EXTENDIDO DE SANGRE PERIFÉRICA La preparación de un frotis sanguíneo puede llevarse a cabo junto a la cama del paciente o en el laboratorio si se emplea sangre anticoagulada con EDTA. Dos de los procedimientos más básicos realizados en el laboratorio de hematología son la preparación y tinción de los frotis sanguíneos. MÉTODO DE EMPUJE EN CUÑA Puede usarse sangre entera anticoagulada con EDTA o sangre capilar de flujo libre. Si se emplea EDTA, los frotis deben prepararse durante la primera hora siguiente a la recolección. Antes de preparar los frotis, se almacena la sangre entre 18 y 25°C. Es necesario mezclar bien la muestra antes de prepararlos. Para realizar el extendido se requieren portaobjetos limpios de vidrio (simples o con un extremo esmerilado), un lápiz marcador y una lámina o laminilla para el empuje. El procedimiento es el siguiente: 1. Colocar una pequeña gota (0.05 mL) de sangre bien mezclada, ya sea de la punción

directa del dedo bien limpiado o del tubo con anticoagulante, a 1cm de un extremo del portaobjetos. Si se emplean portaobjetos de extremo esmerilado, la sangre se coloca cerca de este.

2. Deje el portaobjetos sobre una superficie plana con la gota de sangre al lado derecho. Invierta esta orientación si es zurdo.

3. Coloque un segundo portaobjetos para empujar un poco frente a la gota de sangre. El ángulo de esta laminilla debe ser de unos 45°.

4. Deslice el portaobjetos de empuje hacia atrás, hacia la gota de sangre. Permita que la gota se extienda hasta tres cuartas partes del bisel del portaobjetos de empuje. No permita que la sangre se extienda hasta los bordes. Empuje rápidamente el portaobjetos hacia delante (lejos de la gota). Este movimiento hacia delante debe ser suave y continuo hasta el extremo del portaobjetos.

5. Permita que el frotis se seque al aire antes de teñirlo. Se pueden abanicar en el aire para que se sequen en menos tiempo.

6. Marque el portaobjetos con un lápiz marcador. La identificación debe ser en el extremo grueso (o el esmerilado) del portaobjetos.

Existe un dispositivo especial para empujar o laminilla de extensión en el comercio para dispersar los frotis sanguíneos sin marcas en los bordes.

Evaluación visual de un buen frotis de sangre Un frotis ideal tiene las siguientes características: 1. Progresa de grueso en el punto de origen, a delgado con un borde uniforme en el punto

de terminación. 2. No toca los bordes externos del portaobjetos, ni se desborda por los lados o extremos del

mismo. 3. Se ve liso sin ondas ni huecos. 4. No tiene estrías, crestas ni depresiones, lo cual indicaría que se llevaron más leucocitos a

esta área. 5. Se prepara con una cantidad adecuada de sangre y se extiende para ocupar dos tercios

de la longitud del portaobjetos de vidrio. Causas de un frotis de sangre deficiente 1. Almacenamiento prolongado de muestras de sangre entera anticoagulada. Esto puede

ocasionar distorsión celular. 2. Retraso en la preparación del frotis. Es importante realizar el frotis inmediatamente

después de colocar la gota de sangre en el portaobjetos. Si este proceso se retrasa, las células más grandes, como los neutrófilos y monocitos, se localizan de manera desproporcionada en el extremo desgastado cuando se examina al microscopio.

3. Portaobjetos sucios o de mala calidad. Las laminillas deben estar libres de polvo y manchas de grasa.

4. Tamaño inapropiado de la gota de sangre. Una gota demasiado grande produce un frotis grueso y largo. Una gota demasiado pequeña produce uno delgado y corto.

5. Ángulo incorrecto del portaobjetos de empuje. Mientras menor sea el ángulo del portaobjetos de empuje, es más largo el frotis. Mientras más grande sea el ángulo, el frotis es más grueso.

6. Velocidad inapropiada del movimiento de empuje. La lentitud en el empuje de la gota de sangre produce irregularidades y afecta la distribución de las células en el frotis.

7. Presión inadecuada, mientras más sea la presión, más delgado será el frotis. 8. Humedad en el ambiente del laboratorio. La humedad elevada puede hacer que las

laminillas se sequen con mayor lentitud. El secado prolongado produce distorsión de los eritrocitos al examen microscópico.

MÉTODO CON CUBREOBJETOS PARA PREPARAR UNA PELÍCULA DE SANGRE 1. Sostenga dos cubreobjetos limpios por sus bordes con los dedos pulgar e índice de cada

mano. Toque el centro de un cubreobjetos con una pequeña gota de sangre. 2. Coloque de inmediato el segundo cubreobjetos sobre la gota de sangre en sentido

diagonal. 3. Permita que la sangre se extienda por acción capilar. Justo antes de que se detenga la

diseminación, separe con suavidad y de manera uniforme los cubreobjetos en el plano horizontal.

4. Coloque los frotis en posición vertical y permita que sequen al aire antes de teñirlo. El método del cubreobjetos produce una buena distribución de los leucocitos en todas las partes de la preparación. A causa del menor tamaño de la muestra, se cuentan 50 leucocitos por cada cubreobjetos. Debido a la pequeñez del cubreobjetos, casi siempre se coloca (adhiere) sobre un portaobjetos convencional para teñirlo. TINCIÓN RUTINARIA DE UN FROTIS DE SANGRE PERIFÉRICA Para examinar con detalle las células de un frotis de sangre, es necesario teñirlas. La tinción más usual en el laboratorio de hematología es la del tipo Romanowsky. Principio de la tinción En 1981, Romanowsky y Malachowsky describieron por primera vez el uso de una tinción que combinaba una solución policroma de azul de metileno (oxidado) con eosina para teñir la sangre. Diez años más tarde, Leishmann refinó esta técnica; combinó la eosina con el azul de metileno policromo, recuperó el precipitado y lo disolvió en alcohol metílico. Hoy en día, las tinciones tipo Romanowsky se preparan con esta técnica modificada. Una tinción de Romanowsky se define como cualquier tinción que contenga azul de metileno y/o sus productos de oxidación, además de un pigmento de fluoresceína halogenada, casi siempre eosina B o Y. Las tinciones de base de Romanowsky, como la técnica de Wright, Giemsa o May-Grünwald, son soluciones alcohólicas con componentes ácidos y básicos. Las tinciones de este tipo se conocen como policromas porque pueden impartir muchos colores y producir el efecto de Romanowsky. Este efecto imparte un color típico a ciertos componentes celulares y refleja la acción combinada de los pigmentos contenidos en la tinción a un pH de 6.4 a 7.0. Los colores característicos son púrpura en el núcleo celular, azul y rosa en el citoplasma y varios colores en gránulos específicos. Preparación de la tinción La oxidación del azul de metileno origina una solución que contiene sobre todo azul de metileno; azur A, B y C, violeta de metileno, y la tionina sindimetiltionina. Cuando se agrega el pigmento eosina a esta solución, el precipitado que se forma consiste en eosinatos de estos productos. El eosinato de azur B parece ser el compuesto que produce el efecto Romanowsky característico. Las tinciones con mayor cantidad de eosina azur B reaccionan con rapidez y proporcionan un mejor efecto Romanowsky que los productos que contienen menor cantidad de esta sal.

El contenido de azur B y eosina Y debe ser consistente y guardar las proporciones correctas, pueden prepararse soluciones con una composición y peso conocido de azur (por ejemplo tinción de Giemsa). Una solución base de la tinción se disuelve en una mezcla de glicerol y alcohol metílico absoluto. Luego, la tinción base se diluye con amortiguador de fosfato de pH 6.8 para permitir la ionización de las tinciones. Reacciones de tinción A continuación se describen las tinciones específicas en una tinción tipo Romanowsky y sus reacciones asociadas: El azul de metileno es un pigmento alcalino que tiñe el núcleo y algunas estructuras citoplasmáticas de color azul o púrpura. Por tanto, estas estructuras son basófilas (por ejemplo DNA o RNA). La eosina es un pigmento ácido que tiñe algunas estructuras citoplasmáticas de color rojo -naranja. Las estructuras que adquieren este color son acidófilas (por ejemplo proteínas con grupos amino). Cuando una estructura citoplasmática capta los componentes alcalino y ácido de la mezcla de tinción, adquiere un color rosa o lila. A esto se le conoce como una reacción neutrófila. Procedimiento de la tinción La sangre y otros tipos de muestras pueden teñirse con pigmentos de tipo Romanowsky. Estas tinciones pueden prepararse en el laboratorio o adquirirse en su forma lista para usar. Puede usarse en técnica manual o automática. En algunos laboratorios, los frotis por separado se fijan con alcohol antes de iniciar el procedimiento de tinción. Este paso intensifica la retención de gránulos en las células sanguíneas. El fijador usual es el alcohol metílico. Los portaobjetos pueden colocarse en metanol anhidro y libre de acetona durante 1 minuto o más. Las tinciones de Wright y otras del tipo Romanowsky se disuelven en alcohol metílico, por tanto la fijación suele realizarse cuando se aplica el colorante al frotis sanguíneo. Las tinciones pueden adquirirse en su forma lista para usarse o pueden prepararse mediante la dilución de ampolletas con peso ya determinado en alcohol metílico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se necesita un soporte para tinción o frascos para tinción de Coplin. 1. Coloque la laminilla bien seca y con la identificación adecuada en un soporte para tinción

nivelado con el lado del frotis hacia arriba.

2. Coloque tinte recién filtrado lentamente sobre el portaobjetos hasta que el frotis quede todo cubierto. No agregue tinte en exceso. Los tiempos de tinción varían. A menudo se necesitan de 3 a 10 minutos para obtener un frotis sanguíneo con un a tinción aceptable.

3. Al final del tiempo de tinción, agregue el amortiguador (pH 6.4 con suavidad al portaobjetos sin retirar el tinte. El amortiguador debe formar una burbuja grande de forma convexa sobre la laminilla. No agregue una cantidad excesiva de amortiguador. Algunos laboratorios prefieren usar agua corriente ordinaria en lugar del amortiguador.

4. Mezcle el tinte y el amortiguador mezclando con suavidad e el portaobjetos. Una laminilla bien mezclada debe exhibir un brillo verde metálico en la superficie. El tiempo para esta etapa debe varía entre 2 y 5 minutos.

5. Lave el tinte y el amortiguador del portaobjetos con un flujo suave de agua corriente. Levante el portaobjetos por los bordes y limpie el dorso del mismo para eliminar cualquier pigmento.

6. Permita que el extendido coloreado se seque al aire libre. Fuentes de error en la tinción La tinción de mala calidad puede tener varias causas: 1. La falta de filtrado diario del tinte o antes de usarlo puede producir sedimentos en los

frotis sanguíneos. Si el sedimento precipitado es abundante, será imposible visualizar las células sanguíneas al microscopio. Pequeñas cantidades de sedimento pueden confundirse con plaquetas en el examen microscópico.

2. El pH inapropiado del amortiguador puede producir una reacción tintorial demasiado brillante o demasiado oscura. La solución amortiguadora debe controlar el equilibrio ácido - base de la tinción para producir los colores adecuados en los diversos componentes de las células sanguíneas. Un amortiguador demasiado ácido determina que un frotis sanguíneo se vea demasiado rojo en el examen microscópico. Si el amortiguador es demasiado alcalino, el frotis se verá demasiado azul en el examen microscópico.

3. Los tiempos incorrectos de tinción o amortiguación pueden hacer que la tinción sea débil o que los colores de los frotis de sangre estén alterados. Un tiempo de tinción demasiado breve determina que el frotis de sangre se vea demasiado rojo al microscopio. Si el tiempo de tinción se prolonga mucho, este frotis se verá muy oscuro.

4. Los reactivos deteriorados o las proporciones inapropiadas de tinte y amortiguador durante el proceso, producen colores deslavados en las células.

VALORACIÓN DEL EXTENDIDO DE SANGRE PERIFÉRICA ANOMALÍAS MORFOLÓGICAS EN LOS ERITROCITOS Normalidad

1. Alteraciones morfológicas en los eritrocitos.

• Anisocitosis Desigualdad en el tamaño de los hematíes. Para evaluarla se tiene en cuenta el número de estas en 10 campos observados.

• Microcitosis: Predominio de hematíes de diámetro < 6 µm y VCM < 80 fL. • Macrocitosis: Predominio de hematíes de diámetro>= 12 µm y VCM >100 fL. • Megalocitosis: Predominio de hematíes de diámetro >= 12 µm y VCM >100fL.

2. Alteraciones de la forma (poiquilocitosis).

• Esquistocitos: Hematíes fragmentados. • Dacriocitos: Hematíes con una proyección alongada en un polo(forma de pera o

lágrima) • Esferocitos: Hematíes de forma esférica sin aclaración central. • Ovalocitos: Hematíes en forma de óvalo. • Eliptocitos: Hematíes en forma elíptica. • Drepanocitos: Hematíes falciformes. • Codocitos o hematíes en forma de diana: Hematíes con un área con mayor

contenido de hemoglobina que se sitúa en la zona central clara. • Estomatocitos: Hematíes que en su región central clara posen una hendidura en forma

de boca. • Equinocito o hematíes crenados: Hematíes con espículas cortas distribuidas

regularmente por toda la superficie. • Keratocitos o hematíes en casco: Presentan dos proyecciones en forma de espiculas. • Excentrocitos: Hematíes con distribución anormal de la hemoglobina. Se dispone

como despegada de la parte interna de la membrana y concentrada en uno de sus extremos.

3. Alteraciones de la coloración de la hemoglobina. • Hipocromía: Se consideran los glóbulos rojos hipocrómicos, cuando su contenido de

hemoglobina es inferior al normal. La carencia de hemoglobina severa o marcada, por lo general trae como consecuencia que los glóbulos rojos se deformen produciéndose formas anormales y carentes de hemoglobina, como los cadocitos, anulocitos y leptocitos entre otros. Para evaluar la Hipocromía se deben contar 10 campos microscópicos, sacar el promedio de glóbulos rojos hipocròmicos

• Policromacia: Hematíes jóvenes que conservan parte del material basófilo del eritroblasto y se tiñen de color gris. Un aumento en la policromatofilia observada en ESP es reflejo de una médula ósea en estrés que está respondiendo a la hipoxia generada por la no-disposición de oxígeno en los tejidos. La policromatofilia se relaciona directamente con reticulocitos revelados con la coloración supravital. Para informar la policromatofilia se debe contar diez campos, sacar un promedio.

4. Inclusiones eritrocitarias.

• Corpúsculos de Howell-Jolly: Corpúsculos redondos únicos o múltiples de 1 µm de diámetro de color rojo violáceo. No es común encontrar más de una inclusión en cada glóbulo, y su hallazgo es típico de procesos diseritropoyeticos. Son basófilos y se tiñen intensamente con las coloraciones de Romanowsky. Están compuestos de por cromatina nuclear picnótica. Las anemias hemolíticas graves, anemias diseritropoyéticos. Un pequeño número de estas inclusiones aparece tras la esplenectomía, la asplenia congénita, así como en la mielofibrosis avanzada.

• Anillos de Cabot: Constituyen unas finas fibras basófilas que se tiñen con el azul

de metileno de las coloraciones de Romanowsky, algunas veces se disponen concentricamente a la membrana eritrocitaria, otras aparecen en forma de ocho. El anillo por lo general se encuentra asociado a otras inclusiones como el

punteado basòfilo. Dado su tamaño no se registran en el histograma glóbulos blancos ni dispersograma. Línea muy fina en forma de anillo o de 8 de color rosado o gris.

• Punteado basófilo: Corresponde a una acumulación de gránulos basófilos que

se tiñen con el azul de metileno de los colorantes de Romanosky, están agregados ribosómicos. El punteado basófilo fino se observa generalmente en trastornos caracterizados por la alteración en la biosíntesis de hemoglobina, como en los síndromes diseritropoyéticos, hemoglobinopatías. El punteado basófilo grueso se observa en procesos tóxicos como en intoxicaciones por plomo; no obstante, cualquiera de los dos, fino o grueso, se puede encontrar indiscriminadamente en cualquiera de los casos mencionados. Agrupados de color azul grisáceo.

• Cuerpos de Pappenheimer: Son inclusiones intraeritrocitarias que contienen

gránulos de hierro en asociación con mitocondrias y restos ribosomales. Son indicativos de las alteraciones de la eritropoyesis, especialmente la observada en las anemias sideroblásticas, talasemias, alcoholismo grave y otros procesos diseritropoyèticos. Se pueden observar también en síndromes postesplenectomía. Gránulos azul negruzcos.

• Reticulocitos • Cuerpos de Heinz: Esferulas azules. • Siderocitos: Gránulos verdes (tinción de Perls). • Parásitos: Plasmodium, filaria, babesia, bartonella bacilliformis.

ANOMALÍAS MORFOLÓGICAS DE LEUCOCITOS POLINUCLEARES NEUTROFILOS

1. Alteraciones nucleares

• Anomalía constitucional de Pelger Huet: Es una anormalidad de los Leucocitos PMN con relativa ausencia de segmentación. Queda configurado en forma de banda o en 2 segmentos; cuando son dos se consideran que uno es imagen especular del otro, y se fundamentan como una expresión heterocigótica del fenómeno. La no lobulación obedece a una expresión homocigótica. Hablamos de Pelger cuando todos los PMN son hiposegmentados y de pseudopelger cuando algunos presentan segmentación normal. Pueden encontrarse normalmente en forma hereditaria o patológicamente adquirida y se considera como precursor de un proceso mieloide agudo. Es muy importante tener en cuenta esta anormalidad, ya que la morfología de los neutrófilos se puede prestar a confusión con algunas células inmaduras. En el histograma de leucocitos se registran en la zona del valle

entre monocitos y granulocitos. En el dispersograma queda con el grupo de neutrófilos, ubicándose hacia el límite inferior de su área de informe.

• Núcleos en anillo: Hiposegmentación nuclear con un gran agujero central. • Hipersegmentación nuclear: Polinucleares con 4 o más segmentos. • Pleocariocito: Hipersegmentación nuclear y gigantismo celular simultáneamente.

2. Alteraciones del citoplasma

• Granulación tóxica: Las granulaciones tóxicas de los PMN son gránulos hipertrofiados que le dan un aspecto hipergranular a los citoplasmas, especialmente de los neutrófilos. Las células con este tipo de inclusiones no presentan un registro especial ni en los histogramas ni en dispersogramas. Granulación que se tiñe de forma pronunciada.

• Degranulación: Neutrófilo sin granulación, aparece azulado y agranular. • Anomalía de Alder-Reilly: Es una característica autosómica recesiva que se manifiesta

en los leucocitos con la presencia de gránulos azurofilos agrupados en racimos. Comúnmente se observa en granulocitos, monocitos, y linfocitos, en neutrófilos se podrían confundir con granulaciones tóxicas, sin embargo, las existencias en otras células diferentes de PMN y la ausencia de vacuolas tóxicas y de cuerpos de Doler ayudan a hacer la diferenciación. Esta anomalía se ha asociado al síndrome de Hunter, el síndrome de Hurler (gargolismo) y el enanismo polidistrófico; todos estos asociados con un desorden de los mucopolisacàridos caracterizado por opacidad de la córnea, defectos en el crecimiento, deformidad de la columna vertebral y muerte en la primera década de la vida. Granulaciones burdas de color violeta.

• Anomalía de steinbrinck Chediak- Higashi: Es un desorden autosomico raro que se

caracteriza por la presencia de PMN carentes de gránulos azurofilos primarios, en su lugar se forman gránulos pleomorficos anormales y afuncionales, se encuentran principalmente en los PMN y monocitos. La ausencia de gránulos normales predispone a la infecciones recurrentes que, en general, es lo que acciona la muerte del pacientes anomalía se observa en niños con infecciones crónicas graves. Frecuentemente se asocia con albinismo. Gránulos en forma de inclusiones azules oscuras de 3 a 9 micras.

• Cuerpos de Dohle: No son exclusivos de PMN, también se pueden encontrar en los

citoplasmas de los monocitos y se observan como inclusiones redondeadas basófilas que se depositan en la periferia de las células, por lo tanto, es más factible encontrarlos en el citoplasma de los neutrófilos, ya que al ser acidófilo, las inclusiones basófilas resaltan en los citoplasmas basófilos de los eosinófilos y los monocitos pueden pasar desapercibidos. Inclusiones basófilas, avaladas o rectangulares.

• Bastones de Auer: Son inclusiones intracitoplasmáticas en forma de varilla o bastón

que observamos en los mieloblastos, promielocitos y monoblastos. Se cree que son gránulos azurofilos que se fusionan. Tienen afinidad por la eosina. Se encuentra en

leucemia mieloide aguda y durante la crisis blastica de la leucemia mieloide crónica. Estructuras azurofilas en forma de bastoncillo, de puntas afiladas (desde blasto hasta Neutrófilo).

OBSERVACIONES DE LA LINEA PLAQUETARIA

• Número de plaquetas • Distribución de plaquetas • Cúmulos de plaquetarios • Satelitismo plaquetario • Anisocitosis plaquetaria • Granularidad plaquetaria

REPORTE ERITROCITARIO EN EL EXTENDIDO DE SANGRE PERIFÈRICA Las anormalidades eritrocitarias (anisocitosis, poiquilocitosis, hipocromia y policromatofilia) se reportan en forma semicuantitativa como aparecen en el siguiente cuadro, una vez analizados varios campos microscópicos: ANISOCITOSIS

Normal Ligera Moderada Marcada 0-5 células 6-15 células 16-30 células Más de 30 células

ADE hasta 15,5 16.1 - 18 18.1-20 Mayor de 20

Ìndice Normal Ligera(+) Moderada(++) Marcada(+++)

0-5 6-15 16-30 MAYOR 30

Micro: VCM (FL)

80-95

76-80

66-75

Menor de 65

Macro: VCM(FL)

80-95

96-108

109-120

Mayor de 120

POIQUILOCITOSIS

Normal Ligera(+) Moderada(++) Marcada(+++) 0-1 célula 2-5células 6-15 células Más de 15 células

POLICROMATOFILIA

Indice Normal Ligera(+) Moderada(++) Marcada(+++)

Reticulocitos% 0-1 1-2 3-5 Más de 6 células 0,1 2-4 5-6 Mayor de 6

HIPOCROMIA

Indice Normal Ligera(+) Moderada(++) Marcada(+++)

HCM% 0-5células 6-15 células 16-30 células Más de 30 células

29-33 28-30 25-27 Menor de 24

INCLUSIONES

Indice Normal Ligera(+) Moderada(++) Marcada(+++9 0 1-2 células 3-5 células Más de 6 células