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EXPRESIÓN DE
PROTEÍNAS EN
LEVADURAS
Saccharomyces cerevisiae
Vectores de Saccharomyces cerevisiae
Vector Secuencias de Frecuencia. de Nº copias/cel. Inestabilidad
Levaduras transformacióna mitótica
b
Integrativo
Yip ADN homólogo 102
> 1 0,1%
Reemplazo ADN homólogo 10 1 Estable
rADN rADN nd 100-200 Estable
Episomal
Replicación ARS 104 1-20 20%
(YRp)
Centromérico ARS/CEN 104
1-2 1%
(YCp)
Basados en 2µ ORI, STB, en 104
25 2-8%
(YEp) huésped 2µ (Yep13)
ORI, STB,REP1, REP2 104
50-100 0,6-1,8%
FLP huésped 2µ0 (pJDB248)
ORI, STB,REP1, REP2 nd 200 0,26%
en huésped 2µ0 (pJDB219
ORI, STB,REP1, REP2 nd 50-100 0,20%
D,FLP en huésped 2µ0
(pJB205)
a Transformantes por µg de ADN usando esferoplastos b Células sin plásmido generadas por generación en medio no selectivo
PLÁSMIDO 2 MICRONES
Vectores de Saccharomyces cerevisiae
Vector Secuencias de Frecuencia. de Nº copias/cel. Inestabilidad
Levaduras transformacióna mitótica
b
Integrativo
Yip ADN homólogo 102
> 1 0,1%
Reemplazo ADN homólogo 10 1 Estable
rADN rADN nd 100-200 Estable
Episomal
Replicación ARS 104 1-20 20%
(YRp)
Centromérico ARS/CEN 104
1-2 1%
(YCp)
Basados en 2µ ORI, STB, en 104
25 2-8%
(YEp) huésped 2µ (Yep13)
ORI, STB,REP1, REP2 104
50-100 0,6-1,8%
FLP huésped 2µ0 (pJDB248)
ORI, STB,REP1, REP2 nd 200 0,26%
en huésped 2µ0 (pJDB219
ORI, STB,REP1, REP2 nd 50-100 0,20%
D,FLP en huésped 2µ0
(pJB205)
a Transformantes por µg de ADN usando esferoplastos b Células sin plásmido generadas por generación en medio no selectivo
Integración cromosómica de ADN por
recombinación homóloga
Marcadores de selección
1-Auxotróficos. Alelos que complementan mutaciones en
cepas auxotróficas.
Ej.: LEU2, TRP1, URA3, HIS3, usados en cepas auxotróficas
para leucina, triptofano, uracilo e histidina
2-Dominantes. Se pueden usar en una mayor variedad de
cepas.
Ej: Tn903kanr: selección con G418
DHFR: selección con metotrexate /sulfanilamida
Cmr: selección con cloranfenicol en medio con glicerol
Promotores y terminadores transcripcionales
Promotores de enzimas glicolíticas: son los más poderosos pero poco regulables
Ej: PGK: fosfoglicerato quinasa
GAP: gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa
ADH: alcohol deshidrogenasa
Son inducidos varias veces por glucosa
Promotores del metabolismo de galactosa: Son los promotores regulables más usados.
Ej: GAL1, GAL7 y GAL10: Se inducen hasta 1000 veces por galactosa y se reprimen por glucosa
Promotores híbridos: Ej: PGK/GAL, tiene la fuerza del promotor PGK y la regulación de GAL
Terminadores: sólo de levaduras. En general se usa el terminador de 2
Secreción de proteínas en Saccharomyces
cerevisiae¿Para qué?
Plegamiento correcto
Evitar efectos tóxicos
Facilita la purificación
Péptido señal péptido N-terminal hidrofóbico
propio de levaduras
MF1: feromona
SUC2: invertasa
PHO5: fosfatasa ácida
MF1
Proteína de 165 aa: prepro factor
Procesamiento: clivaje del péptido señal
corte de Lys-Arg por KEX2
remoción de pares Glu-Ala por diaminopeptidasa STE1
remoción de Lys-Arg terminal por KEX1
Construcción del gen para expresar en levaduras
• 1- Eliminar todas las secuencias no codificantes en la región 5’no codificante (5’UTR) ya que secuencias ricas en G y estructuras 2as son inhibitorias de la iniciación de la traducción
• 2- El ATG debe estar precedido por ADN rico en AT, preferentemente AAAAAATG ya que esto favorece la iniciación de la traducción
• 3- Uso de codones propios del sistema
• 4- Usar ADNc
• 5- Analizar secuencia del gen por posibles sitios de poliadenilación, estructuras 2as cerca del ATG, sitios de glicosilación, etc.
• 6- Incluir sitios de restricción para el clonado
Expression of tetanus toxin fragment C in yeast: gene
synthesis is required to eliminate fortuitous polyadenylation
sites in AT-rich DNAMichael A.Romanos*, Andrew J.Makoff, Neil F.Fairweather, Katrina M.Beesley, Debbie E.Slater,
Fred B.Rayment, Mike M.Paynel and Jeffrey J.Clare
Departments of Molecular Biology and 'Protein Chemistry, Wellcome Biotech, Langley Court,
Beckenham, Kent BR3 3BS, UK. Nucleic Acids Research, Vol. 19, No. 7 1461, 1991
Northern blotting
Glicosilación de proteínas
• Las proteínas son transportadas en vesículas al Golgi
donde los hidratos de carbono sufren modificacines
• N- glicosilación: la señal para la adición de azúcares es la
misma que para mamíferos (Asn-X-Ser/Thr). También
ocurre O-Glicosilación.
• Adicionan muchas manosas: S. Cerevisiae, 50-150
manosas. Además los oligosacáridos poseen uniones
terminales 1-3 glicano
Transformación de levaduras
• Esferoplastos: remoción de la pared
• Litio, PEG
• Electroporación
•La mayoría son promotores constitutivos.
•Falta de promotores fuertes. El producto representa
1-5% del total de las proteínas producidas.
•Los promotores inducibles no producen grandes
cantidades de mRNA cuando se desregulan.
•Inestabilidad plasmídica.
•Hiperglicosilación de glicoproteínas secretadas.
Problemas asociados a la producción en S. c.
Casi todos los productos derivados de levaduras
que están en el mercado son producidos en
Saccharomyces cereviciae
2009: la FDA apueba la 1era proteína
biofarmaceútica producida en una levadura
distinta de S.c. : Inhibidor de kallicreína
producida en Pichia pastoris por Dynax Inc.
LEVADURAS METILOTRÓFICAS
• Son capaces de utilizar metanol como única fuente de C
• Poseen capacidad de crecer a altas densidades, proceso fácilmente
escalable a grandes volúmenes de producción
• La producción de proteínas heterólogas en cepas transformadas
con promotores fuertemente inducibles pueden alcanzar
rendimientos de hasta el 30 - 40% de las proteínas solubles
celulares.
• Sistema actualmente muy difundido
Hansenula polymorpha (Pichia angusta)
Candida boidinii
Pichia methanolica
Pichia pastoris
Pichia pastoris
•Son las primeras enzimas del camino metabólico de
metanol y están codificadas por dos genes AOX1 y AOX2.
•A nivel proteico AOX1 y AOX2 presentan un 97% de
homología
•AOX esta constituída por un octámero de subunidades
idénticas a las que se le unen moléculas de FAD.
ALCOHOL OXIDASA
PEROXISOMA CITOSOL
CH3OH
O2 AOX GSH FDH
H2O2 HCHO HCHO GS-CH2OH HCOOH CO2
CATALASA FLDH NAD NAD
1/2O2 + H2O DHAS NADH2 NADH2
Xu5P
GAP DHA
1/3 GAP constituyentes
DHA DHAP celulares
ATP
ADP FBP F6P
GAP P2
CH3OH
•AOX tiene baja afinidad por el oxígeno. La células
compensan esta baja actividad catalítica sintetizando
grandes cantidades de la enzima. Cuando las levaduras
metilotróficas crecen en glucosa, AOX no es detectable,
mientras que en metanol llega a representar el 30-35% de
las proteínas celulares solubles.
•La síntesis de AOX está regulada a nivel transcripcional.
Promotor AOX1: fuerte, AOX2: débil
Inductor: Metanol
Represor: glucosa, glicerol, etanol
Peroxisomas
Vectores de expresión para Pichia pastoris
Inducción
con
metanol
Promotor AOX1
Desventajas del uso del promotor AOX1
Monitoreo complejo de metanol durante el
proceso fermentativo
El metanol es inflamable
El uso de metanol no es deseable para
industria alimentaria
Uso de dos fuentes de carbono distintas
Inducción
con glucosa o
glicerol
Promotor GAP
Inducción con
metil amina o
metanol
Promotor FLD1
Reemplazo génico
Integración del ADN en genoma
Inserción génica
Recombinación homóloga
Inserción génica en AOX
Inserciones múltiples
Inserción génica en his4
Reemplazo génico
Medio MD Medio MM
Muts
Muts
Mut +
Selección de cepas recombinantes
fenotipo His+Mut+ e His+Muts
Confirmación por PCR y Southern blot
Selección de cepas recombinantes
His+Mut+ e His+Muts
MD MM
Cepa Muts KM71: his4arg4 aox1Δ::ARG4
Métodos de transformación de Pichia pastoris
Método Frecuencia de Conveniencia Integración
transformación (por µg) múltiple
Esferoplastos 105 Baja Sí
Electroporación 105 Alta Sí
PEG1000 103 Alta No
LiCl 102 Alta No
Selección de los clones recombinantes
MD
MD
MM
Caracterización del producto de expresión
SDS PAGE +/- DTT Western blot
Caracterización de la cepa productora
PCR: presencia y estabilidad del gen
Southern blot: Mut+/Muts
Dot Blot: Nº de copias del gen
PCR cuantitativa: Nº de copias del gen
GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS
EN LEVADURAS
El patrón de glicosilación en levaduras
es distinto del de mamíferos
GLICOSILACIÓN DE PROTEÍNAS
1- N- GLICOSILACIÓN
2- O- GLICOSILACIÓN
Glicosilación de proteínas
• Las proteínas son transportadas en vesículas al Golgi
donde los hidratos de carbono sufren modificacines
• N- glicosilación: la señal para la adición de azúcares es la
misma que para mamíferos (Asn-X-Ser/Thr). También
ocurre O-Glicosilación.
• Adicionan muchas manosas: S. Cerevisiae, 50-150
manosas. Además los oligosacáridos poseen uniones
terminales 1-3 glicano
N- GLICOSILACIÓN
“Sequon”: Asn-X-Thr/Ser X: cualquier
aa menos Prolina
Asn
Se cortan las glucosas y una manosa α-1,2 y se transporta a
Golgi en donde se adicionan otros azúcares y fosfato
Pichia: 3-13 manosas. S.c. > 50 manosas
La disposición del “sequon” en la estructura terciaria de la
proteína es importante para la glicosilación:
“Competencia”: plegamiento vs. Glicosilación
Formación de puentes de H2
Cercanía a S-S (crecimiento de células con DTT)
Cercanía a COOH terminal (menos tiempo para glicosilarse)
Estabilidad de la estructura secundaria (pro péptido)
Disposición tridimencional de los sequones en la proteína, sobre
todo cuando están cerca (glicosilación del 1º puede alterar al 2º)
Disponibilidad de precursores: oligosacárido dolicol, transferasa
La velocidad de síntesis de la proteína
influencia el grado de glicosilación
Glicosilación y estabilidad de la
proteína
En algunos casos la glicosilación confiere termoestabilidad:
calor o frío
Puede conferir estabilidad estructural:
Evitando proteólisis
Ayudando con el plegamiento correcto
Ser/Treo
α - manosa
α – 1,2 manosa
O-GLICOSILACIÓN EN LEVADURAS
Sequon? Abundancia inusual de ser/treo
Prolinas cerca de ser/thr
aa cargados cerca de ser/treo
GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN
LEVADURAS
El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del
de mamíferos
Las proteínas humanas, glicosiladas en levaduras,
pueden tener efectos inmunogénicos en humanos
Alternativas para prevenir la glicosilación en levaduras
Tunicamicina
Cepas mutantes
Enzimas para desglicosilar
No usar la vía de secreción
Mutagénesis dirigida
La productividad de un sistema recombinante está
determinada por muchos factores genéticos y fisiológicos.
Posibles cuellos de botella:
Uso de codones
Número de copias del gen
Transcripción eficiente usando promotores fuertes
Señales de traducción
Translocación determinada por el péptido señal
Procesamiento y plegamiento en RE y Golgi
Secreción
Proteólisis…..cepas SMD1168 (his4pep4), pH, casa aminoácidos, etc.
A Single Mutation in the Activation Site of Bovine Trypsinogen
Enhances Its Accumulation in the Fermentation Broth of the
Yeast Pichia pastorisJosé Hanquier,1 Yannick Sorlet,2 Dominique Desplancq,2 Laurence Baroche,2 Marc Ebtinger,3 Jean-François Lefèvre,2 Franc
Pattus,2 Charles L. Hershberger,1 and Alain A. Vertès3* Lilly Research Laboratories,
Applied and Environmental Microbiology, February 2003, p. 1108-1113, Vol. 69, No. 2
Engineering of Pichia pastoris for Improved Production of
Antibody FragmentsBrigitte Gasser,1 Michael Maurer,1 Johannes Gach,1 Renate Kunert,1 Diethard Mattanovich1,2
Biotechnology and Bioengineering, Vol. 94, No. 2, June 5, 2006
Retención de la cadena pesada, pero no de la liviana, del Fab a lo
largo de la fermentación el plegamiento de la proteína y el
ensamblado del dímero en el RE son pasos limitantes en la
secreción del Fab
1- Uso de AOX1 vs GAP
2-
Efecto de la sobre expresión de HAC1 y PDI en la secreción del Fab
Conversion of an inactive xylose isomerase into a
functional enzyme by co-expression of GroEL-
GroES chaperonins in Saccharomyces cerevisiaeBeatriz Temer1 , Leandro Vieira dos Santos1,2, Victor Augusti Negri1 , Juliana Pimentel
Galhardo1 , Pedro Henrique Mello Magalhães1 , Juliana José1 , Cidnei Marschalk1 , Thamy
Lívia Ribeiro Corrêa1 , Marcelo Falsarella Carazzolle1 and Gonçalo Amarante Guimarães
Pereira
BMC Biotechnology (2017) 17:71
This study demonstrated that XI from the bacterium Propionibacterium
acidipropionici becomes functional in S. cerevisiae when co-expressed
with GroEL-GroES chaperonin complex from Escherichia coli. The
developed strain BTY34, harboring the chaperonin complex, is able to
efficiently convert xylose to ethanol.
Cambio de escala
2.5 l Fermenters, with 1.5 l working
volume
50 mlShake-flask
cultures20 l Fermenters, with 15 l working
volume
400 l Fermenters, with 300 l working
volume
COSECHA CENTRIFUGACIÓN