FCVA/ UNESP JABOTICABAL

CURSO: Engenharia Agronômica

FUNDAMENTOS DE CROMATOGRAFIA

DOCENTE:

Profa. Dra. Luciana Maria Saran

1. CROMATOGRAFIA

1.1. Histórico

A palavra cromatografia é de origem grega (kromatos – cor; graphos – escrita) e foi usada pela 1a vez em 1906, pelo botânico russo Michael Tswett, para descrever a separação de pigmentos de plantas em zonas de cores distintas.

A partir de 1906 o uso da cromatografia se tornou

popular como um método de identificação e de separação de substâncias.

Atualmente, o método aplica-se também a substâncias

incolores, porém o nome original foi mantido.

1. CROMATOGRAFIA

1.1. Histórico

Os termos cromatograma,

cromatografia e método

cromatográfico, aparecem

em dois trabalhos de Tswett,

que descrevem suas

experiências para separar

pigmentos de folhas e gemas

de ovo, usando uma coluna

empacotada com CaCO3

finamente dividido (fase

estacionária) e éter de

petróleo (fase móvel). A

separação dos componentes

pode ser verificada por meio

de faixas coloridas na coluna.

CaCO3

éter de

petróleo

1. CROMATOGRAFIA

1.2. Fundamentos do Método

É um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura.

A separação é realizada através da distribuição dos

componentes da mistura entre 2 fases que estão em contato íntimo.

Nos processos cromatográficos estão sempre envolvidas

2 fases (fase móvel e fase estacionária), sendo que uma se locomove através de uma outra.

1. CROMATOGRAFIA

1.2. Fundamentos do Método

A fase que se move denomina-se fase móvel. Gases

e líquidos são usados como fases móveis.

A fase que não se move denomina-se fase

estacionária ou suporte. Como fase estacionária, são

empregados sólidos e líquidos.

1. CROMATOGRAFIA

1.2. Fundamentos do Método

Durante a passagem da fase móvel sobre a fase

estacionária, os componentes da mistura são

distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada

um dos componentes é seletivamente retido pela fase

estacionária, resultando em migrações diferenciais

destes componentes.

Transporte dos Componentes de uma Amostra por

uma Fase Móvel Através de uma Fase Estacionária

2. APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA

Identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes.

Purificação de compostos, separando-se as

substâncias indesejáveis. Separação dos componentes de uma mistura. Em análises qualitativas e quantitativas.

3. CRITÉRIOS PARA A CLASSIFICAÇÃO DAS DIFERENTES FORMAS DE

CROMATOGRAFIA

Forma física do sistema cromatográfico.

Fase móvel empregada.

Fase estacionária utilizada.

Modo de separação.

3.1. CLASSIFICAÇÃO PELA FORMA FÍSICA DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO

A forma física do sistema cromatográfico define a

técnica geral, ou seja, a fase estacionária pode ser colocada em um tubo cilíndrico ou disposta sobre uma superfície planar.

Cromatografia em coluna Cromatografia planar:

- cromatografia em papel (CP); - cromatografia em camada delgada (CCD).

3.2. CLASSIFICAÇÃO PELA FASE MÓVEL EMPREGADA

Considerando o estado físico da fase móvel, distingui-se: - cromatografia líquida: a fase móvel é um líquido. - cromatografia gasosa: a fase móvel é um gás. - cromatografia supercrítica: a fase móvel é um

vapor pressurizado, em temperatura acima da sua temperatura crítica.

3.2. CLASSIFICAÇÃO PELA FASE MÓVEL EMPREGADA

Cromatografia Líquida: - Cromatografia líquida clássica (CLC), na qual a fase

móvel é arrastada através da coluna apenas pela força da gravidade.

- Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), na

qual são utilizadas fases estacionárias de partículas menores, sendo necessário o uso de uma bomba de alta pressão para a eluição da fase móvel.

3.2. CLASSIFICAÇÃO PELA FASE MÓVEL EMPREGADA

Cromatografia Gasosa (CG). Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR). Obs.: A diferença entre os dois tipos está na coluna. Na CGAR são usadas colunas capilares, enquanto na CG são empregas colunas de maior diâmetro.

3.3. CLASSIFICAÇÃO PELA FASE ESTACIONÁRIA UTILIZADA

Fases estacionárias sólidas

Fases estacionárias líquidas

Fases estacionárias quimicamente ligadas

3.4. CLASSIFICAÇÃO PELO MODO DE SEPARAÇÃO

De acordo com este critério, as separações cromatográficas são devidas aos seguintes mecanismos: - adsorção - partição - troca iônica

DIFERENÇA ENTRE ABSORÇÃO E ADSORÇÃO

ABSORVER: ato de passar uma substância para o

interior da outra.

ADSORVER: ligar uma substância a uma

superfície. A superfície adsorve a substância.

Distingue-se de absorver.

FENÔMENOS DE ADSORÇÃO E ABSORÇÃO NAS ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS

Cromatografia de Adsorção

Moléculas

menores

penetram

na fase

estacionária

(gel)

Cromatografia de Exclusão

Molecular ou Cromatografia

de Penetração em Gel

4. CROMATOGRAFIA EM COLUNA

4.1. Cromatografia Líquida Clássica

Fases estacionárias mais usadas: sílica e alumina. A fase estacionária é acondicionada em tubos cilíndricos

de vidro, de diâmetros variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior.

FONTE: DEGANI, A. L.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia um Breve Ensaio. Química Nova na Escola, n. 7, p. 23, 1998.

4. CROMATOGRAFIA EM COLUNA

4.1. Cromatografia Líquida Clássica

O fluido que entra na coluna é chamado de eluente e o fluido que emerge ao final da coluna é chamado de eluato.

eluente eluato

COLUNA

entrada saída

O processo de passagem de um líquido ou de um gás por uma coluna cromatográfica é denominado eluição.

Representação Esquemática de uma Separação Cromatográfica

(a) Solução contendo os solutos A e B, colocados no topo de uma coluna empacotada com partículas sólidas e preenchida com solvente.

(b) Adição de mais solvente no topo

da coluna e escoamento da mistura pela coluna devido ao fluxo contínuo de solvente.

(c) O soluto A, com uma afinidade

maior pela fase estacionária do que o soluto B, permanece mais tempo ao longo da coluna.

Representação Esquemática de uma Separação Cromatográfica

4.2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

Baseada no uso de suporte com partículas diminutas responsáveis pela alta eficiência, as quais tornam necessário o uso de bombas de alta pressão para a eluição da fase móvel, devido sua baixa permeabilidade.

As colunas são geralmente de aço inoxidável.

Graças ao grande número de fases estacionárias existentes, é possível realizar análises e separações de uma ampla gamas de compostos com alta eficiência.

EQUIPAMENTO BÁSICO DE CLAE

a) Reservatório da fase móvel; b) Bomba de alta pressão; c) Válvula de injeção; d) Coluna; e) Detector; f) Registrador.

FONTE: DEGANI, A. L.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia um Breve Ensaio. Química Nova na Escola, n. 7, p. 24, 1998.

EQUIPAMENTO BÁSICO DE CLAE

EQUIPAMENTO PARA DE CLAE

COLUNA PARA CLAE

27

COMPARTIMENTO ONDE É INSERIDA A COLUNA

28

RESERVATÓRIO DA FASE MÓVEL

29

SISTEMA DE INJEÇÃO AUTOMÁTICA DE AMOSTRA

30

Frasco para Amostra

31

SISTEMA PARA RECEBIMENTO E ARMAZENAMENTO DOS COMPOSTOS SEPARADOS POR CLAE

32

DETECTORES

4.2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

Cromatograma: gráfico que mostra a resposta do detector em função do tempo de eluição.

O cromatograma é útil para análises qualitativas e quantitativas. A posição dos picos no eixo do tempo podem ser empregadas para identificar os componentes da amostra, enquanto as áreas dos picos provêm uma medida quantitativa da quantidade de cada uma das espécies.

O tempo de retenção, tr, para cada componente é o tempo necessário, a partir da injeção da mistura na coluna, para que o componente alcance o detector.

CROMATOGRAMA MOSTRANDO A SEPARÇÃO DOS ENANTIÔMEROS DO TETRAMISOL

FONTE: DEGANI, A. L.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia um Breve Ensaio.

Química Nova na Escola, n. 7, p. 24, 1998.

5. CROMATOGRAFIA GASOSA

Mecanismo de separação: baseado na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária (líquido não volátil ou sólido).

É muito atrativa devido a possibilidade de detecção em

escala de nano a picogramas (10-9 – 10-12 g). Principal limitação da técnica: necessidade de que a

amostra seja volátil ou termicamente estável. Os gases usados como fase móvel devem ter elevada

pureza e ser inertes em relação a fase estacionária. Os gases mais usados são: H2, N2 e He (gases de arraste).

5. CROMATOGRAFIA GASOSA

Nesta modalidade de cromatografia uma amostra líquida

volátil ou gasosa, é injetada através de um septo (um

disco de borracha) para dentro de uma entrada de

injeção aquecida, onde é rapidamente vaporizada. O

vapor é arrastado através da coluna por meio de um gás

de arraste (He, N2 ou H2) e os analitos separados fluem

pelo detector, cuja resposta é observada em um

computador.

DIAGRAMA ESQUEMÁTICO DE UM CROMATÓGRAFO A GÁS

39

CROMATÓGRAFO A GÁS

Forno da Coluna

40

CROMATÓGRAFO A GÁS

Coluna

41

FORNO DE UM CROMATÓGRAFO A GÁS

Coluna

42

ENTRADAS PARA INJEÇÃO DA AMOSTRA

43

SERINGAS PARA INJEÇÃO DE AMOSTRAS LÍQUIDAS

44

SERINGA PARA INJEÇÃO DE AMOSTRA GASOSA

45

CROMATOGRAMA NA TELA DO MONITOR DO COMPUTADOR ACOPLADO AO CROMATÓGRAFO

46

5. CROMATOGRAFIA GASOSA

Classificação: - Cromatografia Gás-Líquido (CGL)

. Fase móvel: gasosa

. Fase estacionária: líquido não-volátil que recobre a coluna internamente ou um suporte sólido finamente dividido

. Mecanismo de separação: partição

47

5. CROMATOGRAFIA GASOSA

Classificação: - Cromatografia Gás-Sólido (CGS)

. Fase móvel: gasosa

. Fase estacionária: sólida . Mecanismo de separação: adsorção

48

5. CROMATOGRAFIA GASOSA São empregadas colunas capilares estreitas e compridas,

feitas de sílica fundida(SiO2) recobertas com poliimida (um plástico capaz de resistir até 350ºC) para suportar e proteger a coluna da umidade atmosférica.

Colunas:

. Diâmetro interno: 0,10 a 0,53 nm

. Comprimento: 15 a 100 m, sendo comum com 30 m

(a) Dimensões normais de uma coluna capilar por cromatografia a gás. (b) Coluna de sílica fundida . O diâmetro da armação que suporta a coluna, é de 0,2 m (ou 20 cm) e os comprimentos usuais da coluna são de 15 a 100 m.

49

COLUNA CAPILAR PARA CROMATOGRAFIA GASOSA

COLUNAS CROMATOGRÁFICAS USADAS EM CG

(a) (b) (c)

(a) Coluna capilar de parede recoberta: caracteriza-se por um filme, com a espessura de 0,1 e 0,5 µm, da fase estacionária líquida sobre a parede interna da coluna.

(b) Coluna capilar recoberta

com um suporte: tem partículas sólidas, presas na parede interna da coluna, recobertas com a fase estacionária líquida.

(c) Coluna capilar com camada porosa: contém uma fase estacionária sólida sobre a parede interna da coluna. Neste caso, as partículas sólidas são a fase estacionária ativa.

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OUTROS TIPOS DE COLUNA PARA CG

REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UM CROMATOGRAMA GASOSO, MOSTRANDO COMO SÃO MEDIDOS OS TEMPOS DE RETENÇÃO

6. ANÁLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA

A análise quantitativa em cromatografia é baseada em estabelecer o valor da área da banda cromatográfica.

Na CG e na CLAE a banda é registrada como um pico

que, idealmente deve ter formato gaussiano. A área do pico é proporcional a quantidade da

substância na amostra analisada. Equipamentos com integradores eletrônicos, dispensam

a medida manual da área dos picos.

6. ANÁLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA

Cálculo da área do pico: a área do pico pode ser calculada traçando-se tangentes dos dois lados do pico. A intersecção destas duas tangentes com a linha de base fornece um triângulo cuja área pode ser calculada pela seguinte fórmula:

A = (a . wb)/2

Na equação acima:

A = área do pico a = altura do pico wb = largura do pico na linha de base

6. ANÁLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA

Construção da Curva Analítica ou Curva de Calibração:

1. Preparam-se várias soluções da substância a ser quantificada, em diferentes concentrações.

2. Obtém-se o cromatograma correspondente a cada

uma delas. 3. Em um gráfico relacionam-se as áreas obtidas com as

concentrações e a partir do gráfico, pode-se calcular a concentração desta substância na amostra.

CURVA ANALÍTICA OU CURVA DE CALIBRAÇÃO

CURVA ANALÍTICA OU CURVA DE CALIBRAÇÃO

2 4 6 8 10 12 14 16

100

120

140

160

180

200

220

Y = 91,31 + 8,49XÁre

a (

mm

2)

C (g L-1)

C (g L-1) Área

(mm2)

2,8 117

5,7 135

8,4 162

11,2 194

14,1 207