テムセル HS 注...テムセルHS 注 CTD 第2 部（モジュール2） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 JCRファーマ株式会社 2.6.1 緒言 - 4 - 用語の定義

テムセル HS 注

CTD 第 2 部（モジュール 2）

2.6 非臨床試験の概要文及び概要表

ＪＣＲファーマ株式会社

テムセル HS注

CTD 第 2部（モジュール 2）

2.6 非臨床概要

2.6.1 緒言

JCRファーマ株式会社

2.6.1 緒言

- 3 -

目次

2.6.1 緒言 .............................................................................................................................. 5

JR-031の一般性状及び薬理学的特性 .................................................................. 5 2.6.1.1

臨床適応及び用法・用量 ...................................................................................... 6 2.6.1.2

2.6.1 緒言

- 4 -

用語の定義

用語定義・解説

GVHD 移植片対宿主病 (graft-versus-host disease)

hPBMC ヒト末梢血単核細胞 (human peripheral blood mononuclear cell)

IDO インドールアミン 2,3-ジオキシゲナーゼ (indoleamine 2,3-dioxygenase)

IFN-γ インターフェロン γ (interferon γ)

IGF-1 インスリン様成長因子 1 (insulin-like growth factor 1)

JR-031 JCR の hMSC製剤（JCRの hMSCの開発コードとして用いる場合もある）又はその本質

MHC 主要組織適合性遺伝子複合体 (major histocompatibility complex)

MMP マトリックスメタロプロテアーゼ (matrix metalloproteinase)

hMSC ヒト間葉系幹細胞 (human mesenchymal stem cell)

PDGF 血小板由来増殖因子 (platelet-derived growth factor)

PGE2 プロスタグランジン E2 (prostaglandin E2)

TLR Toll 様受容体 (toll-like receptor)

2.6.1 緒言

- 5 -

2.6.1 緒言

JR-031の一般性状及び薬理学的特性 2.6.1.1

2.6.1.1.1 JR-031の一般性状（2.3.S.1参照）

JR-031 は、健常成人骨髄液より分離した有核細胞をプラスチック表面上で培養し、固着する

細胞を増殖させて得られる hMSC からなる細胞性医薬品である。培養状態では紡錘形、剥離剤

を用いて均一な細胞懸濁液とした状態では球状を呈し、あああああによる解析で、約 aa μmの

平均粒子径を示し、粒子の aa%以上は aa μm以下である。骨髄液より分離後から製品までの分

裂回数はおよそ aa回と推定される。製剤に相当する hMSCをさらに長期間で培養すると、徐々

に増殖能は低下し、骨髄液からの推定分裂回数が aa回を超えるとほぼ増殖を停止する。細胞表

面抗原の解析では、CD45及び CD34が陰性、CD105、CD166、CD73及び CD90 が陽性を示す。

軟骨細胞、骨芽細胞及び脂肪細胞への分化能を有する。

2.6.1.1.2 JR-031の薬理学的特性（2.6.2参照）

2.6.1.1.2.1 免疫調節作用

JR-031 は、hPBMC との共培養により、抗 CD3/CD28 抗体刺激によって誘発される T 細胞増

殖を抑制した。本作用には、JR-031が産生する PGE2や IDO が関与することが示された。JR-031

における IDO1 遺伝子の発現は、IFN-γ、TLR3 アゴニスト又は TLR4 アゴニスト刺激により顕

著に増加した。また、JR-031 は、CD4 陽性細胞との共培養により、制御性 T 細胞への分化を誘

導することが示された。

2.6.1.1.2.2 細胞遊走能

JR-031 は、細胞接着分子インテグリン α4、インテグリン β1、ケモカイン受容体 CXCR4及び

血管の基底膜や細胞外マトリックスの分解に関与するマトリックスメタロプロテアーゼ関連の

遺伝子群を発現していることが確認された。in vitro 細胞遊走アッセイにおいて JR-031の遊走能

が観察され、その遊走には、PDGF、IGF-1及び MMP が関与することが示された。

2.6.1.1.2.3 免疫原性

JR-031 において、MHCクラス I分子は無刺激条件でも発現が認められたが、その発現レベル

は低かった。また、MHC クラス I 分子は IFN-γ刺激により発現が増加した。MHC クラス II 分

子は無刺激条件では発現していないが、IFN-γ刺激により発現が誘導された。しかし、その発現

レベルは低かった。T 細胞の活性化に必要な共刺激分子 CD40、CD80 及び CD86 は、いずれも

IFN-γ刺激の有無に関係なく発現は認められなかった。

以上の薬理学的特性により、JR-031 は、生体内において炎症部位を感知してその部位に集簇

し、炎症性サイトカインなどによって活性化され、PGE2及び IDO 等の産生や制御性 T 細胞の

誘導等、複数の機序によりドナー由来の活性化 T細胞機能を抑制することによって GVHD 治療

効果を発現すると推察される。また、JR-031は、MHC クラス I及びクラス II分子の発現レベル

が低く共刺激分子を発現していないことに加え、自身の有する免疫調節作用により患者の同種

免疫応答を抑制して免疫拒絶を遅延又は回避する可能性が考えられる。

2.6.1 緒言

- 6 -

臨床適応及び用法・用量 2.6.1.2

本剤には以下の【効能・効果】及び【用法・用量】が予定されている。

【効能・効果】

造血幹細胞移植後の急性移植片対宿主病

【用法・用量】

通常、1日 1回体重 1 kgあたりヒト間葉系幹細胞として 2×106個/kgを、生理食塩液であらか

じめ希釈して、緩徐に点滴静注する。原則として 1 週間に 2 回計 8 回、4 週間投与する（投与

間隔は 3 日以上とする）。なお、症状の程度に応じて 1週間に 1回計 4回、4週間継続して投与

することができる。

テムセル HS注


2.6 非臨床概要

2.6.2 薬理試験の概要文



- 3 -

目次

2.6.2 薬理試験の概要文 ........................................................................................................ 6

2.6.2.1 まとめ .................................................................................................................... 6

2.6.2.1.1 効力を裏付ける試験 ...................................................................................... 6

2.6.2.1.1.1 JR-031の免疫調節作用 .......................................................................... 6

2.6.2.1.1.2 JR-031の細胞遊走能 .............................................................................. 7

2.6.2.1.1.3 JR-031における免疫原性に関わる因子 ................................................. 7

2.6.2.1.2 安全性薬理試験 .............................................................................................. 7

2.6.2.1.2.1 ラットにおける同種異系MSCの中枢神経系に及ぼす影響 ................... 7

2.6.2.1.2.2 ラットにおける同種異系MSCの呼吸系に及ぼす影響 .......................... 7

2.6.2.2 効力を裏付ける試験 .............................................................................................. 7

2.6.2.2.1 JR-031の免疫調節作用 ................................................................................. 7

2.6.2.2.1.1 JR-031の T細胞増殖抑制作用 ............................................................... 7

2.6.2.2.1.2 JR-031の T細胞増殖抑制作用における PGE2の関与 ........................... 9

2.6.2.2.1.3 JR-031の T細胞増殖抑制作用における IDO阻害剤の影響 ................ 12

2.6.2.2.1.4 JR-031の制御性 T細胞誘導能 ............................................................. 14

2.6.2.2.1.5 JR-031における TLRファミリーの発現 ............................................. 16

2.6.2.2.1.6 JR-031における抗炎症因子遺伝子の発現誘導 .................................... 19

2.6.2.2.2 JR-031の細胞遊走能 ................................................................................... 21

2.6.2.2.2.1 JR-031における細胞遊走関連因子の発現 ........................................... 21

2.6.2.2.2.2 JR-031の細胞遊走能 ............................................................................ 28

2.6.2.2.3 JR-031における免疫原性に関わる因子...................................................... 32

2.6.2.2.3.1 JR-031におけるMHC及び共刺激分子の解析 ..................................... 32

2.6.2.3 副次的薬理試験 ................................................................................................... 38

2.6.2.4 安全性薬理試験 ................................................................................................... 38

2.6.2.4.1 ラットにおける同種異系MSCの中枢神経系に及ぼす影響 ....................... 38

2.6.2.4.2 ラットにおける同種異系MSCの呼吸系に及ぼす影響 ............................... 38

2.6.2.5 薬力学的相互作用試験 ........................................................................................ 39

2.6.2.6 考察及び結論 ....................................................................................................... 39

2.6.2.6.1 JR-031の薬理作用 ...................................................................................... 39

2.6.2.6.1.1 JR-031の免疫調節作用について .......................................................... 39

2.6.2.6.1.2 JR-031の炎症部位への遊走能について ............................................... 41

2.6.2.6.1.3 JR-031の免疫原性について ................................................................. 42

2.6.2.6.1.4 JR-031の GVHD治療効果における作用機序について........................ 43

2.6.2.6.1.5 ラットにおける同種異系 MSC の中枢神経系及び呼吸系に

対する影響について .............................................................................. 43

2.6.2.6.2 結論 .............................................................................................................. 43

2.6.2.7 図表 ..................................................................................................................... 44

2.6.2.8 参考文献 .............................................................................................................. 44


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用語の定義


BrdU ブロモデオキシウリジン (bromodeoxyuridine)

COX-2 シクロオキシゲナーゼ 2 (cyclooxygenase 2)

DCB ドナーセルバンク (donor cell bank)

JR-031 の製造工程における重要中間体

ELISA 酵素結合免疫吸着測定法 (enzyme-linked immunosorbent assay)

FBS ウシ胎児血清 (fetal bovine serum)

FITC フルオレセインイソチオシアネート (fluorescein isothiocyanate)

FoxP3 制御性 T細胞で特異的に発現する転写因子 (forkhead box P3)

GAPDH グリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼ (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)

GVHD 移植片対宿主病 (graft-versus-host disease)


IAR 投与関連反応 (infusion associated reaction)


IFN-γ インターフェロン γ (interferon γ)


IL-1β インターロイキン 1β (interleukin 1β)

IL-6 インターロイキン 6 (interleukin 6)


JCR JCR ファーマ株式会社。hMSC 製剤（JR-031）の製造販売承認申請者又は製造業者。2014

年 1月 1日に日本ケミカルリサーチ株式会社より社名変更した。

JR-031 JCR の hMSC製剤（JCRの hMSCの開発コードとして用いる場合もある）又はその本質

LPS リポ多糖 (lipopolysaccharide)



MSC/hMSC 間葉系幹細胞 (mesenchymal stem cell/human mesenchymal stem cell)

1-MT 1-メチルトリプトファン (1-methyltryptophan)


PE フィコエリスリン (phycoerythrin)


poly (i;c) ポリイノシン-ポリシチジン酸 (polyinosinic-polycytidylic acid)

TLR3 アゴニスト。ウイルス RNA を模倣した合成二本鎖 RNA アナログ

PPP ピクロファーマコライト (picropharmacolite)

rMSC ACI ラット間葉系幹細胞

RT-PCR 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (reverse transcription polymerase chain reaction)

SDF-1 間質細胞由来因子 1 (stromal cell-derived factor 1)

TIMP 内因性 MMP 阻害因子 (tissue inhibitor of metalloproteinase)

TLR Toll 様受容体 (toll-like receptor)

TNF-α 腫瘍壊死因子 α (tumor necrosis factor α)

VCAM-1 血管細胞接着分子 1（vascular cell adhesion molecule-1）


- 6 -


2.6.2.1 まとめ

効力を裏付ける試験では、JR-031の GVHD治療効果における主要な薬理作用である免疫調節

作用について、hPBMCとの共培養系を用い検討した。また、JR-031の免疫調節作用、細胞遊走

及び免疫原性に関わる因子の遺伝子発現を、リアルタイム RT-PCR 又はフローサイトメトリー

にて検討した。さらに、in vitro細胞遊走アッセイを用い JR-031の遊走能を検討した。これらの

試験結果から本薬の GVHD 治療効果における作用機序について考察した。

安全性薬理試験では、本薬の急性的な輸注毒性を詳細に検討する目的で、Irwinの多次元観察

に準じてラットの一般症状及び行動に及ぼす同種異系 MSC投与の影響を検討した。また、静脈

内投与された JR-031が最初に通過する微小循環系は肺であることから、ラットを用い同種異系

MSCの呼吸系に及ぼす影響を検討した。

2.6.2.1.1 効力を裏付ける試験

JR-031の免疫調節作用 2.6.2.1.1.1

2.6.2.1.1.1.1 JR-031の T細胞増殖抑制作用

JR-031 は、hPBMC との共培養により、抗 CD3/CD28 抗体刺激によって誘発される T 細胞増

殖を抑制した。本結果より、JR-031は抗原刺激による T 細胞増殖を抑制することにより、免疫

反応を制御する作用を有することが示された。

2.6.2.1.1.1.2 JR-031の T細胞増殖抑制作用における PGE2の関与

JR-031 の T 細胞増殖抑制作用は、PGE2合成阻害剤の添加により減弱した。本結果より、JR-031

の T細胞増殖抑制作用には、JR-031が分泌する PGE2が関与することが示された。

2.6.2.1.1.1.3 JR-031の T細胞増殖抑制作用における IDO阻害剤の影響

JR-031 の T 細胞増殖抑制作用は、IDO阻害剤の添加により減弱した。本結果より、JR-031の

T 細胞増殖抑制作用には、活性化 T 細胞との相互作用によって産生誘導される IDO が関与する

ことが示された。

2.6.2.1.1.1.4 JR-031の制御性 T細胞誘導能

CD4 陽性細胞（以下、CD4+細胞）を JR-031 と共培養することにより、CD4 陽性かつ CD25

陽性細胞（以下、CD4+CD25

+細胞）の比率は増加し、FoxP3 遺伝子発現の増加が認められた。

本結果より、JR-031は CD4+細胞から制御性 T細胞への分化を誘導することが示された。

2.6.2.1.1.1.5 JR-031における TLRファミリーの発現

JR-031 において、TLR1、TLR3、TLR4 及び TLR6 遺伝子の発現が転写レベルで確認された。

さらに、TLR3 又は TLR4 アゴニストによる刺激により、IL-6 及び IL-8 遺伝子発現の増加が認

められたことから、TLR3及び TLR4 が機能的に発現していることが確認された。

2.6.2.1.1.1.6 JR-031における抗炎症因子遺伝子の発現誘導

JR-031 において、IFN-γ 受容体 α鎖の発現が確認された。JR-031 では、無刺激条件において

は IDO1 遺伝子の発現はほとんど観察されなかったが、IFN-γ、TLR3 アゴニスト又は TLR4 ア


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ゴニストによる刺激により、顕著な IDO1遺伝子の発現誘導が観察された。

JR-031の細胞遊走能 2.6.2.1.1.2

2.6.2.1.1.2.1 JR-031における細胞遊走関連因子の発現

JR-031において、細胞接着分子インテグリンα4、インテグリンβ1、ケモカインCXCL12 (SDF-1)

受容体の CXCR4及び MMP関連の遺伝子群 (MMP2、MMP14、TIMP1、TIMP2) が発現してい

ることが確認された。

2.6.2.1.1.2.2 JR-031の細胞遊走能

in vitro細胞遊走アッセイにおいて、FBS を細胞誘引物質として用いることにより、JR-031の

細胞遊走が観察された。PDGF阻害剤 AG1296、IGF-1阻害剤 PPP 又はMMP阻害剤 GM6001を

添加することにより JR-031 遊走の阻害が認められたことから、JR-031 の細胞遊走には PDGF、

IGF-1及びMMP が関与することが示された。

JR-031における免疫原性に関わる因子 2.6.2.1.1.3

2.6.2.1.1.3.1 JR-031におけるMHC及び共刺激分子の解析

JR-031 において、MHCクラス I分子は無刺激条件でも発現が認められたが、その発現レベル

は低かった。またMHCクラス I分子は IFN-γ刺激により発現が増加した。MHCクラス II分子

は無刺激条件では発現していないが、IFN-γ刺激により発現が誘導された。しかし、その発現レ

ベルは低かった。共刺激分子 CD40、CD80 及び CD86 は、いずれも IFN-γ刺激の有無に関係な

く発現は認められなかった。

2.6.2.1.2 安全性薬理試験

ラットにおける同種異系MSCの中枢神経系に及ぼす影響 2.6.2.1.2.1

ラットに rMSC（生存率 40.3%）を総細胞数として 5, 15 又は 45×106個/kg の用量で単回静脈

内投与し rMSCの中枢神経系（Irwinの多次元観察法）に及ぼす影響を検討した。rMSC は、45×106

個/kgまでの投与により、ラットの中枢神経系に影響を及ぼさなかった。

ラットにおける同種異系MSCの呼吸系に及ぼす影響 2.6.2.1.2.2

ラットに rMSC（生存率 40.3%）を総細胞数として 5, 15 又は 45×106個/kg の用量で単回静脈

内投与した。rMSC 45×106個/kg の投与により呼吸数の増加と 1 回換気量の減少がみられたが、

分時換気量に影響はみられなかった。また、15×106個/kgまでの投与では、ラットの呼吸系に影

響を及ぼさなかった。

2.6.2.2 効力を裏付ける試験

2.6.2.2.1 JR-031の免疫調節作用

JR-031の T細胞増殖抑制作用 2.6.2.2.1.1

添付資料 4.2.1.1.1

1) 試験材料及び試験方法

3 人の異なるドナーから採取した hPBMC を、抗 CD3/CD28 抗体添加及び非添加の条件で、

単独又は JR-031 と共に 3 日間培養した。BrdU を添加し引続き 4 時間培養後、細胞増殖の指


- 8 -

標として BrdU の細胞内取込みを吸光測定し (OD450-OD690)、抗 CD3/CD28 抗体刺激による T

細胞増殖に対する JR-031 共培養の影響を試験した。試験には、ドナーの異なる 3 ロットの

JR-031 製剤（ロット番号 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA）を前培養して用いた。

2) 試験成績

JR-031 は、hPBMC との共培養により、いずれのロットも抗 CD3/CD28 抗体刺激によって

誘発される T細胞増殖を有意に抑制した（図 2.6.2-1及び表 2.6.2-1参照）。hPBMC 単独培養

時の T 細胞増殖を 100%とした時の JR-031 共培養による T 細胞増殖抑制率は、ロット番号

AAAAaあああああああああああで、それぞれ 66, 74及び 80%であり、ロット間で有意な差は

認められなかった（表 2.6.2-1参照）。

3) 結論

JR-031 は、hPBMC との共培養により、抗 CD3/CD28 抗体刺激によって誘発される T 細胞

増殖を抑制した。抗 CD3/CD28 抗体は、抗原提示細胞による T 細胞刺激と類似する様式で T

細胞増殖を刺激することが知られている 1)。

以上の結果より、JR-031は抗原刺激による T 細胞増殖を抑制することにより、免疫反応を

制御する作用を有することが示唆された。


- 9 -

図 2.6.2-1 JR-031の共培養による T細胞増殖抑制作用

T 細胞増殖：抗 CD3/CD28 抗体刺激群の吸光度から無刺激群の吸光度を差

し引いた値

グラフは hPBMC 3 ロットの平均値±標準偏差

**p<0.01 hPBMC単独培養との比較（Tukey-Kramer 検定）

表 2.6.2-1 JR-031の共培養による T細胞増殖抑制作用

- hPBMC単独培養 hPBMC/JR-031共培養

AAAAA AAAAA AAAAA

T細胞増殖 a)

（吸光度） 2.395±0.355 0.826±0.209** 0.629±0.123** 0.480±0.114**

抑制率 b) - 66% 74% 80%

a) T細胞増殖：抗 CD3/CD28 抗体刺激群の吸光度から無刺激群の吸光度を差し引いた値

hPBMC 3ロットの平均値±標準偏差、**p<0.01 hPBMC単独培養との比較（Tukey-Kramer 検定）

b) 抑制率：hPBMC単独培養の T細胞増殖を 100%とした時の hPBMC/JR-031共培養による T細胞増殖抑制率

JR-031の T細胞増殖抑制作用における PGE2の関与 2.6.2.2.1.2

添付資料 4.2.1.1.2


• JR-031 による PGE2分泌

JR-031をTNF-αの添加及び非添加の条件で24時間培養後、培養上清中のPGE2濃度をELISA

法にて測定し、JR-031 による PGE2分泌に対する TNF-α添加の影響を試験した。また、JR-031

の PGE2分泌に対する PGE2合成阻害剤（NS398又はインドメタシン）添加の影響を試験した。

• JR-031 の T 細胞増殖抑制作用に対する PGE2合成阻害剤の影響

hPBMC を抗 CD3/CD28 抗体添加及び非添加の条件で、単独培養又は JR-031 と共培養する

ことにより、JR-031 共培養による T 細胞増殖抑制作用を試験した。次に、NS398又はインド


- 10 -

メタシンを hPBMC/JR-031共培養時に添加することにより、JR-031の T 細胞増殖抑制作用に

及ぼす PGE2合成阻害の影響を確認した。いずれのケースにおいても、3 日間培養した後、BrdU

を添加し引続き 4 時間培養後、細胞増殖の指標として BrdU の細胞内取込みを吸光測定した

(OD450-OD690) 。試験には、1ロットの JR-031 製剤（ロット番号 AAAAA）を前培養して用い

た。

2) 試験成績

• JR-031 による PGE2分泌

JR-031 は TNF-α刺激の有無に関わらず培養上清中に PGE2を分泌しており、TNF-α刺激に

より PGE2分泌量は約 1.4 倍増加した（図 2.6.2-2 及び表 2.6.2-2 参照）。NS398 又はインドメ

タシンの添加により、JR-031 の PGE2分泌は、TNF-α 刺激の有無に関係なくほぼ完全に抑制

された（図 2.6.2-2 及び表 2.6.2-2参照）。

• JR-031 の T 細胞増殖抑制作用に対する PGE2合成阻害剤の影響


増殖を顕著に抑制し、hPBMC 単独培養時の T 細胞増殖を 100%とした時の JR-031共培養によ

る T 細胞増殖抑制率は 79%であった（図 2.6.2-3 及び表 2.6.2-3 参照）。一方、NS398 及びイ

ンドメタシン添加群における T 細胞増殖抑制率は、それぞれ 57%及び 58%であり、PGE2合成

阻害剤の添加により JR-031共培養によるT細胞増殖抑制は減弱した（表 2.6.2-3参照）。なお、

JR-031 又は hPBMC 単独培養時の BrdU 取込みに対し NS398 又はインドメタシン添加の影響

は認められなかった。

3) 結論

JR-031による PGE2分泌は、TNF-α刺激の有無に関わらず PGE2合成阻害剤の添加によりほ

ぼ完全に抑制された。また、JR-031 は hPBMC との共培養により、抗 CD3/CD28 抗体刺激に

よって誘発される T 細胞増殖を顕著に抑制したが、PGE2合成阻害剤の添加により JR-031 共

培養による T細胞増殖抑制は減弱した。

以上の結果から、JR-031 の T 細胞増殖抑制作用には、JR-031 が分泌する PGE2が、少なく

ともその一部において関与すると考えられる。


- 11 -

図 2.6.2-2 JR-031による PGE2分泌に対する PGE2合成阻害剤の影響

二重測定の平均値

Indo：インドメタシン

表 2.6.2-2 JR-031による PGE2分泌に対する PGE2合成阻害剤の影響

- TNF-α 定量結果 a)

(pg/mL) 相対値 b)

JR-031 非添加 2245 1

添加 3197 1.4

JR-031

(NS398)

非添加 -4 -

添加 14 -

JR-031

(Indoc) )

非添加 25 -

添加 3 -

数値は二重測定の平均値

a) 培地のみの定量値を差引いた値

b) TNF-α非添加の PGE2濃度を 1とした相対値

c) Indo：インドメタシン

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

JR-031 JR-031(NS398) JR-031(Indo)

PG

E2

(pg

/mL

)

TNF-α 非添加

TNF-α 添加


- 12 -

図 2.6.2-3 JR-031の T細胞増殖抑制作用に対する PGE2合成阻害剤の影響

T細胞増殖：抗 CD3/CD28抗体刺激群の吸光度から無刺激群の吸光度を差し引いた値

グラフは平均値±標準偏差 (n=3)

Indo：インドメタシン

表 2.6.2-3 JR-031の T細胞増殖抑制作用に対する PGE2合成阻害剤の影響

- hPBMC

単独培養 hPBMC/JR-031共培養

PGE2合成阻害剤 - - NS398 Indoc)

T細胞増殖 a)

（吸光度） 1.549±0.147 0.326±0.058 0.673±0.037 0.645±0.139

抑制率 b) - 79% 57% 58%

a) T細胞増殖：抗 CD3/CD28 抗体刺激群の吸光度から無刺激群の吸光度を差し引いた値、平均値±標準偏差 (n=3)


c) Indo：インドメタシン

JR-031の T細胞増殖抑制作用における IDO阻害剤の影響 2.6.2.2.1.3

添付資料 4.2.1.1.3


hPBMC を抗 CD3/CD28 抗体添加及び非添加の条件で、単独培養又は JR-031 と共培養する

ことにより、JR-031 共培養による T 細胞増殖抑制作用を試験した。次に、IDO 阻害剤の 1-MT

を hPBMC/JR-031共培養時に添加することにより、JR-031のT細胞増殖抑制作用に及ぼす IDO

阻害の影響を試験した。いずれのケースにおいても、3日間培養した後、BrdUを添加し引続

き4時間培養後、細胞増殖の指標としてBrdUの細胞内取込みを吸光測定した (OD450-OD690) 。

試験には、1ロットの JR-031製剤（ロット番号 AAAAA）を前培養して用いた。

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

T細胞増殖（吸光度）


- 13 -

2) 試験成績


増殖を顕著に抑制し、hPBMC 単独培養時の T 細胞増殖を 100%とした時の JR-031共培養によ

る T細胞増殖抑制率は 82%であった（図 2.6.2-4及び表 2.6.2-4参照）。一方、1-MT 添加群に

おける T 細胞増殖抑制率は 64%であり、IDO 阻害剤の添加により JR-031 共培養による T 細

胞増殖抑制は減弱した（表 2.6.2-4 参照）。なお、JR-031 又は hPBMC 単独培養時の BrdU 取

込みに対し 1-MT 添加の影響は認められなかった。

3) 結論

活性化 T 細胞との共培養によって MSC における IDO 産生が誘導されることが知られてお

り、さらに、MSC による T 細胞増殖抑制には、トリプトファンの IDO 代謝物であるキヌレ

ニンが関与することが報告されている 2)。

本試験において、JR-031 は、hPBMC との共培養により、抗 CD3/CD28 抗体刺激によって

誘発される T細胞増殖を顕著に抑制したが、IDO阻害剤の添加により JR-031共培養による T

細胞増殖抑制は減弱した。

以上の結果から、JR-031の T細胞増殖抑制作用には、活性化 T 細胞との共培養によって産

生誘導される IDO が、少なくともその一部において関与すると考えられる。

図 2.6.2-4 JR-031の T細胞増殖抑制作用に対する IDO阻害剤の影響

T 細胞増殖：抗 CD3/CD28 抗体刺激群の吸光度から無刺激群の吸光度を差し引いた

値

グラフは平均値±標準偏差 (n=3)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

T細胞増殖（吸光度）


- 14 -

表 2.6.2-4 JR-031の T細胞増殖抑制作用に対する IDO阻害剤の影響

- hPBMC単独培養 hPBMC/JR-031共培養

IDO阻害剤 - - 1-MT

T細胞増殖 a)

（吸光度） 1.833±0.159 0.336±0.041 0.653±0.066

抑制率 b) - 82% 64%

a) T細胞増殖：抗 CD3/CD28 抗体刺激群の吸光度から無刺激群の吸光度を差し引いた値、平均値±標準偏差 (n=3)


JR-031の制御性 T細胞誘導能 2.6.2.2.1.4

添付資料 4.2.1.1.4及び 4.2.1.1.5


CD4+細胞を単独培養又は JR-031 と共培養した。3 日間培養後、浮遊している CD4

+細胞を

回収し、フローサイトメーターにて総細胞中の CD4+CD25

+細胞比率を解析した。また、回収

したCD4+細胞から total RNAを抽出後、cDNAを合成し、リアルタイムRT-PCR法により FoxP3

遺伝子の発現を定量的に解析した。フローサイトメーターを用いた解析には 1 ロットの

JR-031 DCB（ロット番号 AAAAAA、2回測定）、リアルタイム RT-PCR 法による解析には、2

ロットの JR-031 DCB（ロット番号 AAAAAAAAAAAAAA）を前培養して用いた。

2) 試験成績

• フローサイトメーターによる CD4+CD25

+細胞の解析

CD4+細胞を JR-031 と共培養することにより、CD4

+細胞単独培養と比べ CD4+CD25

+細胞の

比率の増加が認められた（図 2.6.2-5参照）。

• リアルタイム RT-PCR法による FoxP3遺伝子発現の定量的解析

RT-PCR反応物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、FoxP3 及び ATP5F1 遺伝子の特

異的な増幅が確認された（図 2.6.2-6参照）。

リアルタイム RT-PCR 法による FoxP3 遺伝子発現の定量的解析において、CD4+細胞を

JR-031 と共培養することにより、FoxP3遺伝子発現は、CD4+細胞単独培養と比べ、AAAAAA

では 3.0倍、AAAAAAaでは 2.2倍増加した（表 2.6.2-5参照）。

3) 結論

制御性 T細胞は CD4 及び CD25 を共発現し、また制御性 T細胞の発生及び機能におけるマ

スター遺伝子である FoxP3 遺伝子を特異的に発現していることが知られている 3), 4)。本試験

結果から、JR-031との共培養により、CD4+細胞から制御性 T 細胞への分化が誘導されること

が示唆された。


- 15 -

図 2.6.2-5 JR-031共培養による総細胞中の CD4+CD25

+細胞比率の増加

Q1：CD4+CD25-細胞

Q2：CD4+CD25+細胞、数値は総細胞中の CD4+CD25+細胞比率 (%)

左列：検体 1の測定結果、右列：検体 2の測定結果

CD4+細胞単独培養

CD4+細胞/JR-031共培養


- 16 -

図 2.6.2-6 アガロースゲル電気泳動による FoxP3及び ATP5F1 cDNAの特異的増幅の確認

A：CD4+細胞単独培養、B：CD4+細胞/JR-031共培養

左：AAAAAA、右：AAAAAA

MW：分子量マーカー（100 bpラダー）

矢印は特異的に増幅された FoxP3及び ATP5F1 cDNA断片

表 2.6.2-5 CD4+細胞における JR-031共培養による FoxP3遺伝子発現量の増加

ロット番号培養条件 FoxP3 遺伝子発現量 a) 相対値 b)

AAAAAA CD4+細胞単独培養 0.3988±0.0334 1

CD4+細胞/JR-031共培養 1.2133±0.1172 3.0

AAAAAA CD4+細胞単独培養 0.5642±0.0610 1

CD4+細胞/JR-031共培養 1.2289±0.1608 2.2

a) ATP5F1遺伝子発現量を 1とした補正値（n=3、平均値±標準偏差）

b) CD4+細胞単独培養を 1とした相対値

JR-031における TLRファミリーの発現 2.6.2.2.1.5

添付資料 4.2.1.1.6


• JR-031 における TLR ファミリー遺伝子の発現

2 ロットの JR-031 DCB（ロット番号 AAAAAAAAAAAAA）を拡大培養後凍結保存した細

胞を培養し、回収した細胞から total RNAを抽出後、cDNA を合成し、PCR 法により TLR フ

ァミリー遺伝子 (TLR1～TLR10) の発現を解析した。ハウスキーピング遺伝子 GAPDH の発

現を同様に解析し内部標準として用いた。また、PBMC から total RNA を抽出後、cDNAを合

成し、TLR ファミリー遺伝子の発現を確認するための鋳型として用いた。

• JR-031 における TLR アゴニスト刺激による IL-6及び IL-8遺伝子の発現

JR-031を TLR3アゴニスト poly (i:c) 又は TLR4アゴニスト LPSの添加及び非添加の条件で

15時間培養し、回収した細胞から total RNAを抽出後、cDNAを合成し、リアルタイム RT-PCR

法により IL-6 及び IL-8 遺伝子の発現を定量的に解析した。ハウスキーピング遺伝子 B2Mの

発現レベルを同様に解析し内部標準として用いた。また、TLR アゴニスト刺激による培養上


- 17 -

清中への IL-6 及び IL-8 分泌量の変化を、サイトカインアレイを用いて検討した。試験には、

1 ロットの JR-031 DCB（ロット番号 AAAAAA）を拡大培養後凍結保存された細胞を前培養

して用いた。

2) 試験成績

• JR-031 における TLR ファミリー遺伝子の発現

TLR ファミリー遺伝子の発現を確認するために PBMC から抽出、合成した cDNA を鋳型と

し PCR法により確認した結果、TLR1～TLR10 遺伝子すべての発現が認められた（図 2.6.2-7

参照）。JR-031 では、試験した DCB 2 ロットのいずれにおいても TLR1、3、4 及び 6 遺伝子

の発現が認められた。一方、TLR2、5、7～TLR10 遺伝子の発現は認められなかった（図 2.6.2-7

参照）。

• JR-031における TLR アゴニスト刺激による IL-6及び IL-8遺伝子の発現

発現が認められた TLR の機能性を評価する目的で、TLR3 及び TLR4 アゴニスト刺激によ

る IL-6及び IL-8遺伝子の発現誘導を検討した。

TLR3 アゴニスト poly (i:c) を 10, 50及び 100 μg/mL濃度で添加することにより、IL-6遺伝

子の発現レベルは、非添加対照と比べ、それぞれ 2.9, 5.5及び 8.5倍増加し（表 2.6.2-6参照）、

IL-8 遺伝子の発現レベルは、非添加対照と比べ、それぞれ 93.0, 195.0 及び 360.6 倍増加した

（表 2.6.2-7参照）。また、TLR4 アゴニスト LPSを 5, 10及び 50 ng/mL濃度で添加することに

より、IL-6遺伝子の発現レベルは、非添加対照と比べ、それぞれ 2.0, 2.3 及び 3.4倍増加し（表

2.6.2-6参照）、IL-8 遺伝子の発現レベルは、非添加対照と比べ、それぞれ 78.4, 86.0及び 136.2

倍増加した（表 2.6.2-7参照）。

サイトカインアレイを用いた解析において、TLR3アゴニスト poly (i:c) を 50 μg/mL濃度で

添加することにより、培養上清中の IL-6 及び IL-8 濃度は、非添加対照と比べ、それぞれ 1.3

倍及び 12.4倍増加した（表 2.6.2-8参照）。また、TLR4 アゴニスト LPSを 50 ng/mL濃度で添

加することにより、培養上清中の IL-6及び IL-8濃度は、非添加対照と比べ、それぞれ 1.1倍

及び 10.8倍増加した（表 2.6.2-8参照）。

3) 結論

JR-031 において、TLR1、3、4 及び 6 遺伝子の発現が転写レベルで確認された。さらに、

TLR3 及び TLR4 アゴニスト刺激により、IL-6 及び IL-8 遺伝子発現の増加が、アゴニスト添

加濃度依存的に認められたことから、JR-031において、TLR3 及び TLR4 が機能的に発現して

いることが確認された。


- 18 -

図 2.6.2-7 JR-031における TLR ファミリー遺伝子の発現

上：PBMC、中：JR-031（ロット番号 AAAAAA）、

下：JR-031（ロット番号 AAAAAA）

MW：分子量マーカー、A：GAPDH、B：TLR1、C：TLR2、D：TLR3、

E：TLR4、F：TLR5、G：TLR6、H：TLR7、I：TLR8、J：TLR9、K：TLR10

表 2.6.2-6 JR-031における TLRアゴニスト刺激による IL-6遺伝子の発現

JR-031ロット番号 TLR アゴニスト IL-6 遺伝子発現 a) 相対値 b)

AAAAAA

- 0.9707±0.0338 1

poly (i:c) 10 μg/mL 2.8212±0.1822 2.9

poly (i:c) 50 μg/mL 5.3686±0.1864 5.5

poly (i:c) 100 μg/mL 8.2348±0.0654 8.5

LPS 5 ng/mL 1.9042±0.0517 2.0

LPS 10 ng/mL 2.2558±0.0493 2.3

LPS 50 ng/mL 3.3280±0.1451 3.4

a) B2M遺伝子発現量を 1とした補正値（n=3、平均値±標準偏差）

b) TLR アゴニスト非添加の発現量を 1とした相対値

表 2.6.2-7 JR-031における TLRアゴニスト刺激による IL-8遺伝子の発現

JR-031ロット番号 TLR アゴニスト IL-8 遺伝子発現 a) 相対値 b)

AAAAAA

- 0.0297±0.0061 1

poly (i:c) 10 μg/mL 2.7579±0.0936 93.0

poly (i:c) 50 μg/mL 5.7831±0.1435 195.0

poly (i:c) 100 μg/mL 10.6949±0.3824 360.6

LPS 5 ng/mL 2.3252±0.0543 78.4

LPS 10 ng/mL 2.5506±0.0634 86.0

LPS 50 ng/mL 4.0383±0.0968 136.2


b) TLR アゴニスト非添加の発現量を 1とした相対値

表 2.6.2-8 JR-031における TLRアゴニスト刺激による IL-6及び IL-8分泌量の増加

IL-6 分泌量 a) IL-8 分泌量 a)

TLR アゴニスト非添加 1 1

poly (i:c) 50 μg/mL 1.3 12.4

LPS 50 ng/mL 1.1 10.8

a) TLR アゴニスト非添加の分泌量を 1とした相対値


- 19 -

JR-031における抗炎症因子遺伝子の発現誘導 2.6.2.2.1.6

添付資料 4.2.1.1.7


• JR-031 における IFN-γ受容体の発現確認

JR-031 における IFN-γ 受容体の発現を、マウス抗 CD119（IFN-γ 受容体 α 鎖）抗体を用い

フローサイトメーターで確認した。試験には、3ロットの JR-031 DCB（ロット番号AAAAAA、

AAAAAAAAAAAAAAAAa）を拡大培養後凍結保存された細胞を前培養して用いた。

• JR-031 における IFN-γ刺激による IDO1 遺伝子発現誘導

JR-031を IFN-γ添加及び非添加の条件で 15時間培養後、回収した細胞から total RNA を抽

出後、cDNAを合成し、リアルタイム RT-PCR 法により IDO1 遺伝子の発現を定量的に解析し

た。18S rRNA 遺伝子発現レベルを同様に解析し内部標準として用いた。試験には、1ロット

の JR-031 DCB（ロット番号 AAAAAA）を拡大培養後凍結保存された細胞を前培養して用い

た。

• JR-031 における TLR アゴニスト刺激による IDO1遺伝子発現誘導

JR-031を TLR3アゴニスト poly (i:c) 又は TLR4アゴニスト LPSの添加及び非添加の条件で

15時間培養し、細胞を回収して total RNA を抽出後、cDNA を合成し、リアルタイム RT-PCR

法により IDO1 遺伝子の発現を定量的に解析した。18S rRNA遺伝子の発現レベルを同様に解

析し内部標準として用いた。試験には、1ロットの JR-031 DCB（ロット番号 AAAAAAA）を

拡大培養後凍結保存された細胞を前培養して用いた。

2) 試験成績

• JR-031 における IFN-γ受容体の発現確認

試験した 3ロットの JR-031 DCBのいずれにおいても IFN-γ受容体 α鎖の発現が確認された

（図 2.6.2-8参照）。

• JR-031 における IFN-γ刺激による IDO1 遺伝子発現誘導

IFN-γ非添加では、IDO1遺伝子の発現はほとんど観察されなかったが、IFN-γにより IDO1

遺伝子の発現レベルは非添加対照と比べ 3644 倍増加した（表 2.6.2-9参照）。

• JR-031 における TLR アゴニスト刺激による IDO1遺伝子発現誘導

TLR アゴニスト非添加では、IDO1 遺伝子の発現はほとんど観察されなかった。TLR3 アゴ

ニスト poly (i:c) を 10, 50及び 100 μg/mL濃度で添加することにより、IDO1遺伝子の発現レ

ベルは、非添加対照と比べ、それぞれ 60, 403及び 1510倍増加した（表 2.6.2-10参照）。また、

TLR4 アゴニスト LPSを 5, 10及び 50 ng/mL濃度で添加することにより、IDO1 遺伝子の発現

レベルは、非添加対照と比べ、それぞれ 41, 124及び 527倍増加した（表 2.6.2-11参照）。

3) 結論

試験した JR-031 DCB 3 ロットすべてにおいて、IFN-γ受容体 α鎖の発現が確認された。ま

た JR-031では、無刺激条件においては IDO1 遺伝子の発現はほとんど観察されなかったが、

IFN-γ、TLR3 アゴニスト又は TLR4 アゴニストによる刺激により、顕著な IDO1 遺伝子の発

現誘導が観察された。


- 20 -

図 2.6.2-8 JR-031における IFN-γ受容体の発現

左：陰性コントロール、右：抗 CD119（IFN-γ受容体 α鎖）抗体

上：ロット番号 AAAAAA、中：ロット番号 AAAAAA、

下：ロット番号 AAAAAA


- 21 -

表 2.6.2-9 JR-031における IFN-γ刺激による IDO1遺伝子の発現誘導

JR-031ロット番号 IFN-γ (U/mL) IDO1 遺伝子発現 a) 相対値 b)

AAAAAA 0 0.0003±0.0000 1

100 1.0911±0.0988 3644

a) 18S rRNA遺伝子発現量を 1とした補正値（n=3、平均値±標準偏差）

b) IFN-γ非添加の発現量を 1とした相対値

表 2.6.2-10 JR-031における poly (i:c) 刺激による IDO1遺伝子の発現誘導

JR-031ロット番号 poly (i:c) (μg/mL) IDO1 遺伝子発現 a) 相対値 b)

AAAAAA

0 0.0001±0.0000 1

10 0.0044±0.0003 60

50 0.0299±0.0035 403

100 0.1121±0.0040 1510


b) poly (i:c) 非添加の発現量を 1とした相対値

表 2.6.2-11 JR-031における LPS刺激による IDO1遺伝子の発現誘導

JR-031ロット番号 LPS (ng/mL) IDO1 遺伝子発現 a) 相対値 b)

AAAAAA

0 0.0003±0.0000 1

5 0.0121±0.0013 41

10 0.0367±0.0026 124

50 0.1564±0.0193 527


b) LPS非添加の発現量を 1とした相対値

2.6.2.2.2 JR-031の細胞遊走能

JR-031における細胞遊走関連因子の発現 2.6.2.2.2.1

添付資料 4.2.1.1.8及び 4.2.1.1.9


• リアルタイム RT-PCR法による解析

培養した JR-031 を回収して total RNA を抽出後、cDNA を合成し、リアルタイム RT-PCR

法により、細胞接着分子インテグリン α4/β1 (VLA-4) の構成サブユニットであるインテグリ

ン α4 及び β1 遺伝子、ケモカイン CXCL12 (SDF-1) 受容体の CXCR4 遺伝子の発現を定量的

に解析した。MMP 及び TIMP においては、MMP2、MMP9、MMP14、TIMP1 及び TIMP2 遺

伝子の発現を定量的に解析した。ハウスキーピング遺伝子 B2Mの発現を同様に解析し内部標

準として用いた。また、リアルタイム RT-PCR 反応物をアガロースゲル電気泳動で解析し、

各遺伝子の特異的な増幅を確認した。試験には、JR-031 DCB（ロット番号 AAAAAA）を拡

大培養後凍結保存された細胞を前培養して用いた。

• フローサイトメトリーによる解析

JR-031におけるインテグリン α4及び β1、並びに CXCR4の発現をフローサイトメーターで

解析した。インテグリン β1については、細胞を抗 CD29抗体と反応させた後、Alexa Flour 488

で標識した 2次抗体を用い検出した。インテグリン α4及び CXCR4の検出には、FITC 標識し

た抗 CD49d抗体及び PE標識した抗 CD184 抗体をそれぞれ用いた。

インテグリン β1 については、IFN-γ非添加条件で培養後、細胞を剥離回収しフローサイト

メーターにて解析した。インテグリン α4 及び CXCR4 については、発現に対する IFN-γ刺激

の影響を評価するために、JR-031 を IFN-γ 添加及び非添加の条件で培養後、細胞を剥離回収


- 22 -

しフローサイトメーターにて解析した。また細胞内のタンパク質を検出するために、IFN-γ

非添加の条件で培養後、剥離回収した細胞を膜透過処理し、インテグリン α4及び CXCR4 の

発現をフローサイトメーターにて解析した。試験には、JR-031 DCB（ロット番号 AAAAAA、

AAAAAAAAAAAAAAAAa）を拡大培養後凍結保存された細胞を前培養して用いた。

2) 試験成績

• リアルタイム RT-PCR法による解析

リアルタイム RT-PCR法による遺伝子発現解析において、インテグリンでは β1の遺伝子発

現レベルが高く、α4の発現も認められたが β1と比べかなり低かった（表 2.6.2-12参照）。一

方、CXCR4 遺伝子の発現は認められなかった（表 2.6.2-12参照）。MMP 及び TIMP において

は、MMP2、TIMP1 及び TIMP2 遺伝子の高い発現が認められたが、MMP14 は発現が低く、

MMP9の発現は認められなかった（表 2.6.2-13 参照）。

それぞれの RT-PCR 反応物をアガロースゲル電気泳動で解析した結果、インテグリン α4、

インテグリン β1、MMP2、MMP14、TIMP1、TIMP2 遺伝子の特異的な増幅が確認された（図

2.6.2-9及び図 2.6.2-10参照）。

• フローサイトメトリーによる解析

遺伝子発現レベルと細胞表面あるいは細胞内におけるタンパク質発現を確認するためにフ

ローサイトメトリーを用いて解析を行った。その結果、IFN-γ 非添加条件でインテグリン β1

は陰性コントロールに対して右側（強蛍光側）へのシフトが認められたことから、細胞表面

に非常に強く発現していることが確認された（図 2.6.2-11 参照）。一方、インテグリン α4 及

び CXCR4 は、IFN-γ 刺激の有無に関係なく発現が認められなかった（図 2.6.2-12 及び図

2.6.2-13参照）。また細胞内でのインテグリン α4及び CXCR4 の存在を確認した結果、CXCR4

は試験した DCB 3ロット全てにおいて、陰性コントロールに対して右側（強蛍光側）へのシ

フトが認められたことから、細胞内に貯留し存在していることが確認された（図 2.6.2-14 参

照）。一方、インテグリン α4は細胞内においても発現は確認できなかった（図 2.6.2-15参照）。

インテグリン α4 は、遺伝子転写レベルで確認されたがフローサイトメトリーでは細胞表面

及び細胞内いずれにおいても検出できなかった。これについては、細胞剥離の際のトリプシ

ン消化の影響が考えられた 5)。また、CXCR4遺伝子の発現は、転写レベルでは検出されなか

ったが、細胞膜透過処理することで細胞内において検出された。CXCR4 の mRNA レベルは

通常非常に低く、RT-PCR法でもしばしば検出されないことが報告されている 6)。また、少量

の CXCR4 タンパク質は細胞表面に存在するが、大部分は細胞内に貯留され、種々の因子に

よる刺激等により細胞表面へ移行し、遊走に関与する可能性が考えられている 6), 7), 33), 34)。

3) 結論

JR-031において、MSCの炎症部位への遊走に関与することが報告されている細胞接着分子

インテグリン α4/β1 (VLA-4)8)、ケモカイン CXCL12 (SDF-1) 受容体の CXCR4

8)及びMMP2、

MMP14及び TIMP29)が発現していることが、転写レベル又はタンパク質レベルで確認された。


- 23 -

表 2.6.2-12 JR-031におけるインテグリン α4、インテグリン β1及び CXCR4遺伝子発現の比較

JR-031ロット番号遺伝子遺伝子発現 a)

AAAAAA

インテグリン α4 0.0085±0.0012

インテグリン β1 0.7646±0.0155

CXCR4 0.0003±0.0000


表 2.6.2-13 JR-031における MMP2、MMP9、MMP14、TIMP1及び TIMP2遺伝子発現の比較

JR-031ロット番号遺伝子遺伝子発現 a)

AAAAAA

MMP2 3.0980±0.4542

MMP9 0.0003±0.0000

MMP14 0.1363±0.0082

TIMP1 3.3641±0.1370

TIMP2 1.3579±0.1520


図 2.6.2-9 アガロースゲル電気泳動によるインテグリン α4、インテグリン β1、

CXCR4及び B2M cDNAの特異的増幅の確認

MW：分子量マーカー、A：インテグリン α4、B：インテグリン β1、C：CXCR4、D：B2M

A CMW B D

500

1000

100

（bp)


- 24 -

図 2.6.2-10 アガロースゲル電気泳動による MMP2、MMP9、MMP14、TIMP1、

TIMP2及び B2M cDNAの特異的増幅の確認

MW：分子量マーカー、A：MMP2、B：MMP9、C：MMP14、D：TIMP1、

E：TIMP2、F：B2M

図 2.6.2-11 JR-031におけるインテグリン β1 (CD29) の発現確認

左）ロット番号 AAAAAA、中）ロット番号 AAAAAA、右）ロット番号 AAAAAA

上）陰性コントロール、下）インテグリン β1

A FC EMW

500

1000

100

（bp)B D


- 25 -

図 2.6.2-12 JR-031におけるインテグリン α4 (CD49d) の発現及び IFN-γの影響

左）ロット番号 AAAAAA、右）ロット番号 AAAAAA

上）陰性コントロール、中）IFN-γ非添加、下）IFN-γ添加


- 26 -

図 2.6.2-13 JR-031における CXCR4 (CD184) の発現及び IFN-γの影響

左）ロット番号 AAAAAA、右）ロット番号 AAAAAA

上）陰性コントロール、中）IFN-γ非添加、下）IFN-γ添加


- 27 -

図 2.6.2-14 JR-031細胞内における CXCR4 (CD184) の発現確認


上）陰性コントロール、下）CXCR4

図 2.6.2-15 JR-031細胞内におけるインテグリン α4 (CD49d) の発現確認


上）陰性コントロール、下）インテグリン α4


- 28 -

JR-031の細胞遊走能 2.6.2.2.2.2

添付資料 4.2.1.1.10


フルオロブロックセルカルチャーインサートシステムを用い、JR-031 について in vitro細胞

遊走アッセイを行った。本システムは、メンブレンを備えた上部コンパートメントのセルカ

ルチャーインサートと下部のウェルで構成されている。ヒト細胞外マトリックスをコートし

たインサート内に JR-031 を播種し、陽性対照群の下部のウェルには細胞誘引物質としての

FBSを添加した培地を入れた。陰性対照群の下部のウェルには FBSを含まない培地を入れた。

2 日間培養後、細胞をカルセイン-AM で染色し、プレートリーダーにてインサートメンブレ

ンのウェル側に遊走した細胞の蛍光強度を測定した。また、ウェルの底側から蛍光顕微鏡写

真を撮影した。細胞遊走における PDGF、IGF-1 及び MMP の関与を評価するため、PDGF阻

害剤 AG1296、IGF-1 阻害剤 PPP 又はMMP 阻害剤 GM6001を所定の濃度に添加して 2日間培

養し、細胞遊走に及ぼす影響を調べた。試験には、JR-031 DCB（ロット番号 AAAAAA）を

拡大培養後凍結保存された細胞を前培養して用いた。

2) 試験成績

下部ウェルに FBS 添加培地を入れることにより、細胞遊走の指標となる蛍光強度は陰性対

照群と比べ顕著に高く（表 2.6.2-14参照）、また、蛍光顕微鏡観察においてもインサートメン

ブレンのウェル側に遊走した細胞数が顕著に増加することが確認された（図 2.6.2-17 参照）。

細胞に AG1296 を添加して培養した結果、AG1296 濃度依存的に蛍光強度は低下し（表

2.6.2-14 及び図 2.6.2-16 参照）、蛍光顕微鏡観察においても、AG1296 濃度依存的な遊走細胞

の減少が観察された（図 2.6.2-17参照）。

細胞に PPP を添加して培養した結果、PPP 濃度依存的に蛍光強度は低下し（表 2.6.2-15及

び図 2.6.2-18参照）、蛍光顕微鏡観察においても、PPP 濃度依存的な遊走細胞の減少が観察さ

れた（図 2.6.2-19参照）。

細胞に GM6001 を添加して培養した結果、GM6001 濃度依存的に蛍光強度は低下し（表

2.6.2-16 及び図 2.6.2-20 参照）、蛍光顕微鏡観察においても、GM6001 濃度依存的な遊走細胞

の減少が観察された（図 2.6.2-21参照）。

3) 結論

in vitro 細胞遊走アッセイにおいて、FBS を細胞誘引物質として用いることにより、JR-031

の細胞遊走が観察された。PDGF阻害剤 AG1296、IGF-1阻害剤 PPP 又は MMP阻害剤 GM6001

を添加することにより、それぞれの阻害剤において、添加濃度依存的な細胞遊走の阻害が認

められた。本試験結果より、JR-031の細胞遊走には PDGF、IGF-1及び MMP が関与すると考

えられた。


- 29 -

表 2.6.2-14 FBSによる JR-031遊走に対する AG1296添加の影響

試験群蛍光強度 a) 相対値 (%)b)

陰性対照群 55.2±0.4 8.8

陽性対照群 624.8±198.3 100.0

AG1296添加群 2.5 μmol/L 646.0±58.9 103.4

AG1296添加群 5.0 μmol/L 282.5±137.6 45.2

AG1296添加群 10.0 μmol/L 155.1±26.7 24.8

a) 平均値±標準偏差 (n=4)

b) 陽性対照群の蛍光強度を 100%とした相対値

図 2.6.2-16 FBSによる JR-031遊走に対する AG1296添加の影響

陽性対照群の蛍光強度を 100%とした相対値

図 2.6.2-17 FBSによる JR-031遊走に対する AG1296添加の影響

蛍光顕微鏡による遊走細胞画像

A：陰性対照群、B：陽性対照群、C：AG1296添加群 2.5 μmol/L

D：AG1296添加群 5.0 μmol/L、E：AG1296添加群 10.0 μmol/L


- 30 -

表 2.6.2-15 FBSによる JR-031遊走に対する PPP添加の影響


陰性対照群 46.4±3.4 6.1

陽性対照群 764.0±66.5 100.0

PPP 添加群 0.25 μmol/L 681.5±118.7 89.2

PPP 添加群 0.5 μmol/L 211.4±42.8 27.7

PPP 添加群 1.0 μmol/L 129.0±19.1 16.9



図 2.6.2-18 FBSによる JR-031遊走に対する PPP添加の影響


図 2.6.2-19 FBSによる JR-031遊走に対する PPP添加の影響


A：陰性対照群、B：陽性対照群、C：PPP 添加群 0.25 μmol/L

D：PPP 添加群 0.5 μmol/L、E：PPP 添加群 1.0 μmol/L


- 31 -

表 2.6.2-16 FBSによる JR-031遊走に対する GM6001添加の影響


陰性対照群 50.5±5.4 7.3

陽性対照群 687.9±274.6 100.0

GM6001添加群 10 μmol/L 610.2±265.1 88.7

GM6001添加群 20 μmol/L 411.1±217.4 59.8

GM6001添加群 40 μmol/L 103.7±30.4 15.1



図 2.6.2-20 FBSによる JR-031遊走に対する GM6001添加の影響


図 2.6.2-21 FBSによる JR-031遊走に対する GM6001添加の影響


A：陰性対照群、B：陽性対照群、C：GM6001添加群 10 μmol/L

D：GM6001添加群 20 μmol/L、E：GM6001添加群 40 μmol/L


- 32 -

2.6.2.2.3 JR-031における免疫原性に関わる因子

JR-031における MHC及び共刺激分子の解析 2.6.2.2.3.1

添付資料 4.2.1.1.11


JR-031 を IFN-γ添加及び非添加の条件で 3 日間培養後、MHC クラス I 分子、MHC クラス

II分子、CD40、CD80及び CD86 の発現について、FITC 標識抗体を用いフローサイトメトリ

ーで解析した。試験には、JR-031 DCB（ロット番号 AAAAAAAAAAAAAA）を拡大培養後凍

結保存された細胞を前培養して用いた。

2) 試験成績

• MHC クラス I分子及びMHC クラス II分子

試験した DCB 2 ロットのいずれにおいても、IFN-γ無刺激条件でMHC クラス I分子の発現

が認められたが、その発現レベルは低かった。また IFN-γ 刺激により発現の増加が認められ

た（図 2.6.2-22 参照）。一方、MHC クラス II 分子は、いずれのロットにおいても、IFN-γ 無

刺激条件では発現は認められなかったが、IFN-γ刺激により発現が認められた。しかし、その

発現レベルは低かった（図 2.6.2-23参照）。

• CD40、CD80及び CD86

試験した DCB 2 ロットのいずれにおいても、IFN-γ刺激の有無に関係なく CD40、CD80及

び CD86 の発現は認められなかった（図 2.6.2-24、図 2.6.2-25及び図 2.6.2-26参照）。

3) 結論

JR-031において、MHCクラス I分子は無刺激条件でも発現が認められたが、その発現レベ

ルは低かった。また MHC クラス I 分子は IFN-γ刺激により発現が増加した。MHC クラス II

分子は無刺激条件では発現していないが、IFN-γ刺激により発現が誘導された。しかし、その

発現レベルは低かった。共刺激分子 CD40、CD80 及び CD86 は、いずれも IFN-γ刺激の有無

に関係なく発現は認められなかった。


- 33 -

図 2.6.2-22 MHCクラス I分子のフローサイトメトリー解析結果

上：陰性対照（未染色コントロール）、中：無刺激、下：IFN-γ刺激

左：ロット番号 AAAAAA、右：ロット番号 AAAAAA


- 34 -

図 2.6.2-23 MHCクラス II分子のフローサイトメトリー解析結果




- 35 -

図 2.6.2-24 CD40のフローサイトメトリー解析結果




- 36 -





- 37 -





- 38 -

2.6.2.3 副次的薬理試験

該当試験なし。

2.6.2.4 安全性薬理試験

2.6.2.4.1 ラットにおける同種異系MSCの中枢神経系に及ぼす影響

添付資料 4.2.1.3.1


1群 6匹の雄の Fischer 344ラットに rMSC（生存率 40.3%）を、総細胞数として 5, 15又は 45×106

個/kgの用量で単回静脈内投与した。投与液量は 5.62 mL/kg とし、1 mL/分の投与速度で尾静脈

内へ投与した。対照群には生理食塩液又は媒体（1.9%ラット血清及び 3.7%DMSOを含む酢酸リ

ンゲル液）を同様に投与した。

生理食塩液、媒体又は rMSCの投与前、投与 0.5, 1, 3及び 6時間後に、Irwinの多次元観察に

準じてラットの一般症状及び行動に及ぼす影響を観察することにより、rMSC の中枢神経系に

及ぼす影響を評価した。

2) 試験成績

ラットの一般症状及び行動に対し媒体投与の影響はみられなかった。rMSC は、いずれの投

与量においてもラットの一般症状及び行動に影響を及ぼさなかった。

3) 結論

rMSC は 45×106個/kg（生細胞換算で 18×10

6個/kg）までの単回静脈内投与により、ラットの

中枢神経系に影響を及ぼさなかった。

2.6.2.4.2 ラットにおける同種異系MSCの呼吸系に及ぼす影響

添付資料 4.2.1.3.2


1群 8匹の雄の Fischer 344ラットに rMSC（生存率 40.3%）を、総細胞数として 5, 15又は 45×106

個/kgの用量で単回静脈内投与した。投与液量は 5.62 mL/kg とし、1 mL/分の投与速度で尾静脈

内へ投与した。対照群には生理食塩液又は媒体（1.9%ラット血清及び 3.7%DMSOを含む酢酸リ

ンゲル液）を同様に投与した。

生理食塩液、媒体又は rMSCの投与前、投与 0.5, 1, 3及び 6時間後に、無麻酔・非拘束の条

件下で全身プレチスモグラフ法にて呼吸数、1回換気量及び分時換気量を測定することにより、

rMSCの呼吸系に及ぼす影響を評価した。

2) 試験成績

ラットの呼吸数、1 回換気量及び分時換気量に対し媒体投与の影響はみられなかった。rMSC

の 5 及び 15×106個/kg 投与では、いずれのパラメータにも変化は認められなかったが、45×10

6

個/kg の投与では、投与 0.5 時間後から 6 時間後において、媒体投与と比較し呼吸数が増加し、

1 回換気量が減少した。分時換気量については、明らかな変化はみられなかった。呼吸数の増

加は、rMSC 投与による呼吸機能の低下を補うための代償性の反応と推察され、それに伴い 1

回換気量の減少が生じたと考えられた。しかし、分時換気量の低下がみられなかったことより、

重篤な変化ではないと考えられた。

3) 結論


- 39 -

rMSCは 15×106個/kg（生細胞換算で 6×10

6個/kg）までの単回静脈内投与により、ラットの呼

吸系に影響を及ぼさなかった。45×106個/kg（生細胞換算で 18×10

6個/kg）の投与では呼吸数は

増加し 1回換気量は減少したが、分時換気量の変化はみられなかった。

2.6.2.5 薬力学的相互作用試験

該当試験なし。

2.6.2.6 考察及び結論

2.6.2.6.1 JR-031の薬理作用

JR-031 の効力を裏付ける試験として、JR-031の GVHD 治療効果における主要な薬理作用と考

えられる免疫調節作用に加え、JR-031 の炎症部位への遊走能及び免疫原性に関与する因子につ

いて検討し、本薬の GVHD 治療効果における作用機序について考察した。

安全性薬理試験では、本薬の急性的な輸注毒性を検討する目的で、ラットの一般症状及び行

動に及ぼす同種異系 MSC 投与の影響を検討した。また、静脈内投与された JR-031 が最初に通

過する微小循環系は肺であることから、ラットの呼吸系に及ぼす同種異系 MSC 投与の影響を検

討した。

JR-031の免疫調節作用について 2.6.2.6.1.1

MSCは、T 細胞機能阻害、CD4+細胞から制御性 T細胞への誘導、樹状細胞の成熟阻害、単球

から抗炎症性 M2 マクロファージへの分化誘導、Th2 細胞優位へのシフト、種々のサイトカイ

ン産生等、複数の機序によって免疫機能を調節すると考えられている 10), 11), 12)。

MSCによる炎症に関わるシグナルの認識には、種々のサイトカイン受容体や生体内の自然免

疫に関与する TLR ファミリーが重要な役割を演じる 13)。TLR ファミリーの中では、特に TLR3

及び TLR4 が MSC の免疫調節作用に重要であり、IL-1βや IFN-γ等の炎症性サイトカインによ

ってその発現が誘導され、炎症環境の変化に対する感度を上げることによりMSCの速やかな反

応を可能にする 11), 13)。

活性化されたMSCから分泌され、免疫調節作用を発揮する液性因子として多くのものが報告

されている 14), 15)。IL-1β及び IFN-γ等の炎症性サイトカインは、アラキドン酸代謝酵素 COX-2

の発現を誘導することにより PGE2産生を亢進する16)。COX阻害剤で PGE2産生を阻害すると、

MSCによる T細胞及びNK細胞に対する増殖抑制や樹状細胞の成熟阻害作用が減弱することか

ら、PGE2はこれらの作用により MSC の免疫調節作用に関与すると考えられる 17), 18), 19)。また、

MSCを IFN-γや poly (i;c) （TLR3 アゴニスト）又は LPS（TLR4 アゴニスト）で刺激すること

により IDO1の発現が誘導される。トリプトファンの IDO1代謝物キヌレニンは T 細胞の増殖を

抑制するとともに、単球を抗炎症性のM2マクロファージに分化させることが知られている 2), 20)。

このように、PGE2及びトリプトファンの IDO1 代謝物であるキヌレニンは MSC の免疫調節作

用において重要な役割を演じる。MSC の TLR3 又は TLR4 アゴニストによる刺激では、IDO1

の産生誘導を介して抗炎症性反応が惹起される一方で、炎症性サイトカインの IL-6や IL-8の産

生が誘導される 21), 22)。これらの因子は、炎症反応を促進することにより細菌やウイルス感染を

排除すると考えられる 23)。

さらにMSC は、CD4+細胞から制御性 T 細胞への分化を誘導することが知られている 24)。制


- 40 -

御性 T 細胞は、T 細胞を介する炎症反応を特異的に抑制する作用を有し、混合リンパ球反応を

抑制することから、MSCの免疫調節作用の一端を担っていると考えられている 25)。

以上のように、MSCは生体内の環境に応じて免疫反応を調節することにより、抗炎症作用を

発現したり、反対に炎症を促進して細菌やウイルス感染を排除することによって生体の恒常性

維持に関与すると考えられている 11), 12)。

MSCの免疫調節作用に関して報告されている知見に基づき、JR-031の免疫調節作用について

検討した。その結果、JR-031 は、hPBMC との共培養において、抗 CD3/CD28 抗体刺激によっ

て誘発される T 細胞増殖を抑制した（2.6.2.2.1.1 参照）。本作用には、JR-031 が産生する PGE2

や IDO1 が関与することが確認された（2.6.2.2.1.2 及び 2.6.2.2.1.3参照）。さらにMSC の活性化

に重要である TNF-α 受容体の発現が確認され（2.3.S.2.5.5 参照）、TNF-α 刺激による PGE2産生

の亢進が認められた（2.6.2.2.1.2及び 2.3.S.2.5.8 参照）。また、JR-031は、IFN-γ受容体（0参照）、

TLR3 及び TLR4 を発現していることが確認され（2.6.2.2.1.5参照）、IFN-γ、TLR3 又は TLR4 ア

ゴニストで刺激することにより IDO1 遺伝子の顕著な発現誘導が観察された（0 参照）。一方で

TLR3 及び TLR4 アゴニストによる刺激では、IL-6及び IL-8の産生誘導も確認された（2.6.2.2.1.5

参照）。さらに、JR-031は CD4+細胞から制御性 T 細胞への分化を誘導した（2.6.2.2.1.4 参照）。

以上の結果より、JR-031は、種々のシグナルを受けることによって、PGE2やキヌレニン等の

液性因子の産生や制御性 T 細胞の誘導等、複数の機序によって免疫反応を調節することによっ

て抗炎症作用を発現するとともに、細菌やウイルス感染に対しては、IL-6 や IL-8の産生を介し

て炎症反応を促進することにより、これらの感染因子を排除する作用を有することが示唆され

た（図 2.6.2-27参照）。


- 41 -

図 2.6.2-27 推定される JR-031の主要な免疫調節作用メカニズム

JR-031の炎症部位への遊走能について 2.6.2.6.1.2

MSC は、生体内において炎症や組織傷害部位を感知してその部位に集簇し、MSC の特性で

ある免疫調節作用を発現すると考えられるが、炎症・傷害部位への遊走機序は未だ十分には理

解されていない 10)。しかし、近年の研究において、MSC は、リンパ球等の免疫担当細胞と類似

する機序により循環血液中より炎症部位に遊走することが明らかになってきた 10), 29), 30), 31)。免

疫担当細胞等が生体内の炎症部位へ遊走する際には、局所で分泌された炎症性サイトカイン、

成長因子等により刺激を受けて活性化され、血管内をローリングした後、内皮細胞に接着し、

血管内皮の基底膜及び細胞外マトリックスバリアーを分解することによって血管外へ遊走し、

炎症組織内へ浸潤すると考えられている 8), 32)。

MSC は、炎症部位で産生された炎症性サイトカインや成長因子により誘引、活性化される。

遊走の初期ステップであるローリング及び血管内皮細胞への接着には、MSC に発現している P-

セレクチンリガンド 29)、ケモカインレセプターCXCR433), 34)、インテグリン α4/β1 (VLA-4)

29)及

びインテグリン β135)が重要な役割を果たす。また、血管内皮細胞に接着した MSC が基底膜及

び細胞外マトリックスバリアーを分解し、血管外へ遊走して組織内へ浸潤するには、マトリッ

クスメタロプロテアーゼ (MMP2、MMP14) 及びその内因性MMP 阻害因子 (TIMP2) の作用が

重要であると考えられている 9)。

JR-031 について、これらの細胞遊走関連因子の発現をリアルタイム RT-PCR 法及びフローサ

イトメトリーにて解析した結果、インテグリン α4、インテグリン β1、CXCR4 及びマトリック

スメタロプロテアーゼ関連の遺伝子群 (MMP2、MMP14、TIMP1、TIMP2) が発現していること

が、転写レベル又はタンパク質レベルで確認された（2.6.2.2.2.1参照）。さらに、in vitro細胞遊

IFN-γTNF-α

T-cell

CD4

MSC（休止状態）

TLR3

TLR4

IFN-γ

受容体TNF-α

受容体

IDO1

キヌレニン

COX2

PGE2

Treg

CD25CD4

増殖抑制

活性化

分化

免疫調節

炎症部位

炎症シグナル

誘導

IL-6 IL-8

バクテリア、ウイルス排除

トリプトファン

アラキドン酸

LPS

dsRNA

ウイルス

バクテリア

FoxP3


- 42 -

走アッセイにおいて、JR-031の細胞遊走には成長因子である PDGF、IGF-1及びマトリックスメ

タロプロテアーゼが関与していることが示唆された（2.6.2.2.2.2参照）。

以上の結果より、JR-031 は、生体に投与された際、免疫担当細胞と同様のメカニズムにより

血管内皮細胞に接着後、基底膜及び細胞外マトリックスを分解し、血管外へ遊走して組織内へ

浸潤すると推察される（図 2.6.2-28参照）。

図 2.6.2-28 JR-031の推定される血管内皮細胞への接着及び浸潤メカニズム

JR-031の免疫原性について 2.6.2.6.1.3

MSC は MHC クラス I 及びクラス II 分子の発現レベルが低く、T 細胞の活性化に必要な共刺

激分子 CD40、CD80及び CD86を発現していないことから、HLA 型の一致しないドナー由来の

リンパ球と共培養してもリンパ球増殖を惹起せず、MHC のバリアーを超えた投与/移植が可能

であると考えられているが 36), 37), 38), 39)、免疫学的に正常な動物に同種 MSCを投与すると、抗体

産生や細胞性免疫応答が惹起されることが報告されている 40), 41)。したがって、同種 MSC は免

疫学的に拒絶されうると考えられるが、MHC クラス I 及びクラス II 分子の発現レベルが低く、

共刺激分子を発現していないという特性に加え、自身の有する T 細胞活性化の抑制や抗原提示

細胞の成熟阻害作用等により免疫拒絶を遅延又は回避し、他の同種細胞を移植した場合と比べ

よりゆっくり排除されるとの考えが示されている 41), 42)。

JR-031 においても、MHCクラス I分子は恒常的に発現されているがそのレベルは低く、無刺

激条件では MHC クラス II 分子及び共刺激分子は発現していないことが示された（2.6.2.2.3 参

照）。また、IFN-γ刺激条件においても、MHC クラス I分子の発現増加及びクラス II分子の発現

誘導が認められるものの、共刺激分子の発現は認められなかった（2.6.2.2.3 参照）。さらに、JR-031

は、PGE2や IDO1の産生及び制御性 T細胞の誘導等、複数の機序によって免疫応答を抑制する

作用を有することが示された（2.6.2.2.1参照）。

JR-031 の急性 GVHD を対象とした臨床試験では、HLA 型の適合性に関係なく本薬が投与さ

れ、非常に良好な治療成績が得られている（2.7.3 参照）。また、IAR 等の同種抗体産生が疑わ

れる有害事象の発生は認めらなかった（2.7.4参照）。JR-031は、上述したように、MHCクラス

PDGF-β

受容体

IGF-1受容体

P-セレクチンP-セレクチンリガンド

IGF-1TNF-α

PDGF-BB炎症部位

インテグリン

ケモカインレセプター

ケモカイン

（CXCR4）

（SDF-1）

(α4)

(β1)

VCAM-1

MMP2, MMP14

TIMP2

血管内皮細胞

基底膜

TNF-α

受容体

1. 誘引、活性化

免疫調節作用発揮

2. ローリング、接着

3. 細胞浸潤

血流


- 43 -

I 及びクラス II 分子の発現レベルが低く、炎症性刺激によって活性化された状態においても共

刺激分子を発現していないことに加え、自身の持つ免疫調節作用により患者の同種免疫応答を

抑制して免疫拒絶を遅延したり回避したりする可能性が考えられる。これらのことが JR-031に

よるMHC バリアーを超えた治療を可能していると推察される。

JR-031の GVHD治療効果における作用機序について 2.6.2.6.1.4

JR-031 の適応疾患である同種造血幹細胞移植後の急性 GVHDでは、患者は全身放射線照射や

大量化学療法等の強力な移植前処置により腸管粘膜が傷害され、腸内細菌に由来する LPSが循

環血液中に取り込まれることによって、全身の組織において種々の炎症性サイトカイン産生が

誘発されると考えられる 43), 44)。腸内細菌由来の LPS や炎症性サイトカインによって、ドナー由

来の T 細胞が活性化され、レシピエントの主に皮膚、消化管及び肝臓を傷害すると考えられて

いる 43), 44)。

患者に投与された JR-031は、生体内において炎症や組織傷害部位を感知してその部位に集簇

し、炎症性サイトカイン等の種々のシグナルによって活性化され、PGE2 やトリプトファンの

IDO1 代謝物キヌレニン等の液性因子の産生や制御性 T細胞の誘導等、複数の機序によりドナー

由来の活性化 T 細胞機能を抑制することによって GVHD治療効果を発現すると推察される。さ

らに、JR-031は、MHCクラス I及びクラス II分子の発現レベルが低く、共刺激分子を発現して

いないことに加え、自身の持つ免疫調節作用により患者の同種免疫応答を抑制して免疫拒絶を

遅延したり回避したりする可能性が考えられる。このことが JR-031によるMHCバリアーを超

えた治療を可能していると推察される。

ラットにおける同種異系MSCの中枢神経系及び呼吸系に対する影響について 2.6.2.6.1.5

安全性薬理試験において、同種異系ラット由来 MSC は、5, 15 又は 45×106個/kg の単回静脈

内投与によりラットの一般症状及び行動に影響を及ぼさなかった（2.6.2.4.1 参照）。呼吸系に対

しては、45×106個/kgの単回静脈内投与により呼吸数の増加及び1回換気量の減少がみられたが、

重篤な影響はみられず、15×106個/kgまでの投与では、ラットの呼吸系に影響を及ぼさなかった

（2.6.2.4.2 参照）。以上の結果から、JR-031 の臨床使用においてこれらの器官系に関連した重篤

な副作用を誘発する可能性は低いと考えられた。

2.6.2.6.2 結論

JR-031の GVHD治療効果における主要な作用機序について、JR-031は、生体内において炎症

部位を感知してその部位に集簇し、炎症性サイトカインなどによって活性化され、PGE2やトリ

プトファンの IDO1 代謝物キヌレニン等の液性因子の産生や制御性 T 細胞の誘導等、複数の機

序によりドナー由来の活性化T細胞機能を抑制することによってGVHD治療効果を発現すると

推察される。また、JR-031 は自身の持つ免疫調節作用により患者の同種免疫応答を抑制して免

疫拒絶を遅延したり回避したりする可能性が考えられる。このことが JR-031によるMHCバリ

アーを超えた治療を可能していると推察される。

安全性薬理試験の結果より、JR-031 の臨床使用において中枢神経系及び呼吸系に関連した副

作用を誘発する可能性は低いと考えられた。


- 44 -

2.6.2.7 図表

図表は本文中に記載した。

2.6.2.8 参考文献

1) Trickett A, Kwan YL. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol

Methods. 2003; 275: 251-5.

2) Ryan JM, Barry F, Murphy JM, Mahon BP. Interferon-gamma does not break, but promotes the

immunosuppressive capacity of adult human mesenchymal stem cells. Clin Exp Immunol. 2007;

149 (2) : 353-63.

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テムセル HS注


2.6 非臨床概要

2.6.3 薬理試験の概要表



- 3 -

目次

2.6.3 薬理試験概要表 ............................................................................................................ 6

2.6.3.1 薬理試験一覧 ......................................................................................................... 6

2.6.3.1.1 被験物質として JR-031を用いた試験 .......................................................... 6

2.6.3.1.2 被験物質として rMSCを用いた試験 ............................................................. 7

2.6.3.2 効力を裏付ける試験 .............................................................................................. 7

2.6.3.2.1 JR-031の免疫調節作用 ................................................................................. 7

2.6.3.2.2 JR-031の細胞遊走能 ..................................................................................... 8

2.6.3.2.3 JR-031における免疫原性に関わる因子........................................................ 8

2.6.3.3 副次的薬理試験 ..................................................................................................... 8

2.6.3.4 安全性薬理試験 ..................................................................................................... 9

2.6.3.5 薬力学的薬物相互作用試験 ................................................................................... 9


- 4 -


- 5 -

用語の定義


DCB ドナーセルバンク (donor cell bank)

JR-031の製造工程における重要中間体

FBS ウシ胎児血清 (fetal bovine serum)

FoxP3 制御性 T細胞で特異的に発現する転写因子 (forkhead box P3)



IFN-γ インターフェロ γ (interferon γ)




JCR JCRファーマ株式会社。hMSC製剤 (JR-031) の製造販売承認申請者又は製造業者。2014年

1月 1日に日本ケミカルリサーチ株式会社より社名変更した。

JR-031 JCRの hMSC製剤（JCRの hMSCの開発コードとして用いる場合もある）又はその本質



MSC 間葉系幹細胞 (mesenchymal stem cell)

PCR ポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction)



PPP ピクロファーマコライト(picropharmacolite)

rMSC ACIラット間葉系幹細胞

RT-PCR 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (reverse transcription polymerase chain reaction)

TIMP 内因性MMP阻害因子 (tissue inhibitor of metalloproteinase)

TLR Toll様受容体 (Toll-like receptor)


- 6 -

2.6.3 薬理試験概要表

2.6.3.1 薬理試験一覧

2.6.3.1.1 被験物質として JR-031を用いた試験

一覧表

被験物質：JR-031

試験の種類試験系投与方法実施施設試験番号記載箇所

効力を裏付ける試験 Vol. Section

JR-031によるヒト T細胞増殖抑制作用 hPBMC in vitro JCRb) JR031-AAAa 4 4.2.1.1.1

JR-031のヒト T細胞増殖抑制作用に対する PGE2合成阻害剤の影響 hPBMC in vitro JCRb) JR031-AAAa 4 4.2.1.1.2

JR-031のヒト T細胞増殖抑制作用に対する IDO阻害剤の影響 hPBMC in vitro JCRb) JR031-AAAa 4 4.2.1.1.3

JR-031の制御性 T細胞誘導能の評価（PCR）ヒト CD4陽性細胞 in vitro JCRb) JR031-AAAa 4 4.2.1.1.4

JR-031の制御性 T細胞誘導能の評価（フローサイトメトリーによる解析）ヒト CD4陽性細胞 in vitro JCRb) JR031-AAAa 4 4.2.1.1.5

JR-031における TLRファミリーの発現確認及びその機能性評価 NAa) NAa) JCRb) JR031-AAAa 4 4.2.1.1.6

JR-031における抗炎症因子遺伝子の発現誘導の確認 NAa) NAa) JCRb) JR031-AAAa 4 4.2.1.1.7

JR-031における細胞遊走に関わる接着関連因子の解析（PCR） NAa) NAa) JCRb) JR031-AAAa 4 4.2.1.1.8

JR-031における細胞遊走に関わる接着関連因子の解析

（フローサイトメトリーによる解析） NAa) NAa) JCRb) JR031-AAAa 4 4.2.1.1.9

トランズウェルを用いた JR-031の細胞遊走能の評価と阻害剤の影響 NAa) NAa) JCRb) JR031-AAAa 4 4.2.1.1.10

JR-031における免疫原性に関わる細胞表面マーカーの確認 NAa) NAa) JCRb) JR031-AAAa 4 4.2.1.1.11

a) 該当せず

b) JCRファーマ株式会社


- 7 -

2.6.3.1.2 被験物質として rMSCを用いた試験

一覧表

被験物質：rMSC

試験の種類試験系投与方法実施施設試験番号記載箇所

安全性薬理試験 Vol. Section

ACI ラット由来間葉系幹細胞の安全性薬理試験

ラットの中枢神経系に及ぼす影響ラット静脈内あああああああああああぁ AAAAA 4 4.2.1.3.1

ACI ラット由来間葉系幹細胞の安全性薬理試験

ラットの呼吸系に及ぼす影響ラット静脈内あああああああああああぁ AAAAA 4 4.2.1.3.2

a) あああああああああああああああああああああああああああああああ

2.6.3.2 効力を裏付ける試験

2.6.3.2.1 JR-031の免疫調節作用


試験項目試験成績試験番号記載箇所

Vol. Section

JR-031の T細胞増殖抑制作用

JR-031は、hPBMCとの共培養により、抗 CD3/CD28抗体刺激によって誘発される T細胞増殖

を抑制した。本結果より、JR-031は抗原刺激による T細胞増殖を抑制することにより、免疫反

応を制御する作用を有することが示された。

JR031-AAAa 4 4.2.1.1.1

JR-031 の T 細胞増殖抑制作用における

PGE2の関与

JR-031の T細胞増殖抑制作用は、PGE2合成阻害剤の添加により減弱した。本結果より、JR-031

の T細胞増殖抑制作用には、JR-031が分泌する PGE2が関与することが示された。 JR031-AAAa 4 4.2.1.1.2

JR-031 の T 細胞増殖抑制作用における

IDO阻害剤の影響

JR-031の T細胞増殖抑制作用は、IDO阻害剤の添加により減弱した。本結果より、JR-031の T

細胞増殖抑制作用には、活性化 T細胞との相互作用によって産生誘導される IDOが関与するこ

とが示された。

JR031-AAAa 4 4.2.1.1.3

JR-031の制御性 T細胞誘導能

CD4陽性細胞を JR-031と共培養することにより、CD4陽性かつCD25陽性細胞の比率は増加し、

FoxP3遺伝子発現の増加が認められた。本結果より、JR-031は CD4陽性細胞から制御性 T細胞

への分化を誘導することが示された。

JR031-AAAa

JR031-AAAa 4

4.2.1.1.4

4.2.1.1.5

JR-031における TLRファミリーの発現

JR-031において、TLR1, TLR3, TLR4及び TLR6遺伝子の発現が転写レベルで確認された。さら

に、TLR3又は TLR4アゴニストによる刺激により、IL-6及び IL-8遺伝子発現の増加が認めら

れたことから、TLR3及び TLR4が機能的に発現していることが確認された。

JR031-AAAa 4 4.2.1.1.6

JR-031における抗炎症因子遺伝子の

発現誘導

JR-031において、IFN-γ受容体 α鎖の発現が確認された。JR-031では、無刺激条件においては

IDO1遺伝子の発現はほとんど観察されなかったが、IFN-γ、TLR3アゴニスト又は TLR4アゴニ

ストによる刺激により、顕著な IDO1遺伝子の発現誘導が観察された。

JR031-AAAa 4 4.2.1.1.7


- 8 -

2.6.3.2.2 JR-031の細胞遊走能



Vol. Section

JR-031における細胞遊走関連因子の

発現

JR-031において、細胞接着分子インテグリン α4、インテグリン β1、ケモカイン CXCL12 (SDF-1)

受容体の CXCR4及びMMP関連の遺伝子群 (MMP2、MMP14、TIMP1、TIMP2) が発現してい

ることが確認された。

JR031-AAAa

JR031-AAAa 4

4.2.1.1.8

4.2.1.1.9

JR-031の細胞遊走能

in vitro細胞遊走アッセイにおいて、FBSを細胞誘引物質として用いることにより、JR-031の細

胞遊走が観察された。PDGF阻害剤 AG1296、IGF-1阻害剤 PPP又はMMP阻害剤 GM6001を添

加することにより JR-031遊走の阻害が認められたことから、JR-031の細胞遊走には PDGF、

IGF-1及びMMPが関与することが示された。

JR031-AAAa 4 4.2.1.1.10

2.6.3.2.3 JR-031における免疫原性に関わる因子



Vol. Section

JR-031におけるMHC及び共刺激分子の

解析

JR-031において、MHCクラス I分子は未刺激条件でも発現しており、IFN-γ刺激により発現が

増加した。MHCクラス II分子は未刺激条件では発現していないが、IFN-γ刺激により発現が誘

導された。共刺激分子 CD40, CD80及び CD86は、いずれも IFN-γ刺激の有無に関係なく発現は

認められなかった。

JR031-AAAa 4 4.2.1.1.11

2.6.3.3 副次的薬理試験

該当資料なし


- 9 -

2.6.3.4 安全性薬理試験

被験物質：rMSC

試験項目動物種及び系統投与方法投与量 a)

（×106個/kg）

性別及び

動物数/群特記すべき所見 GLP適用試験番号

記載箇所

Vol. Section

中枢神経系ラット，Fischer

344 静脈内 5, 15, 45 雄 6匹影響なし適 AAAAA 4 4.2.1.3.1

呼吸系ラット，Fischer

344 静脈内 5, 15, 45 雄 8匹

5及び 15×106個/kgで影響なし

45×106個/kgで呼吸数の増加と 1回換気量の

減少、分時換気量は変化なし

適 AAAAA 4 4.2.1.3.2

a) 総細胞数

2.6.3.5 薬力学的薬物相互作用試験

該当資料なし

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テムセル HS 注...テムセルHS 注 CTD 第2 部（モジュール2） 2.6 非臨床試験の概要文及び概要表 JCRファーマ株式会社 2.6.1 緒言 - 4 - 用語の定義