パネル解析をはじめよう～解析目的に合わせた実験 …...4 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. パネル解析とは？全ゲノム解析

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パネル解析をはじめよう～解析目的に合わせた実験デザインの構築～

高田よう子イルミナ株式会社・テクニカルアプリケーションサイエンティスト

寺倉伸治イルミナ株式会社・フィールドアプリケーションサイエンティスト

January 30, 2018

2 For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

本日の Outline

1. パネル解析の概要

2. アンプリコン法について：AmpliSeq for Illumina1. ワークフロー

2. パネルの種類

3. コスト

3. キャプチャー法について：Nextera Flex for Enrichment1. ワークフロー


3. コスト

4. パネル解析のシーケンスデザインを考える

3

パネル解析の概要


パネル解析とは？

全ゲノム解析

＝ゲノム全領域をシーケンス

長所

• ゲノムすべての領域が解析できる

• 前処理(ライブラリー調製)が簡便

短所• シーケンスコストが高い• カバレッジが低くなる

• ゲノム全領域を解析するため情報解析が煩雑

パネル解析

＝標的領域のみをシーケンス

長所• コストが安い

• 標的領域を絞っているので情報解析が簡便

• 高いカバレッジの解析が可能（低頻度の体細胞変異の検出など）

短所• 標的領域しか読まない• 前処理（ライブラリ調製）が煩雑


パネル解析のためのライブラリー調製手法「アンプリコン法」と「キャプチャー法」

アンプリコン法キャプチャー法

サンプル↓

ショットガンライブラリ↓

プローブによるハイブリ・キャプチャー

サンプル↓

マルチプレックスPCR

AmpliSeq for illumina Nextera Flex for Enrichment


「アンプリコン法」と「キャプチャー法」の比較

特徴

ライブラリ調製試薬

パネル例

• 簡便な手法• 狭い範囲を解析• 必要サンプル量は少なめ

• AmpliSeq for Illumina

• Cancer Hotspot v2

• Focus

• Comprehensive v3

• やや複雑な手法• 広い範囲を解析• 必要サンプル量は多め

• Nextera Flex for

Enrichment

• TruSight One

• TruSight Cardio

• Exome


1. ワークフロー


3. コスト

アンプリコン法

AmpliSeq for Illuminaの紹介


標的配列を読むためのライブラリー調製手法アンプリコン法： AmpliSeq for Illumina


サンプル↓



サンプル↓




AmpliSeq for Illuminaに必要なサンプル量など

⚫ インプット：DNA、RNA

DNA→変異・バリアント解析

RNA→発現解析、融合遺伝子検出

⚫ 必要核酸量

高品質DNA/RNA：1 ～100 ng

ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプル由来のDNA/RNA：10 ～100 ng

⚫ 作業時間：5~7時間（ハンズオン1.5時間）

⚫ イルミナでシーケンサー内蔵の解析ソフトウェアやクラウド環境での専用の解析ツールを提供しており、簡単に解析が可能


AmpliSeq for Illuminaのワークフロー

AmpliSeq Panel

（標的領域を増幅するプライマー）

Library PLUS

（ライブラリー調製に必要な反応酵素）

Index plate

（サンプルごとにインデックスを付加）

合計5 – 7 時間ハンズオン1.5 時間1–100 ng インプット推奨 – 10ng / プール

DNA RNA

Reversetranscribe

DNA/cDNA

amplicon

Remove primer sequences

Ligate adapters

PCR amplify

Sequencing-ready library


AmpliSeq for Illumina パネルポートフォリオ

Comprehensive Cancer

Cancer Hotspot v2

Focus

Comprehensive v3

BRCA

Immune Response

Transcriptome Human GEx

Exome

Immune Repertoire Plus

Myeloid

Childhood Cancer

カタログパネルコミュニティパネル

受注生産

デザイン済みのパネル

疾患研究をリードする研究者からの情報をもとに選択され、デザインされたコンテンツ

＊パネルの性能は、保証外

カスタムパネル

受注生産

お客様がデザインする製品

お客様の興味のある遺伝子・ゲノム領域をターゲット


合成済


11 30

16 遺伝性疾患

5 がん

3 細胞分子研究

2 免疫

2 感染症

1 神経

1 複合疾患

On-Demandパネル

受注生産

決まったデザインの製品からお客様が組み合わせを選択検証済みの約5,000の遺伝子から選択可能



カタログパネル一覧カタログパネル

サンプルの種類

ターゲット

Comprehensive Cancer

DNA

既知のがん関連409遺伝子の体細胞変異

Cancer Hotspot v2 既知がん関連50遺伝子のホットスポット領域の体細胞変異

Exome 59Mbのエクソン領域の生殖細胞系列変異

BRCABRCA1とBRCA2の全エクソン領域および隣接イントロン配列の体細胞変異と生殖細胞系列変異

Immune Response

RNA

腫瘍免疫系相互作用に関与する395遺伝子におけるがんバイオマーカーの発現

Immune Repertoire Plus T細胞受容体(TCR)の多様性解析

Transcriptome Human

Gene Expression20,000個を超えるヒトRefSeq遺伝子の発現

Comprehensive v3

DNA &

RNA

既知のがん関連161 遺伝子のコピー数異常、融合遺伝子を含むさまざまな体細胞変異

Focus既知のがん関連52遺伝子のコピー数異常、融合遺伝子を含むさまざまな体細胞変異

Myeloid血液がんに関与する69遺伝子、29融合遺伝子、5遺伝子におけるバイオマーカーの発現

Childhood Cancer小児や若年成人のがんと関連する203遺伝子のコピー数異常、融合遺伝子を含むさまざまな体細胞変異


カスタムパネルとOn-Demandパネルの違い

アプリケーション

アンプリコンサイズ

パネルサイズ

製品構成

特徴

Custom

• がん、遺伝性疾患、体細胞または生殖細胞由来の変異解析

• 140 bp (FFPE対応)

• 175 bp (FFPE対応)

• 275 bp

• 375 bp (MiSeqのみ)

• 10プール、24,000アンプリコン（およそ1,200遺伝子）

• 96アンプリコンまで – 750反応• 96アンプリコン以上 – 3,000反応

• 自由設計ができる• 検証されていない

On-Demand

• 約5,000のヒト遺伝性疾患関連遺伝子にフォーカス

• 275 bp

• 2プール、500遺伝子まで

• 24または96反応

• 約5,000遺伝子のコーディング領域に対してデザイン済み

• 検証済み


On-Demandパネルは専用ウェブサイトでデザインDesignStudio: https://designstudio.illumina.com/

Design Name

Assay Technology


On-Demandパネルは専用ウェブサイトでデザイン

実験で得られたカバレッジ、Ampliconの位置、読

むことができなかった領域(Gaps)をビューワーで確認することが可能です。②それぞれの標的遺

伝子のカバレッジと

その均一性を確認することが可能

①遺伝子名を入力、もしくはアップロード


On-Demandパネルは検証結果を確認可能


On-Demandパネル製品構成

製品構成

カタログ番号

20023977 20023979 20023983 20023980 20023978 20023981

遺伝子数 1-50 1-50 51-300 51-300 301-500 301-500

サイズ 24反応 96反応 24反応 96反応 24反応 96反応

価格（円） 180,000 720,000 240,000 960,000 320,000 1,280,000

サンプルあたりの価格（円）

7,500 7,500 10,000 10,000 13,334 13,334


AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2遺伝子一覧

ABL1 EGFR GNAS KRAS PTPN11

AKT1 ERBB2 GNAQ MET RB1

ALK ERBB4 HNF1A MLH1 RET

APC EZH2 HRAS MPL SMAD4

ATM FBXW7 IDH1 NOTCH1 SMARCB1

BRAF FGFR1 JAK2 NPM1 SMO

CDH1 FGFR2 JAK3 NRAS SRC

CDKN2A FGFR3 IDH2 PDGFRA STK11

CSF1R FLT3 KDR PIK3CA TP53

CTNNB1 GNA11 KIT PTEN VHL

遺伝子リストリンク： https://jp.illumina.com/content/dam/illumina-

marketing/documents/products/gene_lists/ampliseq-for-illumina-cancer-hotspot-gene-list.xlsx

体細胞突然変異カタログ（COSMIC）データベースにおいてがんとの関連が特定された50の遺伝子のホットスポット領域にわたり体細胞変異を調べる


コスト試算例： Cancer HotSpot v2

1ランで解析できるサンプル数iSeq 100, MiSeq Reagent Micro Kit v2：16

MiSeq Reagent Kit v2：60

MiSeq Reagent Kit v3：96

カタログ番号製品名希望販売価格（円）

24サンプル実施に必要なキット数


200191161AmpliSeq Cancer Hotspot Panel

v2 for Illumina78,000 1 3,250

20019101AmpliSeq Library PLUS for

Illumina (24 Reactions)372,000 1 15,500

20019105AmpliSeq CD Indexes Set A for

Illumina (96 Indexes, 96 Samples)80,700 1 841

サンプルあたりの価格（合計） 19,591 円

＊解析を行うには、加えてシーケンス試薬の購入が必要


コスト試算例： On-Demandパネル(50遺伝子までの場合)


24サンプル実施に必要なキット数


200191161AmpliSeq Cancer Hotspot Panel

v2 for Illumina180,000 1 7,500

20019101AmpliSeq Library PLUS for

Illumina (24 Reactions)372,000 1 15,500

20019105AmpliSeq CD Indexes Set A for

Illumina (96 Indexes, 96 Samples)80,700 1 841




AmpliSeq for illumina

イルミナウェビナーのご紹介

● イルミナで AmpliSeq for Illumina パネル解析をはじめよう -製品紹介とライブラリー調製編-【イルミナiSchool初級】

- https://jp.illumina.com/events/webinar/2018/webinar-180425-j.html

● イルミナで AmpliSeq for Illumina パネル解析をはじめよう -情報解析編-【イルミナiSchool初級】


● イルミナで AmpliSeq for Illumina パネル解析をはじめよう -カスタムデザイン編-【イルミナiSchool初級】


https://jp.illumina.com/events/webinar/2018/webinar-180425-j.html




AmpliSeq for illuminaの試薬価格

カタログ番号製品名サンプルあたりの価格（円）

希望販売価格（円）

20019101 AmpliSeq Library PLUS for Illumina（24 Reactions） 15,500 372,000

20019102 AmpliSeq Library PLUS for Illumina（96 Reactions） 12,813 1,230,000

20019103 AmpliSeq Library PLUS for Illumina（384 Reactions） 7,657 2,940,000

20019105 AmpliSeq CD Indexes Set A for Illumina （96 Indexes, 96 Samples） 841 80,700

20022654 AmpliSeq cDNA Synthesis for Illumina 671 64,400

カタログ番号製品名サンプルあたりの価格（円）

希望販売価格（円）

20019160 AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel for Illumina 13,000 312,000

20019161 AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 for Illumina 3,250 78,000

20019164 AmpliSeq Focus Panel for Illumina 15,500 372,000

20019168 AmpliSeq BRCA Panel for Illumina 6,000 144,000

20019169 AmpliSeq Immune Response Panel for Illumina 15,500 372,000

20019170 AmpliSeq Transcriptome Human Gene Expression Panel for Illumina 5,417 130,000

20019109 AmpliSeq Comprehensive Panel v3 for Illumina 27,500 660,000

20019166 AmpliSeq Exome Panel for Illumina 9,000 72,000

20024478 AmpliSeq for Illumina Myeloid Panel 13,500 324,000

20024479 AmpliSeq for Illumina Immune Repertoire Plus, TCR beta Panel 14,000 336,000

20019162 AmpliSeq for Illumina Sample ID Panel 188 18,000

AmpliSeq for Illumina ライブラリー調製用試薬

AmpliSeq for Illuminaカタログパネル

試薬消耗品価格表 2018年10月改定版参照


1. ワークフロー


3. コスト

キャプチャー法Nextera Flex for Enrichmentの紹介


標的配列を読むためのライブラリー調製手法「キャプチャー法」


サンプル↓



サンプル↓




Nextera DNA Flex for Enrichmentに必要なサンプル量など

⚫ インプット：高品質のDNA、FFPE由来のDNA、血液、唾液

⚫ 必要インプット量

DNA：1～1000 ng

FFPE由来DNA： 50～1,000 ng、∆ Cq ≤ 5

血液： 10 µl の全血*

唾液： 30 µl*

*血液と唾液サンプルからのDNA抽出には、別途購入品が必要

⚫ 作業時間：6.5時間（ハンズオン2時間）

⚫ イルミナでシーケンサー内蔵の解析ソフトウェアやクラウド環境での専用の解析ツールを提供しており、簡単に解析が可能

まずはショットガンライブラリーを調製し、問題がないことを確認してから、濃縮に進むと良い


Nextera Flex for Enrichmentのワークフロー

合計6.5 時間1 ハンズオン2時間1–1,000 ng ＤＮＡインプット

10 μl血液、30 μl唾液からも可能

1. 合計時間は、アッセイのみの時間 DNA/RNA 定量、希釈およびライブラリーの定量、希釈時間は含まない

Step 1: ショットガンライブラリーの作製 Step 2:プール

Step 3:

濃縮


Nextera Flex for EnrichmentのワークフローStep 1: ショットガンライブラリーの作製

DNA

DNA-eBLT complexEnrichment Bead-Linked

Transposome (eBLT)

Tagmented Library

Indexed Library

Tagment with eBLT

Index PCR primers

Index PCR

1. スタート量が50~1,000ng であれば、

スタート量をそろえる必要性がない。

2. ショットガンライブラリの収量が安定するので、その後のプーリングが楽になる。

3. ライブラリのサイズが安定する。

ビーズ結合トランスポソームがDNAと飽和すると、それ以上タグメンテーションが起こることはありません。このため、飽和による安定したノーマライゼーションが可能となります。

Index plate（サンプルごとにインデックスを付加）


Nextera Flex for EnrichmentのワークフローStep 2:プール（マルチプレックスの場合）

【濃縮前のライブラリーのプーリング】DNAインプットが50 ng以上の場合は、 DNA質量濃度の測定は不要に！

ショットガンライブラリーの収量がほぼ一定となり、濃縮前のプール（ライブラリー混合）は、体積等量でまぜればOK!

Indexed Library

Pooled Sample Library

シングルプレックス、もしくは12プレックスでの濃縮反応を推奨。12プレックスの場合、濃縮コストを大幅に抑えることができます。


Nextera Flex for EnrichmentのワークフローStep 3: 濃縮

Pooled Sample Library

Enriched Library

Add biotinylated probe panel

Enrich using streptavidin magnetic beads

Elute enriched library from beads

PCR amplify

Sequencing-ready library

Panel(標的領域をキャプチャーするプローブ)


Nextera Flex for Enrichmentで購入いただく試薬ライブラリ調製・濃縮試薬、インデックス、パネル

Nextera compatible unique

dual indices Set A

(96インデックス,

96サンプル)

インデックス＋＋ライブラリ調製・濃縮試薬

2種類をご用意• 16サンプル（1プレックス、16濃縮反応）

• 96サンプル（12プレックス、8濃縮反応）

パネル (プローブ)

以下より選択：• イルミナカタログパネル• イルミナカスタムパネル• 3rd party カタログパネル• 3rd partyカスタムパネル

サンプルによって追加でご購入いただく試薬• FFPEサンプル：Infinium FFPE QC Kit

• 血液サンプル：Flex Lysis Reagent Kit＋


イルミナカタログパネル概要

パネル名サイズ標的領域

Illumina Exome

(CEX)8濃縮

ヒト全遺伝子のコーディングエクソン領域（45 Mb）

TruSight One 6濃縮ヒト疾患に関連する4,813遺伝子

TruSight One

Expanded 6濃縮ヒト疾患に関連する6,704遺伝子

TruSight Cancer 8濃縮がん素因に関連する94遺伝子と284のSNP

TruSight Hereditary

Cancer8濃縮

小児期に発症する重度劣性疾患に関連する552遺伝子

TruSightCardio 8濃縮遺伝性心臓疾患（ICC）への関与が知られている174遺伝子

TruSeq

Neurodegeneration8濃縮神経変性疾患に関連する118の遺伝子


Nextera Flex for Enrichmentで使用可能なパネル

カタログパネル

受注生産

お客様がデザインする製品

研究目的に応じて、標的遺伝子・標的領域を自由に設計

プローブ数：2,000 ～ 675,000

(15 Mb程度まで)


合成済


Illumina Exome (CEX)

TruSight One

TruSight One Expanded

TruSight Cancer

TruSight Hereditary Cancer

TruSightCardio

TruSeq Neurodegeneration

カスタムパネル 3rd party パネル7

他社製のカタログパネル、カスタムパネル

＜条件＞-ビオチン化プローブ

-プローブ長：80 bp または 120 bp

-プローブ数：500 ～ 675,000

(15 Mb程度まで)


コスト試算例： Illumina Exome



20020183 Illumina Exome Panel (8 enrichments) 301,000 37,625

20025523Nextera DNA Flex Pre-Enrichment Library

Prep and Enrichment Reagents - 16

samples (16, 1-plex enrichment reactions)

616,000 38,500

20027213Nextera Compatible Unique Dual Indices -

Set A (96 Indexes, 96 Samples)118,000 1,229


1-plexで濃縮反応を行った場合




20025524

Nextera DNA Flex Pre-Enrichment Library

Prep and Enrichment Reagents - 96

samples (8, 12-plex enrichment reactions)

1,430,000 14,896

20027213Nextera Compatible Unique Dual Indices -

Set A (96 Indexes, 96 Samples)118,000 1,229


12-plexで濃縮反応を行った場合



Nextera DNA Flex for Enrichmentの試薬価格

製品番号製品名反応数価格（円）1反応あたりのコスト(円)*3

20025523Nextera DNA Flex Pre-Enrichment Library Prep and Enrichment Reagents - 16

samples (16, 1-plex enrichment reactions)*116 616,000 38,500

20025524Nextera DNA Flex Pre-Enrichment Library Prep and Enrichment Reagents - 96

samples (8, 12-plex enrichment reactions)*196 1,430,000 14,896

20027213 Nextera Compatible Unique Dual Indices - Set A (96 Indexes, 96 Samples)*2 96 118,000 1,229

製品番号製品名反応数価格（円）1反応あたりのコスト(円)

20025519 Nextera DNA Flex Pre-Enrichment Library Prep Reagents (16 samples) 16 135,000 8,438

20025520 Nextera DNA Flex Pre-Enrichment Library Prep Reagents (96 samples) 96 705,000 7,344

*1: 1-plex enrichment reactions は1回の濃縮反応で1検体を濃縮、12-plex enrichment reactionsは1回の濃縮反応で12検体を濃縮することを示しています。*2: ライブラリー調製には” Nextera Compatible Unique Dual Indices”（ショットガンライブラリー調製時のPCRのプライマー）が必要となりますので、合わせてご購入ください。*3: １回の濃縮反応で、12検体をまとめて処理した場合のコストとなります。

ショットガンライブラリー調製に必要な試薬のみの販売も行っています。

ショットガンライブラリー調製と濃縮の際に使用する試薬のセット(濃縮用プローブは別で準備が必要)



Nextera DNA Flex for Enrichment用のプローブ【イルミナのプローブ】

カタログ番号製品名価格（円）1サンプルあたりのコスト（円）*


20029226 TruSight One Expanded (6 enrichments) 189,000 2,625

20029227 TruSight One (6 enrichments) 189,000 2,625

FC-121-0202 TruSight Cancer (8 enrichments) 87,400 910

20024717 TruSight Hereditary Cancer (8 enrichments) 101,000 1,052

20029229 TruSight Cardio (8 enrichments) 101,000 1,052

20029550 TruSeq Neurodegeneration (8 enrichments) 101,000 1,052

*１回の濃縮反応で、12検体をまとめて処理した場合のコストとなります。


36

パネル解析のシーケンスデザインを考える


シーケンスデザインを考えるための二つのファクター変異・バリアントの頻度によって変わる。頻度が低い場合には、たくさん読まないと検出できません。

– 生殖細胞系列のバリアント（ヘテロバリアントの割合は50%）の検出にはカバレッジX20以上シーケンスが必要。

– がんといった体細胞変異の場合、頻度5%の変異の検出にはカバレッジX500以上が必要。

– 上記は、SNP・Short Indelの検出に対し、一般的に言われていることとなります、目的によってさまざまです。

必ずしも標的領域だけ均一に読めるわけではない。

– アンプリコン系であればPCR、キャプチャ系であればハイブリダイゼーションの工程でバイアスが生じます。

– よって、このバイアスを踏まえて、変異・バリアント検出に必要なカバレッジ以上を読まないといけない。

目的（生殖細胞バリアント・体細胞変異）と手法(アンプリコン・キャプチャ)の両方を考慮したシーケンスデザインを考える。


シーケンスデザインを考えるカバレッジ・均一性・オンターゲット率について

カバレッジ

カバレッジの均一性

カバレッジ：標的領域を何回シーケンスしたか？均一性: 標的領域のカバレッジの凸凹オンターゲット率: シーケンスデータのうち標的領域が読まれた割合


アンプリコン法では標的領域を何リード読んだか？

アンプリコン法

【考え方】標的領域をリード何本で読んだか？生殖細胞系列: カバレッジX250程度(250本程度)まで。体細胞変異(5%頻度):カバレッジX2,500程度(2,500本程度)まで。

アンプリコン数が100のパネルで、体細胞変異（5%頻度)の検出を目的とした場合、100 X 2,500 = 250,000、検体当たり25万本読む必要がある。

↓

iSeq 100 では一回のシーケンスで400万クラスター解析ができるので、400万 ÷ 25万 = 16、1回のシーケンスで16検体の解析が可能となる。


キャプチャ法では標的領域の何倍を読んだか？

キャプチャ法

【考え方】標的領域の何倍を読むのか。生殖細胞系列: 標的領域の100~200倍程度*

体細胞変異:標的領域の300~1,000倍程度*

*読み量は製品性能や目的に大きく依存します。

標的領域が1.2 Mbのパネルで、生殖細胞系列のバリアントの検出を目的とした場合、1.2 Mb X 100~200 = 120~240 Mb、検体当たり120~240 Mbが必要。

↓

iSeq 100 では一回のシーケンスで1.2 Gbの収量となるので、1.2 Gb ÷ 120~240 Mb = 5~10、1回のシーケンスで5~10検体の解析が可能となる。


解析結果で期待した解析ができたかが確認可能

各アンプリコンの標的領域のカバレッジが確認できます。アンプリコン法

キャプチャ法標的領域のカバレッジのヒストグラムや集計結果を確認できます。


情報解析はイルミナで専用ツールを準備しています

Local Run Manager™

ローカル環境クラウド環境

②変異・バリアントコール

シーケンスデータを参照配列にアライメントを行い、変異・バリアントを見つける。

③アノテーション

変異・バリアントにデータベースを参考に注釈をつけ、生物学的に重要なものを同定する。

①シーケンス


まとめ

⚫ AmpliSeq for Illumina （アンプリコン法）：

比較的狭い領域の解析に適しており、前処理が簡便で必要サンプル量が少ない。

⚫ Nextera flex for Enrichmet（キャプチャー法）：

比較的広い領域の解析に適しており、幅広いイサンプル量に対応可能。50 ng

以上のDNAや、血液、唾液サンプルからスタートする場合、ノーマライゼーションが不要に。

⚫ どちらも、FFPEサンプルに対応していて、研究目的に合わせて、カタログパネル、カスタムパネル等を選択することができる。

⚫ AmpliSeq for Illumina On-Demandといった検証済みのプローブセットを用いることにより、より確実に読めるカスタムパネルの構築が可能になった。

⚫ 目的（生殖細胞バリアント・体細胞変異）と手法(アンプリコン・キャプチャ)

を考慮した読み量を考える。

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ご清聴ありがとうございました

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.


Appendex:パネルの選択

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