético son co*esi5os 8 ello *ace -ue tras la infec

co+&ortándose/ en caso de seguir un ciclo liso génico/ co+o un &lás+ido 8 a&ro5ec*ando las enzi+as de la reco+,inaci6n de la ,acteria &ara i

fago no tiene &or -ué integrarse/ 8 de *ec*o es +ás *a,itual -ue se co+&orte co+o un 5irus de ciclo lítico.

En el ciclo lisogénico/ el 5irus utiliza las enzi+as de la reco+,inaci6n :5éase inter+edio de Holl8da8 &ara insertarse en un &unto concreto d

estado/ el 5irus se re&lica cuando lo *ace la ,acteria/ &asando su geno+a a las ré&licas de E. coli. %de+ás/ una ,acteria -ue &osea 8a un fago in

-ue el 5irus se introduce en un lugar concreto del cro+oso+a ,acteriano.

El 5irus sintetiza a &artir de su geno+a el re&resor CI/ -ue in*i,e la e3&resi6n del resto de sus genes. En condiciones de estrés celular/ la ,acte

SQS. 4na de las enzi+as -ue inter5ienen en la res&uesta/ 9ec % :-ue ta+,ién inter5iene en la reco+,inaci6n acta in*i,iendo la acti5idad del re

res&uesta en cascada -ue *ace -ue el 5irus integrado &ase a la 5ía lítica.

El ciclo lítico es la for+a +ás *a,itual de actuaci6n del 5irus al infectar la célula/ 8 ta+,ién es la 5ía -ue sigue al final del ciclo liso génico. En ella

son li,eradas al +edio una 5ez -ue la ,acteria *os&edadora es lisada/ +atando a la ,acteria en el &roceso.

El 5irus re&lica su geno+a circular e+&ezando &or un &unto de éste/ 8 desenrollando s6lo una de las dos *e,ras. El resultado es un geno+a lin

gran cantidad de re&eticiones del geno+a original de for+a seguida/ lo -ue se conoce co+o concaté+ero. El 5irus ta+,ién sintetiza las &roteína

el cito&las+a de la ,acteria. Ninal+ente/ la célula es lisada/ li,erando los 5iriones al +edio.

:A?



e) Concepto Biblioteca enómica4na ,i,lioteca gen6+ica de,e re&resentar la totalidad del geno+a de un organis+o co+o un con$unto de la su&er&osici6n de frag+

tanto/ &er+iten el aisla+iento de una secuencia en el geno+a. 7os frag+entos &ara la clonaci6n ideal+ente de,en ser generadas

inde&endiente de secuencia/ &ara asegurar -ue los frag+entos sean generados al azar 8 &or lo tanto no e3ista un sesgo *acia unalti+o/ los frag+entos clonados de,en ser +antenidos en for+a esta,le/ sin tergi5ersaci6n de las secuencias de,ido a la reco+,in

re&licaci6n del %D clonado durante la &ro&agaci6n de los reco+,inantes. Si ,ien estos criterios &ueden &arecer ,astante e3igente

&ara la &roducci6n de ,i,liotecas gen6+icas &er+iten estos re-uisitos -ue de,en cu+&lir +ás o +enos co+&leta+ente.

7a &ri+era consideraci6n en la construcci6n de una ,i,lioteca gen6+ica es el n+ero de clones necesarios. Esto de&ende de una

e5idente es el ta+a'o del geno+a. Por lo tanto/ un geno+a &e-ue'o co+o la de E. coli se re-uieren +enos clones de un &roceso

geno+a *u+ano. El ti&o de 5ector -ue se utilizará 2a+,ién *a8 -ue considerar/ -ue deter+inará el ta+a'o de los frag+entos -ue s

&ráctica/ el ta+a'o de la ,i,lioteca se &uede calcular si+&le+ente so,re la ,ase de la &ro,a,ilidad de -ue una secuencia &articula

,i,lioteca. Ha8 una f6r+ula -ue tenga en cuenta todos los factores 8 &roduce un Tn+ero de clones de 5alor. la f6r+ula es la siguie

donde es el n+ero de clones necesarios/ P es la &ro,a,ilidad de -ue desee de una secuencia &articular de ser re&resentado :tí

)/##/ a es el ta+a'o +edio de los frag+entos de %D &ara ser clonado/ 8 , es el ta+a'o del geno+a :e3&resada en las +is+as u

uso de esta f6r+ula/ es &osi,le deter+inar la +agnitud de la tarea 8 &lanificar una estrategia de la clonaci6n en consecuencia. %lgu

ta+a'o de sus ,i,liotecas asociadas se +uestran en la 2a,la !.A. Estos ta+a'os de la ,i,lioteca de,en ser considerados co+o 5a

generaci6n de frag+entos clonados no &ueden &ro&orcionar un co+&leto con$unto aleatorio 8 re&resentati5o de los clones en la ,i,

gen6+ica *u+ana/ esta+os *a,lando de unos 1)! clones o +ás en Para estar razona,le+ente seguro de aislar un deter+inado g

:A! :A(



!cnicas de purificación delADN



a) Electroforesis

Se deno+ina electro#oresis a la técnica +ediante la cual se se&aran las ,io+olécu

disoluci6n cuando se 5en so+etidas a un ca+&o eléctrico. Se trata de una técnica

funda+ental+ente analítica/ aun-ue ta+,ién se &uede realizar con fines &re&arati5o

Cada +olécula se des&laza &or efecto del ca+&o/ alcanzando rá&ida+ente una 5elo

constante al e-uili,rarse la fuerza i+&ulsora :fuerza del ca+&o eléctrico con la resis

a5ance :fuerza de fricci6n o roza+iento i+&uesta &or el +edio en el -ue se des&laz



a) Electroforesis

7a +uestra de,e situarse en o so,re un +edio so&orte/ &rinci&al+ente &ara e5itar &ertur,accorrientes de con5ecci6n durante la se&araci6n. En algunos so&ortes :&a&el o si+ilares la +

su&erficie 8 a5anza a lo largo de ella/ con escasa fricci6n/ &or lo -ue el +ecanis+o &rinci&al

+agnitud de la carga de cada co+&onente de la +uestra. Qtros +edios de so&orte :<geles=/

gelatinosos están for+ados &or &olí+eros -ue for+an una +alla/ +atriz o red tridi+ensiona

de,en a5anzar las +oléculas de la +uestra/ -ue -ueda e+,e,ida en el +edio de so&orte el

consecuencia/ la fricci6n es nota,le 8 los factores de for+a 8 ta+a'o ad-uieren una alta rele

se&araci6n.



a) Electroforesis

Pa&el0 sencillo/ &ero con ele5ada adsorci6n de,ido a los gru&os *idro3ilo de la celulosa.

%cetato de celulosa0 los gru&os UQH están acetilados/ lo -ue reduce la adsorci6nV ,a$a tinci6

trans&arentarla o disol5erla &ara detectar 8 recu&erar los co+&onentes se&arados.

%l+id6n0 &asta de al+id6n cu8os granos se *an disgregado en un ta+&6n caliente :se *inc*

utiliza &oco/ *a sido sustituido &or la &oliacrila+ida.

%garosa0 &olisacárido/ &roducto &urificado de algas :co+&osici6n si+ilar al agar>agar. Se d

!)C 8 al enfriar solidifica for+ando un gel/ de alta &orosidad.

Poliacrila+ida0 el gel es el resultado de la &oli+erizaci6n -uí+ica de una +ezcla de acrila+i9egulando la concentraci6n de a+,as 8 su &ro&orci6n se consiguen distintas &orosidades/ s

la de los geles de agarosa



a) Electroforesis

Aarosa 2 poliacrilamida0 &orosidad inter+edia.

%oliacrilamida con "D"0 el dodecilsulfato s6dico :Sodium Dodecyl Sulphate es un deterge

une a las &roteínas/ desnaturalizándolas en una confor+aci6n e3tendida recu,ierta de +olé

consecuencia/ el ta+a'o de la +olécula de &roteína es directa+ente &ro&orcional a su longi

su carga -ueda en+ascarada &or la +a8or carga del SDS -ue la recu,re/ -ue es ta+,ién &

longitud. Por lo tanto/ la +o5ilidad electroforética de la &roteína de&ende exclusi*amente de



b) Nout3ern 4 "out3ern $ su aplicaci

Nort3ern blot5 3ibridación nort3ern o ensa$o nort3ern

es una técnica de detecci6n de +oléculas de ácido ri,onucleico :%9 de una secuencia dada d

co+&le$a :&or e$e+&lo/ un %9 +ensa$ero &ara un &é&tido dado en una +uestra de %9 total.

+ezcla de %9 8 se so+ete a una electroforesis en gel a fin de se&arar los frag+entos de acue

2ras esto/ se transfiere el contenido del gel/ 8a resuelto/ a una +e+,rana cargada &ositi5a+ent

la *i,ridaci6n de una sonda +olecular +arcada radiacti5a o -uí+ica+ente.

El no+,re de la técnica deri5a de la -ue detecta ácido deso3irri,onucleico :%D/ deno+inada

a su in5entor/ EdLin Sout*ern :1#(?. En 1#((/ @a+es %lLine/ Da5id Ke+& 8 George StarJ en l

Stanford desarrollaron el nort*ern ,lot 8 lo deno+inaron e+&leando el &unto cardinal o&uesto :Fse&tentrional en inglés/ frente al +eridional Fsout*ern.

:A#:)



Aplicación

El ensa8o nort*ern &er+ite o,ser5ar un &atr6n &articular de e3&resi6n genética entre te$idos/ 6rdesarrollo/ ni5eles de estrés a+,iental/ infecciones causadas &or &at6genos 8 durante el curso

+is+as. Esta técnica se *a utilizado &ara +ostrar la so,ree3&resi6n de oncogenes 8 la desregu

oncosu&resores en células cancerosas cuando son co+&aradas con te$idos nor+ales.

7os &atrones de e3&resi6n o,tenidos nos a8udan a conocer las funciones de los genes. Desde

&or su ta+a'o/ las sondas contra el +is+o &ueden darnos una idea de su ta+a'o/ sugerir a8us

+oti5os re&etidos en la secuencia. 7a 5ariaci6n en el ta+a'o del &roducto de un gen &uede ade

deleciones o errores en el &roceso de transcri&ci6n. %lterando la sonda &ode+os conocer la secdeter+inar -ue regi6n del 9% *a sido delecionada.

:A#:)




Sout*ern ,lot/ *i,ridaci6n Sout*ern o/ si+&le+ente/ Sout*ern

es un +étodo de ,iología +olecular -ue &er+ite detectar la &resencia de una secuencia de %D

de este ácido nucleico. Para ello/ e+&lea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fi

frag+entos de %D de acuerdo a su longitud 8/ des&ués/ una transferencia a una +e+,rana en

*i,ridaci6n de la sonda. Su no+,re &rocede del a&ellido de su in5entor/ un ,i6logo inglés lla+a

:1:A




"ecuenciación de 6cidosnucleicos



a) !cnica "aner

El +étodo de secuenciaci6n &or dideo3inucle6tidos/ +e$or conocido co+o el +étodo Sanger se ,asa en el &r

re&licaci6n del D%. El +étodo de secuenciaci6n ideado &or Sanger está ,asado en el e+&leo de dideo3inucgru&o *idro3ilo del car,ono W/ de +anera -ue cuando uno de estos nucle6tidos se incor&ora a una cadena d

esta cadena no &uede continuar elongándose. Esto es así 8a -ue la D% &oli+erasa necesita un gru&o ter+i

siguiente nucle6tido 8 el dideo3inucle6tido incor&orado carece de este gru&o *idro3ilo.

El +étodo co+ienza una 5ez se aísla 8 se clona el D% -ue se desea secuenciar. Este D% se desnaturaliza

*e,ra &ara la secuenciaci6n. En la secuenciaci6n se utiliza un ce,ador o <&ri+er= -ue se encarga de su+inis

necesita la D% &oli+erasa &ara co+enzar a elongar. Se &re&aran cuatro tu,os de reacci6n/ cada uno con e

sencilla -ue se desea secuenciar/ con D% &oli+erasa/ con el <&ri+er= 8 con los cuatro nucle6tidos trifosfatad

% cada tu,o se le a'ade una &e-ue'a &ro&orci6n de un dideo3inucle6tido trifosfatoV un tu,o con dd%2P/ otro ddG2P 8 el cuarto con ddC2P. En cada uno de estos tu,os se &roducen cadenas de D% de distintas longitu

el lugar en el -ue se incor&or6 el dideo3inucle6tido corres&ondiente a'adido al tu,o. 7os &roductos de las r

conteniendo una &e-ue'a cantidad de uno de los cuatro dideo3inucle6tidos/ son cargados en un gel 8 so+et

o,tendre+os un &atr6n de ,andas en orden/ del -ue deducir la secuencia del %D introducido. :

) - # 7 9 )



b) !ecnica -u#mica 7Maxam89ilbert)

el +étodo re-uiere +arca$e radiacti5o en uno de los e3tre+os 8 la &urificaci6n del frag+ense desea secuenciar. El trata+iento -uí+ico genera ru&turas en una &e-ue'a &ro&orci6n

los cuatro nucle6tidos en cada una de las cuatro reacciones :G/ %G/ C/ C2. 7os agente

utilizados en cada caso son0 DMS :G/ ácido f6r+ico :%G/ *idrazina :C2 e *idrazina +

ese +odo se genera una serie de frag+entos +arcados a &artir del final +arcado radiacti5

el &ri+er lugar de TcorteT en cada +olécula.

7os frag+entos &osterior+ente se se&aran &or ta+a'o +ediante electroforesis en gel/ se&

&roductos de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas/ &ero una al lado de la otra&resenta condiciones desnaturalizantes/ 8 un contenido en &oliacrila+ida -ue 5aría entre u

Para 5isualizar los frag+entos generados en cada reacci6n/ se *ace una autoradiografía d

-ue &ro&orciona una i+agen de una serie de ,andas oscuras corres&ondientes a los frag+

+arcados con el radiois6to&o/ a &artir de las cuales se &uede inferir la secuencia.

) %C&



c) %C&

Esta técnica se funda+enta en la &ro&iedad natural de los %D &oli+erasas &ara re&licar *e,ra

se e+&lean ciclos de altas 8 ,a$as te+&eraturas alternadas &ara se&arar las *e,ras de %D rectras cada fase de re&licaci6n 8/ a continuaci6n/ de$ar -ue las *e,ras de %D 5uel5an a unirse &a

nue5a+ente. 7a reacci6n en cadena de la &oli+erasa fue &erfeccionada &or Kar8 Mullis &ertene

Cor&oration en California/ en la década de 1#").

Inicial+ente la técnica era lenta/ 8a -ue las &oli+erasas se desnaturaliza,an al realizar los ca+

era necesario agregar nue5as &oli+erasas en cada ciclo. Puesto -ue las te+&eraturas del ciclo

desnaturalizaci6n del %D su&onen la in+ediata desnaturalizaci6n de toda &roteína/ se e+&lea

ter+oesta,les/ e3traídas de +icroorganis+os ada&tados a 5i5ir a esas te+&eraturas/ restricti5a

los seres 5i5os. Dic*os +icroorganis+os/ general+ente ar-ueas/ son0 2*er+us a-uaticus :&oli+P8rococcus furiosus :Pfu/ 2*er+ococcus litoralis :Yent 8 2*er+us t*er+o&*ilus :2t*. General

+ezclas de &oli+erasas +u8 &rocesi5as :2a- con otras ca&aces de *acer correcci6n de errore

:!:(

) %C&



c) %C&

Ho8/ todo el &roceso de la PC9 está auto+atizado +ediante un a&arato lla+ado ter+ociclador/ -ue

enfriar los tu,os de reacci6n &ara controlar la te+&eratura necesaria &ara cada eta&a de la reacci6n

ter+ocicladores +odernos *acen uso del efecto Peltier/ -ue &er+ite tanto calentar co+o enfriar los

in5irtiendo la corriente eléctrica. 7os tu,os usados &ara PC9 tienen una &ared +u8 fina/ lo -ue fa5o

conducti5idad tér+ica/ &er+itiendo -ue se alcance rá&ida+ente el e-uili,rio tér+ico. Casi todos los

tienen un siste+a -ue calienta la ta&a de cierre con el fin de e5itar la condensaci6n so,re los tu,os

ter+ocicladores +ás antiguos carecían de este siste+a 8 soluciona,an el &ro,le+a de la condensa

aceite en la &arte su&erior de la +ezcla de reacci6n o con un &oco de cera dentro de los tu,os.Por lo general/ la PC9 es una técnica co+n 8 nor+al+ente indis&ensa,le en la,oratorios de in5es

,iol6gica &ara una gran 5ariedad de a&licaciones. Entre ellas se inclu8en la clonaci6n de %D &ara

filogenia ,asada en %D/ el análisis funcional de genes/ el diagn6stico de trastornos *ereditarios/ la

*uellas genéticas :usada en técnicas forenses 8 test de &aternidad 8 la detecci6n 8 diagn6stico de

infecciosas.

:!:(



d) %C& en tiempo real

7a PC9 cuantitati5a :en inglés/ -uantitati5e &ol8+erase c*ain reactionV -PC9 o >PC9 o PC9 en tieti+e PC9 es una 5ariante de la reacci6n en cadena de la &oli+erasa :PC9 utilizada &ara a+&lificar

cuantificar de for+a a,soluta el &roducto de la a+&lificaci6n de ácido deso3irri,onucleico :%D. Par

+is+o +odo -ue la PC9 con5encional/ un +olde de %D/ al +enos un &ar de ce,adores es&ecíficos

reacci6n adecuado/ 8 una %D &oli+erasa ter+oesta,leV a dic*a +ezcla se le adiciona una sustanci

fluor6foro -ue/ en un ter+ociclador -ue al,ergue sensores &ara +edir fluorescencia tras e3citar el flu

onda a&ro&iada/ &er+ita +edir la tasa de generaci6n de uno o +ás &roductos es&ecíficos.1 Dic*a +e

de cada ciclo de a+&lificaci6n 8 es &or esto -ue ta+,ién se le deno+ina PC9 en tie+&o real :es deci

si+ultánea. En +uc*os casos el +olde -ue se e+&lea &ara la PC9 cuantitati5a no es desde el &rinc&uede ser %D co+&le+entario :%Dc/ de *e,ra si+&le/ o,tenido &or retrotranscri&ci6n de ácido ri,

este caso/ la técnica es una 92>PC9 cuantitati5a o en tie+&o real/ o 92>>PC9. De,e e5itarse la con

deno+inada FPC9 tras transcri&ci6n in5ersa :92>PC9/ del inglés re5erse transcri&tase PC9/ en la

retrotranscri&ci6n de %9 a %D &ero -ue no necesaria+ente cuantifica el &roducto a tie+&o real.

:":#

d) %C& ti l



d) %C& en tiempo real

7a PC9 cuantitati5a $unto a los c*i& de %D son +odernas +etodologías &ara el estudio de la e3&aun-ue otros +étodos tradicionales co+o el ort*ern ,lot/ si ,ien/ no con tanta &recisi6n/ ta+,ién

a,orda$e.A 7a 5aria,ilidad -ue se introduce en la cuantificaci6n 8 -ue conlle5a a un error en la esti

integridad de %D/ eficiencia enzi+ática 8 otros +uc*os factores/ &or lo -ue se *an desarrollado n

de estandarizaci6n. 7os *a8 &ara cuantificar de for+a a,soluta la e3&resi6n génica/ &ero/ de for+a

orientan a la cuantificaci6n relati5a del gen de estudio res&ecto de otro/ deno+inado Fnor+alizado

de,ido a su e3&resi6n casi constanteV estos genes suelen deno+inarse/ en inglés/ *ouse>Jee&ing

suelen estar in5olucrados en funciones ,ásicas en la su&er5i5encia celular/ lo cual suele i+&licar u

constituti5a. De este +odo/ efectuando en cada e3&eri+ento la +edici6n de los genes de interéla e3&resi6n del gen nor+alizador seleccionado es &osi,le co+&arar los &ri+eros an sin conocer

a,solutos su ni5el de e3&resi6n. 7os genes nor+alizadores +ás e+&leados son a-uellos -ue cod

siguientes &roteínas0 tu,ulina/ gliceralde*ído>>fosfato des*idrogenasa/ al,+ina/ ciclofilina/ 9%

:":#



Micro Arrelos

a) concepto



a) concepto

4n con$unto ordenado de genes en una &e-ue'a su&erficie :1)/))) +uestras &or centí+cuadrado. 7os +icro arreglos de D% son una nue5a *erra+ienta de la ,iología +olec

ciencias gen6+icas. Posi,le+ente es una de las a&licaciones +ás i+&ortantes &ara la

o,tenida de la secuenciaci6n siste+ática de los geno+as co+&letos.

En la actualidad e3isten 5arios ti&os de i+&resores &ara los +icro arreglos 8 los &od

en dos clases &rinci&ales0 los de contacto/ -ue co+o su no+,re lo indica/ de&osita l

*aciendo contacto con la su&erficie 8 los &iezoeléctricos en los -ue un a&licador ultra

de&osita la +uestra/ aun-ue estos lti+os son tecnologías +u8 recientes 8 no a,un

ellos. 2a+,ién e3iste otro &rocedi+iento &ara la i+&resi6n de +icro arreglos 8 es el

de D% directa+ente so,re la su&erficie.

:)



Dianostico Molecular

a) Concepto



a) Concepto

Es un tér+ino general -ue englo,a un con$unto de técnicas de ,iología +olecular e+&leadas &ara la identificaci6n de lo+oleculares su,8acentes en una enfer+edad de carácter *ereditario o ,ien &ara la detecci6n de enfer+edades infecci

origen 5írico/ ,acteriano o fngico.

%lgunos +étodos +oleculares de diagn6stico genético son0

1. Análisis cromosómico. Consiste en o,ser5ar si el carioti&o del &aciente es nor+al/ es decir/ si el n+ero de cro

correcto 8 si su ta+a'o 8 orden es nor+al.

A. ibridación fluorescente in situ o NISH. Con esta técnica se &ueden detectar ano+alías cro+os6+icas/ delecio

otras alteraciones -ue &ueden &ro5ocar una enfer+edad genética.

;. &eacción en cadena de la polimerasa o %C&. Este +étodo ,asado en la a+&lificaci6n 8 5isualizaci6n del %D

diagn6stico genético. 7a realizaci6n 5aría de&endiendo de la enfer+edad a detectar/ &ero en general/ consiste en &

a+&lificaci6n del frag+ento de %D -ue su&uesta+ente &osee la +utaci6n -ue genera la enfer+edad/ 8 realizar souna &rue,a accesoria/ co+o el uso es&ecífico de alguna enzi+a de restricci6n/ *i,ridaci6n de +icrosatélites u otras

. "ecuenciación de ADN. 7a secuenciaci6n directa del %D es uno de los +e$ores +étodos &ara el diagn6stico +

consiste en la lectura del gen o genes i+&licados en una enfer+edad 8 la co+&ro,aci6n directa de -ue e3iste o no

%ctual+ente/ la secuenciaci6n se usa +u8 &oco 8a -ue es una técnica +u8 cara/ la,oriosa 8 en la +a8or &arte de l

&or otra técnica +olecular.

:1



!erapia 9nica

a7 Concepto



a7 Concepto

7a tera&ia génica consiste en la inserci6n de genes funcionales ausentes en el geno+aindi5iduo. Se realiza en las células 8 te$idos con el o,$eti5o de tratar una enfer+edad o r

+arca$e.

7a técnica toda5ía está en desarrollo/ +oti5o &or el cual su a&licaci6n se lle5a &rinci&al+

dentro de ensa8os clínicos controlados/ 8 &ara el trata+iento de enfer+edades se5eras

*ereditario o ad-uirido. %l &rinci&io se &lante6 s6lo &ara el trata+iento de enfer+edades

&ero *o8 en día se &lantea 8a &ara casi cual-uier enfer+edad.

Entre los criterios &ara elegir este ti&o de tera&ia se encuentran01. Enfer+edad letal sin trata+iento.

A. 7a causa sea un nico gen -ue esté 8a clonado.

. 7a regulaci6n del gen sea &recisa 8 conocida

a <) 'sos $ aplicaciones



a.<) 'sos $ aplicaciones

a =) lo mas nue*o



a.=) lo mas nue*o



/armacoloia Molecular

a) 'sos $ Aplicaciones



a) 'sos $ Aplicaciones

Biblioraf#as



1. %r-ui+,au/ E. :A))1. Mane$o 8 e3tracci6n de +uestras ,iol6gicas en la,oratorio. 4

De&arta+ento de ciencias e3&eri+entales. 2esis doctoral.

*tt&0;;LLL.td3.cat;,itstrea+;*andle;1)");1));&itarc*.&dfV$sessionidZ#!%E)DD("ND%)

BC".td3A[se-uenceZ1

A.Bell6n/ M. :A)1). Instru+ental 8 e-ui&o. Muestras ,iol6gicas.

*tt&0;;LLL.ecc&n.ai,arra.org;te+ario;seccionA;ca&itulo;ca&itulo.*t+

.Castro/ @. :A)1) .Estado de la cuesti6n so,re in5estigaci6n ,io+édica con +uestras ,io

Médica. 9ecu&erado en0 *tt&0;;institutoroc*e.es;Le,;&df;guia;&df\co+&leto.&df

.CQIC2. Co+isi6n acional De In5estigaci6n Científica 8 2ecnol6gica. :A))". Ma

,ioseguridad. Segunda edici6n. NQDEC2>CQIC2. 9

*tt&0;;LLL.conic8t.cl;&ia;files;A)1;)#;Manual>Bioseguridad.&df

?.C6rdo5a/ @.%./ :A))(. Cuadro ,ásico 8 catálogo de instru+ental &ara e3tracci6n 8 +ane

Biblioraf#as

Biblioraf#as

http://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/10403/pitarch.pdf;jsessionid=96AE0DD783FDA0EC99EBC09A88C10BC8.tdx2?sequence=1


http://www.eccpn.aibarra.org/temario/seccion2/capitulo33/capitulo33.htm

http://institutoroche.es/web/pdf/guia/pdf_completo.pdf

http://www.conicyt.cl/pia/files/2014/09/Manual-Bioseguridad.pdf













!. CQYE/ Co+ité de Yigilancia E&ide+iol6gica. :A)). Manual de nor+as de &roce

,ioseguridad. 9ecu&erado en0 *tt&0;;LLL.,5sde.&a*o.org;,5sacd;cd#;gc>,iosegurida

(. @uárez/ . :1###. or+as de seguridad &ara el +ane$o 8 la e3tracci6n. Instituto de M

or+as. 9ecu&erado en0 *tt&0;;LLL.&oder$udicial.go,.ni;&$u&load;i+l;&df;IM7\))11.&d

". or+as Me3icanas &ara la salud. :Ne,. A)). Mane$o/ e3tracci6n 8 al+acena+i

oficiales. 9ecu&erado en0 *tt&0;;LLL.salud.go,.+3;unidades;cdi;no+;)"(ecolssa.*t+

#. Palo+ares/ @.C. :A)1A. Diagn6stico +ediante +uestras ,iol6gicas/ 2écnicas de ,iolo

9e5ista Intera+ericana. A)>1. 9ecu&erado

*tt&0;;LLL.guia.re5i,eroa++icol.co+;Ca&ituloA).&df

1).Pérez/ B. :A)1). Pro8ecto Bi6sfera. 2écnicas del %D reco+,inante. En la

Biotecnología. 9ecu&erado

*tt&0;;recursos.cnice.+ec.es;,iosfera;alu+no;A,ac*illerato;,iotec;contenidos1).*t+

11 Sánc*ez C :@un A)1) 2ecnología del %D reco+,inante 2écnicas 9ecu&erado en0

Biblioraf#as

http://www.bvsde.paho.org/bvsacd/cd49/gc-bioseguridad.pdf

http://www.poderjudicial.gob.ni/pjupload/iml/pdf/IML_0011.pdf

http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/087ecolssa.html

http://www.guia.reviberoammicol.com/Capitulo20.pdf

http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/biotec/contenidos10.htm













11.Sánc*ez. C. :@un. A)1). 2ecnología del %D reco+,inante. 2écnicas. 9ecu&erado en0

*tt&0;;es.slides*are.net;Cristela8t;tecnologa>del>adn>reco+,inante>A#)(!A?

1A.Santos/ C. :o5. A)). Guía +ane$o de &rue,as ,iol6gicas. S%74D. 9ecu&erado en0

*tt&0;;LLL.&ro+ocion.salud.go,.+3;dg&s;descargas1;influenza;+at;Guia\+ane$o\de\residuos\

1.4ni5ersidades. :A)1). 2écnicas de %D reco+,inante0 la +ani&ulaci6n genética. 9ecu&erado

*tt&0;;u5igen.fcien.edu.u8;ute+;*erra+gen;reco+,.&df

1.4ni5ersidad CES. :A)11. Calle A)/ o. AA/ or+as de ,ioseguridad. Gesti6n *u+ana. Medellí

9ecu&erado en0 *tt&0;;LLL.ces.edu.co;inde3.&*&;nor+as>de>,ioseguridad

1?.Yáz-uez/ %. :A))". or+as generales &ara el trata+iento de +uestras ,iol6gicas. 9ecu&erad

*tt&0;;fundacionanna5az-uez.Lord&ress.co+;A))(;)(;1;nor+as>generales>&ara>trata+iento>de

logicas

;

1!.Yillegas/ 7. :A)1A. or+as generales de ,ioseguridad. 4ni5ersidad 2ecnol6gica de Pereira. PM

Q9M% PM%>)A>%A>GB. 9ecu&erado en0

Biblioraf#as

Biblioraf#as

http://es.slideshare.net/Cristelayt/tecnologa-del-adn-recombinante-2907625

http://www.promocion.salud.gob.mx/dgps/descargas1/influenza/mat/Guia_manejo_de_residuos_biologicos.pdf

http://uvigen.fcien.edu.uy/utem/herramgen/recomb.pdf

http://www.ces.edu.co/index.php/normas-de-bioseguridad

http://fundacionannavazquez.wordpress.com/2007/07/31/normas-generales-para-tratamiento-de-muestras-biologicas/



















1(.So++a/ M./ %nálisis de la Presencia de Qrganis+os Genética+ente Modificados en Muestras de %li+ent

Purificaci6n de %D/ recu&erado de0 *tt&0;;g+o>crl.$rc.ec.euro&a.eu;ca&acit8,uilding;+anuals;ManualA)

1".Del Yalle/ C.:A))/ Co+&araci6n de tres +étodos de e3tracci6n de %D a &artir de restos 6seos/ rescata

LLL.scielo.sa.cr;scielo.&*&[&idZS))>((A))))))))A]scri&tZsci\artte3t .

1#. %le$os Yeláz-uez 7aura Patricia:A)1)/ E3tracci6n 8 &urificaci6n de %D/ rescatado de0 *tt&0;;

LLLA.inecc.go,.+3;&u,licaciones;li,ros;(1);e3traccion.&df

A).Pat*s*are:A)1/ 2ecnologia en el diagnostico +olecular/ recu&erado de0 *tt&0;;LLL.&at*>s*are.co+;[

-Zs8ste+;files;&ri5ate;articles;Ca&C%DtuloA)A)2ecnologiaA)I.&df .

Biblioraf#as

Biblioraf#as

http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n4.pdf


http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S0034-77442004000300032&script=sci_arttext

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf


http://www.path-share.com/?q=system/files/private/articles/Cap%C3%ADtulo%203%20Tecnologia%20I.pdf


















21.Campbell, M. K., & O., F. S. (2010). Bioguimica Sexta edicion. Mexico:

Lea!i!".22.O!#a$a, %. N. (200). Biologia moderna. Mexico: 'illa.

2.Me#mol (200*) 'emi!o #el "loaio coepo!#ie!+e a plami#o, ec++p:--me#mol.e-"loaio-*-

2/.!iei#a# #e Ga!a#a(200*), Co!3"acio!, 4!#ice +em5+ico i+3al, %#e: ++p:--666.3".e-7eia!e$-Micobiolo"ia-1*co!3"a.+m89'oc/

A?.Est*er 7eder,erg/ T78sogenicit8 in Escherichia coli strain K>1A/ Microbial Genet

5.1/ &&. ?>" :@an. 1#?)V seguido &or T78sogenicit8 in E. coli K>1AT/ Genetics/ 5.:1#?1 :a,stract.

A!. F2rans&ort Media :en inglés. Consultado el )( de se&tie+,re de A)11.

A(.Des+ond S. 2. ic*oll. :A))". Genetic Engineering :en inglés :ra edici6n. Ca

Biblioraf#as

Biblioraf#as

http://medmol.es/glosario/87/


http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/18conjuga.htm#_Toc64554413

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Esther_Lederberg&action=edit&redlink=1
















A".4ni5ersidad de %lcalá:A))" ,io+odeloV Electroforesis de &roteínas

8 de ácidos nucleicos. 9escatado de0 *tt&0;;,io+odel.ua*.es;tecnicas;elfo;inicio.*t+

A#.âtson/ @/ D.V BaJer/ 2. %.V Bell/ S. P.V Gann/ %.V 7e5ine/ M. et 7osicJ/ 9 :A)). Mole

of t*e Gene :Nift* edition edici6n. San Nrancisco0 Ben$a+in Cu++ings. ISB )>A1

).Streit/ SV Mic*alsJi/ CV ErJan/ MV Kleef/ @V Nriess/ H :A))#. Fort*ern ,lot anal8sis fo

9% in &ancreatic cancer cells and tissues. ature Protocols

1.Griffit*s/ @ .N. %. et al. :A))A. Genética. McGraL>Hill Intera+ericana. ISB ">"!>)

A.Sout*ern/ E.M. :1#(?0 TDetection of s&ecific se-uences a+ong D% frag+ents se&

electro&*oresisT/ @ Mol Biol./ #"0?)>?1(. PMID 11#?#(

33.Bioquímica. Escrito &or @ere+8 MarJ Berg/ 7u,ert Str8er/ @o*n 28+oczJo

Biblioraf#as

Biblioraf#as



Biblioraf#as

.Ma3a+ %M/ Gil,ert ̂ 0 A new method for sequencin D!A/ Proc atl %cad Sci 4 S %. 1#((. rescatado de0

*tt&0;;no,el&rize.org;no,el\&rizes;c*e+istr8;laureates;1#");gil,ert>lecture.&df

?.âlter Gil,ert 8 %llan Ma3a+0 "he !ucleotide Sequence of the lac #perator / Proc atl %cad Sci 4 S %. 1#( Dicie+

!. PC9 %&&lications. Protocols for functional geno+ics. Ca&ítulo 1. Edited ,8 Mic*ael %. Innis/ Da5id H. Gelfand/ @o*

)>1A>(A1"!>?/ %cade+ic Press 1###.

(.âtson/ @/ D.V BaJer/ 2. %.V Bell/ S. P.V Gann/ %.V 7e5ine/ M. et 7osicJ/ 9 :A)). Molecular Biolog8 of t*e Gene :Nift*

San Nrancisco0 Ben$a+in Cu++ings.

".El8se Poitras et %lain Houde :A))A. 7a PC9 en te+&s réel0 &rinci&es et a&&lications. 9e5ieLs in Biolog8 and Biotec

de0 *tt&0;;LLL.collegea*untsic.-c.ca;&agesde&t;,iologie;Progra++es;Biotec*nologies;A1)>11>%H;PC9.&df

#.Bustin S% :A))). %,solute -uantification of +9% using real>ti+e re5erse transcri&tion &ol8+erase c*ain reaction a

Endocrinol. 9escatado de0 *tt&0;;LLL.nc,i.nl+.ni*.go5;&u,+ed;11)1?

).Nlores Herrera Q.:A))/ MIC9Q%99EG7QS DE D%/ 4%M. 9escatado de0

*tt&0;;,-.una+.+3;LiJide&;u&loads;Mensa$eBio-ui+ico;Mensa$e\Bio-)5A(&)#(\@orge\9a+irez.&df

Biblioraf#as

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11013345







1.Patrinos G/ %nsorge ̂ :A))? Diagnostico Molecular. Ca&ítulo 1/ &áginas 1">A.

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FICHERO VIRTUAL(COMPLETO) Daniel Efrain Hernandez Gutierrez 136689