シグマ アルドリッチMISSIONreg RNAi 総合カタログ

The life science business of Merck operates as MilliporeSigma in the US and Canada

掲載製品　 shRNA　 siRNA　 esiRNA（endoribonuclease prepared siRNA）　 miRNA（microRNA）

標的スクリーニング（Target ID）用MISSION miRNAライブラリー

MISSION shRNA

シグマ アルドリッチの RNAi 技術で

確実な遺伝子発現抑制と

効率的なターゲットスクリーニングが

実現します

3 UTRスクリーニング用MISSION miRNAライブラリー

MISSIONreg siRNAMISSION esiRNA

shRNAMISSION shRNA 概要 4MISSIONshRNA フォーマット選択ガイドおよび実験プロトコル 7選択用抗生物質（ピューロマイシン）濃度の最適化方法 9レンチウイルス感染効率評価方法10MISSION shRNA クローンご注文情報（価格納期等） 11MISSION shRNA クローンご注文方法 12コントロール shRNA 13shRNA パッケージングプラスミドならびに関連製品 14レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズ ExpressMag 15カスタム shRNA 用ベクター 16IPTG 発現誘導用 shRNA ベクター 17ゲノムの特定領域上への shRNA 導入用ベクター 18スクリーニング用 MISSION shRNA ライブラリー概要 19MISSION shRNA ライブラリーによる全ゲノムスクリーニング 20遺伝子機能別 shRNA ライブラリー 21プール型全ゲノム shRNA ライブラリー 22カスタム shRNA ライブラリー 23

siRNAMISSION siRNA 概要 24カスタム siRNA 26in vivo 用 siRNA 27遺伝子機能別 siRNA ライブラリー 28小容量 siRNA （ヒトキナーゼ用ならびにフォスファターゼ用） 29

esiRNAMISSION esiRNA（プール型 siRNA） 30lncRNA ノックダウン用 MISSION esiRNA 32

miRNA成熟 miRNA ミミック 33MISSION 合成 miRNA インヒビター 34MISSION レンチウイルス型 miRNA インヒビター 35ヒト miRNA ターゲット網羅的探索用 3 UTR ライブラリー 36ヒト miRNA ターゲット確認用 3 UTR クローン 37miRNA 検出定量試薬 38

大腸菌グリセロールフォーマットおよびレンチウイルスフォーマットの MISSION RNAi 製品は全て「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」（通称カルタヘナ法）に基づく使用規制対象品です当該製品をご使用の際は関連法規に則り適切に取り扱ってください施設申請に必要な製品の詳細情報は sigmacomrnai-jp にてご確認ください

shRNA

4

製品特性および仕様 網羅的な shRNA コレクション

約 250000 のクローニング済み shRNA コンストラクト ヒト約 20000 以上マウス約 21000 以上の標的遺伝

子を網羅MISSION shRNA ライブラリーの概要は RNAi に最適なレンチウイルスをベースとしたシステム

一過性ノックダウン 安定的ノックダウンのどちらにも応用可能

導入用のウイルス粒子もラインアップゲノムへの組み込みによる長期的ノックダウン非分裂細胞を含むほぼ全ての細胞種に導入可能インターフェロン応答を回避するデザイン組み換えによる導入配列の変異は認められておりません106 ～ 107 TUmL の高力価

高効率なノックダウン効果が得られる shRNA デザインBroad Institute のアルゴリズムによる配列特異性およ

び設計位置に基づいたスコアリング1 遺伝子あたり約 5 クローンで標的遺伝子を広範囲にカ

バー表現型レスキュー実験用の 3 UTR 領域にデザインした

shRNA も提供可能

様々なオプションを選択可能ベクターの変更（15 種類）

マーカー遺伝子詳細（16 ページ）タイターの変更（106-109 TUmL）ボリューム変更（01-10 mL）

トランスフェクションが困難な細胞や非分裂細胞での RNAi 実験やまたは効果的で高品質の長期ノックダウン実験系にはshRNA の利用が最適ですThe RNAi Consortium （TRC）とシグマ アルドリッチがさまざまな shRNA ソリューションをお届けします

TRC はマサチューセッツ工科大学とハーバード大学の合同出資により設立された研究機関であるブロード研究所（Broad Institute）に拠点を置き研究者や研究団体に RNAi ツールを提供するための世界的に有名な学術機関とライフサイエンス研究組織から構成されるコンソーシアムですシグマ アルドリッチはTRC のメンバーおよび協力パートナーとしてヒトおよびマウスのゲノムを標的とする TRC shRNA レンチウイルスライブラリー技術に基づいた高品質の製品とサービスをご提供できるよう努めています

ハイスループット（HT）に最適のシステムHT ウイルス作製ハイスループットスクリーニングおよびハイコンテントスク

リーニングの実績あり

信頼性の高い製造システム最先端のロボットバーコードおよび LIMS による追跡管理文書の使用研究開発製造品質管理および品質保証の専門家か

らなる熟練のスタッフ

豊富な製品フォーマットプールドタイプのウイルス全ライブラリー（LentiPlexreg）遺伝子ファミリーセットターゲットセットおよび単一クローン大腸菌グリセロールプラスミド DNAレンチウイルスパー

ティクルの 3 種類のフォーマット

レンチウイルス shRNA 製品のリーダー高い先端技術力に裏打ちされた製品とサービス広範囲にわたるウェブベースのリソース技術および研究開発の専門家による充実したサポート

TRC2 クローンはシグマ アルドリッチの独占販売です約 50000 クローン以上の新規クローン数千遺伝子の新規ターゲット遺伝子30000 以上のバリデート済みクローン

あらゆる細胞への安定したRNAiを実現MISSIONreg shRNA概要

バリデートデータと保証の範囲保証の範囲

MISSION shRNA は Broad Institute によって開発された独自のアルゴリズムに基づいてクローンセット中1 クローン以上が 70 以上のノックダウンレベルを示す事を保証します

保証の条件保証は下記条件を全て満たした場合のみ適用となりますクローンセット（11 ページ）をご購入いただいた場合適切なコントロールにてノックダウンを検証済みの場合実験系でノックダウンが確認されなかった場合は導

入された shRNA が十分に発現している事を確認した場合

ノックダウンが確認されなかったら下記何れかの方法で対応させていただきます

別のクローンを 1 つ無償提供別の製品によって金額相当の無償提供金額相当のご返金弊社営業またはテクニカルサポートまでご連絡ください

バリデートデータとはバリデートデータはBroad Institute にて 50以上のノックダウン効果を示したものを表示しておりますこれらのデータは表示の手法表示の細胞において検証されたノックダウンレベルとなりますお客様の実験系におけるノックダウンレベルを保証したものではありません予めご了承ください

shRNA

5

ウイルスデリバリーシステムウイルスは様々な細胞株に感染するよう独自に進化を遂げてきましたその特長を利用してここ数十年間興味のある遺伝子を安全に標的細胞にデリバリーするためのベクター開発に向け種々のウイルスの遺伝子操作が行なわれてきましたそれぞれのウイルスシステム（Table 1）はそれぞれ利点と欠点を持ちますがレンチウイルスシステムではすべての用途で望ましいウイルスベクターとなる非常に多くの特長を持ちます現在のレンチウイルスシステムは複数世代の組換えと修飾により得られたレトロウイルスシステムの一種です

Feature Adeno-virus AAV Retro-

virusLenti- virus

非分裂細胞への感染 宿主ゲノムへの安定的な組み込み シュードタイプ作製 長いフラグメントの挿入 インターフェロン応答の回避 ゲノム内に転写サイレンシングに関する問題がない NA

Adeno-Associated Virus

Table 1 ウイルスシステムの比較

レンチウイルスシステム概要レンチウイルスシステムには遺伝子のデリバリーに特に有用となる多くの特性（広範な親和性安定的な組み込みなど）がありますFigure 1 は野生型レンチウイルスのライフサイクルを示しています野生型ウイルスが細胞に侵入し組み込みウイルス遺伝子を発現させることにより新しいビリオンを形成することが可能となります安全性を確保し導入遺伝子を挿入する十分な領域を確保するために今日のシステムではウイルス粒子の産生に必要なウイルス遺伝子を複数のプラスミド上に分けて組み込んでいます（Figure 2）トランスファーベクターは改変 Long Terminal Repeat（LTR）領域の間にシグナル配列とシス作用性配列を持ちますshRNA選択マーカーなどの導入遺伝子はトランスファーベクターの非ウイルスプロモーターの後方へクローニングされますウイルスの構造および複製に必要なすべての遺伝子は別のパッケージングベクター（通常 1 ～ 2 個）に搭載しますこれらの遺伝子にはさまざまなバージョンのウイルスgag オペロンおよび pol オペロンがあります通常さらに安全性を高めるためすべての野生型アクセサリー遺伝子を除去します最後にエンベロープベクターによりウイルス粒子の親和性を決定するエンベロープタンパクが供給され多彩な可能性を示す様々なシュードタイプウイルスが得られますシグマ アルドリッチでは広範な親和性を確保し非分裂細胞および最終分化細胞を含むほぼすべての細胞型に導入するために主に VSV-G（水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク）を持つシュードタイプウイルス粒子としております

Attachment

EntryMaturation

Assembly ampBudding

RNA Transcript

Export

Synthesis of viral Proteins Release of

Viral RNA

ReverseTranscription

ViralcDNA

Integration ofViral cDNA

Wild-TypeLentiviral Particles

Transcription

Figure 1野生型レンチウイルスの生活環

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

TransferVector

PackagingVector Packaging

Plasmids

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

PackagingVector

EnvelopeVector

EnvelopeVector

Assembly ampBudding

Maturation

Figure 2組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

MISSION Lentiviral Packaging Mix（14ページ）

Attachment

Entry

MISSIONLentiviralParticle

NO Virion Production

Release ofViral RNA

ReverseTranscription

Viral cDNA

Integration ofViral cDNA

Exported shRNA

Enter RNAiPathway Transcription

Figure 3MISSIONreg TRC shRNAレンチウイルス粒子による標的細胞への導入

shRNA

6

5 -

3 - UU

Sense Strand

Antisense Strand

Sense StrandCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT T T T TGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAA

Antisense StrandLoop

Loo

p

cPPT

TRC2-pLKO-puro7518 bp

hPGK

puroR

WPRE

pUC ori

RRE

SIN3rsquo LTR

RSV5 LTR

U6

f1 oriampR

Psi

TRC shRNA ベクターマップおよび特徴

RSV5rsquo LTR Chimeric LTR involved in replication and integration U3 substitution for safety

Psi (ψ) Packaging dimerization signal

RRE Involved in nuclear export of viral genome transcript during packaging

U6 Robust pol III promoter with precise initiation and termination of shRNA transcription at high levels

cPPT Role in cDNA synthesis and nuclear import in target cell

hPGK Promoter driving expression of puromycin resistance gene hPGK is weaker than U6 for assurance of high shRNA expression levels in stable selected cells

puroR Allows stable selection with puromycin

SIN3rsquo LTR LTR involved in replication and integration U3 deletion for safety

WPRE Woodchuck Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Element

5 -

3 - UU

Sense Strand

Antisense Strand

Sense StrandCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT T T T TGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAA

Antisense StrandLoop

Loo

p

cPPT

pLKO1-puro7086 bp

hPGK

puroR

pUC ori

RRE

SIN3rsquo LTR

RSV5 LTR

U6

f1 ori

ampR

Psi

Figure 4 TRC1 and TRC15 Vector Map (pLKO1-puro)

Figure 5 TRC2 Vector Map (TRC2-pLKO-puro)

レンチウイルスシステム概要 (contrsquod）レンチウイルス粒子はHEK293T 細胞などの産生細胞株内でパッケージングされます（Figure 2）プラスミド（トランスファーベクターパッケージングベクターおよびエンベロープベクター）を同時に導入させることによりすべての必要な配列を使用して興味のある導入遺伝子を含むウイルス粒子を作製しパッケージングすることができますトランスファーベクターのウイルス LTR の間の領域のみがウイルスのカプシド内にパッケージングされます得られたシュードウイルス粒子は力価を測定し標的細胞への導入に使用します（Figure 3）導入の際ウイルス LTR の間の領域は標的細胞のゲノムに組み込まれますこのシュードウイルス粒子には野生型ウイルスの遺伝子がないため野生型ウイルスのライフサイクルのように増殖することはおろか（Figure 1）複製もできません導入遺伝子の配列のみが細胞内で発現します（Figure 3）

MISSIONreg TRC shRNA コレクションshRNA 配列デザインMISSION TRC ライブラリーは約 20000 のヒト遺伝子と約 21000 のマウス遺伝子を標的とした合計 250000 を超えるクローン（各生物種約 120000 クローン）からなりますshRNA 配列はBroad Institute のアルゴリズムを使ってデザインされています本アルゴリズムでは配列特異性および標的遺伝子内の位置に基づき候補配列をスコアリングします候補配列はノックダウンの最適化とオフターゲット効果の最小化のバランスが取れていなければなりません転写産物の変異体の構造と配列がまだ十分に理解されていない等の理由もあり1 遺伝子あたり約 5 ～20 クローンをデザインし構築していますそのうち少なくとも 1 ～ 2 クローンでは非常に高いレベルのノックダウン効果が得られると予測されます

形質導入用ベクター候補配列は pLKO1-puro レンチウイルスベクターにクローニングされています（Figure 4）pLKO1 ベクターの骨格により大腸菌内での増殖や選択哺乳動物細胞での

（一時的なまたは長期間の）発現が可能になりますまたプラスミド DNA を用いることによりshRNA の配列を持つウイルス粒子を産生することができます（Figure 2）TRC2 では候補配列はTRC2-pLKO-puro レンチウイルスベクターにクローニングされています（Figure 5）このベクターには shRNA の発現を安定化させる WPRE を導入しています

MISSION ベクターコレクション（カスタム品）もご提供可能です（16ページ）

shRNA

7

MISSIONshRNA のレンチウイルスパーティクルを用いたプロトコ－ルと各種フォーマット（レンチウイルスパーティクルプラスミド DNA大腸菌グリセロールストック）の選択ガイドを掲載しています

各種フォーマットの選択ガイド大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG）

一度ご購入いただき正しく保管いただければ何度でもご利用になれますレンチウイルスパーティクルの作製などの手間がかかります

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND） レンチウイルスパーティクルの作製もしくは目的の細胞へのトランスフェクションが必要です

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV）Ready-to-use の製品でご購入後直ちにトランスフェクションが可能ですただしウイルスパーティクルの再産生はできません

大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG）

プラスミド DNA 抽出精製

レンチウイルスにパッケージング（14 ページ）

目的の細胞にトランスフェクション

RNAi による遺伝子ノックダウン

目的の細胞にトランスフェクション

力価（titer）測定（10 ページ）

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV）

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）

大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG） プロトコール大腸菌の培養1 50 ～ 100 μL のストックを取り出します

滅菌した 05 mL の LB （抗生物質不含）に入れます2 37で 15 ～ 30 分間振とう培養します3 Carbenicillin （100 μgmL 製品番号 C3416）を含む寒

天培地に大腸菌培養液 25 ～ 50 μL をストリーク（画線培養）

4 37で 15 ～ 20 時間インキュベート5 シングルコロニーをピックしてプラスミド DNA の抽出を行

います

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）プロトコール適当なトランスフェクション方法で行いますトランスフェクションの方法は用いる試薬に適したプロトコールで行ってください

MISSIONregshRNA フォーマット選択ガイド および実験プロトコル

shRNA実験ワークフロー

shRNA

8

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV） プロトコールMISSIONreg shRNA レンチウイルスを感染させる基本的なプロトコールを記載しています1 日目

1トランスフェクションの 24 時間前に哺乳動物細胞をプレートに撒いて培養

2 トランスフェクションは 50 ～ 80コンフルエントで行う

2 日目1 ウイルスパーティクルストックを氷上に出してゆっくり

解凍2 Hexadimethrine bromide を細胞に添加（最終濃

度 8 microgmL）して振とう　 トランスフェクション効率を高める（ただし神経

細胞の初代培養などには不適）3 適した量（MOI）のウイルスパーティクルを添加して

振とう　 初めての場合は幾つかのmultiplicity of infection

（MOI）を試す（05 - 20など）　 MOI 細胞に対するウイルス粒子の個数　　（1 ウェル中の全細胞数） x （目的の MOI）= （必要な TU） 　　（必要な TU） （CoA に書かれている TUmL） 　　= （1 ウェルに添加するレンチウイルス粒子の容量）4 37で一晩インキュベート 　 一晩のインキュベートで細胞毒性が生じる場合は

4 時間インキュベーションを行った後に培地交換

3 日目1 ウイルスパーティクルを含む培地を除去2 新しい培地に置換

4 日目a トランジェント（一過性発現）で実験する場合　 細胞を回収して qRT-PCR などでノックダウン効率

を検証するb ステーブル（安定発現）で実験する場合　 培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に交換

（方法は下記に記載）　 細胞により至適濃度は異なるが1 ～ 10 microgmL が

標準的

5 日目以降（ステーブルの場合のみ）3 ～ 4 日ごとに培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に置換 （一般的に 10 ～ 12 日後くらいでクローンが確立できる）5 クローン以上をピックしてノックダウン効果を検証する

ピューロマイシンによるセレクション（最適化法9 ページ）1 96 穴プレート各ウェルに 16x104 細胞 と 120 μL の培

地を用意する2 次の日に 1 ～ 10 μgmL となるようピューロマイシン

を分注する3 2 日後に生細胞を調べる4 3 日間ごとにピューロマイシン入りの培地に交換し

3 ～ 14 日間培養し最適な選択期間を検討する

各トランスフェクションは ExpressMagreg レンチウイルスデリバリーシステムを用いて1 日ずつ短縮することも可能ですまた導入しにくい細胞系などをご利用の際にも ExpressMag をご利用くださいExpressMag（15ページ）

shRNA実験情報に関するシグマ アルドリッチURL

shRNA TOP( 各種製品添付資料技術資料FAQ などもこちら )sigmacomshrna-jp

細胞実施例sigmacomshtable

shRNA

9

使用する細胞により最適な抗生物質の濃度は異なります初めて使用する細胞などで適切な抗生物質濃度がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる検討を行い細胞ストレスを低減するためにできる限り低濃度で且つ効率の高い抗生物質濃度を決定しておく必要があります多くの場合shRNA ベクターが導入されていない細胞は 1-10 μgmL の濃度で死滅します

選択用抗生物質（ピューロマイシン）濃度の最適化方法

必要な試薬と機器ピューロマイシン溶液（製品番号 P9620）培養液　　ノックダウン対象の細胞の増殖維持に適した培地（DMEM + 10 FCS など）

培養用インキュベーター6 ウェルプレート

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ50 の細胞密度となるよう細胞を播種（ex 2 x 105 cellwell）2 一晩インキュベート

Day 13 培地を温めておく4 ピューロマイシンの希釈系列（ex 0 10 25 50 75 100 microgmL）を培地を用いて調整5 培地をピューロマイシンを含む選択培地に交換6 それぞれのウェルの生細胞数を測定

Day 3-107 ２日毎に選択培地に交換し死細胞を除去8 ２日毎に生細胞数を測定

Day 109 細胞の死滅曲線を描き選択培地で培養した７ー 10 日の間に細胞が 100死滅したピューロマイシン濃度

を決定する

備考ピューロマイシンの凍結融解は最小限にとどめ選択培地は用事調製する10 μgmL 以上のピューロマイシン濃度が必要であった場合ピューロマイシンの使用期限を確認する

参考ピューロマイシン濃度Hela 3 microgmL HEK293 3 microgmL B16 1-3 microgmL PC10 10 microgmL A431 1 microgmL Jurkat 4 microgmL

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

shRNA

10

使用する細胞によりレンチウイルスの感染効率は異なります初めて使用する細胞などで適切な条件がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる条件検討を行い最適な Multiplicity Of Infection（MOI）を決定しておく必要がありますMISSIONreg TurboGFP trade コントロール（SHC003V）をご利用いただくと簡便に最適な MOI を決定することが可能です

TurboGFP コントロール（SHC003V）で用いられている CMV プロモーターは幹細胞リンパ球初代神経細胞などでその発現活性があまり高くないことが知られておりこれら細胞から得られる GFP シグナルが減少するため感染効率を実際よりも低く見積もってしまう場合がありますそれらの細胞において感染効率評価を実施する場合は限外希釈法を用いる必要があります

レンチウイルス感染効率評価方法

必要な試薬と機器TurboGFP コントロール（製品番号 SHC003V）Hexadimethrine bromide（製品番号 H9268）または Protamine sulfate（製品番号 P3369）培地培養用インキュベーター蛍光顕微鏡および GFP 用フィルター

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ24 時間後に細胞密度が 50となるよう細胞を播種2 一晩インキュベート

Day 13 レンチウイルスコントロール（製品番号 SHC003V）を室温にて溶解4 チューブを指で軽く弾き撹拌し氷上で保存する5 コントロールの段階希釈系列（10 倍希釈）を調整し各ウェルへ添加し振とう6 Hexadimethrine bromide または Protamine sulfate を終濃度 8 microgmL となるように添加し振とう7 18-20 時間インキュベート

Day 28 培地交換しウイルスを含む培地を除去9 さらに 24-48 時間インキュベートしGFP を十分発現させる多くの場合TurboGFP は感染後 72 時間後

に強い発現を示す

Day 3-510 蛍光顕微鏡下で観察しTurboGFP 発現細胞の割合が最も高い条件を決定する

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

Multiplicity Of Infection (MOI) 算出式

MOI　 =ウイルスタイター（TUmL） x 容量（mL）

細胞数

shRNA

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本製品はカルタヘナ法該当製品です数十万クローンから構成され数万遺伝子を標的とするライブラリーから製品仕様をご選択いただく必要がありお手数ではございますがご注文の仕様をご指定いただくための専用『ご注文用紙』（12ページ⑤）にご記入いただいております必要な情報をご記入後に弊社代理店へご注文用紙をお渡しください弊社ウェブサイトに掲載しておりますご注文用紙はPDF に直接ご入力いただけます製品を検索いただいたのち必要な情報をコピー amp ペーストにてご入力いただけますPDF は sigmacomshrna-jp　からご取得ください

個別クローン基本価格（1 クローンご注文の場合の単価）フォーマット 製品番号 価格 納期 基本仕様

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen25000 2-3週間 保管温度-70 内容物Terrific Broth carbenicillin 100 μgmL 15 glycerol

精製プラスミドDNA SHCLND yen60000 3-4週間 保管温度-20 容量40 μL 内容物1 μg プラスミドDNA（20 ngμL Tris-EDTA buffer）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen70000 4-6週間 保管温度-70 容量200 μL 内容物≧106 TUmL液体培地（DMEM 10 FBS penicillin-streptomycin）

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません

5 クローンセット割引価格（5 クローン以上ある製品に適用） ある遺伝子（RefSeq）に対する shRNA クローンを同一生物種同一フォーマットから 2 クローン以上お求めの場合は

お得な 5 クローンセットでお申し込み下さいターゲット遺伝子に対して 5 クローン以上製品が無い場合には別途お問合せ下さい　（その場合全クローンお選びいただければセット価格が適用になります）6 クローン以上ご購入いただく場合は5 クローンセット時の 1 クローン単価timesクローンの個数となります納期は 1 クローンご注文の場合と同様ですクローンセットでご購入の場合バリデート保証が適用されます（4ページ）

フォーマット 製品番号 5 クローンセット合計価格 1 クローン単価 納期

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen50000 yen10000 1 クローンと同様（上記表を参照）

精製プラスミドDNA SHCLND yen115000 yen23000 1 クローンと同様（上記表を参照）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen125005 yen25001 1 クローンと同様（上記表を参照）

オプション価格（ベクター変更タイター変更容量変更）カスタムベクターの詳細についてはカスタムクローニングサービス

のご紹介を参照ください（16 ページ） 1 クローンまたは 5 クローンセット価格に各オプション金額が加

算されますオプション選択時にも5 クローンセット割引価格は適用となります

（5 クローンセットでお求めの際は全てのクローンにおいて同一オプションとなります）

納期は1 オプションにつき通常納期に 2 週間ずつ加算されますオプションの種類 1 クローン購入時 5 クローンセットで購入時

（5 クローン合計） 納期

ベクター変更各種（プラスミドDNA）

+ yen70000 + yen190000 + 2 週間各種（レンチウイルスパーティクル）

タイター変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様1x106 TUmL

1x107 TUmL + yen97000 + yen485000 + 2 週間1x108 TUmL + yen155800 + yen779000 + 2 週間1x109 TUmL + yen305800 + yen1529000 + 2 週間

容量変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様02 mL

01 mL - yen15200 - yen76000 変更なし10 mL + yen15000 + yen75000 + 2 週間20 mL + yen23400 + yen117000 + 2 週間50 mL + yen32800 + yen164000 + 2 週間100 mL + yen43000 + yen215000 + 2 週間

107 TUmL 以上のタイターオプションとの併用時のみ選択可能です

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません 25 クローン以下の購入の場合 バイアル（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷 大腸菌フォーマットは 14 mL TrakMates チューブでの出荷 26 クローン以上の購入の場合 96-well Plate（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷Plate Map CD-ROM 付き

価格　－ 計算例 － セット価格で計算した場合

納品形態レンチウイルスパーティクル（製品番号SHCLNV）

①クローン数5 クローンセット yen125005

②オプションベクター変更（pLKO1-CMV-Neo） yen156000

仕様合計（①と②の合計） yen366000

MISSIONreg shRNA クローンご注文情報

shRNA

12

shRNAご注文方法シグマ アルドリッチウェブサイトの情報検索ウィンドウよりターゲット遺伝子に対する MISSIONregshRNA クローンの検索を行うことができます

① sigmacomjapan

③生物種とフォーマット選択

④クローンの選択

⑤専用注文用紙に記入sigmacomshrna-jp より専用発注書をダウンロードしAcrobat Reader などで開きクローン番号など必要な情報をご入力ください（追記型 PDFファイルのため直接タイプ ペーストしていただけます）

⑥代理店様に発注発注書に必要事項を入力後再度保存しメール添付ファイルの形で代理店様にご発注ください

②ターゲット遺伝子選択

遺伝子名やAccession No で検索

ターゲット遺伝子を探し青字の製品カテゴリーにある『shRNA』をクリック

生物種（ヒトマウス）および3 種類のフォーマット よりご希望の製品番号に該当するldquo価格rdquoボタンをクリック

各クローンの情報（ターゲット遺伝子情報バリデーションの有無配列TRC バージョン情報など）が表示されるのでこれらの情報より目的クローンを選択一部のオプションはプルダウンでご選択いただけますオプションには別途費用が発生いたしますご注意ください

カスタムサービスも承りますお見積もり依頼はコチラ

httpgooglta5NTa

shRNA

13

コントロールshRNA各種コントロールをご利用いただけますフォーマット蛍光マーカープロモーターなどから細胞や実験に適した製品をご選択ください高タイターのコントロールをご希望の場合は別途ご相談ください

各コントロールを MOI = 5 にて導入した A549 細胞（上図は明視野下図は蛍光画像）

コントロール一覧 　

用途 製品名製品番号

希望販売価格TRC1 series TRC2 seriesPlasmid DNA Lentiviral Plasmid DNA Lentiviral

ネガティブコントロールpLKO1-puro Non-Target shRNA Control 1 SHC002 SHC002V SHC202 SHC202V yen59000

pLKO1-puro Non-Target shRNA Control 2 SHC016 SHC016V SHC216 SHC216V yen59000

蛍光タンパク質トランスダクションコントロール

（ポジティブコントロール）

pLKO1-puro CMV-TurboGFP SHC003 SHC003V SHC203 SHC203V

製品番号になしの製品

yen59000

ありの製品yen93000

pLKO1-puro CMV-TagCFPtrade SHC010 SHC010V - -

pLKO1-puro CMV-TagYFPtrade SHC011 SHC011V - -

pLKO1-puro CMV-TagRFPtrade SHC012 SHC012V - -

pLKO1-puro CMV-TagFP635trade SHC013 SHC013V - -

pLKO1-puro UbC-TurboGFP SHC014 SHC014V - -

pLKO1-puro UbC-TagFP635 SHC015 SHC015V - -

外来性遺伝子用shRNAコントロール

TurboGFP shRNA Control SHC004 SHC004V SHC204 SHC204V yen59000

eGFP shRNA Control SHC005 SHC005V - - yen59000

Luciferase shRNA Control SHC007 SHC007V - - yen59000

内在性遺伝子用shRNAコントロール

shRNA Human Positive Control 1（B2M） SHC008 SHC008V - - yen59000

shRNA Human Positive Control 2（ARHGDIA） SHC009 SHC009V - - yen59000

Emptyコントロールベクター pLKO1-puro Control SHC001 SHC001V SHC201 SHC201V yen59000仕様 plasmid DNA 5 μg DNA -20 stock 500 ng μL TE buffer

Lentiviral 4 x 50 μL -70 stock 106 TUmL (via p24 titering assay) ハイタイターコントロールのご用意もございます別途お問合せ下さい

Transduction Knockdown

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)TurboGFP(SHC003SHC003V)TagCFP(SHC010SHC010V)TagYFP(SHC011SHC011V)TagRFP(SHC012SHC012V)TagFP635(SHC013SHC013V)UbC-TurboGFP(SHC014SHC014V)UbC-TagFP635(SHC015SHC015V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)TurboGFP(SHC203SHC203V)

TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)shRNA Positive Control 1(HumanB2M) (SHC008SHC008V)shRNA Positive Control 2(HumanARHGDIA) (SHC009SHC009V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

Monitor

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)Non-Target shRNA 1(SHC002SHC002V)Non-Target shRNA 2(SHC016SHC016V)TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)Non-Target shRNA 1(SHC202SHC202V)Non-Target shRNA 2(SHC216SHC216V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

MISSION shRNA Controls

NegativePositive

UbC-TagFP635 trade UbC-TurboGFP trade CMV-TagFP635 trade CMV-TagYFP trade CMV-TagCFP trade

sigma-aldrichcomcontrols

MISSIONreg shRNA コントロール製品群

shRNA

14

Packaging PlasmidsMISSIONreg Lentiviral Packaging Mix はMISSION TRC shRNA コレクションに最適化したパッケージング用プラスミドのプレミックス製品です本製品にはレンチウイルスの構造および複製に関与する遺伝子（gag および pol）を有するパッケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ドVSV-G エ ン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエンベロープベクターから成ります本製品は独自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用いただけますがシグマ アルドリッチでは時間を節約し品質を確保するために弊社がご提供するウイルスフォーマットのコレクションをご使用いただくことを強くお勧めいたします

製品名 カタログ番号 価格

MISSION lentiviral Packaging MixSHP001-025ML yen50000SHP001-17ML yen175000

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

Assembly ampBudding

Maturation

pMISSION GAG POL

12150 bp

ampR

Sv40

gag

CMV

pol

rev tat

insulin polyA

pMISSION VSV-G

5824 bp

CMV

VSV-G

Envelope VectorPackaging Vector

Lentiviral Packaging Mix

TransferVector

PackagingVector Envelope

Vector

組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

shRNAパッケージングプラスミドならびに関連製品

その他試薬

製品名 カタログ番号 価格 備考

Puromycin dihydrochloride P9620-10ML yen20900 調製済puromycin溶液

Hexadimethrine bromideH9268-5G yen8600

レンチウイルスの導入効率を向上H9268-10G yen12900H9268-50G yen49700

Protamine sulfateP3369-10G yen44400 レンチウイルスの導入効率を向上

Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効P3369-100G yen250000

Carbenicillin disodium saltC3416-250MG yen8700C3416-1G yen21800C3416-5G yen65800

Terrific Broth T5574-500ML yen11300 液体培地

Terrific Broth Modified EZMixtrade Powder T9179-6X500ML yen7900

顆粒T9179-2X5L yen18800

各種 MISSION 製品の添付資料はこちらからsigmacomshrnatechbull-jp

shRNA

15

マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

16

MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

標的スクリーニング（Target ID）用MISSION miRNAライブラリー

MISSION shRNA

シグマ アルドリッチの RNAi 技術で

確実な遺伝子発現抑制と

効率的なターゲットスクリーニングが

実現します

3 UTRスクリーニング用MISSION miRNAライブラリー

MISSIONreg siRNAMISSION esiRNA

shRNAMISSION shRNA 概要 4MISSIONshRNA フォーマット選択ガイドおよび実験プロトコル 7選択用抗生物質（ピューロマイシン）濃度の最適化方法 9レンチウイルス感染効率評価方法10MISSION shRNA クローンご注文情報（価格納期等） 11MISSION shRNA クローンご注文方法 12コントロール shRNA 13shRNA パッケージングプラスミドならびに関連製品 14レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズ ExpressMag 15カスタム shRNA 用ベクター 16IPTG 発現誘導用 shRNA ベクター 17ゲノムの特定領域上への shRNA 導入用ベクター 18スクリーニング用 MISSION shRNA ライブラリー概要 19MISSION shRNA ライブラリーによる全ゲノムスクリーニング 20遺伝子機能別 shRNA ライブラリー 21プール型全ゲノム shRNA ライブラリー 22カスタム shRNA ライブラリー 23

siRNAMISSION siRNA 概要 24カスタム siRNA 26in vivo 用 siRNA 27遺伝子機能別 siRNA ライブラリー 28小容量 siRNA （ヒトキナーゼ用ならびにフォスファターゼ用） 29

esiRNAMISSION esiRNA（プール型 siRNA） 30lncRNA ノックダウン用 MISSION esiRNA 32

miRNA成熟 miRNA ミミック 33MISSION 合成 miRNA インヒビター 34MISSION レンチウイルス型 miRNA インヒビター 35ヒト miRNA ターゲット網羅的探索用 3 UTR ライブラリー 36ヒト miRNA ターゲット確認用 3 UTR クローン 37miRNA 検出定量試薬 38

大腸菌グリセロールフォーマットおよびレンチウイルスフォーマットの MISSION RNAi 製品は全て「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」（通称カルタヘナ法）に基づく使用規制対象品です当該製品をご使用の際は関連法規に則り適切に取り扱ってください施設申請に必要な製品の詳細情報は sigmacomrnai-jp にてご確認ください

shRNA

4

製品特性および仕様 網羅的な shRNA コレクション

約 250000 のクローニング済み shRNA コンストラクト ヒト約 20000 以上マウス約 21000 以上の標的遺伝

子を網羅MISSION shRNA ライブラリーの概要は RNAi に最適なレンチウイルスをベースとしたシステム

一過性ノックダウン 安定的ノックダウンのどちらにも応用可能

導入用のウイルス粒子もラインアップゲノムへの組み込みによる長期的ノックダウン非分裂細胞を含むほぼ全ての細胞種に導入可能インターフェロン応答を回避するデザイン組み換えによる導入配列の変異は認められておりません106 ～ 107 TUmL の高力価

高効率なノックダウン効果が得られる shRNA デザインBroad Institute のアルゴリズムによる配列特異性およ

び設計位置に基づいたスコアリング1 遺伝子あたり約 5 クローンで標的遺伝子を広範囲にカ

バー表現型レスキュー実験用の 3 UTR 領域にデザインした

shRNA も提供可能

様々なオプションを選択可能ベクターの変更（15 種類）

マーカー遺伝子詳細（16 ページ）タイターの変更（106-109 TUmL）ボリューム変更（01-10 mL）

トランスフェクションが困難な細胞や非分裂細胞での RNAi 実験やまたは効果的で高品質の長期ノックダウン実験系にはshRNA の利用が最適ですThe RNAi Consortium （TRC）とシグマ アルドリッチがさまざまな shRNA ソリューションをお届けします

TRC はマサチューセッツ工科大学とハーバード大学の合同出資により設立された研究機関であるブロード研究所（Broad Institute）に拠点を置き研究者や研究団体に RNAi ツールを提供するための世界的に有名な学術機関とライフサイエンス研究組織から構成されるコンソーシアムですシグマ アルドリッチはTRC のメンバーおよび協力パートナーとしてヒトおよびマウスのゲノムを標的とする TRC shRNA レンチウイルスライブラリー技術に基づいた高品質の製品とサービスをご提供できるよう努めています

ハイスループット（HT）に最適のシステムHT ウイルス作製ハイスループットスクリーニングおよびハイコンテントスク

リーニングの実績あり

信頼性の高い製造システム最先端のロボットバーコードおよび LIMS による追跡管理文書の使用研究開発製造品質管理および品質保証の専門家か

らなる熟練のスタッフ

豊富な製品フォーマットプールドタイプのウイルス全ライブラリー（LentiPlexreg）遺伝子ファミリーセットターゲットセットおよび単一クローン大腸菌グリセロールプラスミド DNAレンチウイルスパー

ティクルの 3 種類のフォーマット

レンチウイルス shRNA 製品のリーダー高い先端技術力に裏打ちされた製品とサービス広範囲にわたるウェブベースのリソース技術および研究開発の専門家による充実したサポート

TRC2 クローンはシグマ アルドリッチの独占販売です約 50000 クローン以上の新規クローン数千遺伝子の新規ターゲット遺伝子30000 以上のバリデート済みクローン

あらゆる細胞への安定したRNAiを実現MISSIONreg shRNA概要

バリデートデータと保証の範囲保証の範囲

MISSION shRNA は Broad Institute によって開発された独自のアルゴリズムに基づいてクローンセット中1 クローン以上が 70 以上のノックダウンレベルを示す事を保証します

保証の条件保証は下記条件を全て満たした場合のみ適用となりますクローンセット（11 ページ）をご購入いただいた場合適切なコントロールにてノックダウンを検証済みの場合実験系でノックダウンが確認されなかった場合は導

入された shRNA が十分に発現している事を確認した場合

ノックダウンが確認されなかったら下記何れかの方法で対応させていただきます

別のクローンを 1 つ無償提供別の製品によって金額相当の無償提供金額相当のご返金弊社営業またはテクニカルサポートまでご連絡ください

バリデートデータとはバリデートデータはBroad Institute にて 50以上のノックダウン効果を示したものを表示しておりますこれらのデータは表示の手法表示の細胞において検証されたノックダウンレベルとなりますお客様の実験系におけるノックダウンレベルを保証したものではありません予めご了承ください

shRNA

5

ウイルスデリバリーシステムウイルスは様々な細胞株に感染するよう独自に進化を遂げてきましたその特長を利用してここ数十年間興味のある遺伝子を安全に標的細胞にデリバリーするためのベクター開発に向け種々のウイルスの遺伝子操作が行なわれてきましたそれぞれのウイルスシステム（Table 1）はそれぞれ利点と欠点を持ちますがレンチウイルスシステムではすべての用途で望ましいウイルスベクターとなる非常に多くの特長を持ちます現在のレンチウイルスシステムは複数世代の組換えと修飾により得られたレトロウイルスシステムの一種です

Feature Adeno-virus AAV Retro-

virusLenti- virus

非分裂細胞への感染 宿主ゲノムへの安定的な組み込み シュードタイプ作製 長いフラグメントの挿入 インターフェロン応答の回避 ゲノム内に転写サイレンシングに関する問題がない NA

Adeno-Associated Virus

Table 1 ウイルスシステムの比較

レンチウイルスシステム概要レンチウイルスシステムには遺伝子のデリバリーに特に有用となる多くの特性（広範な親和性安定的な組み込みなど）がありますFigure 1 は野生型レンチウイルスのライフサイクルを示しています野生型ウイルスが細胞に侵入し組み込みウイルス遺伝子を発現させることにより新しいビリオンを形成することが可能となります安全性を確保し導入遺伝子を挿入する十分な領域を確保するために今日のシステムではウイルス粒子の産生に必要なウイルス遺伝子を複数のプラスミド上に分けて組み込んでいます（Figure 2）トランスファーベクターは改変 Long Terminal Repeat（LTR）領域の間にシグナル配列とシス作用性配列を持ちますshRNA選択マーカーなどの導入遺伝子はトランスファーベクターの非ウイルスプロモーターの後方へクローニングされますウイルスの構造および複製に必要なすべての遺伝子は別のパッケージングベクター（通常 1 ～ 2 個）に搭載しますこれらの遺伝子にはさまざまなバージョンのウイルスgag オペロンおよび pol オペロンがあります通常さらに安全性を高めるためすべての野生型アクセサリー遺伝子を除去します最後にエンベロープベクターによりウイルス粒子の親和性を決定するエンベロープタンパクが供給され多彩な可能性を示す様々なシュードタイプウイルスが得られますシグマ アルドリッチでは広範な親和性を確保し非分裂細胞および最終分化細胞を含むほぼすべての細胞型に導入するために主に VSV-G（水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク）を持つシュードタイプウイルス粒子としております

Attachment

EntryMaturation

Assembly ampBudding

RNA Transcript

Export

Synthesis of viral Proteins Release of

Viral RNA

ReverseTranscription

ViralcDNA

Integration ofViral cDNA

Wild-TypeLentiviral Particles

Transcription

Figure 1野生型レンチウイルスの生活環

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

TransferVector

PackagingVector Packaging

Plasmids

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

PackagingVector

EnvelopeVector

EnvelopeVector

Assembly ampBudding

Maturation

Figure 2組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

MISSION Lentiviral Packaging Mix（14ページ）

Attachment

Entry

MISSIONLentiviralParticle

NO Virion Production

Release ofViral RNA

ReverseTranscription

Viral cDNA

Integration ofViral cDNA

Exported shRNA

Enter RNAiPathway Transcription

Figure 3MISSIONreg TRC shRNAレンチウイルス粒子による標的細胞への導入

shRNA

6

5 -

3 - UU

Sense Strand

Antisense Strand

Sense StrandCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT T T T TGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAA

Antisense StrandLoop

Loo

p

cPPT

TRC2-pLKO-puro7518 bp

hPGK

puroR

WPRE

pUC ori

RRE

SIN3rsquo LTR

RSV5 LTR

U6

f1 oriampR

Psi

TRC shRNA ベクターマップおよび特徴

RSV5rsquo LTR Chimeric LTR involved in replication and integration U3 substitution for safety

Psi (ψ) Packaging dimerization signal

RRE Involved in nuclear export of viral genome transcript during packaging

U6 Robust pol III promoter with precise initiation and termination of shRNA transcription at high levels

cPPT Role in cDNA synthesis and nuclear import in target cell

hPGK Promoter driving expression of puromycin resistance gene hPGK is weaker than U6 for assurance of high shRNA expression levels in stable selected cells

puroR Allows stable selection with puromycin

SIN3rsquo LTR LTR involved in replication and integration U3 deletion for safety

WPRE Woodchuck Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Element

5 -

3 - UU

Sense Strand

Antisense Strand

Sense StrandCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT T T T TGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAA

Antisense StrandLoop

Loo

p

cPPT

pLKO1-puro7086 bp

hPGK

puroR

pUC ori

RRE

SIN3rsquo LTR

RSV5 LTR

U6

f1 ori

ampR

Psi

Figure 4 TRC1 and TRC15 Vector Map (pLKO1-puro)

Figure 5 TRC2 Vector Map (TRC2-pLKO-puro)

レンチウイルスシステム概要 (contrsquod）レンチウイルス粒子はHEK293T 細胞などの産生細胞株内でパッケージングされます（Figure 2）プラスミド（トランスファーベクターパッケージングベクターおよびエンベロープベクター）を同時に導入させることによりすべての必要な配列を使用して興味のある導入遺伝子を含むウイルス粒子を作製しパッケージングすることができますトランスファーベクターのウイルス LTR の間の領域のみがウイルスのカプシド内にパッケージングされます得られたシュードウイルス粒子は力価を測定し標的細胞への導入に使用します（Figure 3）導入の際ウイルス LTR の間の領域は標的細胞のゲノムに組み込まれますこのシュードウイルス粒子には野生型ウイルスの遺伝子がないため野生型ウイルスのライフサイクルのように増殖することはおろか（Figure 1）複製もできません導入遺伝子の配列のみが細胞内で発現します（Figure 3）

MISSIONreg TRC shRNA コレクションshRNA 配列デザインMISSION TRC ライブラリーは約 20000 のヒト遺伝子と約 21000 のマウス遺伝子を標的とした合計 250000 を超えるクローン（各生物種約 120000 クローン）からなりますshRNA 配列はBroad Institute のアルゴリズムを使ってデザインされています本アルゴリズムでは配列特異性および標的遺伝子内の位置に基づき候補配列をスコアリングします候補配列はノックダウンの最適化とオフターゲット効果の最小化のバランスが取れていなければなりません転写産物の変異体の構造と配列がまだ十分に理解されていない等の理由もあり1 遺伝子あたり約 5 ～20 クローンをデザインし構築していますそのうち少なくとも 1 ～ 2 クローンでは非常に高いレベルのノックダウン効果が得られると予測されます

形質導入用ベクター候補配列は pLKO1-puro レンチウイルスベクターにクローニングされています（Figure 4）pLKO1 ベクターの骨格により大腸菌内での増殖や選択哺乳動物細胞での

（一時的なまたは長期間の）発現が可能になりますまたプラスミド DNA を用いることによりshRNA の配列を持つウイルス粒子を産生することができます（Figure 2）TRC2 では候補配列はTRC2-pLKO-puro レンチウイルスベクターにクローニングされています（Figure 5）このベクターには shRNA の発現を安定化させる WPRE を導入しています

MISSION ベクターコレクション（カスタム品）もご提供可能です（16ページ）

shRNA

7

MISSIONshRNA のレンチウイルスパーティクルを用いたプロトコ－ルと各種フォーマット（レンチウイルスパーティクルプラスミド DNA大腸菌グリセロールストック）の選択ガイドを掲載しています

各種フォーマットの選択ガイド大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG）

一度ご購入いただき正しく保管いただければ何度でもご利用になれますレンチウイルスパーティクルの作製などの手間がかかります

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND） レンチウイルスパーティクルの作製もしくは目的の細胞へのトランスフェクションが必要です

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV）Ready-to-use の製品でご購入後直ちにトランスフェクションが可能ですただしウイルスパーティクルの再産生はできません

大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG）

プラスミド DNA 抽出精製

レンチウイルスにパッケージング（14 ページ）

目的の細胞にトランスフェクション

RNAi による遺伝子ノックダウン

目的の細胞にトランスフェクション

力価（titer）測定（10 ページ）

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV）

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）

大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG） プロトコール大腸菌の培養1 50 ～ 100 μL のストックを取り出します

滅菌した 05 mL の LB （抗生物質不含）に入れます2 37で 15 ～ 30 分間振とう培養します3 Carbenicillin （100 μgmL 製品番号 C3416）を含む寒

天培地に大腸菌培養液 25 ～ 50 μL をストリーク（画線培養）

4 37で 15 ～ 20 時間インキュベート5 シングルコロニーをピックしてプラスミド DNA の抽出を行

います

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）プロトコール適当なトランスフェクション方法で行いますトランスフェクションの方法は用いる試薬に適したプロトコールで行ってください

MISSIONregshRNA フォーマット選択ガイド および実験プロトコル

shRNA実験ワークフロー

shRNA

8

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV） プロトコールMISSIONreg shRNA レンチウイルスを感染させる基本的なプロトコールを記載しています1 日目

1トランスフェクションの 24 時間前に哺乳動物細胞をプレートに撒いて培養

2 トランスフェクションは 50 ～ 80コンフルエントで行う

2 日目1 ウイルスパーティクルストックを氷上に出してゆっくり

解凍2 Hexadimethrine bromide を細胞に添加（最終濃

度 8 microgmL）して振とう　 トランスフェクション効率を高める（ただし神経

細胞の初代培養などには不適）3 適した量（MOI）のウイルスパーティクルを添加して

振とう　 初めての場合は幾つかのmultiplicity of infection

（MOI）を試す（05 - 20など）　 MOI 細胞に対するウイルス粒子の個数　　（1 ウェル中の全細胞数） x （目的の MOI）= （必要な TU） 　　（必要な TU） （CoA に書かれている TUmL） 　　= （1 ウェルに添加するレンチウイルス粒子の容量）4 37で一晩インキュベート 　 一晩のインキュベートで細胞毒性が生じる場合は

4 時間インキュベーションを行った後に培地交換

3 日目1 ウイルスパーティクルを含む培地を除去2 新しい培地に置換

4 日目a トランジェント（一過性発現）で実験する場合　 細胞を回収して qRT-PCR などでノックダウン効率

を検証するb ステーブル（安定発現）で実験する場合　 培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に交換

（方法は下記に記載）　 細胞により至適濃度は異なるが1 ～ 10 microgmL が

標準的

5 日目以降（ステーブルの場合のみ）3 ～ 4 日ごとに培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に置換 （一般的に 10 ～ 12 日後くらいでクローンが確立できる）5 クローン以上をピックしてノックダウン効果を検証する

ピューロマイシンによるセレクション（最適化法9 ページ）1 96 穴プレート各ウェルに 16x104 細胞 と 120 μL の培

地を用意する2 次の日に 1 ～ 10 μgmL となるようピューロマイシン

を分注する3 2 日後に生細胞を調べる4 3 日間ごとにピューロマイシン入りの培地に交換し

3 ～ 14 日間培養し最適な選択期間を検討する

各トランスフェクションは ExpressMagreg レンチウイルスデリバリーシステムを用いて1 日ずつ短縮することも可能ですまた導入しにくい細胞系などをご利用の際にも ExpressMag をご利用くださいExpressMag（15ページ）

shRNA実験情報に関するシグマ アルドリッチURL

shRNA TOP( 各種製品添付資料技術資料FAQ などもこちら )sigmacomshrna-jp

細胞実施例sigmacomshtable

shRNA

9

使用する細胞により最適な抗生物質の濃度は異なります初めて使用する細胞などで適切な抗生物質濃度がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる検討を行い細胞ストレスを低減するためにできる限り低濃度で且つ効率の高い抗生物質濃度を決定しておく必要があります多くの場合shRNA ベクターが導入されていない細胞は 1-10 μgmL の濃度で死滅します

選択用抗生物質（ピューロマイシン）濃度の最適化方法

必要な試薬と機器ピューロマイシン溶液（製品番号 P9620）培養液　　ノックダウン対象の細胞の増殖維持に適した培地（DMEM + 10 FCS など）

培養用インキュベーター6 ウェルプレート

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ50 の細胞密度となるよう細胞を播種（ex 2 x 105 cellwell）2 一晩インキュベート

Day 13 培地を温めておく4 ピューロマイシンの希釈系列（ex 0 10 25 50 75 100 microgmL）を培地を用いて調整5 培地をピューロマイシンを含む選択培地に交換6 それぞれのウェルの生細胞数を測定

Day 3-107 ２日毎に選択培地に交換し死細胞を除去8 ２日毎に生細胞数を測定

Day 109 細胞の死滅曲線を描き選択培地で培養した７ー 10 日の間に細胞が 100死滅したピューロマイシン濃度

を決定する

備考ピューロマイシンの凍結融解は最小限にとどめ選択培地は用事調製する10 μgmL 以上のピューロマイシン濃度が必要であった場合ピューロマイシンの使用期限を確認する

参考ピューロマイシン濃度Hela 3 microgmL HEK293 3 microgmL B16 1-3 microgmL PC10 10 microgmL A431 1 microgmL Jurkat 4 microgmL

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

shRNA

10

使用する細胞によりレンチウイルスの感染効率は異なります初めて使用する細胞などで適切な条件がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる条件検討を行い最適な Multiplicity Of Infection（MOI）を決定しておく必要がありますMISSIONreg TurboGFP trade コントロール（SHC003V）をご利用いただくと簡便に最適な MOI を決定することが可能です

TurboGFP コントロール（SHC003V）で用いられている CMV プロモーターは幹細胞リンパ球初代神経細胞などでその発現活性があまり高くないことが知られておりこれら細胞から得られる GFP シグナルが減少するため感染効率を実際よりも低く見積もってしまう場合がありますそれらの細胞において感染効率評価を実施する場合は限外希釈法を用いる必要があります

レンチウイルス感染効率評価方法

必要な試薬と機器TurboGFP コントロール（製品番号 SHC003V）Hexadimethrine bromide（製品番号 H9268）または Protamine sulfate（製品番号 P3369）培地培養用インキュベーター蛍光顕微鏡および GFP 用フィルター

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ24 時間後に細胞密度が 50となるよう細胞を播種2 一晩インキュベート

Day 13 レンチウイルスコントロール（製品番号 SHC003V）を室温にて溶解4 チューブを指で軽く弾き撹拌し氷上で保存する5 コントロールの段階希釈系列（10 倍希釈）を調整し各ウェルへ添加し振とう6 Hexadimethrine bromide または Protamine sulfate を終濃度 8 microgmL となるように添加し振とう7 18-20 時間インキュベート

Day 28 培地交換しウイルスを含む培地を除去9 さらに 24-48 時間インキュベートしGFP を十分発現させる多くの場合TurboGFP は感染後 72 時間後

に強い発現を示す

Day 3-510 蛍光顕微鏡下で観察しTurboGFP 発現細胞の割合が最も高い条件を決定する

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

Multiplicity Of Infection (MOI) 算出式

MOI　 =ウイルスタイター（TUmL） x 容量（mL）

細胞数

shRNA

11

本製品はカルタヘナ法該当製品です数十万クローンから構成され数万遺伝子を標的とするライブラリーから製品仕様をご選択いただく必要がありお手数ではございますがご注文の仕様をご指定いただくための専用『ご注文用紙』（12ページ⑤）にご記入いただいております必要な情報をご記入後に弊社代理店へご注文用紙をお渡しください弊社ウェブサイトに掲載しておりますご注文用紙はPDF に直接ご入力いただけます製品を検索いただいたのち必要な情報をコピー amp ペーストにてご入力いただけますPDF は sigmacomshrna-jp　からご取得ください

個別クローン基本価格（1 クローンご注文の場合の単価）フォーマット 製品番号 価格 納期 基本仕様

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen25000 2-3週間 保管温度-70 内容物Terrific Broth carbenicillin 100 μgmL 15 glycerol

精製プラスミドDNA SHCLND yen60000 3-4週間 保管温度-20 容量40 μL 内容物1 μg プラスミドDNA（20 ngμL Tris-EDTA buffer）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen70000 4-6週間 保管温度-70 容量200 μL 内容物≧106 TUmL液体培地（DMEM 10 FBS penicillin-streptomycin）

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません

5 クローンセット割引価格（5 クローン以上ある製品に適用） ある遺伝子（RefSeq）に対する shRNA クローンを同一生物種同一フォーマットから 2 クローン以上お求めの場合は

お得な 5 クローンセットでお申し込み下さいターゲット遺伝子に対して 5 クローン以上製品が無い場合には別途お問合せ下さい　（その場合全クローンお選びいただければセット価格が適用になります）6 クローン以上ご購入いただく場合は5 クローンセット時の 1 クローン単価timesクローンの個数となります納期は 1 クローンご注文の場合と同様ですクローンセットでご購入の場合バリデート保証が適用されます（4ページ）

フォーマット 製品番号 5 クローンセット合計価格 1 クローン単価 納期

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen50000 yen10000 1 クローンと同様（上記表を参照）

精製プラスミドDNA SHCLND yen115000 yen23000 1 クローンと同様（上記表を参照）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen125005 yen25001 1 クローンと同様（上記表を参照）

オプション価格（ベクター変更タイター変更容量変更）カスタムベクターの詳細についてはカスタムクローニングサービス

のご紹介を参照ください（16 ページ） 1 クローンまたは 5 クローンセット価格に各オプション金額が加

算されますオプション選択時にも5 クローンセット割引価格は適用となります

（5 クローンセットでお求めの際は全てのクローンにおいて同一オプションとなります）

納期は1 オプションにつき通常納期に 2 週間ずつ加算されますオプションの種類 1 クローン購入時 5 クローンセットで購入時

（5 クローン合計） 納期

ベクター変更各種（プラスミドDNA）

+ yen70000 + yen190000 + 2 週間各種（レンチウイルスパーティクル）

タイター変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様1x106 TUmL

1x107 TUmL + yen97000 + yen485000 + 2 週間1x108 TUmL + yen155800 + yen779000 + 2 週間1x109 TUmL + yen305800 + yen1529000 + 2 週間

容量変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様02 mL

01 mL - yen15200 - yen76000 変更なし10 mL + yen15000 + yen75000 + 2 週間20 mL + yen23400 + yen117000 + 2 週間50 mL + yen32800 + yen164000 + 2 週間100 mL + yen43000 + yen215000 + 2 週間

107 TUmL 以上のタイターオプションとの併用時のみ選択可能です

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません 25 クローン以下の購入の場合 バイアル（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷 大腸菌フォーマットは 14 mL TrakMates チューブでの出荷 26 クローン以上の購入の場合 96-well Plate（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷Plate Map CD-ROM 付き

価格　－ 計算例 － セット価格で計算した場合

納品形態レンチウイルスパーティクル（製品番号SHCLNV）

①クローン数5 クローンセット yen125005

②オプションベクター変更（pLKO1-CMV-Neo） yen156000

仕様合計（①と②の合計） yen366000

MISSIONreg shRNA クローンご注文情報

shRNA

12

shRNAご注文方法シグマ アルドリッチウェブサイトの情報検索ウィンドウよりターゲット遺伝子に対する MISSIONregshRNA クローンの検索を行うことができます

① sigmacomjapan

③生物種とフォーマット選択

④クローンの選択

⑤専用注文用紙に記入sigmacomshrna-jp より専用発注書をダウンロードしAcrobat Reader などで開きクローン番号など必要な情報をご入力ください（追記型 PDFファイルのため直接タイプ ペーストしていただけます）

⑥代理店様に発注発注書に必要事項を入力後再度保存しメール添付ファイルの形で代理店様にご発注ください

②ターゲット遺伝子選択

遺伝子名やAccession No で検索

ターゲット遺伝子を探し青字の製品カテゴリーにある『shRNA』をクリック

生物種（ヒトマウス）および3 種類のフォーマット よりご希望の製品番号に該当するldquo価格rdquoボタンをクリック

各クローンの情報（ターゲット遺伝子情報バリデーションの有無配列TRC バージョン情報など）が表示されるのでこれらの情報より目的クローンを選択一部のオプションはプルダウンでご選択いただけますオプションには別途費用が発生いたしますご注意ください

カスタムサービスも承りますお見積もり依頼はコチラ

httpgooglta5NTa

shRNA

13

コントロールshRNA各種コントロールをご利用いただけますフォーマット蛍光マーカープロモーターなどから細胞や実験に適した製品をご選択ください高タイターのコントロールをご希望の場合は別途ご相談ください

各コントロールを MOI = 5 にて導入した A549 細胞（上図は明視野下図は蛍光画像）

コントロール一覧 　

用途 製品名製品番号

希望販売価格TRC1 series TRC2 seriesPlasmid DNA Lentiviral Plasmid DNA Lentiviral

ネガティブコントロールpLKO1-puro Non-Target shRNA Control 1 SHC002 SHC002V SHC202 SHC202V yen59000

pLKO1-puro Non-Target shRNA Control 2 SHC016 SHC016V SHC216 SHC216V yen59000

蛍光タンパク質トランスダクションコントロール

（ポジティブコントロール）

pLKO1-puro CMV-TurboGFP SHC003 SHC003V SHC203 SHC203V

製品番号になしの製品

yen59000

ありの製品yen93000

pLKO1-puro CMV-TagCFPtrade SHC010 SHC010V - -

pLKO1-puro CMV-TagYFPtrade SHC011 SHC011V - -

pLKO1-puro CMV-TagRFPtrade SHC012 SHC012V - -

pLKO1-puro CMV-TagFP635trade SHC013 SHC013V - -

pLKO1-puro UbC-TurboGFP SHC014 SHC014V - -

pLKO1-puro UbC-TagFP635 SHC015 SHC015V - -

外来性遺伝子用shRNAコントロール

TurboGFP shRNA Control SHC004 SHC004V SHC204 SHC204V yen59000

eGFP shRNA Control SHC005 SHC005V - - yen59000

Luciferase shRNA Control SHC007 SHC007V - - yen59000

内在性遺伝子用shRNAコントロール

shRNA Human Positive Control 1（B2M） SHC008 SHC008V - - yen59000

shRNA Human Positive Control 2（ARHGDIA） SHC009 SHC009V - - yen59000

Emptyコントロールベクター pLKO1-puro Control SHC001 SHC001V SHC201 SHC201V yen59000仕様 plasmid DNA 5 μg DNA -20 stock 500 ng μL TE buffer

Lentiviral 4 x 50 μL -70 stock 106 TUmL (via p24 titering assay) ハイタイターコントロールのご用意もございます別途お問合せ下さい

Transduction Knockdown

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)TurboGFP(SHC003SHC003V)TagCFP(SHC010SHC010V)TagYFP(SHC011SHC011V)TagRFP(SHC012SHC012V)TagFP635(SHC013SHC013V)UbC-TurboGFP(SHC014SHC014V)UbC-TagFP635(SHC015SHC015V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)TurboGFP(SHC203SHC203V)

TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)shRNA Positive Control 1(HumanB2M) (SHC008SHC008V)shRNA Positive Control 2(HumanARHGDIA) (SHC009SHC009V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

Monitor

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)Non-Target shRNA 1(SHC002SHC002V)Non-Target shRNA 2(SHC016SHC016V)TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)Non-Target shRNA 1(SHC202SHC202V)Non-Target shRNA 2(SHC216SHC216V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

MISSION shRNA Controls

NegativePositive

UbC-TagFP635 trade UbC-TurboGFP trade CMV-TagFP635 trade CMV-TagYFP trade CMV-TagCFP trade

sigma-aldrichcomcontrols

MISSIONreg shRNA コントロール製品群

shRNA

14

Packaging PlasmidsMISSIONreg Lentiviral Packaging Mix はMISSION TRC shRNA コレクションに最適化したパッケージング用プラスミドのプレミックス製品です本製品にはレンチウイルスの構造および複製に関与する遺伝子（gag および pol）を有するパッケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ドVSV-G エ ン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエンベロープベクターから成ります本製品は独自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用いただけますがシグマ アルドリッチでは時間を節約し品質を確保するために弊社がご提供するウイルスフォーマットのコレクションをご使用いただくことを強くお勧めいたします

製品名 カタログ番号 価格

MISSION lentiviral Packaging MixSHP001-025ML yen50000SHP001-17ML yen175000

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

Assembly ampBudding

Maturation

pMISSION GAG POL

12150 bp

ampR

Sv40

gag

CMV

pol

rev tat

insulin polyA

pMISSION VSV-G

5824 bp

CMV

VSV-G

Envelope VectorPackaging Vector

Lentiviral Packaging Mix

TransferVector

PackagingVector Envelope

Vector

組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

shRNAパッケージングプラスミドならびに関連製品

その他試薬

製品名 カタログ番号 価格 備考

Puromycin dihydrochloride P9620-10ML yen20900 調製済puromycin溶液

Hexadimethrine bromideH9268-5G yen8600

レンチウイルスの導入効率を向上H9268-10G yen12900H9268-50G yen49700

Protamine sulfateP3369-10G yen44400 レンチウイルスの導入効率を向上

Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効P3369-100G yen250000

Carbenicillin disodium saltC3416-250MG yen8700C3416-1G yen21800C3416-5G yen65800

Terrific Broth T5574-500ML yen11300 液体培地

Terrific Broth Modified EZMixtrade Powder T9179-6X500ML yen7900

顆粒T9179-2X5L yen18800

各種 MISSION 製品の添付資料はこちらからsigmacomshrnatechbull-jp

shRNA

15

マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

16

MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

3 UTRスクリーニング用MISSION miRNAライブラリー

MISSIONreg siRNAMISSION esiRNA

shRNAMISSION shRNA 概要 4MISSIONshRNA フォーマット選択ガイドおよび実験プロトコル 7選択用抗生物質（ピューロマイシン）濃度の最適化方法 9レンチウイルス感染効率評価方法10MISSION shRNA クローンご注文情報（価格納期等） 11MISSION shRNA クローンご注文方法 12コントロール shRNA 13shRNA パッケージングプラスミドならびに関連製品 14レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズ ExpressMag 15カスタム shRNA 用ベクター 16IPTG 発現誘導用 shRNA ベクター 17ゲノムの特定領域上への shRNA 導入用ベクター 18スクリーニング用 MISSION shRNA ライブラリー概要 19MISSION shRNA ライブラリーによる全ゲノムスクリーニング 20遺伝子機能別 shRNA ライブラリー 21プール型全ゲノム shRNA ライブラリー 22カスタム shRNA ライブラリー 23

siRNAMISSION siRNA 概要 24カスタム siRNA 26in vivo 用 siRNA 27遺伝子機能別 siRNA ライブラリー 28小容量 siRNA （ヒトキナーゼ用ならびにフォスファターゼ用） 29

esiRNAMISSION esiRNA（プール型 siRNA） 30lncRNA ノックダウン用 MISSION esiRNA 32

miRNA成熟 miRNA ミミック 33MISSION 合成 miRNA インヒビター 34MISSION レンチウイルス型 miRNA インヒビター 35ヒト miRNA ターゲット網羅的探索用 3 UTR ライブラリー 36ヒト miRNA ターゲット確認用 3 UTR クローン 37miRNA 検出定量試薬 38

大腸菌グリセロールフォーマットおよびレンチウイルスフォーマットの MISSION RNAi 製品は全て「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」（通称カルタヘナ法）に基づく使用規制対象品です当該製品をご使用の際は関連法規に則り適切に取り扱ってください施設申請に必要な製品の詳細情報は sigmacomrnai-jp にてご確認ください

shRNA

4

製品特性および仕様 網羅的な shRNA コレクション

約 250000 のクローニング済み shRNA コンストラクト ヒト約 20000 以上マウス約 21000 以上の標的遺伝

子を網羅MISSION shRNA ライブラリーの概要は RNAi に最適なレンチウイルスをベースとしたシステム

一過性ノックダウン 安定的ノックダウンのどちらにも応用可能

導入用のウイルス粒子もラインアップゲノムへの組み込みによる長期的ノックダウン非分裂細胞を含むほぼ全ての細胞種に導入可能インターフェロン応答を回避するデザイン組み換えによる導入配列の変異は認められておりません106 ～ 107 TUmL の高力価

高効率なノックダウン効果が得られる shRNA デザインBroad Institute のアルゴリズムによる配列特異性およ

び設計位置に基づいたスコアリング1 遺伝子あたり約 5 クローンで標的遺伝子を広範囲にカ

バー表現型レスキュー実験用の 3 UTR 領域にデザインした

shRNA も提供可能

様々なオプションを選択可能ベクターの変更（15 種類）

マーカー遺伝子詳細（16 ページ）タイターの変更（106-109 TUmL）ボリューム変更（01-10 mL）

トランスフェクションが困難な細胞や非分裂細胞での RNAi 実験やまたは効果的で高品質の長期ノックダウン実験系にはshRNA の利用が最適ですThe RNAi Consortium （TRC）とシグマ アルドリッチがさまざまな shRNA ソリューションをお届けします

TRC はマサチューセッツ工科大学とハーバード大学の合同出資により設立された研究機関であるブロード研究所（Broad Institute）に拠点を置き研究者や研究団体に RNAi ツールを提供するための世界的に有名な学術機関とライフサイエンス研究組織から構成されるコンソーシアムですシグマ アルドリッチはTRC のメンバーおよび協力パートナーとしてヒトおよびマウスのゲノムを標的とする TRC shRNA レンチウイルスライブラリー技術に基づいた高品質の製品とサービスをご提供できるよう努めています

ハイスループット（HT）に最適のシステムHT ウイルス作製ハイスループットスクリーニングおよびハイコンテントスク

リーニングの実績あり

信頼性の高い製造システム最先端のロボットバーコードおよび LIMS による追跡管理文書の使用研究開発製造品質管理および品質保証の専門家か

らなる熟練のスタッフ

豊富な製品フォーマットプールドタイプのウイルス全ライブラリー（LentiPlexreg）遺伝子ファミリーセットターゲットセットおよび単一クローン大腸菌グリセロールプラスミド DNAレンチウイルスパー

ティクルの 3 種類のフォーマット

レンチウイルス shRNA 製品のリーダー高い先端技術力に裏打ちされた製品とサービス広範囲にわたるウェブベースのリソース技術および研究開発の専門家による充実したサポート

TRC2 クローンはシグマ アルドリッチの独占販売です約 50000 クローン以上の新規クローン数千遺伝子の新規ターゲット遺伝子30000 以上のバリデート済みクローン

あらゆる細胞への安定したRNAiを実現MISSIONreg shRNA概要

バリデートデータと保証の範囲保証の範囲

MISSION shRNA は Broad Institute によって開発された独自のアルゴリズムに基づいてクローンセット中1 クローン以上が 70 以上のノックダウンレベルを示す事を保証します

保証の条件保証は下記条件を全て満たした場合のみ適用となりますクローンセット（11 ページ）をご購入いただいた場合適切なコントロールにてノックダウンを検証済みの場合実験系でノックダウンが確認されなかった場合は導

入された shRNA が十分に発現している事を確認した場合

ノックダウンが確認されなかったら下記何れかの方法で対応させていただきます

別のクローンを 1 つ無償提供別の製品によって金額相当の無償提供金額相当のご返金弊社営業またはテクニカルサポートまでご連絡ください

バリデートデータとはバリデートデータはBroad Institute にて 50以上のノックダウン効果を示したものを表示しておりますこれらのデータは表示の手法表示の細胞において検証されたノックダウンレベルとなりますお客様の実験系におけるノックダウンレベルを保証したものではありません予めご了承ください

shRNA

5

ウイルスデリバリーシステムウイルスは様々な細胞株に感染するよう独自に進化を遂げてきましたその特長を利用してここ数十年間興味のある遺伝子を安全に標的細胞にデリバリーするためのベクター開発に向け種々のウイルスの遺伝子操作が行なわれてきましたそれぞれのウイルスシステム（Table 1）はそれぞれ利点と欠点を持ちますがレンチウイルスシステムではすべての用途で望ましいウイルスベクターとなる非常に多くの特長を持ちます現在のレンチウイルスシステムは複数世代の組換えと修飾により得られたレトロウイルスシステムの一種です

Feature Adeno-virus AAV Retro-

virusLenti- virus

非分裂細胞への感染 宿主ゲノムへの安定的な組み込み シュードタイプ作製 長いフラグメントの挿入 インターフェロン応答の回避 ゲノム内に転写サイレンシングに関する問題がない NA

Adeno-Associated Virus

Table 1 ウイルスシステムの比較

レンチウイルスシステム概要レンチウイルスシステムには遺伝子のデリバリーに特に有用となる多くの特性（広範な親和性安定的な組み込みなど）がありますFigure 1 は野生型レンチウイルスのライフサイクルを示しています野生型ウイルスが細胞に侵入し組み込みウイルス遺伝子を発現させることにより新しいビリオンを形成することが可能となります安全性を確保し導入遺伝子を挿入する十分な領域を確保するために今日のシステムではウイルス粒子の産生に必要なウイルス遺伝子を複数のプラスミド上に分けて組み込んでいます（Figure 2）トランスファーベクターは改変 Long Terminal Repeat（LTR）領域の間にシグナル配列とシス作用性配列を持ちますshRNA選択マーカーなどの導入遺伝子はトランスファーベクターの非ウイルスプロモーターの後方へクローニングされますウイルスの構造および複製に必要なすべての遺伝子は別のパッケージングベクター（通常 1 ～ 2 個）に搭載しますこれらの遺伝子にはさまざまなバージョンのウイルスgag オペロンおよび pol オペロンがあります通常さらに安全性を高めるためすべての野生型アクセサリー遺伝子を除去します最後にエンベロープベクターによりウイルス粒子の親和性を決定するエンベロープタンパクが供給され多彩な可能性を示す様々なシュードタイプウイルスが得られますシグマ アルドリッチでは広範な親和性を確保し非分裂細胞および最終分化細胞を含むほぼすべての細胞型に導入するために主に VSV-G（水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク）を持つシュードタイプウイルス粒子としております

Attachment

EntryMaturation

Assembly ampBudding

RNA Transcript

Export

Synthesis of viral Proteins Release of

Viral RNA

ReverseTranscription

ViralcDNA

Integration ofViral cDNA

Wild-TypeLentiviral Particles

Transcription

Figure 1野生型レンチウイルスの生活環

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

TransferVector

PackagingVector Packaging

Plasmids

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

PackagingVector

EnvelopeVector

EnvelopeVector

Assembly ampBudding

Maturation

Figure 2組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

MISSION Lentiviral Packaging Mix（14ページ）

Attachment

Entry

MISSIONLentiviralParticle

NO Virion Production

Release ofViral RNA

ReverseTranscription

Viral cDNA

Integration ofViral cDNA

Exported shRNA

Enter RNAiPathway Transcription

Figure 3MISSIONreg TRC shRNAレンチウイルス粒子による標的細胞への導入

shRNA

6

5 -

3 - UU

Sense Strand

Antisense Strand

Sense StrandCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT T T T TGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAA

Antisense StrandLoop

Loo

p

cPPT

TRC2-pLKO-puro7518 bp

hPGK

puroR

WPRE

pUC ori

RRE

SIN3rsquo LTR

RSV5 LTR

U6

f1 oriampR

Psi

TRC shRNA ベクターマップおよび特徴

RSV5rsquo LTR Chimeric LTR involved in replication and integration U3 substitution for safety

Psi (ψ) Packaging dimerization signal

RRE Involved in nuclear export of viral genome transcript during packaging

U6 Robust pol III promoter with precise initiation and termination of shRNA transcription at high levels

cPPT Role in cDNA synthesis and nuclear import in target cell

hPGK Promoter driving expression of puromycin resistance gene hPGK is weaker than U6 for assurance of high shRNA expression levels in stable selected cells

puroR Allows stable selection with puromycin

SIN3rsquo LTR LTR involved in replication and integration U3 deletion for safety

WPRE Woodchuck Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Element

5 -

3 - UU

Sense Strand

Antisense Strand

Sense StrandCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT T T T TGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAA

Antisense StrandLoop

Loo

p

cPPT

pLKO1-puro7086 bp

hPGK

puroR

pUC ori

RRE

SIN3rsquo LTR

RSV5 LTR

U6

f1 ori

ampR

Psi

Figure 4 TRC1 and TRC15 Vector Map (pLKO1-puro)

Figure 5 TRC2 Vector Map (TRC2-pLKO-puro)

レンチウイルスシステム概要 (contrsquod）レンチウイルス粒子はHEK293T 細胞などの産生細胞株内でパッケージングされます（Figure 2）プラスミド（トランスファーベクターパッケージングベクターおよびエンベロープベクター）を同時に導入させることによりすべての必要な配列を使用して興味のある導入遺伝子を含むウイルス粒子を作製しパッケージングすることができますトランスファーベクターのウイルス LTR の間の領域のみがウイルスのカプシド内にパッケージングされます得られたシュードウイルス粒子は力価を測定し標的細胞への導入に使用します（Figure 3）導入の際ウイルス LTR の間の領域は標的細胞のゲノムに組み込まれますこのシュードウイルス粒子には野生型ウイルスの遺伝子がないため野生型ウイルスのライフサイクルのように増殖することはおろか（Figure 1）複製もできません導入遺伝子の配列のみが細胞内で発現します（Figure 3）

MISSIONreg TRC shRNA コレクションshRNA 配列デザインMISSION TRC ライブラリーは約 20000 のヒト遺伝子と約 21000 のマウス遺伝子を標的とした合計 250000 を超えるクローン（各生物種約 120000 クローン）からなりますshRNA 配列はBroad Institute のアルゴリズムを使ってデザインされています本アルゴリズムでは配列特異性および標的遺伝子内の位置に基づき候補配列をスコアリングします候補配列はノックダウンの最適化とオフターゲット効果の最小化のバランスが取れていなければなりません転写産物の変異体の構造と配列がまだ十分に理解されていない等の理由もあり1 遺伝子あたり約 5 ～20 クローンをデザインし構築していますそのうち少なくとも 1 ～ 2 クローンでは非常に高いレベルのノックダウン効果が得られると予測されます

形質導入用ベクター候補配列は pLKO1-puro レンチウイルスベクターにクローニングされています（Figure 4）pLKO1 ベクターの骨格により大腸菌内での増殖や選択哺乳動物細胞での

（一時的なまたは長期間の）発現が可能になりますまたプラスミド DNA を用いることによりshRNA の配列を持つウイルス粒子を産生することができます（Figure 2）TRC2 では候補配列はTRC2-pLKO-puro レンチウイルスベクターにクローニングされています（Figure 5）このベクターには shRNA の発現を安定化させる WPRE を導入しています

MISSION ベクターコレクション（カスタム品）もご提供可能です（16ページ）

shRNA

7

MISSIONshRNA のレンチウイルスパーティクルを用いたプロトコ－ルと各種フォーマット（レンチウイルスパーティクルプラスミド DNA大腸菌グリセロールストック）の選択ガイドを掲載しています

各種フォーマットの選択ガイド大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG）

一度ご購入いただき正しく保管いただければ何度でもご利用になれますレンチウイルスパーティクルの作製などの手間がかかります

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND） レンチウイルスパーティクルの作製もしくは目的の細胞へのトランスフェクションが必要です

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV）Ready-to-use の製品でご購入後直ちにトランスフェクションが可能ですただしウイルスパーティクルの再産生はできません

大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG）

プラスミド DNA 抽出精製

レンチウイルスにパッケージング（14 ページ）

目的の細胞にトランスフェクション

RNAi による遺伝子ノックダウン

目的の細胞にトランスフェクション

力価（titer）測定（10 ページ）

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV）

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）

大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG） プロトコール大腸菌の培養1 50 ～ 100 μL のストックを取り出します

滅菌した 05 mL の LB （抗生物質不含）に入れます2 37で 15 ～ 30 分間振とう培養します3 Carbenicillin （100 μgmL 製品番号 C3416）を含む寒

天培地に大腸菌培養液 25 ～ 50 μL をストリーク（画線培養）

4 37で 15 ～ 20 時間インキュベート5 シングルコロニーをピックしてプラスミド DNA の抽出を行

います

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）プロトコール適当なトランスフェクション方法で行いますトランスフェクションの方法は用いる試薬に適したプロトコールで行ってください

MISSIONregshRNA フォーマット選択ガイド および実験プロトコル

shRNA実験ワークフロー

shRNA

8

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV） プロトコールMISSIONreg shRNA レンチウイルスを感染させる基本的なプロトコールを記載しています1 日目

1トランスフェクションの 24 時間前に哺乳動物細胞をプレートに撒いて培養

2 トランスフェクションは 50 ～ 80コンフルエントで行う

2 日目1 ウイルスパーティクルストックを氷上に出してゆっくり

解凍2 Hexadimethrine bromide を細胞に添加（最終濃

度 8 microgmL）して振とう　 トランスフェクション効率を高める（ただし神経

細胞の初代培養などには不適）3 適した量（MOI）のウイルスパーティクルを添加して

振とう　 初めての場合は幾つかのmultiplicity of infection

（MOI）を試す（05 - 20など）　 MOI 細胞に対するウイルス粒子の個数　　（1 ウェル中の全細胞数） x （目的の MOI）= （必要な TU） 　　（必要な TU） （CoA に書かれている TUmL） 　　= （1 ウェルに添加するレンチウイルス粒子の容量）4 37で一晩インキュベート 　 一晩のインキュベートで細胞毒性が生じる場合は

4 時間インキュベーションを行った後に培地交換

3 日目1 ウイルスパーティクルを含む培地を除去2 新しい培地に置換

4 日目a トランジェント（一過性発現）で実験する場合　 細胞を回収して qRT-PCR などでノックダウン効率

を検証するb ステーブル（安定発現）で実験する場合　 培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に交換

（方法は下記に記載）　 細胞により至適濃度は異なるが1 ～ 10 microgmL が

標準的

5 日目以降（ステーブルの場合のみ）3 ～ 4 日ごとに培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に置換 （一般的に 10 ～ 12 日後くらいでクローンが確立できる）5 クローン以上をピックしてノックダウン効果を検証する

ピューロマイシンによるセレクション（最適化法9 ページ）1 96 穴プレート各ウェルに 16x104 細胞 と 120 μL の培

地を用意する2 次の日に 1 ～ 10 μgmL となるようピューロマイシン

を分注する3 2 日後に生細胞を調べる4 3 日間ごとにピューロマイシン入りの培地に交換し

3 ～ 14 日間培養し最適な選択期間を検討する

各トランスフェクションは ExpressMagreg レンチウイルスデリバリーシステムを用いて1 日ずつ短縮することも可能ですまた導入しにくい細胞系などをご利用の際にも ExpressMag をご利用くださいExpressMag（15ページ）

shRNA実験情報に関するシグマ アルドリッチURL

shRNA TOP( 各種製品添付資料技術資料FAQ などもこちら )sigmacomshrna-jp

細胞実施例sigmacomshtable

shRNA

9

使用する細胞により最適な抗生物質の濃度は異なります初めて使用する細胞などで適切な抗生物質濃度がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる検討を行い細胞ストレスを低減するためにできる限り低濃度で且つ効率の高い抗生物質濃度を決定しておく必要があります多くの場合shRNA ベクターが導入されていない細胞は 1-10 μgmL の濃度で死滅します

選択用抗生物質（ピューロマイシン）濃度の最適化方法

必要な試薬と機器ピューロマイシン溶液（製品番号 P9620）培養液　　ノックダウン対象の細胞の増殖維持に適した培地（DMEM + 10 FCS など）

培養用インキュベーター6 ウェルプレート

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ50 の細胞密度となるよう細胞を播種（ex 2 x 105 cellwell）2 一晩インキュベート

Day 13 培地を温めておく4 ピューロマイシンの希釈系列（ex 0 10 25 50 75 100 microgmL）を培地を用いて調整5 培地をピューロマイシンを含む選択培地に交換6 それぞれのウェルの生細胞数を測定

Day 3-107 ２日毎に選択培地に交換し死細胞を除去8 ２日毎に生細胞数を測定

Day 109 細胞の死滅曲線を描き選択培地で培養した７ー 10 日の間に細胞が 100死滅したピューロマイシン濃度

を決定する

備考ピューロマイシンの凍結融解は最小限にとどめ選択培地は用事調製する10 μgmL 以上のピューロマイシン濃度が必要であった場合ピューロマイシンの使用期限を確認する

参考ピューロマイシン濃度Hela 3 microgmL HEK293 3 microgmL B16 1-3 microgmL PC10 10 microgmL A431 1 microgmL Jurkat 4 microgmL

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

shRNA

10

使用する細胞によりレンチウイルスの感染効率は異なります初めて使用する細胞などで適切な条件がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる条件検討を行い最適な Multiplicity Of Infection（MOI）を決定しておく必要がありますMISSIONreg TurboGFP trade コントロール（SHC003V）をご利用いただくと簡便に最適な MOI を決定することが可能です

TurboGFP コントロール（SHC003V）で用いられている CMV プロモーターは幹細胞リンパ球初代神経細胞などでその発現活性があまり高くないことが知られておりこれら細胞から得られる GFP シグナルが減少するため感染効率を実際よりも低く見積もってしまう場合がありますそれらの細胞において感染効率評価を実施する場合は限外希釈法を用いる必要があります

レンチウイルス感染効率評価方法

必要な試薬と機器TurboGFP コントロール（製品番号 SHC003V）Hexadimethrine bromide（製品番号 H9268）または Protamine sulfate（製品番号 P3369）培地培養用インキュベーター蛍光顕微鏡および GFP 用フィルター

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ24 時間後に細胞密度が 50となるよう細胞を播種2 一晩インキュベート

Day 13 レンチウイルスコントロール（製品番号 SHC003V）を室温にて溶解4 チューブを指で軽く弾き撹拌し氷上で保存する5 コントロールの段階希釈系列（10 倍希釈）を調整し各ウェルへ添加し振とう6 Hexadimethrine bromide または Protamine sulfate を終濃度 8 microgmL となるように添加し振とう7 18-20 時間インキュベート

Day 28 培地交換しウイルスを含む培地を除去9 さらに 24-48 時間インキュベートしGFP を十分発現させる多くの場合TurboGFP は感染後 72 時間後

に強い発現を示す

Day 3-510 蛍光顕微鏡下で観察しTurboGFP 発現細胞の割合が最も高い条件を決定する

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

Multiplicity Of Infection (MOI) 算出式

MOI　 =ウイルスタイター（TUmL） x 容量（mL）

細胞数

shRNA

11

本製品はカルタヘナ法該当製品です数十万クローンから構成され数万遺伝子を標的とするライブラリーから製品仕様をご選択いただく必要がありお手数ではございますがご注文の仕様をご指定いただくための専用『ご注文用紙』（12ページ⑤）にご記入いただいております必要な情報をご記入後に弊社代理店へご注文用紙をお渡しください弊社ウェブサイトに掲載しておりますご注文用紙はPDF に直接ご入力いただけます製品を検索いただいたのち必要な情報をコピー amp ペーストにてご入力いただけますPDF は sigmacomshrna-jp　からご取得ください

個別クローン基本価格（1 クローンご注文の場合の単価）フォーマット 製品番号 価格 納期 基本仕様

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen25000 2-3週間 保管温度-70 内容物Terrific Broth carbenicillin 100 μgmL 15 glycerol

精製プラスミドDNA SHCLND yen60000 3-4週間 保管温度-20 容量40 μL 内容物1 μg プラスミドDNA（20 ngμL Tris-EDTA buffer）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen70000 4-6週間 保管温度-70 容量200 μL 内容物≧106 TUmL液体培地（DMEM 10 FBS penicillin-streptomycin）

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません

5 クローンセット割引価格（5 クローン以上ある製品に適用） ある遺伝子（RefSeq）に対する shRNA クローンを同一生物種同一フォーマットから 2 クローン以上お求めの場合は

お得な 5 クローンセットでお申し込み下さいターゲット遺伝子に対して 5 クローン以上製品が無い場合には別途お問合せ下さい　（その場合全クローンお選びいただければセット価格が適用になります）6 クローン以上ご購入いただく場合は5 クローンセット時の 1 クローン単価timesクローンの個数となります納期は 1 クローンご注文の場合と同様ですクローンセットでご購入の場合バリデート保証が適用されます（4ページ）

フォーマット 製品番号 5 クローンセット合計価格 1 クローン単価 納期

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen50000 yen10000 1 クローンと同様（上記表を参照）

精製プラスミドDNA SHCLND yen115000 yen23000 1 クローンと同様（上記表を参照）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen125005 yen25001 1 クローンと同様（上記表を参照）

オプション価格（ベクター変更タイター変更容量変更）カスタムベクターの詳細についてはカスタムクローニングサービス

のご紹介を参照ください（16 ページ） 1 クローンまたは 5 クローンセット価格に各オプション金額が加

算されますオプション選択時にも5 クローンセット割引価格は適用となります

（5 クローンセットでお求めの際は全てのクローンにおいて同一オプションとなります）

納期は1 オプションにつき通常納期に 2 週間ずつ加算されますオプションの種類 1 クローン購入時 5 クローンセットで購入時

（5 クローン合計） 納期

ベクター変更各種（プラスミドDNA）

+ yen70000 + yen190000 + 2 週間各種（レンチウイルスパーティクル）

タイター変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様1x106 TUmL

1x107 TUmL + yen97000 + yen485000 + 2 週間1x108 TUmL + yen155800 + yen779000 + 2 週間1x109 TUmL + yen305800 + yen1529000 + 2 週間

容量変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様02 mL

01 mL - yen15200 - yen76000 変更なし10 mL + yen15000 + yen75000 + 2 週間20 mL + yen23400 + yen117000 + 2 週間50 mL + yen32800 + yen164000 + 2 週間100 mL + yen43000 + yen215000 + 2 週間

107 TUmL 以上のタイターオプションとの併用時のみ選択可能です

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません 25 クローン以下の購入の場合 バイアル（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷 大腸菌フォーマットは 14 mL TrakMates チューブでの出荷 26 クローン以上の購入の場合 96-well Plate（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷Plate Map CD-ROM 付き

価格　－ 計算例 － セット価格で計算した場合

納品形態レンチウイルスパーティクル（製品番号SHCLNV）

①クローン数5 クローンセット yen125005

②オプションベクター変更（pLKO1-CMV-Neo） yen156000

仕様合計（①と②の合計） yen366000

MISSIONreg shRNA クローンご注文情報

shRNA

12

shRNAご注文方法シグマ アルドリッチウェブサイトの情報検索ウィンドウよりターゲット遺伝子に対する MISSIONregshRNA クローンの検索を行うことができます

① sigmacomjapan

③生物種とフォーマット選択

④クローンの選択

⑤専用注文用紙に記入sigmacomshrna-jp より専用発注書をダウンロードしAcrobat Reader などで開きクローン番号など必要な情報をご入力ください（追記型 PDFファイルのため直接タイプ ペーストしていただけます）

⑥代理店様に発注発注書に必要事項を入力後再度保存しメール添付ファイルの形で代理店様にご発注ください

②ターゲット遺伝子選択

遺伝子名やAccession No で検索

ターゲット遺伝子を探し青字の製品カテゴリーにある『shRNA』をクリック

生物種（ヒトマウス）および3 種類のフォーマット よりご希望の製品番号に該当するldquo価格rdquoボタンをクリック

各クローンの情報（ターゲット遺伝子情報バリデーションの有無配列TRC バージョン情報など）が表示されるのでこれらの情報より目的クローンを選択一部のオプションはプルダウンでご選択いただけますオプションには別途費用が発生いたしますご注意ください

カスタムサービスも承りますお見積もり依頼はコチラ

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shRNA

13

コントロールshRNA各種コントロールをご利用いただけますフォーマット蛍光マーカープロモーターなどから細胞や実験に適した製品をご選択ください高タイターのコントロールをご希望の場合は別途ご相談ください

各コントロールを MOI = 5 にて導入した A549 細胞（上図は明視野下図は蛍光画像）

コントロール一覧 　

用途 製品名製品番号

希望販売価格TRC1 series TRC2 seriesPlasmid DNA Lentiviral Plasmid DNA Lentiviral

ネガティブコントロールpLKO1-puro Non-Target shRNA Control 1 SHC002 SHC002V SHC202 SHC202V yen59000

pLKO1-puro Non-Target shRNA Control 2 SHC016 SHC016V SHC216 SHC216V yen59000

蛍光タンパク質トランスダクションコントロール

（ポジティブコントロール）

pLKO1-puro CMV-TurboGFP SHC003 SHC003V SHC203 SHC203V

製品番号になしの製品

yen59000

ありの製品yen93000

pLKO1-puro CMV-TagCFPtrade SHC010 SHC010V - -

pLKO1-puro CMV-TagYFPtrade SHC011 SHC011V - -

pLKO1-puro CMV-TagRFPtrade SHC012 SHC012V - -

pLKO1-puro CMV-TagFP635trade SHC013 SHC013V - -

pLKO1-puro UbC-TurboGFP SHC014 SHC014V - -

pLKO1-puro UbC-TagFP635 SHC015 SHC015V - -

外来性遺伝子用shRNAコントロール

TurboGFP shRNA Control SHC004 SHC004V SHC204 SHC204V yen59000

eGFP shRNA Control SHC005 SHC005V - - yen59000

Luciferase shRNA Control SHC007 SHC007V - - yen59000

内在性遺伝子用shRNAコントロール

shRNA Human Positive Control 1（B2M） SHC008 SHC008V - - yen59000

shRNA Human Positive Control 2（ARHGDIA） SHC009 SHC009V - - yen59000

Emptyコントロールベクター pLKO1-puro Control SHC001 SHC001V SHC201 SHC201V yen59000仕様 plasmid DNA 5 μg DNA -20 stock 500 ng μL TE buffer

Lentiviral 4 x 50 μL -70 stock 106 TUmL (via p24 titering assay) ハイタイターコントロールのご用意もございます別途お問合せ下さい

Transduction Knockdown

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)TurboGFP(SHC003SHC003V)TagCFP(SHC010SHC010V)TagYFP(SHC011SHC011V)TagRFP(SHC012SHC012V)TagFP635(SHC013SHC013V)UbC-TurboGFP(SHC014SHC014V)UbC-TagFP635(SHC015SHC015V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)TurboGFP(SHC203SHC203V)

TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)shRNA Positive Control 1(HumanB2M) (SHC008SHC008V)shRNA Positive Control 2(HumanARHGDIA) (SHC009SHC009V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

Monitor

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)Non-Target shRNA 1(SHC002SHC002V)Non-Target shRNA 2(SHC016SHC016V)TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)Non-Target shRNA 1(SHC202SHC202V)Non-Target shRNA 2(SHC216SHC216V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

MISSION shRNA Controls

NegativePositive

UbC-TagFP635 trade UbC-TurboGFP trade CMV-TagFP635 trade CMV-TagYFP trade CMV-TagCFP trade

sigma-aldrichcomcontrols

MISSIONreg shRNA コントロール製品群

shRNA

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Packaging PlasmidsMISSIONreg Lentiviral Packaging Mix はMISSION TRC shRNA コレクションに最適化したパッケージング用プラスミドのプレミックス製品です本製品にはレンチウイルスの構造および複製に関与する遺伝子（gag および pol）を有するパッケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ドVSV-G エ ン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエンベロープベクターから成ります本製品は独自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用いただけますがシグマ アルドリッチでは時間を節約し品質を確保するために弊社がご提供するウイルスフォーマットのコレクションをご使用いただくことを強くお勧めいたします

製品名 カタログ番号 価格

MISSION lentiviral Packaging MixSHP001-025ML yen50000SHP001-17ML yen175000

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

Assembly ampBudding

Maturation

pMISSION GAG POL

12150 bp

ampR

Sv40

gag

CMV

pol

rev tat

insulin polyA

pMISSION VSV-G

5824 bp

CMV

VSV-G

Envelope VectorPackaging Vector

Lentiviral Packaging Mix

TransferVector

PackagingVector Envelope

Vector

組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

shRNAパッケージングプラスミドならびに関連製品

その他試薬

製品名 カタログ番号 価格 備考

Puromycin dihydrochloride P9620-10ML yen20900 調製済puromycin溶液

Hexadimethrine bromideH9268-5G yen8600

レンチウイルスの導入効率を向上H9268-10G yen12900H9268-50G yen49700

Protamine sulfateP3369-10G yen44400 レンチウイルスの導入効率を向上

Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効P3369-100G yen250000

Carbenicillin disodium saltC3416-250MG yen8700C3416-1G yen21800C3416-5G yen65800

Terrific Broth T5574-500ML yen11300 液体培地

Terrific Broth Modified EZMixtrade Powder T9179-6X500ML yen7900

顆粒T9179-2X5L yen18800

各種 MISSION 製品の添付資料はこちらからsigmacomshrnatechbull-jp

shRNA

15

マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

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MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

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IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

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レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

4

製品特性および仕様 網羅的な shRNA コレクション

約 250000 のクローニング済み shRNA コンストラクト ヒト約 20000 以上マウス約 21000 以上の標的遺伝

子を網羅MISSION shRNA ライブラリーの概要は RNAi に最適なレンチウイルスをベースとしたシステム

一過性ノックダウン 安定的ノックダウンのどちらにも応用可能

導入用のウイルス粒子もラインアップゲノムへの組み込みによる長期的ノックダウン非分裂細胞を含むほぼ全ての細胞種に導入可能インターフェロン応答を回避するデザイン組み換えによる導入配列の変異は認められておりません106 ～ 107 TUmL の高力価

高効率なノックダウン効果が得られる shRNA デザインBroad Institute のアルゴリズムによる配列特異性およ

び設計位置に基づいたスコアリング1 遺伝子あたり約 5 クローンで標的遺伝子を広範囲にカ

バー表現型レスキュー実験用の 3 UTR 領域にデザインした

shRNA も提供可能

様々なオプションを選択可能ベクターの変更（15 種類）

マーカー遺伝子詳細（16 ページ）タイターの変更（106-109 TUmL）ボリューム変更（01-10 mL）

トランスフェクションが困難な細胞や非分裂細胞での RNAi 実験やまたは効果的で高品質の長期ノックダウン実験系にはshRNA の利用が最適ですThe RNAi Consortium （TRC）とシグマ アルドリッチがさまざまな shRNA ソリューションをお届けします

TRC はマサチューセッツ工科大学とハーバード大学の合同出資により設立された研究機関であるブロード研究所（Broad Institute）に拠点を置き研究者や研究団体に RNAi ツールを提供するための世界的に有名な学術機関とライフサイエンス研究組織から構成されるコンソーシアムですシグマ アルドリッチはTRC のメンバーおよび協力パートナーとしてヒトおよびマウスのゲノムを標的とする TRC shRNA レンチウイルスライブラリー技術に基づいた高品質の製品とサービスをご提供できるよう努めています

ハイスループット（HT）に最適のシステムHT ウイルス作製ハイスループットスクリーニングおよびハイコンテントスク

リーニングの実績あり

信頼性の高い製造システム最先端のロボットバーコードおよび LIMS による追跡管理文書の使用研究開発製造品質管理および品質保証の専門家か

らなる熟練のスタッフ

豊富な製品フォーマットプールドタイプのウイルス全ライブラリー（LentiPlexreg）遺伝子ファミリーセットターゲットセットおよび単一クローン大腸菌グリセロールプラスミド DNAレンチウイルスパー

ティクルの 3 種類のフォーマット

レンチウイルス shRNA 製品のリーダー高い先端技術力に裏打ちされた製品とサービス広範囲にわたるウェブベースのリソース技術および研究開発の専門家による充実したサポート

TRC2 クローンはシグマ アルドリッチの独占販売です約 50000 クローン以上の新規クローン数千遺伝子の新規ターゲット遺伝子30000 以上のバリデート済みクローン

あらゆる細胞への安定したRNAiを実現MISSIONreg shRNA概要

バリデートデータと保証の範囲保証の範囲

MISSION shRNA は Broad Institute によって開発された独自のアルゴリズムに基づいてクローンセット中1 クローン以上が 70 以上のノックダウンレベルを示す事を保証します

保証の条件保証は下記条件を全て満たした場合のみ適用となりますクローンセット（11 ページ）をご購入いただいた場合適切なコントロールにてノックダウンを検証済みの場合実験系でノックダウンが確認されなかった場合は導

入された shRNA が十分に発現している事を確認した場合

ノックダウンが確認されなかったら下記何れかの方法で対応させていただきます

別のクローンを 1 つ無償提供別の製品によって金額相当の無償提供金額相当のご返金弊社営業またはテクニカルサポートまでご連絡ください

バリデートデータとはバリデートデータはBroad Institute にて 50以上のノックダウン効果を示したものを表示しておりますこれらのデータは表示の手法表示の細胞において検証されたノックダウンレベルとなりますお客様の実験系におけるノックダウンレベルを保証したものではありません予めご了承ください

shRNA

5

ウイルスデリバリーシステムウイルスは様々な細胞株に感染するよう独自に進化を遂げてきましたその特長を利用してここ数十年間興味のある遺伝子を安全に標的細胞にデリバリーするためのベクター開発に向け種々のウイルスの遺伝子操作が行なわれてきましたそれぞれのウイルスシステム（Table 1）はそれぞれ利点と欠点を持ちますがレンチウイルスシステムではすべての用途で望ましいウイルスベクターとなる非常に多くの特長を持ちます現在のレンチウイルスシステムは複数世代の組換えと修飾により得られたレトロウイルスシステムの一種です

Feature Adeno-virus AAV Retro-

virusLenti- virus

非分裂細胞への感染 宿主ゲノムへの安定的な組み込み シュードタイプ作製 長いフラグメントの挿入 インターフェロン応答の回避 ゲノム内に転写サイレンシングに関する問題がない NA

Adeno-Associated Virus

Table 1 ウイルスシステムの比較

レンチウイルスシステム概要レンチウイルスシステムには遺伝子のデリバリーに特に有用となる多くの特性（広範な親和性安定的な組み込みなど）がありますFigure 1 は野生型レンチウイルスのライフサイクルを示しています野生型ウイルスが細胞に侵入し組み込みウイルス遺伝子を発現させることにより新しいビリオンを形成することが可能となります安全性を確保し導入遺伝子を挿入する十分な領域を確保するために今日のシステムではウイルス粒子の産生に必要なウイルス遺伝子を複数のプラスミド上に分けて組み込んでいます（Figure 2）トランスファーベクターは改変 Long Terminal Repeat（LTR）領域の間にシグナル配列とシス作用性配列を持ちますshRNA選択マーカーなどの導入遺伝子はトランスファーベクターの非ウイルスプロモーターの後方へクローニングされますウイルスの構造および複製に必要なすべての遺伝子は別のパッケージングベクター（通常 1 ～ 2 個）に搭載しますこれらの遺伝子にはさまざまなバージョンのウイルスgag オペロンおよび pol オペロンがあります通常さらに安全性を高めるためすべての野生型アクセサリー遺伝子を除去します最後にエンベロープベクターによりウイルス粒子の親和性を決定するエンベロープタンパクが供給され多彩な可能性を示す様々なシュードタイプウイルスが得られますシグマ アルドリッチでは広範な親和性を確保し非分裂細胞および最終分化細胞を含むほぼすべての細胞型に導入するために主に VSV-G（水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク）を持つシュードタイプウイルス粒子としております

Attachment

EntryMaturation

Assembly ampBudding

RNA Transcript

Export

Synthesis of viral Proteins Release of

Viral RNA

ReverseTranscription

ViralcDNA

Integration ofViral cDNA

Wild-TypeLentiviral Particles

Transcription

Figure 1野生型レンチウイルスの生活環

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

TransferVector

PackagingVector Packaging

Plasmids

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

PackagingVector

EnvelopeVector

EnvelopeVector

Assembly ampBudding

Maturation

Figure 2組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

MISSION Lentiviral Packaging Mix（14ページ）

Attachment

Entry

MISSIONLentiviralParticle

NO Virion Production

Release ofViral RNA

ReverseTranscription

Viral cDNA

Integration ofViral cDNA

Exported shRNA

Enter RNAiPathway Transcription

Figure 3MISSIONreg TRC shRNAレンチウイルス粒子による標的細胞への導入

shRNA

6

5 -

3 - UU

Sense Strand

Antisense Strand

Sense StrandCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT T T T TGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAA

Antisense StrandLoop

Loo

p

cPPT

TRC2-pLKO-puro7518 bp

hPGK

puroR

WPRE

pUC ori

RRE

SIN3rsquo LTR

RSV5 LTR

U6

f1 oriampR

Psi

TRC shRNA ベクターマップおよび特徴

RSV5rsquo LTR Chimeric LTR involved in replication and integration U3 substitution for safety

Psi (ψ) Packaging dimerization signal

RRE Involved in nuclear export of viral genome transcript during packaging

U6 Robust pol III promoter with precise initiation and termination of shRNA transcription at high levels

cPPT Role in cDNA synthesis and nuclear import in target cell

hPGK Promoter driving expression of puromycin resistance gene hPGK is weaker than U6 for assurance of high shRNA expression levels in stable selected cells

puroR Allows stable selection with puromycin

SIN3rsquo LTR LTR involved in replication and integration U3 deletion for safety

WPRE Woodchuck Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Element

5 -

3 - UU

Sense Strand

Antisense Strand

Sense StrandCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT T T T TGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAA

Antisense StrandLoop

Loo

p

cPPT

pLKO1-puro7086 bp

hPGK

puroR

pUC ori

RRE

SIN3rsquo LTR

RSV5 LTR

U6

f1 ori

ampR

Psi

Figure 4 TRC1 and TRC15 Vector Map (pLKO1-puro)

Figure 5 TRC2 Vector Map (TRC2-pLKO-puro)

レンチウイルスシステム概要 (contrsquod）レンチウイルス粒子はHEK293T 細胞などの産生細胞株内でパッケージングされます（Figure 2）プラスミド（トランスファーベクターパッケージングベクターおよびエンベロープベクター）を同時に導入させることによりすべての必要な配列を使用して興味のある導入遺伝子を含むウイルス粒子を作製しパッケージングすることができますトランスファーベクターのウイルス LTR の間の領域のみがウイルスのカプシド内にパッケージングされます得られたシュードウイルス粒子は力価を測定し標的細胞への導入に使用します（Figure 3）導入の際ウイルス LTR の間の領域は標的細胞のゲノムに組み込まれますこのシュードウイルス粒子には野生型ウイルスの遺伝子がないため野生型ウイルスのライフサイクルのように増殖することはおろか（Figure 1）複製もできません導入遺伝子の配列のみが細胞内で発現します（Figure 3）

MISSIONreg TRC shRNA コレクションshRNA 配列デザインMISSION TRC ライブラリーは約 20000 のヒト遺伝子と約 21000 のマウス遺伝子を標的とした合計 250000 を超えるクローン（各生物種約 120000 クローン）からなりますshRNA 配列はBroad Institute のアルゴリズムを使ってデザインされています本アルゴリズムでは配列特異性および標的遺伝子内の位置に基づき候補配列をスコアリングします候補配列はノックダウンの最適化とオフターゲット効果の最小化のバランスが取れていなければなりません転写産物の変異体の構造と配列がまだ十分に理解されていない等の理由もあり1 遺伝子あたり約 5 ～20 クローンをデザインし構築していますそのうち少なくとも 1 ～ 2 クローンでは非常に高いレベルのノックダウン効果が得られると予測されます

形質導入用ベクター候補配列は pLKO1-puro レンチウイルスベクターにクローニングされています（Figure 4）pLKO1 ベクターの骨格により大腸菌内での増殖や選択哺乳動物細胞での

（一時的なまたは長期間の）発現が可能になりますまたプラスミド DNA を用いることによりshRNA の配列を持つウイルス粒子を産生することができます（Figure 2）TRC2 では候補配列はTRC2-pLKO-puro レンチウイルスベクターにクローニングされています（Figure 5）このベクターには shRNA の発現を安定化させる WPRE を導入しています

MISSION ベクターコレクション（カスタム品）もご提供可能です（16ページ）

shRNA

7

MISSIONshRNA のレンチウイルスパーティクルを用いたプロトコ－ルと各種フォーマット（レンチウイルスパーティクルプラスミド DNA大腸菌グリセロールストック）の選択ガイドを掲載しています

各種フォーマットの選択ガイド大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG）

一度ご購入いただき正しく保管いただければ何度でもご利用になれますレンチウイルスパーティクルの作製などの手間がかかります

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND） レンチウイルスパーティクルの作製もしくは目的の細胞へのトランスフェクションが必要です

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV）Ready-to-use の製品でご購入後直ちにトランスフェクションが可能ですただしウイルスパーティクルの再産生はできません

大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG）

プラスミド DNA 抽出精製

レンチウイルスにパッケージング（14 ページ）

目的の細胞にトランスフェクション

RNAi による遺伝子ノックダウン

目的の細胞にトランスフェクション

力価（titer）測定（10 ページ）

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV）

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）

大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG） プロトコール大腸菌の培養1 50 ～ 100 μL のストックを取り出します

滅菌した 05 mL の LB （抗生物質不含）に入れます2 37で 15 ～ 30 分間振とう培養します3 Carbenicillin （100 μgmL 製品番号 C3416）を含む寒

天培地に大腸菌培養液 25 ～ 50 μL をストリーク（画線培養）

4 37で 15 ～ 20 時間インキュベート5 シングルコロニーをピックしてプラスミド DNA の抽出を行

います

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）プロトコール適当なトランスフェクション方法で行いますトランスフェクションの方法は用いる試薬に適したプロトコールで行ってください

MISSIONregshRNA フォーマット選択ガイド および実験プロトコル

shRNA実験ワークフロー

shRNA

8

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV） プロトコールMISSIONreg shRNA レンチウイルスを感染させる基本的なプロトコールを記載しています1 日目

1トランスフェクションの 24 時間前に哺乳動物細胞をプレートに撒いて培養

2 トランスフェクションは 50 ～ 80コンフルエントで行う

2 日目1 ウイルスパーティクルストックを氷上に出してゆっくり

解凍2 Hexadimethrine bromide を細胞に添加（最終濃

度 8 microgmL）して振とう　 トランスフェクション効率を高める（ただし神経

細胞の初代培養などには不適）3 適した量（MOI）のウイルスパーティクルを添加して

振とう　 初めての場合は幾つかのmultiplicity of infection

（MOI）を試す（05 - 20など）　 MOI 細胞に対するウイルス粒子の個数　　（1 ウェル中の全細胞数） x （目的の MOI）= （必要な TU） 　　（必要な TU） （CoA に書かれている TUmL） 　　= （1 ウェルに添加するレンチウイルス粒子の容量）4 37で一晩インキュベート 　 一晩のインキュベートで細胞毒性が生じる場合は

4 時間インキュベーションを行った後に培地交換

3 日目1 ウイルスパーティクルを含む培地を除去2 新しい培地に置換

4 日目a トランジェント（一過性発現）で実験する場合　 細胞を回収して qRT-PCR などでノックダウン効率

を検証するb ステーブル（安定発現）で実験する場合　 培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に交換

（方法は下記に記載）　 細胞により至適濃度は異なるが1 ～ 10 microgmL が

標準的

5 日目以降（ステーブルの場合のみ）3 ～ 4 日ごとに培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に置換 （一般的に 10 ～ 12 日後くらいでクローンが確立できる）5 クローン以上をピックしてノックダウン効果を検証する

ピューロマイシンによるセレクション（最適化法9 ページ）1 96 穴プレート各ウェルに 16x104 細胞 と 120 μL の培

地を用意する2 次の日に 1 ～ 10 μgmL となるようピューロマイシン

を分注する3 2 日後に生細胞を調べる4 3 日間ごとにピューロマイシン入りの培地に交換し

3 ～ 14 日間培養し最適な選択期間を検討する

各トランスフェクションは ExpressMagreg レンチウイルスデリバリーシステムを用いて1 日ずつ短縮することも可能ですまた導入しにくい細胞系などをご利用の際にも ExpressMag をご利用くださいExpressMag（15ページ）

shRNA実験情報に関するシグマ アルドリッチURL

shRNA TOP( 各種製品添付資料技術資料FAQ などもこちら )sigmacomshrna-jp

細胞実施例sigmacomshtable

shRNA

9

使用する細胞により最適な抗生物質の濃度は異なります初めて使用する細胞などで適切な抗生物質濃度がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる検討を行い細胞ストレスを低減するためにできる限り低濃度で且つ効率の高い抗生物質濃度を決定しておく必要があります多くの場合shRNA ベクターが導入されていない細胞は 1-10 μgmL の濃度で死滅します

選択用抗生物質（ピューロマイシン）濃度の最適化方法

必要な試薬と機器ピューロマイシン溶液（製品番号 P9620）培養液　　ノックダウン対象の細胞の増殖維持に適した培地（DMEM + 10 FCS など）

培養用インキュベーター6 ウェルプレート

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ50 の細胞密度となるよう細胞を播種（ex 2 x 105 cellwell）2 一晩インキュベート

Day 13 培地を温めておく4 ピューロマイシンの希釈系列（ex 0 10 25 50 75 100 microgmL）を培地を用いて調整5 培地をピューロマイシンを含む選択培地に交換6 それぞれのウェルの生細胞数を測定

Day 3-107 ２日毎に選択培地に交換し死細胞を除去8 ２日毎に生細胞数を測定

Day 109 細胞の死滅曲線を描き選択培地で培養した７ー 10 日の間に細胞が 100死滅したピューロマイシン濃度

を決定する

備考ピューロマイシンの凍結融解は最小限にとどめ選択培地は用事調製する10 μgmL 以上のピューロマイシン濃度が必要であった場合ピューロマイシンの使用期限を確認する

参考ピューロマイシン濃度Hela 3 microgmL HEK293 3 microgmL B16 1-3 microgmL PC10 10 microgmL A431 1 microgmL Jurkat 4 microgmL

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

shRNA

10

使用する細胞によりレンチウイルスの感染効率は異なります初めて使用する細胞などで適切な条件がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる条件検討を行い最適な Multiplicity Of Infection（MOI）を決定しておく必要がありますMISSIONreg TurboGFP trade コントロール（SHC003V）をご利用いただくと簡便に最適な MOI を決定することが可能です

TurboGFP コントロール（SHC003V）で用いられている CMV プロモーターは幹細胞リンパ球初代神経細胞などでその発現活性があまり高くないことが知られておりこれら細胞から得られる GFP シグナルが減少するため感染効率を実際よりも低く見積もってしまう場合がありますそれらの細胞において感染効率評価を実施する場合は限外希釈法を用いる必要があります

レンチウイルス感染効率評価方法

必要な試薬と機器TurboGFP コントロール（製品番号 SHC003V）Hexadimethrine bromide（製品番号 H9268）または Protamine sulfate（製品番号 P3369）培地培養用インキュベーター蛍光顕微鏡および GFP 用フィルター

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ24 時間後に細胞密度が 50となるよう細胞を播種2 一晩インキュベート

Day 13 レンチウイルスコントロール（製品番号 SHC003V）を室温にて溶解4 チューブを指で軽く弾き撹拌し氷上で保存する5 コントロールの段階希釈系列（10 倍希釈）を調整し各ウェルへ添加し振とう6 Hexadimethrine bromide または Protamine sulfate を終濃度 8 microgmL となるように添加し振とう7 18-20 時間インキュベート

Day 28 培地交換しウイルスを含む培地を除去9 さらに 24-48 時間インキュベートしGFP を十分発現させる多くの場合TurboGFP は感染後 72 時間後

に強い発現を示す

Day 3-510 蛍光顕微鏡下で観察しTurboGFP 発現細胞の割合が最も高い条件を決定する

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

Multiplicity Of Infection (MOI) 算出式

MOI　 =ウイルスタイター（TUmL） x 容量（mL）

細胞数

shRNA

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本製品はカルタヘナ法該当製品です数十万クローンから構成され数万遺伝子を標的とするライブラリーから製品仕様をご選択いただく必要がありお手数ではございますがご注文の仕様をご指定いただくための専用『ご注文用紙』（12ページ⑤）にご記入いただいております必要な情報をご記入後に弊社代理店へご注文用紙をお渡しください弊社ウェブサイトに掲載しておりますご注文用紙はPDF に直接ご入力いただけます製品を検索いただいたのち必要な情報をコピー amp ペーストにてご入力いただけますPDF は sigmacomshrna-jp　からご取得ください

個別クローン基本価格（1 クローンご注文の場合の単価）フォーマット 製品番号 価格 納期 基本仕様

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen25000 2-3週間 保管温度-70 内容物Terrific Broth carbenicillin 100 μgmL 15 glycerol

精製プラスミドDNA SHCLND yen60000 3-4週間 保管温度-20 容量40 μL 内容物1 μg プラスミドDNA（20 ngμL Tris-EDTA buffer）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen70000 4-6週間 保管温度-70 容量200 μL 内容物≧106 TUmL液体培地（DMEM 10 FBS penicillin-streptomycin）

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません

5 クローンセット割引価格（5 クローン以上ある製品に適用） ある遺伝子（RefSeq）に対する shRNA クローンを同一生物種同一フォーマットから 2 クローン以上お求めの場合は

お得な 5 クローンセットでお申し込み下さいターゲット遺伝子に対して 5 クローン以上製品が無い場合には別途お問合せ下さい　（その場合全クローンお選びいただければセット価格が適用になります）6 クローン以上ご購入いただく場合は5 クローンセット時の 1 クローン単価timesクローンの個数となります納期は 1 クローンご注文の場合と同様ですクローンセットでご購入の場合バリデート保証が適用されます（4ページ）

フォーマット 製品番号 5 クローンセット合計価格 1 クローン単価 納期

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen50000 yen10000 1 クローンと同様（上記表を参照）

精製プラスミドDNA SHCLND yen115000 yen23000 1 クローンと同様（上記表を参照）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen125005 yen25001 1 クローンと同様（上記表を参照）

オプション価格（ベクター変更タイター変更容量変更）カスタムベクターの詳細についてはカスタムクローニングサービス

のご紹介を参照ください（16 ページ） 1 クローンまたは 5 クローンセット価格に各オプション金額が加

算されますオプション選択時にも5 クローンセット割引価格は適用となります

（5 クローンセットでお求めの際は全てのクローンにおいて同一オプションとなります）

納期は1 オプションにつき通常納期に 2 週間ずつ加算されますオプションの種類 1 クローン購入時 5 クローンセットで購入時

（5 クローン合計） 納期

ベクター変更各種（プラスミドDNA）

+ yen70000 + yen190000 + 2 週間各種（レンチウイルスパーティクル）

タイター変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様1x106 TUmL

1x107 TUmL + yen97000 + yen485000 + 2 週間1x108 TUmL + yen155800 + yen779000 + 2 週間1x109 TUmL + yen305800 + yen1529000 + 2 週間

容量変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様02 mL

01 mL - yen15200 - yen76000 変更なし10 mL + yen15000 + yen75000 + 2 週間20 mL + yen23400 + yen117000 + 2 週間50 mL + yen32800 + yen164000 + 2 週間100 mL + yen43000 + yen215000 + 2 週間

107 TUmL 以上のタイターオプションとの併用時のみ選択可能です

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません 25 クローン以下の購入の場合 バイアル（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷 大腸菌フォーマットは 14 mL TrakMates チューブでの出荷 26 クローン以上の購入の場合 96-well Plate（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷Plate Map CD-ROM 付き

価格　－ 計算例 － セット価格で計算した場合

納品形態レンチウイルスパーティクル（製品番号SHCLNV）

①クローン数5 クローンセット yen125005

②オプションベクター変更（pLKO1-CMV-Neo） yen156000

仕様合計（①と②の合計） yen366000

MISSIONreg shRNA クローンご注文情報

shRNA

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shRNAご注文方法シグマ アルドリッチウェブサイトの情報検索ウィンドウよりターゲット遺伝子に対する MISSIONregshRNA クローンの検索を行うことができます

① sigmacomjapan

③生物種とフォーマット選択

④クローンの選択

⑤専用注文用紙に記入sigmacomshrna-jp より専用発注書をダウンロードしAcrobat Reader などで開きクローン番号など必要な情報をご入力ください（追記型 PDFファイルのため直接タイプ ペーストしていただけます）

⑥代理店様に発注発注書に必要事項を入力後再度保存しメール添付ファイルの形で代理店様にご発注ください

②ターゲット遺伝子選択

遺伝子名やAccession No で検索

ターゲット遺伝子を探し青字の製品カテゴリーにある『shRNA』をクリック

生物種（ヒトマウス）および3 種類のフォーマット よりご希望の製品番号に該当するldquo価格rdquoボタンをクリック

各クローンの情報（ターゲット遺伝子情報バリデーションの有無配列TRC バージョン情報など）が表示されるのでこれらの情報より目的クローンを選択一部のオプションはプルダウンでご選択いただけますオプションには別途費用が発生いたしますご注意ください

カスタムサービスも承りますお見積もり依頼はコチラ

httpgooglta5NTa

shRNA

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コントロールshRNA各種コントロールをご利用いただけますフォーマット蛍光マーカープロモーターなどから細胞や実験に適した製品をご選択ください高タイターのコントロールをご希望の場合は別途ご相談ください

各コントロールを MOI = 5 にて導入した A549 細胞（上図は明視野下図は蛍光画像）

コントロール一覧 　

用途 製品名製品番号

希望販売価格TRC1 series TRC2 seriesPlasmid DNA Lentiviral Plasmid DNA Lentiviral

ネガティブコントロールpLKO1-puro Non-Target shRNA Control 1 SHC002 SHC002V SHC202 SHC202V yen59000

pLKO1-puro Non-Target shRNA Control 2 SHC016 SHC016V SHC216 SHC216V yen59000

蛍光タンパク質トランスダクションコントロール

（ポジティブコントロール）

pLKO1-puro CMV-TurboGFP SHC003 SHC003V SHC203 SHC203V

製品番号になしの製品

yen59000

ありの製品yen93000

pLKO1-puro CMV-TagCFPtrade SHC010 SHC010V - -

pLKO1-puro CMV-TagYFPtrade SHC011 SHC011V - -

pLKO1-puro CMV-TagRFPtrade SHC012 SHC012V - -

pLKO1-puro CMV-TagFP635trade SHC013 SHC013V - -

pLKO1-puro UbC-TurboGFP SHC014 SHC014V - -

pLKO1-puro UbC-TagFP635 SHC015 SHC015V - -

外来性遺伝子用shRNAコントロール

TurboGFP shRNA Control SHC004 SHC004V SHC204 SHC204V yen59000

eGFP shRNA Control SHC005 SHC005V - - yen59000

Luciferase shRNA Control SHC007 SHC007V - - yen59000

内在性遺伝子用shRNAコントロール

shRNA Human Positive Control 1（B2M） SHC008 SHC008V - - yen59000

shRNA Human Positive Control 2（ARHGDIA） SHC009 SHC009V - - yen59000

Emptyコントロールベクター pLKO1-puro Control SHC001 SHC001V SHC201 SHC201V yen59000仕様 plasmid DNA 5 μg DNA -20 stock 500 ng μL TE buffer

Lentiviral 4 x 50 μL -70 stock 106 TUmL (via p24 titering assay) ハイタイターコントロールのご用意もございます別途お問合せ下さい

Transduction Knockdown

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)TurboGFP(SHC003SHC003V)TagCFP(SHC010SHC010V)TagYFP(SHC011SHC011V)TagRFP(SHC012SHC012V)TagFP635(SHC013SHC013V)UbC-TurboGFP(SHC014SHC014V)UbC-TagFP635(SHC015SHC015V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)TurboGFP(SHC203SHC203V)

TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)shRNA Positive Control 1(HumanB2M) (SHC008SHC008V)shRNA Positive Control 2(HumanARHGDIA) (SHC009SHC009V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

Monitor

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)Non-Target shRNA 1(SHC002SHC002V)Non-Target shRNA 2(SHC016SHC016V)TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)Non-Target shRNA 1(SHC202SHC202V)Non-Target shRNA 2(SHC216SHC216V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

MISSION shRNA Controls

NegativePositive

UbC-TagFP635 trade UbC-TurboGFP trade CMV-TagFP635 trade CMV-TagYFP trade CMV-TagCFP trade

sigma-aldrichcomcontrols

MISSIONreg shRNA コントロール製品群

shRNA

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Packaging PlasmidsMISSIONreg Lentiviral Packaging Mix はMISSION TRC shRNA コレクションに最適化したパッケージング用プラスミドのプレミックス製品です本製品にはレンチウイルスの構造および複製に関与する遺伝子（gag および pol）を有するパッケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ドVSV-G エ ン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエンベロープベクターから成ります本製品は独自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用いただけますがシグマ アルドリッチでは時間を節約し品質を確保するために弊社がご提供するウイルスフォーマットのコレクションをご使用いただくことを強くお勧めいたします

製品名 カタログ番号 価格

MISSION lentiviral Packaging MixSHP001-025ML yen50000SHP001-17ML yen175000

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

Assembly ampBudding

Maturation

pMISSION GAG POL

12150 bp

ampR

Sv40

gag

CMV

pol

rev tat

insulin polyA

pMISSION VSV-G

5824 bp

CMV

VSV-G

Envelope VectorPackaging Vector

Lentiviral Packaging Mix

TransferVector

PackagingVector Envelope

Vector

組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

shRNAパッケージングプラスミドならびに関連製品

その他試薬

製品名 カタログ番号 価格 備考

Puromycin dihydrochloride P9620-10ML yen20900 調製済puromycin溶液

Hexadimethrine bromideH9268-5G yen8600

レンチウイルスの導入効率を向上H9268-10G yen12900H9268-50G yen49700

Protamine sulfateP3369-10G yen44400 レンチウイルスの導入効率を向上

Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効P3369-100G yen250000

Carbenicillin disodium saltC3416-250MG yen8700C3416-1G yen21800C3416-5G yen65800

Terrific Broth T5574-500ML yen11300 液体培地

Terrific Broth Modified EZMixtrade Powder T9179-6X500ML yen7900

顆粒T9179-2X5L yen18800

各種 MISSION 製品の添付資料はこちらからsigmacomshrnatechbull-jp

shRNA

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マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

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MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

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IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

5

ウイルスデリバリーシステムウイルスは様々な細胞株に感染するよう独自に進化を遂げてきましたその特長を利用してここ数十年間興味のある遺伝子を安全に標的細胞にデリバリーするためのベクター開発に向け種々のウイルスの遺伝子操作が行なわれてきましたそれぞれのウイルスシステム（Table 1）はそれぞれ利点と欠点を持ちますがレンチウイルスシステムではすべての用途で望ましいウイルスベクターとなる非常に多くの特長を持ちます現在のレンチウイルスシステムは複数世代の組換えと修飾により得られたレトロウイルスシステムの一種です

Feature Adeno-virus AAV Retro-

virusLenti- virus

非分裂細胞への感染 宿主ゲノムへの安定的な組み込み シュードタイプ作製 長いフラグメントの挿入 インターフェロン応答の回避 ゲノム内に転写サイレンシングに関する問題がない NA

Adeno-Associated Virus

Table 1 ウイルスシステムの比較

レンチウイルスシステム概要レンチウイルスシステムには遺伝子のデリバリーに特に有用となる多くの特性（広範な親和性安定的な組み込みなど）がありますFigure 1 は野生型レンチウイルスのライフサイクルを示しています野生型ウイルスが細胞に侵入し組み込みウイルス遺伝子を発現させることにより新しいビリオンを形成することが可能となります安全性を確保し導入遺伝子を挿入する十分な領域を確保するために今日のシステムではウイルス粒子の産生に必要なウイルス遺伝子を複数のプラスミド上に分けて組み込んでいます（Figure 2）トランスファーベクターは改変 Long Terminal Repeat（LTR）領域の間にシグナル配列とシス作用性配列を持ちますshRNA選択マーカーなどの導入遺伝子はトランスファーベクターの非ウイルスプロモーターの後方へクローニングされますウイルスの構造および複製に必要なすべての遺伝子は別のパッケージングベクター（通常 1 ～ 2 個）に搭載しますこれらの遺伝子にはさまざまなバージョンのウイルスgag オペロンおよび pol オペロンがあります通常さらに安全性を高めるためすべての野生型アクセサリー遺伝子を除去します最後にエンベロープベクターによりウイルス粒子の親和性を決定するエンベロープタンパクが供給され多彩な可能性を示す様々なシュードタイプウイルスが得られますシグマ アルドリッチでは広範な親和性を確保し非分裂細胞および最終分化細胞を含むほぼすべての細胞型に導入するために主に VSV-G（水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク）を持つシュードタイプウイルス粒子としております

Attachment

EntryMaturation

Assembly ampBudding

RNA Transcript

Export

Synthesis of viral Proteins Release of

Viral RNA

ReverseTranscription

ViralcDNA

Integration ofViral cDNA

Wild-TypeLentiviral Particles

Transcription

Figure 1野生型レンチウイルスの生活環

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

TransferVector

PackagingVector Packaging

Plasmids

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

PackagingVector

EnvelopeVector

EnvelopeVector

Assembly ampBudding

Maturation

Figure 2組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

MISSION Lentiviral Packaging Mix（14ページ）

Attachment

Entry

MISSIONLentiviralParticle

NO Virion Production

Release ofViral RNA

ReverseTranscription

Viral cDNA

Integration ofViral cDNA

Exported shRNA

Enter RNAiPathway Transcription

Figure 3MISSIONreg TRC shRNAレンチウイルス粒子による標的細胞への導入

shRNA

6

5 -

3 - UU

Sense Strand

Antisense Strand

Sense StrandCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT T T T TGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAA

Antisense StrandLoop

Loo

p

cPPT

TRC2-pLKO-puro7518 bp

hPGK

puroR

WPRE

pUC ori

RRE

SIN3rsquo LTR

RSV5 LTR

U6

f1 oriampR

Psi

TRC shRNA ベクターマップおよび特徴

RSV5rsquo LTR Chimeric LTR involved in replication and integration U3 substitution for safety

Psi (ψ) Packaging dimerization signal

RRE Involved in nuclear export of viral genome transcript during packaging

U6 Robust pol III promoter with precise initiation and termination of shRNA transcription at high levels

cPPT Role in cDNA synthesis and nuclear import in target cell

hPGK Promoter driving expression of puromycin resistance gene hPGK is weaker than U6 for assurance of high shRNA expression levels in stable selected cells

puroR Allows stable selection with puromycin

SIN3rsquo LTR LTR involved in replication and integration U3 deletion for safety

WPRE Woodchuck Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Element

5 -

3 - UU

Sense Strand

Antisense Strand

Sense StrandCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT T T T TGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAA

Antisense StrandLoop

Loo

p

cPPT

pLKO1-puro7086 bp

hPGK

puroR

pUC ori

RRE

SIN3rsquo LTR

RSV5 LTR

U6

f1 ori

ampR

Psi

Figure 4 TRC1 and TRC15 Vector Map (pLKO1-puro)

Figure 5 TRC2 Vector Map (TRC2-pLKO-puro)

レンチウイルスシステム概要 (contrsquod）レンチウイルス粒子はHEK293T 細胞などの産生細胞株内でパッケージングされます（Figure 2）プラスミド（トランスファーベクターパッケージングベクターおよびエンベロープベクター）を同時に導入させることによりすべての必要な配列を使用して興味のある導入遺伝子を含むウイルス粒子を作製しパッケージングすることができますトランスファーベクターのウイルス LTR の間の領域のみがウイルスのカプシド内にパッケージングされます得られたシュードウイルス粒子は力価を測定し標的細胞への導入に使用します（Figure 3）導入の際ウイルス LTR の間の領域は標的細胞のゲノムに組み込まれますこのシュードウイルス粒子には野生型ウイルスの遺伝子がないため野生型ウイルスのライフサイクルのように増殖することはおろか（Figure 1）複製もできません導入遺伝子の配列のみが細胞内で発現します（Figure 3）

MISSIONreg TRC shRNA コレクションshRNA 配列デザインMISSION TRC ライブラリーは約 20000 のヒト遺伝子と約 21000 のマウス遺伝子を標的とした合計 250000 を超えるクローン（各生物種約 120000 クローン）からなりますshRNA 配列はBroad Institute のアルゴリズムを使ってデザインされています本アルゴリズムでは配列特異性および標的遺伝子内の位置に基づき候補配列をスコアリングします候補配列はノックダウンの最適化とオフターゲット効果の最小化のバランスが取れていなければなりません転写産物の変異体の構造と配列がまだ十分に理解されていない等の理由もあり1 遺伝子あたり約 5 ～20 クローンをデザインし構築していますそのうち少なくとも 1 ～ 2 クローンでは非常に高いレベルのノックダウン効果が得られると予測されます

形質導入用ベクター候補配列は pLKO1-puro レンチウイルスベクターにクローニングされています（Figure 4）pLKO1 ベクターの骨格により大腸菌内での増殖や選択哺乳動物細胞での

（一時的なまたは長期間の）発現が可能になりますまたプラスミド DNA を用いることによりshRNA の配列を持つウイルス粒子を産生することができます（Figure 2）TRC2 では候補配列はTRC2-pLKO-puro レンチウイルスベクターにクローニングされています（Figure 5）このベクターには shRNA の発現を安定化させる WPRE を導入しています

MISSION ベクターコレクション（カスタム品）もご提供可能です（16ページ）

shRNA

7

MISSIONshRNA のレンチウイルスパーティクルを用いたプロトコ－ルと各種フォーマット（レンチウイルスパーティクルプラスミド DNA大腸菌グリセロールストック）の選択ガイドを掲載しています

各種フォーマットの選択ガイド大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG）

一度ご購入いただき正しく保管いただければ何度でもご利用になれますレンチウイルスパーティクルの作製などの手間がかかります

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND） レンチウイルスパーティクルの作製もしくは目的の細胞へのトランスフェクションが必要です

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV）Ready-to-use の製品でご購入後直ちにトランスフェクションが可能ですただしウイルスパーティクルの再産生はできません

大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG）

プラスミド DNA 抽出精製

レンチウイルスにパッケージング（14 ページ）

目的の細胞にトランスフェクション

RNAi による遺伝子ノックダウン

目的の細胞にトランスフェクション

力価（titer）測定（10 ページ）

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV）

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）

大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG） プロトコール大腸菌の培養1 50 ～ 100 μL のストックを取り出します

滅菌した 05 mL の LB （抗生物質不含）に入れます2 37で 15 ～ 30 分間振とう培養します3 Carbenicillin （100 μgmL 製品番号 C3416）を含む寒

天培地に大腸菌培養液 25 ～ 50 μL をストリーク（画線培養）

4 37で 15 ～ 20 時間インキュベート5 シングルコロニーをピックしてプラスミド DNA の抽出を行

います

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）プロトコール適当なトランスフェクション方法で行いますトランスフェクションの方法は用いる試薬に適したプロトコールで行ってください

MISSIONregshRNA フォーマット選択ガイド および実験プロトコル

shRNA実験ワークフロー

shRNA

8

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV） プロトコールMISSIONreg shRNA レンチウイルスを感染させる基本的なプロトコールを記載しています1 日目

1トランスフェクションの 24 時間前に哺乳動物細胞をプレートに撒いて培養

2 トランスフェクションは 50 ～ 80コンフルエントで行う

2 日目1 ウイルスパーティクルストックを氷上に出してゆっくり

解凍2 Hexadimethrine bromide を細胞に添加（最終濃

度 8 microgmL）して振とう　 トランスフェクション効率を高める（ただし神経

細胞の初代培養などには不適）3 適した量（MOI）のウイルスパーティクルを添加して

振とう　 初めての場合は幾つかのmultiplicity of infection

（MOI）を試す（05 - 20など）　 MOI 細胞に対するウイルス粒子の個数　　（1 ウェル中の全細胞数） x （目的の MOI）= （必要な TU） 　　（必要な TU） （CoA に書かれている TUmL） 　　= （1 ウェルに添加するレンチウイルス粒子の容量）4 37で一晩インキュベート 　 一晩のインキュベートで細胞毒性が生じる場合は

4 時間インキュベーションを行った後に培地交換

3 日目1 ウイルスパーティクルを含む培地を除去2 新しい培地に置換

4 日目a トランジェント（一過性発現）で実験する場合　 細胞を回収して qRT-PCR などでノックダウン効率

を検証するb ステーブル（安定発現）で実験する場合　 培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に交換

（方法は下記に記載）　 細胞により至適濃度は異なるが1 ～ 10 microgmL が

標準的

5 日目以降（ステーブルの場合のみ）3 ～ 4 日ごとに培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に置換 （一般的に 10 ～ 12 日後くらいでクローンが確立できる）5 クローン以上をピックしてノックダウン効果を検証する

ピューロマイシンによるセレクション（最適化法9 ページ）1 96 穴プレート各ウェルに 16x104 細胞 と 120 μL の培

地を用意する2 次の日に 1 ～ 10 μgmL となるようピューロマイシン

を分注する3 2 日後に生細胞を調べる4 3 日間ごとにピューロマイシン入りの培地に交換し

3 ～ 14 日間培養し最適な選択期間を検討する

各トランスフェクションは ExpressMagreg レンチウイルスデリバリーシステムを用いて1 日ずつ短縮することも可能ですまた導入しにくい細胞系などをご利用の際にも ExpressMag をご利用くださいExpressMag（15ページ）

shRNA実験情報に関するシグマ アルドリッチURL

shRNA TOP( 各種製品添付資料技術資料FAQ などもこちら )sigmacomshrna-jp

細胞実施例sigmacomshtable

shRNA

9

使用する細胞により最適な抗生物質の濃度は異なります初めて使用する細胞などで適切な抗生物質濃度がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる検討を行い細胞ストレスを低減するためにできる限り低濃度で且つ効率の高い抗生物質濃度を決定しておく必要があります多くの場合shRNA ベクターが導入されていない細胞は 1-10 μgmL の濃度で死滅します

選択用抗生物質（ピューロマイシン）濃度の最適化方法

必要な試薬と機器ピューロマイシン溶液（製品番号 P9620）培養液　　ノックダウン対象の細胞の増殖維持に適した培地（DMEM + 10 FCS など）

培養用インキュベーター6 ウェルプレート

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ50 の細胞密度となるよう細胞を播種（ex 2 x 105 cellwell）2 一晩インキュベート

Day 13 培地を温めておく4 ピューロマイシンの希釈系列（ex 0 10 25 50 75 100 microgmL）を培地を用いて調整5 培地をピューロマイシンを含む選択培地に交換6 それぞれのウェルの生細胞数を測定

Day 3-107 ２日毎に選択培地に交換し死細胞を除去8 ２日毎に生細胞数を測定

Day 109 細胞の死滅曲線を描き選択培地で培養した７ー 10 日の間に細胞が 100死滅したピューロマイシン濃度

を決定する

備考ピューロマイシンの凍結融解は最小限にとどめ選択培地は用事調製する10 μgmL 以上のピューロマイシン濃度が必要であった場合ピューロマイシンの使用期限を確認する

参考ピューロマイシン濃度Hela 3 microgmL HEK293 3 microgmL B16 1-3 microgmL PC10 10 microgmL A431 1 microgmL Jurkat 4 microgmL

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

shRNA

10

使用する細胞によりレンチウイルスの感染効率は異なります初めて使用する細胞などで適切な条件がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる条件検討を行い最適な Multiplicity Of Infection（MOI）を決定しておく必要がありますMISSIONreg TurboGFP trade コントロール（SHC003V）をご利用いただくと簡便に最適な MOI を決定することが可能です

TurboGFP コントロール（SHC003V）で用いられている CMV プロモーターは幹細胞リンパ球初代神経細胞などでその発現活性があまり高くないことが知られておりこれら細胞から得られる GFP シグナルが減少するため感染効率を実際よりも低く見積もってしまう場合がありますそれらの細胞において感染効率評価を実施する場合は限外希釈法を用いる必要があります

レンチウイルス感染効率評価方法

必要な試薬と機器TurboGFP コントロール（製品番号 SHC003V）Hexadimethrine bromide（製品番号 H9268）または Protamine sulfate（製品番号 P3369）培地培養用インキュベーター蛍光顕微鏡および GFP 用フィルター

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ24 時間後に細胞密度が 50となるよう細胞を播種2 一晩インキュベート

Day 13 レンチウイルスコントロール（製品番号 SHC003V）を室温にて溶解4 チューブを指で軽く弾き撹拌し氷上で保存する5 コントロールの段階希釈系列（10 倍希釈）を調整し各ウェルへ添加し振とう6 Hexadimethrine bromide または Protamine sulfate を終濃度 8 microgmL となるように添加し振とう7 18-20 時間インキュベート

Day 28 培地交換しウイルスを含む培地を除去9 さらに 24-48 時間インキュベートしGFP を十分発現させる多くの場合TurboGFP は感染後 72 時間後

に強い発現を示す

Day 3-510 蛍光顕微鏡下で観察しTurboGFP 発現細胞の割合が最も高い条件を決定する

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

Multiplicity Of Infection (MOI) 算出式

MOI　 =ウイルスタイター（TUmL） x 容量（mL）

細胞数

shRNA

11

本製品はカルタヘナ法該当製品です数十万クローンから構成され数万遺伝子を標的とするライブラリーから製品仕様をご選択いただく必要がありお手数ではございますがご注文の仕様をご指定いただくための専用『ご注文用紙』（12ページ⑤）にご記入いただいております必要な情報をご記入後に弊社代理店へご注文用紙をお渡しください弊社ウェブサイトに掲載しておりますご注文用紙はPDF に直接ご入力いただけます製品を検索いただいたのち必要な情報をコピー amp ペーストにてご入力いただけますPDF は sigmacomshrna-jp　からご取得ください

個別クローン基本価格（1 クローンご注文の場合の単価）フォーマット 製品番号 価格 納期 基本仕様

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen25000 2-3週間 保管温度-70 内容物Terrific Broth carbenicillin 100 μgmL 15 glycerol

精製プラスミドDNA SHCLND yen60000 3-4週間 保管温度-20 容量40 μL 内容物1 μg プラスミドDNA（20 ngμL Tris-EDTA buffer）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen70000 4-6週間 保管温度-70 容量200 μL 内容物≧106 TUmL液体培地（DMEM 10 FBS penicillin-streptomycin）

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません

5 クローンセット割引価格（5 クローン以上ある製品に適用） ある遺伝子（RefSeq）に対する shRNA クローンを同一生物種同一フォーマットから 2 クローン以上お求めの場合は

お得な 5 クローンセットでお申し込み下さいターゲット遺伝子に対して 5 クローン以上製品が無い場合には別途お問合せ下さい　（その場合全クローンお選びいただければセット価格が適用になります）6 クローン以上ご購入いただく場合は5 クローンセット時の 1 クローン単価timesクローンの個数となります納期は 1 クローンご注文の場合と同様ですクローンセットでご購入の場合バリデート保証が適用されます（4ページ）

フォーマット 製品番号 5 クローンセット合計価格 1 クローン単価 納期

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen50000 yen10000 1 クローンと同様（上記表を参照）

精製プラスミドDNA SHCLND yen115000 yen23000 1 クローンと同様（上記表を参照）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen125005 yen25001 1 クローンと同様（上記表を参照）

オプション価格（ベクター変更タイター変更容量変更）カスタムベクターの詳細についてはカスタムクローニングサービス

のご紹介を参照ください（16 ページ） 1 クローンまたは 5 クローンセット価格に各オプション金額が加

算されますオプション選択時にも5 クローンセット割引価格は適用となります

（5 クローンセットでお求めの際は全てのクローンにおいて同一オプションとなります）

納期は1 オプションにつき通常納期に 2 週間ずつ加算されますオプションの種類 1 クローン購入時 5 クローンセットで購入時

（5 クローン合計） 納期

ベクター変更各種（プラスミドDNA）

+ yen70000 + yen190000 + 2 週間各種（レンチウイルスパーティクル）

タイター変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様1x106 TUmL

1x107 TUmL + yen97000 + yen485000 + 2 週間1x108 TUmL + yen155800 + yen779000 + 2 週間1x109 TUmL + yen305800 + yen1529000 + 2 週間

容量変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様02 mL

01 mL - yen15200 - yen76000 変更なし10 mL + yen15000 + yen75000 + 2 週間20 mL + yen23400 + yen117000 + 2 週間50 mL + yen32800 + yen164000 + 2 週間100 mL + yen43000 + yen215000 + 2 週間

107 TUmL 以上のタイターオプションとの併用時のみ選択可能です

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません 25 クローン以下の購入の場合 バイアル（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷 大腸菌フォーマットは 14 mL TrakMates チューブでの出荷 26 クローン以上の購入の場合 96-well Plate（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷Plate Map CD-ROM 付き

価格　－ 計算例 － セット価格で計算した場合

納品形態レンチウイルスパーティクル（製品番号SHCLNV）

①クローン数5 クローンセット yen125005

②オプションベクター変更（pLKO1-CMV-Neo） yen156000

仕様合計（①と②の合計） yen366000

MISSIONreg shRNA クローンご注文情報

shRNA

12

shRNAご注文方法シグマ アルドリッチウェブサイトの情報検索ウィンドウよりターゲット遺伝子に対する MISSIONregshRNA クローンの検索を行うことができます

① sigmacomjapan

③生物種とフォーマット選択

④クローンの選択

⑤専用注文用紙に記入sigmacomshrna-jp より専用発注書をダウンロードしAcrobat Reader などで開きクローン番号など必要な情報をご入力ください（追記型 PDFファイルのため直接タイプ ペーストしていただけます）

⑥代理店様に発注発注書に必要事項を入力後再度保存しメール添付ファイルの形で代理店様にご発注ください

②ターゲット遺伝子選択

遺伝子名やAccession No で検索

ターゲット遺伝子を探し青字の製品カテゴリーにある『shRNA』をクリック

生物種（ヒトマウス）および3 種類のフォーマット よりご希望の製品番号に該当するldquo価格rdquoボタンをクリック

各クローンの情報（ターゲット遺伝子情報バリデーションの有無配列TRC バージョン情報など）が表示されるのでこれらの情報より目的クローンを選択一部のオプションはプルダウンでご選択いただけますオプションには別途費用が発生いたしますご注意ください

カスタムサービスも承りますお見積もり依頼はコチラ

httpgooglta5NTa

shRNA

13

コントロールshRNA各種コントロールをご利用いただけますフォーマット蛍光マーカープロモーターなどから細胞や実験に適した製品をご選択ください高タイターのコントロールをご希望の場合は別途ご相談ください

各コントロールを MOI = 5 にて導入した A549 細胞（上図は明視野下図は蛍光画像）

コントロール一覧 　

用途 製品名製品番号

希望販売価格TRC1 series TRC2 seriesPlasmid DNA Lentiviral Plasmid DNA Lentiviral

ネガティブコントロールpLKO1-puro Non-Target shRNA Control 1 SHC002 SHC002V SHC202 SHC202V yen59000

pLKO1-puro Non-Target shRNA Control 2 SHC016 SHC016V SHC216 SHC216V yen59000

蛍光タンパク質トランスダクションコントロール

（ポジティブコントロール）

pLKO1-puro CMV-TurboGFP SHC003 SHC003V SHC203 SHC203V

製品番号になしの製品

yen59000

ありの製品yen93000

pLKO1-puro CMV-TagCFPtrade SHC010 SHC010V - -

pLKO1-puro CMV-TagYFPtrade SHC011 SHC011V - -

pLKO1-puro CMV-TagRFPtrade SHC012 SHC012V - -

pLKO1-puro CMV-TagFP635trade SHC013 SHC013V - -

pLKO1-puro UbC-TurboGFP SHC014 SHC014V - -

pLKO1-puro UbC-TagFP635 SHC015 SHC015V - -

外来性遺伝子用shRNAコントロール

TurboGFP shRNA Control SHC004 SHC004V SHC204 SHC204V yen59000

eGFP shRNA Control SHC005 SHC005V - - yen59000

Luciferase shRNA Control SHC007 SHC007V - - yen59000

内在性遺伝子用shRNAコントロール

shRNA Human Positive Control 1（B2M） SHC008 SHC008V - - yen59000

shRNA Human Positive Control 2（ARHGDIA） SHC009 SHC009V - - yen59000

Emptyコントロールベクター pLKO1-puro Control SHC001 SHC001V SHC201 SHC201V yen59000仕様 plasmid DNA 5 μg DNA -20 stock 500 ng μL TE buffer

Lentiviral 4 x 50 μL -70 stock 106 TUmL (via p24 titering assay) ハイタイターコントロールのご用意もございます別途お問合せ下さい

Transduction Knockdown

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)TurboGFP(SHC003SHC003V)TagCFP(SHC010SHC010V)TagYFP(SHC011SHC011V)TagRFP(SHC012SHC012V)TagFP635(SHC013SHC013V)UbC-TurboGFP(SHC014SHC014V)UbC-TagFP635(SHC015SHC015V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)TurboGFP(SHC203SHC203V)

TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)shRNA Positive Control 1(HumanB2M) (SHC008SHC008V)shRNA Positive Control 2(HumanARHGDIA) (SHC009SHC009V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

Monitor

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)Non-Target shRNA 1(SHC002SHC002V)Non-Target shRNA 2(SHC016SHC016V)TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)Non-Target shRNA 1(SHC202SHC202V)Non-Target shRNA 2(SHC216SHC216V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

MISSION shRNA Controls

NegativePositive

UbC-TagFP635 trade UbC-TurboGFP trade CMV-TagFP635 trade CMV-TagYFP trade CMV-TagCFP trade

sigma-aldrichcomcontrols

MISSIONreg shRNA コントロール製品群

shRNA

14

Packaging PlasmidsMISSIONreg Lentiviral Packaging Mix はMISSION TRC shRNA コレクションに最適化したパッケージング用プラスミドのプレミックス製品です本製品にはレンチウイルスの構造および複製に関与する遺伝子（gag および pol）を有するパッケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ドVSV-G エ ン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエンベロープベクターから成ります本製品は独自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用いただけますがシグマ アルドリッチでは時間を節約し品質を確保するために弊社がご提供するウイルスフォーマットのコレクションをご使用いただくことを強くお勧めいたします

製品名 カタログ番号 価格

MISSION lentiviral Packaging MixSHP001-025ML yen50000SHP001-17ML yen175000

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

Assembly ampBudding

Maturation

pMISSION GAG POL

12150 bp

ampR

Sv40

gag

CMV

pol

rev tat

insulin polyA

pMISSION VSV-G

5824 bp

CMV

VSV-G

Envelope VectorPackaging Vector

Lentiviral Packaging Mix

TransferVector

PackagingVector Envelope

Vector

組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

shRNAパッケージングプラスミドならびに関連製品

その他試薬

製品名 カタログ番号 価格 備考

Puromycin dihydrochloride P9620-10ML yen20900 調製済puromycin溶液

Hexadimethrine bromideH9268-5G yen8600

レンチウイルスの導入効率を向上H9268-10G yen12900H9268-50G yen49700

Protamine sulfateP3369-10G yen44400 レンチウイルスの導入効率を向上

Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効P3369-100G yen250000

Carbenicillin disodium saltC3416-250MG yen8700C3416-1G yen21800C3416-5G yen65800

Terrific Broth T5574-500ML yen11300 液体培地

Terrific Broth Modified EZMixtrade Powder T9179-6X500ML yen7900

顆粒T9179-2X5L yen18800

各種 MISSION 製品の添付資料はこちらからsigmacomshrnatechbull-jp

shRNA

15

マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

16

MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

6

5 -

3 - UU

Sense Strand

Antisense Strand

Sense StrandCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT T T T TGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAA

Antisense StrandLoop

Loo

p

cPPT

TRC2-pLKO-puro7518 bp

hPGK

puroR

WPRE

pUC ori

RRE

SIN3rsquo LTR

RSV5 LTR

U6

f1 oriampR

Psi

TRC shRNA ベクターマップおよび特徴

RSV5rsquo LTR Chimeric LTR involved in replication and integration U3 substitution for safety

Psi (ψ) Packaging dimerization signal

RRE Involved in nuclear export of viral genome transcript during packaging

U6 Robust pol III promoter with precise initiation and termination of shRNA transcription at high levels

cPPT Role in cDNA synthesis and nuclear import in target cell

hPGK Promoter driving expression of puromycin resistance gene hPGK is weaker than U6 for assurance of high shRNA expression levels in stable selected cells

puroR Allows stable selection with puromycin

SIN3rsquo LTR LTR involved in replication and integration U3 deletion for safety

WPRE Woodchuck Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Element

5 -

3 - UU

Sense Strand

Antisense Strand

Sense StrandCCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCTCGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNT T T T TGGCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAAA

Antisense StrandLoop

Loo

p

cPPT

pLKO1-puro7086 bp

hPGK

puroR

pUC ori

RRE

SIN3rsquo LTR

RSV5 LTR

U6

f1 ori

ampR

Psi

Figure 4 TRC1 and TRC15 Vector Map (pLKO1-puro)

Figure 5 TRC2 Vector Map (TRC2-pLKO-puro)

レンチウイルスシステム概要 (contrsquod）レンチウイルス粒子はHEK293T 細胞などの産生細胞株内でパッケージングされます（Figure 2）プラスミド（トランスファーベクターパッケージングベクターおよびエンベロープベクター）を同時に導入させることによりすべての必要な配列を使用して興味のある導入遺伝子を含むウイルス粒子を作製しパッケージングすることができますトランスファーベクターのウイルス LTR の間の領域のみがウイルスのカプシド内にパッケージングされます得られたシュードウイルス粒子は力価を測定し標的細胞への導入に使用します（Figure 3）導入の際ウイルス LTR の間の領域は標的細胞のゲノムに組み込まれますこのシュードウイルス粒子には野生型ウイルスの遺伝子がないため野生型ウイルスのライフサイクルのように増殖することはおろか（Figure 1）複製もできません導入遺伝子の配列のみが細胞内で発現します（Figure 3）

MISSIONreg TRC shRNA コレクションshRNA 配列デザインMISSION TRC ライブラリーは約 20000 のヒト遺伝子と約 21000 のマウス遺伝子を標的とした合計 250000 を超えるクローン（各生物種約 120000 クローン）からなりますshRNA 配列はBroad Institute のアルゴリズムを使ってデザインされています本アルゴリズムでは配列特異性および標的遺伝子内の位置に基づき候補配列をスコアリングします候補配列はノックダウンの最適化とオフターゲット効果の最小化のバランスが取れていなければなりません転写産物の変異体の構造と配列がまだ十分に理解されていない等の理由もあり1 遺伝子あたり約 5 ～20 クローンをデザインし構築していますそのうち少なくとも 1 ～ 2 クローンでは非常に高いレベルのノックダウン効果が得られると予測されます

形質導入用ベクター候補配列は pLKO1-puro レンチウイルスベクターにクローニングされています（Figure 4）pLKO1 ベクターの骨格により大腸菌内での増殖や選択哺乳動物細胞での

（一時的なまたは長期間の）発現が可能になりますまたプラスミド DNA を用いることによりshRNA の配列を持つウイルス粒子を産生することができます（Figure 2）TRC2 では候補配列はTRC2-pLKO-puro レンチウイルスベクターにクローニングされています（Figure 5）このベクターには shRNA の発現を安定化させる WPRE を導入しています

MISSION ベクターコレクション（カスタム品）もご提供可能です（16ページ）

shRNA

7

MISSIONshRNA のレンチウイルスパーティクルを用いたプロトコ－ルと各種フォーマット（レンチウイルスパーティクルプラスミド DNA大腸菌グリセロールストック）の選択ガイドを掲載しています

各種フォーマットの選択ガイド大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG）

一度ご購入いただき正しく保管いただければ何度でもご利用になれますレンチウイルスパーティクルの作製などの手間がかかります

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND） レンチウイルスパーティクルの作製もしくは目的の細胞へのトランスフェクションが必要です

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV）Ready-to-use の製品でご購入後直ちにトランスフェクションが可能ですただしウイルスパーティクルの再産生はできません

大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG）

プラスミド DNA 抽出精製

レンチウイルスにパッケージング（14 ページ）

目的の細胞にトランスフェクション

RNAi による遺伝子ノックダウン

目的の細胞にトランスフェクション

力価（titer）測定（10 ページ）

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV）

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）

大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG） プロトコール大腸菌の培養1 50 ～ 100 μL のストックを取り出します

滅菌した 05 mL の LB （抗生物質不含）に入れます2 37で 15 ～ 30 分間振とう培養します3 Carbenicillin （100 μgmL 製品番号 C3416）を含む寒

天培地に大腸菌培養液 25 ～ 50 μL をストリーク（画線培養）

4 37で 15 ～ 20 時間インキュベート5 シングルコロニーをピックしてプラスミド DNA の抽出を行

います

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）プロトコール適当なトランスフェクション方法で行いますトランスフェクションの方法は用いる試薬に適したプロトコールで行ってください

MISSIONregshRNA フォーマット選択ガイド および実験プロトコル

shRNA実験ワークフロー

shRNA

8

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV） プロトコールMISSIONreg shRNA レンチウイルスを感染させる基本的なプロトコールを記載しています1 日目

1トランスフェクションの 24 時間前に哺乳動物細胞をプレートに撒いて培養

2 トランスフェクションは 50 ～ 80コンフルエントで行う

2 日目1 ウイルスパーティクルストックを氷上に出してゆっくり

解凍2 Hexadimethrine bromide を細胞に添加（最終濃

度 8 microgmL）して振とう　 トランスフェクション効率を高める（ただし神経

細胞の初代培養などには不適）3 適した量（MOI）のウイルスパーティクルを添加して

振とう　 初めての場合は幾つかのmultiplicity of infection

（MOI）を試す（05 - 20など）　 MOI 細胞に対するウイルス粒子の個数　　（1 ウェル中の全細胞数） x （目的の MOI）= （必要な TU） 　　（必要な TU） （CoA に書かれている TUmL） 　　= （1 ウェルに添加するレンチウイルス粒子の容量）4 37で一晩インキュベート 　 一晩のインキュベートで細胞毒性が生じる場合は

4 時間インキュベーションを行った後に培地交換

3 日目1 ウイルスパーティクルを含む培地を除去2 新しい培地に置換

4 日目a トランジェント（一過性発現）で実験する場合　 細胞を回収して qRT-PCR などでノックダウン効率

を検証するb ステーブル（安定発現）で実験する場合　 培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に交換

（方法は下記に記載）　 細胞により至適濃度は異なるが1 ～ 10 microgmL が

標準的

5 日目以降（ステーブルの場合のみ）3 ～ 4 日ごとに培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に置換 （一般的に 10 ～ 12 日後くらいでクローンが確立できる）5 クローン以上をピックしてノックダウン効果を検証する

ピューロマイシンによるセレクション（最適化法9 ページ）1 96 穴プレート各ウェルに 16x104 細胞 と 120 μL の培

地を用意する2 次の日に 1 ～ 10 μgmL となるようピューロマイシン

を分注する3 2 日後に生細胞を調べる4 3 日間ごとにピューロマイシン入りの培地に交換し

3 ～ 14 日間培養し最適な選択期間を検討する

各トランスフェクションは ExpressMagreg レンチウイルスデリバリーシステムを用いて1 日ずつ短縮することも可能ですまた導入しにくい細胞系などをご利用の際にも ExpressMag をご利用くださいExpressMag（15ページ）

shRNA実験情報に関するシグマ アルドリッチURL

shRNA TOP( 各種製品添付資料技術資料FAQ などもこちら )sigmacomshrna-jp

細胞実施例sigmacomshtable

shRNA

9

使用する細胞により最適な抗生物質の濃度は異なります初めて使用する細胞などで適切な抗生物質濃度がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる検討を行い細胞ストレスを低減するためにできる限り低濃度で且つ効率の高い抗生物質濃度を決定しておく必要があります多くの場合shRNA ベクターが導入されていない細胞は 1-10 μgmL の濃度で死滅します

選択用抗生物質（ピューロマイシン）濃度の最適化方法

必要な試薬と機器ピューロマイシン溶液（製品番号 P9620）培養液　　ノックダウン対象の細胞の増殖維持に適した培地（DMEM + 10 FCS など）

培養用インキュベーター6 ウェルプレート

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ50 の細胞密度となるよう細胞を播種（ex 2 x 105 cellwell）2 一晩インキュベート

Day 13 培地を温めておく4 ピューロマイシンの希釈系列（ex 0 10 25 50 75 100 microgmL）を培地を用いて調整5 培地をピューロマイシンを含む選択培地に交換6 それぞれのウェルの生細胞数を測定

Day 3-107 ２日毎に選択培地に交換し死細胞を除去8 ２日毎に生細胞数を測定

Day 109 細胞の死滅曲線を描き選択培地で培養した７ー 10 日の間に細胞が 100死滅したピューロマイシン濃度

を決定する

備考ピューロマイシンの凍結融解は最小限にとどめ選択培地は用事調製する10 μgmL 以上のピューロマイシン濃度が必要であった場合ピューロマイシンの使用期限を確認する

参考ピューロマイシン濃度Hela 3 microgmL HEK293 3 microgmL B16 1-3 microgmL PC10 10 microgmL A431 1 microgmL Jurkat 4 microgmL

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

shRNA

10

使用する細胞によりレンチウイルスの感染効率は異なります初めて使用する細胞などで適切な条件がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる条件検討を行い最適な Multiplicity Of Infection（MOI）を決定しておく必要がありますMISSIONreg TurboGFP trade コントロール（SHC003V）をご利用いただくと簡便に最適な MOI を決定することが可能です

TurboGFP コントロール（SHC003V）で用いられている CMV プロモーターは幹細胞リンパ球初代神経細胞などでその発現活性があまり高くないことが知られておりこれら細胞から得られる GFP シグナルが減少するため感染効率を実際よりも低く見積もってしまう場合がありますそれらの細胞において感染効率評価を実施する場合は限外希釈法を用いる必要があります

レンチウイルス感染効率評価方法

必要な試薬と機器TurboGFP コントロール（製品番号 SHC003V）Hexadimethrine bromide（製品番号 H9268）または Protamine sulfate（製品番号 P3369）培地培養用インキュベーター蛍光顕微鏡および GFP 用フィルター

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ24 時間後に細胞密度が 50となるよう細胞を播種2 一晩インキュベート

Day 13 レンチウイルスコントロール（製品番号 SHC003V）を室温にて溶解4 チューブを指で軽く弾き撹拌し氷上で保存する5 コントロールの段階希釈系列（10 倍希釈）を調整し各ウェルへ添加し振とう6 Hexadimethrine bromide または Protamine sulfate を終濃度 8 microgmL となるように添加し振とう7 18-20 時間インキュベート

Day 28 培地交換しウイルスを含む培地を除去9 さらに 24-48 時間インキュベートしGFP を十分発現させる多くの場合TurboGFP は感染後 72 時間後

に強い発現を示す

Day 3-510 蛍光顕微鏡下で観察しTurboGFP 発現細胞の割合が最も高い条件を決定する

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

Multiplicity Of Infection (MOI) 算出式

MOI　 =ウイルスタイター（TUmL） x 容量（mL）

細胞数

shRNA

11

本製品はカルタヘナ法該当製品です数十万クローンから構成され数万遺伝子を標的とするライブラリーから製品仕様をご選択いただく必要がありお手数ではございますがご注文の仕様をご指定いただくための専用『ご注文用紙』（12ページ⑤）にご記入いただいております必要な情報をご記入後に弊社代理店へご注文用紙をお渡しください弊社ウェブサイトに掲載しておりますご注文用紙はPDF に直接ご入力いただけます製品を検索いただいたのち必要な情報をコピー amp ペーストにてご入力いただけますPDF は sigmacomshrna-jp　からご取得ください

個別クローン基本価格（1 クローンご注文の場合の単価）フォーマット 製品番号 価格 納期 基本仕様

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen25000 2-3週間 保管温度-70 内容物Terrific Broth carbenicillin 100 μgmL 15 glycerol

精製プラスミドDNA SHCLND yen60000 3-4週間 保管温度-20 容量40 μL 内容物1 μg プラスミドDNA（20 ngμL Tris-EDTA buffer）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen70000 4-6週間 保管温度-70 容量200 μL 内容物≧106 TUmL液体培地（DMEM 10 FBS penicillin-streptomycin）

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません

5 クローンセット割引価格（5 クローン以上ある製品に適用） ある遺伝子（RefSeq）に対する shRNA クローンを同一生物種同一フォーマットから 2 クローン以上お求めの場合は

お得な 5 クローンセットでお申し込み下さいターゲット遺伝子に対して 5 クローン以上製品が無い場合には別途お問合せ下さい　（その場合全クローンお選びいただければセット価格が適用になります）6 クローン以上ご購入いただく場合は5 クローンセット時の 1 クローン単価timesクローンの個数となります納期は 1 クローンご注文の場合と同様ですクローンセットでご購入の場合バリデート保証が適用されます（4ページ）

フォーマット 製品番号 5 クローンセット合計価格 1 クローン単価 納期

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen50000 yen10000 1 クローンと同様（上記表を参照）

精製プラスミドDNA SHCLND yen115000 yen23000 1 クローンと同様（上記表を参照）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen125005 yen25001 1 クローンと同様（上記表を参照）

オプション価格（ベクター変更タイター変更容量変更）カスタムベクターの詳細についてはカスタムクローニングサービス

のご紹介を参照ください（16 ページ） 1 クローンまたは 5 クローンセット価格に各オプション金額が加

算されますオプション選択時にも5 クローンセット割引価格は適用となります

（5 クローンセットでお求めの際は全てのクローンにおいて同一オプションとなります）

納期は1 オプションにつき通常納期に 2 週間ずつ加算されますオプションの種類 1 クローン購入時 5 クローンセットで購入時

（5 クローン合計） 納期

ベクター変更各種（プラスミドDNA）

+ yen70000 + yen190000 + 2 週間各種（レンチウイルスパーティクル）

タイター変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様1x106 TUmL

1x107 TUmL + yen97000 + yen485000 + 2 週間1x108 TUmL + yen155800 + yen779000 + 2 週間1x109 TUmL + yen305800 + yen1529000 + 2 週間

容量変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様02 mL

01 mL - yen15200 - yen76000 変更なし10 mL + yen15000 + yen75000 + 2 週間20 mL + yen23400 + yen117000 + 2 週間50 mL + yen32800 + yen164000 + 2 週間100 mL + yen43000 + yen215000 + 2 週間

107 TUmL 以上のタイターオプションとの併用時のみ選択可能です

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません 25 クローン以下の購入の場合 バイアル（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷 大腸菌フォーマットは 14 mL TrakMates チューブでの出荷 26 クローン以上の購入の場合 96-well Plate（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷Plate Map CD-ROM 付き

価格　－ 計算例 － セット価格で計算した場合

納品形態レンチウイルスパーティクル（製品番号SHCLNV）

①クローン数5 クローンセット yen125005

②オプションベクター変更（pLKO1-CMV-Neo） yen156000

仕様合計（①と②の合計） yen366000

MISSIONreg shRNA クローンご注文情報

shRNA

12

shRNAご注文方法シグマ アルドリッチウェブサイトの情報検索ウィンドウよりターゲット遺伝子に対する MISSIONregshRNA クローンの検索を行うことができます

① sigmacomjapan

③生物種とフォーマット選択

④クローンの選択

⑤専用注文用紙に記入sigmacomshrna-jp より専用発注書をダウンロードしAcrobat Reader などで開きクローン番号など必要な情報をご入力ください（追記型 PDFファイルのため直接タイプ ペーストしていただけます）

⑥代理店様に発注発注書に必要事項を入力後再度保存しメール添付ファイルの形で代理店様にご発注ください

②ターゲット遺伝子選択

遺伝子名やAccession No で検索

ターゲット遺伝子を探し青字の製品カテゴリーにある『shRNA』をクリック

生物種（ヒトマウス）および3 種類のフォーマット よりご希望の製品番号に該当するldquo価格rdquoボタンをクリック

各クローンの情報（ターゲット遺伝子情報バリデーションの有無配列TRC バージョン情報など）が表示されるのでこれらの情報より目的クローンを選択一部のオプションはプルダウンでご選択いただけますオプションには別途費用が発生いたしますご注意ください

カスタムサービスも承りますお見積もり依頼はコチラ

httpgooglta5NTa

shRNA

13

コントロールshRNA各種コントロールをご利用いただけますフォーマット蛍光マーカープロモーターなどから細胞や実験に適した製品をご選択ください高タイターのコントロールをご希望の場合は別途ご相談ください

各コントロールを MOI = 5 にて導入した A549 細胞（上図は明視野下図は蛍光画像）

コントロール一覧 　

用途 製品名製品番号

希望販売価格TRC1 series TRC2 seriesPlasmid DNA Lentiviral Plasmid DNA Lentiviral

ネガティブコントロールpLKO1-puro Non-Target shRNA Control 1 SHC002 SHC002V SHC202 SHC202V yen59000

pLKO1-puro Non-Target shRNA Control 2 SHC016 SHC016V SHC216 SHC216V yen59000

蛍光タンパク質トランスダクションコントロール

（ポジティブコントロール）

pLKO1-puro CMV-TurboGFP SHC003 SHC003V SHC203 SHC203V

製品番号になしの製品

yen59000

ありの製品yen93000

pLKO1-puro CMV-TagCFPtrade SHC010 SHC010V - -

pLKO1-puro CMV-TagYFPtrade SHC011 SHC011V - -

pLKO1-puro CMV-TagRFPtrade SHC012 SHC012V - -

pLKO1-puro CMV-TagFP635trade SHC013 SHC013V - -

pLKO1-puro UbC-TurboGFP SHC014 SHC014V - -

pLKO1-puro UbC-TagFP635 SHC015 SHC015V - -

外来性遺伝子用shRNAコントロール

TurboGFP shRNA Control SHC004 SHC004V SHC204 SHC204V yen59000

eGFP shRNA Control SHC005 SHC005V - - yen59000

Luciferase shRNA Control SHC007 SHC007V - - yen59000

内在性遺伝子用shRNAコントロール

shRNA Human Positive Control 1（B2M） SHC008 SHC008V - - yen59000

shRNA Human Positive Control 2（ARHGDIA） SHC009 SHC009V - - yen59000

Emptyコントロールベクター pLKO1-puro Control SHC001 SHC001V SHC201 SHC201V yen59000仕様 plasmid DNA 5 μg DNA -20 stock 500 ng μL TE buffer

Lentiviral 4 x 50 μL -70 stock 106 TUmL (via p24 titering assay) ハイタイターコントロールのご用意もございます別途お問合せ下さい

Transduction Knockdown

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)TurboGFP(SHC003SHC003V)TagCFP(SHC010SHC010V)TagYFP(SHC011SHC011V)TagRFP(SHC012SHC012V)TagFP635(SHC013SHC013V)UbC-TurboGFP(SHC014SHC014V)UbC-TagFP635(SHC015SHC015V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)TurboGFP(SHC203SHC203V)

TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)shRNA Positive Control 1(HumanB2M) (SHC008SHC008V)shRNA Positive Control 2(HumanARHGDIA) (SHC009SHC009V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

Monitor

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)Non-Target shRNA 1(SHC002SHC002V)Non-Target shRNA 2(SHC016SHC016V)TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)Non-Target shRNA 1(SHC202SHC202V)Non-Target shRNA 2(SHC216SHC216V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

MISSION shRNA Controls

NegativePositive

UbC-TagFP635 trade UbC-TurboGFP trade CMV-TagFP635 trade CMV-TagYFP trade CMV-TagCFP trade

sigma-aldrichcomcontrols

MISSIONreg shRNA コントロール製品群

shRNA

14

Packaging PlasmidsMISSIONreg Lentiviral Packaging Mix はMISSION TRC shRNA コレクションに最適化したパッケージング用プラスミドのプレミックス製品です本製品にはレンチウイルスの構造および複製に関与する遺伝子（gag および pol）を有するパッケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ドVSV-G エ ン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエンベロープベクターから成ります本製品は独自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用いただけますがシグマ アルドリッチでは時間を節約し品質を確保するために弊社がご提供するウイルスフォーマットのコレクションをご使用いただくことを強くお勧めいたします

製品名 カタログ番号 価格

MISSION lentiviral Packaging MixSHP001-025ML yen50000SHP001-17ML yen175000

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

Assembly ampBudding

Maturation

pMISSION GAG POL

12150 bp

ampR

Sv40

gag

CMV

pol

rev tat

insulin polyA

pMISSION VSV-G

5824 bp

CMV

VSV-G

Envelope VectorPackaging Vector

Lentiviral Packaging Mix

TransferVector

PackagingVector Envelope

Vector

組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

shRNAパッケージングプラスミドならびに関連製品

その他試薬

製品名 カタログ番号 価格 備考

Puromycin dihydrochloride P9620-10ML yen20900 調製済puromycin溶液

Hexadimethrine bromideH9268-5G yen8600

レンチウイルスの導入効率を向上H9268-10G yen12900H9268-50G yen49700

Protamine sulfateP3369-10G yen44400 レンチウイルスの導入効率を向上

Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効P3369-100G yen250000

Carbenicillin disodium saltC3416-250MG yen8700C3416-1G yen21800C3416-5G yen65800

Terrific Broth T5574-500ML yen11300 液体培地

Terrific Broth Modified EZMixtrade Powder T9179-6X500ML yen7900

顆粒T9179-2X5L yen18800

各種 MISSION 製品の添付資料はこちらからsigmacomshrnatechbull-jp

shRNA

15

マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

16

MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

7

MISSIONshRNA のレンチウイルスパーティクルを用いたプロトコ－ルと各種フォーマット（レンチウイルスパーティクルプラスミド DNA大腸菌グリセロールストック）の選択ガイドを掲載しています

各種フォーマットの選択ガイド大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG）

一度ご購入いただき正しく保管いただければ何度でもご利用になれますレンチウイルスパーティクルの作製などの手間がかかります

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND） レンチウイルスパーティクルの作製もしくは目的の細胞へのトランスフェクションが必要です

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV）Ready-to-use の製品でご購入後直ちにトランスフェクションが可能ですただしウイルスパーティクルの再産生はできません

大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG）

プラスミド DNA 抽出精製

レンチウイルスにパッケージング（14 ページ）

目的の細胞にトランスフェクション

RNAi による遺伝子ノックダウン

目的の細胞にトランスフェクション

力価（titer）測定（10 ページ）

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV）

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）

大腸菌グリセロールストック（製品番号 SHCLNG） プロトコール大腸菌の培養1 50 ～ 100 μL のストックを取り出します

滅菌した 05 mL の LB （抗生物質不含）に入れます2 37で 15 ～ 30 分間振とう培養します3 Carbenicillin （100 μgmL 製品番号 C3416）を含む寒

天培地に大腸菌培養液 25 ～ 50 μL をストリーク（画線培養）

4 37で 15 ～ 20 時間インキュベート5 シングルコロニーをピックしてプラスミド DNA の抽出を行

います

プラスミド DNA（製品番号 SHCLND）プロトコール適当なトランスフェクション方法で行いますトランスフェクションの方法は用いる試薬に適したプロトコールで行ってください

MISSIONregshRNA フォーマット選択ガイド および実験プロトコル

shRNA実験ワークフロー

shRNA

8

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV） プロトコールMISSIONreg shRNA レンチウイルスを感染させる基本的なプロトコールを記載しています1 日目

1トランスフェクションの 24 時間前に哺乳動物細胞をプレートに撒いて培養

2 トランスフェクションは 50 ～ 80コンフルエントで行う

2 日目1 ウイルスパーティクルストックを氷上に出してゆっくり

解凍2 Hexadimethrine bromide を細胞に添加（最終濃

度 8 microgmL）して振とう　 トランスフェクション効率を高める（ただし神経

細胞の初代培養などには不適）3 適した量（MOI）のウイルスパーティクルを添加して

振とう　 初めての場合は幾つかのmultiplicity of infection

（MOI）を試す（05 - 20など）　 MOI 細胞に対するウイルス粒子の個数　　（1 ウェル中の全細胞数） x （目的の MOI）= （必要な TU） 　　（必要な TU） （CoA に書かれている TUmL） 　　= （1 ウェルに添加するレンチウイルス粒子の容量）4 37で一晩インキュベート 　 一晩のインキュベートで細胞毒性が生じる場合は

4 時間インキュベーションを行った後に培地交換

3 日目1 ウイルスパーティクルを含む培地を除去2 新しい培地に置換

4 日目a トランジェント（一過性発現）で実験する場合　 細胞を回収して qRT-PCR などでノックダウン効率

を検証するb ステーブル（安定発現）で実験する場合　 培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に交換

（方法は下記に記載）　 細胞により至適濃度は異なるが1 ～ 10 microgmL が

標準的

5 日目以降（ステーブルの場合のみ）3 ～ 4 日ごとに培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に置換 （一般的に 10 ～ 12 日後くらいでクローンが確立できる）5 クローン以上をピックしてノックダウン効果を検証する

ピューロマイシンによるセレクション（最適化法9 ページ）1 96 穴プレート各ウェルに 16x104 細胞 と 120 μL の培

地を用意する2 次の日に 1 ～ 10 μgmL となるようピューロマイシン

を分注する3 2 日後に生細胞を調べる4 3 日間ごとにピューロマイシン入りの培地に交換し

3 ～ 14 日間培養し最適な選択期間を検討する

各トランスフェクションは ExpressMagreg レンチウイルスデリバリーシステムを用いて1 日ずつ短縮することも可能ですまた導入しにくい細胞系などをご利用の際にも ExpressMag をご利用くださいExpressMag（15ページ）

shRNA実験情報に関するシグマ アルドリッチURL

shRNA TOP( 各種製品添付資料技術資料FAQ などもこちら )sigmacomshrna-jp

細胞実施例sigmacomshtable

shRNA

9

使用する細胞により最適な抗生物質の濃度は異なります初めて使用する細胞などで適切な抗生物質濃度がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる検討を行い細胞ストレスを低減するためにできる限り低濃度で且つ効率の高い抗生物質濃度を決定しておく必要があります多くの場合shRNA ベクターが導入されていない細胞は 1-10 μgmL の濃度で死滅します

選択用抗生物質（ピューロマイシン）濃度の最適化方法

必要な試薬と機器ピューロマイシン溶液（製品番号 P9620）培養液　　ノックダウン対象の細胞の増殖維持に適した培地（DMEM + 10 FCS など）

培養用インキュベーター6 ウェルプレート

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ50 の細胞密度となるよう細胞を播種（ex 2 x 105 cellwell）2 一晩インキュベート

Day 13 培地を温めておく4 ピューロマイシンの希釈系列（ex 0 10 25 50 75 100 microgmL）を培地を用いて調整5 培地をピューロマイシンを含む選択培地に交換6 それぞれのウェルの生細胞数を測定

Day 3-107 ２日毎に選択培地に交換し死細胞を除去8 ２日毎に生細胞数を測定

Day 109 細胞の死滅曲線を描き選択培地で培養した７ー 10 日の間に細胞が 100死滅したピューロマイシン濃度

を決定する

備考ピューロマイシンの凍結融解は最小限にとどめ選択培地は用事調製する10 μgmL 以上のピューロマイシン濃度が必要であった場合ピューロマイシンの使用期限を確認する

参考ピューロマイシン濃度Hela 3 microgmL HEK293 3 microgmL B16 1-3 microgmL PC10 10 microgmL A431 1 microgmL Jurkat 4 microgmL

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

shRNA

10

使用する細胞によりレンチウイルスの感染効率は異なります初めて使用する細胞などで適切な条件がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる条件検討を行い最適な Multiplicity Of Infection（MOI）を決定しておく必要がありますMISSIONreg TurboGFP trade コントロール（SHC003V）をご利用いただくと簡便に最適な MOI を決定することが可能です

TurboGFP コントロール（SHC003V）で用いられている CMV プロモーターは幹細胞リンパ球初代神経細胞などでその発現活性があまり高くないことが知られておりこれら細胞から得られる GFP シグナルが減少するため感染効率を実際よりも低く見積もってしまう場合がありますそれらの細胞において感染効率評価を実施する場合は限外希釈法を用いる必要があります

レンチウイルス感染効率評価方法

必要な試薬と機器TurboGFP コントロール（製品番号 SHC003V）Hexadimethrine bromide（製品番号 H9268）または Protamine sulfate（製品番号 P3369）培地培養用インキュベーター蛍光顕微鏡および GFP 用フィルター

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ24 時間後に細胞密度が 50となるよう細胞を播種2 一晩インキュベート

Day 13 レンチウイルスコントロール（製品番号 SHC003V）を室温にて溶解4 チューブを指で軽く弾き撹拌し氷上で保存する5 コントロールの段階希釈系列（10 倍希釈）を調整し各ウェルへ添加し振とう6 Hexadimethrine bromide または Protamine sulfate を終濃度 8 microgmL となるように添加し振とう7 18-20 時間インキュベート

Day 28 培地交換しウイルスを含む培地を除去9 さらに 24-48 時間インキュベートしGFP を十分発現させる多くの場合TurboGFP は感染後 72 時間後

に強い発現を示す

Day 3-510 蛍光顕微鏡下で観察しTurboGFP 発現細胞の割合が最も高い条件を決定する

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

Multiplicity Of Infection (MOI) 算出式

MOI　 =ウイルスタイター（TUmL） x 容量（mL）

細胞数

shRNA

11

本製品はカルタヘナ法該当製品です数十万クローンから構成され数万遺伝子を標的とするライブラリーから製品仕様をご選択いただく必要がありお手数ではございますがご注文の仕様をご指定いただくための専用『ご注文用紙』（12ページ⑤）にご記入いただいております必要な情報をご記入後に弊社代理店へご注文用紙をお渡しください弊社ウェブサイトに掲載しておりますご注文用紙はPDF に直接ご入力いただけます製品を検索いただいたのち必要な情報をコピー amp ペーストにてご入力いただけますPDF は sigmacomshrna-jp　からご取得ください

個別クローン基本価格（1 クローンご注文の場合の単価）フォーマット 製品番号 価格 納期 基本仕様

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen25000 2-3週間 保管温度-70 内容物Terrific Broth carbenicillin 100 μgmL 15 glycerol

精製プラスミドDNA SHCLND yen60000 3-4週間 保管温度-20 容量40 μL 内容物1 μg プラスミドDNA（20 ngμL Tris-EDTA buffer）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen70000 4-6週間 保管温度-70 容量200 μL 内容物≧106 TUmL液体培地（DMEM 10 FBS penicillin-streptomycin）

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません

5 クローンセット割引価格（5 クローン以上ある製品に適用） ある遺伝子（RefSeq）に対する shRNA クローンを同一生物種同一フォーマットから 2 クローン以上お求めの場合は

お得な 5 クローンセットでお申し込み下さいターゲット遺伝子に対して 5 クローン以上製品が無い場合には別途お問合せ下さい　（その場合全クローンお選びいただければセット価格が適用になります）6 クローン以上ご購入いただく場合は5 クローンセット時の 1 クローン単価timesクローンの個数となります納期は 1 クローンご注文の場合と同様ですクローンセットでご購入の場合バリデート保証が適用されます（4ページ）

フォーマット 製品番号 5 クローンセット合計価格 1 クローン単価 納期

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen50000 yen10000 1 クローンと同様（上記表を参照）

精製プラスミドDNA SHCLND yen115000 yen23000 1 クローンと同様（上記表を参照）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen125005 yen25001 1 クローンと同様（上記表を参照）

オプション価格（ベクター変更タイター変更容量変更）カスタムベクターの詳細についてはカスタムクローニングサービス

のご紹介を参照ください（16 ページ） 1 クローンまたは 5 クローンセット価格に各オプション金額が加

算されますオプション選択時にも5 クローンセット割引価格は適用となります

（5 クローンセットでお求めの際は全てのクローンにおいて同一オプションとなります）

納期は1 オプションにつき通常納期に 2 週間ずつ加算されますオプションの種類 1 クローン購入時 5 クローンセットで購入時

（5 クローン合計） 納期

ベクター変更各種（プラスミドDNA）

+ yen70000 + yen190000 + 2 週間各種（レンチウイルスパーティクル）

タイター変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様1x106 TUmL

1x107 TUmL + yen97000 + yen485000 + 2 週間1x108 TUmL + yen155800 + yen779000 + 2 週間1x109 TUmL + yen305800 + yen1529000 + 2 週間

容量変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様02 mL

01 mL - yen15200 - yen76000 変更なし10 mL + yen15000 + yen75000 + 2 週間20 mL + yen23400 + yen117000 + 2 週間50 mL + yen32800 + yen164000 + 2 週間100 mL + yen43000 + yen215000 + 2 週間

107 TUmL 以上のタイターオプションとの併用時のみ選択可能です

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません 25 クローン以下の購入の場合 バイアル（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷 大腸菌フォーマットは 14 mL TrakMates チューブでの出荷 26 クローン以上の購入の場合 96-well Plate（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷Plate Map CD-ROM 付き

価格　－ 計算例 － セット価格で計算した場合

納品形態レンチウイルスパーティクル（製品番号SHCLNV）

①クローン数5 クローンセット yen125005

②オプションベクター変更（pLKO1-CMV-Neo） yen156000

仕様合計（①と②の合計） yen366000

MISSIONreg shRNA クローンご注文情報

shRNA

12

shRNAご注文方法シグマ アルドリッチウェブサイトの情報検索ウィンドウよりターゲット遺伝子に対する MISSIONregshRNA クローンの検索を行うことができます

① sigmacomjapan

③生物種とフォーマット選択

④クローンの選択

⑤専用注文用紙に記入sigmacomshrna-jp より専用発注書をダウンロードしAcrobat Reader などで開きクローン番号など必要な情報をご入力ください（追記型 PDFファイルのため直接タイプ ペーストしていただけます）

⑥代理店様に発注発注書に必要事項を入力後再度保存しメール添付ファイルの形で代理店様にご発注ください

②ターゲット遺伝子選択

遺伝子名やAccession No で検索

ターゲット遺伝子を探し青字の製品カテゴリーにある『shRNA』をクリック

生物種（ヒトマウス）および3 種類のフォーマット よりご希望の製品番号に該当するldquo価格rdquoボタンをクリック

各クローンの情報（ターゲット遺伝子情報バリデーションの有無配列TRC バージョン情報など）が表示されるのでこれらの情報より目的クローンを選択一部のオプションはプルダウンでご選択いただけますオプションには別途費用が発生いたしますご注意ください

カスタムサービスも承りますお見積もり依頼はコチラ

httpgooglta5NTa

shRNA

13

コントロールshRNA各種コントロールをご利用いただけますフォーマット蛍光マーカープロモーターなどから細胞や実験に適した製品をご選択ください高タイターのコントロールをご希望の場合は別途ご相談ください

各コントロールを MOI = 5 にて導入した A549 細胞（上図は明視野下図は蛍光画像）

コントロール一覧 　

用途 製品名製品番号

希望販売価格TRC1 series TRC2 seriesPlasmid DNA Lentiviral Plasmid DNA Lentiviral

ネガティブコントロールpLKO1-puro Non-Target shRNA Control 1 SHC002 SHC002V SHC202 SHC202V yen59000

pLKO1-puro Non-Target shRNA Control 2 SHC016 SHC016V SHC216 SHC216V yen59000

蛍光タンパク質トランスダクションコントロール

（ポジティブコントロール）

pLKO1-puro CMV-TurboGFP SHC003 SHC003V SHC203 SHC203V

製品番号になしの製品

yen59000

ありの製品yen93000

pLKO1-puro CMV-TagCFPtrade SHC010 SHC010V - -

pLKO1-puro CMV-TagYFPtrade SHC011 SHC011V - -

pLKO1-puro CMV-TagRFPtrade SHC012 SHC012V - -

pLKO1-puro CMV-TagFP635trade SHC013 SHC013V - -

pLKO1-puro UbC-TurboGFP SHC014 SHC014V - -

pLKO1-puro UbC-TagFP635 SHC015 SHC015V - -

外来性遺伝子用shRNAコントロール

TurboGFP shRNA Control SHC004 SHC004V SHC204 SHC204V yen59000

eGFP shRNA Control SHC005 SHC005V - - yen59000

Luciferase shRNA Control SHC007 SHC007V - - yen59000

内在性遺伝子用shRNAコントロール

shRNA Human Positive Control 1（B2M） SHC008 SHC008V - - yen59000

shRNA Human Positive Control 2（ARHGDIA） SHC009 SHC009V - - yen59000

Emptyコントロールベクター pLKO1-puro Control SHC001 SHC001V SHC201 SHC201V yen59000仕様 plasmid DNA 5 μg DNA -20 stock 500 ng μL TE buffer

Lentiviral 4 x 50 μL -70 stock 106 TUmL (via p24 titering assay) ハイタイターコントロールのご用意もございます別途お問合せ下さい

Transduction Knockdown

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)TurboGFP(SHC003SHC003V)TagCFP(SHC010SHC010V)TagYFP(SHC011SHC011V)TagRFP(SHC012SHC012V)TagFP635(SHC013SHC013V)UbC-TurboGFP(SHC014SHC014V)UbC-TagFP635(SHC015SHC015V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)TurboGFP(SHC203SHC203V)

TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)shRNA Positive Control 1(HumanB2M) (SHC008SHC008V)shRNA Positive Control 2(HumanARHGDIA) (SHC009SHC009V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

Monitor

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)Non-Target shRNA 1(SHC002SHC002V)Non-Target shRNA 2(SHC016SHC016V)TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)Non-Target shRNA 1(SHC202SHC202V)Non-Target shRNA 2(SHC216SHC216V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

MISSION shRNA Controls

NegativePositive

UbC-TagFP635 trade UbC-TurboGFP trade CMV-TagFP635 trade CMV-TagYFP trade CMV-TagCFP trade

sigma-aldrichcomcontrols

MISSIONreg shRNA コントロール製品群

shRNA

14

Packaging PlasmidsMISSIONreg Lentiviral Packaging Mix はMISSION TRC shRNA コレクションに最適化したパッケージング用プラスミドのプレミックス製品です本製品にはレンチウイルスの構造および複製に関与する遺伝子（gag および pol）を有するパッケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ドVSV-G エ ン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエンベロープベクターから成ります本製品は独自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用いただけますがシグマ アルドリッチでは時間を節約し品質を確保するために弊社がご提供するウイルスフォーマットのコレクションをご使用いただくことを強くお勧めいたします

製品名 カタログ番号 価格

MISSION lentiviral Packaging MixSHP001-025ML yen50000SHP001-17ML yen175000

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

Assembly ampBudding

Maturation

pMISSION GAG POL

12150 bp

ampR

Sv40

gag

CMV

pol

rev tat

insulin polyA

pMISSION VSV-G

5824 bp

CMV

VSV-G

Envelope VectorPackaging Vector

Lentiviral Packaging Mix

TransferVector

PackagingVector Envelope

Vector

組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

shRNAパッケージングプラスミドならびに関連製品

その他試薬

製品名 カタログ番号 価格 備考

Puromycin dihydrochloride P9620-10ML yen20900 調製済puromycin溶液

Hexadimethrine bromideH9268-5G yen8600

レンチウイルスの導入効率を向上H9268-10G yen12900H9268-50G yen49700

Protamine sulfateP3369-10G yen44400 レンチウイルスの導入効率を向上

Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効P3369-100G yen250000

Carbenicillin disodium saltC3416-250MG yen8700C3416-1G yen21800C3416-5G yen65800

Terrific Broth T5574-500ML yen11300 液体培地

Terrific Broth Modified EZMixtrade Powder T9179-6X500ML yen7900

顆粒T9179-2X5L yen18800

各種 MISSION 製品の添付資料はこちらからsigmacomshrnatechbull-jp

shRNA

15

マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

16

MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

8

レンチウイルスパーティクル（製品番号 SHCLNV） プロトコールMISSIONreg shRNA レンチウイルスを感染させる基本的なプロトコールを記載しています1 日目

1トランスフェクションの 24 時間前に哺乳動物細胞をプレートに撒いて培養

2 トランスフェクションは 50 ～ 80コンフルエントで行う

2 日目1 ウイルスパーティクルストックを氷上に出してゆっくり

解凍2 Hexadimethrine bromide を細胞に添加（最終濃

度 8 microgmL）して振とう　 トランスフェクション効率を高める（ただし神経

細胞の初代培養などには不適）3 適した量（MOI）のウイルスパーティクルを添加して

振とう　 初めての場合は幾つかのmultiplicity of infection

（MOI）を試す（05 - 20など）　 MOI 細胞に対するウイルス粒子の個数　　（1 ウェル中の全細胞数） x （目的の MOI）= （必要な TU） 　　（必要な TU） （CoA に書かれている TUmL） 　　= （1 ウェルに添加するレンチウイルス粒子の容量）4 37で一晩インキュベート 　 一晩のインキュベートで細胞毒性が生じる場合は

4 時間インキュベーションを行った後に培地交換

3 日目1 ウイルスパーティクルを含む培地を除去2 新しい培地に置換

4 日目a トランジェント（一過性発現）で実験する場合　 細胞を回収して qRT-PCR などでノックダウン効率

を検証するb ステーブル（安定発現）で実験する場合　 培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に交換

（方法は下記に記載）　 細胞により至適濃度は異なるが1 ～ 10 microgmL が

標準的

5 日目以降（ステーブルの場合のみ）3 ～ 4 日ごとに培地を適当量のピューロマイシンを含む培地に置換 （一般的に 10 ～ 12 日後くらいでクローンが確立できる）5 クローン以上をピックしてノックダウン効果を検証する

ピューロマイシンによるセレクション（最適化法9 ページ）1 96 穴プレート各ウェルに 16x104 細胞 と 120 μL の培

地を用意する2 次の日に 1 ～ 10 μgmL となるようピューロマイシン

を分注する3 2 日後に生細胞を調べる4 3 日間ごとにピューロマイシン入りの培地に交換し

3 ～ 14 日間培養し最適な選択期間を検討する

各トランスフェクションは ExpressMagreg レンチウイルスデリバリーシステムを用いて1 日ずつ短縮することも可能ですまた導入しにくい細胞系などをご利用の際にも ExpressMag をご利用くださいExpressMag（15ページ）

shRNA実験情報に関するシグマ アルドリッチURL

shRNA TOP( 各種製品添付資料技術資料FAQ などもこちら )sigmacomshrna-jp

細胞実施例sigmacomshtable

shRNA

9

使用する細胞により最適な抗生物質の濃度は異なります初めて使用する細胞などで適切な抗生物質濃度がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる検討を行い細胞ストレスを低減するためにできる限り低濃度で且つ効率の高い抗生物質濃度を決定しておく必要があります多くの場合shRNA ベクターが導入されていない細胞は 1-10 μgmL の濃度で死滅します

選択用抗生物質（ピューロマイシン）濃度の最適化方法

必要な試薬と機器ピューロマイシン溶液（製品番号 P9620）培養液　　ノックダウン対象の細胞の増殖維持に適した培地（DMEM + 10 FCS など）

培養用インキュベーター6 ウェルプレート

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ50 の細胞密度となるよう細胞を播種（ex 2 x 105 cellwell）2 一晩インキュベート

Day 13 培地を温めておく4 ピューロマイシンの希釈系列（ex 0 10 25 50 75 100 microgmL）を培地を用いて調整5 培地をピューロマイシンを含む選択培地に交換6 それぞれのウェルの生細胞数を測定

Day 3-107 ２日毎に選択培地に交換し死細胞を除去8 ２日毎に生細胞数を測定

Day 109 細胞の死滅曲線を描き選択培地で培養した７ー 10 日の間に細胞が 100死滅したピューロマイシン濃度

を決定する

備考ピューロマイシンの凍結融解は最小限にとどめ選択培地は用事調製する10 μgmL 以上のピューロマイシン濃度が必要であった場合ピューロマイシンの使用期限を確認する

参考ピューロマイシン濃度Hela 3 microgmL HEK293 3 microgmL B16 1-3 microgmL PC10 10 microgmL A431 1 microgmL Jurkat 4 microgmL

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

shRNA

10

使用する細胞によりレンチウイルスの感染効率は異なります初めて使用する細胞などで適切な条件がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる条件検討を行い最適な Multiplicity Of Infection（MOI）を決定しておく必要がありますMISSIONreg TurboGFP trade コントロール（SHC003V）をご利用いただくと簡便に最適な MOI を決定することが可能です

TurboGFP コントロール（SHC003V）で用いられている CMV プロモーターは幹細胞リンパ球初代神経細胞などでその発現活性があまり高くないことが知られておりこれら細胞から得られる GFP シグナルが減少するため感染効率を実際よりも低く見積もってしまう場合がありますそれらの細胞において感染効率評価を実施する場合は限外希釈法を用いる必要があります

レンチウイルス感染効率評価方法

必要な試薬と機器TurboGFP コントロール（製品番号 SHC003V）Hexadimethrine bromide（製品番号 H9268）または Protamine sulfate（製品番号 P3369）培地培養用インキュベーター蛍光顕微鏡および GFP 用フィルター

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ24 時間後に細胞密度が 50となるよう細胞を播種2 一晩インキュベート

Day 13 レンチウイルスコントロール（製品番号 SHC003V）を室温にて溶解4 チューブを指で軽く弾き撹拌し氷上で保存する5 コントロールの段階希釈系列（10 倍希釈）を調整し各ウェルへ添加し振とう6 Hexadimethrine bromide または Protamine sulfate を終濃度 8 microgmL となるように添加し振とう7 18-20 時間インキュベート

Day 28 培地交換しウイルスを含む培地を除去9 さらに 24-48 時間インキュベートしGFP を十分発現させる多くの場合TurboGFP は感染後 72 時間後

に強い発現を示す

Day 3-510 蛍光顕微鏡下で観察しTurboGFP 発現細胞の割合が最も高い条件を決定する

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

Multiplicity Of Infection (MOI) 算出式

MOI　 =ウイルスタイター（TUmL） x 容量（mL）

細胞数

shRNA

11

本製品はカルタヘナ法該当製品です数十万クローンから構成され数万遺伝子を標的とするライブラリーから製品仕様をご選択いただく必要がありお手数ではございますがご注文の仕様をご指定いただくための専用『ご注文用紙』（12ページ⑤）にご記入いただいております必要な情報をご記入後に弊社代理店へご注文用紙をお渡しください弊社ウェブサイトに掲載しておりますご注文用紙はPDF に直接ご入力いただけます製品を検索いただいたのち必要な情報をコピー amp ペーストにてご入力いただけますPDF は sigmacomshrna-jp　からご取得ください

個別クローン基本価格（1 クローンご注文の場合の単価）フォーマット 製品番号 価格 納期 基本仕様

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen25000 2-3週間 保管温度-70 内容物Terrific Broth carbenicillin 100 μgmL 15 glycerol

精製プラスミドDNA SHCLND yen60000 3-4週間 保管温度-20 容量40 μL 内容物1 μg プラスミドDNA（20 ngμL Tris-EDTA buffer）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen70000 4-6週間 保管温度-70 容量200 μL 内容物≧106 TUmL液体培地（DMEM 10 FBS penicillin-streptomycin）

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません

5 クローンセット割引価格（5 クローン以上ある製品に適用） ある遺伝子（RefSeq）に対する shRNA クローンを同一生物種同一フォーマットから 2 クローン以上お求めの場合は

お得な 5 クローンセットでお申し込み下さいターゲット遺伝子に対して 5 クローン以上製品が無い場合には別途お問合せ下さい　（その場合全クローンお選びいただければセット価格が適用になります）6 クローン以上ご購入いただく場合は5 クローンセット時の 1 クローン単価timesクローンの個数となります納期は 1 クローンご注文の場合と同様ですクローンセットでご購入の場合バリデート保証が適用されます（4ページ）

フォーマット 製品番号 5 クローンセット合計価格 1 クローン単価 納期

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen50000 yen10000 1 クローンと同様（上記表を参照）

精製プラスミドDNA SHCLND yen115000 yen23000 1 クローンと同様（上記表を参照）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen125005 yen25001 1 クローンと同様（上記表を参照）

オプション価格（ベクター変更タイター変更容量変更）カスタムベクターの詳細についてはカスタムクローニングサービス

のご紹介を参照ください（16 ページ） 1 クローンまたは 5 クローンセット価格に各オプション金額が加

算されますオプション選択時にも5 クローンセット割引価格は適用となります

（5 クローンセットでお求めの際は全てのクローンにおいて同一オプションとなります）

納期は1 オプションにつき通常納期に 2 週間ずつ加算されますオプションの種類 1 クローン購入時 5 クローンセットで購入時

（5 クローン合計） 納期

ベクター変更各種（プラスミドDNA）

+ yen70000 + yen190000 + 2 週間各種（レンチウイルスパーティクル）

タイター変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様1x106 TUmL

1x107 TUmL + yen97000 + yen485000 + 2 週間1x108 TUmL + yen155800 + yen779000 + 2 週間1x109 TUmL + yen305800 + yen1529000 + 2 週間

容量変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様02 mL

01 mL - yen15200 - yen76000 変更なし10 mL + yen15000 + yen75000 + 2 週間20 mL + yen23400 + yen117000 + 2 週間50 mL + yen32800 + yen164000 + 2 週間100 mL + yen43000 + yen215000 + 2 週間

107 TUmL 以上のタイターオプションとの併用時のみ選択可能です

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません 25 クローン以下の購入の場合 バイアル（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷 大腸菌フォーマットは 14 mL TrakMates チューブでの出荷 26 クローン以上の購入の場合 96-well Plate（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷Plate Map CD-ROM 付き

価格　－ 計算例 － セット価格で計算した場合

納品形態レンチウイルスパーティクル（製品番号SHCLNV）

①クローン数5 クローンセット yen125005

②オプションベクター変更（pLKO1-CMV-Neo） yen156000

仕様合計（①と②の合計） yen366000

MISSIONreg shRNA クローンご注文情報

shRNA

12

shRNAご注文方法シグマ アルドリッチウェブサイトの情報検索ウィンドウよりターゲット遺伝子に対する MISSIONregshRNA クローンの検索を行うことができます

① sigmacomjapan

③生物種とフォーマット選択

④クローンの選択

⑤専用注文用紙に記入sigmacomshrna-jp より専用発注書をダウンロードしAcrobat Reader などで開きクローン番号など必要な情報をご入力ください（追記型 PDFファイルのため直接タイプ ペーストしていただけます）

⑥代理店様に発注発注書に必要事項を入力後再度保存しメール添付ファイルの形で代理店様にご発注ください

②ターゲット遺伝子選択

遺伝子名やAccession No で検索

ターゲット遺伝子を探し青字の製品カテゴリーにある『shRNA』をクリック

生物種（ヒトマウス）および3 種類のフォーマット よりご希望の製品番号に該当するldquo価格rdquoボタンをクリック

各クローンの情報（ターゲット遺伝子情報バリデーションの有無配列TRC バージョン情報など）が表示されるのでこれらの情報より目的クローンを選択一部のオプションはプルダウンでご選択いただけますオプションには別途費用が発生いたしますご注意ください

カスタムサービスも承りますお見積もり依頼はコチラ

httpgooglta5NTa

shRNA

13

コントロールshRNA各種コントロールをご利用いただけますフォーマット蛍光マーカープロモーターなどから細胞や実験に適した製品をご選択ください高タイターのコントロールをご希望の場合は別途ご相談ください

各コントロールを MOI = 5 にて導入した A549 細胞（上図は明視野下図は蛍光画像）

コントロール一覧 　

用途 製品名製品番号

希望販売価格TRC1 series TRC2 seriesPlasmid DNA Lentiviral Plasmid DNA Lentiviral

ネガティブコントロールpLKO1-puro Non-Target shRNA Control 1 SHC002 SHC002V SHC202 SHC202V yen59000

pLKO1-puro Non-Target shRNA Control 2 SHC016 SHC016V SHC216 SHC216V yen59000

蛍光タンパク質トランスダクションコントロール

（ポジティブコントロール）

pLKO1-puro CMV-TurboGFP SHC003 SHC003V SHC203 SHC203V

製品番号になしの製品

yen59000

ありの製品yen93000

pLKO1-puro CMV-TagCFPtrade SHC010 SHC010V - -

pLKO1-puro CMV-TagYFPtrade SHC011 SHC011V - -

pLKO1-puro CMV-TagRFPtrade SHC012 SHC012V - -

pLKO1-puro CMV-TagFP635trade SHC013 SHC013V - -

pLKO1-puro UbC-TurboGFP SHC014 SHC014V - -

pLKO1-puro UbC-TagFP635 SHC015 SHC015V - -

外来性遺伝子用shRNAコントロール

TurboGFP shRNA Control SHC004 SHC004V SHC204 SHC204V yen59000

eGFP shRNA Control SHC005 SHC005V - - yen59000

Luciferase shRNA Control SHC007 SHC007V - - yen59000

内在性遺伝子用shRNAコントロール

shRNA Human Positive Control 1（B2M） SHC008 SHC008V - - yen59000

shRNA Human Positive Control 2（ARHGDIA） SHC009 SHC009V - - yen59000

Emptyコントロールベクター pLKO1-puro Control SHC001 SHC001V SHC201 SHC201V yen59000仕様 plasmid DNA 5 μg DNA -20 stock 500 ng μL TE buffer

Lentiviral 4 x 50 μL -70 stock 106 TUmL (via p24 titering assay) ハイタイターコントロールのご用意もございます別途お問合せ下さい

Transduction Knockdown

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)TurboGFP(SHC003SHC003V)TagCFP(SHC010SHC010V)TagYFP(SHC011SHC011V)TagRFP(SHC012SHC012V)TagFP635(SHC013SHC013V)UbC-TurboGFP(SHC014SHC014V)UbC-TagFP635(SHC015SHC015V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)TurboGFP(SHC203SHC203V)

TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)shRNA Positive Control 1(HumanB2M) (SHC008SHC008V)shRNA Positive Control 2(HumanARHGDIA) (SHC009SHC009V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

Monitor

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)Non-Target shRNA 1(SHC002SHC002V)Non-Target shRNA 2(SHC016SHC016V)TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)Non-Target shRNA 1(SHC202SHC202V)Non-Target shRNA 2(SHC216SHC216V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

MISSION shRNA Controls

NegativePositive

UbC-TagFP635 trade UbC-TurboGFP trade CMV-TagFP635 trade CMV-TagYFP trade CMV-TagCFP trade

sigma-aldrichcomcontrols

MISSIONreg shRNA コントロール製品群

shRNA

14

Packaging PlasmidsMISSIONreg Lentiviral Packaging Mix はMISSION TRC shRNA コレクションに最適化したパッケージング用プラスミドのプレミックス製品です本製品にはレンチウイルスの構造および複製に関与する遺伝子（gag および pol）を有するパッケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ドVSV-G エ ン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエンベロープベクターから成ります本製品は独自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用いただけますがシグマ アルドリッチでは時間を節約し品質を確保するために弊社がご提供するウイルスフォーマットのコレクションをご使用いただくことを強くお勧めいたします

製品名 カタログ番号 価格

MISSION lentiviral Packaging MixSHP001-025ML yen50000SHP001-17ML yen175000

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

Assembly ampBudding

Maturation

pMISSION GAG POL

12150 bp

ampR

Sv40

gag

CMV

pol

rev tat

insulin polyA

pMISSION VSV-G

5824 bp

CMV

VSV-G

Envelope VectorPackaging Vector

Lentiviral Packaging Mix

TransferVector

PackagingVector Envelope

Vector

組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

shRNAパッケージングプラスミドならびに関連製品

その他試薬

製品名 カタログ番号 価格 備考

Puromycin dihydrochloride P9620-10ML yen20900 調製済puromycin溶液

Hexadimethrine bromideH9268-5G yen8600

レンチウイルスの導入効率を向上H9268-10G yen12900H9268-50G yen49700

Protamine sulfateP3369-10G yen44400 レンチウイルスの導入効率を向上

Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効P3369-100G yen250000

Carbenicillin disodium saltC3416-250MG yen8700C3416-1G yen21800C3416-5G yen65800

Terrific Broth T5574-500ML yen11300 液体培地

Terrific Broth Modified EZMixtrade Powder T9179-6X500ML yen7900

顆粒T9179-2X5L yen18800

各種 MISSION 製品の添付資料はこちらからsigmacomshrnatechbull-jp

shRNA

15

マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

16

MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

9

使用する細胞により最適な抗生物質の濃度は異なります初めて使用する細胞などで適切な抗生物質濃度がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる検討を行い細胞ストレスを低減するためにできる限り低濃度で且つ効率の高い抗生物質濃度を決定しておく必要があります多くの場合shRNA ベクターが導入されていない細胞は 1-10 μgmL の濃度で死滅します

選択用抗生物質（ピューロマイシン）濃度の最適化方法

必要な試薬と機器ピューロマイシン溶液（製品番号 P9620）培養液　　ノックダウン対象の細胞の増殖維持に適した培地（DMEM + 10 FCS など）

培養用インキュベーター6 ウェルプレート

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ50 の細胞密度となるよう細胞を播種（ex 2 x 105 cellwell）2 一晩インキュベート

Day 13 培地を温めておく4 ピューロマイシンの希釈系列（ex 0 10 25 50 75 100 microgmL）を培地を用いて調整5 培地をピューロマイシンを含む選択培地に交換6 それぞれのウェルの生細胞数を測定

Day 3-107 ２日毎に選択培地に交換し死細胞を除去8 ２日毎に生細胞数を測定

Day 109 細胞の死滅曲線を描き選択培地で培養した７ー 10 日の間に細胞が 100死滅したピューロマイシン濃度

を決定する

備考ピューロマイシンの凍結融解は最小限にとどめ選択培地は用事調製する10 μgmL 以上のピューロマイシン濃度が必要であった場合ピューロマイシンの使用期限を確認する

参考ピューロマイシン濃度Hela 3 microgmL HEK293 3 microgmL B16 1-3 microgmL PC10 10 microgmL A431 1 microgmL Jurkat 4 microgmL

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

shRNA

10

使用する細胞によりレンチウイルスの感染効率は異なります初めて使用する細胞などで適切な条件がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる条件検討を行い最適な Multiplicity Of Infection（MOI）を決定しておく必要がありますMISSIONreg TurboGFP trade コントロール（SHC003V）をご利用いただくと簡便に最適な MOI を決定することが可能です

TurboGFP コントロール（SHC003V）で用いられている CMV プロモーターは幹細胞リンパ球初代神経細胞などでその発現活性があまり高くないことが知られておりこれら細胞から得られる GFP シグナルが減少するため感染効率を実際よりも低く見積もってしまう場合がありますそれらの細胞において感染効率評価を実施する場合は限外希釈法を用いる必要があります

レンチウイルス感染効率評価方法

必要な試薬と機器TurboGFP コントロール（製品番号 SHC003V）Hexadimethrine bromide（製品番号 H9268）または Protamine sulfate（製品番号 P3369）培地培養用インキュベーター蛍光顕微鏡および GFP 用フィルター

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ24 時間後に細胞密度が 50となるよう細胞を播種2 一晩インキュベート

Day 13 レンチウイルスコントロール（製品番号 SHC003V）を室温にて溶解4 チューブを指で軽く弾き撹拌し氷上で保存する5 コントロールの段階希釈系列（10 倍希釈）を調整し各ウェルへ添加し振とう6 Hexadimethrine bromide または Protamine sulfate を終濃度 8 microgmL となるように添加し振とう7 18-20 時間インキュベート

Day 28 培地交換しウイルスを含む培地を除去9 さらに 24-48 時間インキュベートしGFP を十分発現させる多くの場合TurboGFP は感染後 72 時間後

に強い発現を示す

Day 3-510 蛍光顕微鏡下で観察しTurboGFP 発現細胞の割合が最も高い条件を決定する

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

Multiplicity Of Infection (MOI) 算出式

MOI　 =ウイルスタイター（TUmL） x 容量（mL）

細胞数

shRNA

11

本製品はカルタヘナ法該当製品です数十万クローンから構成され数万遺伝子を標的とするライブラリーから製品仕様をご選択いただく必要がありお手数ではございますがご注文の仕様をご指定いただくための専用『ご注文用紙』（12ページ⑤）にご記入いただいております必要な情報をご記入後に弊社代理店へご注文用紙をお渡しください弊社ウェブサイトに掲載しておりますご注文用紙はPDF に直接ご入力いただけます製品を検索いただいたのち必要な情報をコピー amp ペーストにてご入力いただけますPDF は sigmacomshrna-jp　からご取得ください

個別クローン基本価格（1 クローンご注文の場合の単価）フォーマット 製品番号 価格 納期 基本仕様

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen25000 2-3週間 保管温度-70 内容物Terrific Broth carbenicillin 100 μgmL 15 glycerol

精製プラスミドDNA SHCLND yen60000 3-4週間 保管温度-20 容量40 μL 内容物1 μg プラスミドDNA（20 ngμL Tris-EDTA buffer）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen70000 4-6週間 保管温度-70 容量200 μL 内容物≧106 TUmL液体培地（DMEM 10 FBS penicillin-streptomycin）

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません

5 クローンセット割引価格（5 クローン以上ある製品に適用） ある遺伝子（RefSeq）に対する shRNA クローンを同一生物種同一フォーマットから 2 クローン以上お求めの場合は

お得な 5 クローンセットでお申し込み下さいターゲット遺伝子に対して 5 クローン以上製品が無い場合には別途お問合せ下さい　（その場合全クローンお選びいただければセット価格が適用になります）6 クローン以上ご購入いただく場合は5 クローンセット時の 1 クローン単価timesクローンの個数となります納期は 1 クローンご注文の場合と同様ですクローンセットでご購入の場合バリデート保証が適用されます（4ページ）

フォーマット 製品番号 5 クローンセット合計価格 1 クローン単価 納期

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen50000 yen10000 1 クローンと同様（上記表を参照）

精製プラスミドDNA SHCLND yen115000 yen23000 1 クローンと同様（上記表を参照）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen125005 yen25001 1 クローンと同様（上記表を参照）

オプション価格（ベクター変更タイター変更容量変更）カスタムベクターの詳細についてはカスタムクローニングサービス

のご紹介を参照ください（16 ページ） 1 クローンまたは 5 クローンセット価格に各オプション金額が加

算されますオプション選択時にも5 クローンセット割引価格は適用となります

（5 クローンセットでお求めの際は全てのクローンにおいて同一オプションとなります）

納期は1 オプションにつき通常納期に 2 週間ずつ加算されますオプションの種類 1 クローン購入時 5 クローンセットで購入時

（5 クローン合計） 納期

ベクター変更各種（プラスミドDNA）

+ yen70000 + yen190000 + 2 週間各種（レンチウイルスパーティクル）

タイター変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様1x106 TUmL

1x107 TUmL + yen97000 + yen485000 + 2 週間1x108 TUmL + yen155800 + yen779000 + 2 週間1x109 TUmL + yen305800 + yen1529000 + 2 週間

容量変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様02 mL

01 mL - yen15200 - yen76000 変更なし10 mL + yen15000 + yen75000 + 2 週間20 mL + yen23400 + yen117000 + 2 週間50 mL + yen32800 + yen164000 + 2 週間100 mL + yen43000 + yen215000 + 2 週間

107 TUmL 以上のタイターオプションとの併用時のみ選択可能です

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません 25 クローン以下の購入の場合 バイアル（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷 大腸菌フォーマットは 14 mL TrakMates チューブでの出荷 26 クローン以上の購入の場合 96-well Plate（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷Plate Map CD-ROM 付き

価格　－ 計算例 － セット価格で計算した場合

納品形態レンチウイルスパーティクル（製品番号SHCLNV）

①クローン数5 クローンセット yen125005

②オプションベクター変更（pLKO1-CMV-Neo） yen156000

仕様合計（①と②の合計） yen366000

MISSIONreg shRNA クローンご注文情報

shRNA

12

shRNAご注文方法シグマ アルドリッチウェブサイトの情報検索ウィンドウよりターゲット遺伝子に対する MISSIONregshRNA クローンの検索を行うことができます

① sigmacomjapan

③生物種とフォーマット選択

④クローンの選択

⑤専用注文用紙に記入sigmacomshrna-jp より専用発注書をダウンロードしAcrobat Reader などで開きクローン番号など必要な情報をご入力ください（追記型 PDFファイルのため直接タイプ ペーストしていただけます）

⑥代理店様に発注発注書に必要事項を入力後再度保存しメール添付ファイルの形で代理店様にご発注ください

②ターゲット遺伝子選択

遺伝子名やAccession No で検索

ターゲット遺伝子を探し青字の製品カテゴリーにある『shRNA』をクリック

生物種（ヒトマウス）および3 種類のフォーマット よりご希望の製品番号に該当するldquo価格rdquoボタンをクリック

各クローンの情報（ターゲット遺伝子情報バリデーションの有無配列TRC バージョン情報など）が表示されるのでこれらの情報より目的クローンを選択一部のオプションはプルダウンでご選択いただけますオプションには別途費用が発生いたしますご注意ください

カスタムサービスも承りますお見積もり依頼はコチラ

httpgooglta5NTa

shRNA

13

コントロールshRNA各種コントロールをご利用いただけますフォーマット蛍光マーカープロモーターなどから細胞や実験に適した製品をご選択ください高タイターのコントロールをご希望の場合は別途ご相談ください

各コントロールを MOI = 5 にて導入した A549 細胞（上図は明視野下図は蛍光画像）

コントロール一覧 　

用途 製品名製品番号

希望販売価格TRC1 series TRC2 seriesPlasmid DNA Lentiviral Plasmid DNA Lentiviral

ネガティブコントロールpLKO1-puro Non-Target shRNA Control 1 SHC002 SHC002V SHC202 SHC202V yen59000

pLKO1-puro Non-Target shRNA Control 2 SHC016 SHC016V SHC216 SHC216V yen59000

蛍光タンパク質トランスダクションコントロール

（ポジティブコントロール）

pLKO1-puro CMV-TurboGFP SHC003 SHC003V SHC203 SHC203V

製品番号になしの製品

yen59000

ありの製品yen93000

pLKO1-puro CMV-TagCFPtrade SHC010 SHC010V - -

pLKO1-puro CMV-TagYFPtrade SHC011 SHC011V - -

pLKO1-puro CMV-TagRFPtrade SHC012 SHC012V - -

pLKO1-puro CMV-TagFP635trade SHC013 SHC013V - -

pLKO1-puro UbC-TurboGFP SHC014 SHC014V - -

pLKO1-puro UbC-TagFP635 SHC015 SHC015V - -

外来性遺伝子用shRNAコントロール

TurboGFP shRNA Control SHC004 SHC004V SHC204 SHC204V yen59000

eGFP shRNA Control SHC005 SHC005V - - yen59000

Luciferase shRNA Control SHC007 SHC007V - - yen59000

内在性遺伝子用shRNAコントロール

shRNA Human Positive Control 1（B2M） SHC008 SHC008V - - yen59000

shRNA Human Positive Control 2（ARHGDIA） SHC009 SHC009V - - yen59000

Emptyコントロールベクター pLKO1-puro Control SHC001 SHC001V SHC201 SHC201V yen59000仕様 plasmid DNA 5 μg DNA -20 stock 500 ng μL TE buffer

Lentiviral 4 x 50 μL -70 stock 106 TUmL (via p24 titering assay) ハイタイターコントロールのご用意もございます別途お問合せ下さい

Transduction Knockdown

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)TurboGFP(SHC003SHC003V)TagCFP(SHC010SHC010V)TagYFP(SHC011SHC011V)TagRFP(SHC012SHC012V)TagFP635(SHC013SHC013V)UbC-TurboGFP(SHC014SHC014V)UbC-TagFP635(SHC015SHC015V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)TurboGFP(SHC203SHC203V)

TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)shRNA Positive Control 1(HumanB2M) (SHC008SHC008V)shRNA Positive Control 2(HumanARHGDIA) (SHC009SHC009V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

Monitor

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)Non-Target shRNA 1(SHC002SHC002V)Non-Target shRNA 2(SHC016SHC016V)TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)Non-Target shRNA 1(SHC202SHC202V)Non-Target shRNA 2(SHC216SHC216V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

MISSION shRNA Controls

NegativePositive

UbC-TagFP635 trade UbC-TurboGFP trade CMV-TagFP635 trade CMV-TagYFP trade CMV-TagCFP trade

sigma-aldrichcomcontrols

MISSIONreg shRNA コントロール製品群

shRNA

14

Packaging PlasmidsMISSIONreg Lentiviral Packaging Mix はMISSION TRC shRNA コレクションに最適化したパッケージング用プラスミドのプレミックス製品です本製品にはレンチウイルスの構造および複製に関与する遺伝子（gag および pol）を有するパッケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ドVSV-G エ ン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエンベロープベクターから成ります本製品は独自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用いただけますがシグマ アルドリッチでは時間を節約し品質を確保するために弊社がご提供するウイルスフォーマットのコレクションをご使用いただくことを強くお勧めいたします

製品名 カタログ番号 価格

MISSION lentiviral Packaging MixSHP001-025ML yen50000SHP001-17ML yen175000

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

Assembly ampBudding

Maturation

pMISSION GAG POL

12150 bp

ampR

Sv40

gag

CMV

pol

rev tat

insulin polyA

pMISSION VSV-G

5824 bp

CMV

VSV-G

Envelope VectorPackaging Vector

Lentiviral Packaging Mix

TransferVector

PackagingVector Envelope

Vector

組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

shRNAパッケージングプラスミドならびに関連製品

その他試薬

製品名 カタログ番号 価格 備考

Puromycin dihydrochloride P9620-10ML yen20900 調製済puromycin溶液

Hexadimethrine bromideH9268-5G yen8600

レンチウイルスの導入効率を向上H9268-10G yen12900H9268-50G yen49700

Protamine sulfateP3369-10G yen44400 レンチウイルスの導入効率を向上

Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効P3369-100G yen250000

Carbenicillin disodium saltC3416-250MG yen8700C3416-1G yen21800C3416-5G yen65800

Terrific Broth T5574-500ML yen11300 液体培地

Terrific Broth Modified EZMixtrade Powder T9179-6X500ML yen7900

顆粒T9179-2X5L yen18800

各種 MISSION 製品の添付資料はこちらからsigmacomshrnatechbull-jp

shRNA

15

マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

16

MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

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使用する細胞によりレンチウイルスの感染効率は異なります初めて使用する細胞などで適切な条件がわからない場合は本実験前にタイトレーションによる条件検討を行い最適な Multiplicity Of Infection（MOI）を決定しておく必要がありますMISSIONreg TurboGFP trade コントロール（SHC003V）をご利用いただくと簡便に最適な MOI を決定することが可能です

TurboGFP コントロール（SHC003V）で用いられている CMV プロモーターは幹細胞リンパ球初代神経細胞などでその発現活性があまり高くないことが知られておりこれら細胞から得られる GFP シグナルが減少するため感染効率を実際よりも低く見積もってしまう場合がありますそれらの細胞において感染効率評価を実施する場合は限外希釈法を用いる必要があります

レンチウイルス感染効率評価方法

必要な試薬と機器TurboGFP コントロール（製品番号 SHC003V）Hexadimethrine bromide（製品番号 H9268）または Protamine sulfate（製品番号 P3369）培地培養用インキュベーター蛍光顕微鏡および GFP 用フィルター

プロトコールDay 01 プレートの各ウェルへ24 時間後に細胞密度が 50となるよう細胞を播種2 一晩インキュベート

Day 13 レンチウイルスコントロール（製品番号 SHC003V）を室温にて溶解4 チューブを指で軽く弾き撹拌し氷上で保存する5 コントロールの段階希釈系列（10 倍希釈）を調整し各ウェルへ添加し振とう6 Hexadimethrine bromide または Protamine sulfate を終濃度 8 microgmL となるように添加し振とう7 18-20 時間インキュベート

Day 28 培地交換しウイルスを含む培地を除去9 さらに 24-48 時間インキュベートしGFP を十分発現させる多くの場合TurboGFP は感染後 72 時間後

に強い発現を示す

Day 3-510 蛍光顕微鏡下で観察しTurboGFP 発現細胞の割合が最も高い条件を決定する

その他 shRNA 関連プロトコルはこちらからsigmacomshrnaprotocol-jp

Multiplicity Of Infection (MOI) 算出式

MOI　 =ウイルスタイター（TUmL） x 容量（mL）

細胞数

shRNA

11

本製品はカルタヘナ法該当製品です数十万クローンから構成され数万遺伝子を標的とするライブラリーから製品仕様をご選択いただく必要がありお手数ではございますがご注文の仕様をご指定いただくための専用『ご注文用紙』（12ページ⑤）にご記入いただいております必要な情報をご記入後に弊社代理店へご注文用紙をお渡しください弊社ウェブサイトに掲載しておりますご注文用紙はPDF に直接ご入力いただけます製品を検索いただいたのち必要な情報をコピー amp ペーストにてご入力いただけますPDF は sigmacomshrna-jp　からご取得ください

個別クローン基本価格（1 クローンご注文の場合の単価）フォーマット 製品番号 価格 納期 基本仕様

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen25000 2-3週間 保管温度-70 内容物Terrific Broth carbenicillin 100 μgmL 15 glycerol

精製プラスミドDNA SHCLND yen60000 3-4週間 保管温度-20 容量40 μL 内容物1 μg プラスミドDNA（20 ngμL Tris-EDTA buffer）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen70000 4-6週間 保管温度-70 容量200 μL 内容物≧106 TUmL液体培地（DMEM 10 FBS penicillin-streptomycin）

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません

5 クローンセット割引価格（5 クローン以上ある製品に適用） ある遺伝子（RefSeq）に対する shRNA クローンを同一生物種同一フォーマットから 2 クローン以上お求めの場合は

お得な 5 クローンセットでお申し込み下さいターゲット遺伝子に対して 5 クローン以上製品が無い場合には別途お問合せ下さい　（その場合全クローンお選びいただければセット価格が適用になります）6 クローン以上ご購入いただく場合は5 クローンセット時の 1 クローン単価timesクローンの個数となります納期は 1 クローンご注文の場合と同様ですクローンセットでご購入の場合バリデート保証が適用されます（4ページ）

フォーマット 製品番号 5 クローンセット合計価格 1 クローン単価 納期

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen50000 yen10000 1 クローンと同様（上記表を参照）

精製プラスミドDNA SHCLND yen115000 yen23000 1 クローンと同様（上記表を参照）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen125005 yen25001 1 クローンと同様（上記表を参照）

オプション価格（ベクター変更タイター変更容量変更）カスタムベクターの詳細についてはカスタムクローニングサービス

のご紹介を参照ください（16 ページ） 1 クローンまたは 5 クローンセット価格に各オプション金額が加

算されますオプション選択時にも5 クローンセット割引価格は適用となります

（5 クローンセットでお求めの際は全てのクローンにおいて同一オプションとなります）

納期は1 オプションにつき通常納期に 2 週間ずつ加算されますオプションの種類 1 クローン購入時 5 クローンセットで購入時

（5 クローン合計） 納期

ベクター変更各種（プラスミドDNA）

+ yen70000 + yen190000 + 2 週間各種（レンチウイルスパーティクル）

タイター変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様1x106 TUmL

1x107 TUmL + yen97000 + yen485000 + 2 週間1x108 TUmL + yen155800 + yen779000 + 2 週間1x109 TUmL + yen305800 + yen1529000 + 2 週間

容量変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様02 mL

01 mL - yen15200 - yen76000 変更なし10 mL + yen15000 + yen75000 + 2 週間20 mL + yen23400 + yen117000 + 2 週間50 mL + yen32800 + yen164000 + 2 週間100 mL + yen43000 + yen215000 + 2 週間

107 TUmL 以上のタイターオプションとの併用時のみ選択可能です

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません 25 クローン以下の購入の場合 バイアル（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷 大腸菌フォーマットは 14 mL TrakMates チューブでの出荷 26 クローン以上の購入の場合 96-well Plate（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷Plate Map CD-ROM 付き

価格　－ 計算例 － セット価格で計算した場合

納品形態レンチウイルスパーティクル（製品番号SHCLNV）

①クローン数5 クローンセット yen125005

②オプションベクター変更（pLKO1-CMV-Neo） yen156000

仕様合計（①と②の合計） yen366000

MISSIONreg shRNA クローンご注文情報

shRNA

12

shRNAご注文方法シグマ アルドリッチウェブサイトの情報検索ウィンドウよりターゲット遺伝子に対する MISSIONregshRNA クローンの検索を行うことができます

① sigmacomjapan

③生物種とフォーマット選択

④クローンの選択

⑤専用注文用紙に記入sigmacomshrna-jp より専用発注書をダウンロードしAcrobat Reader などで開きクローン番号など必要な情報をご入力ください（追記型 PDFファイルのため直接タイプ ペーストしていただけます）

⑥代理店様に発注発注書に必要事項を入力後再度保存しメール添付ファイルの形で代理店様にご発注ください

②ターゲット遺伝子選択

遺伝子名やAccession No で検索

ターゲット遺伝子を探し青字の製品カテゴリーにある『shRNA』をクリック

生物種（ヒトマウス）および3 種類のフォーマット よりご希望の製品番号に該当するldquo価格rdquoボタンをクリック

各クローンの情報（ターゲット遺伝子情報バリデーションの有無配列TRC バージョン情報など）が表示されるのでこれらの情報より目的クローンを選択一部のオプションはプルダウンでご選択いただけますオプションには別途費用が発生いたしますご注意ください

カスタムサービスも承りますお見積もり依頼はコチラ

httpgooglta5NTa

shRNA

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コントロールshRNA各種コントロールをご利用いただけますフォーマット蛍光マーカープロモーターなどから細胞や実験に適した製品をご選択ください高タイターのコントロールをご希望の場合は別途ご相談ください

各コントロールを MOI = 5 にて導入した A549 細胞（上図は明視野下図は蛍光画像）

コントロール一覧 　

用途 製品名製品番号

希望販売価格TRC1 series TRC2 seriesPlasmid DNA Lentiviral Plasmid DNA Lentiviral

ネガティブコントロールpLKO1-puro Non-Target shRNA Control 1 SHC002 SHC002V SHC202 SHC202V yen59000

pLKO1-puro Non-Target shRNA Control 2 SHC016 SHC016V SHC216 SHC216V yen59000

蛍光タンパク質トランスダクションコントロール

（ポジティブコントロール）

pLKO1-puro CMV-TurboGFP SHC003 SHC003V SHC203 SHC203V

製品番号になしの製品

yen59000

ありの製品yen93000

pLKO1-puro CMV-TagCFPtrade SHC010 SHC010V - -

pLKO1-puro CMV-TagYFPtrade SHC011 SHC011V - -

pLKO1-puro CMV-TagRFPtrade SHC012 SHC012V - -

pLKO1-puro CMV-TagFP635trade SHC013 SHC013V - -

pLKO1-puro UbC-TurboGFP SHC014 SHC014V - -

pLKO1-puro UbC-TagFP635 SHC015 SHC015V - -

外来性遺伝子用shRNAコントロール

TurboGFP shRNA Control SHC004 SHC004V SHC204 SHC204V yen59000

eGFP shRNA Control SHC005 SHC005V - - yen59000

Luciferase shRNA Control SHC007 SHC007V - - yen59000

内在性遺伝子用shRNAコントロール

shRNA Human Positive Control 1（B2M） SHC008 SHC008V - - yen59000

shRNA Human Positive Control 2（ARHGDIA） SHC009 SHC009V - - yen59000

Emptyコントロールベクター pLKO1-puro Control SHC001 SHC001V SHC201 SHC201V yen59000仕様 plasmid DNA 5 μg DNA -20 stock 500 ng μL TE buffer

Lentiviral 4 x 50 μL -70 stock 106 TUmL (via p24 titering assay) ハイタイターコントロールのご用意もございます別途お問合せ下さい

Transduction Knockdown

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)TurboGFP(SHC003SHC003V)TagCFP(SHC010SHC010V)TagYFP(SHC011SHC011V)TagRFP(SHC012SHC012V)TagFP635(SHC013SHC013V)UbC-TurboGFP(SHC014SHC014V)UbC-TagFP635(SHC015SHC015V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)TurboGFP(SHC203SHC203V)

TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)shRNA Positive Control 1(HumanB2M) (SHC008SHC008V)shRNA Positive Control 2(HumanARHGDIA) (SHC009SHC009V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

Monitor

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)Non-Target shRNA 1(SHC002SHC002V)Non-Target shRNA 2(SHC016SHC016V)TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)Non-Target shRNA 1(SHC202SHC202V)Non-Target shRNA 2(SHC216SHC216V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

MISSION shRNA Controls

NegativePositive

UbC-TagFP635 trade UbC-TurboGFP trade CMV-TagFP635 trade CMV-TagYFP trade CMV-TagCFP trade

sigma-aldrichcomcontrols

MISSIONreg shRNA コントロール製品群

shRNA

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Packaging PlasmidsMISSIONreg Lentiviral Packaging Mix はMISSION TRC shRNA コレクションに最適化したパッケージング用プラスミドのプレミックス製品です本製品にはレンチウイルスの構造および複製に関与する遺伝子（gag および pol）を有するパッケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ドVSV-G エ ン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエンベロープベクターから成ります本製品は独自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用いただけますがシグマ アルドリッチでは時間を節約し品質を確保するために弊社がご提供するウイルスフォーマットのコレクションをご使用いただくことを強くお勧めいたします

製品名 カタログ番号 価格

MISSION lentiviral Packaging MixSHP001-025ML yen50000SHP001-17ML yen175000

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

Assembly ampBudding

Maturation

pMISSION GAG POL

12150 bp

ampR

Sv40

gag

CMV

pol

rev tat

insulin polyA

pMISSION VSV-G

5824 bp

CMV

VSV-G

Envelope VectorPackaging Vector

Lentiviral Packaging Mix

TransferVector

PackagingVector Envelope

Vector

組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

shRNAパッケージングプラスミドならびに関連製品

その他試薬

製品名 カタログ番号 価格 備考

Puromycin dihydrochloride P9620-10ML yen20900 調製済puromycin溶液

Hexadimethrine bromideH9268-5G yen8600

レンチウイルスの導入効率を向上H9268-10G yen12900H9268-50G yen49700

Protamine sulfateP3369-10G yen44400 レンチウイルスの導入効率を向上

Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効P3369-100G yen250000

Carbenicillin disodium saltC3416-250MG yen8700C3416-1G yen21800C3416-5G yen65800

Terrific Broth T5574-500ML yen11300 液体培地

Terrific Broth Modified EZMixtrade Powder T9179-6X500ML yen7900

顆粒T9179-2X5L yen18800

各種 MISSION 製品の添付資料はこちらからsigmacomshrnatechbull-jp

shRNA

15

マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

16

MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

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本製品はカルタヘナ法該当製品です数十万クローンから構成され数万遺伝子を標的とするライブラリーから製品仕様をご選択いただく必要がありお手数ではございますがご注文の仕様をご指定いただくための専用『ご注文用紙』（12ページ⑤）にご記入いただいております必要な情報をご記入後に弊社代理店へご注文用紙をお渡しください弊社ウェブサイトに掲載しておりますご注文用紙はPDF に直接ご入力いただけます製品を検索いただいたのち必要な情報をコピー amp ペーストにてご入力いただけますPDF は sigmacomshrna-jp　からご取得ください

個別クローン基本価格（1 クローンご注文の場合の単価）フォーマット 製品番号 価格 納期 基本仕様

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen25000 2-3週間 保管温度-70 内容物Terrific Broth carbenicillin 100 μgmL 15 glycerol

精製プラスミドDNA SHCLND yen60000 3-4週間 保管温度-20 容量40 μL 内容物1 μg プラスミドDNA（20 ngμL Tris-EDTA buffer）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen70000 4-6週間 保管温度-70 容量200 μL 内容物≧106 TUmL液体培地（DMEM 10 FBS penicillin-streptomycin）

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません

5 クローンセット割引価格（5 クローン以上ある製品に適用） ある遺伝子（RefSeq）に対する shRNA クローンを同一生物種同一フォーマットから 2 クローン以上お求めの場合は

お得な 5 クローンセットでお申し込み下さいターゲット遺伝子に対して 5 クローン以上製品が無い場合には別途お問合せ下さい　（その場合全クローンお選びいただければセット価格が適用になります）6 クローン以上ご購入いただく場合は5 クローンセット時の 1 クローン単価timesクローンの個数となります納期は 1 クローンご注文の場合と同様ですクローンセットでご購入の場合バリデート保証が適用されます（4ページ）

フォーマット 製品番号 5 クローンセット合計価格 1 クローン単価 納期

大腸菌グリセロールストック SHCLNG yen50000 yen10000 1 クローンと同様（上記表を参照）

精製プラスミドDNA SHCLND yen115000 yen23000 1 クローンと同様（上記表を参照）

レンチウイルスパーティクル SHCLNV yen125005 yen25001 1 クローンと同様（上記表を参照）

オプション価格（ベクター変更タイター変更容量変更）カスタムベクターの詳細についてはカスタムクローニングサービス

のご紹介を参照ください（16 ページ） 1 クローンまたは 5 クローンセット価格に各オプション金額が加

算されますオプション選択時にも5 クローンセット割引価格は適用となります

（5 クローンセットでお求めの際は全てのクローンにおいて同一オプションとなります）

納期は1 オプションにつき通常納期に 2 週間ずつ加算されますオプションの種類 1 クローン購入時 5 クローンセットで購入時

（5 クローン合計） 納期

ベクター変更各種（プラスミドDNA）

+ yen70000 + yen190000 + 2 週間各種（レンチウイルスパーティクル）

タイター変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様1x106 TUmL

1x107 TUmL + yen97000 + yen485000 + 2 週間1x108 TUmL + yen155800 + yen779000 + 2 週間1x109 TUmL + yen305800 + yen1529000 + 2 週間

容量変更（レンチウイルスパーティクルのみ）

基本仕様02 mL

01 mL - yen15200 - yen76000 変更なし10 mL + yen15000 + yen75000 + 2 週間20 mL + yen23400 + yen117000 + 2 週間50 mL + yen32800 + yen164000 + 2 週間100 mL + yen43000 + yen215000 + 2 週間

107 TUmL 以上のタイターオプションとの併用時のみ選択可能です

受注生産品のためご発注後の仕様変更キャンセルはできません 25 クローン以下の購入の場合 バイアル（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷 大腸菌フォーマットは 14 mL TrakMates チューブでの出荷 26 クローン以上の購入の場合 96-well Plate（一次元バーコードTRC 番号付き）出荷Plate Map CD-ROM 付き

価格　－ 計算例 － セット価格で計算した場合

納品形態レンチウイルスパーティクル（製品番号SHCLNV）

①クローン数5 クローンセット yen125005

②オプションベクター変更（pLKO1-CMV-Neo） yen156000

仕様合計（①と②の合計） yen366000

MISSIONreg shRNA クローンご注文情報

shRNA

12

shRNAご注文方法シグマ アルドリッチウェブサイトの情報検索ウィンドウよりターゲット遺伝子に対する MISSIONregshRNA クローンの検索を行うことができます

① sigmacomjapan

③生物種とフォーマット選択

④クローンの選択

⑤専用注文用紙に記入sigmacomshrna-jp より専用発注書をダウンロードしAcrobat Reader などで開きクローン番号など必要な情報をご入力ください（追記型 PDFファイルのため直接タイプ ペーストしていただけます）

⑥代理店様に発注発注書に必要事項を入力後再度保存しメール添付ファイルの形で代理店様にご発注ください

②ターゲット遺伝子選択

遺伝子名やAccession No で検索

ターゲット遺伝子を探し青字の製品カテゴリーにある『shRNA』をクリック

生物種（ヒトマウス）および3 種類のフォーマット よりご希望の製品番号に該当するldquo価格rdquoボタンをクリック

各クローンの情報（ターゲット遺伝子情報バリデーションの有無配列TRC バージョン情報など）が表示されるのでこれらの情報より目的クローンを選択一部のオプションはプルダウンでご選択いただけますオプションには別途費用が発生いたしますご注意ください

カスタムサービスも承りますお見積もり依頼はコチラ

httpgooglta5NTa

shRNA

13

コントロールshRNA各種コントロールをご利用いただけますフォーマット蛍光マーカープロモーターなどから細胞や実験に適した製品をご選択ください高タイターのコントロールをご希望の場合は別途ご相談ください

各コントロールを MOI = 5 にて導入した A549 細胞（上図は明視野下図は蛍光画像）

コントロール一覧 　

用途 製品名製品番号

希望販売価格TRC1 series TRC2 seriesPlasmid DNA Lentiviral Plasmid DNA Lentiviral

ネガティブコントロールpLKO1-puro Non-Target shRNA Control 1 SHC002 SHC002V SHC202 SHC202V yen59000

pLKO1-puro Non-Target shRNA Control 2 SHC016 SHC016V SHC216 SHC216V yen59000

蛍光タンパク質トランスダクションコントロール

（ポジティブコントロール）

pLKO1-puro CMV-TurboGFP SHC003 SHC003V SHC203 SHC203V

製品番号になしの製品

yen59000

ありの製品yen93000

pLKO1-puro CMV-TagCFPtrade SHC010 SHC010V - -

pLKO1-puro CMV-TagYFPtrade SHC011 SHC011V - -

pLKO1-puro CMV-TagRFPtrade SHC012 SHC012V - -

pLKO1-puro CMV-TagFP635trade SHC013 SHC013V - -

pLKO1-puro UbC-TurboGFP SHC014 SHC014V - -

pLKO1-puro UbC-TagFP635 SHC015 SHC015V - -

外来性遺伝子用shRNAコントロール

TurboGFP shRNA Control SHC004 SHC004V SHC204 SHC204V yen59000

eGFP shRNA Control SHC005 SHC005V - - yen59000

Luciferase shRNA Control SHC007 SHC007V - - yen59000

内在性遺伝子用shRNAコントロール

shRNA Human Positive Control 1（B2M） SHC008 SHC008V - - yen59000

shRNA Human Positive Control 2（ARHGDIA） SHC009 SHC009V - - yen59000

Emptyコントロールベクター pLKO1-puro Control SHC001 SHC001V SHC201 SHC201V yen59000仕様 plasmid DNA 5 μg DNA -20 stock 500 ng μL TE buffer

Lentiviral 4 x 50 μL -70 stock 106 TUmL (via p24 titering assay) ハイタイターコントロールのご用意もございます別途お問合せ下さい

Transduction Knockdown

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)TurboGFP(SHC003SHC003V)TagCFP(SHC010SHC010V)TagYFP(SHC011SHC011V)TagRFP(SHC012SHC012V)TagFP635(SHC013SHC013V)UbC-TurboGFP(SHC014SHC014V)UbC-TagFP635(SHC015SHC015V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)TurboGFP(SHC203SHC203V)

TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)shRNA Positive Control 1(HumanB2M) (SHC008SHC008V)shRNA Positive Control 2(HumanARHGDIA) (SHC009SHC009V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

Monitor

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)Non-Target shRNA 1(SHC002SHC002V)Non-Target shRNA 2(SHC016SHC016V)TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)Non-Target shRNA 1(SHC202SHC202V)Non-Target shRNA 2(SHC216SHC216V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

MISSION shRNA Controls

NegativePositive

UbC-TagFP635 trade UbC-TurboGFP trade CMV-TagFP635 trade CMV-TagYFP trade CMV-TagCFP trade

sigma-aldrichcomcontrols

MISSIONreg shRNA コントロール製品群

shRNA

14

Packaging PlasmidsMISSIONreg Lentiviral Packaging Mix はMISSION TRC shRNA コレクションに最適化したパッケージング用プラスミドのプレミックス製品です本製品にはレンチウイルスの構造および複製に関与する遺伝子（gag および pol）を有するパッケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ドVSV-G エ ン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエンベロープベクターから成ります本製品は独自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用いただけますがシグマ アルドリッチでは時間を節約し品質を確保するために弊社がご提供するウイルスフォーマットのコレクションをご使用いただくことを強くお勧めいたします

製品名 カタログ番号 価格

MISSION lentiviral Packaging MixSHP001-025ML yen50000SHP001-17ML yen175000

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

Assembly ampBudding

Maturation

pMISSION GAG POL

12150 bp

ampR

Sv40

gag

CMV

pol

rev tat

insulin polyA

pMISSION VSV-G

5824 bp

CMV

VSV-G

Envelope VectorPackaging Vector

Lentiviral Packaging Mix

TransferVector

PackagingVector Envelope

Vector

組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

shRNAパッケージングプラスミドならびに関連製品

その他試薬

製品名 カタログ番号 価格 備考

Puromycin dihydrochloride P9620-10ML yen20900 調製済puromycin溶液

Hexadimethrine bromideH9268-5G yen8600

レンチウイルスの導入効率を向上H9268-10G yen12900H9268-50G yen49700

Protamine sulfateP3369-10G yen44400 レンチウイルスの導入効率を向上

Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効P3369-100G yen250000

Carbenicillin disodium saltC3416-250MG yen8700C3416-1G yen21800C3416-5G yen65800

Terrific Broth T5574-500ML yen11300 液体培地

Terrific Broth Modified EZMixtrade Powder T9179-6X500ML yen7900

顆粒T9179-2X5L yen18800

各種 MISSION 製品の添付資料はこちらからsigmacomshrnatechbull-jp

shRNA

15

マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

16

MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

12

shRNAご注文方法シグマ アルドリッチウェブサイトの情報検索ウィンドウよりターゲット遺伝子に対する MISSIONregshRNA クローンの検索を行うことができます

① sigmacomjapan

③生物種とフォーマット選択

④クローンの選択

⑤専用注文用紙に記入sigmacomshrna-jp より専用発注書をダウンロードしAcrobat Reader などで開きクローン番号など必要な情報をご入力ください（追記型 PDFファイルのため直接タイプ ペーストしていただけます）

⑥代理店様に発注発注書に必要事項を入力後再度保存しメール添付ファイルの形で代理店様にご発注ください

②ターゲット遺伝子選択

遺伝子名やAccession No で検索

ターゲット遺伝子を探し青字の製品カテゴリーにある『shRNA』をクリック

生物種（ヒトマウス）および3 種類のフォーマット よりご希望の製品番号に該当するldquo価格rdquoボタンをクリック

各クローンの情報（ターゲット遺伝子情報バリデーションの有無配列TRC バージョン情報など）が表示されるのでこれらの情報より目的クローンを選択一部のオプションはプルダウンでご選択いただけますオプションには別途費用が発生いたしますご注意ください

カスタムサービスも承りますお見積もり依頼はコチラ

httpgooglta5NTa

shRNA

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コントロールshRNA各種コントロールをご利用いただけますフォーマット蛍光マーカープロモーターなどから細胞や実験に適した製品をご選択ください高タイターのコントロールをご希望の場合は別途ご相談ください

各コントロールを MOI = 5 にて導入した A549 細胞（上図は明視野下図は蛍光画像）

コントロール一覧 　

用途 製品名製品番号

希望販売価格TRC1 series TRC2 seriesPlasmid DNA Lentiviral Plasmid DNA Lentiviral

ネガティブコントロールpLKO1-puro Non-Target shRNA Control 1 SHC002 SHC002V SHC202 SHC202V yen59000

pLKO1-puro Non-Target shRNA Control 2 SHC016 SHC016V SHC216 SHC216V yen59000

蛍光タンパク質トランスダクションコントロール

（ポジティブコントロール）

pLKO1-puro CMV-TurboGFP SHC003 SHC003V SHC203 SHC203V

製品番号になしの製品

yen59000

ありの製品yen93000

pLKO1-puro CMV-TagCFPtrade SHC010 SHC010V - -

pLKO1-puro CMV-TagYFPtrade SHC011 SHC011V - -

pLKO1-puro CMV-TagRFPtrade SHC012 SHC012V - -

pLKO1-puro CMV-TagFP635trade SHC013 SHC013V - -

pLKO1-puro UbC-TurboGFP SHC014 SHC014V - -

pLKO1-puro UbC-TagFP635 SHC015 SHC015V - -

外来性遺伝子用shRNAコントロール

TurboGFP shRNA Control SHC004 SHC004V SHC204 SHC204V yen59000

eGFP shRNA Control SHC005 SHC005V - - yen59000

Luciferase shRNA Control SHC007 SHC007V - - yen59000

内在性遺伝子用shRNAコントロール

shRNA Human Positive Control 1（B2M） SHC008 SHC008V - - yen59000

shRNA Human Positive Control 2（ARHGDIA） SHC009 SHC009V - - yen59000

Emptyコントロールベクター pLKO1-puro Control SHC001 SHC001V SHC201 SHC201V yen59000仕様 plasmid DNA 5 μg DNA -20 stock 500 ng μL TE buffer

Lentiviral 4 x 50 μL -70 stock 106 TUmL (via p24 titering assay) ハイタイターコントロールのご用意もございます別途お問合せ下さい

Transduction Knockdown

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)TurboGFP(SHC003SHC003V)TagCFP(SHC010SHC010V)TagYFP(SHC011SHC011V)TagRFP(SHC012SHC012V)TagFP635(SHC013SHC013V)UbC-TurboGFP(SHC014SHC014V)UbC-TagFP635(SHC015SHC015V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)TurboGFP(SHC203SHC203V)

TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)shRNA Positive Control 1(HumanB2M) (SHC008SHC008V)shRNA Positive Control 2(HumanARHGDIA) (SHC009SHC009V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

Monitor

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)Non-Target shRNA 1(SHC002SHC002V)Non-Target shRNA 2(SHC016SHC016V)TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)Non-Target shRNA 1(SHC202SHC202V)Non-Target shRNA 2(SHC216SHC216V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

MISSION shRNA Controls

NegativePositive

UbC-TagFP635 trade UbC-TurboGFP trade CMV-TagFP635 trade CMV-TagYFP trade CMV-TagCFP trade

sigma-aldrichcomcontrols

MISSIONreg shRNA コントロール製品群

shRNA

14

Packaging PlasmidsMISSIONreg Lentiviral Packaging Mix はMISSION TRC shRNA コレクションに最適化したパッケージング用プラスミドのプレミックス製品です本製品にはレンチウイルスの構造および複製に関与する遺伝子（gag および pol）を有するパッケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ドVSV-G エ ン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエンベロープベクターから成ります本製品は独自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用いただけますがシグマ アルドリッチでは時間を節約し品質を確保するために弊社がご提供するウイルスフォーマットのコレクションをご使用いただくことを強くお勧めいたします

製品名 カタログ番号 価格

MISSION lentiviral Packaging MixSHP001-025ML yen50000SHP001-17ML yen175000

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

Assembly ampBudding

Maturation

pMISSION GAG POL

12150 bp

ampR

Sv40

gag

CMV

pol

rev tat

insulin polyA

pMISSION VSV-G

5824 bp

CMV

VSV-G

Envelope VectorPackaging Vector

Lentiviral Packaging Mix

TransferVector

PackagingVector Envelope

Vector

組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

shRNAパッケージングプラスミドならびに関連製品

その他試薬

製品名 カタログ番号 価格 備考

Puromycin dihydrochloride P9620-10ML yen20900 調製済puromycin溶液

Hexadimethrine bromideH9268-5G yen8600

レンチウイルスの導入効率を向上H9268-10G yen12900H9268-50G yen49700

Protamine sulfateP3369-10G yen44400 レンチウイルスの導入効率を向上

Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効P3369-100G yen250000

Carbenicillin disodium saltC3416-250MG yen8700C3416-1G yen21800C3416-5G yen65800

Terrific Broth T5574-500ML yen11300 液体培地

Terrific Broth Modified EZMixtrade Powder T9179-6X500ML yen7900

顆粒T9179-2X5L yen18800

各種 MISSION 製品の添付資料はこちらからsigmacomshrnatechbull-jp

shRNA

15

マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

16

MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

13

コントロールshRNA各種コントロールをご利用いただけますフォーマット蛍光マーカープロモーターなどから細胞や実験に適した製品をご選択ください高タイターのコントロールをご希望の場合は別途ご相談ください

各コントロールを MOI = 5 にて導入した A549 細胞（上図は明視野下図は蛍光画像）

コントロール一覧 　

用途 製品名製品番号

希望販売価格TRC1 series TRC2 seriesPlasmid DNA Lentiviral Plasmid DNA Lentiviral

ネガティブコントロールpLKO1-puro Non-Target shRNA Control 1 SHC002 SHC002V SHC202 SHC202V yen59000

pLKO1-puro Non-Target shRNA Control 2 SHC016 SHC016V SHC216 SHC216V yen59000

蛍光タンパク質トランスダクションコントロール

（ポジティブコントロール）

pLKO1-puro CMV-TurboGFP SHC003 SHC003V SHC203 SHC203V

製品番号になしの製品

yen59000

ありの製品yen93000

pLKO1-puro CMV-TagCFPtrade SHC010 SHC010V - -

pLKO1-puro CMV-TagYFPtrade SHC011 SHC011V - -

pLKO1-puro CMV-TagRFPtrade SHC012 SHC012V - -

pLKO1-puro CMV-TagFP635trade SHC013 SHC013V - -

pLKO1-puro UbC-TurboGFP SHC014 SHC014V - -

pLKO1-puro UbC-TagFP635 SHC015 SHC015V - -

外来性遺伝子用shRNAコントロール

TurboGFP shRNA Control SHC004 SHC004V SHC204 SHC204V yen59000

eGFP shRNA Control SHC005 SHC005V - - yen59000

Luciferase shRNA Control SHC007 SHC007V - - yen59000

内在性遺伝子用shRNAコントロール

shRNA Human Positive Control 1（B2M） SHC008 SHC008V - - yen59000

shRNA Human Positive Control 2（ARHGDIA） SHC009 SHC009V - - yen59000

Emptyコントロールベクター pLKO1-puro Control SHC001 SHC001V SHC201 SHC201V yen59000仕様 plasmid DNA 5 μg DNA -20 stock 500 ng μL TE buffer

Lentiviral 4 x 50 μL -70 stock 106 TUmL (via p24 titering assay) ハイタイターコントロールのご用意もございます別途お問合せ下さい

Transduction Knockdown

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)TurboGFP(SHC003SHC003V)TagCFP(SHC010SHC010V)TagYFP(SHC011SHC011V)TagRFP(SHC012SHC012V)TagFP635(SHC013SHC013V)UbC-TurboGFP(SHC014SHC014V)UbC-TagFP635(SHC015SHC015V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)TurboGFP(SHC203SHC203V)

TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)shRNA Positive Control 1(HumanB2M) (SHC008SHC008V)shRNA Positive Control 2(HumanARHGDIA) (SHC009SHC009V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

Monitor

pLKO1-puro(SHC001SHC001V)Non-Target shRNA 1(SHC002SHC002V)Non-Target shRNA 2(SHC016SHC016V)TurboGFP shRNA(SHC004SHC004V)eGFP shRNA(SHC005SHC005V)Luciferase shRNA(SHC007SHC007V)TRC2-pLKO-puro(SHC201SHC201V)Non-Target shRNA 1(SHC202SHC202V)Non-Target shRNA 2(SHC216SHC216V)TurboGFP shRNA(SHC204SHC204V)

MISSION shRNA Controls

NegativePositive

UbC-TagFP635 trade UbC-TurboGFP trade CMV-TagFP635 trade CMV-TagYFP trade CMV-TagCFP trade

sigma-aldrichcomcontrols

MISSIONreg shRNA コントロール製品群

shRNA

14

Packaging PlasmidsMISSIONreg Lentiviral Packaging Mix はMISSION TRC shRNA コレクションに最適化したパッケージング用プラスミドのプレミックス製品です本製品にはレンチウイルスの構造および複製に関与する遺伝子（gag および pol）を有するパッケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ドVSV-G エ ン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエンベロープベクターから成ります本製品は独自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用いただけますがシグマ アルドリッチでは時間を節約し品質を確保するために弊社がご提供するウイルスフォーマットのコレクションをご使用いただくことを強くお勧めいたします

製品名 カタログ番号 価格

MISSION lentiviral Packaging MixSHP001-025ML yen50000SHP001-17ML yen175000

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

Assembly ampBudding

Maturation

pMISSION GAG POL

12150 bp

ampR

Sv40

gag

CMV

pol

rev tat

insulin polyA

pMISSION VSV-G

5824 bp

CMV

VSV-G

Envelope VectorPackaging Vector

Lentiviral Packaging Mix

TransferVector

PackagingVector Envelope

Vector

組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

shRNAパッケージングプラスミドならびに関連製品

その他試薬

製品名 カタログ番号 価格 備考

Puromycin dihydrochloride P9620-10ML yen20900 調製済puromycin溶液

Hexadimethrine bromideH9268-5G yen8600

レンチウイルスの導入効率を向上H9268-10G yen12900H9268-50G yen49700

Protamine sulfateP3369-10G yen44400 レンチウイルスの導入効率を向上

Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効P3369-100G yen250000

Carbenicillin disodium saltC3416-250MG yen8700C3416-1G yen21800C3416-5G yen65800

Terrific Broth T5574-500ML yen11300 液体培地

Terrific Broth Modified EZMixtrade Powder T9179-6X500ML yen7900

顆粒T9179-2X5L yen18800

各種 MISSION 製品の添付資料はこちらからsigmacomshrnatechbull-jp

shRNA

15

マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

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MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

14

Packaging PlasmidsMISSIONreg Lentiviral Packaging Mix はMISSION TRC shRNA コレクションに最適化したパッケージング用プラスミドのプレミックス製品です本製品にはレンチウイルスの構造および複製に関与する遺伝子（gag および pol）を有するパッケ ー ジ ン グ プ ラ ス ミ ドVSV-G エ ン ベロープ遺伝子（広範な親和性）を有するエンベロープベクターから成ります本製品は独自のウイルス粒子を作製したい方にもご利用いただけますがシグマ アルドリッチでは時間を節約し品質を確保するために弊社がご提供するウイルスフォーマットのコレクションをご使用いただくことを強くお勧めいたします

製品名 カタログ番号 価格

MISSION lentiviral Packaging MixSHP001-025ML yen50000SHP001-17ML yen175000

Synthesis of Viral Proteins

Recombinant RNATranscript Export

MISSIONTransfer Vector

RecombinantLentiviral Particles

Co-Transfection ofHEK 293T Cells

Transcription

Assembly ampBudding

Maturation

pMISSION GAG POL

12150 bp

ampR

Sv40

gag

CMV

pol

rev tat

insulin polyA

pMISSION VSV-G

5824 bp

CMV

VSV-G

Envelope VectorPackaging Vector

Lentiviral Packaging Mix

TransferVector

PackagingVector Envelope

Vector

組み換えレンチウイルスのパッケージング過程

shRNAパッケージングプラスミドならびに関連製品

その他試薬

製品名 カタログ番号 価格 備考

Puromycin dihydrochloride P9620-10ML yen20900 調製済puromycin溶液

Hexadimethrine bromideH9268-5G yen8600

レンチウイルスの導入効率を向上H9268-10G yen12900H9268-50G yen49700

Protamine sulfateP3369-10G yen44400 レンチウイルスの導入効率を向上

Hexadimethrineで細胞毒性を示す細胞に有効P3369-100G yen250000

Carbenicillin disodium saltC3416-250MG yen8700C3416-1G yen21800C3416-5G yen65800

Terrific Broth T5574-500ML yen11300 液体培地

Terrific Broth Modified EZMixtrade Powder T9179-6X500ML yen7900

顆粒T9179-2X5L yen18800

各種 MISSION 製品の添付資料はこちらからsigmacomshrnatechbull-jp

shRNA

15

マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

16

MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

15

マグネットビーズを利用した ExpressMag はレンチウイルスによる形質導入が難しい細胞でもトランスフェクション効率を向上させることが可能です

特長 最大で 10 倍以上のトランスフェクション効率の向上が可能

トランスフェクションプロセスをたった 15 分に短縮可能（通常約 1 日かかります） 浮遊系細胞や初代培養細胞などに対する革新的な トランスフェクション方法 MISSIONreg shRNA lentiviral particles によって確認試験済み

キ ット に は ExpressMag Bead バ イ ア ル が 含 ま れ て おりこのビーズがレンチウイルスパーティクルと結 合しExpressMag 磁性プレートによりプレート側に引き寄せられます更に細胞表面にウイルスを誘引することによってトランスフェクション効率が飛躍的に向上します標準サイズのウェルプレートT-25 ～ T-75 の組織培養フラスコや5 cm 以下のシャーレと組み合わせてご使用いただけます ExpressMag によりMISSION レンチウイルスによる 293T浮遊細胞のトランスフェクションが向上することが実証されておりMOI が 1 程度のケラチノサイトなどのヒト初代培養細胞のトランスフェクションも可能です

HEK 293T浮遊細胞 における効果

A 臭化ヘキサジメトリンによる標準的トランスフェクション

B ExpressMagを使用した トランスフェクション

ExpressMag を使用しMISSION TurboGFPtrade Control Particles （SHC003V）を感染させたMOI=149 時間インキュベート

MISSION ExpressMag製品名 製品番号 Size 価格

Super Magnetic Kit SHM01 1 KT yen12680096-well Magnetic Kit SHM02 1 KT yen149000Beads SHM03 100 μL yen34100

300 μL yen896001 mL yen219000

Super Magnetic Plate SHM04 1 EA yen14100096-well Magnetic Plate SHM05 1 EA yen129800

概算使用回数100 μL 63回（96-well） 15回（24-well） 1回（T-25） 300 μL 190回（96-well） 47回（24-well） 4回（T-25） 1 mL 633回（96-well） 158回（24-well） 15回（T-25）

ExpressMagシステムWorkflow

Entry

Transduction

ExpressMagNanoparticles

ExpressMagNanoparticleComplexes

Apply toTargetCells

96-well CellCulture Dish

96-well Magnetic PlateSuper Magnetic Plate

Wide Variety ofCell Culture Dishes

MISSIONLentiviral Particles

ExpressMagによりトランスフェクションの成功が確認されている初代培養細胞リスト

Primary Cell Type SpeciesAirway epithelium Human PorcineAortic endothelial cells Human BovineCarotid artery smooth muscle BovineChondrocytes PorcineChromaffin BovineCytotrophoblastic Human MouseEmbryonic fibroblast MouseEpicardial mesothelial RatFibroblast HumanFibrochondrocyte PorcineGastric gland HumanGlial Human Mouse RatHippocampal neurons Mouse RatHuman umbilical vein endothelial cells Human

Human mammalian epithelial cells HumanKeratinocyte Human MouseMegakaryocyte progenitor MouseNasal airway epithelium HumanNeurons Mouse RatPeripheral blood lymphocytes Human MousePeripheral blood mononuclear cells MacaquesRat hepatocytes Wistar RatSmooth muscle PorcineT lymphocytes （CD4+） MacaquesT lymphocytes （CD8+） MouseTrophoblastic Human

sigma-aldrichcomexpressmag

レンチウイルス感染効率改善磁気ビーズExpressMagregExpressMag Lentiviral Delivery

shRNA

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MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

16

MISSIONreg shRNA のサービスをお客様のニーズに合わせてカスタマイズすることが可能ですCMVネオマイシン耐性IPTG による発現誘導蛍光タンパク導入済みのベクターなどのオプションをご用意しております下表下図にはMISSION shRNA のカスタマイズベクターの一部を示していますこれ以外にもお客様ご要望の配列を組み込むカスタムサービス等もございますご要望がございましたらお気軽にお申しつけください

MISSION shRNA ベクターコレクション

pLKO1-puro7032 bp

hPGK

puroR

U6

(Ψ) PsipLKO1-CMV-tGFP

7435 bp

CMV

TurboGFPTM

U6

(Ψ) Psi

shRNA

( ) Psi

pLKO1-puro-CMV-tGFP

8371 bp

TurboGFPpuroR

hPGK

CMV

U6

shRNA

hPGK

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo

7178 bp

shRNA CMV

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-CMV-Neo

7241 bp

shRNA

neoR

U6

(Ψ) Psi

pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP

8497 bp

shRNA

TurboGFP hPGK

CMV

cPPT

pLKO_IPTG_1xLacO8684 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 1xLacO

RREGSG-F2A

LacO 　　　　　　　 cPPT

pLKO_IPTG_3xLacO8726 bp

hPGK promoter

puroR

AMP resistance

RSV

WPREPUC Origin

5rsquoLTR

HIV sin 3rsquo LTR

F1 ORI

Lacl

hU6 2xLacO

RREGSG-F2A

LacO

1xLacO

LacO

Vector Backbone Expression Selection MethodConstitutive Inducible Puromycin Neomycin （G418） Fluorescence

pLKO1-puro TRC2-pLKO-puro pLKO1-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-tGFP pLKO1-CMV-Neo pLKO1-hPGK-Neo pLKO1-hPGK-Neo-CMV-tGFP pLKO1-puro-CMV-TagCFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagYFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagRFPtrade pLKO1-puro-CMV-TagFP635trade pLKO1-puro-UbC-TurboGFP pLKO1-puro-UbC-TagFP635 pLKO-puro-IPTG-1xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO

カスタムshRNA用ベクター

sigmacomcustomcloning

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

ress

ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

こちらはカスタムサービスになります詳細はお問い合わせ下さい

Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

17

IPTG 発現誘導用 shRNAベクターshRNA が一定のレベルで安定的に発現されることは RNAi 実験において非常に重要ですしかしさらなる機能解析を行う場合遺伝子の発現をコントロールすることが重要な要素の１つです発現のコントロールは特に致死性や重要な遺伝子の研究に不可欠です新しい pLKO IPTG 誘導ベクターは LacI（リプレッサー）及び改変ヒト U6 プロモーターとLacO（オペレーター）が導入されていますIPTG 非存在下ではLacI リプレッサーが LacOオペレーターに結合しshRNA の発現を抑制しますIPTG を添加するとアロステリックな LacI は構造が変化することで解離しU6 プロモーターによって shRNA が発現されるようになります

特長 IPTG によって shRNA 発現の ONOFF を調節可能 単一ベクターシステムで shRNA を効率的に発現調節

3xLacO1xLacO0

20

40

60

80

100

with IPTG

wo Repressor

wo IPTG

U6 promoters variants

rem

aini

ng G

FP m

edia

n FL

[]

shRNA発現誘導効率の比較GFP 発現 Jurkat 細胞へGFP 特異的な shRNA を組み込んだベクターを導入したコントロールとしてリプレッサーを除去したプラスミドも導入した全ての細胞は 1 mM IPTG で処理した導入後 5 日目に GFP の発現量を測定しempty ベクターコントロールのデータを用いて標準化した

IPTG inducible shRNA コントロール

用途 製品名製品番号

プラスミドＤＮＡ レンチウイルス

ネガティブコントロール

MISSIONreg 1x LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC312 SHC312V

MISSION 3X LacO Inducible Non-Target shRNA Control SHC332 SHC332V

tGFP shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible TurboGFPtrade shRNA Control SHC314 SHC314V

MISSION 3x LacO Inducible TurboGFP shRNA Control SHC334 SHC334V

Luciferase shRNA コントロール

MISSION 1x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC317 SHC317V

MISSION 3x LacO Inducible Luciferase shRNA Control SHC337 SHC337V

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Expected Knockdown of Target Gene

Gene Silencing Potency

Vect

or

Leakiness

0 20 40 60 80 100

Constitutive

3x LacO

1x LacO

Express ion without IPTG induction

Vect

or

カスタマイズ可能ですご要望に応じてカスタムクローニングサービスをご提供いたします

ベクター 1x LacO または 3x LacO フォーマット プラスミド DNA または ウイルス粒子 タイター 1x106 ～ 1x109 TUmL 容量 200 μL ～ 10 mL shRNA 配列 MISSION shRNA 配列 または カスタム配列

sigmacominducible

hU6 hPGK Puro 2A LacI

IPTG

shRNALacO

hU6 hPGK Puro 2A LacIshRNALacO

Switch OFF

Switch ON

shRNA

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レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

80

100

E

xpre

ssio

n

Exp

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ion

0

20

40

60

80

100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

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Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

18

レンチウイルスによるランダムインテグレーションはターゲットではない他の遺伝子や配列が改変されることで表現型にも影響を与える可能性があることが知られていますMISSIONreg Targeted Integration shRNA Kit は CompoZrreg Zinc Finger Nuclease テクノロジーを用いることでshRNA を safe harbor であることが知られているヒト AAVS1 領域に挿入されるよう設計されておりランダムインテグレーションのリスクを軽減することが可能です

特長 shRNA の挿入箇所が一定（ヒト AAVS1 領域）のため実験間クローン間でのばらつきが減少

ランダムインテグレーションが抑制されターゲット遺伝子のみを詳細に観察可能

Zinc Finger Nuclease を用いることで shRNA を効率的に AAVS1 領域へ挿入可能

実験ワークフローSA-2A-Puro-PolyA

AAVS1 LeftHomology Arm

AAVS1 RightHomology Arm

Sigma MISSION Operations Subclonesa user-specied shRNA coding sequenceinto MCS of pZDonor-AAVS1 Puromycin

mRNA EncodingZFN Targeting AAVS1

Co-Transfect Donor Plasmid and ZFN mRNA into Cell Type of Interest

ZFN Cuts AAVS1 Site in Genome of Cell Type of Interest(Human chr1960318931-60318961)

shRNApZDonor-AAVS1

Puromycin

shRNApZDonor

Plasmid DNA

shRNApZDonor

Plasmid DNA

Targeted Integration of shRNA

Puromycin Selection to Identify Targeted Clones

ZFN Cutting Stimulates HomologyDirected Repair to Integrate

Donor Plasmid-DNA

U6

A)

B)

C)

D)

E)

F)

MCS

Targeted shRNA integration in K562 cells

0

20

40

60

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100

E

xpre

ssio

n

Exp

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ion

0

20

40

60

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100

Ctrl BRCA-1 Ctrl ULK-1 Ctrl TXN

任意の shRNA をクローニングしたプラスミド DNA 及び shRNA 配列をゲノム DNA に組み込むために必要な AAVS1 領域を切断するための ZFN-mRNA を K562 細胞へ導入したターゲット遺伝子のノックダウン効率は qRT-PCR 法を用いて測定しnon-targeting shRNA のデータをもとに標準化した

参考文献1 DeKelver R C et al (2010) Functional genomics proteomics

and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome Genome Res 20(8) 1133-1142 (PMID 20508142)

2 Lombardo A et al (2011) Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer Nat Methods 8(10) 861-869 (PMID 21857672)

ご注文情報製品番号 製品名CSTPZD MISSION Targeted Integration shRNA Kit

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Kit ComponentsKit Reagents SuppliedZFN mRNA ndash AAVS1 3 x ~06 μgμLAAVS1 Forward Primer 1 x 25 μMPuro Reverse Primer 1 x 25 μMIntegration Control ndash AAVS1 1 x ~35 ngμLpZDonor ndash AAVS1-shRNA 1 x ~250 μgμL

ゲノムの特定領域上へのshRNA導入Targeted Integration shRNA Kit

shRNA

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MISSION shRNA ライブラリーはシグマ アルドリッチが独占的販売権を有しており80000 以上の検証済み shRNA クローンを含む約 250000 の shRNA クローンを保有しています（下表）MISSION shRNA ライブラリー には信頼性の高い TRC1 Library だけでなく新たに約 88000 クローンが加えられていますこの中には 5000 以上のヒト遺伝子4000 以上のマウス遺伝子が新たなターゲットとして含まれています

MISSION shRNALibrary TRC1 Library

Gene Total Validated Total Validated

Human Genes 20018 8897 16019 7405

Mouse Genes 21171 8345 15960 6506

Total Genes 41189 17242 31979 13911

Clone Total Validated Total Validated

Human Clones 129695 43470 82017 24550

Mouse Clones 118062 36654 77819 20564

Total Clones 247757 80124 159836 45114

高効率全ゲノムスクリーニングに最適なMISSIONreg shRNAライブラリー概要

MISSION shRNA ライブラリークローンの遺伝子カバー率

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17+

MISSION Human shRNA Library Coverage

Num

ber o

f Gen

es

Number of Clones Per Gene

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16+

MISSION Mouse shRNA Library Coverage

Number of Clones Per Gene

Num

ber o

f Gen

es

sigmacomshrnalibrary

shRNA

20

シグマ アルドリッチでは TRC コレクションの網羅性を活用し様々な RNAi スクリーニング用ライブラリーをご用意しています全ゲノムスクリーニング可能なプール型shRNA ライブラリー遺伝子機能別ライブラリーのほかカスタムライブラリーの作製も可能ですあらゆる研究の目的に適したフォーマットをご提供いたします

Choose the Screen that Fits Your Research

製品名 製品番号 Content Format Screen DurationKnockdown Analysis Workload

Arrayed ndash Single shRNA per wellPooled ndash Multiple shRNAs per well

+++ = Longer ++ = Moderate + = Quick

+++ = Advanced ++ = Intermediate + = Novice

LentiPlex SHPH01SHPM01

whole genomehuman or mouse

Pooled + +++

LentiExpress SHX001 kinome human Arrayed + +Pre-designed Panels SHxxxx

（xxxxは数字）focused gene collectionshuman or mouse

Arrayed ++ +

Custom-designedPanels and Pools

Custom your gene list any species Arrayed or pooled + to +++ + to +++

shRNA の同定にはFACS や次世代シークエンサーが必要になる場合があります

MISSION shRNA ライブラリーによるハイスループットスクリーニング

MISSION shRNA ライブラリーは新たなパスウェイの解明や新たなマーカー遺伝子の発見をもたらすためのスクリーニングツールですこれらのライブラリー製品を使って細胞の生存増殖遊走有糸分裂停止酵素反応などに関する多様なスクリーニングアッセイを行なうことができます

Paclitaxel 感受性に関する腫瘍抑制遺伝子ノックダウン細胞のスクリーニングMISSION TRC Human Tumor Suppressor Family Set（製品番号 SH0531）を使用し抗がん剤の一種 Paclitaxel に対する細胞の感受性を増大させる遺伝子をスクリーニングしたレンチウイルス粒子を使用して 96 ウェルプレート内で細胞に導入し対応する腫瘍抑制遺伝子の発現をノックダウンした細胞を 2 つに分け一方のサンプルセットは Paclitaxel でもう一方のサンプルは培地のみで処理た結果を pLKO1-puro Control Transduction Particle（製品番号 SHC001V）により標準化した統計的に有意差のある遺伝子ヒットの存在はそれらのノックダウンが Paclitaxel 処理に対する感受性増大に関与していることを示している赤色のデータポイントはPaclitaxel に対する感受性増大のポジティブコントロールである

Percent Cell Growth Relative to pLKO Control with No Drug Treatment

Decreased Sensitivity

Enhanced Sensitivity

01

1

10

100

1000

01 1 10 100 1000

Percent Cell Growth Relative to Control

C

ell G

row

th R

elat

ive

to p

LKO

Co

ntro

l with

Pac

litax

el T

reat

men

tMISSIONreg shRNAライブラリーによる全ゲノムスクリーニング

shRNA

21

仕様 大腸菌グリセロールストック50 μL aliquot of bacterial glycerol stocks （terrific broth carbenicillin at 100 microgmL and 15 glycerol） QC No Sequencing Visual Inspection for Growth

精製プラスミド DNA An average of 2 microg per clone （range of 400 ng ndash 4 microg） is provided and is aliquoted at 40 μL per well QC Sequencing Verification DNA Quantitation

レンチウイルスパーティクル （representational plate titer） 4 x 50 μL aliquots of VSV-G pseudotyped lentivirus 10 representational plate titer QC Sequencing Verification p24 ELISA Titer

レンチウイルスパーティクル （full individual well titer） 4 x 50 μL aliquots of VSV-G pseudotyped lentivirus fully titered to individual wells QC Sequencing Verification p24 ELISA Titer カスタム品となります詳細はお問合せ下さい

表中のクローン数ターゲット数が実際の納品物と異なる場合がございます価格については都度お見積りとなります詳細はお問合せ下さい

MISSION shRNA Gene Family Sets は特異的な細胞間 分子間相互作用の情報を NCBIGene Ontology Protein LoungeIngenuity Systems より抽出した遺伝子セットとなりますコレクションは TRC115 のクローンで構成されています3 種類のフォーマット（大腸菌グリセロール精製プラスミド DNAレンチウイルスパーティクル）で提供可能です

MISSION shRNA Gene Family Sets

生物種 Gene Family Set製品番号 製品情報

Glycerol Plasmid DNA

Lentivirus Rep Titer

Lentivirus Full Titer Gene Count Clone

CountAvg Number CloneGene

Human

Apoptosis Pathway SH1911 SH1921 SH1931

お問い合わせ ください

443 3512 79B-Cell Activation SH2911 SH2921 SH2931 99 661 67Cell Adhesion Genes SH2211 SH2221 SH2231 368 2396 65Cytokine and Chemokine SH0811 SH0821 SH0831 106 538 51Cytokine and Chemokine Receptors SH1311 SH1321 SH1331 93 584 63Cytoskeleton Genes SH2311 SH2321 SH2331 275 1991 72Epigenetic Regulators SH3011 SH3021 SH3031 10 59 59DNA Repair Pathway SH1811 SH1821 SH1831 117 837 72Ubiquitin Hydrolases (DUBS) SH0711 SH0721 SH0731 127 830 65Extracellular Matrix Genes SH2511 SH2521 SH2531 331 1968 59G-Protein Coupled Receptors (GPCRs) SH0211 SH0221 SH0231 541 2864 53Helicase SH2611 SH2621 SH2631 136 909 67Ion Channel SH1011 SH1021 SH1031 279 1456 52JAK-STAT Pathway SH2711 SH2721 SH2731 190 1358 71Kinases complete SH0111 SH0121 SH0131 672 7742 112Nuclear Hormone Receptors SH1111 SH1121 SH1131 218 1448 66p53 Pathway SH2411 SH2421 SH2431 242 1865 77Phosphatases SH0411 SH0421 SH0431 316 2065 65T-Cell Activation SH2811 SH2821 SH2831 242 1469 61Tumor Supressors SH0511 SH0521 SH0531 73 575 79Tyrosine Kinases お問い合わせください 133 1728 130Ubiquitin Ligases (E1 E2 E3) SH2111 SH2121 SH2131 349 2151 62

MouseKinases complete SM0111 SM0121 SM0131 618 3916 63Phosphatase SM0411 SM0421 SM0431 290 1734 60Tyrosine Kinase SM2011 SM2021 SM2031 133 850 64カスタムライブラリー お問い合わせください

価格についてはお問い合わせください

sigmacomshrnascreen

遺伝子機能別shRNA ライブラリーMISSIONreg shRNA Gene Family Sets

shRNA

22

Highly Validated Gene and Clone ContentsTotal Validated

Human Clones 129000+ 43000+

Mouse Clones 118000+ 36000+

Total Clones 247000+ 80000+

Human Genes 20000+ 8000+

Mouse Genes 21000+ 8000+

Total Genes 41000+ 16000+

ヒト遺伝子 MISSION LentiPlex Pooled shRNA ライブラリー

総クローン数 総遺伝子数 サブプール数 クローン数サブプール 製品名 カタログ番号 通常価格

80000+ 16000+ 10 8000 LentiPlex 10 SHPH01-1SET yen150000025000+ 6000+ 3 8000 LentiPlex 15 SHPH15-1SET yen96000020000+ 5000+ 3 6000 LentiPlex 20 SHPH2-1SET yen800000

125000+ 20000+ 16 6000 or 8000 LentiPlex Complete （10 + 15 + 20） SHPHLIBR-1SET yen2300000

マウス遺伝子 MISSION LentiPlex Pooled shRNA ライブラリー

総クローン数 総遺伝子数 サブプール数 クローン数サブプール 製品名 カタログ番号 通常価格

75000+ 15000+ 10 8000 LentiPlex 10 SHPM01-1SET yen140000010000+ 4000+ 2 5500 LentiPlex 15 SHPM15-1SET yen44750025000+ 7000+ 3 8000 LentiPlex 20 SHPM2-1SET yen800000

110000+ 21000+ 15 5500 or 8000 LentiPlex Complete (10 + 15 + 20) SHPMLIBR-1SET yen2000000

MISSION LentiPlex Pooled System Work Flow 細胞をコロニークローニングか FACS で単離し PCR 後シーケンサーで配列を同定あらかじめ決定しておいた MOI でウイルスサブプールをそれぞれ感染させた後薬剤選択を行うその後FACS 等を用い目的の表現型を示した細胞群を分取するゲノムに組み込まれた shRNA は PCR の後にシーケンサーを用いて確認する各々の shRNA がターゲットとする遺伝子を同定後それらの生物学的役割を検証する

参考文献1 Karlsson C et al (2010) Forward RNAi screens in human stem cells Methods Mol Biol 650 29-43 (PMID 20686941)2 Possemato R et al (2011) Functional genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer Nature 476(7360)

346-350 (PMID 21760589)

MISSIONreg LentiPlex Pooled Library は信頼性の高い TRC shRNA ライブラリーを用いてベンチトップ上でゲノムワイドな RNAi スクリーニングを可能にするスクリーニングツールです使いやすいフォーマットになっておりスクリーニング用の大型機器等は必要なく試薬の使用量も最小限に抑えることが可能です

sigmacomlentiplex

プール型 全ゲノム shRNA ライブラリーLentiPlexreg Pooled Whole Genome Library

Human および Mouse それぞれ 100000 クローンを大きく超える膨大なライブラリー 擬陽性発生頻度低減のため5500 ～ 8000 クローンのサブプールに分割済み ウイルスタイターはp24 アッセイにおいて 5ｘ108 TUmL 以上 ロボットや分注機が不要で全てベンチトップで実験可能 FACS 等多くの蛍光を用いたアッセイに適応

サブプールに分かれたLentiPlexPooledLibrary

ウイルスを予め決められたMOIで細胞集団に感染させる

インキュベーション2-4日ピューロマイシンで選択表現系により目的の細胞を選択

シークエンスした配列とデータベースを照会し目的の shRNAを同定

細胞からゲノムDNAを抽出し増幅プライマーでPCRをかける

shRNA

20

シグマ アルドリッチでは TRC コレクションの網羅性を活用し様々な RNAi スクリーニング用ライブラリーをご用意しています全ゲノムスクリーニング可能なプール型shRNA ライブラリー遺伝子機能別ライブラリーのほかカスタムライブラリーの作製も可能ですあらゆる研究の目的に適したフォーマットをご提供いたします

Choose the Screen that Fits Your Research

製品名 製品番号 Content Format Screen DurationKnockdown Analysis Workload

Arrayed ndash Single shRNA per wellPooled ndash Multiple shRNAs per well

+++ = Longer ++ = Moderate + = Quick

+++ = Advanced ++ = Intermediate + = Novice

LentiPlex SHPH01SHPM01

whole genomehuman or mouse

Pooled + +++

LentiExpress SHX001 kinome human Arrayed + +Pre-designed Panels SHxxxx

（xxxxは数字）focused gene collectionshuman or mouse

Arrayed ++ +

Custom-designedPanels and Pools

Custom your gene list any species Arrayed or pooled + to +++ + to +++

shRNA の同定にはFACS や次世代シークエンサーが必要になる場合があります

MISSION shRNA ライブラリーによるハイスループットスクリーニング

MISSION shRNA ライブラリーは新たなパスウェイの解明や新たなマーカー遺伝子の発見をもたらすためのスクリーニングツールですこれらのライブラリー製品を使って細胞の生存増殖遊走有糸分裂停止酵素反応などに関する多様なスクリーニングアッセイを行なうことができます

Paclitaxel 感受性に関する腫瘍抑制遺伝子ノックダウン細胞のスクリーニングMISSION TRC Human Tumor Suppressor Family Set（製品番号 SH0531）を使用し抗がん剤の一種 Paclitaxel に対する細胞の感受性を増大させる遺伝子をスクリーニングしたレンチウイルス粒子を使用して 96 ウェルプレート内で細胞に導入し対応する腫瘍抑制遺伝子の発現をノックダウンした細胞を 2 つに分け一方のサンプルセットは Paclitaxel でもう一方のサンプルは培地のみで処理た結果を pLKO1-puro Control Transduction Particle（製品番号 SHC001V）により標準化した統計的に有意差のある遺伝子ヒットの存在はそれらのノックダウンが Paclitaxel 処理に対する感受性増大に関与していることを示している赤色のデータポイントはPaclitaxel に対する感受性増大のポジティブコントロールである

Percent Cell Growth Relative to pLKO Control with No Drug Treatment

Decreased Sensitivity

Enhanced Sensitivity

01

1

10

100

1000

01 1 10 100 1000

Percent Cell Growth Relative to Control

C

ell G

row

th R

elat

ive

to p

LKO

Co

ntro

l with

Pac

litax

el T

reat

men

tMISSIONreg shRNAライブラリーによる全ゲノムスクリーニング

shRNA

21

仕様 大腸菌グリセロールストック50 μL aliquot of bacterial glycerol stocks （terrific broth carbenicillin at 100 microgmL and 15 glycerol） QC No Sequencing Visual Inspection for Growth

精製プラスミド DNA An average of 2 microg per clone （range of 400 ng ndash 4 microg） is provided and is aliquoted at 40 μL per well QC Sequencing Verification DNA Quantitation

レンチウイルスパーティクル （representational plate titer） 4 x 50 μL aliquots of VSV-G pseudotyped lentivirus 10 representational plate titer QC Sequencing Verification p24 ELISA Titer

レンチウイルスパーティクル （full individual well titer） 4 x 50 μL aliquots of VSV-G pseudotyped lentivirus fully titered to individual wells QC Sequencing Verification p24 ELISA Titer カスタム品となります詳細はお問合せ下さい

表中のクローン数ターゲット数が実際の納品物と異なる場合がございます価格については都度お見積りとなります詳細はお問合せ下さい

MISSION shRNA Gene Family Sets は特異的な細胞間 分子間相互作用の情報を NCBIGene Ontology Protein LoungeIngenuity Systems より抽出した遺伝子セットとなりますコレクションは TRC115 のクローンで構成されています3 種類のフォーマット（大腸菌グリセロール精製プラスミド DNAレンチウイルスパーティクル）で提供可能です

MISSION shRNA Gene Family Sets

生物種 Gene Family Set製品番号 製品情報

Glycerol Plasmid DNA

Lentivirus Rep Titer

Lentivirus Full Titer Gene Count Clone

CountAvg Number CloneGene

Human

Apoptosis Pathway SH1911 SH1921 SH1931

お問い合わせ ください

443 3512 79B-Cell Activation SH2911 SH2921 SH2931 99 661 67Cell Adhesion Genes SH2211 SH2221 SH2231 368 2396 65Cytokine and Chemokine SH0811 SH0821 SH0831 106 538 51Cytokine and Chemokine Receptors SH1311 SH1321 SH1331 93 584 63Cytoskeleton Genes SH2311 SH2321 SH2331 275 1991 72Epigenetic Regulators SH3011 SH3021 SH3031 10 59 59DNA Repair Pathway SH1811 SH1821 SH1831 117 837 72Ubiquitin Hydrolases (DUBS) SH0711 SH0721 SH0731 127 830 65Extracellular Matrix Genes SH2511 SH2521 SH2531 331 1968 59G-Protein Coupled Receptors (GPCRs) SH0211 SH0221 SH0231 541 2864 53Helicase SH2611 SH2621 SH2631 136 909 67Ion Channel SH1011 SH1021 SH1031 279 1456 52JAK-STAT Pathway SH2711 SH2721 SH2731 190 1358 71Kinases complete SH0111 SH0121 SH0131 672 7742 112Nuclear Hormone Receptors SH1111 SH1121 SH1131 218 1448 66p53 Pathway SH2411 SH2421 SH2431 242 1865 77Phosphatases SH0411 SH0421 SH0431 316 2065 65T-Cell Activation SH2811 SH2821 SH2831 242 1469 61Tumor Supressors SH0511 SH0521 SH0531 73 575 79Tyrosine Kinases お問い合わせください 133 1728 130Ubiquitin Ligases (E1 E2 E3) SH2111 SH2121 SH2131 349 2151 62

MouseKinases complete SM0111 SM0121 SM0131 618 3916 63Phosphatase SM0411 SM0421 SM0431 290 1734 60Tyrosine Kinase SM2011 SM2021 SM2031 133 850 64カスタムライブラリー お問い合わせください

価格についてはお問い合わせください

sigmacomshrnascreen

遺伝子機能別shRNA ライブラリーMISSIONreg shRNA Gene Family Sets

shRNA

22

Highly Validated Gene and Clone ContentsTotal Validated

Human Clones 129000+ 43000+

Mouse Clones 118000+ 36000+

Total Clones 247000+ 80000+

Human Genes 20000+ 8000+

Mouse Genes 21000+ 8000+

Total Genes 41000+ 16000+

ヒト遺伝子 MISSION LentiPlex Pooled shRNA ライブラリー

総クローン数 総遺伝子数 サブプール数 クローン数サブプール 製品名 カタログ番号 通常価格

80000+ 16000+ 10 8000 LentiPlex 10 SHPH01-1SET yen150000025000+ 6000+ 3 8000 LentiPlex 15 SHPH15-1SET yen96000020000+ 5000+ 3 6000 LentiPlex 20 SHPH2-1SET yen800000

125000+ 20000+ 16 6000 or 8000 LentiPlex Complete （10 + 15 + 20） SHPHLIBR-1SET yen2300000

マウス遺伝子 MISSION LentiPlex Pooled shRNA ライブラリー

総クローン数 総遺伝子数 サブプール数 クローン数サブプール 製品名 カタログ番号 通常価格

75000+ 15000+ 10 8000 LentiPlex 10 SHPM01-1SET yen140000010000+ 4000+ 2 5500 LentiPlex 15 SHPM15-1SET yen44750025000+ 7000+ 3 8000 LentiPlex 20 SHPM2-1SET yen800000

110000+ 21000+ 15 5500 or 8000 LentiPlex Complete (10 + 15 + 20) SHPMLIBR-1SET yen2000000

MISSION LentiPlex Pooled System Work Flow 細胞をコロニークローニングか FACS で単離し PCR 後シーケンサーで配列を同定あらかじめ決定しておいた MOI でウイルスサブプールをそれぞれ感染させた後薬剤選択を行うその後FACS 等を用い目的の表現型を示した細胞群を分取するゲノムに組み込まれた shRNA は PCR の後にシーケンサーを用いて確認する各々の shRNA がターゲットとする遺伝子を同定後それらの生物学的役割を検証する

参考文献1 Karlsson C et al (2010) Forward RNAi screens in human stem cells Methods Mol Biol 650 29-43 (PMID 20686941)2 Possemato R et al (2011) Functional genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer Nature 476(7360)

346-350 (PMID 21760589)

MISSIONreg LentiPlex Pooled Library は信頼性の高い TRC shRNA ライブラリーを用いてベンチトップ上でゲノムワイドな RNAi スクリーニングを可能にするスクリーニングツールです使いやすいフォーマットになっておりスクリーニング用の大型機器等は必要なく試薬の使用量も最小限に抑えることが可能です

sigmacomlentiplex

プール型 全ゲノム shRNA ライブラリーLentiPlexreg Pooled Whole Genome Library

Human および Mouse それぞれ 100000 クローンを大きく超える膨大なライブラリー 擬陽性発生頻度低減のため5500 ～ 8000 クローンのサブプールに分割済み ウイルスタイターはp24 アッセイにおいて 5ｘ108 TUmL 以上 ロボットや分注機が不要で全てベンチトップで実験可能 FACS 等多くの蛍光を用いたアッセイに適応

サブプールに分かれたLentiPlexPooledLibrary

ウイルスを予め決められたMOIで細胞集団に感染させる

インキュベーション2-4日ピューロマイシンで選択表現系により目的の細胞を選択

シークエンスした配列とデータベースを照会し目的の shRNAを同定

細胞からゲノムDNAを抽出し増幅プライマーでPCRをかける

shRNA

21

仕様 大腸菌グリセロールストック50 μL aliquot of bacterial glycerol stocks （terrific broth carbenicillin at 100 microgmL and 15 glycerol） QC No Sequencing Visual Inspection for Growth

精製プラスミド DNA An average of 2 microg per clone （range of 400 ng ndash 4 microg） is provided and is aliquoted at 40 μL per well QC Sequencing Verification DNA Quantitation

レンチウイルスパーティクル （representational plate titer） 4 x 50 μL aliquots of VSV-G pseudotyped lentivirus 10 representational plate titer QC Sequencing Verification p24 ELISA Titer

レンチウイルスパーティクル （full individual well titer） 4 x 50 μL aliquots of VSV-G pseudotyped lentivirus fully titered to individual wells QC Sequencing Verification p24 ELISA Titer カスタム品となります詳細はお問合せ下さい

表中のクローン数ターゲット数が実際の納品物と異なる場合がございます価格については都度お見積りとなります詳細はお問合せ下さい

MISSION shRNA Gene Family Sets は特異的な細胞間 分子間相互作用の情報を NCBIGene Ontology Protein LoungeIngenuity Systems より抽出した遺伝子セットとなりますコレクションは TRC115 のクローンで構成されています3 種類のフォーマット（大腸菌グリセロール精製プラスミド DNAレンチウイルスパーティクル）で提供可能です

MISSION shRNA Gene Family Sets

生物種 Gene Family Set製品番号 製品情報

Glycerol Plasmid DNA

Lentivirus Rep Titer

Lentivirus Full Titer Gene Count Clone

CountAvg Number CloneGene

Human

Apoptosis Pathway SH1911 SH1921 SH1931

お問い合わせ ください

443 3512 79B-Cell Activation SH2911 SH2921 SH2931 99 661 67Cell Adhesion Genes SH2211 SH2221 SH2231 368 2396 65Cytokine and Chemokine SH0811 SH0821 SH0831 106 538 51Cytokine and Chemokine Receptors SH1311 SH1321 SH1331 93 584 63Cytoskeleton Genes SH2311 SH2321 SH2331 275 1991 72Epigenetic Regulators SH3011 SH3021 SH3031 10 59 59DNA Repair Pathway SH1811 SH1821 SH1831 117 837 72Ubiquitin Hydrolases (DUBS) SH0711 SH0721 SH0731 127 830 65Extracellular Matrix Genes SH2511 SH2521 SH2531 331 1968 59G-Protein Coupled Receptors (GPCRs) SH0211 SH0221 SH0231 541 2864 53Helicase SH2611 SH2621 SH2631 136 909 67Ion Channel SH1011 SH1021 SH1031 279 1456 52JAK-STAT Pathway SH2711 SH2721 SH2731 190 1358 71Kinases complete SH0111 SH0121 SH0131 672 7742 112Nuclear Hormone Receptors SH1111 SH1121 SH1131 218 1448 66p53 Pathway SH2411 SH2421 SH2431 242 1865 77Phosphatases SH0411 SH0421 SH0431 316 2065 65T-Cell Activation SH2811 SH2821 SH2831 242 1469 61Tumor Supressors SH0511 SH0521 SH0531 73 575 79Tyrosine Kinases お問い合わせください 133 1728 130Ubiquitin Ligases (E1 E2 E3) SH2111 SH2121 SH2131 349 2151 62

MouseKinases complete SM0111 SM0121 SM0131 618 3916 63Phosphatase SM0411 SM0421 SM0431 290 1734 60Tyrosine Kinase SM2011 SM2021 SM2031 133 850 64カスタムライブラリー お問い合わせください

価格についてはお問い合わせください

sigmacomshrnascreen

遺伝子機能別shRNA ライブラリーMISSIONreg shRNA Gene Family Sets

shRNA

22

Highly Validated Gene and Clone ContentsTotal Validated

Human Clones 129000+ 43000+

Mouse Clones 118000+ 36000+

Total Clones 247000+ 80000+

Human Genes 20000+ 8000+

Mouse Genes 21000+ 8000+

Total Genes 41000+ 16000+

ヒト遺伝子 MISSION LentiPlex Pooled shRNA ライブラリー

総クローン数 総遺伝子数 サブプール数 クローン数サブプール 製品名 カタログ番号 通常価格

80000+ 16000+ 10 8000 LentiPlex 10 SHPH01-1SET yen150000025000+ 6000+ 3 8000 LentiPlex 15 SHPH15-1SET yen96000020000+ 5000+ 3 6000 LentiPlex 20 SHPH2-1SET yen800000

125000+ 20000+ 16 6000 or 8000 LentiPlex Complete （10 + 15 + 20） SHPHLIBR-1SET yen2300000

マウス遺伝子 MISSION LentiPlex Pooled shRNA ライブラリー

総クローン数 総遺伝子数 サブプール数 クローン数サブプール 製品名 カタログ番号 通常価格

75000+ 15000+ 10 8000 LentiPlex 10 SHPM01-1SET yen140000010000+ 4000+ 2 5500 LentiPlex 15 SHPM15-1SET yen44750025000+ 7000+ 3 8000 LentiPlex 20 SHPM2-1SET yen800000

110000+ 21000+ 15 5500 or 8000 LentiPlex Complete (10 + 15 + 20) SHPMLIBR-1SET yen2000000

MISSION LentiPlex Pooled System Work Flow 細胞をコロニークローニングか FACS で単離し PCR 後シーケンサーで配列を同定あらかじめ決定しておいた MOI でウイルスサブプールをそれぞれ感染させた後薬剤選択を行うその後FACS 等を用い目的の表現型を示した細胞群を分取するゲノムに組み込まれた shRNA は PCR の後にシーケンサーを用いて確認する各々の shRNA がターゲットとする遺伝子を同定後それらの生物学的役割を検証する

参考文献1 Karlsson C et al (2010) Forward RNAi screens in human stem cells Methods Mol Biol 650 29-43 (PMID 20686941)2 Possemato R et al (2011) Functional genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer Nature 476(7360)

346-350 (PMID 21760589)

MISSIONreg LentiPlex Pooled Library は信頼性の高い TRC shRNA ライブラリーを用いてベンチトップ上でゲノムワイドな RNAi スクリーニングを可能にするスクリーニングツールです使いやすいフォーマットになっておりスクリーニング用の大型機器等は必要なく試薬の使用量も最小限に抑えることが可能です

sigmacomlentiplex

プール型 全ゲノム shRNA ライブラリーLentiPlexreg Pooled Whole Genome Library

Human および Mouse それぞれ 100000 クローンを大きく超える膨大なライブラリー 擬陽性発生頻度低減のため5500 ～ 8000 クローンのサブプールに分割済み ウイルスタイターはp24 アッセイにおいて 5ｘ108 TUmL 以上 ロボットや分注機が不要で全てベンチトップで実験可能 FACS 等多くの蛍光を用いたアッセイに適応

サブプールに分かれたLentiPlexPooledLibrary

ウイルスを予め決められたMOIで細胞集団に感染させる

インキュベーション2-4日ピューロマイシンで選択表現系により目的の細胞を選択

シークエンスした配列とデータベースを照会し目的の shRNAを同定

細胞からゲノムDNAを抽出し増幅プライマーでPCRをかける

shRNA

22

Highly Validated Gene and Clone ContentsTotal Validated

Human Clones 129000+ 43000+

Mouse Clones 118000+ 36000+

Total Clones 247000+ 80000+

Human Genes 20000+ 8000+

Mouse Genes 21000+ 8000+

Total Genes 41000+ 16000+

ヒト遺伝子 MISSION LentiPlex Pooled shRNA ライブラリー

総クローン数 総遺伝子数 サブプール数 クローン数サブプール 製品名 カタログ番号 通常価格

80000+ 16000+ 10 8000 LentiPlex 10 SHPH01-1SET yen150000025000+ 6000+ 3 8000 LentiPlex 15 SHPH15-1SET yen96000020000+ 5000+ 3 6000 LentiPlex 20 SHPH2-1SET yen800000

125000+ 20000+ 16 6000 or 8000 LentiPlex Complete （10 + 15 + 20） SHPHLIBR-1SET yen2300000

マウス遺伝子 MISSION LentiPlex Pooled shRNA ライブラリー

総クローン数 総遺伝子数 サブプール数 クローン数サブプール 製品名 カタログ番号 通常価格

75000+ 15000+ 10 8000 LentiPlex 10 SHPM01-1SET yen140000010000+ 4000+ 2 5500 LentiPlex 15 SHPM15-1SET yen44750025000+ 7000+ 3 8000 LentiPlex 20 SHPM2-1SET yen800000

110000+ 21000+ 15 5500 or 8000 LentiPlex Complete (10 + 15 + 20) SHPMLIBR-1SET yen2000000

MISSION LentiPlex Pooled System Work Flow 細胞をコロニークローニングか FACS で単離し PCR 後シーケンサーで配列を同定あらかじめ決定しておいた MOI でウイルスサブプールをそれぞれ感染させた後薬剤選択を行うその後FACS 等を用い目的の表現型を示した細胞群を分取するゲノムに組み込まれた shRNA は PCR の後にシーケンサーを用いて確認する各々の shRNA がターゲットとする遺伝子を同定後それらの生物学的役割を検証する

参考文献1 Karlsson C et al (2010) Forward RNAi screens in human stem cells Methods Mol Biol 650 29-43 (PMID 20686941)2 Possemato R et al (2011) Functional genomics reveal that the serine synthesis pathway is essential in breast cancer Nature 476(7360)

346-350 (PMID 21760589)

MISSIONreg LentiPlex Pooled Library は信頼性の高い TRC shRNA ライブラリーを用いてベンチトップ上でゲノムワイドな RNAi スクリーニングを可能にするスクリーニングツールです使いやすいフォーマットになっておりスクリーニング用の大型機器等は必要なく試薬の使用量も最小限に抑えることが可能です

sigmacomlentiplex

プール型 全ゲノム shRNA ライブラリーLentiPlexreg Pooled Whole Genome Library

Human および Mouse それぞれ 100000 クローンを大きく超える膨大なライブラリー 擬陽性発生頻度低減のため5500 ～ 8000 クローンのサブプールに分割済み ウイルスタイターはp24 アッセイにおいて 5ｘ108 TUmL 以上 ロボットや分注機が不要で全てベンチトップで実験可能 FACS 等多くの蛍光を用いたアッセイに適応

サブプールに分かれたLentiPlexPooledLibrary

ウイルスを予め決められたMOIで細胞集団に感染させる

インキュベーション2-4日ピューロマイシンで選択表現系により目的の細胞を選択

シークエンスした配列とデータベースを照会し目的の shRNAを同定

細胞からゲノムDNAを抽出し増幅プライマーでPCRをかける

shRNA

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カスタムshRNAライブラリーTRC ライブラリーからお客様の抽出されたクローンをプレートでご提供するサービスです100 クローン以上より承ります（プールライブラリーは 500 クローン以上となります）

Format Material Provided Quality Control

Bacterial Glycerol Stock 50 μL aliquot of bacterial glycerol stocks （terrific broth carbenicillin at 100 μgmL and 15 glycerol）

No Sequencing Visual Inspection for Growth

Purified Plasmid DNA An average of 2 μg per clone （range of 400 ng - 4 μg） is provided and is aliquoted at 40 μL per well

SequencingVerification DNA Quantitation

Lentivirus（representational plate titer）

4 x 50 μL aliquots of VSV-G pseudotyped lentivirus 10 representational plate titer（1x106 TUmL）

SequencingVerificationp24 ELISA Titer

Lentivirus（full individual well titer）

4 x 50 μL aliquots of VSV-G pseudotyped lentivirus fully titered to individual wells（1x106 TUmL）

SequencingVerificationp24 ELISA Titer

Pooled lentivirus 8 x 25 μL aliquots of VSV-G pseudotyped lentivirus deep sequencing

次世代シーケンサーを用いたプール型 LentiPlex shRNA ライブラリーの解析方法

次世代シークエンシングによる shRNA スクリーニングのヒット遺伝子追加検証 NGS による配列解析によりクローンの正確な出現頻度を知ることができる 網羅的で再現性の高いデータの取得が可能 情報が豊富なため統計的にも堅牢なデータ

shRNA スクリーニングで選抜されたヒット遺伝子の追加検証に 次世代シークエンサーが用いられる理由

広いダイナミックレンジ 正確な shRNA 頻度をカウント可能 ハイブリダイゼーションのバイアスが無い偽陰性データが少ない クロス - ハイブリダイズが無い偽陽性データが少ない TA クローニングが不要 細胞のクローニングが不要

DNA Preparation andDeconvolution Workflow

Genomic DNA

shRNA

Primers containing adapter barcode and binding sites

PCR of shRNA from genomic DNA

Pool multiple samples

High Throughput Sequencing

1 times 106 - 10 times 106 Cells

or

Tumor Samples

Genomic DNA Extraction

PCR shRNA from Genomic DNA Extraction

Sequence shRNA in pool

Sequence Alignment and Data Clean-up

siRNA

24

一過性RNAiによるノックダウン実験のスタンダードMISSIONreg siRNA概要RNAi 実験を成功させるには siRNA のデザインがきわめて重要なファクターであることはよく知られていますシグマ アルドリッチはsiRNA 研究のリーディングカンパニー Rosetta Inpharmatics との専属提携しMISSION siRNA のデザインに特許技術 Rosetta siRNA デザインアルゴリズムを採用していますRosetta siRNA デザインアルゴリズムは位置特異的スコアマトリックスと siRNA の Seed Region に関するあらゆる重要な知見を利用してターゲット遺伝子に対して最も効果的かつ特異的な siRNA の配列を予測し実際の遺伝子サイレンシング実験からのフィードバックを繰り返して最適化されていますその理論の適合性はsiRNA デザインが採用された多くの実験におけるノックダウン実績により実証されています最高のアルゴリズムによりデザインされた MISSION siRNA を使用することで時間と予算を節約できsiRNA のデザインや確認といった準備作業を軽減しその先の実験に注力いただけます

特長 Seed Region 最適化方式によるターゲット特異性の増大 微量な mRNA を効率的にノックダウン 遺伝子サイレンシングを保証 高品質 siRNA を ISO 90012008 認定拠点で生産 研究用途にではライセンスフリー

参考文献1 Matsubara T et al (2008) BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation J Biol Chem 283(43) 29119-

29125 (PMID 18703512)2 Meng W et al (2008) Anchorage of microtubule minus ends to adherens junctions regulates epithelial cell-cell contacts Cell 135(5) 948-

959 (PMID 19041755)3 Zhou H et al (2008) Genome-scale RNAi screen for host factors required for HIV replication Cell Host Microbe 4(5) 495-504 (PMID

18976975)4 Nishita M et al (2010) Ror2Frizzled complex mediates Wnt5a-induced AP-1 activation by regulating Dishevelled polymerization Mol Cell

Biol 30(14) 3610-3619 (PMID 20457807)5 Cho H S et al (2011) Demethylation of RB regulator MYPT1 by histone demethylase LSD1 promotes cell cycle progression in cancer cells

Cancer Res 71(3) 655-660 (PMID 21115810)6 Gilot D et al (2011) RNAi-based screening identifies kinases interfering with dioxin-mediated up-regulation of CYP1A1 activity PLoS One

6(3) e18261 (PMID 21479225)

MISSION Predesigned siRNA provide best-in-class gene silencing

Gene Specific siRNA

HeLa cells transfected at a concentration of 30 nM siRNA Percentage remaining gene expression levels measured via quantitative real-time PCR 48 hours after transfection (relative to mock) Data represents the mean of four biological replicates

MISSION siRNA はオンデマンド合成にてご提供しており ま す 弊 社 ウ ェ ブ サ イ ト（sigmacomjapan） に てGene SymbolRefSeq IDまたは Gene ID からご希望の遺伝子に対する siRNA を検索いただけます

ご注文は 1 duplex から　 ヒトマウスラットの pre-designed siRNA を 1 duplex

からご注文可能ノックダウンを保証　 1 ターゲット遺伝子に対して3 duplex ご注文いただ

いた場合そのうち少なくとも 1 duplex が 75 以上のノックダウン効率を示すことを保証いたします

短納期　 国内製造拠点からご希望の MISSION siRNA をお届けい

たします

sigmacommissionsirna-jp

siRNA

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一過性RNAiによるノックダウン実験のスタンダードMISSIONreg siRNA概要RNAi 実験を成功させるには siRNA のデザインがきわめて重要なファクターであることはよく知られていますシグマ アルドリッチはsiRNA 研究のリーディングカンパニー Rosetta Inpharmatics との専属提携しMISSION siRNA のデザインに特許技術 Rosetta siRNA デザインアルゴリズムを採用していますRosetta siRNA デザインアルゴリズムは位置特異的スコアマトリックスと siRNA の Seed Region に関するあらゆる重要な知見を利用してターゲット遺伝子に対して最も効果的かつ特異的な siRNA の配列を予測し実際の遺伝子サイレンシング実験からのフィードバックを繰り返して最適化されていますその理論の適合性はsiRNA デザインが採用された多くの実験におけるノックダウン実績により実証されています最高のアルゴリズムによりデザインされた MISSION siRNA を使用することで時間と予算を節約できsiRNA のデザインや確認といった準備作業を軽減しその先の実験に注力いただけます

特長 Seed Region 最適化方式によるターゲット特異性の増大 微量な mRNA を効率的にノックダウン 遺伝子サイレンシングを保証 高品質 siRNA を ISO 90012008 認定拠点で生産 研究用途にではライセンスフリー

参考文献1 Matsubara T et al (2008) BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation J Biol Chem 283(43) 29119-

29125 (PMID 18703512)2 Meng W et al (2008) Anchorage of microtubule minus ends to adherens junctions regulates epithelial cell-cell contacts Cell 135(5) 948-

959 (PMID 19041755)3 Zhou H et al (2008) Genome-scale RNAi screen for host factors required for HIV replication Cell Host Microbe 4(5) 495-504 (PMID

18976975)4 Nishita M et al (2010) Ror2Frizzled complex mediates Wnt5a-induced AP-1 activation by regulating Dishevelled polymerization Mol Cell

Biol 30(14) 3610-3619 (PMID 20457807)5 Cho H S et al (2011) Demethylation of RB regulator MYPT1 by histone demethylase LSD1 promotes cell cycle progression in cancer cells

Cancer Res 71(3) 655-660 (PMID 21115810)6 Gilot D et al (2011) RNAi-based screening identifies kinases interfering with dioxin-mediated up-regulation of CYP1A1 activity PLoS One

6(3) e18261 (PMID 21479225)

MISSION Predesigned siRNA provide best-in-class gene silencing

Gene Specific siRNA

HeLa cells transfected at a concentration of 30 nM siRNA Percentage remaining gene expression levels measured via quantitative real-time PCR 48 hours after transfection (relative to mock) Data represents the mean of four biological replicates

MISSION siRNA はオンデマンド合成にてご提供しており ま す 弊 社 ウ ェ ブ サ イ ト（sigmacomjapan） に てGene SymbolRefSeq IDまたは Gene ID からご希望の遺伝子に対する siRNA を検索いただけます

ご注文は 1 duplex から　 ヒトマウスラットの pre-designed siRNA を 1 duplex

からご注文可能ノックダウンを保証　 1 ターゲット遺伝子に対して3 duplex ご注文いただ

いた場合そのうち少なくとも 1 duplex が 75 以上のノックダウン効率を示すことを保証いたします

短納期　 国内製造拠点からご希望の MISSION siRNA をお届けい

たします

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siRNA

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MISSIONreg siRNA 価格表 1 ターゲット遺伝子に対して3 duplex 以上ご注文い

ただいた場合ノックダウン保証の対象となります保証収量1

（概算収量2）濃度

（microM） 価格 納期3

2 OD (10 nmol) 50 yen20000duplex 6日4

5 OD (25 nmol) 100 yen32000duplex 6日4

10 OD (50 nmol) 300 yen45000duplex 6日4

50 OD (250 nmol) 1500 yen82000duplex 7日5

Validated MISSION siRNA 価格表 Validated MISSION siRNA の一覧は弊社ウェブサイト

からご確認いただけます保証収量1

（概算収量2）濃度

（microM） 価格 納期3

2 OD (10 nmol) 50 yen36000duplex 6日4

5 OD (25 nmol) 100 yen57000duplex 6日4

10 OD (50 nmol) 300 yen80000duplex 6日4

50 OD (250 nmol) 1500 yen156000duplex 7日5

1 Single strand RNA の状態における値です各保証 OD 値の Single strand RNA を duplex にしております

2 概算収量は配列によって変動いたします 3 土日祝日弊社休業日は納期に含まれておりませんのでご了承くださいまた

地域により若干前後する場合がございます 4 4 duplex 追加ごとに＋ 1 日となります

（例5 ～ 8 duplex＋ 1 日9 ～ 12 duplex＋ 2 日13 ～ 16 duplex＋ 3 日） 5 2 duplex 追加ごとに＋ 1 日となります

（例3 ～ 4 duplex＋ 1 日5 ～ 6 duplex＋ 2 日7 ～ 8 duplex＋ 3 日　 9 ～ 10 duplex＋ 4 日）

sigmacomjapan

各ターゲットに対する製品情報は弊社ウェブサイトから検索いただけますターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です

この検索窓から検索いただけます

MISSION siRNA Positive Control特長

Rosetta siRNA デザインアルゴリズムを使用 特異遺伝子をターゲットとした siRNA qRT-PCR にてノックダウンを確認済み

Human RatValidated cell line HeLa 9LlacZ

Gene symbol

GAPDH GAPDHMAPK1 MAPK1Lamin AC Lamin ACCyclophilin B (PPIB) Cyclophilin B (PPIB)TP53 TP53KIF11

MISSION siRNA Universal Negative Control特長ヒトマウスラット細胞用にデザイン Mature および Predicted の RefSeq mRNA シーケンス

と一切相同性を示さないデザイン 免疫反応モチーフを含まずqRT-PCR により免疫反応が

起こらないことを確認済みのデザイン Agilentreg 社 40K Human Gene Arrays を用いて

オフターゲット効果を示さないことを確認済み

価格仕様全て 50 μM に濃度調整し5 nmoltube に小分けされた状態でお届けします 製品名 容量 カタログ番号 価格

MISSION siRNA Universal Negative Control 1

1 OD 5 nmol SIC-001-5 yen120002 OD 10 nmol SIC-001-10 yen190005 OD 25 nmol SIC-001-25 yen3000010 OD 50 nmol SIC-001-50 yen42000

MISSION siRNA Universal Negative Control 2

1 OD 5 nmol SIC-002-5 yen120002 OD 10 nmol SIC-002-10 yen190005 OD 25 nmol SIC-002-25 yen3000010 OD 50 nmol SIC-002-50 yen42000

ご注文方法Universal Negative Control は通常のカスタム製品とご注文方法が異なります上記製品名とカタログ番号を担当代理店様へお伝えくださいご不明な点は弊社カスタマーサービス（genosysjpsialcom）までお問い合わせください（納期は在庫状況によりますが通常 2-3 日でお届けが可能です）

トランスフェクション試薬をお探しのお客様は弊社テクニカルサービス

（TEL 03-6756-8245email sialjptssialcom）までお問い合わせください

参考文献1 Hornung V et al (2005) Sequence-specific potent induction of IFN-alpha by short interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through

TLR7 Nat Med 11(3) 263-270 (PMID 15723075)2 Judge A D et al (2005) Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA Nat Biotechnol

23(4) 457-462 (PMID 15778705)

sigma-aldrichcomsinega-jp

ご注文情報 コントロールsiRNA

siRNA

26

1 duplex yen20000 ~　（保証収量 2 OD 脱塩）

シグマ アルドリッチはsiRNA 合成において効果的ノックダウンに必要な要因を特定しており常に高品質な siRNA を提供可能な RNA 合成プラットフォームを開発しています弊社の RNA 合成では2rsquo 位 tert- ブチルジメチルシリル（TBDMS）基に3rsquo 位ホスホルアミダイトによって保護された高速脱保護リボヌクレオシドホスホルアミダイトが採用されています独自のプラットフォームを元に最適化されたこの特許取得済みプロセスにより高いカップリング効率と迅速な脱保護を実現し高品質な siRNA を短期間で合成することが可能です

siRNA カスタム合成サービスの特長 高品質かつ短納期で対費用効果の高い siRNA 脱塩でも十分なノックダウン効果を発揮 大規模プロジェクト向けのハイスループット製造能力

保証収量 価格 納期

保証収量（概算収量1） トランスフェクション24-well plateフォーマット（概算） 濃度（microM） 精製 価格 納期2

2 OD （ 10 nmol） 150 wells 50 脱塩 yen20000duplex 6日 5 OD （ 25 nmol ) 375 wells 100 脱塩 yen32000duplex 6日 10 OD （ 50 nmol ) 750 wells 300 脱塩 yen45000duplex 6日 50 OD （ 250 nmol ) 3750 wells 1500 脱塩 yen82000duplex 7日 1 OD （ 5 nmol ) 75 wells 30 PAGE yen41000duplex 7日 5 OD （ 25 nmol ) 375 wells 100 HPLC yen61000duplex 8日 10 OD （ 50 nmol ) 750 wells 300 HPLC yen76000duplex 9日

1　概算収量は配列によって変動いたします 2　 土日祝日弊社休業日は納期に含んでおりませんのでご了承ください

また地域およびご注文本数により若干前後することがございます

修飾 siRNA未修飾 siRNA だけでなくリン酸化などの化学修飾Cy5reg などの蛍光修飾も可能です

修飾の一例2rsquo -O-Me RNA2rsquo -F-RNAENAリン酸化アミノ化（NH2）Biotinチオール化（SH）CholesterolFluorescein 6-FAM TETHEXCy3regCy5Cy55regTAMRABHQ-1 BHQ-3 DNP DIGこのほかにも多数の合成実績がございます

様々なご要望にお応えしますカスタムデザイン一本鎖 RNA大量スケールミックスin vivo 仕様も承ります是非一度ご相談ください

カスタム siRNA

各種修飾オプションの詳細は下記 URL をご確認ください

sigmacomcustomsirna-jp

siRNA

27

in vivo用 siRNAMISSIONreg In Vivo Quality and iScale Oligostrade

MISSION In Vivo Quality siRNA and iScale Oligos は動物個体で RNAi 研究をするために適した高品質な siRNA ですiScale siRNA は大容量（～グラム単位）の納品や修飾などさまざまなご要望に対してフレキシブルに対応いたします

基本製品仕様 HPLC 精製（≧ 90 純度） アニーリング後に透析済 ろ過滅菌済（022 μ m フィルター） エンドトキシンテスト済

必要に応じた収量オプション 3 mg　　 50 mg 　　 100 mg収量のご希望はご相談ください

トレーサビリティ 安定性向上のための修飾オプション 5 6-FAM 5 Phosphate 5 Cy5reg 5 Cy3reg 5 Amino 5 or 3 Cholesterol Phosphorothioate linkages など

in vivo での使用実績NODSCID マウスに H1155luc 細胞を移植し腫瘍が形成された後ルシフェラーゼ特異的またはコントロール（non-target）iScale siRNA を LANCErII を用いてインジェクションを行った24 時間後D-luciferin 溶液をインジェクションしNight OWL in vivo イメージングシステムを用いて画像解析を行った結果ルシフェラーゼ特異的 iScale siRNA 処理した個体では有意にルシフェラーゼ活性が減少していた

1 2 1 2

1ルシフェラーゼ特異的 siRNA を導入したモデルマウス2non-targeting siRNA を導入（コントロール）

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Luciferase siRNA treated

Replicate 1

Luciferase siRNA treated

Replicate 2

Luciferase siRNA treated

Replicate 3

Negative treated

Sample

L

ucPr

otei

n Ex

pres

sion

インジェクション後７２時間で腫瘍を摘出しタンパク質を抽出したルシフェラーゼ活性はコントロールと比較すると約 12 に減少していた

参考文献1 Kleinman M E et al (2008) Sequence- and target-independent angiogenesis suppression by siRNA via TLR3 Nature 452(7187) 591-597

(PMID 18368052)2 Robbins M et al (2008) Misinterpreting the therapeutic effects of small interfering RNA caused by immune stimulation Hum Gene Ther

19(10) 991-999 (PMID 18713023)3 Watabe M et al (2008) A dominant role of GTRAP3-18 in neuronal glutathione synthesis J Neurosci 28(38) 9404-9413 (PMID 18799673)4 Yang Z et al (2008) Toll-like receptor 3 and geographic atrophy in age-related macular degeneration N Engl J Med 359(14) 1456-1463

(PMID 18753640)5 Brahmamdam P et al (2009) Targeted delivery of siRNA to cell death proteins in sepsis Shock 32(2) 131-139 (PMID 19033888)

sigmacominvivosirna-jp

siRNA

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in vivo用 siRNAMISSIONreg In Vivo Quality and iScale Oligostrade

MISSION In Vivo Quality siRNA and iScale Oligos は動物個体で RNAi 研究をするために適した高品質な siRNA ですiScale siRNA は大容量（～グラム単位）の納品や修飾などさまざまなご要望に対してフレキシブルに対応いたします

基本製品仕様 HPLC 精製（≧ 90 純度） アニーリング後に透析済 ろ過滅菌済（022 μ m フィルター） エンドトキシンテスト済

必要に応じた収量オプション 3 mg　　 50 mg 　　 100 mg収量のご希望はご相談ください

トレーサビリティ 安定性向上のための修飾オプション 5 6-FAM 5 Phosphate 5 Cy5reg 5 Cy3reg 5 Amino 5 or 3 Cholesterol Phosphorothioate linkages など

in vivo での使用実績NODSCID マウスに H1155luc 細胞を移植し腫瘍が形成された後ルシフェラーゼ特異的またはコントロール（non-target）iScale siRNA を LANCErII を用いてインジェクションを行った24 時間後D-luciferin 溶液をインジェクションしNight OWL in vivo イメージングシステムを用いて画像解析を行った結果ルシフェラーゼ特異的 iScale siRNA 処理した個体では有意にルシフェラーゼ活性が減少していた

1 2 1 2

1ルシフェラーゼ特異的 siRNA を導入したモデルマウス2non-targeting siRNA を導入（コントロール）

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Luciferase siRNA treated

Replicate 1

Luciferase siRNA treated

Replicate 2

Luciferase siRNA treated

Replicate 3

Negative treated

Sample

L

ucPr

otei

n Ex

pres

sion

インジェクション後７２時間で腫瘍を摘出しタンパク質を抽出したルシフェラーゼ活性はコントロールと比較すると約 12 に減少していた

参考文献1 Kleinman M E et al (2008) Sequence- and target-independent angiogenesis suppression by siRNA via TLR3 Nature 452(7187) 591-597

(PMID 18368052)2 Robbins M et al (2008) Misinterpreting the therapeutic effects of small interfering RNA caused by immune stimulation Hum Gene Ther

19(10) 991-999 (PMID 18713023)3 Watabe M et al (2008) A dominant role of GTRAP3-18 in neuronal glutathione synthesis J Neurosci 28(38) 9404-9413 (PMID 18799673)4 Yang Z et al (2008) Toll-like receptor 3 and geographic atrophy in age-related macular degeneration N Engl J Med 359(14) 1456-1463

(PMID 18753640)5 Brahmamdam P et al (2009) Targeted delivery of siRNA to cell death proteins in sepsis Shock 32(2) 131-139 (PMID 19033888)

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siRNA

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MISSION siRNA ライブラリーパネルは大手製薬企業からの情報提供により創薬に有用な遺伝子群のハイスループットスクリーニング用として非常に魅力的な siRNA コレクションです

特長 siRNA は遺伝子ノックダウン効率とターゲット特異性を高めるためRosetta siRNA デザインアルゴリズムを用いて設計 遺伝子ごとに siRNA が 3 duplex 含まれておりsiRNA をプールして使用することも可能 複数回のスクリーニングが可能な十分量の siRNA を提供 大手製薬企業と共同で遺伝子を選抜

製品仕様 全長21 mer（3-dTdT Overhang を持つ 19 bp の標的配列） 入数1 ターゲット遺伝子につきsiRNA duplex 3 本 形状全 siRNA duplex は 96 ウェルマイクロプレートに分注（1 プレートあたり 80 duplex） 対照全プレートに Positive Control siRNA を同梱

ご注文情報MISSION siRNA Human Libraries

MISSION siRNA Rat Librariesカタログ番号 製品名 Targets 容量SI20100-1SET MISSION siRNA Rat

Druggable Genome Library6016 1 nmol

SI21100-1SET MISSION siRNA Rat Ligase Panel 816 1 nmolSI22100-1SET MISSION siRNA Rat Kinase Panel 667 1 nmolSI23100-1SET MISSION siRNA Rat Phosphatase

Panel266 1 nmol

SI24100-1SET MISSION siRNA Rat Growth Factors and Receptors Panel

341 1 nmol

SI25100-1SET MISSION siRNA Rat Cell Adhesion and Cytoskeleton Panel

433 1 nmol

SI26100-1SET MISSION siRNA Rat Ion Channel and Transporters Panel

593 1 nmol

SI27100-1SET MISSION siRNA Rat Assorted Function Panel

210 1 nmol

SI28100-1SET MISSION siRNA Rat GPCR Panel 273 1 nmolSI29100-1SET MISSION siRNA Rat Hydrolase Panel 188 1 nmolSI30100-1SET MISSION siRNA Rat Metabolism and

Cell Traffic Panel200 1 nmol

SI31100-1SET MISSION siRNA Rat Nucleic Acid Binding Panel

286 1 nmol

SI32100-1SET MISSION siRNA Rat Oxidoreductase Panel

302 1 nmol

SI33100-1SET MISSION siRNA Rat Protease Panel 341 1 nmolSI34100-1SET MISSION siRNA Rat Cell Surface and

Nuclear Receptors Panel646 1 nmol

SI35100-1SET MISSION siRNA Rat Cell Regulation Panel

214 1 nmol

SI36100-1SET MISSION siRNA Rat Transfer and Carrier Proteins Panel

66 1 nmol

SI37100-1SET MISSION siRNA Rat Transferase Panel 174 1 nmol

MISSION siRNA Mouse Librariesカタログ番号 製品名 Targets 容量SI42050-1SET MISSION siRNA Mouse Kinase Panel 623 05 nmol

カタログ番号 製品名 Targets 容量SI00100-1SET MISSION siRNA Human Druggable

Genome Library6650 1 nmol

SI01100-1SET MISSION siRNA Human Ligase Panel 949 1 nmolSI02100-1SET MISSION siRNA Human Kinase Panel 719 025 nmolSI03200-1SET MISSION siRNA Human Phosphatase

Panel303 025 nmol

SI04100-1SET MISSION siRNA Human Growth Factors and Receptors Panel

375 1 nmol

SI05100-1SET MISSION siRNA Human Cell Adhesion and Cytoskeleton Panel

496 1 nmol

SI06100-1SET MISSION siRNA Human Ion Channel and Transporters Panel

639 1 nmol

SI07100-1SET MISSION siRNA Human Assorted Function Panel

228 1 nmol

SI08100-1SET MISSION siRNA Human GPCR Panel 304 1 nmolSI09100-1SET MISSION siRNA Human Hydrolase

Panel204 1 nmol

SI10100-1SET MISSION siRNA Human Metabolism and Cell Traffic Panel

217 1 nmol

SI11100-1SET MISSION siRNA Human Nucleic Acid Binding Panel

310 1 nmol

SI12100-1SET MISSION siRNA Human Oxidoreductase Panel

338 1 nmol

SI13100-1SET MISSION siRNA Human Protease Panel

379 1 nmol

SI14100-1SET MISSION siRNA Human Cell Surface and Nuclear Receptors Panel

722 1 nmol

SI15100-1SET MISSION siRNA Human Cell Regulation Panel

227 1 nmol

SI16100-1SET MISSION siRNA Human Transfer and Carrier Proteins Panel

71 1 nmol

SI17100-1SET MISSION siRNA Human Transferase Panel

184 1 nmol

遺伝子機能別 siRNA ライブラリーMISSIONreg siRNA Library Panel

sigmacommissionsirna

siRNA

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小容量 siRNA（ヒトキナーゼならびにフォスファターゼ用） MISSIONreg siRNA Nano scale MISSION siRNA の小容量パッケージ製品です小容量のためコスト効率が高く数回程度の実験をされる方に最適ですhuman kinase panel（製品番号 SI02100 約 2500 duplex）と human phosphatase panel（製品番号 SI03200 約 1100 duplex）に含まれている siRNA を個別にご注文いただくことが可能です

特長 MISSION siRNA human kinase panel（製品番号 SI02100）および human phosphatase panel （製品番号 SI03200）

に含まれる MISSION siRNA から構成 小容量（025 nmol）

価格製品名 製品番号（X は数字） 容量 価格Human Kinase Nano Scale SIHKXXXX

025 nmol yen5000Human Phosphatase Nano Scale SIHPXXXX

製品リストから選択

Kinase siRNA sigmacomsirnakinase-jpPhosphatase siRNA sigmacomsirnaphosphatase-jp

遺伝子情報から選択

各ターゲットに対する製品情報は弊社ウェブサイトから検索いただけますターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です

この検索窓から検索いただけます

sigmacomjapan

製品プロトコールはウェブサイトから取得いただけます

シグマ アルドリッチでは環境保護の観点（Go Greenプロジェクト）から製品添付資料の見直しを行っています製品の詳細およびプロトコールは弊社ウェブサイトで各製品ページの製品名の下にある POPULAR DOCUMENTS 項目（Bulletin Product Information SheetDatasheetなど各種）から ご確認いただけます環境保全の観点からもぜひ弊社ウェブサイトをご活用ください

esiRNA

30

確実なノックダウンかつ低オフターゲット効果リスクMISSIONreg esiRNA（プール型siRNA）MISSION esiRNA（endoribonuclease prepared siRNA）は1 つの mRNA ターゲットに対する複数（数百種類）の異なるsiRNA がミックスされたプール型の siRNA でありRNAi スクリーニングにおいて シンプル経済的で確実な方法です16000 以上のヒト遺伝子14000 以上のマウス遺伝子を対象としたライブラリーであり個別の遺伝子以外にホールゲノムライブラリーカスタムライブラリーとしても提供可能です

特長 低いオフターゲット 同一の mRNA に対する siRNA が多数含まれています (200-300 duplex) 複数の siRNA が低濃度で同時に作用するためオフターゲット効果が低減されます 経済的 アッセイが１つの mRNA ターゲットにつき１つの esiRNA で済むため コストパフォーマンスの高い RNAi スクリーニングツールです 導入には通常のトランスフェクション試薬をご利用いただけます 豊富なプレデザイン ヒト遺伝子 16741 クローンマウス遺伝子 14068 クローンから構成されるプレデザイン済ライブラリー

です

target mRNA

siRNAは各ターゲットへの相対濃度が高く（20 μM）オフターゲット効果のリスクが高い

esiRNAは各ターゲットへの相対濃度が低く（50 pM）オフターゲット効果のリスクが低い

21bp

Off-target CBA

target region

target mRNA

300-600bptarget region

5rsquo 3rsquo 5rsquo 3rsquo

Off-target CBA CBA CBA

siRNA と esiRNA の作用機序比較

siRNA標的

標的デザイン（鎖長）

作用単位

オフターゲット効果

esiRNA

サイレンシングにおける siRNA と esiRNA の特異性比較

KIAA1387（矢印）に対する siRNA または esiRNA を細胞に導入した後遺伝子発現量の変化をマイクロアレイを用いて解析した発現量が優位（plt001）に変動した遺伝子は赤（発現上昇）と青（発現低下）で示したsiRNA を導入した場合ターゲット以外の多くの遺伝子が変動していることがわかった（黄色）各 siRNA またはesiRNA のノックダウン効率は右側に示した

sigmacomesiRNA

esiRNA

31

2 蛍光色を利用したウェスタンブロッティングによるノックダウン検証

Hela 細胞へ各ターゲット mRNA に対する esiRNA を導入した 72 時間後にウェスタンブロットにより発現量を測定した各シグナルデータは Odyssey imaging system（Li-COR）によって取得しコントロール（GAPDH or tubulin）によってノーマライズした緑がターゲット mRNA を示す

個別 esiRNA製品番号 生物種

（Xは数字） 個別 esiRNAEHUXXXXXX Human 16000種以上EMUXXXXXX Mouse 14000種以上

各クローンのバリデーション情報については別途お問い合わせください

容量 価格20μg yen2800050μg yen50000

esiFlex ホールゲノムライブラリーについてはお問合せください

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sigmacomjapan

esiRNA による表現型スクリーニング実施例

左では RLUC（コントロール）に対する esiRNA右ではモータータンパク質 Eg5 をコードする遺伝子（KIF11）に対する esiRNAそれぞれ 30 ng を Hela 細胞に導入したEG5 がノックダウンされた細胞では紡錘体の形成不全となり有糸分裂が停止した（矢印）写真は esiRNA 導入 48 時間後の細胞の明視野像

MISSIONreg esiRNA 製品フォーマット ラインナップ個別esiRNA プレートesiRNA カスタムesiRNA（esiFlex） ホールゲノムライブラリー

生物種 ヒトマウス

ヒトマウス

ヒトマウス

ヒトマウス

容量 20 μg（2 nmol）50 μg（5 nmol）

20 μg（2 nmol）50 μg（5 nmol）

10 μg（01 nmol）25 μg（025 nmol）50 μg（05 nmol）

10 μg（01 nmol）25 μg（025 nmol）50 μg（05 nmol）

フォーマット 2 mLチューブ 96wellプレート 96wellプレート 384wellプレートプレート esiRNA は 20 本以上esiFlex は 50 本以上からご注文が可能です

Controls製品番号 製品名 容量

Negative Controls

EHUEGFP esiRNA targeting EGFP 20 μg 50 μgEHUFLUC esiRNA targeting FLUC 20 μg 50 μgEHURLUC esiRNA targeting RLUC 20 μg 50 μgPositive Control

EHU019931 esiRNA targeting human KIF11 20 μg 50 μgEMU017691 esiRNA targeting mouse KIF11 20 μg 50 μg

KIF11 以外にも LAMIN APLK4 や AURKB など多数の遺伝子がmRNA またはタンパクレベルでバリデーションされています詳細はお問い合わせください

参考文献1 Krastev D B et al (2011) A systematic RNAi synthetic interaction screen reveals a link between p53 and snoRNP assembly Nat Cell Biol

13(7) 809-818 (PMID 21642980)2 Lin Z P et al (2011) Reduced level of ribonucleotide reductase R2 subunits increases dependence on homologous recombination repair of

cisplatin-induced DNA damage Mol Pharmacol 80(6) 1000-1012 (PMID 21875941)3 Nitzsche A et al (2011) RAD21 cooperates with pluripotency transcription factors in the maintenance of embryonic stem cell identity PLoS

One 6(5) e19470 (PMID 21589869)

ご注文情報

siRNA

29

小容量 siRNA（ヒトキナーゼならびにフォスファターゼ用） MISSIONreg siRNA Nano scale MISSION siRNA の小容量パッケージ製品です小容量のためコスト効率が高く数回程度の実験をされる方に最適ですhuman kinase panel（製品番号 SI02100 約 2500 duplex）と human phosphatase panel（製品番号 SI03200 約 1100 duplex）に含まれている siRNA を個別にご注文いただくことが可能です

特長 MISSION siRNA human kinase panel（製品番号 SI02100）および human phosphatase panel （製品番号 SI03200）

に含まれる MISSION siRNA から構成 小容量（025 nmol）

価格製品名 製品番号（X は数字） 容量 価格Human Kinase Nano Scale SIHKXXXX

025 nmol yen5000Human Phosphatase Nano Scale SIHPXXXX

製品リストから選択

Kinase siRNA sigmacomsirnakinase-jpPhosphatase siRNA sigmacomsirnaphosphatase-jp

遺伝子情報から選択

各ターゲットに対する製品情報は弊社ウェブサイトから検索いただけますターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です

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sigmacomjapan

製品プロトコールはウェブサイトから取得いただけます

シグマ アルドリッチでは環境保護の観点（Go Greenプロジェクト）から製品添付資料の見直しを行っています製品の詳細およびプロトコールは弊社ウェブサイトで各製品ページの製品名の下にある POPULAR DOCUMENTS 項目（Bulletin Product Information SheetDatasheetなど各種）から ご確認いただけます環境保全の観点からもぜひ弊社ウェブサイトをご活用ください

esiRNA

30

確実なノックダウンかつ低オフターゲット効果リスクMISSIONreg esiRNA（プール型siRNA）MISSION esiRNA（endoribonuclease prepared siRNA）は1 つの mRNA ターゲットに対する複数（数百種類）の異なるsiRNA がミックスされたプール型の siRNA でありRNAi スクリーニングにおいて シンプル経済的で確実な方法です16000 以上のヒト遺伝子14000 以上のマウス遺伝子を対象としたライブラリーであり個別の遺伝子以外にホールゲノムライブラリーカスタムライブラリーとしても提供可能です

特長 低いオフターゲット 同一の mRNA に対する siRNA が多数含まれています (200-300 duplex) 複数の siRNA が低濃度で同時に作用するためオフターゲット効果が低減されます 経済的 アッセイが１つの mRNA ターゲットにつき１つの esiRNA で済むため コストパフォーマンスの高い RNAi スクリーニングツールです 導入には通常のトランスフェクション試薬をご利用いただけます 豊富なプレデザイン ヒト遺伝子 16741 クローンマウス遺伝子 14068 クローンから構成されるプレデザイン済ライブラリー

です

target mRNA

siRNAは各ターゲットへの相対濃度が高く（20 μM）オフターゲット効果のリスクが高い

esiRNAは各ターゲットへの相対濃度が低く（50 pM）オフターゲット効果のリスクが低い

21bp

Off-target CBA

target region

target mRNA

300-600bptarget region

5rsquo 3rsquo 5rsquo 3rsquo

Off-target CBA CBA CBA

siRNA と esiRNA の作用機序比較

siRNA標的

標的デザイン（鎖長）

作用単位

オフターゲット効果

esiRNA

サイレンシングにおける siRNA と esiRNA の特異性比較

KIAA1387（矢印）に対する siRNA または esiRNA を細胞に導入した後遺伝子発現量の変化をマイクロアレイを用いて解析した発現量が優位（plt001）に変動した遺伝子は赤（発現上昇）と青（発現低下）で示したsiRNA を導入した場合ターゲット以外の多くの遺伝子が変動していることがわかった（黄色）各 siRNA またはesiRNA のノックダウン効率は右側に示した

sigmacomesiRNA

esiRNA

31

2 蛍光色を利用したウェスタンブロッティングによるノックダウン検証

Hela 細胞へ各ターゲット mRNA に対する esiRNA を導入した 72 時間後にウェスタンブロットにより発現量を測定した各シグナルデータは Odyssey imaging system（Li-COR）によって取得しコントロール（GAPDH or tubulin）によってノーマライズした緑がターゲット mRNA を示す

個別 esiRNA製品番号 生物種

（Xは数字） 個別 esiRNAEHUXXXXXX Human 16000種以上EMUXXXXXX Mouse 14000種以上

各クローンのバリデーション情報については別途お問い合わせください

容量 価格20μg yen2800050μg yen50000

esiFlex ホールゲノムライブラリーについてはお問合せください

各ターゲットに対する製品情報は弊社ウェブサイトから検索いただけますターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です

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sigmacomjapan

esiRNA による表現型スクリーニング実施例

左では RLUC（コントロール）に対する esiRNA右ではモータータンパク質 Eg5 をコードする遺伝子（KIF11）に対する esiRNAそれぞれ 30 ng を Hela 細胞に導入したEG5 がノックダウンされた細胞では紡錘体の形成不全となり有糸分裂が停止した（矢印）写真は esiRNA 導入 48 時間後の細胞の明視野像

MISSIONreg esiRNA 製品フォーマット ラインナップ個別esiRNA プレートesiRNA カスタムesiRNA（esiFlex） ホールゲノムライブラリー

生物種 ヒトマウス

ヒトマウス

ヒトマウス

ヒトマウス

容量 20 μg（2 nmol）50 μg（5 nmol）

20 μg（2 nmol）50 μg（5 nmol）

10 μg（01 nmol）25 μg（025 nmol）50 μg（05 nmol）

10 μg（01 nmol）25 μg（025 nmol）50 μg（05 nmol）

フォーマット 2 mLチューブ 96wellプレート 96wellプレート 384wellプレートプレート esiRNA は 20 本以上esiFlex は 50 本以上からご注文が可能です

Controls製品番号 製品名 容量

Negative Controls

EHUEGFP esiRNA targeting EGFP 20 μg 50 μgEHUFLUC esiRNA targeting FLUC 20 μg 50 μgEHURLUC esiRNA targeting RLUC 20 μg 50 μgPositive Control

EHU019931 esiRNA targeting human KIF11 20 μg 50 μgEMU017691 esiRNA targeting mouse KIF11 20 μg 50 μg

KIF11 以外にも LAMIN APLK4 や AURKB など多数の遺伝子がmRNA またはタンパクレベルでバリデーションされています詳細はお問い合わせください

参考文献1 Krastev D B et al (2011) A systematic RNAi synthetic interaction screen reveals a link between p53 and snoRNP assembly Nat Cell Biol

13(7) 809-818 (PMID 21642980)2 Lin Z P et al (2011) Reduced level of ribonucleotide reductase R2 subunits increases dependence on homologous recombination repair of

cisplatin-induced DNA damage Mol Pharmacol 80(6) 1000-1012 (PMID 21875941)3 Nitzsche A et al (2011) RAD21 cooperates with pluripotency transcription factors in the maintenance of embryonic stem cell identity PLoS

One 6(5) e19470 (PMID 21589869)

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esiRNA

30

確実なノックダウンかつ低オフターゲット効果リスクMISSIONreg esiRNA（プール型siRNA）MISSION esiRNA（endoribonuclease prepared siRNA）は1 つの mRNA ターゲットに対する複数（数百種類）の異なるsiRNA がミックスされたプール型の siRNA でありRNAi スクリーニングにおいて シンプル経済的で確実な方法です16000 以上のヒト遺伝子14000 以上のマウス遺伝子を対象としたライブラリーであり個別の遺伝子以外にホールゲノムライブラリーカスタムライブラリーとしても提供可能です

特長 低いオフターゲット 同一の mRNA に対する siRNA が多数含まれています (200-300 duplex) 複数の siRNA が低濃度で同時に作用するためオフターゲット効果が低減されます 経済的 アッセイが１つの mRNA ターゲットにつき１つの esiRNA で済むため コストパフォーマンスの高い RNAi スクリーニングツールです 導入には通常のトランスフェクション試薬をご利用いただけます 豊富なプレデザイン ヒト遺伝子 16741 クローンマウス遺伝子 14068 クローンから構成されるプレデザイン済ライブラリー

です

target mRNA

siRNAは各ターゲットへの相対濃度が高く（20 μM）オフターゲット効果のリスクが高い

esiRNAは各ターゲットへの相対濃度が低く（50 pM）オフターゲット効果のリスクが低い

21bp

Off-target CBA

target region

target mRNA

300-600bptarget region

5rsquo 3rsquo 5rsquo 3rsquo

Off-target CBA CBA CBA

siRNA と esiRNA の作用機序比較

siRNA標的

標的デザイン（鎖長）

作用単位

オフターゲット効果

esiRNA

サイレンシングにおける siRNA と esiRNA の特異性比較

KIAA1387（矢印）に対する siRNA または esiRNA を細胞に導入した後遺伝子発現量の変化をマイクロアレイを用いて解析した発現量が優位（plt001）に変動した遺伝子は赤（発現上昇）と青（発現低下）で示したsiRNA を導入した場合ターゲット以外の多くの遺伝子が変動していることがわかった（黄色）各 siRNA またはesiRNA のノックダウン効率は右側に示した

sigmacomesiRNA

esiRNA

31

2 蛍光色を利用したウェスタンブロッティングによるノックダウン検証

Hela 細胞へ各ターゲット mRNA に対する esiRNA を導入した 72 時間後にウェスタンブロットにより発現量を測定した各シグナルデータは Odyssey imaging system（Li-COR）によって取得しコントロール（GAPDH or tubulin）によってノーマライズした緑がターゲット mRNA を示す

個別 esiRNA製品番号 生物種

（Xは数字） 個別 esiRNAEHUXXXXXX Human 16000種以上EMUXXXXXX Mouse 14000種以上

各クローンのバリデーション情報については別途お問い合わせください

容量 価格20μg yen2800050μg yen50000

esiFlex ホールゲノムライブラリーについてはお問合せください

各ターゲットに対する製品情報は弊社ウェブサイトから検索いただけますターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です

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sigmacomjapan

esiRNA による表現型スクリーニング実施例

左では RLUC（コントロール）に対する esiRNA右ではモータータンパク質 Eg5 をコードする遺伝子（KIF11）に対する esiRNAそれぞれ 30 ng を Hela 細胞に導入したEG5 がノックダウンされた細胞では紡錘体の形成不全となり有糸分裂が停止した（矢印）写真は esiRNA 導入 48 時間後の細胞の明視野像

MISSIONreg esiRNA 製品フォーマット ラインナップ個別esiRNA プレートesiRNA カスタムesiRNA（esiFlex） ホールゲノムライブラリー

生物種 ヒトマウス

ヒトマウス

ヒトマウス

ヒトマウス

容量 20 μg（2 nmol）50 μg（5 nmol）

20 μg（2 nmol）50 μg（5 nmol）

10 μg（01 nmol）25 μg（025 nmol）50 μg（05 nmol）

10 μg（01 nmol）25 μg（025 nmol）50 μg（05 nmol）

フォーマット 2 mLチューブ 96wellプレート 96wellプレート 384wellプレートプレート esiRNA は 20 本以上esiFlex は 50 本以上からご注文が可能です

Controls製品番号 製品名 容量

Negative Controls

EHUEGFP esiRNA targeting EGFP 20 μg 50 μgEHUFLUC esiRNA targeting FLUC 20 μg 50 μgEHURLUC esiRNA targeting RLUC 20 μg 50 μgPositive Control

EHU019931 esiRNA targeting human KIF11 20 μg 50 μgEMU017691 esiRNA targeting mouse KIF11 20 μg 50 μg

KIF11 以外にも LAMIN APLK4 や AURKB など多数の遺伝子がmRNA またはタンパクレベルでバリデーションされています詳細はお問い合わせください

参考文献1 Krastev D B et al (2011) A systematic RNAi synthetic interaction screen reveals a link between p53 and snoRNP assembly Nat Cell Biol

13(7) 809-818 (PMID 21642980)2 Lin Z P et al (2011) Reduced level of ribonucleotide reductase R2 subunits increases dependence on homologous recombination repair of

cisplatin-induced DNA damage Mol Pharmacol 80(6) 1000-1012 (PMID 21875941)3 Nitzsche A et al (2011) RAD21 cooperates with pluripotency transcription factors in the maintenance of embryonic stem cell identity PLoS

One 6(5) e19470 (PMID 21589869)

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esiRNA

31

2 蛍光色を利用したウェスタンブロッティングによるノックダウン検証

Hela 細胞へ各ターゲット mRNA に対する esiRNA を導入した 72 時間後にウェスタンブロットにより発現量を測定した各シグナルデータは Odyssey imaging system（Li-COR）によって取得しコントロール（GAPDH or tubulin）によってノーマライズした緑がターゲット mRNA を示す

個別 esiRNA製品番号 生物種

（Xは数字） 個別 esiRNAEHUXXXXXX Human 16000種以上EMUXXXXXX Mouse 14000種以上

各クローンのバリデーション情報については別途お問い合わせください

容量 価格20μg yen2800050μg yen50000

esiFlex ホールゲノムライブラリーについてはお問合せください

各ターゲットに対する製品情報は弊社ウェブサイトから検索いただけますターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です

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esiRNA による表現型スクリーニング実施例

左では RLUC（コントロール）に対する esiRNA右ではモータータンパク質 Eg5 をコードする遺伝子（KIF11）に対する esiRNAそれぞれ 30 ng を Hela 細胞に導入したEG5 がノックダウンされた細胞では紡錘体の形成不全となり有糸分裂が停止した（矢印）写真は esiRNA 導入 48 時間後の細胞の明視野像

MISSIONreg esiRNA 製品フォーマット ラインナップ個別esiRNA プレートesiRNA カスタムesiRNA（esiFlex） ホールゲノムライブラリー

生物種 ヒトマウス

ヒトマウス

ヒトマウス

ヒトマウス

容量 20 μg（2 nmol）50 μg（5 nmol）

20 μg（2 nmol）50 μg（5 nmol）

10 μg（01 nmol）25 μg（025 nmol）50 μg（05 nmol）

10 μg（01 nmol）25 μg（025 nmol）50 μg（05 nmol）

フォーマット 2 mLチューブ 96wellプレート 96wellプレート 384wellプレートプレート esiRNA は 20 本以上esiFlex は 50 本以上からご注文が可能です

Controls製品番号 製品名 容量

Negative Controls

EHUEGFP esiRNA targeting EGFP 20 μg 50 μgEHUFLUC esiRNA targeting FLUC 20 μg 50 μgEHURLUC esiRNA targeting RLUC 20 μg 50 μgPositive Control

EHU019931 esiRNA targeting human KIF11 20 μg 50 μgEMU017691 esiRNA targeting mouse KIF11 20 μg 50 μg

KIF11 以外にも LAMIN APLK4 や AURKB など多数の遺伝子がmRNA またはタンパクレベルでバリデーションされています詳細はお問い合わせください

参考文献1 Krastev D B et al (2011) A systematic RNAi synthetic interaction screen reveals a link between p53 and snoRNP assembly Nat Cell Biol

13(7) 809-818 (PMID 21642980)2 Lin Z P et al (2011) Reduced level of ribonucleotide reductase R2 subunits increases dependence on homologous recombination repair of

cisplatin-induced DNA damage Mol Pharmacol 80(6) 1000-1012 (PMID 21875941)3 Nitzsche A et al (2011) RAD21 cooperates with pluripotency transcription factors in the maintenance of embryonic stem cell identity PLoS

One 6(5) e19470 (PMID 21589869)

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esiRNA

32

MISSION esiRNA Long-Non Coding RNA は Long Non-coding RNA をターゲットとした RNAi 試薬です esiRNA は多数のsiRNA がプールされているためオフターゲット効果を低減し経済的に RNAi スクリーニングを行うことが可能なツールですesiRNA 製品の特長は 30 ページをご参照ください

特長マウスライブラリーは 643 クローンヒトライブラリーは 1245 クローンの esiRNA を含有 esiRNA のデザインには DEQOR デザインアルゴリズムを使用

DAPI + mouse IncRNAmouse IncRNA

マウス lncRNA に対する FISH の結果マウスの細胞にネガティブコントロール（top）lncRNA（bottom）に対する esiRNA を導入したパネルの右側は DAPI による染色

DAPI + mouse IncRNAmouse IncRNA

ヒト lncRNA に対する FISH の 結 果Hela 細 胞 にネガティブコントロ ール（top）lncRNA（bottom）に対する esiRNA を導入したパネルの左側は DAPI による染色

sigmacomncesirna

個別 esiRNA製品番号 生物種

（Xは数字） 個別 esiRNAEHNCXXXXX Human 1245種EMNCXXXXX Mouse 643種

容量 価格20μg yen2800050μg yen50000

全てのクローンをライブラリーとしてご提供することも可能 です詳細はお問い合わせください

コントロール製品番号 製品名 容量

Negative ControlsEHUEGFP esiRNA targeting EGFP 20 μg 50 μgEHUFLUC esiRNA targeting FLUC 20 μg 50 μgEHURLUC esiRNA targeting RLUC 20 μg 50 μgPositive ControlEHU019931 esiRNA targeting human KIF11 20 μg 50 μgEHU017691 esiRNA targeting mouse KIF11 20 μg 50 μg

バリデーション済みクローンについては別途お問い合わせください

参考文献1 Chakraborty D et al (2012) Combined RNAi and localization for functionally dissecting long noncoding RNAs Nat Methods 9(4) 360-362

(PMID 22327834)

lncRNAノックダウン用MISSIONreg esiRNAMISSION esiRNA for Long Non-Coding RNA

ご注文情報

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sigmacomjapan

miRNA

33

MISSION microRNA Mimics は成熟 miRNA として機能するようにデザインされたmiRNA の機能解析に適した合成二本鎖オリゴヌクレオチドですです特殊な修飾とデザインによりパッセンジャー鎖のオフターゲット効果が低減されています

特長特殊な修飾とデザインによるオフターゲット効果の減少他の生物種や異なるバージョンの miRBase に対する

カスタムデザインも対応可能

MISSION miRNA ミミックのデザイン

3 rsquo- d Td TACCU U UAC AU U CCU U C AC AC ACC - N H 2-5rsquo

5rsquo- U G G - A AU G UA AGGA AG U GUGUGG - 3 rsquo

Extra base creates bulge

3 rsquo5rsquo

AmineSense strand

Anti-sense strand

特長的なデザインと修飾によりセンス鎖によるオフターゲット効果を低減するよう設計されている

MISSION microRNA Mimic製品名 生物種 製品番号 容量 価格

Individual clonesMISSION human microRNA mimic

（ターゲットmiRNAをご検索ください）human HMIxxxx 5 nmol yen39800

Negative controlControl 1 A thaliana HMC0002

5 nmol yen39800Control 2 C elegans HMC0003LibraryMISSION microRNA Mimics Human Library human MI00300 025 nmol

each yen1599800

納期は在庫状況により異なりますご発注時にご確認ください

MISSION miRNA ミミックによるノックダウン例

0

20

40

60

80

100

120

1 101 206 15a 29a 10a 221 155 20a 21 27a 130a

R

epor

ter E

xpre

ssio

n

Negative ControlmiR-X

HeLa 細胞へ任意の miRNA Mimics と miRNA のターゲット配列を含んだ psi-CHECK2 Dual Luciferase Reporter（Promega）を導入したそれぞれのコンストラクトにはmiRNA のターゲット配列と 100 相補的な配列を含む3rsquo UTR の全長が組み込まれているネガティブコントロールはヒトのゲノム 転写産物に対応していない miRNA を使用した

MISSION miRNA ミミックの低オフターゲット効果

0

20

40

60

80

100

120

siDesign (+) siDesign (-) MISSION (+) MISSION (-)

R

epor

ter A

ctiv

ity

Negative Control~95

hsa-miR-206 に対応する miRNA Mimics を用いパッセンジャー鎖のオフターゲット効果を検証した従来の siRNA デザイン（siDesign）で設計した配列に対し修飾（siDesign＋）と非修飾（siDesign －）を作製また MISSION miRNA Mimics デザイン（MISSION）で設計した配列についても修飾（MISSION ＋）と非修飾（MISSION －）を作製しそれぞれのオフターゲット効果を検証したレポーターはパッセンジャー鎖に 95 相同的な配列を含んでいるMISSION miRNA Mimics で使用されているデザインと修飾がオフターゲットの低減に効果的であった

成熟microRNAミミックMISSIONreg microRNA Mimics

他の生物種に対するデザイン各種修飾in vivo 用途なども承りますお気軽にお問い合わせください

参考文献1 Collino F et al (2010) Microvesicles derived from adult human bone marrow and tissue specific mesenchymal stem cells shuttle selected

pattern of miRNAs PLoS One 5(7) e11803 (PMID 20668554)2 Schultz N et al (2011) Off-target effects dominate a large-scale RNAi screen for modulators of the TGF-β pathway and reveal microRNA

regulation of TGFBR2 Silence 2 3 (PMID 21401928)

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sigmacomjapan

miRNA

34

他の生物種に対するデザイン各種修飾in vivo 用途なども承りますお気軽にお問い合わせください

MISSION miRNA インヒビターはmiRNA と相補的な配列を有し効率的且つ特異的に miRNA 活性を抑制する Synthetic Tough Decoy（S-TuD）RNA ですS-TuD RNA はヌクレアーゼ耐性の修飾を持つ合成２本鎖 RNA で導入細胞内で長期間機能しますS-TuD RNA は東京大学医科学研究所 伊庭英夫教授らによって開発された技術です

sigmacomsyninhibitor

MISSION 合成 miRNA インヒビター模式図

STEM I STEM II

miRNA binding site (MBS)

Synthetic miRNA inhibitor は 2 種類の 2 本鎖領域 (STEM I II) 及び miRNA 結合領域 (MBS) で構成され1 分子中に 2 つの MBS を有する合成二本鎖 RNA 分子であるRNA は 2lsquo-O- メチル化されておりヌクレアーゼ耐性である

0

5

10

15

20

25

30

35

10nM 1nM

Repo

rter

Exp

ress

ion

(Ren

illa

RFU

Fi

rey

RFU

)

Inhibitor Concentration

Inhibition of miR-191-5p

Sigma

Competitor 1

Competitor 2

Hela 細胞へ各社の miRNA インヒビターおよび hsa-miR-191-5p と相補的な配列を組み込んだ psi-CHECK2 Dual Luciferase Reporter（Promega）を導入した48 時間後にルシフェラーゼの発現を測定しmiRNA 活性の抑制効果を比較した

製品情報

製品名 生物種 製品番号 容量 価格

MISSION Synthetic miRNA inhibitor 個別クローン（ターゲットmiRNAに対するクローンをご検索ください）

Human HSTUDxxxx

5 nmol

yen 32000

Mouse MSTUDxxxx yen 32000

MISSION synthetic miRNA inhibitor negative control 1 A thaliana NCSTUD001 yen 32000

MISSION synthetic miRNA inhibitor negative control 2 C elegans NCSTUD002 yen 32000

カスタム ndash ndash ndash お問い合わせください

参考文献1 Haraguchi T et al (2009) Vectors expressing efficient RNA

decoys achieve the long-term suppression of specific microRNA activity in mammalian cells Nucleic Acids Res 37(6) e43 (PMID 19223327)

2 Haraguchi T et al (2012) A potent 2-O-methylated RNA-based microRNA inhibitor with unique secondary structures Nucleic Acids Res 40(8) e58 (PMID 22259037)

MISSION 合成 microRNA インヒビターによる標的 miRNAの機能抑制

00

50

100

150

200

250

Let-7c 20b-5p 21-5p 27a-3p 101-3p 125a-5p

Repo

rter

Exp

ress

ion

(Ren

illa

Fire

fly)

miRNA InhibitorNegative Control

Dual Luciferase Assay Hela Synthetic miRNA Inhibitor Cell LinesHela 細 胞 へ miRNA inhibitor および miRNA に対するルシフェラー ゼ レポーター

（Promega）を同時に導入したmiRNA inhibitor を導入した場合ルシフェラーゼの発光がコントロールに比べ優位に高かった

MISSIONreg合成microRNAインヒビターMISSION Synthetic microRNA Inhibitor

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miRNA

35

参考文献1 Haraguchi T et al (2009) Vectors expressing efficient RNA decoys achieve the long-term suppression of specific microRNA activity in

mammalian cells Nucleic Acids Res 37(6) e43 (PMID 19223327)

MISSION レンチウイルス型 miRNA インヒビターはmiRNA と相補的な配列を有し効率的且つ特異的に miRNA 活性を抑制する Tough Decoy（TuD）RNA を細胞内で発現させるための製品ですレンチウイルスフォーマットであるため目的細胞への導入を効率的に行うことが可能ですTuD RNA は東京大学医科学研究所 伊庭英夫教授らによって開発された技術です

MISSION レンチウイルス型 miRNA インヒビター模式図

STEM I STEM II

miRNA binding site (MBS)

Lenti miRNA inhibitor は 2 種類の2 本鎖領域（STEM III）及びmiRNA 結合領域 （MBS）で構成され1 分子中に 2 つの MBS を有する一本鎖 RNA 分子である

MISSION レンチウイルス型 miRNA インヒビターの発現機構

hU6 promoter

Integrated lentiviral miRNA inhibitor cassette

Expression of miRNA inhibitor

miRNA inhibitor

miRNA inhibitor bound to miRNAs

レンチウイルスによって目的細胞のゲノムに導入された Lenti miRNA inhibitor はヒトU6 プロモーターにより転写され各 miRNA 特異的にデザインされた MBS によって任意の miRNA の活性が抑制される

製品情報

製品名 生物種 製品番号 フォーマット 価格

MISSION Lenti miRNA inhibitor 個別クローン（ターゲットmiRNAに対するクローンをご検索ください）

Human HLTUDxxxx

レンチウイルス≧ 1x106 TUmL 02 mL

yen 100000

Mouse MLTUDxxxx yen 100000

MISSION Lenti miRNA inhibitor negative control 1 A thaliana HLTUD001C yen 100000

MISSION Lenti miRNA inhibitor negative control 2 C elegans HLTUD002C yen 100000

カスタム ndash ndash ndash お問い合わせください

MISSIONregレンチウイルス型microRNAインヒビターMISSION Lenti microRNA Inhibitor

Validation of Lenti miRNA Inhibitors by Dual Luciferase Assay

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

miRNA 206 inhibitorControl

Not

ch3

mRN

A E

xpre

ssio

n

Renilla

Fire

fly L

ucife

rase

Lum

ines

cenc

e

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Control

miRNA 222 inhibito

r

miRNA 206 inhibito

r

miRNA 125a inhibito

r

Control

Control

Dual Luciferase Assay Hela Lenti miRNA Inhibitor Cell Lines任意の Lenti miRNA inhibitor を導入した Hela 細胞を 2 週間培養した後それぞれの miRNA 配列を挿入したルシフェラーゼレポーター（Promega）を導入したmiRNA inhibitor を導入することによってルシフェラーゼの発光は優位に上昇した

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miRNA

35

参考文献1 Haraguchi T et al (2009) Vectors expressing efficient RNA decoys achieve the long-term suppression of specific microRNA activity in

mammalian cells Nucleic Acids Res 37(6) e43 (PMID 19223327)

MISSION レンチウイルス型 miRNA インヒビターはmiRNA と相補的な配列を有し効率的且つ特異的に miRNA 活性を抑制する Tough Decoy（TuD）RNA を細胞内で発現させるための製品ですレンチウイルスフォーマットであるため目的細胞への導入を効率的に行うことが可能ですTuD RNA は東京大学医科学研究所 伊庭英夫教授らによって開発された技術です

MISSION レンチウイルス型 miRNA インヒビター模式図

STEM I STEM II

miRNA binding site (MBS)

Lenti miRNA inhibitor は 2 種類の2 本鎖領域（STEM III）及びmiRNA 結合領域 （MBS）で構成され1 分子中に 2 つの MBS を有する一本鎖 RNA 分子である

MISSION レンチウイルス型 miRNA インヒビターの発現機構

hU6 promoter

Integrated lentiviral miRNA inhibitor cassette

Expression of miRNA inhibitor

miRNA inhibitor

miRNA inhibitor bound to miRNAs

レンチウイルスによって目的細胞のゲノムに導入された Lenti miRNA inhibitor はヒトU6 プロモーターにより転写され各 miRNA 特異的にデザインされた MBS によって任意の miRNA の活性が抑制される

製品情報

製品名 生物種 製品番号 フォーマット 価格

MISSION Lenti miRNA inhibitor 個別クローン（ターゲットmiRNAに対するクローンをご検索ください）

Human HLTUDxxxx

レンチウイルス≧ 1x106 TUmL 02 mL

yen 100000

Mouse MLTUDxxxx yen 100000

MISSION Lenti miRNA inhibitor negative control 1 A thaliana HLTUD001C yen 100000

MISSION Lenti miRNA inhibitor negative control 2 C elegans HLTUD002C yen 100000

カスタム ndash ndash ndash お問い合わせください

MISSIONregレンチウイルス型microRNAインヒビターMISSION Lenti microRNA Inhibitor

Validation of Lenti miRNA Inhibitors by Dual Luciferase Assay

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

miRNA 206 inhibitorControl

Not

ch3

mRN

A E

xpre

ssio

n

Renilla

Fire

fly L

ucife

rase

Lum

ines

cenc

e

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Control

miRNA 222 inhibito

r

miRNA 206 inhibito

r

miRNA 125a inhibito

r

Control

Control

Dual Luciferase Assay Hela Lenti miRNA Inhibitor Cell Lines任意の Lenti miRNA inhibitor を導入した Hela 細胞を 2 週間培養した後それぞれの miRNA 配列を挿入したルシフェラーゼレポーター（Promega）を導入したmiRNA inhibitor を導入することによってルシフェラーゼの発光は優位に上昇した

各ターゲットに対する製品情報は弊社ウェブサイトから検索いただけますターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です

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sigmacomjapan

miRNA

36

特長 網羅的なターゲット 3 UTR スクリーニング

約 20000 種類の Human cDNA が組み込まれたライブラリー網羅的な UTR 領域のスクリーニングが簡単に行えます

効率的ポジティブ ネガティブセレクションを組合せバックグラウンドを抑えた UTR スクリーニングが可能です

カタログ番号 Kit components 価格

MREH01-1SET Target ID Library（200 μL1 μgμL）Target ID Amplification Primer 1（200 μL25 μM）Target ID Amplification Primer 2（200 μL25 μM）

yen600000

MISSION Target ID Library Vector Overview

4878 SnaBI

BamHI1SmaI7PstI13EcoRI19HindIII31

p3rsquoTKzeo5190 bps

SnaBI279

PstI786

TKzeo

3485 ScaI

SI1624SI1637

EcoRI1672PvuII1762

PvuII2296

4169 SspI

CMV5000

1000

20003000

4000

polyA

SmaI267

4539 SpeI

4302 Bg1II

MISSION Target ID Library ワークフロー

MISSION Target ID Library Transfection細胞に Target ID を導入します（約 3-5 日）

Zeocin Selection （Positive Selection）ゼオシンによる細胞のセレクションを行います導入されているゼオシン耐性遺伝子によりTarget ID がゲノムに取り込まれた細胞のみがセレクションされます

幾つかの細胞においては内在性の miRNA がコンストラクトの3 UTR に作用しTKzeo を発現抑制してしまい死滅する場合があります興味のある miRNA が対象細胞において発現しておらずそれらの遺伝子ターゲットがポジティブセレクションにおいて選択可能である事が必要です

microRNA TransfectionTarget ID ライブラリ－が導入された細胞に目的の miRNA を導入します

Ganciclovir Selection （Negative Selection）安定発現株が得られたらガンシクロビル処理を行ないますガンシクロビルの存在下でHSV チミジンキナーゼ（HSVTK）が作用すると細胞は死滅しますこれに対し対象 miRNA が 3 UTR のターゲットサイトと作用し TKzeo が制御されるとガンシクロビル耐性となります

PCR and Sequencingターゲット同定のためゲノム抽出後にキット付属のプライマーを利用して増幅しシーケンス解析によって配列を同定します

MISSION Target ID Library Transfection

Zeocin selection (Positive Selection)

microRNA transfection

PCR and Sequencing

Ganciclovir selection(Negative Selection)

sigmacomtargetid

ヒトmiRNAターゲット網羅的探索用3 UTRライブラリーMISSIONreg Target ID Library

参考文献1 Gaumlken J et al (2012) A functional assay for microRNA target identification and validation Nucleic Acids Res 40(10) e75 (PMID 22323518)

miRNA

37

ヒトmiRNAターゲット確認用3 UTRクローンMISSIONreg 3 UTR Lenti GoClonetrade

クローニングされた 10000 種類以上のクローンSigmareg レンチウイルスシステムに導入された Human 3rsquo UTRシグマ アルドリッチと SwitchGear Genomicstradeは MISSION 3rsquo UTR Lenti GoClone 製品において提携を結びましたSwitchGear の持つルシフェラーゼレポーターと 3rsquo UTRを導入したプレクローンのブランド『GoClone』とシグマ アルドリッチの MISSION レンチウイルスデリバリーシステムの組み合わせがより簡便で確実な細胞導入に成功しました

Convenienceクローニング済みなので即時トランスフェクション可能

Flexibilityトランスフェクションの難しい細胞や分化した細胞への導入がレンチウイルスデリバリーで可能

Experimental consistency簡便に安定発現細胞株を作製可能

Quality優れた性能を提供する経験に基づいた最高のウイルス品質

Optimized最適化されたウミシイタケルシフェラーゼレポーターによる高感度化

sigmacomlentigoclone

MISSION 3rsquo UTR Lenti GoClone Vector Map

pLSG_UTR_RenSP7895 bp

PGK promoter

Puro

Amp

LTR

LTR

poly A

ori

RRE

RenSP

RPL 10prom

3 UTR

製品名 カタログ番号 フォーマット 価格個別クローン（対象クローンはご検索ください） HUTRｘｘｘｘｘ

≧1x106TUmL 02 mL

yen70000MISSION 3 UTR Lenti Housekeeping Control （GAPDH） HUTR001C yen70000MISSION 3 UTR Lenti Empty Vector Control HUTR002C yen70000MISSION 3 UTR Lenti Non-target Control 1 （random） HUTR003C yen70000MISSION 3 UTR Lenti Non-target Control 2 （random） HUTR004C yen70000MISSION LightSwitch Luciferase Assay Reagent MLS0001-1KT 100 assays yen23600

製品概要

cPPT

SHC203(TRC2-pLKO-puro

Turbo GFPtrade)8802 bp

hPGK

puroR

pUC ori

RRESIN3rsquo LTR

RSV5 LTR

U6

f1 ori

ampR

(Ψ) Psi

WPRE

TurboGFPtrade

CMV

miRNA mimicor

non-targeting control

transduce

integrate

expressinhibit

transfect

hibit

Light output withmiRNA mimic

Light outputwith control

Specic activity of miRNA mimic on target UTR

MISSION 3rsquoUTRLenti GoClone Vector

pLSG_UTR_RenSP

promoter

luciferase 3rsquoUTR

Lenti GoClone viral particle

RISC complex

Hybrid LUC-3rsquoUTR Transcript

1 目的細胞に選択した MISSION 3rsquo UTR Lenti GoClone を導入2 導入プロモーターによりLUC-3rsquo UTR ハイブリットコンストラクトが発現しますRenSP

（最適化された Renilla Luciferase レポーター）はルシフェラーゼ基質の導入により発光します

3 ここに MISSION miRNA mimic をトランスフェクションします4 導 入 し た miRNA が GoClones の 3rsquo UTR と 特 異 的 に 相 互 作 用 を 起 こ す と

LUC-3rsquo UTR の発光が抑制されます5 ルシフェラーゼ基質の蛍光測定にはルミノメーターを使用します

miRNA

38

microRNA検出定量試薬microRNA cDNA 合成キット MystiCq microRNA Synthesis Kit

micoRNA 発現測定用プライマー MystiCq microRNA qPCR Primers

mature microRNA targetrsquo3rsquo5

AAAAAAAAAAAAAA

Poly(A) polymerasePoly(A)tailing

AAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAA

Reverse Transcriptase

oligo-dT adapter primercDNA synthesis

MystiCq microRNA specic-Assay Primer (or Control Primer)

Universal PCR primer

特長 対象生物種ヒトマウスラット バリデート済み 自己相補性プライマーダイマーの抑制を考慮したデザイン

製品名 製品番号 使用回数 価格

MystiCq microRNA qPCR Assay Primer MIRAPxxxxx 250RXN yen19100

MystiCq microRNA qPCR Control Primer MIRCPxxxxx 250RXN yen19100

MystiCq Universal PCR Primer MIRUP 500RXN yen19100

本キットにはmicroRNA を qPCR のテンプレートとするためのポリアデニル化及び逆転写に必要な試薬が全て含まれています

キット内容 Poly（A） Tailing Buffer （5x） Poly（A） Polymerase microRNA cDNA Reaction Mix Reverse Transcriptase Universal PCR Primer Human Control Primer （SNORD44） RNaseDNase-Free Water

製品名 製品番号 使用回数 価格

MystiCq microRNA cDNA Synthesis Mix MIRRT25RXN yen58000

100RXN yen191600

本製品はバリデーション済みの microRNA 特異的プライマーですMystiCq microRNA cDNA Synthesis Mix を用いて作製された cDNA サンプルから特異的な成熟 microRNA を検出するために用いるためのプレデザイン プライマーです

各ターゲットに対する製品情報は弊社ウェブサイトから検索いただけますターゲット遺伝子に関連する全ての製品を閲覧することが可能です

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sigmacomjapan

miRNA

39

SYBRreg Green qPCR Ready MixtradeReady Mix はホットスタート Taq ポリメラーゼを用いmicroRNA の検出に最適化された qPCR アッセイキットですリファレンス色素は各 qPCR 機器に最適化されています

製品名 製品番号 使用回数 価格

MystiCq microRNA SYBR Green qPCR ReadyMix MIRRM00100RXN yen50300500RXN yen216800

2000RXN yen764400

MystiCq microRNA SYBR Green qPCR ReadyMix Low ROXtrade MIRRM01100RXN yen50300500RXN yen216800

2000RXN yen764400

MystiCq microRNA SYBR Green qPCR ReadyMix with ROX MIRRM02100RXN yen50300500RXN yen216800

2000RXN yen764400

MystiCq microRNA SYBR Green qPCR ReadyMix iQtrade MIRRM03100RXN yen50300500RXN yen216800

2000RXN yen764400

qPCR機器適応表

Real-time PCR Instrument NameMystiCq microRNA SYBRGreen qPCR ReadyMixtrade

MystiCq microRNA SYBR GreenqPCR ReadyMix Low ROXtrade

MystiCq microRNA SYBR GreenqPCR ReadyMix with ROX

MystiCq microRNA SYBRGreen qPCR ReadyMix iQ

MIRRM00 MIRRM01 MIRRM02 MIRRM03Applied Biosystems 5700

Applied Biosystems 7000 Applied Biosystems 7300 Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems 7700 Applied Biosystems 7900 Applied Biosystems 7900 HT Fast Applied Biosystems 7900HT Applied Biosystems StepOnePlustrade Applied Biosystems StepOnetrade Applied Biosystems ViiA 7 Bio-Rad CFX384trade Bio-Rad CFX96trade Bio-Rad iCycler iQreg Bio-Rad iQtrade5 Bio-Rad MiniOpticontrade Bio-Rad MyiQtrade Bio-RadMJ Chromo4trade Bio-RadMJ Opticon 2 Bio-RadMJ Opticontrade Cepheid Smart Cyclerreg Eppendorf Mastercyclerreg ep realplex Eppendorf Mastercycler ep realplex2 s Illumina Eco qPCR QiagenCorbett Rotor-Genereg 3000 QiagenCorbett Rotor-Gene 6000 QiagenCorbett Rotor-Gene Q Roche LightCyclertrade 480 Stratagene Mx3000Preg Stratagene Mx3005Preg Stratagene Mx4000trade Takara Dicetrade Takara Smart Cycler

Agilent Mx3000P and Mx3005P are registered trademarks of Agilent Technologies Mx4000 is a trademark of Agilent Technologies ROX StepOne and StepOnePlus are trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US andor certain other countries CFX384 CFX96 Chromo4 iQ MiniOpticon MyiQ and Opticon are trademarks of Bio-Rad Laboratories Inc iCycler iQ is a registered trademark of Bio-Rad Laboratories Inc SmartCycler is a registered trademark of Cepheid Inc Mastercycler is a registered trademark of Eppendorf AG TagCFP TagFP635 TagRFP TagYFP and TurboGFP are trademarks of Evrogen Co Cy3 Cy5 and Cy55 are registered trademarks of GE Healthcare UK Limited SYBR is a registered trademark of Life Technologies Rotor-Gene is a registered trademark of Qiagen Group GoClone and SwitchGear Genomics are trademarks of SwitchGear Genomics Dice are trademarks of TAKARA BIO INC

お問合せは下記代理店へ

[RBM027]1706-3KF

本紙記載の製品は試験研究用ですヒト動物への治療もしくは診断目的として使用しないようご注意ください本紙記載の製品構成は諸般の事情により予告なく変更となる場合がありますのであらかじめご了承ください記載価格に消費税は含まれておりません本文中のすべてのブランド名または製品名は特記なき場合Sigma-Aldrich Co LLC の登録商標もしくは商標です本誌記載の内容は 2017 年 6 月時点の情報ですcopy2017 Sigma-Aldrich Co LLC All rights reserved

153-8927　東京都目黒区下目黒 1-8-1 アルコタワー 5F製品に関するお問い合わせは弊社テクニカルサービスへ TEL03-6756-8245　FAX03-6756-8302 E-mail sialjptssialcom在庫照会ご注文方法に関するお問い合わせは弊社カスタマーサービスへ TEL03-6756-8275　FAX03-6756-8301 E-mail sialjpcssialcom

wwwsigma-aldrichcomjapanシグマ アルドリッチ ジャパン合同会社はメルクのグループ会社です

ノックダウンやノックアウトのレスキュー検証にMISSIONreg TRC3 Human LentiORF コレクション

cDNA 合成はきわめて一般的な技術ですが適切な cDNA クローンの取得には多くの時間とコストが費やされる可能性がありますバイアスの発生につながりやすい複数のステップが必要になる可能性が高くクローニングされた配列の検証も必要ですまた突然変異の導入により望ましい転写産物を得るためのクローニング実験を繰り返さなくてはならない場合もありますMISSION TRC3 Human LentiORF コレクションは14000 を超えるヒト遺伝子を網羅する50000 を超えるクローニング済み ORF から構成されエントリーベクターブラストサイジン選択用ベクターピューロマイシン選択用ベクターという 3 種類の Gateway 適合ベクターにパッケージングされた全配列決定済み ORF の包括的コレクションですMISSION TRC3 ヒト LentiORF コレクションを活用し配列の検証PCRライゲーションをはじめとする時間のかかるクローニングステップを省いてください

LentiORFブラストサイジン選択用ベクターライブラリー特長MISSION TRC3 Blasticidin LibraryはCCSB-Broadライブラリー由来の

遺伝子及び拡張クローンからなる合計14000を超えるヒト遺伝子と16000を超える クローンを含有

ブラストサイジン耐性遺伝子（Bsd）を持ちORFのC末端側は特異抗体を用いて ウェスタンブロッティング免疫蛍光検出及び免疫沈降実験に利用できる V5-タグをコード

ほぼすべての哺乳類細胞に適用可能なCMVプロモーターベースの ORF過剰発現用コンストラクト

LentiORFエントリーベクターライブラリー特長hORFeome v81ライブラリー由来でカバーする合計ヒト遺伝子数は14000超

（クローンは16000超） 天然の終止コドンが除去されているORFGatewayシステム用（エントリーベクター）ライブラリーで異なるプロモーター

選択マーカー発色団テトラサイクリン発現調節系などを含む 様々なGateway適合発現ベクターに簡単かつ効率的に転移可能

製品名 対象 フォーマット 薬剤選択2 ご注文方法 希望販売価格MISSION TRC3 Human LentiORF Collection

レンチウイルスが感染可能な細胞

グリセロールストックプラスミドDNAまたはレンチウィルス粒子1から選択可能

ブラストサイジンまたはピューロマイシン

お問い合わせください お問い合わせください

1 LentiORF エントリーベクターライブラリーは大腸菌グリセロールストックあるいはプラスミド DNA フォーマットでのご提供となります 2 発現用ベクター（ブラストサイジン選択用ベクターならびにピューロマイシン選択用ベクター）のもつ哺乳類細胞選択用薬剤耐性遺伝子です

製品仕様ベクターマップ（pLX304）

LentiORFピューロマイシン選択用ライブラリー特長7000を超えるヒトORFのコレクションピューロマイシン耐性遺伝子（Pac）を持ちCMVプロモーターが

サイレンシングを受ける細胞での使用にも最適なEF1-αプロモーターを持つ 哺乳類細胞過剰発現用ベクター

プール型スクリーニングのアプリケーションに適合V5タグの下流には 24塩基のクローン固有バーコード配列と転写終止コドンが配置されており ヒット遺伝子の容易な同定が可能

製品仕様ベクターマップ（pDONR223）

製品仕様ベクターマップ（pLX317）

miRNA

38

microRNA検出定量試薬microRNA cDNA 合成キット MystiCq microRNA Synthesis Kit

micoRNA 発現測定用プライマー MystiCq microRNA qPCR Primers

mature microRNA targetrsquo3rsquo5

AAAAAAAAAAAAAA

Poly(A) polymerasePoly(A)tailing

AAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAA

Reverse Transcriptase

oligo-dT adapter primercDNA synthesis

MystiCq microRNA specic-Assay Primer (or Control Primer)

Universal PCR primer

特長 対象生物種ヒトマウスラット バリデート済み 自己相補性プライマーダイマーの抑制を考慮したデザイン

製品名 製品番号 使用回数 価格

MystiCq microRNA qPCR Assay Primer MIRAPxxxxx 250RXN yen19100

MystiCq microRNA qPCR Control Primer MIRCPxxxxx 250RXN yen19100

MystiCq Universal PCR Primer MIRUP 500RXN yen19100

本キットにはmicroRNA を qPCR のテンプレートとするためのポリアデニル化及び逆転写に必要な試薬が全て含まれています

キット内容 Poly（A） Tailing Buffer （5x） Poly（A） Polymerase microRNA cDNA Reaction Mix Reverse Transcriptase Universal PCR Primer Human Control Primer （SNORD44） RNaseDNase-Free Water

製品名 製品番号 使用回数 価格

MystiCq microRNA cDNA Synthesis Mix MIRRT25RXN yen58000

100RXN yen191600

本製品はバリデーション済みの microRNA 特異的プライマーですMystiCq microRNA cDNA Synthesis Mix を用いて作製された cDNA サンプルから特異的な成熟 microRNA を検出するために用いるためのプレデザイン プライマーです

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miRNA

39

SYBRreg Green qPCR Ready MixtradeReady Mix はホットスタート Taq ポリメラーゼを用いmicroRNA の検出に最適化された qPCR アッセイキットですリファレンス色素は各 qPCR 機器に最適化されています

製品名 製品番号 使用回数 価格

MystiCq microRNA SYBR Green qPCR ReadyMix MIRRM00100RXN yen50300500RXN yen216800

2000RXN yen764400

MystiCq microRNA SYBR Green qPCR ReadyMix Low ROXtrade MIRRM01100RXN yen50300500RXN yen216800

2000RXN yen764400

MystiCq microRNA SYBR Green qPCR ReadyMix with ROX MIRRM02100RXN yen50300500RXN yen216800

2000RXN yen764400

MystiCq microRNA SYBR Green qPCR ReadyMix iQtrade MIRRM03100RXN yen50300500RXN yen216800

2000RXN yen764400

qPCR機器適応表

Real-time PCR Instrument NameMystiCq microRNA SYBRGreen qPCR ReadyMixtrade

MystiCq microRNA SYBR GreenqPCR ReadyMix Low ROXtrade

MystiCq microRNA SYBR GreenqPCR ReadyMix with ROX

MystiCq microRNA SYBRGreen qPCR ReadyMix iQ

MIRRM00 MIRRM01 MIRRM02 MIRRM03Applied Biosystems 5700

Applied Biosystems 7000 Applied Biosystems 7300 Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems 7700 Applied Biosystems 7900 Applied Biosystems 7900 HT Fast Applied Biosystems 7900HT Applied Biosystems StepOnePlustrade Applied Biosystems StepOnetrade Applied Biosystems ViiA 7 Bio-Rad CFX384trade Bio-Rad CFX96trade Bio-Rad iCycler iQreg Bio-Rad iQtrade5 Bio-Rad MiniOpticontrade Bio-Rad MyiQtrade Bio-RadMJ Chromo4trade Bio-RadMJ Opticon 2 Bio-RadMJ Opticontrade Cepheid Smart Cyclerreg Eppendorf Mastercyclerreg ep realplex Eppendorf Mastercycler ep realplex2 s Illumina Eco qPCR QiagenCorbett Rotor-Genereg 3000 QiagenCorbett Rotor-Gene 6000 QiagenCorbett Rotor-Gene Q Roche LightCyclertrade 480 Stratagene Mx3000Preg Stratagene Mx3005Preg Stratagene Mx4000trade Takara Dicetrade Takara Smart Cycler

Agilent Mx3000P and Mx3005P are registered trademarks of Agilent Technologies Mx4000 is a trademark of Agilent Technologies ROX StepOne and StepOnePlus are trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US andor certain other countries CFX384 CFX96 Chromo4 iQ MiniOpticon MyiQ and Opticon are trademarks of Bio-Rad Laboratories Inc iCycler iQ is a registered trademark of Bio-Rad Laboratories Inc SmartCycler is a registered trademark of Cepheid Inc Mastercycler is a registered trademark of Eppendorf AG TagCFP TagFP635 TagRFP TagYFP and TurboGFP are trademarks of Evrogen Co Cy3 Cy5 and Cy55 are registered trademarks of GE Healthcare UK Limited SYBR is a registered trademark of Life Technologies Rotor-Gene is a registered trademark of Qiagen Group GoClone and SwitchGear Genomics are trademarks of SwitchGear Genomics Dice are trademarks of TAKARA BIO INC

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本紙記載の製品は試験研究用ですヒト動物への治療もしくは診断目的として使用しないようご注意ください本紙記載の製品構成は諸般の事情により予告なく変更となる場合がありますのであらかじめご了承ください記載価格に消費税は含まれておりません本文中のすべてのブランド名または製品名は特記なき場合Sigma-Aldrich Co LLC の登録商標もしくは商標です本誌記載の内容は 2017 年 6 月時点の情報ですcopy2017 Sigma-Aldrich Co LLC All rights reserved

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cDNA 合成はきわめて一般的な技術ですが適切な cDNA クローンの取得には多くの時間とコストが費やされる可能性がありますバイアスの発生につながりやすい複数のステップが必要になる可能性が高くクローニングされた配列の検証も必要ですまた突然変異の導入により望ましい転写産物を得るためのクローニング実験を繰り返さなくてはならない場合もありますMISSION TRC3 Human LentiORF コレクションは14000 を超えるヒト遺伝子を網羅する50000 を超えるクローニング済み ORF から構成されエントリーベクターブラストサイジン選択用ベクターピューロマイシン選択用ベクターという 3 種類の Gateway 適合ベクターにパッケージングされた全配列決定済み ORF の包括的コレクションですMISSION TRC3 ヒト LentiORF コレクションを活用し配列の検証PCRライゲーションをはじめとする時間のかかるクローニングステップを省いてください

LentiORFブラストサイジン選択用ベクターライブラリー特長MISSION TRC3 Blasticidin LibraryはCCSB-Broadライブラリー由来の

遺伝子及び拡張クローンからなる合計14000を超えるヒト遺伝子と16000を超える クローンを含有

ブラストサイジン耐性遺伝子（Bsd）を持ちORFのC末端側は特異抗体を用いて ウェスタンブロッティング免疫蛍光検出及び免疫沈降実験に利用できる V5-タグをコード

ほぼすべての哺乳類細胞に適用可能なCMVプロモーターベースの ORF過剰発現用コンストラクト

LentiORFエントリーベクターライブラリー特長hORFeome v81ライブラリー由来でカバーする合計ヒト遺伝子数は14000超

（クローンは16000超） 天然の終止コドンが除去されているORFGatewayシステム用（エントリーベクター）ライブラリーで異なるプロモーター

選択マーカー発色団テトラサイクリン発現調節系などを含む 様々なGateway適合発現ベクターに簡単かつ効率的に転移可能

製品名 対象 フォーマット 薬剤選択2 ご注文方法 希望販売価格MISSION TRC3 Human LentiORF Collection

レンチウイルスが感染可能な細胞

グリセロールストックプラスミドDNAまたはレンチウィルス粒子1から選択可能

ブラストサイジンまたはピューロマイシン

お問い合わせください お問い合わせください

1 LentiORF エントリーベクターライブラリーは大腸菌グリセロールストックあるいはプラスミド DNA フォーマットでのご提供となります 2 発現用ベクター（ブラストサイジン選択用ベクターならびにピューロマイシン選択用ベクター）のもつ哺乳類細胞選択用薬剤耐性遺伝子です

製品仕様ベクターマップ（pLX304）

LentiORFピューロマイシン選択用ライブラリー特長7000を超えるヒトORFのコレクションピューロマイシン耐性遺伝子（Pac）を持ちCMVプロモーターが

サイレンシングを受ける細胞での使用にも最適なEF1-αプロモーターを持つ 哺乳類細胞過剰発現用ベクター

プール型スクリーニングのアプリケーションに適合V5タグの下流には 24塩基のクローン固有バーコード配列と転写終止コドンが配置されており ヒット遺伝子の容易な同定が可能

製品仕様ベクターマップ（pDONR223）

製品仕様ベクターマップ（pLX317）

miRNA

39

SYBRreg Green qPCR Ready MixtradeReady Mix はホットスタート Taq ポリメラーゼを用いmicroRNA の検出に最適化された qPCR アッセイキットですリファレンス色素は各 qPCR 機器に最適化されています

製品名 製品番号 使用回数 価格

MystiCq microRNA SYBR Green qPCR ReadyMix MIRRM00100RXN yen50300500RXN yen216800

2000RXN yen764400

MystiCq microRNA SYBR Green qPCR ReadyMix Low ROXtrade MIRRM01100RXN yen50300500RXN yen216800

2000RXN yen764400

MystiCq microRNA SYBR Green qPCR ReadyMix with ROX MIRRM02100RXN yen50300500RXN yen216800

2000RXN yen764400

MystiCq microRNA SYBR Green qPCR ReadyMix iQtrade MIRRM03100RXN yen50300500RXN yen216800

2000RXN yen764400

qPCR機器適応表

Real-time PCR Instrument NameMystiCq microRNA SYBRGreen qPCR ReadyMixtrade

MystiCq microRNA SYBR GreenqPCR ReadyMix Low ROXtrade

MystiCq microRNA SYBR GreenqPCR ReadyMix with ROX

MystiCq microRNA SYBRGreen qPCR ReadyMix iQ

MIRRM00 MIRRM01 MIRRM02 MIRRM03Applied Biosystems 5700

Applied Biosystems 7000 Applied Biosystems 7300 Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems 7700 Applied Biosystems 7900 Applied Biosystems 7900 HT Fast Applied Biosystems 7900HT Applied Biosystems StepOnePlustrade Applied Biosystems StepOnetrade Applied Biosystems ViiA 7 Bio-Rad CFX384trade Bio-Rad CFX96trade Bio-Rad iCycler iQreg Bio-Rad iQtrade5 Bio-Rad MiniOpticontrade Bio-Rad MyiQtrade Bio-RadMJ Chromo4trade Bio-RadMJ Opticon 2 Bio-RadMJ Opticontrade Cepheid Smart Cyclerreg Eppendorf Mastercyclerreg ep realplex Eppendorf Mastercycler ep realplex2 s Illumina Eco qPCR QiagenCorbett Rotor-Genereg 3000 QiagenCorbett Rotor-Gene 6000 QiagenCorbett Rotor-Gene Q Roche LightCyclertrade 480 Stratagene Mx3000Preg Stratagene Mx3005Preg Stratagene Mx4000trade Takara Dicetrade Takara Smart Cycler

Agilent Mx3000P and Mx3005P are registered trademarks of Agilent Technologies Mx4000 is a trademark of Agilent Technologies ROX StepOne and StepOnePlus are trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US andor certain other countries CFX384 CFX96 Chromo4 iQ MiniOpticon MyiQ and Opticon are trademarks of Bio-Rad Laboratories Inc iCycler iQ is a registered trademark of Bio-Rad Laboratories Inc SmartCycler is a registered trademark of Cepheid Inc Mastercycler is a registered trademark of Eppendorf AG TagCFP TagFP635 TagRFP TagYFP and TurboGFP are trademarks of Evrogen Co Cy3 Cy5 and Cy55 are registered trademarks of GE Healthcare UK Limited SYBR is a registered trademark of Life Technologies Rotor-Gene is a registered trademark of Qiagen Group GoClone and SwitchGear Genomics are trademarks of SwitchGear Genomics Dice are trademarks of TAKARA BIO INC

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本紙記載の製品は試験研究用ですヒト動物への治療もしくは診断目的として使用しないようご注意ください本紙記載の製品構成は諸般の事情により予告なく変更となる場合がありますのであらかじめご了承ください記載価格に消費税は含まれておりません本文中のすべてのブランド名または製品名は特記なき場合Sigma-Aldrich Co LLC の登録商標もしくは商標です本誌記載の内容は 2017 年 6 月時点の情報ですcopy2017 Sigma-Aldrich Co LLC All rights reserved

153-8927　東京都目黒区下目黒 1-8-1 アルコタワー 5F製品に関するお問い合わせは弊社テクニカルサービスへ TEL03-6756-8245　FAX03-6756-8302 E-mail sialjptssialcom在庫照会ご注文方法に関するお問い合わせは弊社カスタマーサービスへ TEL03-6756-8275　FAX03-6756-8301 E-mail sialjpcssialcom

wwwsigma-aldrichcomjapanシグマ アルドリッチ ジャパン合同会社はメルクのグループ会社です

ノックダウンやノックアウトのレスキュー検証にMISSIONreg TRC3 Human LentiORF コレクション

cDNA 合成はきわめて一般的な技術ですが適切な cDNA クローンの取得には多くの時間とコストが費やされる可能性がありますバイアスの発生につながりやすい複数のステップが必要になる可能性が高くクローニングされた配列の検証も必要ですまた突然変異の導入により望ましい転写産物を得るためのクローニング実験を繰り返さなくてはならない場合もありますMISSION TRC3 Human LentiORF コレクションは14000 を超えるヒト遺伝子を網羅する50000 を超えるクローニング済み ORF から構成されエントリーベクターブラストサイジン選択用ベクターピューロマイシン選択用ベクターという 3 種類の Gateway 適合ベクターにパッケージングされた全配列決定済み ORF の包括的コレクションですMISSION TRC3 ヒト LentiORF コレクションを活用し配列の検証PCRライゲーションをはじめとする時間のかかるクローニングステップを省いてください

LentiORFブラストサイジン選択用ベクターライブラリー特長MISSION TRC3 Blasticidin LibraryはCCSB-Broadライブラリー由来の

遺伝子及び拡張クローンからなる合計14000を超えるヒト遺伝子と16000を超える クローンを含有

ブラストサイジン耐性遺伝子（Bsd）を持ちORFのC末端側は特異抗体を用いて ウェスタンブロッティング免疫蛍光検出及び免疫沈降実験に利用できる V5-タグをコード

ほぼすべての哺乳類細胞に適用可能なCMVプロモーターベースの ORF過剰発現用コンストラクト

LentiORFエントリーベクターライブラリー特長hORFeome v81ライブラリー由来でカバーする合計ヒト遺伝子数は14000超

（クローンは16000超） 天然の終止コドンが除去されているORFGatewayシステム用（エントリーベクター）ライブラリーで異なるプロモーター

選択マーカー発色団テトラサイクリン発現調節系などを含む 様々なGateway適合発現ベクターに簡単かつ効率的に転移可能

製品名 対象 フォーマット 薬剤選択2 ご注文方法 希望販売価格MISSION TRC3 Human LentiORF Collection

レンチウイルスが感染可能な細胞

グリセロールストックプラスミドDNAまたはレンチウィルス粒子1から選択可能

ブラストサイジンまたはピューロマイシン

お問い合わせください お問い合わせください

1 LentiORF エントリーベクターライブラリーは大腸菌グリセロールストックあるいはプラスミド DNA フォーマットでのご提供となります 2 発現用ベクター（ブラストサイジン選択用ベクターならびにピューロマイシン選択用ベクター）のもつ哺乳類細胞選択用薬剤耐性遺伝子です

製品仕様ベクターマップ（pLX304）

LentiORFピューロマイシン選択用ライブラリー特長7000を超えるヒトORFのコレクションピューロマイシン耐性遺伝子（Pac）を持ちCMVプロモーターが

サイレンシングを受ける細胞での使用にも最適なEF1-αプロモーターを持つ 哺乳類細胞過剰発現用ベクター

プール型スクリーニングのアプリケーションに適合V5タグの下流には 24塩基のクローン固有バーコード配列と転写終止コドンが配置されており ヒット遺伝子の容易な同定が可能

製品仕様ベクターマップ（pDONR223）

製品仕様ベクターマップ（pLX317）

お問合せは下記代理店へ

[RBM027]1706-3KF

本紙記載の製品は試験研究用ですヒト動物への治療もしくは診断目的として使用しないようご注意ください本紙記載の製品構成は諸般の事情により予告なく変更となる場合がありますのであらかじめご了承ください記載価格に消費税は含まれておりません本文中のすべてのブランド名または製品名は特記なき場合Sigma-Aldrich Co LLC の登録商標もしくは商標です本誌記載の内容は 2017 年 6 月時点の情報ですcopy2017 Sigma-Aldrich Co LLC All rights reserved

153-8927　東京都目黒区下目黒 1-8-1 アルコタワー 5F製品に関するお問い合わせは弊社テクニカルサービスへ TEL03-6756-8245　FAX03-6756-8302 E-mail sialjptssialcom在庫照会ご注文方法に関するお問い合わせは弊社カスタマーサービスへ TEL03-6756-8275　FAX03-6756-8301 E-mail sialjpcssialcom

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cDNA 合成はきわめて一般的な技術ですが適切な cDNA クローンの取得には多くの時間とコストが費やされる可能性がありますバイアスの発生につながりやすい複数のステップが必要になる可能性が高くクローニングされた配列の検証も必要ですまた突然変異の導入により望ましい転写産物を得るためのクローニング実験を繰り返さなくてはならない場合もありますMISSION TRC3 Human LentiORF コレクションは14000 を超えるヒト遺伝子を網羅する50000 を超えるクローニング済み ORF から構成されエントリーベクターブラストサイジン選択用ベクターピューロマイシン選択用ベクターという 3 種類の Gateway 適合ベクターにパッケージングされた全配列決定済み ORF の包括的コレクションですMISSION TRC3 ヒト LentiORF コレクションを活用し配列の検証PCRライゲーションをはじめとする時間のかかるクローニングステップを省いてください

LentiORFブラストサイジン選択用ベクターライブラリー特長MISSION TRC3 Blasticidin LibraryはCCSB-Broadライブラリー由来の

遺伝子及び拡張クローンからなる合計14000を超えるヒト遺伝子と16000を超える クローンを含有

ブラストサイジン耐性遺伝子（Bsd）を持ちORFのC末端側は特異抗体を用いて ウェスタンブロッティング免疫蛍光検出及び免疫沈降実験に利用できる V5-タグをコード

ほぼすべての哺乳類細胞に適用可能なCMVプロモーターベースの ORF過剰発現用コンストラクト

LentiORFエントリーベクターライブラリー特長hORFeome v81ライブラリー由来でカバーする合計ヒト遺伝子数は14000超

（クローンは16000超） 天然の終止コドンが除去されているORFGatewayシステム用（エントリーベクター）ライブラリーで異なるプロモーター

選択マーカー発色団テトラサイクリン発現調節系などを含む 様々なGateway適合発現ベクターに簡単かつ効率的に転移可能

製品名 対象 フォーマット 薬剤選択2 ご注文方法 希望販売価格MISSION TRC3 Human LentiORF Collection

レンチウイルスが感染可能な細胞

グリセロールストックプラスミドDNAまたはレンチウィルス粒子1から選択可能

ブラストサイジンまたはピューロマイシン

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1 LentiORF エントリーベクターライブラリーは大腸菌グリセロールストックあるいはプラスミド DNA フォーマットでのご提供となります 2 発現用ベクター（ブラストサイジン選択用ベクターならびにピューロマイシン選択用ベクター）のもつ哺乳類細胞選択用薬剤耐性遺伝子です

製品仕様ベクターマップ（pLX304）

LentiORFピューロマイシン選択用ライブラリー特長7000を超えるヒトORFのコレクションピューロマイシン耐性遺伝子（Pac）を持ちCMVプロモーターが

サイレンシングを受ける細胞での使用にも最適なEF1-αプロモーターを持つ 哺乳類細胞過剰発現用ベクター

プール型スクリーニングのアプリケーションに適合V5タグの下流には 24塩基のクローン固有バーコード配列と転写終止コドンが配置されており ヒット遺伝子の容易な同定が可能

製品仕様ベクターマップ（pDONR223）

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