1

11

Farmakokinetické modelovanie

a vývoj liečiv

V. Frecer

Katedra fyzikálnej chémie liečiv FaF UK

Povinne voliteľný predmet, 4. akademický rok, LS, 2P/1S

2019/2020

Prednáška 1 & 2

2

Zoznam prednášok:

• Prednáška 1,2 - Úvod do farmakokinetiky - pohyb a osud liečiva vorganizme, výskum liečiv. Molekulová štruktúra a farmakokinetické parametre

• Prednáška 3 - Fyzikálnochemické princípy distribúcie látok

• Prednáška 4 - Farmakokinetické modely dispozície liečiva

• Prednáška 5 - Kompartmentové farmakokinetické modely

• Prednáška 6 - Nelineárne farmakokinetické modely

• Prednáška 7 - Perfúzne farmakokinetické modely

• Prednáška 8 - Fyziologické farmakokinetické modely

• Prednáška 9 - Farmakokinetické modely účinku liečiva na receptor

• Prednáška 10 - Metódy predpovedania transportných vlastností látok

Obsah predmetu

1

2

2

3

Literatúra

Odporúčaná literatúra:

• ATKINS, Peter W. – DE PAULA, Julio: Physical Chemistry: Thermodynamics, Structure, and Change, 10th Ed., Oxford University Press, Oxford, UK, 2014.

• BOROUJERDI, Mehdi: Pharmacokinetics and Toxicokinetics, CRC Press, Boca Raton, FL, U.S.A. 2015.

• DOSTÁLEK, Miroslav a kol.: Farmakokinetika, Grada, Praha, ČR, 2006.

• JAMBHEKAR, Sunil S. - BREEN, Philip J.: Basic Pharmacokinetics, 2nd Ed., Pharmaceutical Press, London, UK, 2012.

• KERNS, Edward H. - DI, Li: Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods, Elsevier, Burlington, MA, U.S.A., 2008.

• PATRICK, Graham L.: An Introduction to Medicinal Chemistry, 5th Ed., Oxford University Press, Oxford, UK, 2013.

• REMKO, Milan: Molekulové modelovanie. Princípy a aplikácie, Slovak Academic Press, Bratislava, SR, 2000.

• REMKO, Milan: Základy medicínskej a farmaceutickej chémie, Slovak Academic Press, Bratislava, SR, 2005.

• ZATHURECKÝ, Ladislav a kol.: Biofarmácia a farmakokinetika, Osveta, Martin, SR, 1989.

4

Prednáška 1

Úvod do farmakokinetiky:

Pohyb a osud liečiva v organizme

Výskum liečiv

Molekulová štruktúra a farmakokineticképarametre

3

4

3

5

Farmakokinetika

Farmakokinetika – štúdium časového priebehu koncentrácie liečiva a jeho

metabolitov v organizme

Absorpcia Distribúcia Metabolizácia Exkrécia

eliminácia

Podaniep.o.i.m.s.c.

Krv

cirkulácia Pečeň

biotrans-formácia

Vylučo-vanie

močstolica

orgány

tkanivá

receptory

i.v.

absorpcia

6

Farmakokinetické termíny

Základné farmakokinetické pojmy:

◼ Absorpcia - prechod liečiva z miesta podania do krvného obehu;

podiel z dávky, ktorý prenikne črevnou stenou do krvného obehu (v %)

◼ Distribúcia – proces, počas ktorého dochádza k rozptýleniu alebo rozdeleniu

liečiva z krvného obehu do tkanív a orgánov tela

◼ Metabolizmus – chemická premena liečiva v živom organizme na iné zlúčeniny

biochemickými pochodmi enzymatického pôvodu

◼ Exkrécia – eliminácia, klírens - proces, počas ktorého sa ktorého sa organizmus

zbavuje liečiva a jeho metabolitov vylúčením von z tela;

množstvo krvi, ktoré sa zbaví liečiva za jednotku času (v ml/s)

◼ Dávka - množstvo liečiva (v g, ml, ...) podaného na dosiahnutie terapeutického

účinku

◼ Perorálna biologická dostupnosť -

podiel z dávky liečiva, ktorý sa dostane

do systémového krvného obehu

(po I. fáze metabolizácie v pečeni)

◼ Distribučný objem – podiel

dávky a počiatočnej koncentrácie

liečiva v krvnej plazme

5

6

4

7

Pohyb a osud liečiva v organizme

absorpcia

metabolizmus

distribúcia

väzba

exkrécia

liek liečivo

rozpustené

viazaný

metabolit voľný

liečivo viazané

voľné

vylúčený

vylúčené

GITkožasvalypľúca

telesné tekutinya tkanivá

močstolica

žlčdych

sliny, pot

Zathurecký L. a kol.: Biofarmácia a farmakokinetika, 1989.

biologickýúčinok

Farmakodyna-mická fáza

interakcia liečivo-

-receptorv mieste účinku

liečivo dostupné pre

účinnosť

biologická dostupnosť

Farmakokine-tická fáza

absorpcia

distribúcia

metabolizmus

exkrécia

väzba

liečivo dostupné pre

absorpciu

farmaceutická dostupnosť

Farmaceutická fáza

dezintegrácialiekovej formy

rozpúšťanieuvoľnenie aktívnej formy

Extravaskul.podanádávkaliečiva

Interakcia liečiva s organizmom:

8

Prestup liečiv biologickými membránami

Model bunkovej

membrány:

fluidná dvojvrstvafosfolilidov

(fosfatidylcholín)s proteínmi

hrúbka: 75 – 100 nm

membránovékanály - póry

priemer:~4 nm

Bates TR, Gibaldi M. Biopharmaceutics. Lea & Febiger, Philadelphia, USA, 1970.

Prestup liečiv:

▪ pasívna difúzia molekúl cez membránu (lipofilné látky, nedisociované polárne molekuly, logPo,w, pKa), hnacia sila: koncentračný gradient

▪ prestup látky pórmi bunkovej m. (rozpustné elektrolyty a ióny do priemeru póru, závisí od náboja v ústí póru, d < 4 nm, Mw < 200 Da)

▪ transport pomocou špecifických nosičov (aktívny transport proti koncentr. a elektrochem. grad., facilitovaná difúzia v smere konc. a elektrochem. grad.)

▪ pinocytóza (veľké molekuly obalené membránou)

7

8

5

9

Disociácia a prestup liečiv membránami

B[100]

OH- BH+

[1]

Spolu: [101]

B[100]

BH+ OH-

[1]

Spolu: [101]

pH = 7,0

slabá báza pKa =5,0 slabá báza pKa =5,0

B[100]

OH- BH+

[1]

Spolu: [101]

B[100]

BH+ OH-

[10000]

Spolu: [10100]

pH = 7,0 pH = 7,0 pH = 3,0

Disociácia: kys. AH + H2O H3O+ + A- báza B + H2O BH+ + OH-

pKa=-log[H3O+][A-]/[AH] Henderson-Hasselbach: pKa – pH = log[AH]/[A-]

pKa – pH = log[BH+]/[B]

pKa – pH = 5 – 7 = -2 kyselina [A-] = 100 a [AH] = 1

báza [BH+] = 1 a [B] = 100 (pKb = 14 - pKa = 14 – 5 = 9)

pKa – pH = 5 – 3 = 2 kyselina [A-] = 1 a [AH] = 100

báza [BH+] = 100 a [B] = 1

Difúzia: cez membrány len neutrálna nedisociovaná forma, rovnováha v každej fáze

10

Absorpcia liečiv

Absorpcia liečiv z GIT do krvného obehu

▪ absorpcia závisí od štruktúry a fyzikálnochemických vlastností molekúl

▪ Lipinského „Rule of five“ - perorálna biodostupnosť: Mw < 500 Da,

5 HB prot. don., 10 HB prot. akcep., logPo/w 5 (2245 perorál. liečiv z WDI, 1997)

▪ Vlastnosti, ktoré určujú ADME

- molekulová štruktúra (zloženie, topológia, 3D-štr.)

- molekulová hmotnosť Mw,

- polárny a hydrofóbny molekulový povrch Ap An,

- počet vodíkových väzieb HBpd a Hbpa,

- počet rotovateľných väzieb Nrot,

- rozdeľovací koeficient oktanol/voda logPo/v,

- rozpustnosť vo vode logSv,

- hemato/encefalický rozdeľovací koeficient logPBB,

- permeabilita Caco-2 buniek,

- väzba na proteíny v sére logKsp,

- väzba na sérum albumíny logKhsa,

- počet možných metabolických reakcií

Lipinski CR. et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 23, 3-25 (1997).

absorbcia molekúl liečiva v tenkom čreve

molekulová štruktúra určuje fyzikálnochemické vlastnosti látok

9

10

6

11

Význam ADME vlastností pre vývoj liečiv

Podiel ADME/Tox vlastností na neúspešnom skončení projektov:

ADME

- nepriaznivý farmakokinetický profil (39 %)

Toxicita

- toxicita na zvieratách (11 %)

- nepriaznivé vedľajšie účinky u ľudí (10 %)

12

Predpovedanie ADME vlastností liečiv

Fyzikálnochemické vlastnosti určujú ADME (W. Jorgensen)

- rozdeľovací koeficient oktanol/voda logPo/v, QikProp

- rozpustnosť vo vode logSv,

- hemato/encelafický rozdeľovací koeficient logPBB,

- väzba na sérum albumíny logKhsa,

Fyzikálnochemické vlastnosti vypočítané pom. molekulovej mechaniky (MM), kvantovej chémie (QM), počítačových simulácií, ... sa korelujú s experimentálnymi veličinami (logPo/v, logSv, ...) pre veľké súbory látok (700 molekúl z toho 500 liečiv)

QikProp, Schrödinger, release 2016-4 , LLC, New York, NY,

U.S.A. 2016.

Duffy EM, Jorgensen WL. J. Am. Chem. Soc. 122, 2878-2888

(2000).

Jorgensen WL, Duffy EM. Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 1155-

1158 (2000).

11

12

7

131313

Výberochorenia

izolácia proteínusúvisiaceho s

ochorením

nájdenie molekulypôsobiacej na

proteín

preklinickétestovanie

syntéza účinnej látky (scale up)

formulácialieku

klinické testovanieschválenie lieku

(FDA, EMEA)

drug in clinical practice

◼ preskúmať moleklárne mechanizmy spojené s ochorením (biochémia,

identifikácia pharmacologického targetu, …)

◼ izolácia proteínu, určenie kryštálovej štruktúry, protein homology

modeling, nájdenie väzbového miesta , …

◼ racionálny dizajn liečiv, kombinatoriálna chémia, virtuálny skríning, QSAR,

identifikácia aktívnej látky (lead compound), …

◼ Vývoj nového lieku: ~15 rokov, náklady: >800 mil. US$

Fázy vývoja liečiva

14

Fázy vývoja liečiva

Bogdan B, Villiger R.: Valuation in Life Sciences, 2nd ed. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg (2007).

Vývoj nového liečiva: ~15 rokov, náklady: >800 mil. US$

13

14

8

15

selektivita

účinnosť toxicita

metabolizmus

absorpcia

exkrécia

distribúcia

potenciálneliečivo

Vlastnosti vyžadované od liečiv

Vývoj liečiv - multidisciplinárny projekt

• genetika

• bunková a molekulárna biológia

• štruktúrna biológia

• biochémia

• počítačový molekulový dizajn

• farmaceutická chémia

• toxikológia

• farmakokinetika

• chemická technológia

• klinická farmakológia

• medicína

16161616161616

Príspevok farmakokinetiky k vývoju liečiv

Identifikácia a validácia miesta pôsobenia

Genetika, Molekulová biológia

Bioinformatika

Určenie 3D štruktúry

Kryštalografická analýza

NMR spektr., Homologické mod.

Farmaceutická chémia

Organická syntéza

Kombinatorická chémia

Chémia peptidov

Biologické testovanie

High throughput skríning

in vitro, in vivo testovanie

Molekulový dizajn

Molekulové modelovanie

Počítačová chémia

Počítačová grafika

Optimalizácia aktívnych mol.

QSAR, Toxikológia, ADME

Klinické testovanie

Farmakológia, farmakokinet.

Nájdenie aktívnych ligandov

Skríning databáz

15

16

9

171717

◼ Simulácie založené na silových poliach (force field)

◼ Kvantovochemické výpočty

◼ QSAR analýza

◼ Modelovanie proteínov na základe homológie

◼ Molekulová diverzita

◼ Dizajn kombinatorických knižníc

◼ In silico skríning

◼ Molekulové kotvenie (docking)

◼ Predpovede väzby ligandu na receptor

◼ Modely farmakofórov

◼ Predpovedanie ADME vlastností

◼ Solvatácia

◼ Analýza dát (data mining)

◼ Bioinformatika

◼ Chemoiformatika

◼ Molekulová grafika

Metódy počítačového vývoja liečiv

18

Kombinatorická (paralelná)

syntéza (rovnaká príprava)

• v tuhej fáze

• v roztoku

103-105 látok/experiment

Tradičná (sériová) syntéza

1 chemik =

~50 látok/rok

A + B AB

BmA1 B1

A2 B2

A3 B3

. .

. .

An(kyseliny)

Bm(amíny) n x m (amidy)

B1 B2

A2

A1

An

HTS

Tradičný a kombinatorický výskum liečiv

17

18

10

191919

Dizajn virtuálnych kombinatorických knižníc

3D štruktúra

proteínu

farmakofór

trieda

proteínov

žiadne

informácie

zacielená rozmanitá

Info

rmácie

o t

arg

ete

Dizajn založený

na štruktúre

Dizajn založený

na farmakofóre

Redukované knižnice

(Targeted Sets)

Prvotné knižnice

(mol. diverzita)

Veľkosť knižnice

Chemický priestor: ~1050 - 1080 látok Arpád Furka, 1981

(čas trvania vesmíru od Veľkého tresku: ~5.1018 s)

2020

Stratégie dizajnu liečiv

2020

Metódy výskumu

a vývoja liečiv

Známa aktívna látka?

Áno Nie

Známa 3D štruktúra receptora

?

Nie

A

Dizajn založený na farmakofóre, QSAR

Zacielené malé knižnice

Náhodné testovanie,

HTS

Veľké rôznorodé knižnice

Áno

B

Dizajn založený na 3D štruktúre

receptora

Zacielené malé knižnice

C

Dizajn založený na molekulových fragmentoch

Knižnice fragmentov

Tradičný dizajn:

individuálne

látky

Kombinatorický

dizajn:

knižnice látok

19

20

11

21

A) Dizajn založený na aktívnych ligandoch

(Ligand-based drug design, LBDD)

• Neznáma 3D štruktúra receptora

• Dizajn založený na známych ligandoch:

- prehľadávanie databáz ligandov (farmakofór)

- kvantitatívne vzťahy štruktúra-aktivita (QSAR)

- 3D-QSAR analýza (CoMFA)

donor

akceptor

záporný náboj

hydrofóbna

Free – Wilson QSAR analýza: biologická aktivita je výsledkom príspevkov od jednotlivých substituentov

3D vrstevnicová mapa v okolí kumarínu a inhibítorov cytochrómu P450 2A5

22

Dizajn založený na farmakofóre

Farmakofór - priestorové usporiadanie súboru funkčných skupín alebo častí molekuly, ktoré sú nositeľom jej biologickej aktivity

Použitie:

- Skríning databáz –

• nová molekulová štrukúra, ktorá zodpovedá

farmakofóru

donor

akceptor

náboj negat.

hydrofóbna

Farmakofór tymidínmonofosfát kinázyM. Tuberculosis

prekryv s navrhovaným inhibítorom

Keita M, et al.: RSC Adv. 4(99), 55853-55866 (2014).

21

22

12

23

Kvantitatívne vzťahy štruktúra - aktivita, QSAR

• QSAR: chemické, fyzikálne, biologické vlastnosti (aktivita) – zakódované v chemickej štruktúre

- podobné molekuly ~ podobné vlastnosti, odlišné molekuly ~ odlišné vlast.

- model aktivity

biologický účinok = f(molekulovej štruktúry)

* mechanizmus účinku

* predpovedanie aktivít analógov

Molekulová vlast. Deskriptor

Lipofilita p, logPo/w, Rt

Stérické vlastnosti Mw, Vm, tieňový ind., 3D des.

Elektronické vlast. q, sd, EHOMO, ELUMO, E.A.

Štruktúra, topológia HB, W, logZ, ,

Biologický efekt Deskriptor

Väzba na receptor štruktúrne, elektronické, topol.

Perorálna biodostupnosť lipofilita, štruktúrne, stérické d.

Metabolická aktivácia štruktúrne, elektronické d.

24

Metódy QSAR:

- L.P. Hammett, R.W. Taft disociačné konštanty aromatických kyselín

pK = pKo - .s

- S.M. Free, J.W. Wilson biol. aktivita: suma príspevkov substituentov

log(1/C) = a.(prísp.R1)+b.(prísp.R2)+...

- C. Hansch, A. Leo biol. aktivita: lipofilita, stérické a elektronické p.

log(1/C) = a.π2 + b.π + c.Es +d.s + e

Kvantitatívne vzťahy štruktúra - aktivita, QSAR

iteratívny postup výberu

deskriptorova QSAR modelu

Metódy:genetické algoritmy

neurónové sietestrojové učenie

(machine learning)a pod.

23

24

13

25

3D kvantitatívne vzťahy štruktúra-aktivita(3D-QSAR)

QSAR modely:

- 2D-QSAR modely – deskriptory odvodené z molekulovej štruktúry

- 3D-QSAR modely (CoMFA, CoMSIA, CoMMA,...) deskriptory z hodnôtmolekulových polí (MEP, hydrofóbne interakcie, ...) v okolí molekuly

CoMFA modely závisia od kvality preloženia/prekrytia (alignment) molekúl:

prekrytie podľa farmakofóruprekrytie podľa atómov

prekrytie podľa tvaru molekuly prekrytie podľa molekulových polí

26

B) Dizajn založený na štruktúre receptora

(Structure-based drug design, SBDD)

Trojrozmerná štruktúra farmakologického cieľa (miesta pôsobenia):

• röntgenová štruktúrna analýza kryštálov proteínov (Protein Data Bank, ~149 tis. 3D štr. makromolekúl, feb. 2019)

• NMR štruktúra proteínov v roztoku

• homology modelling

Výber ligandov:

• in situ modifikácie známych ligandov

• molekulové kotvenie nových molekúl(docking, in silico skríning)

IAV N1 neuraminidáza–oseltamivir (2HU0) hemagglutinin IAV H18N11 (4MC5)

25

26

14

27

Dizajn založený na štruktúre receptora - SBDD

Interakcie ligandu vo väzbovom mieste receptora a dizajn ligandu:

• komplementarita L a R (stérická, molekulových polí)

• desolvatácia L a R

• entropické efekty

A B

C D

www.kubinyi.de

väzbovémiesto

receptora

ligand 1

Odhad väzbovej afinity ligandu na receptor:

výpočet Gibbsovejvoľnej energie tvorby komplexu LR

DGo = -RTlnKi

molekulovépolia

ligand 2

tvar väzbového miesta štruktúra väzbového miesta

komplementarita ligandu a väzbového miesta

28

Dizajn založený na štruktúre receptora - SBDD

Faktory, ktoré prispievajú k rozpoznaniu a väzbe ligandu:

π-π interakcie

hydrofóbnekontakty

explicitnémolekuly vody

vodíkové väzby(smerové interakcie)

stérické interakcie

flexibilita ligandua receptora

desolvatácia ligandua receptora

peptidomimetickýinhibítor plasmepsinu II

27

28

15

292929

Modelovanie homologických proteínov

Počet dostupných 3D štruktúr makromolekúl (proteínov, nukleových kyselín, komplexov,...) je limitovaný

• PDB (160,000 X-ray a NMR štruktúr na úrovni atómového rozlíšenia), 148,000 proteínov, len 30000 sekvencií s <30% identitou

• podobná a.a. sekvencia → podobná 3D štruktúra (celkový tvar overall fold) → podobná funkcia proteínu

• štruktúra proteínov je yachvávaná viac ako sekvencie medzi homologickými proteínmi (do 30% identity sekvencií)

• modelovanie proteínov na základe homológies so známym (target) proteínom

- výber templete proteínu (nájdenie evolučných súvislostí)

- prekrytie target-templates sekvencií (alignment)(BLAST, FASTA, PFAM, protein threading RaptorX,…)

- prekrytie target-templates štruktúr a skonštruovanie modelu(generovanie kostry proteínu, modelovanie slučiek (loops), priradenie konformérov bočným reťazcom a..a., vzpresnenie) (Modeller, Jackal, SCRWL, SwissModel, …

- hodnotenie modelu (What If, ProCheck, PSQS, Ramachandran plot,…)

303030

Sali A, Kuriyan J.: Trends Biochem. Sci. 22, M20–M24 (1999)

Kvalita homologických modelov závisí najmä na:

- výber template proteínov

- prekrytie a sekvencií a ichpodobnosť k template proteínom

- rozlíšenie kryštálovej štruktúrytemplate proteínu

- metóda modelovania a vypresnenia modelovej štruktúry

Modelovanie homologických proteínov

29

30

16

31

Väzbová afinita ligandu na receptor

Modely väzby ligand-receptor:

- Teória zámku a kľúča (Lock and key)- Teória indukovaného prispôsobenia (Induced fit theory)

ligand (L) + receptor (R) → ligand-receptor (LR) komplex

+

Farmakodynamický efekt ligandu:

kas kf kdis [LR] [L]L + R LR LR* Kd = —— Rel. odozva = —— = ————

kdis k-f kas [Ro] [L] + Kd

väzbová afinita farmakol. disociačná účinok závislý na dávke Lefekt konštanta

[L] – konc. voľného ligandu

Väzbová afinita L: lnKd = DGo/RT vlastnosť komplexu LR

32

Predpovedanie väzbovej afinity ligandov

Molekulové modelovanie – výpočet väzbovej afinity – modelovanie LRaq

pKd = -log10Kd = aDGcom,aq/2,303RT + b

Termodynamický cyklus:

DGcom,g

Lg + Rg LRg plynná fáza

Gsol(L) Gsol(R) Gsol(LR)

DGcom,aq

Laq + Raq LRaq vodný roztok

Gibbsova voľná energia tvorby LRaq:

DGcom,aq = [Gg(LR) - Gg (L) - Gg (R)] + [Gsol(LR) - Gsol(L) - Gsol(R)]

kde:Gg = Etot + termálne korekcie vnútornej energie a entropie

31

32

17

33

Výpočet interakcií ligand-receptor

• Energie molekúl a medzimolekulové interakcie:

- kvantovochemické met. (QM)

- molekulovo mechanické met. (MM, force fields)

- hybridné QM/MM metódy

- hodnotiace funkcie (scoring functions)

• Molekulové simulácie, štatistický spriemernené veličiny:

- MC simulácie, MD simulácie

- konformačné prehľadávanie

• Solvatácia:

- explicitné modely (diskrétne molekuly rozpúšťadla)

- implicitné mod. (GBSA - Still et al., PB - Honig et al., PCM - Miertuš et al.)

• Modely odhadu DGcom,aq využívané vo výskume liečiv:

- MM-PBSA/GBSA (Kollman et al.)

- LIE (Åqvist et al.)

- MM-PCM (Frecer, Miertuš)

- …

34

Metódy počítačovej chémie

Kvantovochemické metódy (ab initio, semiempirické, DFT)

Schrödingerova rovnica

ĤΨ(r1,…,rn,R1,…,RN) = EΨ(r1,…,rn,R1,…,RN)

Ĥ – Hamiltonov operátor celkovej e., Ψ – vlnová funkcia (pozorovateľné fyzikálne

veličiny), E – energia molekuly, ri, Ri – polohové vektory elektrónov a jadier

I. R. Levine

hyperplocha E(r,R)

Science 2007;315:1561-1565.

propanal

33

34

18

3535

Metódy počítačovej chémie

Molekulová mechanika - potenciálna energia molekuly

U(x1,…,x3N) = ½∑vkv(l-lo)2 + ½∑uku(θ-θo)

2 +

+ ½∑tVnt[1+cos(nω-γ)] +

+ ½∑i∑j(qiqj/εrij) +

+ ½∑i∑j[Aij/rij12-Bij/rij

6] +

Konštanty silového poľa (force field): parametrizácia (experiment, ab initio výpočty)

+ ½∑i∑j[Cij/rij12-Dij/rij

1 0]

Molecules 2014;19(10):15735

väzbová

neväzbová

elektrostatická

disperzno-repulzná

36

Metódy počítačovej chémie

Hybridné kvantomechanické/molekulovo mechanické metódy (QM/MM):

• Väzbové miesto – QM región

Schrödingerova rovnica: ĤΨ = EΨ

• Telo proteínu – MM región

molekulová mechanika: E = väzbové + neväzbové členy

• Solvent – MM región

- explicitná hydratácia (MM)

- implicitná hydratácia – klasické modely (Born, Jano, PCM, PB, GBSA, ....)

• Prepojenie QM a MM častí proteínu (dummy atómy, atomóvé frozen orbitály, ...)

Nobelova cena za chémiu 2013: QM/MM metódyM. Karplus, A. Warshel, M. Levitt

35

36

19

37

Model implicitnej solvatácie(Polarizable Continuum Model, PCM)

MEP na molekulovom povrchu imidazolu

Solvent – spojité homogénne polarizovateľné médium (dielektrická konštanta)

Reakčné pole – elst. interakcia s molekulou v kavite

Kvantovochemický model a:

Gsol,els = <Ψ|Ĥo+VRF|Ψ> - <Ψo|Ĥo|Ψo> - ½ <Ψ|VRF|Ψ>

Klasický model b:

Gsol,els = ½ j (qj VRF,j – mj ●ERF,j)

a Miertus S., Scrocco E., Tomasi J. Chem. Phys. 55(1), 117-129 (1981).

Miertus S., Tomasi J. Chem. Phys. 65(2), 239-245 (1982).

b Frecer V., Miertus S. Int. J. Quant. Chem. 42(5), 1449-1469 (1991).

Miertus S., Frecer V. J. Math. Chem. 10(1), 183-204 (1992).

vdW kavita - aminopropanón

38

Molekulové simulácie

• Experimentálne biologické aktivity:

Ki, IC50 - termodynamické veličiny merané pre veľké súbory molekúl

(V = 1μL, c = 1 μM 6·1011 molekúl enzýmu pri [T, p])

(makroskopické veličiny spriemernené cez najpravdepodobnejšie konfigurácie štatistického súboru v termálnej rovnováhe)

• Predpovedanie Ki, IC50 pomocou výpočtov väzbovej afinity (lnKi = -DG°bin/RT):

spriemernenie DG°bin cez štatistický súbor rôznych konfigurácií: DG°bin

• Výpočet termodynamických veličín - molekulové simulácie:

- Monte Carlo simulácie

- molekulová dynamika

dihydrofolátreduktázav periodickom boxe s vodou

37

38

20

39

Monte Carlo simulácie

• MC simulácie:

- prehliadanie konfiguračného priestoru (sampling) pomocou generovania stavov Ai (náhodnými zmenami vnútorných súradníc)

- výpočet spriemernených fyz. chem. veličín: A = 1/n·∑i

nAi

- konfigurácia Ai+1 sa generuje z konfigurácie Ai (Markov chain)

- konfigurácia Ai+1 sa prijme do štatistického súboru ak: Ei+1 < Ei

ak : Ei+1 > Ei generátor náhodných čísel (0<R<1)

Boltzmannova pravdepodobnosť stavu Ai+1 (Metropolis importance sampling)

• R > exp[-(Ei+1-Ei)/kT] Ai+1 sa prijme

• R < exp[-(Ei+1-Ei)/kT] Ai+1 sa odmietne

Tapia L, et al.: Bioinformatics 23(13), i539-i548 (2007).

Evolúcia populáciíkonformácií pri

zbalení proteínu (protein folding)

Monte Carlo simulácia

40

Molekulová dynamika

• Molekulová dynamika:

- metóda štatistickej mechaniky: simulácia vývoja zložitých systémov, výpočet časovo spriemernených fyzikálnochemických veličín

- generovanie MD trajektórií (konfigurácií systému) - numerická integrácia Newtonových pohybových rovníc (dt = 1 fs) v konštantne sa meniacom potenciáli (silovom poli):

fxi = miaxi = mi(d2xi/dt2) = -∂U(x1,…,x3N)/∂xi

axi(t) = fxi/mi vxi(t+dt) = vxi(t) + axi(t)·dt

xi(t+dt) = xi(t) + vi(t)·dt + ½ ai(t)·dt2

U(x1,…,x3N) – potenciálna energia (FF)

xi = xi(t), vi = vi(t) i= 1, ..., 3N

trajektória

van Eijk M, et al.: J. Biol. Chem. 287, 26666-26677 (2012).

časový priebeh RMSD slučky prasacieho a ľudského

surfactant protein D (collectin)

39

40

21

41

Molekulová dynamika

• Aplikácie molekulovej dynamiky:

- výpočet termodynamických veličín systému - stredné hodnoty štat. súb.

Ā = 1/n·∑i

nAi

- kinetické veličiny

- konformačné prechody

- vypresnenie štruktúry systému

- sledovanie dynamického chovania makromolekúl: termálne fluktuácie

Programy: CHARMM, AMBER, GROMOS, NAMD, GROMACS, MacroModel, Tinker, ...

Snímky proteínu v rôznych časových okamihoch MD simulácie

Dôsledkom termálnych fluktuácií je, že proteíny „dýchajú“,

čo môže viesť aj k prechodom medzi rôznymi konformáciami

42

Molekulové kotvenie (Docking)

• Virtuálny (in silico) skríning knižnice látok:

- 3D štruktúra makromolekulového receptora

- väzbové miesto ligandu

- kotvenie: generovanie póz (poloha a konformácia ligandu vo väzbovom mieste receptora)

- hodnotiace funkcie (scoring functions)

- hodnotenie (bodovanie) póz

- selekcia perspektívnych ligandovpre syntézu a testovanie

Plasmodium falciparum enoyl-acyl carrier protein reductase

Aktívne centrumPfENR

Prekrytie generovaných póz vybraných analógov triclosanu

Frecer V., Megnassan E., Miertus S. Eur. J. Med. Chem. 44(7), 3009-3019 (2009).

41

42

22

43

Molekulové kotvenie (Docking)

• Hodnotiace funkcie (scoring functions) :

- založené na potenciálových funkciách (AMBER, CHARMM, MMFF, OPLS, ..)fyzikálne „správne“, vhodné pre organické molekuly,

- empirické založené na početnosti výskytu určitého druhu interakcií

- knowledge-based analýza kryštálových štruktúr komplexov LR,preferujú najčastejšie interakcie a geometrie

• Známe hodnotiace funkcie:

AutoDock, LigScore, ChemScore, GlideScore, PLP, PMF, LUDI, FlexXMMFF(tot, vdW), OPLS(tot, vdW), HINT, ICM, Validate, DrugScore, ...

• Kotvenie do rigidného a flexibilného receptora

Kitchen, D. B., et al.: Nat. Rev. Drug Discov. 3, 935-949 (2004).

Moitessier, N. et al.: Brit. J. Pharmacol. 153, 7-26 (2008).

44

C) Dizajn založený na molekulových fragmentoch

(Fragment-based drug design, FBDD)

• Ligand sa konštruuje z „fragmentov“ vo väzbovom mieste receptora

- fragment - malá molekula (<300 Da), slabšia väzba v kapse aktívneho centra, pospájanie linkermi do väčšej molekuly (500-700 Da)

- zachovanie pozícií fragmentov v molekule

Hajduk PJ, et al.: J. Am. Chem. Soc. 119(25), 5818-5827 (1997).

Ki = 17 mM Ki = 20 μM

Ki = 15 nM

SAR by NMRvývoj nepetidických

inhibítorov metaloproteinázy

stromelysin

fragment 1 fragment 2

linker

www.kubinyi.de

43

44

23

45

Dizajn založený na molekulových fragmentoch

Hunk A, et al.: Angew. Chemie Int. Ed. 48(45), 8452-8456 (2009).

inhibítor panthotenát syntázy M. tuberculosis

vyvinutý pomocou FBDD

• FBDD sa skladá z 3 krokov:

- dizajn kvalitnej knižnice fragmentov

- molekulové kotvenie, hodnotenie a zoradenie fragmentov

- nárast, kombinácia a spájanie fragmentov do výsledného ligandu

• Softvér pre FBDD:

- GRID, MCSS, SPROUT, MUSIC, LUDI, SkelGen, Superstar, SEED, FFLD, GANDI, eHiTS, Caveat, HOOK, Recore, Allegrow, Confirm, MED-SuMo, LEGEND, GROWMOL, LigBuilder, SMoG, HOOK, PRO_LIGAND, SPLICE/RACHEL, CLIX, LORE, GEMINI, ...

46

Príklady dizajnu bioaktívnych látok s využitím molekulového modelovania

45

46

24

47

Kubinyi H., In: Computer Applications in Pharmaceutical Research and Development, Ekins S. (Ed.), John Wiley & Sons, Inc., (2006).

Liečivá vyvinuté pomocou metód molekulového modelovania:

▪ Dorzolamide (Trusopt – Merck, 1995)Inhibítor karbonickej anhydrázyterapia glaukómu, očné kvapky

▪ Imatinib (STI-571, Gleevec, Glivec – Novartis, 2001)

Inhibítor tyrozín kinázy, terapia nádorových ochorení (chronická myelogénna leukémia)

▪ Nelfinavir (AG1343, Viracept - Aguron Pharm., Pfizer, 1997)

Inhibítor aspartickej proteázy HIV-1 vírusuterapia HIV-1 infekcie a AIDS

Príklady úspešného molekulového dizajnu liečiv

48

Prípadové štúdie – počítačový dizajn liečiv

47

48

25

49

Príklad 1. Dizajn inhibítorov proteázy HIV-1 vírusu

Dizajn peptidomimetických inhibítorov aspartickej proteázy HIV-1 (HIV PR)

kryštálová štruktúra HIV PR s inhibítorom XV-638 (1BV9)

HIV PR esenciálny enzýmnevyhnutný pre dozrievanie vírusov

Vybrané inhibítory HIV-PRschválené FDA

HIV-1 vírus

50

Získaná rezistencia HIV-1 vírusov

mutácie, ktoré spôsobujú získanú rezistenciu HIVvírusov na inhibítory PR

Virálna rezistencia na liečivá vzniká pod selekčným tlakom:

- známe mutácie PR

R8K, R8Q, V32I, K45I, M46I/M46L/M46F, I47V, G48V, F53L, A71V, V82A/V82I/V82T, I84V, L89M a kombinácie

Potreba vyvíjať nové inhibítory, ktoré pôsobia na širšie spektrum mutantov HIV PR

49

50

26

51

SBDD: Peptidomimetické inhibítory

- SBDD inhibítorov, kryštálová štruktúra komplexu PR-I z PDB

- Vypresnenie štruktúry komplexov: MM, MD

- MM a PCM: predpovedanie väzbovej afinity (DGcom)

- QSAR model pre tréningový set: pIC50 = -logIC50 = a.DGcom + b

- Derivatizácia in situ najlepších inhibítorov z trening. setu

- Počítačová predikcia ADME vlastností analógov

- Selekcia najlepších analógov pre syntézu

-5

-3

-1

1

-2 8 18 28

pIC

50

ex

p

DDGcom

Training Set: correlation equation

pIC50 = -0.1577·ΔΔGcom + 0.1536n = 10, r2 = 0,86, σ = 0,59, F-test = 44,6

Tréningový set inhibítorov

Frecer V, Berti F, Benedetti F, Miertus S. J. Mol. Graphics Modell. 27(3), 376-378 (2008).

Inhibítor FP23 v aktívnom centre HIV PR

Peptidomimetické inhibítory HIV PR

Tri série C2-symetrických HIV PR inhibítorov:

- obsahujú nerozštiepiteľné izostéry peptidickej väzby

(pripravené v spolupráci s Univerzitou v Terste, Taliansko)

dihydroxyetyléndiamínové jadro--Phe-Ψ[CHOH-CHOH]-Phe--

hydroxyetyléndiamínové jadro--Phe-Ψ[CH2-CHOH]-Phe--

dihydroxyetyléndiamínové jadro--Phe-Ψ[CHOH-CHOH]-Pro--

Lopinavir, Abbott Laboratories

51

52

27

53

Peptidomimetické inhibítory HIV PR

dihydroxyetylénediamínové jadro --Phe-Ψ[CHOH-CHOH]-Phe--

12 štruktúr navrhnutých

Frecer V, Miertus S, Tossi A, Romeo D. Drug Des. Disc. 15(4), 211-231 (1998).

Burello E, Bologa C, Frecer V, Miertus S. Mol. Phys. 100(19) 3187-3198 (2002).

5454

hydroxyetylénediamínové jadro --Phe-Ψ[CH2-CHOH]-Phe--

32 štruktúr navrhnutých

Frecer V. Miertus S. Macromol. Chem. Phys. 203(10-11), 1650-1657 (2002).

Frecer V, Jedinak A, Tossi A, Berti F, Benedetti F, Romeo D, Miertus S. Lett. Drug Des. Disc. 2(8), 638-646 (2005).

T17 v aktívnom centre HIV PR

Peptidomimetické inhibítory HIV PR

53

54

28

555555

Dihydroxyetylénediamínové jadro --Phe-Ψ[CHOH-CHOH]-Pro--

79 štruktúr navrhnutých

Frecer V, Berti F, Benedetti F, Miertus S. J. Mol. Graphics Modell. 27(3), 376-378 (2008).

FP23 najlepší navrhnutý kandidát

FP23 v katalytickom centre HIV PR

priaznivé ADME vlastnosti

Peptidomimetické inhibítory HIV PR

56

Experimentálne overenie predpovedaných inhibičných účinností anti-HIV

peptidomimetík: skupina F. Benedetti a F. Berti, Univerzita v Terste

Potvrdené inhibičné konštanty v oblasti nízkych nanomolárnych koncentrácií

Syntéza a testovanie inhibítorov HIV PR

Frecer V, Jedinák A, Tossi A, Berti F, Benedetti F, Romeo D, Miertus S. Lett. Drug Des. Disc. 2(8), 638-646 (2005).

Berti F, Frecer V, Miertus S.: Curr. Pharm. Des. 20(3), 3398-3411 (2014).

55

56

29

5757

zvýšenýdrug-likecharakter

Syntéza a testovanie inhibítorov HIV PR

Experimentálne overenie predpovedaných inhibičných účinností anti-HIV

peptidomimetík: skupina F. Benedetti a F. Berti, Univerzita v Terste

Potvrdené inhibičné konštanty v oblasti nízkych nanomolárnych koncentrácií

Frecer V, Berti F, Benedetti F, Miertus S. J. Mol. Graphics Modell. 27(3), 376-378 (2008).

Berti F, Frecer V, Miertus S.: Curr. Pharm. Des. 20(3), 3398-3411 (2014).

5858

Plasmodium falciparum – virulentná forma malárie v krajinách tretieho sveta

Rezistentné formy P. falciparum – potrebné nové “dostupné” liečivá zacielené proti novým farmakologickým targetom

Target - enzýmy FAS-II biochemickej syntézy mastných kyselín

enoyl-acyl carrier protein reduktáza esenciálny enzým FAS-II pathway (PfENR)

kryštálová štruktúra PfENR s peptidomimetickým inhibítorom TCL11

Freundlich JS, et al. J. Biol. Chem. 282(35), 25436-25444 (2007).

séria PfENR inhibítorov odvodených od triclosanu, aktívne v nanomolárnych koncentráciách

Príklad 2. Kombinatorický dizajn inhibítorov

Anopheles gambiae

57

58

30

5959

- predpoveď väzbovej afinity: kotvenie inhibítorov do kryštálovej štruktúry PfENR-TCL11 (IC50 =76 nM)

- QSAR model pre tréningový set: pIC50 = -logIC50 = a.LUDI + btarget specific scoring function LUDI (prispôsobená pre PfENR)

- predpoveď ADME vlastností

- QSAR model aplikovaný na in silico skríning kombinatorickej knižniceanalógov

inhibítory PfENR tréningového setu

pIC50 = -6.3473 + 0.0069·LUDI

n = 16, R2 = 0.83, F-test = 65.7

Enoyl-acyl carrier protein reduktáza - P. falciparum

aktívne centrum PfENR

V. Frecer, E. Megnassan, S. Miertus, Eur. J. Med. Chem. 44(7), 3009-3019 (2009).

6060

Kombinatorická knižnica inhibítorov

60

Peptidomimetický skafold, 3 R-groups

počiatočná diversity library

40 (R1) x 23 (R2) x 11 (R3) =

= knižnica10120 analógov

zacielená knižnica

8 (R1) x 5 (R2) x 3 (R3) =

= knižnica120 analógov

R-groups zacielenej (výslednej) knižnice

Kombinatorická knižnica - 3 substitučné miesta R1, R2, R3

8 R1 5 R2 3 R3

59

60

31

61

Navrhnuté inhibítory PfENR

Vybrané štruktúry najlepších kandidátov na inhibítory PfENR

Frecer V, Megnassan E, Miertus S. Eur. J. Med. Chem. 44(7), 3009-3019 (2009).

TCL-40-9-11 preložená s TCL11

Predpovedaná IC50 = 13 nM

62

Ďakujem za pozornosť

61

62

32

63

Spolupracovníci:ICS-UNIDO, UCM University of TriesteS. Miertuš D. Romeo

F. BenedettiInternational Fellows F. BertiE. Burello (Italy) A. TossiS. DeNardi (Italy) S. PriclC. Bologa (USA) A. Jedinák (Slovakia) National University of SingaporeA. Nair (India) J.L. DingE. Megnassan (Ivory Coast) B. HoM. Keita (Ivory Coast) D.H.P. LowM. Kabeláč (Czech Rep.) D. Cerin (Slovenia) University of MilanR. Kothamarti (India) P. SeneciL. Owono (Cameroon) T. Udommaneethanakit (Thailand) Xeptagen, VeniceT. Rungrotmongkol (Thailand) G. FassinaM. Malaisree (Thailand) P. PengoD. Kong (China) L. Beneduce

63