10
Extension of life span and stress resistance of Drosophila melanogaster by long-term supplementation with melatonin Ernesto Bonilla a,b, * , Shirley Medina-Leendertz b , Solangel Dõ Âaz b a Instituto de Investigaciones Clõ Ânicas ªDr Ame Ârico Negretteº, Facultad de Medicina, Universidad del Zulia, Apartado Postal 1151 Maracaibo, Venezuela b Instituto de Investigaciones Biome Âdicas INBIOMED), Fundacite Zulia, Apartado Postal 121 Maracaibo, Venezuela Received 7 August 2001; received in revised form 19 November 2001; accepted 20 November 2001 Abstract According to the free radical theory of aging, free radicals are involved in the production of changes in cellular metabolism that lead to a time-dependent functional decline in all living beings. Consequently, antioxidant and/or free radicals scavengers may retard the aging process. We explored the effect of melatonin on the life span of Drosophila melanogaster Oregon wild strain). It was presumed that given the antioxidant and free radicals scavenger properties of melatonin, this hormone would prevent oxidative damage to the ¯y tissues and slow down the process of aging. Melatonin, added daily to the nutrition medium at a concentration of 100 ug/ml, increased signi®cantly the life span of D. melanogaster. The maximum life span was 61.2 days in controls and 81.5 days in melatonin fed ¯ies. Relative to the controls, the percentage increase in the melatonin fed ¯ies was 33.2% in maximum life span, 19.3% in the onset of 90% mortality, and 13.5% in median life span. Furthermore, in a test of superoxide mediated toxicity it was shown that melatonin treatment increased the resistance of D. melanogaster to paraquat. Finally, the augmented resistance to an ambient temperature of 36 8C was also a demonstration of the antioxidative protection provided by the hormone. q 2002 Elsevier Science Inc. All rights reserved. Keywords: Drosophila melanogaster; Melatonin; Aging; Longevity; Paraquat; Free radicals 1. Introduction Although it is doubtful that a single theory can explain all the mechanisms of aging, the `free radical theory of aging' proposed by Harman 1956) is currently being supported by the majority of published reports. This theory is based on the premise that a single common process, modi®able by genetic and environmental factors, is responsible for the aging and death of all living beings Harman, 1981). The theory postulates that aging is caused by free radicals reactions that may be involved in the production of the aging changes associated with the environment, disease, and the intrinsic aging process. Reactive oxygen species oxygen free radicals and hydroperoxides) are initially produced by the univa- lent reduction of dioxygen to generate sequentially superoxide anion radical and hydrogen peroxide. The latter, if not eliminated, generates the highly reac- tive hydroxyl free radical, which is widely believed to be the main agent of oxidative damage Fridovich, 1978). The main assumption of the free radicals Experimental Gerontology 37 2002) 629±638 0531-5565/02/$ - see front matter q 2002 Elsevier Science Inc. All rights reserved. PII: S0531-556501)00229-7 www.elsevier.com/locate/expgero * Corresponding author. Address: Instituto de Investigaciones Clõ Ânicas ªDr Ame Ârico Negretteº, Facultad de Medicina, Universi- dad del Zulia, Apartado Postal 1151, Maracaibo, Venezuela. Tel.: 158-261-7597247; fax: 185-261-7838857. E-mail address: [email protected] E. Bonilla).

Extension of life span and stress resistance of Drosophila melanogaster by long-term supplementation with melatonin

Embed Size (px)

Citation preview

��������� � �� ���� �� ������ ���������� � ������������� ���� �� �������� �������������� ���� ��������

������� ����������� ������ �� �������� ������ ������ � !���

���������� �� ������� ������ �������� ��� ������� �� ������� ������ �� �������� ���������� ��� �����

������ ���� !!"! ����#�� $���%������������� �� ������� ������ &�������� '��&�(�)�*� �������� ����� ������ ���� !+! ����#�� $���%���

"����#� $ %����� &''() �����#� �� ��#��� ��� (* +�#����� &''() ������� &' +�#����� &''(

��������

%���� ��� �� ��� ��� �� ��� ������ � ������ ��� �� ���� ��� ��#�#� �� ��� ��� ������ � ������� �� ����� ���������

���� �� �� � ����� ���� ��� �������� ����� �� � �#��� ������, -����.������ ������� ��� �� /�� ��� �� ���� ���#������

��� ����� ��� ����� �������, 0� ������ ��� ���� � �������� �� ��� �� ���� � ��������� ���� ���� 12����� ��

������3, 4� ��� ������� ���� ��#�� ��� ������� ��� �� ��� �� ���� ���#����� ���������� � ��������� ���� ������� ���

���#��� ��� ���#� ����� �� ��� 5� ������� �� ��� ��� ��� ������� � �����, ��������� � � ��� �� ��� ��������� �� ���

�� � ������������� � ('' ��/�� �������� �����6����� ��� �� ���� � �, ���� ����, 7�� ������� �� ���� ��� 8(,& ���

�� ������� �� 9(,: ��� �� �������� � 5���, "����#� �� ��� �������� ��� ���������� �������� �� ��� �������� � 5��� ���

;;,&< �� ������� �� ����� (*,;< �� ��� ����� � *'< ��������� �� (;,:< �� �� ��� �� ����, =����������� �� � ���� �

�������� � �� ���� �������� �� ��� ����� ���� �������� ��������� �������� ��� ���������� � �, ���� ���� �� ����.���,

=����� ��� �������� ���������� �� �� ������� ����������� � ;8 �- ��� ��� � ������������ � ��� ������� ���#� ����������

���#� � �� ��� �������, � &''& ���#��� ������� 4��, % ������ �����#� ,

-�./����> ��������� ���� ����) ��������) %����) �����#���) ?���.���) =��� �� ����

� ���� ������

%������ �� �� ����� ���� � ����� ������ ���

������ � ��� ���������� � ������ ��� @��� �� ���

������ � �����A ������� �� B����� 1(*:83 ��

�������� ����� �������� �� ��� ��C����� �

������� �������, 7��� ������ �� ���� �� ��� �������

���� � ����� ������ �������� �� �6��� �� �������

�� ��#��������� ������� �� ���������� �� ��� �����

�� ���� � � �#��� ������ 1B������ (*9(3, 7��

������ ��������� ���� ����� �� ����� �� ��� �� ����

��������� ���� ��� �� ��#�#� �� ��� ��� ������ � ���

����� ������� ��������� ���� ��� ��#���������

������� �� ��� ��������� ����� �������,

"�����#� ������ ������� 1������ ��� �� ���� ��

�� �������� ��3 ��� ������� ��� ��� �� ��� ���#��

��� �� ������ � ������� �� �������� ��.�������

�������� � ����� �� ��� �� �� ����� ������ �,

7�� ������ � ��� �������� � ��������� ��� ����� �����

��#� �� ���� ��� �� ���� ����� �� �� �� ����#� ��

�� ��� ���� ����� � ��� ���#� ����� 1=�� �#����

(*$93, 7�� ���� ���������� � ��� ��� �� ����

����������� D��������� ;$ 1&''&3 8&*E8;9

':;(�::8:/'&/F � ��� ���� ������ � &''& ���#��� ������� 4��, % ������ �����#� ,

?44> �':;(�::8:1'(3''&&*�$

���,���#���,���/�����/�������

� -�������� ��� ������, % ����> 4�������� � 4�#������������

- !����� G�� %��!���� +�������H� =����� � �� ������ I��#�����

� � J���� %����� � ?���� ((:(� ���������� K�������, 7�,>

�:9�&8(�$:*$&L$) ��> �9:�&8(�$9;99:$,

)0�� ������1 ��������M�����,��� 1�, �����3,

���������� � ����� �� ���� ��� ������� ��� ������ ���

��� �� �6������ �� ���� � ������� � ������#� ������

������� 1"2�3 ������� ���������� �� ��5���� ����

���� ����� ���� ���������� ���� ���� �������

������� ��� �������� ��������� ��������� ���� �����,

7�� �����6� ��� � ������ ��� �� ���� �� ���

����� ������� �� �� ������� �� ��� �����#����� ����

�� ���� (< � ��� ������ ������� �� � ��������� ��

�� ���������� �� ��� �� ��� �������� ��� �������

��������� ����� 1��#���� �� �,� (*$&3, 2#�� ����� �����

������ �� ���� ��� ����� �� ����#������ �����

����� 1��.�� �� �,� (*9'3, B����� 1(*$&3 6���

�������� ��� ��� � ��� �� ���� �� �������� ���

����� �� �����.���� ����������, 4� ��� ����

������� ���� ����� �� ����� �� ��C��� �� ���������

��� �+% �� ��� � �� ��� �� ���� ��� ��� �����

�������� ��� �������� 1������ �� �,� (**:) "����

���� (**:3,

4� � ����� �� �������� ���� ����� ��������

������� ��� ��� "2� ���� ��� ��������� ��������

���� ������) ������� ���� �� 5�#��� ���� ��� ��

���� �������� ��� ����� ������ ��� � ��������� �����

�������� �� �������������) �� �� ������ � ����

�� ����������� ���� �� .�������� 5�#���� ������

���� ��������� �� ���������� �����) �� �� ��� ������

� ���������� ������� ���� �� ���� ����� ���������

������ ������ �� ����.��� 1B���� �� D������

� ��� (*9:3,

�������� �� ��� ���� ������ �� ���� �� ���

���#����� 17�� �� �,� (**;3, 4� �� ����� ����� ��

��� � �� �� ��� �������� � ���� ����� � �� ������

����� 1��� � �� �,� (**L3, 7�������� ���� ������� ���

��� ������� ��� �� �������� �� ����� ��� �������

��� �� ��� ��� ������ �� �#��� �������� ��������

���� ������� ��� ��� � � ������� ������ 1"������

(**:3,

+����� �+% ����� ��� �� �� ��������� ������

���� � ����� 1��������� �� D������ (**;3, �����

�������� ��� ������� ������������� ��������

�+%� ������� ��� �� ���� �����N� �� ��� �� �

��C�� ����� �� ���������� ��� ���� �� ����� ������

���� ���, =����������� ��� ������ ������ �N� �+%

������ �� ����� ��� �� ��������� ������ � �����

1O�� (**;3� �� �������� ��� ���� ��� �� �� ���

��� ������ ����� �� #�#� 1?�����6��� �� �,� (**;3, 4�

��� �������� ��� ����#��� � ��� ������� ���#� ������

���������� ������ ���� ������� ������ �� �����

��� ���#� ����� 1"������ (**:3,

7�� ������ ���#��� ������ �� ����� ���������� ��

����� �� ��� �� ����, ��� �� ��� �������� �� ������

������ ��� ������������ ��� �� �������� ��������� ��

�����, 7���� � �������� ����������� ���#� �� �����

��� ��� ���������� �� ��� ������ �� ��� ��� �����

�� ��������� ������� 1"������ (**:3, 4� ���� �� ���

���� ����� ���� ����� � ������������ � �������� ��

���N��� ����� �� ����� ���� ������� ���#�#� �

�%��/� ����� ��� &;,9 �� &9,( ������, ������

������ ���� ���� �� +�� J���� ���N �����

��������� �� : ������ �� -:$��/8 ���� ��������

�� (* ������ 1?������� �� "������� (**L3,

��������� ���� ���� �� �� ������� �� � ��

������������ �������� ������� � ��� �����#�� �����

�� ����) ��� � �� 5��� ������ �� ���� ���� � ���

������������� � ����� ���������� �����#� ��

������> ���� ������� ��� �� ��������� �� ��

������� ��������� ��� ������) �+%��� ����

������� ������������� �� ������� �� ��� �������

� ��������� ��� �#����� �� ����� ����� ��

������ ������� ���� ������ �� ���� 1=����� ��

�,� (**&3,

�������� �� ��� ������ ����N������ �������

������������ ����� �������� ��� ���� ������� ���� ��

�������� ���������� ��� ������� �� �, ���� ����

1=���������� �� �,� (*99) B��������� �� �,� (**:3, 2�

��� ����� ��� � ��� ������� ���#� ���� � ����

������� �� �, ���� ���� ��� ���� ����������

�� -���������� �� B�� ��� 1(***3 ��� �����

���� �������� ���#���� ��� �������� �� �������

������� ���� ��� ���#� ������ ��� �� �������

������� ��� ������� �� ��� � ������������ � ���

������� ��������� ;�������(�&�L��������,

7��� ��� � ��� ������ �� ���� ��� ���� � ����

����� �� ��� �� ���� � � �� �, ���� ����, 4� ���

������� ���� ��#�� ��� ������� ��� �� ��� �� ���

���#����� ���������� � ���� �������� ��� � ���������

���� ��� ���#��� ��� ���#� ����� �� ��� 5� �������

�������� �� ��� ������ ���#��� ������� ����� ��

����� ���������� �� ����� �� ����������� �� ��

���,

� ��������� �� ����� �

+,!, ��������� ����2 �� �������

��� �� ����� 5��� � �, ���� ���� 12�����

), &����� �� �, 3 )4�������� 5�������� . 67 '+88+* 9+:;96<8;'

�� ������3 ���� ��� , =��� ���� ����� �� � ����/

��N 1��3 ���� � (&>(& � �� � ����������� � &: �-,

7�� ���� �� ���� ��� �������� > ',; � � ����E�����

: � � ���� 5���� (,: � � ������ (,&: � � (''<

������� : � � � ����� ����� ������� 1('' � �

����� �� ('' � � ����� �����3� ',8: � � �����

���� ������������ 1����� -������ -�� �2� I�%3�

�� L;,$: � � �����,

+,+, =�>� ��� �������

2�� �� � ���� ���� ��������� �� ���� #���

1?���� ������� *,8 � ('' ��3 ���������� ( � � ���

���� �� , 7�� 5��� ���� �� �� ������ � 6#� ��� #��,

% ���� ������� � �������� 1"������� �����������

4������������ �%� I�%3 ��� ������� ��� �� �

������������� � ('' ��/� � ���� ���, 4� ����

#�� ( � � ��� ������ �� �� ��� �������� ��������

��� �� ��� � � , 7�� #��� ���� ���� ���� ������

��������, �#��� �� �� LE: �,�,� �� 5��� ����

������ �� ���#�#��� ��� ��������� �� �����

������� �� ,

=�#� ��� �� �� ����� 5��� ���� ��� �� ��� ���

�� ���� ��� ���, ��#���� ������� �� $' ��������

� 5��� ���� ������ �� ���� � ��� ��� ��� ����

���� ������ ��� ������� P������ �� P��,

+,6, �?�� ��������� ����

7�� ��� ���� ��������� ��� ��� ����� ���

��� �� ��� 5��� ���� � ���� � �������� ��������

��� �� 1('' ��/�3 �� � ����� � :� ('� (:� �� &'

���, 4� ���� ���� ����� � &: � ��� �������� � 5���

�� &: � ��� ��������� ��� ������� ���� ����#� ��

8 �, %������ �� ���� ���� ��������� �� #���

���������� ��� 6��� ����� ���N� ���� &' �� �����

.��� 1�����3 �� :< ������� �������, ���#�#� ���

�������� &L �� L9 � ����, 7��� ����� ��� �������

��� ���� �����, % ���� ������ � 8'' 5��� ����

��� ,

+,@, A���� ������ ����

2�� ��� �� ��� 5��� ���� � ��� ����

�������� ���������� �� 1('' ��/�3 ��������

�� ��� ���� �� �� �� ��� ��#���� �� � ���,

7�� 5��� ���� ���� ��������� �� #��� ����������

( � � � ������� � (< ���� �� :< ������� ��

���� ���� � �� ��������� �� ;8 �-, 7�� �#�����

���#�#� ���� 1�� �����3 ��� �������� �� ����

������ �� �������� � 5���, 7��� ���� ���

������� ����� �����,

), &����� �� �, 3 )4�������� 5�������� . 67 '+88+* 9+:;96< 8;(

=��, (, Q����E����� ���#�#� ����� ���������� ��� ���� � �������� �� ��� �� ���� � ��������� ���� ����, ���� #��� ���������� ���

���� � ��� �� ���� ��� ���, ��#���� ������� �� $' �������� � 5��� ���� ��� �� ���� ��� �, 1E�E3 �������� � 5���� 1E�E3 -�����,

+,", B�������� ��.���

���#�#� ���#�� �� ������ �� �������� � 5���

���� ������� �� ����� ��� ��������������

0������ ����� "��N ��� ���� ���� ��� Q����E

����� ����� ��� 1�����N�� (**:3,

7� ��������� ������� ��� ������ ����� � ����������

�� �����6���� ����� �� ��� �� ���� � ��������

� �� ������ 5���� ������� ������� � #�������

1%+2K%3 ��� ������ ���, ��������� �������

����������� ������ ���� ����� �� �����6�����

����� ��� ��� ���E+�����EQ��� ����� ���

1�����N�� (**:3,

� �������

7�� �� ���� � �, ���� ���� ��������

�����6����� ���� �������� ��� � � �� ��� ��

1=��, (3, 7�� ����� � �� ���� *'<� �� (''< ������

��� �� ��� �������� � 5��� ��� ���� , 7�� �����

��� �� ���� � ��� �������� � 5��� ��� 9(,:� &'

��� ���� ���� �� �������, %� ������� �� ���

�������� ��� ���������� �������� �� ��� ��������

� 5���� ��� ;;,&< �� ��� ������� �� ����

1�� ','''(3� (*,;< �� ��� ����� � *'< ��������

1�� ',''(3� �� (;,:< 1+�3 �� ��� �� ��� �� ����

17��� (3,

4� & ��� � 5��� ������ ���� �������� �� :

� ������ ���� ���#�#� ������� ��� ������ ��� ��

�������� &'' 5��� �� ������ �������������� � �����

.��� ����� L9 �, % ������� �� ������ 5���

���#�#� �� ��� �������� �� : �� ����.���, 0���

(' ��� 9'< � �������� � �� 8L< � �������

���� ��� ��#�, 2�� L< � ������� �� &L< �

�������� ������ 5��� ���#�#� �� � ������������� �

), &����� �� �, 3 )4�������� 5�������� . 67 '+88+* 9+:;96<8;&

=��, &, ���#�#� � ������ �� �������� � ��������� ���� ���� ���� &L �� L9 � � �������� �� &' �� ����.���, K���� ��������� ���

���� � ���, � ����� ������, ��� ',''( ���� ������� �� ��� ��������� ��� ������, % ���� ������ � 8'' 5��� ���� ��� ,

&' ��, =����� � ��� ����������� �� ������ 5���

�� ���� ������ ���� L' �� ����.���, �����.����

��� ��� � ��� ����.��� �������� ���� ��� ���� �

������������� � &' ��,

=��, & ����� ���� ���� : ��� � �������� ������

����� 99< � ��� 5��� ������ �� &' �� ����.���

���� ��� ��#� �� &L �, 4� ��������� 89< � ��� �������

���#�#� ) ��� ������� ��� �����6���� 1�� ',''(3,

%� L9 �� ����� *8< � ��� ������� �� $8< � ���

�������� � 5��� ���� �� 1�� ',''(3, 7�� ���

���� �������� ���������� LL< � ��� 5��� ���#�#�

&L � �������� �� ����.��� �� ������� �� L'< � ���

�������, 2�� 9< � ��� �������� � �� L< � ���

������ 5��� ������� ��#� �� L9 � 1�� ',''(3, 2�

), &����� �� �, 3 )4�������� 5�������� . 67 '+88+* 9+:;96< 8;;

=��, ;, 7����� ������ ����, ���#�#� ���� 1�����3 � ��� ������� �� 5��� � ���� �������� 1('' ��/�3 ����� : ��� ���� ��������� ��

;8 �- �� #��� ���������� ( � � � ������� � (< ���� �� :< �������, K���� ��� ��� ���� � ��� � ����� �����������, % ���� ������ � ;''

5��� ���� ������ ,

7��� (

���� � ��� 1�� ���3 � ��� :'� *'� �� (''< �������� �� ��� ���#�#� ��� ��� ���� ��������� ���� ����, ��#���� ������� �� $'

�������� � 5��� ���� ��� �� ���� ��� �

D����� 7��� ������ � 5��� ��������

:'< *'< (''<

-����� &9' ;L�9 � &�9 :&�9 � (�& 8(�& � '�$

��������������� &9' ;*�: � &�8 8;�' � &�$ 9(�: � &�&

� +� � ',''( � ','''(

��� 6������ ��� (& �� L< � ��� �������� � ���

���� � ��� ������ 5��� ���#�#� �� &L �� L9 ��

��������#��, 2� ��� ��������� ��� (&< � ��� ����

����� � 5��� ���#�#� ���� &L � � ����.��� ������

����� ��� ���� �� L9 �,

%� ����� �� =��, ;� �������� � 5��� ���#�#�

&:,9< ����� 1;&,$ � (,'9 �3 ���� �������

1&8,' � ',$ �3 �� ;8 �- 1�� ',''(3,

� ����������

2�� ���#� ������ ���� �� ��������� ��� �� ��#����

��� ��� �� ���� � �, ���� ���� 1=����� �� �,�

(**&3, % �� ��� ������ � �������� ��� ���� ������

��� �� ��� ����������� ������� �� ���� �� �������

� ��� ������ �� ���������, ������ �� �, 1(*$:3

��#� ���� ���� ��� ����#��� � ��� ������ �������� �

�������� 1�2�3� ����� �������� ��� ���������� �

��� �������� � �� ��� 1��-�� �� =�� �#���� (*8*3�

�� ��� �����6����� ������ ������� �� ������� �

��������� ����� �� ���� ��� ��� �� �� ���� ��

L'<, B���#��� ������� �� �, 1(*$*3 ������� ���� �

����� �#� ������ � ��������� ��� �6����� �� ����

�2� ����#���, 4� ��� ��� ���� ����� ���� -�EJ�/

�2� �� ������� �� ��������� ��#� � ��������

�� ��� �� ���� 1?����� �� �,� (*9*3, 2� ��� �����

��� � 2�� �� ���� 1(**L3 ��#� ���������� ����

�#������������ � ���� -�EJ�/�2� �� �������

����� �� �, ���� ���� ����� � ��� �� ���� �

��� ���������� 5��� �� �� �� ��� ���� ������� ��

�������, 7��������� 5��� ��� �������� � ����

�#� � ������� ��� ���#� ����� �� � ������ �����

���� ���� �� � �� ��� ���� ������ 5���, ������ ������

#������ ���� �� � �� 5��� ���������� ��� �����

�2�( ��������� �� ����� �������� ����� ������ ��

� ������� ��������� � ��� �� ���� �� ����� L'<

1?��N�� �� �,� (**93, 7�� ���������� � �������

������ ��� ������������ �� �� �������� ���� ��

��� �� ����, 7�������� ��� �����6� ��������� �� ���

������ � ��� �� ���� ������ � ����� � �� ��� ���

������������ ��� ����� � ���������� �������� �� ���

�� ���� � ��� ���� �����, 7��� ��� �� ��� �������

� ��� ������ ������� ����#������ �� ����� ���� �

������ �� ����� ��� �� ���� � �� ����� �����0

���� �� ������� �� ������#� ��������� ���� �����

� ������������ 1?��N�� �� �,� (***3,

4� �� �� �� �#�� ��� ���� ���� � �������

���N����� �� ��� �� ���� � �, ���� �����

��� �� 7���� 1(***3 ��� ����� =�? �����������

�� � ������ ���������� ������ 1=�?�2I73 �� ���

�� ��� �#������������ � ������� �� /�� -�EJ�/

�2� �� � �� �, ���� ����, 7�� =�?�2I7 �� ��

���� ������ ���#� �� ������ ������� �� ��� �����

� ������� ���N����� , -����� �� �����������

1�#������������3 ���������� ��� ��������� � ������

�� ��� ��� �� ��� ��� � ��� �� ����� ���� ����

�� ��� �����.������, I� �� ��� ��� ������ ������ �

��� ���� ���� ���� �� ������ �� ������ ������#�

����� �� ��� �� ����, -������ �#������������ ��

�� ����� ��� -�EJ�/�2� �#������������ ����� �

��� ���� �� ���� �� �� L9<, 7���� ��� ����� ����

��� ���#� ����� �� ��� ������������ ����� �� ���

�� ���� � � �� ��������� �� ���� ��� �#���������

���� � � ����� ����� -�EJ�/�2�� ��� �����6�����

����� ��,

4� ��� ���� ������� ���� ��� ������� ��� ��������

�������� ��������� ��� �� ���� � ��������� 1����N

�� �,� (**$3, 7��� ���� ��� �� � ����� � ��� �� ���

���#����� ��������� ��� �� ����� ����������� �� ����,

�����#��� ��������������� �� � �������� ���� �� �

���������� ���������, �������� ����� ������ �

������� ������� ���� �����6����� ��������� ���� ���

���� �� ������� �� ���� � ��������� ����

���� ��� � �� ����� ������ �� ���� ���� � ����������

���� � ',;< �� � ������ ��������� 1"� � �� �,�

(*993,

�#� ���� � ��� ������ � �� ������� �������� ��

���#���� ��� �� ���� ��� �������� �� 7�� �� �,

1(**L3 ��� ���������� � ���� ������� ����#� �

��� ����� ��� � � ����� ���� ����������� ��������

�������������� ��� ��6����� �� ������� �� ��� ���

���������� � �+% �� ��� �� ����, =�����������

?����� �� �, 1(**$3 ��� ���� ������������ ����

#��� ���� � ��� ������� ������� �� #������� #��

���#������ � ��� ���#� ����� ����� �� ���� ����

�� ��� �������� �� �������� ���������� ������

�#�� ����� �� �������� ��������������, % ������

��� ����� �� �, 1(***3 ������� ���� �����������

�������������� � �������� ���������� �� ��� ����

������� ��� ������ � ����� ����� �� ���� ���� �����

��� ��� ������������ � ��� ������� �� �� ��� �� ���

� #�����,

4� ��� ��� ���� ������� ���� �������� ���#�����

�� ����� ������ � 1B&2&3 �� � �������������� �����

��� ������ �� ���#�� �� ������ ������ B&2& ��

), &����� �� �, 3 )4�������� 5�������� . 67 '+88+* 9+:;96<8;L

�#��� ���������, ����� ���� B&2& �� �������� ���

������� �� � �������� ������������� ����������

��� ��������� ������� � ���� ������� ��� �� ��

��������� ��� ����#����� � ������� �� ����������

������ ��� �� ����������� ���������� B&2& �������

�������� �� ���� ������� �#�� 17�� �� �,� &'''3,

4� ����� � ��� ����� ��� ������� ����� �� ��� �

����� ���������� ��� ������ �� ��� �����������

���#���� � ��� ������� ��� ���������� � ��������,

4� �� #���� ��� ���� ������ �� �, 1(**83 ��� ����

�������� ������� ��� ������ ����� � ��������

���������� � �� ��� ��� �� ���#���� �����������

��� �� ������� ������� ������� ������#����� �� ����

������) ��#��������� �� � ��� ���#���� ��������

� � �� ��� �� ���N� �������� �+% �������

����� �� ��� ����� �������� ������, B���#���

Q�������N �� �, 1&'''3 ������� ���� ��������

�������� ����������� ��� ����� � ���� �� �

�������� �� ������ �� �+% �� ��� �#�� ���������

��������, ���� ��� ���� ������� ���#���� ��� ($��

����� ����� ��� �+% ����� �� ������� N� ����

1Q�������N �� �,� &''(3, 2���� �� #���� ��� ��� �

��� ������� � ����� ����������� ���#���� � ����

����� �� �� ������� ��� �� ��� ������ ����� ���������

1%��C� �� �,� (**$3, 2� ��� ����� ��� � ����� � ��

�, 1&'''3 ����� ���� �������� ��� ����� �� �����

��� ��� ���� �� ��� ������ ����� ��� ������ �����

�� ���������, ���� ����������� ��#� �#�� ��� � ��N

� �� ������ ������� �������� � �������� 1�������

��� �� �,� (**93 �� ������ ��#� �����#� ������ ���

���������� � ��� ������� �� #���� 1�� ����+�#���� ��

�,� (***) 0�5�� �� �,� &''(3,

4� �� ����������� �� ���� ���� ��� ������� ��� �������

��#� ���� � �������� �� �������� ������� ���

��� �� ������ ��� ������� ��� ��������� � �������

� ��� ����� �������, 7��� �� ������� ��������� ���

����#��� � ���������� ������ ���� �� ������� ���#�

������� ����� ���������� ��������� �������

������� �� ��������� ��� ���� 1?���� �� �,�

(**:3, =����������� �������� ��������� ����� �����

��� ���#� ������� ���� ��� �������� � ���������

���������� �� ������� �� ������� 1"����� �� �,�

&''(3, �������� ��� �������� ����������

���������� �#�� �� ���������� ��� ������������

������ �� ��� ���������� ���������������� �������

���� 1I���� �� �,� (***3, =����� �������� ��������

��� ������ ���#� ������� ������ ��� � ���������� ��

������������ �� ��������� ��� �6������ � ���

������� ��������� ����� ������� �� ����� �������

��N��� �� ��� ���������� � ��� �� ���� 1"����� ��

�,� &''(3,

%������ �������� �� ��� ��� ��� ������� ���#�

����� ������ ������ �� ��������� �� �������� �

���������� �� ������ �� ������ ���� ��� 10� ����

��� �� �,� (*99) "������ (**:) ����� �� �,� (***) Q����

���� �� �,� (***3, B���#��� ���� ���������� ��� ����

������� �� � ������ ���N �� ����� �� �����6����

������� ��� ������ ������� � ������ ����� �

� �� ��� �� ������ �� ������� �� ��� � �����

���� �� ��� �� ������� ����� ��� ������ � �� ���

����� &L � �#����� �������� ������������� 1J������

�� �,� (***3, 2���� ������� ���#� ����� ������ ����

��#� ���� ��� �� ������ ������ ����� �� ��������

���������� �� 1������� (**;3,

7�� ������� ��� � ����������� ���� ��� ���� ����

��� �������������� ���� �������� ��������� ��� ��

���� � �, ���� ����� ���������� ���� ����� �� ��

���� �� ��� �� ������ ���� � �����, 7���� 6� ����

��#� ������� �� ��� ��� �� ��� ������ � �����, 2��

������ � ��� ����� ���� ����� � %������# �� �,

1(**$3 ��� � ��� ������ �� �������� ��� ����

� �������� �� ��� �� ���� � ���������, 7��

�������� ��� �� �� �� ��� ��� ���� ���� � �

�������� �� ��� �� ��� �� ��� ��� ������ � ��#�

�#������� �� ��� ���������� ��� �� ���� � ���

5���,

4�����# �� 2��N��#� 1(***3 ���� � ��� ����

����� �� ��� ������ �� ��� ��� �� ��� ����� � �#��

������ ��� � ������������� ���� �� ��� �� ��

���� ��������� � ��������� ��� ��� �� ��� ����

�� ����, B���#��� �� �� ����������� �� ���� ����

���� �� �������� ����� ��� ��� ����� � ���������

���� ��� ������� ���� ��������� ��� 5��� �� � ����/

��N ���� � ' �/&L � �� ������ �� ��� (& �/(& �

���� ��� �� ��� ������� ��� �,

?���.��� ��������� �������� � �� ���� ���� �����

����� �� #�#� 1B����� �� =�� �#���� (*$93, 7���

�� ��� �� � ��������� ������ ������ � �������

������ ������ ������ �� �� ������� ������� �� ���

���� �� ����� ���� � "2�� �� � #������ � ��������

������ ���� ��� �+%� ��� � �� ��������, 7��

�������� � �� ��� �� ��� ��� �� #�#� �� � ������

� �������� ��������� ���� ���� � ���������� �����

�������� �� ������������ ��� ����� 1=�� �#����

(*$93,

7�� ��������#� ���� � �������� ������� ����.���

), &����� �� �, 3 )4�������� 5�������� . 67 '+88+* 9+:;96< 8;:

������ �� ���� ��� � �� ���� �#� ��� �� ������� 5���

1$ �� (& ��� � 3 ���� �� ��� � ��� 1($ �� && ���

� 3 ���������� ���� ����� ������� ���#� �����

������� ������ 5� ������� ��� ��� �6����� �� ���

� ��� ������ 5��� ����� ���� � ��� ���#�#� ��� �����

.��� ������� ���� &L � � ��������, 2� ��� �����

��� � �#�� ���� (: ��� � ��������� ���� ��������

��� ������ ����� �� ��� �� L9 � �������� �� �����

.��� �� ����� � �� 5��� ��� �� ��#��� ���� �� ��� ���

���������� �� �������� ����������, 7���� ������

���� �� �� � �����.����� � ��� ���������� �������

����� ����� � ���������, B���������� �������

����� �������� ������� ���� ���� �������� �� ���

����������� � ������� �� ������� �������� ����

�� ������� ���� ��� �������� ���#��� �� �������

����� ������� �N� ����� � ��������� ���� ��#� ��

��������#� �������� �� ������ ����� ���, �����

��� ������ ������� ������ ��� ����#��� �� ��������

��� ����� ���������� ������� ���� ���� ������ ��

� ����� � � ������� �� ������� ��� ���������� ����

���� �� �� �������� ���� � ��� ������ ��� ��� �� ��

����� �������� ��� ������ �� �� ���������� �� �

��� ���#� ������ ����� �� ����� ��5������ ��� ���� �

����� 1���� �� 0��� ����� (**83, 4� ����������

���������� �� ����.��� �� �� �� ������ � �����

������� ������#� ��� ����� ������,

��������� ��� ��� 6��� ������� ������ �� �����

������� ������ ���������� ��� ��N� �� �������� ��

���� 1���#��� �� �,� (*9:3, 4� ����� 5���� �������� ��

������ ���������� ��� ��� �� � ��������� �� ��������

�� ����#��� 1"��� �� �,� (**&3, 4����#� ����������

�� ��� ���#� ������ ��������� ����#���� �� ��� ����

����� �� ��� ������������ � �2��������� �� �����

�#� �, ���� ���� 1�� �� �� %�N���� (**:3,

4������� �� ��������� ���� ���� ��� ���N��

�������� ������� ����������� ����� ����� ��������

���� ����#��� �� �������� ����� �� ����, % �� 5���

��#� � ������� �� ���� �� ���� ����������� �������

���� ��� ���� ���������� ����#�, 4� ���� ������

����������� ��� ����� �� �� ��#����� ��������

�� ��������� �� ���� 1��.�� �� �,� (*$83, 7��� ��

�� �� ��� �������� ���������� � ��� �������� �

�� ��� 1=�� �#���� (*$:3, 7�� ����N��� �������� ��

��� ���������� �� ����������� ������ �� ��� ��������

� 5��� ��� �� � ������������ � ��� ������� ���#�

���������� ���#� � �� ��� �������,

4� ���������� �� ��#� �������� �#� ���� ����

������ ����N� � �������� ��� ����� ��� �� ����

���������� ���� ���� �� �� �� ��� ���������� ��

������� ������������ �� �� ��� ��� ���#� ������

�� ��� �� ����.���, 0� ��� �������� ������� ��

��� � ��� �������� ���� � ��� 5��� ������ �� ����

����� �� ���� ������� ��� ������� �� �� ����� ��� �����

� ��� �� ��� ����� �� ��� ������� �� ������� ���

���������, 7�� ���� � �������� �� ��� ����� ���

��#� ���� � ���� 5���� ������� �� � ���� ������ �

����� �� ��� �� ����� ,

�������� �������

7��� �������� ��� ������� �������� �� ������

��� -2+4-47 �� =I+�%-47� JI�4%, ?��������

������ %������ �� ������� � !�� ��� ��� =����� �

�������� 1I��#���� � � J���3 ��������� ���#� �

��� ��� � ��������� ���� ���� ��� �� ����

��������,

����������

%��C�� ?,�,� ��������� ?,� B���� �,� ������������� Q,� ������

������ B,� (**$, %������ ��� ��� � �������� �� ��� ������

� ����� � ����� ���, =��� ����, L(;� &9*E&*;,

%������#� K,+,� ����N�#� �,K,� 2������� 7,4,� Q��#������ K,Q,�

(**$, ���� � �������� �� ����� ����� � ����������� �������

���� �� �� ���� �� ��� �� ��� ��� ����� �� ���������

���� ����, ����, %����� ��#, *$� 9(E*(,

������� �,� D����� �,� ������� �,� B������� �,� ������ �,P,� (**:,

?�������#� ����� � ������ I$L;9*= 1(8� ������� ������� 3

�� �� ������ ��� ��� ������ ����� �� �+% ����� �� �����

�� �#�� �� ������� ����������� � ������� ����#��� �� ���

�����, =��� "� ��, ���, �� , (*� 98$E9$&,

���������� ",� Q������ -,� �������� �,� -������ ?,� D����� �,�

������� �,� (**9, K������ � ����������� �� ��� �� ��� ���#�

������ �� �� ��� ��� �� ������� �� �������� �� �� ���

�� ����������������, =��� "� ��, ���, �� , &L� ((9$E((*&,

�������� D,� ���N�� 0,� =��� � ",� (*$*, �������� � �������� ��

�� ���� � ��������� ���� ����, ����������� ;:� ((*;E

((*L,

������ �,� D������� ",� "������ ",P,� D�������������� �,� 2����� -,�

D�������� P,�,� (***, ?���������� �#�� � �������� �������

���� �� ��� ������� ��� �������� � ����� �����, P, ?���� "��,

&$� :*E8L,

���������� B,� D������ B,�,� (**;, �+% ����� �� �����, 4�> O��

�,?, 1� ,3, =��� "� ���� �� %����, -"- ?����� ���� "�����

=�� ��, 9*E(&&,

��#����� %,� 2������ +,� -������ �,� (*$&, 7�� ����� ��� ������

� �� ����� ������ �, �������, P, (&9� 8($E8;',

����N� -,� ��������7��R����� �,� ������� �,� (**$, ���������������

���� ��� ������ �� ��������� ��� �� ���� � ���������

���� ����, -�, ��, ��� ���, :;� *8'E*88,

), &����� �� �, 3 )4�������� 5�������� . 67 '+88+* 9+:;96<8;8

-����������� %,� B�� ��� � ",� (***, %������ ���#� ����� �

�������� �� ��������� ���� ����> �������������� �

����� �� ��� �� ��� ���������� � �������, P, ?���� "��,

&$� (:LE(:9,

�� ��� �,?,� %�N���� ",� (**:, % ���� ����� ����������� � �����

��� ��� ���� ����#����� �� ��������� ���� ��� ���� ����� �

���������� �� � �����#� ������ � ���������, P, D������, %,

���, ���, �� , ���, :'� �(($E�(&$,

=����������� �,� -������� P,� ������� P,�,� P���� P,�,� (*99,

�������� ������������ �� ���������> ��� ������ �� ��� �����,

P, +��������, :'� ;9&E;9$,

=������ P,�,� "�#���� � 4,� +�� �����N�� %,� (**&, "�� � ��� ��

��#� ������ �� ��������� �����, ���, "��, &$:� &8$E&$*,

=�� �#���� 4,� (*$:, �������� � ���������, %��, "�#, �������, LL�

(L$E(:*,

=�� �#���� 4,� (*$9, 7�� ������ � ������ �� ����, ������� &'(�

9$:E99',

B����� �,� D������ ��� P,�,� (*9:, 7�� ���������� � ��� �� ��

��� �� �������� ���� ���� �� ����� �������, ��, %������

�� , 9� 9*E(*;,

B������ �,� (*:8, %����> � ������ ���� �� ��� �� ��� �� �� ���

���� ���������, D��������� ((� &*9E;'',

B������ �,� (*$&, 7�� �������� ���N> ��� �������� ���, P, %�,

D������, ���, &'� (L:E(L$,

B������ �,� (*9(, 7�� ����� �������, ?���, +�� %�� , ���, I�%

$9� $(&;E$(&9,

B������ B,�,� =�� �#���� 4,� (*$9, �������� � �� ��� �� ���

������ ����������� � ��� �������� � ����.��� �� )���������

����, P, ���, -���, &:;� 9(L;E9(L9,

B���������� �,� P���� ?,� ������ I,%,� (**:, 4������� �� �������

���������� � �� ����N������ ����������������� ��� �����0

���� ���� ����, =��� ����, ;$:� (L9E(:',

4�����#� �,�,� 2��N��#�� �,Q,� (***, D������������ �����#��

���� � ��������> ��#���������� � �� ���� ���������� ��0

�� ����, ����, %����� ��#, ('8� &;;E&L',

Q�������N� �,� "������ ",P,� S�� 0,� D��� !�� P,P,� 7��� �,T,� �������

����� �,-,� K�C�������� &''', ?�������#� ����� � ��������

������� ��� ����� � ������� ����� �� �+% �� ������� ������

���� �������� 5�� ��� �� ��� �#�� �� ��� �� ���� �� � ������

��� �� ������, ��, -�, �������, &((� (;$E(LL,

Q�������N� �,� "������ ",P,� -������� P,� D��� !�� P,P,� &''(, -������

���� � ��� ��������#� ���� � �������� ���� ����� ������� ����

�� ��� ������� N� ��� �� � � ����� ����� ��� �+% �����,

���, "��, L$L� 9$E*&,

Q�������� �,P,� ����������� Q,� ������� �,� ���N� �,� #�� ��

B��#�� -,� "������ +,� (***, I������ 8����������������

��������� �� �����> ��� ����� �� ������� ��#��� � ��� ������

����, P, ?���� "��, &$� &('E&&',

������� Q,%,� "������ ",P,� ?�������� �,� %������ 2,4,� B�����

�,� (**8, �#������� � ��� ������� ��� ����#��� � �������� ��

#����, =��� "� ��, ���, �� , &(� ;'$E;(:,

������� B,",� ���� � �,�,� �������� �,�,� (*$:, ���� � �����

���� ��� �+% ���� ����� �� ��������� ���� ����, D�����

������ &(� &;(E&;9,

������� �,� (**;, %�������� ���������� �� ������� ���#� ������,

4�> O�� �,?, 1� ,3, =��� "� ���� �� %����, -"- ?����� ����

"����� =�� ��, (L;E(9&,

��-�� � P,�,� =�� �#���� 4,� (*8*, �������� � ��������, %� �����

��� ������� �� �������������� 1�����������3, P, ���, -���,

&LL� 8'L*E8'::,

�� ����+�#����� ",� ����!��"����� D,� B��N�� P,P,� (***, ?���

��� ��� ���������� � �������� �� ��� �� #���� ����������� ����

��� ������ ������, �� ���, "��, &:� &8;E&9',

��.��� P,� ��� ����� ?,",� ������� Q,D,� %���� B,� (*$8, �����

� ����������� �� ��� �������� #������ �� 6�� ��������� �

��������� ���� ����, ����, %����� ��#, :� ;L$E;$',

��.��� P,� ��������� %,-,� =������ P,� P������ P�,� P,�,� (*9',

�������� ��� ��� �� �� �����, ���, D������, (:� :$:E:*(,

����� �� -,� -������ �,� �������� 7,� -������ �,� %������ �,� &''',

���N � �������� ���� �� �� ����� ������ � �� ��� �������

������������� �� ������ �� ������ ��� ���, ��� ���, 88�

;;*E;LL,

�����N�� B,� (**:, 4������#� �������������, 2��� I��#������ ?�����

+�� O��N,

2��� 0,-,� ����� ",�,� (**L, ��������� � ������� �� �#���������

���� � �������� � �������� �� ������� �� ��������� ��0

�� ����, ������� &8;� ((&9E((;',

?����� �,4,� %������� �,7,� D��������� ",� "����� P,�,� "������ ",P,�

������0� ��� �,� %���U��-�����#��C�� �,� ����!� ���?�����

%,� (**:, �������� ��������� ��� ����#��� � ��� ���������

������ ���������� ������ ��� �� ��#��� ������� � ����N�, P,

?���� "��, (*� (((E((:,

?������ �,%,� ���� �,� 2���� ",%,� ���N� ",P,� B��N�������N�

�,�,�,� "������ ",P,� ������������� �,� "���N��� +,Q,� (**$,

�������� ���#���� ���� � ������������ ��� ������ �� ���

%������� ����� ����� �, P, +�������, ($� (89;E(8*',

?��N��� 7,�,� ���� %,P,� ���N������ �,� B��N��� %,P,� ?������ P,?,�

��������� D,�,� (**9, ��������� � ��������� ������ ��

�#������������ � ����� �2�( �� ������������, +�����

D����, (*� ($(E($L,

?��N��� 7,�,� B��N��� %,P,� ?������ P,?,� (***, ������������� �����

��#� ������� �� �� ���� �� ���������, +�������, %���� &'�

:;(E:;:,

?������ P,?,� -������ �,�,� ������ � �,� -����������� �,� B���

N��� %,P,� (*9*, +� �������� � ������/���� �������� � �����

���� �� ��������� ������ ������������#��� �� ����.��� ��

�� ��� ����#���, ?���, +�� %�� , ���, I�% 98� &$8(E&$8:,

?�������� 0,� "������� 0,� (**L, ?���� ������ � �����> ���� �

�������� �� ����� ������� �� ����� ����, ?���, +�� %�� ,

���, I�% *L� $9$E$*(,

?�����6���� D,� 7���� D,� -�������� D,� B������� 4,� �������� B,�

(**;, %������ ��� �������� � �������� �� ����, "��,

-�����, -���, ?����, ?�������, 9'� &((E&&;,

"������ ",P,� (**:, 7�� ����� ��� �� �������� �� ������� ��

�����> � ������� � ��� �������� �� � ��� ���, ���, D������,

;'� (**E&(&,

"������ ",P,� %���U��-�����#��C�� �,� 7��� �,T,� ���N��� �� �,� &''(,

=��� �� ������ ���� ������� �����, ���������� �� ���

��������#� ������� � �������� �� ��� ������ ���#��� ������,

%��, +,O, %�� , ���, *;*� &''E&(:,

"������� -,� (**:, 2�� ���#� ����� �� �������� ��� �+% ��

��� ������������ �� ������, 4��, P, �������, -� ���, &$�

8L$E8:;,

"���� �,",� K�� �,+,� ?��N� �,I,� D��#�� P�� P,�,� (**&, �������� ��

), &����� �� �, 3 )4�������� 5�������� . 67 '+88+* 9+:;96< 8;$

������ ���������� ��������� ����#��� �� ��������� ���� 0

����, ���, D������, &$� &L(E&:',

"� �� �,�,� O�������� �,�,� ��.��� P,� ��������� ",� =������

P,�,� (*99, ?���� ����� ���� ���������� �� ���������

���� ����, %�� ((� :LE:9,

���#���� ?,�,� B���������� �,0,� ���N����� �,�,� "���� �,",�

(*9:, "��������� �� ��#��������� ������ �� ��������� ����0

���� ������ �� �������� ����������, ?�����, J��, :9�

;9'E;9*,

��� �� -,�,� -��������� %,�,4,� =���� � �,7,� (**L, B��� ��������

� �������� �� �.����� �� ���, P, ?���� "��, (8� (*9E&'(,

����� ",�,� 0��� ����� ",� (**8, 2�� ���#� ������� ������ ��������

����� �� �����, ������� &$;� :*E8;,

���� P,� 7����� P,� (***, =�? �������������� ���� �� ������ �

-�/J���������� � �������� ��������� ���������� ��� �����

��� �� ���� � � �� ��������� ���� ���� 5���, ��,

-�, ���, (*� &(8E&&9,

7��� �,T,� -���� �,T,� ?�������� �,� ����������� �,-,� "������

",P,� (**;, ��������> � ������� �� ������� �� ���� �� ���

���#�����, �� ���, P, (� :$E8',

7��� �,T,� "������ ",P,� -���� �,�,� ?�������� �,� �����������

�,-,� ������0� ��� �,",� (**L, ���� ����������� �� �����

��������� �#�� � �������� �� ��� �+% � ��� ��������

�� ��� �� ��� ���������� �����, -������������� (:� &(:E&(9,

7��� �,T,� ����������� �,-,� "������ ",P,� ?������ �,=,� �������

P,� 0��������� �,7,� S�� 0,� &''', �������� ������ ���#�����

�� ����� ������ �> � ��������� ��� �������� ������� �

�������� ����������������, =��� "� ��, ���, �� , &*�

(($$E((9:,

I����� O,� B����� �,� D���� �,� 7� ���N�� �,� 4� �� 7,� -��� �,�

B����� Q,� Q�� �� 7,� (***, �������� �� ���� �����������

���������� ���������� �� ���� �� ����#���� ��������( ��

����� #������ �� ������ ���, =��� "� ��, ���, �� , &$�

9;9E9L$,

O�� �,?,� (**;, 2�� ���#� ����� �� ��� �� ���� �� ��� ������

� ����� �� �����, 4�> O�� �,?, 1� ,3, =��� "� ���� �� %����,

-"- ?����� ���� "����� =�� ��, :$E99,

0� ������� =,� 0������������� D,� 7������ �,� D�������� �,� 0� �

���������������� �,� =������ B,� (*99, %��������� �� ��������

����� �������� �#�� �� ������ ���� ������ �� �����, P,

-��, �� ������, �����, 88� 8L9E8:&,

0�5��� %,� -����� B,-,� %��C�� ?,�,� ����� D,� ������������� Q,�

��������� ?,�,� &''(, ?����� ��� ����#��� � ��������

�������� ����� ��� �� ���� �� ����� ��N���� P��N��

���, =��� ����, :'&� (&$E(;(,

J������� P,�,� ������� P,�,� ���� P,=,� Q������ �,�,� ���������

7,�,� ��CN� �,� -������� -,%,� (***, �� ����� ��������

�������������� ����� ���� ���V, %�, P, �� , ('$� L;&EL;8,

), &����� �� �, 3 )4�������� 5�������� . 67 '+88+* 9+:;96<8;9