Fatores de transcrição Foxo e indução de células T reguladoras

Djalma Jonilson

Jaqueline

Origem de células T reguladoras no timo e na periferia

Workman et al. Cell Mol Life Sci (2010) 66, 2603-2622

Vias de sinalização que convergem para a indução de Foxp3

Existe uma rede transcricional que determina a expressão de foxp3 e outros genes relacionados

às células T reguladoras?

Identificação molecular, estrutura e padrão de expressão do gene fkh (fox)

As proteínas expressas pelo gene fkh estão localizadas no núcleo

e portanto podem agir como um reguladores transcricionais

6

Subfamílias das protíenas Fox 15 Subfamílias classificadas de acordo com sua homologia

Kaestner, K. H., et al. Genes Dev. 2000 14: 142-146

Modificações pós-traducionais nos fatores de trancrição Foxo

Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

NES: Sequência de exportação nuclearNLS: sinal de localização nuclear

Funções dos fatores de transcrição FoxO nas células e organismos

Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

Regulação dos fatores de transcrição FoxO

Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

Regulação dos fatores de transcrição FoxO

Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

Interação entre FoxO e outros fatores de transcrição

Indução de genes pró-apoptóticos Inibição de genes relacionados ao ciclo celular

Indução da expressão de genes supressores de tumor

ER: Receptor nuclear de estrógenoCalnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

Remodelamento da cromatina por proteínas FoxO

Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288

Regulação de genes envolvidos na migração e homeostase de células T por Foxo1

Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

(Naive) (Ativadas)

Papel de proteínas FoxO na ativação e diferenciação de células T

Ouyang, W., et al. Immunity (2009) 30, 358-371

Outra funções de proteínas FoxO em células T

Peng, S. L. Oncogene (2008) 27, 2337-2344

Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

Modelo provável de diferenciação de nTregs no timo

Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33

Controle molecular da diferenciação de células T reguladoras induzida por TGF-β

OBJETIVO

Avaliar as funções de Foxo1 e Foxo3 em linfócitos T, principalmente no que se refere ao desenvolvimento de funcionalidade de Tregs.

Qual o efeito da deleção de Foxo1 e/ou Foxo3 em linfócitos T?WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-

Foxo1+/-Foxo3-/-

Foxo1-/-Foxo3-/-

Expressão Foxo Score

clínico

Histologia

8 semanas

A deleção de Foxo1 e Foxo3 em linfócitos T de camundongos resultou em caquexia, esplenomegalia, linfadenopatia, grande infiltrado de células mononucleares em órgãos vitais, aumento do título de

autoanticorpos e falecimento precoce dos animais, demonstrando um papel cooperativo de Foxo1 e Foxo3 na proteção contra uma desordem inflamatória fatal.

ELISA

Quais são as causas da imunopatologia observada em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-?

WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-

Foxo1+/-Foxo3-/-

Foxo1-/-Foxo3-/-

FACS

6 a 8 semanas

A desordem inflamatória observada em camundongos de 6 a 8 semanas está associada com a expansão específica da população de células CD4.

CD4

CD8

Qual é o fenótipo e função das células CD4 em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-? WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-

Foxo1+/-Foxo3-/-

Foxo1-/-Foxo3-/-

6 a 8 semans

Isolamento CD4 (FACS)

Foxo1 e Foxo3 desempenham função crítica na inibição da ativação e diferenciação de linfócitos T, mais especificamente a diferenciação em células CD4 efetoras

do tipo Th1 e Th17.

FACS

PMA+iono (4h)

FACS

Como é a diferenciação de Tregs em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-?

WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-

Foxo1+/-Foxo3-/-

Foxo1-/-Foxo3-/-

FACS (timo e baço)

3 semanas

timo

baço

timo baço

Em camundongos deficientes de Foxo1 e Foxo3 é possível observar menor frequência e número total de células T reguladoras no timo e no baço.

Como é a sobrevivência e proliferação das Tregs na ausência de Foxo1 e Foxo3?

FACS

WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-

Foxo1+/-Foxo3-/-

Foxo1-/-Foxo3-/-

Tregs

Cultura com FITC-VAD-FMK

FACS

3 semanas

Camundongos com 6 semanas

As Tregs deficientes de Foxo1 e Foxo3 apresentam sobrevivência semelhante às Tregs WT e maior proliferação.

WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-

Foxo1+/-Foxo3-/-

Foxo1-/-Foxo3-/-

Tregs

CD4 naive – CFSEAnti – CD3Esplenócitos irradiados (72h)

FACS

3 semanas

Como é a funcionalidade das Tregs in vitro e in vivo na ausência de Foxo1 e Foxo3?

FACS

CD4 T naive (4x105 )

Tregs WTTregs Foxo1-/-Foxo3-/-

(1x105)

Rag1 -/-

Mudança de pesoDesenvolvimento de colite

Foxo1 e Foxo3 são necessários para a função supressiva de células Treg.

6 semanas

Quais são os genes regulados por Foxo1 e Foxo3? WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3-/-

Tregs baço (FACS)

Extração e amplificação

RNA

Hibridização Affymetrix

603 sondas analisadas (genes assinatura Treg)

189 sondas com diferença de expressão

(1.5)

• 33 genes positivamente correlacionados com a expressão de Foxp3 downregulados no DKO

• 3 genes negativamente correlacionados com a expressão de Foxp3 upregulados no DKO

• Sem mudanças na expressão de Foxp3, CTLA4 e CD25

• Maior expressão de genes correlacionados à proliferação celular• Maior expressão de genes codificantes para receptores de citocinas do padrão

Th1 e Th17 (IL-12, IL-18, IL-1 e IL-17)• Maior expressão de genes de fatores de transcrição (STAT1, Rorc, Rora e Ahr)

Devido à expressão semelhante de Foxp3 em Tregs WT e DKO, Foxo1 e Foxo3 podem controlar a expressão de uma série de genes assinatura de Treg

independentemente da expressão de Foxp3.

3 semanas

Os defeitos de Tregs deficientes para Foxo1 e Foxo3 são responsáveis pela imunopatologia observada em camundongos?

Foxo1-/-Foxo3-/- (CD45.2)

WT Tregs (CD45.1)(3x105)

FACS (Treg e CD4)

V

CD4

Os defeitos funcionais de Treg contribuem para o fenótipo inflamatório em camundongos deficientes de Foxo1 e Foxo3, sendo que estes também têm função na

supressão da expressão de citocinas inflamatórias nas Tregs.

3-4 dias

8 semanas

Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 no controle de doenças autoimunes sistêmicas causadas por deficiência de Tregs?

BM scurfy (2x106 )

BM WTBM Foxo1-/-Foxo3-/-

(2x106)

Rag1 -/-

SobrevivênciaFACS

Foxo1 e Foxo3 são essenciais para a geração de um compartimento efetivo de Tregs para evitar a ativação de linfócitos T scurfy.

6ª 8 semanas

Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 na diferenciação de Tregs no timo?

WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3-/-

Isolamento CD4 timo

Cultura IL-2, anti-CD3 e anti-CD28 por 18 ou 54h

(TGF-β)

Expressão Foxp3 (FACS)Expressão mRNA Foxp3 (RT-PCR)

3 semanas

BM WT (2x106 ) CD45.1

BM Foxo1-/-Foxo3-/-

(2x106) CD45.2

Rag1 -/-

FACS Tregs timo

Foxo1 e Foxo3 podem controlar a transcrição e expressão de Foxp3 em Tregs do timo.

6ª 8 semanas

Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 na diferenciação de Tregs na periferia?

WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3-/-

Isolamento CD4 periferia(naive)

Cultura IL-2, anti-CD3 e anti-CD28 por 54h com ou sem TGF-β

Expressão Foxp3 (FACS)Expressão mRNA Foxp3 (RT-PCR)

3 semanas

Foxo1 e Foxo3 podem controlar a transcrição e expressão de Foxp3 em Tregs induzidas por TGF-β.

Foxo1 e Foxo3 se ligam no gene de Foxp3 para controlar a transcrição?

WT

Isolamento CD4 e Tregs (Foxp3+)

Preparação cromatina

Incubação com Ab anti-foxo1 e anti-foxo3

3 semanas

Precipitação com beads de proteína A agarose

PCR do precipitado

Anti-Foxo1 Anti-Foxo3

rVISTA tool

Foxo1 e Foxo3 interagem com o gene de Foxp3 e, possivelmente, podem controlar a sua transcrição.

Objetivo: Avaliar o papel dos fatores de transcrição Foxo na diferenciação de linfócitos.

Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1?

Animais com 3, 8 ou15 semanas

foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO

Citometria de fluxo CD44, CD69Linfocitos CD4+ TCRb+

LN, baço

Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1?

Animais com 8 semanas

foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO

Linfocitos CD4+ TCRb+Incorporação de BrdU

LN, baço

Linfocitos CD4+ TCRb+PMA+IonomicinaElisa

Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1?

Foxo1 é essencial na prevenção a ativação sistêmica e patológica de linfócitos T.

Animais com 8 semanas

foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO

HE- infiltrado celularParalisia de membros posteriores

Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1?

Animais com 3,8 ou 15 semanas

foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO

LN, baço

Linfócitos B B220+Citometria de fluxo GL-7 e FAS

Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1?

Animais com 8 semanas

foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO

Quantificação de Igs e anticorpo anti DNA dupla fita.

Soro

Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1?

Animais com 8 semanas

foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO

Linfócitos T CD4+ CD44hiCitometria de fluxo CXCR5, PD-1, CD62L

Cxcr5-Tfh

LNBaço

Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1?

A ausência de Foxo1 é capaz de induzir uma autoimunidade dependente de Linfócitos B (aumento de células no centro

germinativo, anticorpos circulantes, Tfh, expressão de il21 e Bcl6)

Animais com 8 semanas

foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO

Linfócitos T CD4+ CD44hi do LNRT-qPCR Prdm1, Bcl6 e Il21.

LN

A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T?

Animais com 8 semanas

foxo1f/ f- Cd4Cre foxo1f/f – foxo1f/ f- Il7ra tgCd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg

Linfócitos T CD4+Citometria de fluxo CD44, CD69.

Fatores Foxo regulam 7Ilra

A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T?

Animais com 8 semanas

foxo1f/ fCd4Cre foxo1f/f foxo1f/ f- Il7ra tgCd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg

Linfócitos T CD4+Citometria de fluxo CD44, CD69.

A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T?

A expressão de IL-7Ra não é capaz de prevenir a ativação de linfócitos T na ausência de de foxo1 (não é conseqüência de

alteração homeostática).

Animais com 8 semanas

foxo1f/ f- Cd4Cre foxo1f/f – foxo1f/ f- Il7ra tgCd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg

LN, baço

Linfócitos B B220+Citometria de fluxo GL-7 e FAS

A ausencia de Foxo1 interfere com as tolerâncias : central periférica ou dominante?

Transferência Medula óssea foxo1f/ f CD45.1Cd4Cre foxo1f/f CD45.1/2 E na proporção 1:4 WT:KO

Tcra-/-CD45.2

após 8 semanas

Linfócitos T CD4+Citometria de fluxo CD44, CD69., Foxp3

A ausência de Foxo1 interfere com as tolerâncias : central periférica ou dominante?

Foxo1 controla a tolerância dominante de células T (Tregs).

Transferência Medula óssea foxp3- foxo1f/ f+ foxp3-Cd4Cre foxo1f/f+ foxp3+

Tcra-/-CD45.2

após 6 semanas

Linfócitos T CD4+Citometria de fluxo CD44, CD69, Foxp3

Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg?

Animais com 8 semanas

foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO

Citometria de fluxo Foxp3, CTLA-4 CD25 e CD62L.

Timo

Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg?

periferia

Animais com 8 semanas

foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO

Citometria de fluxo Foxp3, CD44, CD103 CD62L CD127

Linfócitos CD4+ TCRb+

LN, baço

Foxp3+

Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg?

Foxo1 controla a homeostase e o desenvolvimento de célula nTreg (diminuição de CTLA-4, CD-25 e CD62L).

Animais com 8 semanas

foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO

Linfócitos CD4+ TCRb+Citometria de fluxo CTLA-4

LN

Naive

Estimuladas3 dias aCd3 aCD28 e TGFb

Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg?

foxo1f/ f- WtER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno

Linfócitos naives CD4+ Cd69- Cd25- foram isoladas

Citometria :Proliferação CFSEExpressão de Foxp3 após 3 dias de tratamento com TGFb ou não

Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg?

foxo1f/ f- WtER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno

Linfócitos naivesCD4+ Cd69- Cd25- foram isoladas

Citometria :Expressão de Foxp3, CTLA-4, CD25 , IFN-g após 3 dias de tratamento com TGFb ou não

Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg?

Foxo1 controla a responsividade de célula iTreg na TGF-b (diminuição de CTLA-4 CD-25 e CD62L).

foxo1f/ f- WtER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno

Linfócitos naives CD4+ CD69- CD25- foram isoladas dos animais LN

Co- cultura células CD45.1 WT Naives também de LN

Citometria :Expressão de Foxp3,GITR g após 3 dias de estímulo com TGFb, aCD3 e aCD28

Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?

Animais com 8 semanas

CD4Cre-Cd4Cre foxo1f/f foxo3kca/kca

HE- infiltrado celularImunofluorescencia a dsDNA

Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?

Animais com 8 semanas

foxo1f/f foxo3f/fCd4Cre foxo1f/f foxo3f/f

Citometria de fluxo CD44, CD69Linfócitos CD4+ TCRb+

Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?

Animais com 8 semanas

foxo1f/f foxo3f/fCd4Cre foxo1f/f foxo3f/f

LN, baço

Linfócitos B B220+Citometria de fluxo GL-7 e FAS

Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?

Foxo3 e Foxo1 possuem papeis sobrepostos no desenvolvimento e função de linfócitos t reguladores derivados do timo apesar de não serem necessários para

expressão e manutenção de Foxp3.

Animais com 8 semanas

foxo1f/f foxo3f/fCd4Cre foxo1f/f foxo3f/f

Linfócitos T CD4+citometria de fluxo CD25, FOxp3 eTCRb

Treg periférica

Timo

LN

foxo1f/f foxo3f/fCd4Cre foxo1f/f foxo3f/f