バイオ解析チーム教育セミナー資料―質量分析9 · 5 Hyperbplic Rods (Q1) 双曲面を持つHyperbolic Rods 分解能を上げても高い透過効率を維持円柱面を持つRound

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バイオ解析チーム教育セミナー資料―質量分析9

1

ベンチトップ型四重極Orbitrap“Q-Exactive”によるProteome解析

サーモフィッシャーサイエンティフィック㈱

アプリケーション部アプリケション部

肥後大輔

Thermo Scientific: Mass Spectrometers

TSQ VantageQ-Exactive

Exactive＋

2

LTQ

LTQ FT Ultra

LTQ Orbitrap

2

ベンチップ型四重極Orbitrap “Q-Exactive”

• MS scan：m/z50-4,000• Q1 isolation：～m/z2500• Isolation width：>0 4amu

74cm

• Isolation width：>0.4amu• MS/MS：m/z50-4,000• 質量精度：1ppm(内部標準)

5ppm(外部標準)• 分解能： 17,500@12Hz

140,000@1Hz• Pos/Neg切り替え測定(<1s)

94cm

3

g切り替え測定( )• Data dependent MS/MS測定

• SIM測定91cm


• HCD collision cell• Predict AGC• Prefilling + HCD-MS/MS• 高感度/高速なMS/MS測定

• Quadrupole mass filter (Q1) • 円柱面ではなく双曲面の四重極

• 高分解能モードでも透過効率を維持

• SIMモードによる定量高感度/高速なMS/MS測定 SIMモドによる定量

• S-lens高イオ透過効率

4

• 高イオン透過効率

• Orbitrap detector• 新しいFTプログラム: Enhanced FT• 従来よりも1.8倍の高分解能 ( or 高速化)

3


• S-lens高イオ透過効率

5

• 高イオン透過効率

従来のイオンガイド

S-Lens: Stacked Lens

• 従来のトランスファーチューブを短く切断して、代わりにS-Lensを搭載

• イオン透過効率が向上

S-Lens

6

4

8 5

9 0

9 5

10 0 N L :8 .8 0 E 3m / z= 2 7 3 .5 0 -2 7 4 .5 0 +2 8 0 .5 0 -2 8 1.5 0 M S A lp D u a lID 7 _ 5 mm t p 6 _ 2 m m C L 8 0 th _ 0 6N L :8 .8 0 E 3

8 5

9 0

9 5

10 0 N L: 1.0 7E3m/ z= 2 73 .50 - 2 74 .50 +2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S A lp S t d LT Q 10 0 f g _ 01N L: 1.0 7E3m/ z= 2 73 .50 - 2 74 .50 +2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S alp s t d lt q 10 0 f g _ 0 2

Standard LTQ Intensity: 1.1E3

+S-Lens:Intensity: 8.8E3

x5 x5

S-Lens: Stacked Lens

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0

Rel

ativ

e A

bund

ance

m / z= 2 7 3 .5 0 -2 7 4 .5 0 +2 8 0 .5 0 -2 8 1.5 0 M S a lp d u a lid 7 _ 5 m m tp 6 _ 2 m m c l8 0 t h _ 07N L :8 .8 0 E 3m / z= 2 7 3 .5 0 -2 7 4 .5 0 +2 8 0 .5 0 -2 8 1.5 0 M S a lp d u a lid 7 _ 5 m m tp 6 _ 2 m m c l8 0 t h _ 08N L :8 .8 0 E 3m / z= 2 7 3 .5 0 -2 7 4 .5 0 +2 8 0 .5 0 -2 8 1.5 0 M S a lp d u a lid 7 _ 5 m m tp 6 _ 2 m m c l8 0 t h _ 09N L :8 .8 0 E 3m / z= 2 7 3 .5 0 -2 7 4 .5 0 +2 8 0 .5 0 -2 8 1.5 0 M S a lp d u a lid 7 _ 5 m m tp 6 _ 2 m m c l8 0 t h _ 10

3 0

3 5

4 0

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

7 0

7 5

8 0N L: 1.0 7E3m/ z= 2 73 .50 - 2 74 .50 +2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S alp s t d lt q 10 0 f g _ 0 3N L: 1.0 7E3m/ z= 2 73 .50 - 2 74 .50 +2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S alp s t d lt q 10 0 f g _ 0 4N L: 1.0 7E3m/ z= 2 73 .50 - 2 74 .50 +2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S alp s t d lt q 10 0 f g _ 0 5N L: 1.0 7E3m/ z= 2 73 .50 - 2 74 .50 +2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S alp s t d lt q 10 0 f g _ 0 6N L: 1.0 7E3m/ z= 2 73 .50 - 2 74 .50 +2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S A lp S t d LT Q 10 0 f g _ 07N L: 1.0 7E3m/ z= 2 73 .50 - 2 74 .50 +2 8 0 .50 - 2 8 1.50 M S alp s t d lt q 10 0 f g _ 0 8

7

0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1.0T im e (m in )

0

5

10

15

2 0

2 50

0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1.0 1.2T im e (m in )

0

5

10

15

2 0

2 5

5 injections of Alprazolam

x7~10の感度（イオン透過効率）向上


• Quadrupole mass filter (Q1) • 円柱面ではなく双曲面の四重極

• 高分解能モードでも透過効率を維持

• SIMモードによる定量SIMモドによる定量

8

5

Hyperbplic Rods (Q1)

双曲面を持つHyperbolic Rods分解能を上げても高い透過効率を維持

円柱面を持つRound rod

•• ユニット分解能ユニット分解能Quantum •• ユニット分解能ユニット分解能

9

• プリカーサーイオンのアイソレーション：～m/z2,500まで対応

• SIMモードの測定：感度（S/N）とダイナミックレンジの向上

• HR/AMによるターゲット定量

nce 40

6080

100195.0876

N=248,402 NL: 1.94E8[150.00-2000.00]

Full MS@m/z150 to 2,000S/N = 745

Selected ion monitoring: Q1 mass filter

020406080

100

Rel

ativ

e A

bund

a

020

195.0877N=20,741 NL: 1.12E8

[190.10-200.10] SIM@m/z190 to 200S/N = 5,400

3000

4000

5000

6000

ectr

um)

m/z195Caffeine

Q1 filter: 10amu

10

0

1000

2000

3000

195.082 195.084 195.086 195.088 195.09 195.092 195.094

S/N

(spe

S/N (FMS) S/N (SIM10)

Sensitivity gain 5 – 10 x with SIM mode

6


• HCD collision cell• Predict AGC• Prefilling + HCD-MS/MS• 高感度/高速なMS/MS測定高感度/高速なMS/MS測定

11

BSA 20fmol: m/z474.23 (0.79ppm), z=3, MS/MS

12 MASCOT search result: MS tol.=10ppm, MS/MS tol.=0.02Da

7





8


15


““...Static charges can not be stable in ...Static charges can not be stable in electrostatic fields...”electrostatic fields...”

静電場によるイオンのトラップ

Linear traps Segmented-ring traps

Orbital traps

16

Orbital traps

9

Orbitrapでのイオンの軌道

• Characteristic frequencies:• Frequency of rotation ωφ• Frequency of radial oscillations ωr• Frequency of axial oscillations ωz

r

22

⎟⎞

⎜⎛ Rmωω

12

2

−⎟⎠⎞

⎜⎝⎛=RRmzωωϕ

z

17

2−⎟⎠

⎜⎝

=Rm

zr ωω

qmk

z /=ω

{ })/ln(2/2

),( 222mm RrRrzkzrU ⋅+−⋅=

φ

Lord of the ion rings: “リング”の形成

ElectrodynamicSqueezing

“Fast” Injection

A.A. Makarov, Anal. Chem., v.72 (2000), No.6, p.1156-1162.A.A. Makarov, US Pat. 5,886,346, 1999.

18

10

k

Lord of the ion rings: “リング”の維持

zmk/

=ω

19

1. 周波数の決定はフーリエ変換を利用→質量の情報へ2. 高感度かつ高分解能を得るためには、イオンを持続的に運動する必要がある

→さらなる高真空度を要求

精密質量を妨害する要因

質量の誤差

1)装置の温度変化に対する観測質量のシフト

mass shift (m/z 524) vs. TIC

2.004.006.008.00

ppm

)

質量の誤差

測定時間

20

-8.00-6.00-4.00-2.000.002.00

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

TIC

devi

atio

n (

イオン強度の増加

2)検出器の飽和による観測質量のシフト

11

観測質量の精度はシグナル強度に依存


2.004.006.008.00

(ppm

)

質量誤差（ｐｐｍ）

Intensity

-8.00-6.00-4.00-2.000.002.00

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

TIC

devi

atio

n (

強いシグナル

21

R.T.

弱いシグナル

精密質量を妨害する要因の解決１～イオン量制御～

・Auto Gain Control (AGC)MSスペクトルの観測を行う前に、プレスキャン(~1msec)を行い、予め溶出ピークのイオン量を確認し、観測を行う際には適切なイオン量を導入ソフトウェアによる自動制御で、実際の操作では全く気が付きません。。。

0

10

20

30

40

50

60

0 100 200 300 400 500 600Scan Number

Inje

ctio

n Ti

me

(ms)

Injection Time

イオン溜め込み時間

イオン強度

22

0.0E+001.0E+082.0E+083.0E+084.0E+085.0E+086.0E+087.0E+088.0E+08

0 100 200 300 400 500 600Scan Number

Scal

ed T

IC (c

ount

s)

Scaled TIC

イオン強度

12

mass shift of m/z 524

2 004.006.008.00

pm)

AGC OFF


-8.00-6.00-4.00-2.000.002.00

0 20 40 60 80 100 120 140

scan number

devi

atio

n (p


4 006.008.00

m)

23

-8.00-6.00-4.00-2.000.002.004.00

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

TIC

devi

atio

n (p

pm

イオン量を制御していないと、その強度の増減に影響して観測質量の誤差が生じてしまいます。

AGC ONmass shift of m/z 524

4.006.008.00

pm)


-8.00-6.00-4.00-2.000.002.00

0 20 40 60 80 100 120 140

scan number

devi

atio

n (p

p


4 006.008.00

m)

制御されたイオン量範囲

24

-8.00-6.00-4.00-2.000.002.004.00

0 2000 4000 6000 8000

TIC

devi

atio

n (p

pm

適切なイオン量によって質量分析精度が向上

13

設定分解能と測定時間の比較

12

14

Orbitrap+ Enhanced FT

Acquisition speedHz

2

4

6

8

10

Orbitrap

25

0

2

0 20000 40000 60000 80000 100000 120000

Resolusion

HCD-MS/MS: Prefilling in C-trap

RP70k256ms

17.5k64ms

MS2 MS2 MS2 MS2 MS2 MS2 MS2 MS2 MS2 MS2Full MS MS21

MS22

MS23

MS24

MS25

MS26

MS27

MS28

MS29

MS210

イオン貯め込み時間（Sec）

26

1 Full MS scan + Top10-MS/MS測定のサイクルタイム (Sec)

0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.0

14

1 Full MS scan + Top10-MS/MS = 1 secE.Coli tryptic digested 1 ug：nanoLC-MS(30k)-ddTop10(17.5k)

27

サンプルおよび測定/解析Method

Proteome Discoverer 1.3, MASCOT ver2.3

Count only rank1 peptide, FDR<1%

E.Coli / Yeastのタンパク質

・還元アルキル化（CAM）・Trypsin消化

nanoLC：Easy nLC ( Thermo scientific)nanoLC：Easy nLC ( Thermo scientific)

・Trap column：0.1x10mm, ODS (Easy column, Thermo scientific)

・Analytical column：0.075x100mm, ODS(日京テクノス)

・移動相A：水+0.1%ギ酸・移動相B：アセトニトリル+0.1%ギ酸・グラジェント：0-35%B(120min)・Flow rate：300nL/min

28

MS：Q-Exactive (Thermo scientific)

・Full MS scan：m/z300-1500 (RP70k)・ddTop10：HCD NCE30(RP17.5k)・Charge state：Z=2 and 3・Dynamic exclusion

15

四重極Q1によるIsolation widthの効果

E.Coli = 500 ng Iso width=2.0 Iso width=0.7 Iso width=0.4Input 51,746 51,644 52,012PSM 10,851 10,838 10,043

Peptide 6,123 6,219 5,894

4000

5000

6000

70006,123 6,219

5,894

p , , ,Protein 1,178 1,216 1,197

Average score 43.08 47.64 47.49

Peptide ID

Protein ID

29

0

1000

2000

3000

000

1 2 3

1,178 1,216 1,197

IsolationWidth = 2.0



同定ペプチドの質量誤差：Isolation width = 0.7

15

<15ppm :10,838 ( 100% )<5ppm : 9,598 ( 88.56% )<3ppm : 8,658 ( 79.89% )

0

5

10

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000Error( ppm )

30

-15

-10

-5Numberof peptide

16

Isolation widthによる同定タンパク質のオーバーラップ

Mascot (B2)53

78

Isolation

IsolationWidth = 0.71,216 protein

Mascot (A2)

76

83

1002


1002/1385= 72.3%

31

Mascot (C2)

52

41


E.Coliタンパク質の同定結果

E.Coli 20 ng 50 ng 100 ng 500 ngInput 42,056 45,724 46,437 54,276PSM 5,045 6,515 6,902 11,013

Peptide 3,320 4,172 4,345 5,815pProtein 787 897 933 1,162

Average score 43.44 44.01 44.57 47.26

4,000

5,000

6,000

Peptide ID

Protein ID3,320

4,172 4,345

5,815

32

0

1,000

2,000

3,000

1 2 3 420 ng 50 ng 100 ng 500 ng

787 897 933 1,162

17

同定タンパク質の再現性

50ng 1st run897 protein

50ng 2nd run885 proteinp p

807/976= 82.7%

33

500ng 1st run1,162 protein

500ng 2nd run1,176 protein

1069/1272= 84.0%

微量プロテオーム解析

Yeast protein with reported cellular copy number*

600

ins

100

200

300

400

500 10 ng

100 ng

1000 ng

umbe

r of I

nden

tifie

d P

rote

34

*Yeast cellular protein copy numbers are from Weissman and co-workers, Nature, 2003, 16, 737-41.

0

Cellular Copy Number in Log-phase Growth Cells

Nu

18

Extracted from: C:\Xcalibur\data\Zhiqi\ID_QE\20110321_10ngYeastDigest_Top10_140min_01.raw #23048 RT: 77.42 FTMS, HCD, z=+2, Mono m/z=645.83948 Da, MH+=1290.67168 Da, Match Tol.=20 mmu

L G N D D E V I L F RL G N D D E V I L F R MASCOT IonScore: 90

微量プロテオーム解析

High confidence identification from 10 ng of Yeast Digest

b₅⁺-NH₃ y₆⁺-H₂Oy₉⁺

1120 55273

y₂⁺322.18576

y₈⁺1006.51752

y₆⁺776.46594

y₁₀⁺1177.57886

y₁⁺175.11826

y₇⁺891.48932

y₅⁺647.42157

y₃⁺435.26990

y₄⁺548.35284

10

20

30

40

50

Inte

nsity

[cou

nts]

(10^

3)

L G N D D E V I L F RL G N D D E V I L F R MASCOT IonScore: 90Exp Value: 3.8 E-9

35

Peptide of YOR020C, 149 copy number, identified from 10 ng yeast digest

b₅ -NH₃498.17874

y₆ H₂O758.45410

1120.55273

200 400 600 800 1000 1200

m/z

0

10

Method of Q ExactiveFULL MS / DD-MS² (TOPN)GeneralPolarity positive Full MSMicroscans 1 Resolution 70,000 AGC target 1e6 Maximum IT 60 ms

0.075x120mm ODS column (Nikkyo tech)

測定条件

Number of scan ranges 1 Scan range 300 to 1500 m/zdd-MS² / dd-SIMMicroscans 1 Resolution 17,500 AGC target 5e5 Maximum IT 80 msLoop count 10 MSX count 1 TopN 10 Isolation window 2.0 m/zFixed first mass 140.0 m/zNCE 30.0 Stepped NCE ― dd Settings

36

Underfill ratio 0.1 %Intensity threshold 6.3e3 Apex trigger ― Charge exclusion unassigned, 1, 4 - 8, >8 Peptide match ― Exclude isotopes on Dynamic exclusion 30.0 s

LOCK MASSES445.12003 Positive 391.28429 Positive

Sample• サンプルは0.1ug/uLと0.01ug/uLとなるように0.1%FAにて溶

解・希釈しました。

• サンプルは設定濃度となるように注入量を変えて測定を行っております。

19

RT: 0.00 - 128.04

60

70

80

90

100

danc

e

54.40576.29

78.92472.77 84.39

477.3154.69576.29

52.80488.73 62.27

425.7787.47

495.2975.94590.8167.97

416 25 111.77

NL:1.37E9Base Peak F: ms MS THP1_500ng_iso07_10

500 ng

1st Isolation width 0.7

サンプル測定結果（BPC）Isolation widthの比較

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

Rel

ativ

e A

bund

416.25 966.5955.99516.8048.74

599.77 73.00581.31

46.97567.78

94.62895.95

43.99719.28 99.96

839.47 103.87851.4640.44

430.76117.58872.42

120.68947.1239.18

732.3315.06

371.1031.85

371.108.34

371.1021.49

371.103.62

371.1078.61

472.7754.27576.29

84.38477.31

61.77425.7752.53

488.73 87.35495.29

111.72966.5975.60


2nd Isolation width 2.0

37

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120Time (min)

0

10

20

30

40

50

60 590.8148.55599.77 54.96

715.41 66.01663.38 67.73

416.2560.13394.74

46.71567.78 94.58

895.9596.55

601.3143.77

719.28 90.93782.06 103.92

851.46 112.56872.91

120.68947.12

42.61510.5138.94

732.3317.44

371.1026.03

371.1013.51

371.107.35

371.10

RT: 0.00 - 126.17

20

40

60

80

100

55.66576.29 80.48

472.7786.10

477.3158.00516.80

64.85425.77

67.81442.59

77.27590.82

112.73966.59

88.95495.2954.24

488.7349.54599.76

63.09394.7422.08

371.1017.14

371.101.18

371.1011.87

371.1032.39

371.1039.46

445.1295.17

895.95101.01839.47

119.43445.12

109.45445.12


20 ng

Isolation width 2.0

サンプル測定結果（BPC）サンプル濃度の比較

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

0 55.49576.29

85.99477.31

80.53472.7757.61

516.8088.86

495.2977.28

590.8264.71

425.77 112.70966.59

53.96488.73 73.49

513.3149.26

599.7745.57

408.7362.81

394.74 97.61601.3195.37

895.95100.86839.47

104.49851.46

8.42371.10

121.12947.12

0.43371.10

30.74371.10

18.82371.10

35.16445.12

118.03872.41

27.55371.10

79.64472.77

55.16576.29 85.16

477.3163.44425.77 88.01

495.2976.44

590.8153.66

488.7366.86

442.59112.13966.59

57.05516.8049.32

599.7794.92

895.9596.99

601.3146.14

408.73104.15851.46

117.56872 41

120.77947 12

41.42514 81

34.4726.4818.4113.549.72



50 ng

200 ng

38

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120Time (min)

0

20

40

60

80

100

0851.46 872.41 947.12514.81373.23371.10371.10445.12445.12

78.61472.7754.27

576.29 84.38477.3161.77

425.7752.53488.73

87.35495.29

111.72966.5975.60

590.8148.55

599.7754.96

715.4166.01

663.38 94.58895.95 96.55

601.3143.77

719.28 103.92851.46 112.56

872.91120.68947.12

40.72522.55

17.44371.10

26.03371.10

13.51371.10

7.35371.10

31.52445.12


500 ng

20

Percolatorを使用したMASCOT検索

39

各サンプル濃度における同定結果の比較

THP-1 500ng 200ng 50ng 20ng# of MS/MS 42,169 41,347 38,296 33,724

PSM 10,891 10,054 7,071 3,901peptide hit 8,691 7,972 5,681 3,193protein hit 2,091 1,875 1,454 912

4000

5000

6000

7000

8000

9000

8,6917,972

5,681

3,193

# of protein

# of peptide

40

0

1000

2000

3000

4000

1 2 3 4500ng 200ng 50ng 20ng

2,091 1,875 1,454912

3,193

21

Isolation widthにおける同定結果の比較

THP-1, 500ng Isolation 2.0 Isolation 0.7 Isolation 0.4# of MS/MS 42,169 42,269 41,718

PSM 10,891 10,435 8,062peptide hit 8,691 8,201 6,522protein hit 2,091 2,048 1,849

5000

6000

7000

8000

9000

8,691 8,201

6,522# of protein

# of peptide

41

0

1000

2000

3000

4000

1 2 3Isolation width = 2.0

2,091 2,048 1,849

Isolation width = 0.7

Isolation width = 0.4

Qual / Quan proteome解析

Target peptide quan

22

タンパク質同定＆発現量変動解析

比較定量の手法

Label Free

SIEVE

ラベル試薬

43

TMT, SILAC, iTRAQ

N-termand K

126-131 103-97

TMT reagent (229Da)

Pierce Biotechnology is Part of Thermo Scientific

TMT (Tandem Mass Tag)

Reporter Balance

* * * * *

**

**

*

**

* *

* * * **

126 Da 129 Da

• ペプチドレベルでラベル化

• N-末端 / Kのアミノ基に結合

44

*

**

**

*

****

*

* *127 Da 130 Da

131 Da128 Da

• 多群間での比較定量が一度の分析結果から解析可能

• 同定はMS/MSから、定量もMS/MSスペクトルから解析

23

Cleavable Linker

TMT試薬を用いたタンパク質発現変動解析

Mass Reporter Mass Normalizer Reactive Group

126-131 103-97

タンパク質可溶化酵素消化

TMT126 (229Da)

45

TMT reagent (229Da) 126 103

127 102

TMT127 (229Da)TMT試薬のラベル化

Cleavable LinkerTMT2 ：２サンプルの比較

126, 127

(Normalizer : 99 - 100)


Mass Reporter Mass Normalizer Reactive Group

80

90

1000 130.1409

129.1374

MS/MS spectra129 130 TMT126 (229Da)

(Normalizer : 99 - 104)

TMT6 ：６サンプルの比較

126, 127, 128, 129, 130, 131

46

126 127 128 129 130 131 132m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

128.1341

131.1382

127.1309

126.1281126

127

128

131 126 103

127 102

TMT127 (229Da)

24

130.1409+ 1.9 ppm

129.1374- 3.0 ppm

128.1341+ 2.6 ppm

131.1382+ 1.2 ppm127.1309

+ 1 5 ppm

exp. ratio 1 : 2 : 4 : 6 : 8 : 3obs. ratio 1 : 2 : 4 : 7 : 8 : 3

126-131


b4b2

b1100

ndan

ce

130.1409

1156.6582393.2339230.1703

798.4240506.3185

m/z126 127 128 129 130 131 132

+ 1.5 ppm126.1281+ 2.9 ppmReporter

47

y1

y2

y3b6

b5

b3

a5

a4

a3

a2

a1

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 m/z0

50

Rel

ativ

e Ab

u

175.1188669.3823

365.2380

770.4313359.2400 1139.6388478.3249911.5057

641.3881246.1567 982.5510883.5048

126~131 103~97

Discovery Quan (TMT) – accuracy and precision

1.4n ra

tio

Peptide level quan error <5%CV<13%

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

observedexpected

TMT

repo

rter i

on

48

0127/126 128/126 129/126 130/126 131/126

Result from 80 ng E. Coli digest

25

Discovery Quan (TMT) - >97% of identified peptides were quantified

at 1

% F

DR

9000

10000m

ber o

f pep

tides

a

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

unique peptidetotal IDed MSMS spectraquantifiable MSMS spectra

49

Num

Amount of E. Coli digest

0

1000

2000

20ng 40ng 80ng 200ng 500ng

Accurate mass / High resolution MSでのSIM定量

• Quadrupole mass filter (Q1)• Multi plex SIM・同時に大１０チャンネルをQ1で選択

50


26

nce 40

6080

100195.0876

N=248,402 NL: 1.94E8[150.00-2000.00]

Full MS@m/z150 to 2,000S/N = 745

Selected ion monitoring: Q1 mass filter

020406080

100

Rel

ativ

e A

bund

a

020

195.0877N=20,741 NL: 1.12E8

[190.10-200.10] SIM@m/z190 to 200S/N = 5,400

3000

4000

5000

6000

ectr

um)

m/z195Caffeine

Q1 filter: 10amu

51

0

1000

2000

3000

195.082 195.084 195.086 195.088 195.09 195.092 195.094

S/N

(spe

S/N (FMS) S/N (SIM10)

Sensitivity gain 5 – 10 x with SIM mode

SIMによるペプチドターゲット定量

Qフィルターと高分解能MSによるSIMで高感度/高精度な定量

52

27

Exactive vs. TSQ Ultra - Calibration Curves

Antifungal drug curves : LC-ESI-TSQ Ultra - MS

Antifungal drug curves : LC-ESI Exactive - MS

hydroxy-Itraconazole Itraconazole Posaconazole

0 2 4 6 8 10

mg/L

Area

Rat

io

0 2 4 6 8 10

mg/L

Area

Rat

io0 2 4 6 8 10

mg/L

Area

Rat

io

Voriconazole Voriconazole-NOCaspofungin

53

0 2 4 6 8 10mg/L

Area

Rat

io

0 1 2 3 4 5

mg/L

Area

Rat

io

0 5 10 15 20 25 30

mg/L

Area

Rat

io

SIMによるペプチドターゲット定量 ( Low matrix )

4.E+09

• Low amole detection• 4 orders of linearity• CV<10% at 50amole

k A

rea)

S/N: >40

10 ng Yeastに添加したペプチド標品の検量線

2.E+09

3.E+09

Pea

k A

rea

SSAAPPPPPR*

GISNEGQNASIK*

Log 1

0(P

eak

Log10(Sample Amount) 10amole 1fmole 100fmole

54

0.E+00

1.E+09

0 50 100Sample Amount (fmole)

DIPVPKPK*

R2: 0.9991-0.9999

28

SIMによるペプチドターゲット定量 ( High matrix )

6E+08

rea) S/N: 2.5-6

• 100amol- 1fmol detection for most targets• 3 to 4 orders of linearity

1,000 ng Yeastに添加したペプチド標品の検量線

2E+08

3E+08

4E+08

5E+08

Pea

k A

rea

NGFILDGFPR*

GLILVGGYGTR*

Log 1

0(P

eak

Ar

Log10(Sample Amount) 10amole 1fmole 100fmole

55

0E+00

1E+08

0 50 100

R2: 0.9997-1.0000

Sample Amount (fmole)

まとめ

• ベンチトップ型オービトラップ “Q-Exactive” によるタンパク質の大規模解析の評価を行いました

• 新しいFTプログラム「Enhanced FT」によって高速な測定が可能なり 1MS＋10MS/MSを1秒で観測することが可能でしたり、1MS＋10MS/MSを1秒で観測することが可能でした

• Orbitrapの水冷式から、Q-Exactiveでは空冷式に変更したものの、質量精度は安定している結果が得られ、<5ppmでの同定が可能でした。

• 繰り返し測定から同定されるタンパク質の再現性は80%以上である結果を得ました。

• より発現量の少ないタンパク質の同定が可能な高感度分析が可能でした。

56

• SILACやiTRAQ、TMTなどのラベル化試薬を利用することにより大規模な同定結果と同時に比較定量結果を得ることが可能でした。

• SIMでのターゲット定量では4桁のダイナミックレンジで良好な直線性

が得られることが判りました。また、複雑なマトリクス条件下においてもamolオーダーでの定量が可能でした。

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バイオ解析チーム教育セミナー資料―質量分析9 · 5 Hyperbplic Rods (Q1) 双曲面を持つHyperbolic Rods 分解能を上げても高い透過効率を維持 円柱面を持つRound

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