Univerzitet u Beogradu Biološki fakultet

mr Saša P. Marić

Evolucijska istorija kompleksa potočne pastrmke Salmo trutta L. 1758 na području

Republike Srbije i značaj za ribarstvo

Doktorska disertacija

Beograd, 2005.

Univerzitet u Beogradu Biološki fakultet

mr Saša P. Marić

Evolucijska istorija kompleksa potočne pastrmke Salmo trutta L. 1758 na području

Republike Srbije i značaj za ribarstvo

Mentor: dr Predrag Simonović – vanredni profesor Biološki fakultet Univerzitet u Beogradu

Članovi komisije: dr Jelka Crnobrnja - Isailović – naučni saradnik Institut za biološka istraživanja «Siniša Stanković» Beograd dr Aleš Snoj – naučni saradnik Biotehnički fakultet Univerzitet u Ljubljani Datum odbrane:

Doktorska disertacija

Beograd, 2005.

Zahvalnica III

Zahvalnica

Zahvaljujem se svima koji su mi na bilo koji način olakšali rad na izradi disertacije i koji su svojim zalaganjem i nesebičnošću doprineli da ona ugleda svetlost dana. Srdačno se zahvaljujem mentoru i članovima Komisije na korektnom i profesionalnom odnosu punom razumevanja. Zahvaljujem se mentoru Prof. dr Predragu Simonoviću, koji mi je, osim istina iz ove nauke, pokazao da se autoritet i poštovanje stiču jedino znanjem i korektnim odnosom prema kandidatu. Posebno se zahvaljujem za ukazano poverenje i neograničenu slobodu. Zahvaljujem se dr Alešu Snoju koji je rukovodio laboratorijskim radom i koji me je upoznao sa metodama molekularne genetike. Posebno mu se zahvaljujem na posvećenom vremenu, izuzetnom stpljenju, ukazanom poverenju, ustupljenoj literaturi, savetima, kao i odnosu za koji sigurno mogu reći da prevazilazi granice profesionalnog. Takođe se zahvaljujem dr Jelki Crnobrnji – Isailović koja mi je izašla u susret kada je to bilo neophodno, i u najkraćem roku pregledala disertaciju dajući veoma korisne sugestije. Zahvaljujem se Nenadu Sekuliću iz Zavoda za zaštitu prirode Srbije na ustupljenom materijalu sa područja Kosova i Metohije, kao i kolegama Prof. dr Božidaru Ćurčiću, Prof. dr Predragu Simonoviću, Doc. dr Veri Nikolić, dr Ljiljani Tomović, Vladanu Bjedovu, Rastku Ajtiću, Nikoli Kolundžiću, Čedomiru Mijoviću i Žiki Milenkoviću, predsedniku Ribarskog područja «Južna Morava I» Leskovac, koji su mi na različite načine pomogli u prikupljanju analiziranog materijala. Zahvaljujem se kolegama dr Simoni Sušnik, mr Andreju Raspetu, mr Tamari Jug, mr Brigiti Slavec, mr Poloni Frajman i Vidi Štuhec sa Biotehničkog fakulteta u Ljubljani koji su mi pomogli u prevazilaženju svih laboratorijskih problema i koji su svojom ljubaznošću i gostoprimstvom svakako doprineli da mi deo izrade teze koji se odvijao na Biotehnickom fakultetu u Ljubljani ostane u prelepom sećanju.

Zahvaljujem se kolegama Prof. dr Milošu Kaleziću, Doc. dr Ani Ivanović, dr Ljiljani Tomović i mr Imreu Krizmaniću na razumevanju i peuzimanju dela nastavnih i drugih obaveza za vreme izrade disertacije.

Takođe se zahvaljujem mr Tamari Karan Žnidaršič na korisnim sugestijama vezanim za tehničku obradu teksta, a mr Biljani Stojković za pomoć pri tumačenju pojedinih rezultata.

Posebno bih se zahvalio svojim roditeljima, bratu i naravno supruzi Katarini, za

pruženu podršku, moralnu potporu i sva odricanja koja su bila neminovna prilikom izrade disertacije. Najlepše vam hvala.

Saša Marić

Izvod IV

Izvod

Za rasvetljavanje filogeografije populacija potočne pastrmke (Salmo trutta) na

području Republike Srbije, sekvencioniran je 5' kraj kontrolnog regiona mtDNA u dužini

od 561 bp i dobijene sekvence upoređene su sa poznatim sekvencama iz prethodnih

istraživanja na drugim teritorijama. U analizu je uključena 101 jedinka poreklom iz

gornjih tokova reka crnomorskog, egejskog i jadranskog sliva. Sekvencioniranjem je

identifikovano petnaest haplotipova, od kojih se četrnaest smatra autohtonim i oni

pripadaju dunavskoj i jadranskoj liniji, dok samo jedan haplotip (ATcs1), pronađen kod

dve jedinke poreklom iz dve poribljavane reke, pripada atlantskoj liniji koja je

komercijalizovana i najčešće korišćena za poribljavanje. Autohtoni haplotipovi odlikuju

se izrazitom geografskom distribucijom: dunavski haplotipovi su strogo ograničeni na

reke dunavskog sliva, dok jadranski haplotipovi dominiraju u rekama egejskog i

jadranskog sliva; najveći deo ukupne molekularne varijanse (69%) pripisan je upravo

razlikama između slivova. Filogenetskom rekonstrukcijom, koja je dopunjena sa šest

novih haplotipova, po prvi put opisanih u ovom radu, podržano je stanovište o

ancestralnoj poziciji dunavske linije unutar kompleksa potočne pastrmke, kao i naglašeno

postojanje posebne farioides (Ad+) klade otkrivene unutar jadransko-mediteranske-

marmoratus filogenetske grupe. Dobijeni rezultati potvrdili su naša očekivanja o

postojanju visokog genetičkog diverziteta balkanskih populacija potočne pastrmke, što

zahteva dalja istraživanja koja bi trebala da obuhvate pastrmske populacije iz celog

regiona.

Sadržaj VI

Sadržaj

Zahvalnica................................................................................................. III Izvod ......................................................................................................... IV Abstract .......................................................................................................V Sadržaj....................................................................................................... VI Skraćenice i simboli ................................................................................VIII

1. UVOD......................................................................................................... 1

1.1. Uvodne napomene ...................................................................................... 1 1.2. Pregled lterature .......................................................................................... 3 1.2.1. Uopšteno o Salmonidama ........................................................................... 3 1.2.2. Karakteristike familije Salmonidae............................................................. 4 1.2.3. Klasifikacija i filogenetski odnosi unutar familije Salmonidae.................. 5 1.2.4. Salmo trutta (Linnaeus, 1758) - potočna pastrmka................................... 12 1.2.5. Metode razlikovanja ribljih populacija ..................................................... 21 1.2.5.1. Morfološke metode razlikovanja ribljih populacija .................................. 21 1.2.5.2. Genetičke metode razlikovanja ribljih populacija .................................... 22 1.2.5.2.1. Alozimi ..................................................................................................... 23 1.2.5.2.2. Savremeni genetički markeri .................................................................... 24 1.2.5.2.2.1. Ponavljajuća DNA .................................................................................... 25 1.2.5.2.2.1.1. Mikrosateliti .............................................................................................. 25 1.2.5.2.2.2. Mitohondrijalna DNA............................................................................... 27 1.2.5.2.2.2.1. Osobine mitohondrijalne DNA ................................................................. 28 1.2.5.2.2.2.2. Mitohondrijska DNA kao genetski marker............................................... 31 1.2.5.2.2.2.3. Upotreba mtDNA za proučavanje vrsta i populacija salmonida............... 32 1.2.6. Ugroženost potočne pastrmke (Salmo trutta) u Evropi ............................ 35 1.3. Ciljevi rada................................................................................................ 38

2. MATERIAL I METODE.......................................................................... 39

2.1. Materijal .................................................................................................... 39 2.1.1. Prikupljanje i čuvanje uzoraka.................................................................. 39 2.1.2. Raspored lokaliteta i brojnost analiziranih uzoraka.................................. 40 2.1.3. Hemikalije................................................................................................. 42 2.1.3.1. Priprenljeni setovi hemikalija ................................................................... 42 2.1.3.2. Enzimi ....................................................................................................... 42 2.1.3.3. Početni oligonuklotidi (prajmeri).............................................................. 43 2.1.3.4. Markeri...................................................................................................... 43 2.1.3.5. Puferi......................................................................................................... 43 2.1.4. Laboratorijska oprema .............................................................................. 43 2.2. Metode ...................................................................................................... 44 2.2.1. Izolacija DNA ........................................................................................... 44 2.2.1.1. Fenolna ekstrakcija ................................................................................... 44 2.2.1.2. Wizard® Genomic DNA Purification Kit ................................................. 45 2.2.1.3. Jet quick tissue DNA spin kit/250 ............................................................ 45

Sadržaj VII

2.2.2. Provera uspešnosti izolacije DNA ............................................................ 45 2.2.3. Lančana reakcija polimeraze (PCR) ......................................................... 46 2.2.4. Restrikciona analiza kontrolnog regiona mtDNA..................................... 48 2.2.5. Sekvencioniranje mitohondrijalne DNA................................................... 48 2.2.5.1. Izolacija fragmenata DNA iz agaroznog gela ........................................... 48 2.2.5.2. Priprema reakcije za automatski sekvenator............................................. 49 2.2.5.3. Priprema DNA fragmenata za sekvencioniranje....................................... 50 2.2.5.4. Sekvencioniranje DNA fragmenata .......................................................... 50 2.2.6. Programska analiza kontrolnog regiona mtDNA...................................... 51

3. REZULTATI............................................................................................. 53

3.1. Analiza kontrolnog regiona mtDNA upotrebom RFLP tehnike ............... 53 3.2. Analiza sekvencioniranja kontrolnog regiona mtDNA............................. 54 3.2.1. Upoređivanje sekvenci kontrolnog regiona mtDNA pronađenih

haplotipova na teritoriji Srbije sa već poznatim haplotipovima potočne pastrmke iz svih filogenetskih linija ......................................................... 63

4. DISKUSIJA .............................................................................................. 71

4.1. Analiza kontrolnog regiona mtDNA......................................................... 72 4.2. Paleozoogeografska razmatranja, sa osvrtom na kolonizaciju Evrope

potočnom pastrmkom ............................................................................... 81 4.3. Konzervacija genetičke raznovrsnosti populacija potočne pastrmke ....... 95 4.3.1. Specifičnosti konzervacije potočne pastrmke........................................... 95 4.3.2. Status ugroženosti potočne pastrmke u Evropi ......................................... 97 4.3.3. Definisanje konzervacionih jedinica......................................................... 98 4.3.4. Krajnja preporuka u konzervaciji potočne pastrmke ................................ 99 4.3.5. Konzervacija diverziteta haplotipova u Srbiji i značaj za ribarstvo ....... 100

5. ZAKLJUČCI........................................................................................... 107

6. SUMMARY............................................................................................ 111

7. LITERATURA ....................................................................................... 113

Skraćenice i simboli VIII

Skraćenice i simboli

A adenin

ATP adenozin trifosfat

bp bazni par

C citozin

ddNTP 2’, 3’ – dideoksinukleozid 5’–trifosfat

DNA dezoksiribonukleinska kislina

dNTP 2’ – deoksinukleozid 5’ – trifosfat

EDTA etilen – diamino – tetraosirćetna kislina

eng. engleski

G guanin

kbp hiljadu baznih parova

mtDNA mitohondrijska DNA

PCR polymerase chain reaction

pH negativni logaritam koncentracije vodonikovih jona

RFLP restriction fragment lenght polymorphism

RNA ribonukleinska kislina

rRNA ribozomalna RNA

SDS sodium dodecyl sulphate

T timin

TAE rastvor Trisa, acetata u EDTA

Taq DNA–polimeraza DNA – polimeraza, izolovana iz Thermus aquaticus

TBE rastvor Trisa, borata u EDTA

TEN rastvor Trisa, EDTA u NaCl

Tris 2 – amino – 2 – (hidroksimetil) – 1, 3 – propandiol

tRNA transportna RNA

TSR template suppresion reagent

Uvod

1

1. UVOD 1.1. UVODNE NAPOMENE

Povoljni prirodni uslovi omogućuju postojanje više hiljada vodotokova na

teritoriji Srbije. Njihova ukupna dužina iznosi 65980 km ili prosečno 747 m/km2. U Srbiji

ima samo 11 reka čija dužina iznosi preko 200 km, što znači da preovlađuju male i

srednje reke dužine ispod 100 km (Gavrilović i Dukić, 2002).

Reke Srbije otiču u tri mora, tako da se može reći da Srbija predstavlja

hidrografski čvor Balkana. Najveća površina teritorije odvodnjava se prema Crnom

(92,46%), a znatno manja površina ka Jadranskom (5,36%) i Egejskom moru (2,18%).

Morski slivovi Srbije razlikuju se ne samo po veličini nego i hidrološki, što je uzrokovano

specifičnim klimatskim prilikama, uslovima oticanja padavina i geološkim sastavom

terena.

Hidrološka raznovrsnost na području Srbije u pogledu broja, veličine, geografskog

položaja i oticanja reka uslovila je i raznovrsnost živog sveta koji je vezan za vodena

staništa. U planinskim vodama koje preovlađuju po broju u odnosu na ravničarske

nalazimo idealne uslove za život pastrmskih vrsta riba. Prirodna nepovezanost morskih

slivova i geotektonski događaji uslovili su da danas na području Srbije žive izolovane,

lokalno specifične populacije potočne pastrmke (Salmo trutta).

U poslednjih 20 godina mnogo je rađeno na utvrđivanju genetičkog identiteta

populacija potočne pastrmke na području Evrope (Ferguson i Fleming, 1983; Krieg i

Guyomard, 1985; Ferguson, 1989; Karakousis i Triantaphyllidis 1990; Phillips i Pleyte,

1991; Bernatchez i sar., 1992; Bernatchez, 1995; 2001; Giuffra i sar., 1994; 1996;

Bernatchez i Osinov, 1995; Riffel i sar., 1995; Apostolidis i sar., 1996; 1996a; 1997;

Garcia-Marin i sar., 1996; 1999; McKay i sar., 1996; Shed'ko i sar., 1996; Oleynik, 1997;

Phillips i Oakley, 1997; Weiss i sar., 2000; 2001; Cortey i García-Marín, 2002; Cortey i

sar., 2004). Na osnovu već poznatih rezultata, predpostavili smo da i populacije na

području Srbije zbog duge izolovanosti i specifičnosti staništa predstavljaju posebne

evolutivne grane.

Snažan razvoj sportskog ribolova, kao i veoma zastupljen krivolov uz narušavanje

prirodnih uslova staništa doveli su do značajnog smanjenja brojnosti populacija potočne

pastrmke, a pojedine populacije su postale ugrožene sa stanovišta opstanka. Kao

Uvod

2

posledica toga dolazi vrlo često do poribljavanja komercijalnim linijama koje su

prilagođene ribnjačkom uzgoju. Najčešće se radi o linijama alohtonog porekla, koje se

nakon ubacivanja u vodotokove nesmetano ukrštaju sa autohtonim populacijama, što

može dovesti do ugrožavanja genetičke specifičnosti autohtone populacije. Unošenje

alohtonih populacija može dovesti i do kompeticije u pogledu osnovnih životnih resursa

što može rezultirati potiskivanjem autohtonih populacija iz njihovih prirodnih staništa.

Pastrmke imaju izrazitu osobinu fenotipske plastičnosti, odnosno odgovora na

promenu uslova staništa što često dovodi do nastanka specifičnih životnih formi, tako da

se genetički različite jedinke fenotipski ne razlikuju i obratno (Bernatchez i sar., 1992).

Fenotipski karakteri mogu biti indikativni (Marić i sar., 2004), ali nisu do kraja pouzdani

za razlikovanje autohtonih od alohtonih populacija, pa je zbog toga neophodno koristiti

precizne molekularno-genetičke metode. Na osnovu rezultata dobijenih uz pomoć ovih

metoda može se sa velikom tačnošću utvrditi autohtonost populacija. Autohtone

populacije su još uvek sačuvane u izvorišnim, nepristupačnim delovima vodotokova koji

su vrlo često odvojeni prirodnim barijerama od nizvodnih delova tokova. Autohtone

populacije su retke ali još uvek postoje, pa, zahvaljujući tome, u budućnosti mogu biti

formirana autohtona matična jata (stvaranje matičnih jata je skupo, nije uvek praktično za

održavanje i isplati se samo za jata zastupljena u ribolovno atraktivnim vodama i gde

postoje dokazi da nije bilo introdukcije). Autohtono matično jato može se koristiti za

repopulaciju na onim lokalitetima na kojima je pastrmka gotovo istrebljena, kao i na

ribolovno atraktivnim vodama pod snažnim ribolovnim pritiskom.

Kao marker za utvrđivanje genetičke varijabilnosti populacija potočne pastrmke u

ovom radu koristili smo kontrolni region mitohondrijalne DNA, koji je, zbog svoje

hipervarijabilnosti, dobar genetički marker. Zbog načina nasleđivanja, mtDNA se koristi

za utvrđivanje filogenetskih odnosa između rodova, vrsta i nižih taksonomskih jedinica.

Ovaj tip istraživanja spada u filogeografske studije pomoću kojih se može utvrditi

geografski raspored evolutivnih linija, kao i geografski procesi koji su uticali na taj

raspored, sa posebnim osvrtom na različitost, kako između srodnih vrsta, tako i unutar

vrste (Avise, 1998; Hewitt, 2001).

Uvod

3

1.2. PREGLED LITERATURE 1.2.1. UOPŠTENO O SALMONIDAMA

Salmoniformes je relativno brojan red primitivnih Euteleostei koji obuhvata dva

podreda: Osmeroidei i Salmonoidei (Johnson i Patterson, 1996).

U okviru podreda Osmeroidei nalazi se porodica Osmeridae sa šest rodova. Vrste

ove porodice uglavnom su ograničene na severne delove Atlantika i Pacifika. To su ribe

male veličine sa adipoznim perajem. Žive u obalnim zonama odakle mnoge ulaze u reke

gde se mreste. U nekim delovima areala dostižu veliku brojnost, tako da su i ekonomski

važne ribe.

Podred Salmonoidei uključuje anadromne i potamodromne grupe, koje veći deo

životnog ciklusa provode u morima i čije migracije po spektakularnosti nalikuju

migracijama jegulja. Zavičajno ponašanje ovih riba je veoma izraženo. Salmonidnim

ribama pripadaju i grupe koje su isključivo slatkovodne (npr. Hucho, Salmothymus,

Salvethymus). Kod salmonidnih riba iza dorzalnog peraja postoji dobro razvijeno

adipozno peraje. Kod anadromnih salmonidnih riba primarna metamorfoza se događa

tokom nizvodnih migracija. Sekundarna metamorfoza se odvija tokom uzvodnih

migracija pred period mresta. Kod pripadnika roda Salmo i nekih drugih rodova dolazi do

"regresivne metamorfoze", gubljenja morfoloških karakteristika nastalih sekundarnom

metamorfozom tokom njihovih nizvodnih migracija posle reprodukcije. Kada naredni put

ove ribe krenu da se mreste, kod njih se ponavlja ciklus morfoloških promena i njihovog

gubljenja (Saunders i Schom, 1985).

Salmonide imaju cirkumpolarno rasprostranjenje i karakteristične su za severnu

Zemljinu hemisferu (Slika 1). Naseljavaju područja Severnog ledenog mora i severnog

dela Atlantika i Pacifika, reke i mora Evrope, zapadne Azije i Severne Amerike (Lagler,

1977). Zbog njihovog komercijalnog značaja introdukovane su i u vode južne Amerike,

Australije i Novog Zelanda (Wheeler, 1992).

Slika 1. Područje rasprostranjenja Salmonida (Maitland, 1995) – modifikovano.

Uvod

4

Na osnovu palentoloških dokaza utvrđena je pojava salmonidnih vrsta još početkom

tercijara u eocenu, dok su krajem tercijara i početkom kvartara bile široko rasprostranjene

(Mitrović i Pavlović, 1980). Među naučnicima postoje nesuglasice oko pradomovine

salmonida. Neki smatraju da salmonide vode poreklo iz slatkih voda (Neave, 1958;

Vladykov, 1963), ali ima i onih koji veruju da je more njihovo prvobitno stanište (Schmidt,

1947).

1.2.2. KARAKTERISTIKE FAMILIJE SALMONIDAE

Jedna od osnovnih zajedničkih karakteristika svih vrsta riba iz familije

Salmonidae je postojanje masnog ili adipoznog peraja, koje se nalazi između leđnog i

repnog peraja. Celo telo riba iz ove familije je, izuzev glave, prekriveno sitnim krljuštima.

Bočna linija je jasno uočljiva. Leđno peraje je kratko. Dentalne, gornjevilične i

međuvilične kosti salmonidnih vrsta riba su nazubljene, a od kostiju gornje vilice

najsnažnije je nazubljen vomer. Kod salmonidnih vrsta on je različito nazubljen, pa oblik

i nazubljenost vomera (kao i broj piloričnih nastavaka koji varira između 17 i 210)

predstavlja važan taksonomski karakter, koji služi za identifikaciju riba iz ove familije.

Kako su one izraziti predatori, želudac im je prilagođen varenju hrane životinjskog

porekla - širok je i mišićav.

Leđa i bokovi salmonidnih vrsta su prekriveni crnim i/ili crvenim pegama, a kod

nekih vrsta i raznim tipovima pruga i šara.

Sve salmonidne vrste obitavaju isključivo u hladnim, bistrim i nezagađenim

potocima ili rekama brzog toka, koje su bogate rastvorenim kiseonikom (O2) ili u

planinskim jezerima čije se temperature vode kreću oko 10oC i koje, ni u najtoplije doba

godine, ne prelaze 18oC (maksimalno 20oC). To su sve tzv. reofilne vrste riba,

vretenastog oblika tela, prilagođene životu u brzim rečnim tokovima.

Sve vrste iz familije Salmonidae mreste se isključivo u slatkoj vodi, i to u

izvorišnim delovima potoka ili reka u kojima obitavaju ili pak, u priobalnim delovima

jezera, u kojima žive na peskovitom, šljunkovitom ili kamenitom dnu navedenih vodenih

biotopa. Sazrevanje gonada riba iz ove familije nastupa u kasnim jesenjim danima, od

novembra do januara - ređe od oktobra do februara - izuzev mladice (Hucho hucho),

mekousne pastrmke (Salmothymus obtusirostris) i lipljana (Thymallus), koje se mreste u

prolećnim mesecima (mart - april). Relativna plodnost (RF – predstavlja broj jaja na 1 kg

Uvod

5

telesne težine) salmonidnih vrsta riba relativno je mala i kreće se od oko 1500 jaja - ikre

(kod potočne pastrmke) do oko 12000 jaja (kod mladice) u odnosu na 1 kg telesne težine.

Veličina riba iz familije Salmonidae je neujednačena. Dok vrste iz roda Salmo,

Salvelinus i Salmothymus u potocima i manjim rečicama narastu otprilike do 30 ili 40 cm

totalne dužine i između 0,30 kg i 1 kg mase tela (nekada i nešto više), one iz većih, dubljih

reka ili jezera narastu znatno više, čak i preko 22 kg, a mladica i preko 50 kg (Aganović,

1979).

1.2.3. KLASIFIKACIJA I FILOGENETSKI ODNOSI UNUTAR FAMILIJE SALMONIDAE

Klasifikacija porodice Salmonidae je često menjana, tako da je vrlo teško dati

precizan broj rodova u okviru podfamilije Salmoninae. Broj rodova, u zavisnosti od

autora, kreće se između 5 i 10 (Nelsen, 1984). Prema klasifikaciji Starley-a i Smith-a

(1993) broj rodova je 8, a prema najnovijoj klasifikaciji salmonida po ITISu (eng.

Integrated Taxonomic Information Sistem, 30. 03. 2004.), broj rodova u okviru

podfamilije Salmoninae je 7.

Superordo: Protacanthopterygii

Ordo: Salmoniformes

Familia: Salmonidae

Subfamilia: Corregoninae (ozimice)

Subfamilia: Thymalinae (lipljani)

Subfamilia: Salmoninae

Genus: Brachymystax, (lenok)

Genus: Hucho, (mladica)

Genus: Oncorhynchus, (pacifički lososi i pacifičke pastrmke)

Genus: Parahucho

Genus: Salmo, (atlantski losos i pastrmka)

Genus: Salvelinus, (zlatovčice)

Genus: Salvethymus

Uvod

6

Porodica Salmonidae obuhvata tri podporodice: Thymallinae, Coregoninae i

Salmoninae (Shaposhnikova, 1975). Ovakva podela porodice Salmonidae na tri

podporodice je opšte prihvaćena. Prema morfologiji rodovi podporodice Salmoninae su

noviji i napredniji oblici u odnosu na rodove podporodica Thymallinae i Coregoninae, za

koje se smatra da su evolutivno stariji (Stearley i Smith, 1993; Slika 2).

Slika 2. Prikaz odnosa među rodovima porodice Salmonidae na osnovu morfoloških

istraživanja (Starley i Smith, 1993).

Mnogo veća neslaganja među autorima možemo sresti pri klasifikaciji rodova

unutar podporodice Salmoninae.

Autori se uglavnom slažu oko filogenetskog statusa najbolje proučenih rodova

(Hucho, Salvelinus, Salmo, Oncorhynchus), za koje se smatra da predstavljaju naprednije

salmonide. To se posebno odnosi na rodove Oncorhynchus i Salmo. Ostali rodovi:

Brachymystax, Salmothymus, Acantholingua i Platysalmo, koji su slabije proučeni,

smatraju se morfološki primitivnijim i njihovo filogenetsko mesto još uvek je potpuno

nejasno (Stearley i Smith, 1993; Osinov, 1999; Phillips i Oakley, 1997).

Uvod

7

Slika 3.Prikaz četiri filogenetske hipoteze date na osnovu morfoloških analiza od strane

različitih autora (za odnose između rodova Brachymystax, Hucho i Salvelinus) (1) Norden

(1961), (2) Kendall i Behnke (1984), (3) Dorofeeva (1989) i (4) Stearley i Smith (1993).

(1)

(3)

Prema prvoj hipotezi, Norden (1961) smatra da svaki od rodova ima monofiletsko

poreklo (Slika 3-1). Kendall i Behnke (1984), prema drugoj hipotezi, smatraju da rodovi

Brachymystax, Hucho i Salvelinus vode poreklo od zajedničke monofiletske grupe (Slika

3-2). Dorofeyeva (1989), prema trećoj hipotezi, smatra da rodovi Brachymystax, Hucho i

Parahucho vode poreklo od jedne zajedničke monofiletske grupe, a Salvelinus od druge

(Slika 3-3). Stearley i Smith (1993), prema četvrtoj hipotezi, smatraju da rodovi Hucho i

Salvelinus vode poreklo od jedne monofiletske grupe, Salmothymus i Acantholingua od

druge, a Brachymystax od treće (Slika 3-4).

Intergenerički odnosi u podporodici Salmoninae znatno su izmenjeni nakon

uvođenja molekularnih tehnika (Slika 4). Dobijanjem novih rezultata koji su bili različiti

u odnosu na rezultate dobijene morfološkim analizama, bilo je neophodno izvršiti

reklasifikaciju rodova u okviru podporodice. Dobijeni rezultati bili su pre svega značajni

za utvrđivanje taksonomske pozicije “problematičnih” rodova (Brachymystax,

Salmothymus, Acantholingua i Platysalmo).

Thymallus

Brachymystax

Hucho Salvleinus

Salmo

Oncorhynchus

Thymullus

Brachymystax

Hucho

Parahucho

Salvelinus

Salmothymus

Salmo

Oncorhynchus

Thymallus

Brachymystax

Hucho

Salvelinus

Salmo

Oncorhynchus

Thymallus

Brachymystax

Acantholingua

Salmothymus

Hucho

Salvelinus

Salmo

Oncorhynchus

(2)

(4)

Uvod

8

Predstavnici rodova Parahucho i Salvethymus (ITIS, 2004), na osnovu genetičkih

istraživanja, svrstani su u rodove Hucho i Salvelinus (Phillips i Oakley, 1997).

Oakley i Phillips (1999) su sekvencionirali gen hormona rasta (GH2C) i dobili

rezultate na osnovu kojih je rod Brachymystax predstavljen kao izvedeniji predstavnik

roda Hucho. Samim tim je odbačena hipoteza o rodu Brachymystax kao primitivnijem

(arhaičnom) rodu podporodice Salmoninae.

Sistematsko mesto roda Acantholingua je takođe izmenjeno nakon rezultata koje

su dobili Phillips i sar., (2000), sekvencioniranjem gena hormona rasta (GH2C), gena na

ribozomalnoj RNA (ITS1) i citohroma b na mitohondrijalnoj DNA. Na osnovu dobijenih

rezultata, rod Acantholingua filogenetski je najbliži rodu Salmo.

Slika 4. Reklasifikacija rodova podfamilije Salmoninae bazirana na molekularnim

podacima (mtDNA, GH2C i ITS1).

Sistematsko mesto roda Salmothymus takođe je bilo diskutabilno dok nisu urađene

analize nuklearne DNA i sekvencioniranja kontrolnog regiona i citohroma b

mitohondrijalne DNA (Slika 5). Na osnovu dobijenih rezultata, rod Salmothymus, isto kao

i rod Acantholingua, filogenetski je najbliži rodu Salmo (Snoj i sar., 2002).

Thymallus Brachymystax Acantholingua Salmothymus Hucho Salvelinus Salmo Oncorhynchus

Thymallus Salmothymus Hucho Brachymystax Salvelinus Acantholingua Salmo Oncorhynchus

Uvod

9

Slika 5. Intergeneričko stablo porodice Salmonidae, urađeno na osnovu analiza nuklearne

DNA i sekvencioniranja kontrolnog regiona i citohroma b mtDNA.

Rodovi Salmothymus, Acantholingua i Salmo čine posebnu grupu u okviru

intergeneričkog stabla, što govori o njihovim srodničkim vezama.

Dalja istraživanja išla su u pravcu utvrđivanja tačnog položaja roda Salmothymus i

Acantholingua unutar grupe Salmo (Slika 6). Istraživanja su vršena ispitivanjem LDH-

C1* i ITS1 gena nuklearne DNA i kontrolnog regiona mtDNA (Snoj i sar., 2002; Snoj,

2003). U analizama se kao veoma bitan pokazao LDH-C1* gen koji je sinapomorfna

odlika rodova Salmothymus, Acantholingua i Salmo, što ga čini validnim genetičkim

markerom za utvrđivanje filogenetskih odnosa ovih rodova.

0.1

Oncorhynchus keta

Oncorhynchus mykissSalmo salar

Salmo trutta

Salmothymus obtusirostris

Acantholingua ohridana

Salvelinus fontinalis

Salvelinus alpinus

Coregonus lavaretus

Thymallus thymallus

Thymallus arcticus

Coregonus albula

Brachymystax lenok

Uvod

10

Slika 6. Filogenetski odnosi unutar grupe Salmo, dobijeni na osnovu sekvencioniranja

LDH-C1* i ITS1 gena nuklearne DNA, kontrolnog regiona i citohroma b mtDNA. Da –

dunavska, At – atlantska, Ma – marmoratus i Ad – jadranska linija.

Na osnovu dobijenih rezultata (Snoj i sar., 2002; Snoj, 2003), autori su zaključili

da unutar grupe Salmo postoje tri podgrupe: Salmo salar, Salmo trutta kompleks koji

uključuje i Salmo marmoratus i treća podgrupa koju čine Acantholingua ohridana i

Salmothymus obtusirostris. Autori takođe smatraju da su vrste iz treće podgrupe

sestrinske i da predstavljaju evolutivni prelaz između Salmo salar i Salmo trutta

kompleksa, pri čemu su znatno bliže kompleksu Salmo trutta.

Autori su na osnovu dobijenih rezultata predložili reklasifikaciju roda

Salmothymus kao zasebnog roda, i predlažu svrstavanje vrsta istog unutar roda Salmo.

Sušnik i sar. (2004) na osnovu rezultata sekvencioniranja mtDNA zaključuju da

vrste Salmo marmoratus i Salmo (Platysalmo) platycephalus ulaze u sastav filogenetskog

kompleksa Salmo trutta (Slika 7).

Oncorhynchus mykiss

Salmo salar

Salmo obtusirostris

Acantholingua ohridana

Salmo trutta/ marmoratus complex

Da

At

Ma

Ad

100

100

94

81 0.01

Salvelinus fontinalis

Uvod

11

Slika 7. Filogenetski odnosi unutar grupe Salmo, sa posebnim akcentom na položaj vrste

Salmo platycephalus, dobijeni na osnovu sekvencioniranja ITS1 gena nuklearne DNA,

kontrolnog regiona i citohroma b mtDNA (Sušnik i sar., 2004). Ma – marmoratus, Me –

mediteranska, Ad – jadranska, At – atlantska i Da – dunavska linija.

Utvrđivanje preciznih filogenetskih odnosa rodova i vrsta unutar porodice

Salmonidae je veoma bitno zbog njihove zaštite, jer je poznato da su mnoge vrste iz ove

porodice procenjene kao ugrožene (Crivelli, 1996).

Veliki broj autora se slaže da postojeće nedoumice u vezi filogenije rodova i vrsta

porodice Salmonidae mogu biti razrešene samo kombinovanjem rezultata morfoloških i

molekularnih analiza (Delling, 2003; Bernatchez i sar., 1992).

Uvod

12

1.2.4. SALMO TRUTTA (LINNAEUS, 1758) – POTOČNA PASTRMKA

Pastrmka kao autohtona salmonidna vrsta naseljava vode Evroazije i severne

Afrike. Rasprostranjena je na području od severne Norveške i severoistočnog dela Rusije

na severu do planine Atlas u severnoj Africi na jugu, i od Islanda na zapadu do Aralskog

mora na istoku (Behnke, 1986; Elliott, 1994). Tokom prošlog veka pastrmku su naselili u

24 zemlje izvan Evrope, i to u preostali deo Azije i Afrike, zatim u Australiju, Severnu i

Južnu Ameriku (Laikre i sar., 1999).

Kod ove vrste zubi su raspoređeni na vomeru, vilicama, jeziku i na nepcu (Povž i

Sket, 1990). Zubi na vomeru su raspoređeni u dva reda i zadržavaju se tokom celog

života. U gornjoj vilici postoje mnogobrojni zubi usmereni unazad. Ovi zubi služe samo

za pridržavanje plena. Krljušti na telu su sitne, glava je bez krljušti. Branhiospina na

prvom škržnom luku ima od 18 - 24. Piloričnih nastavaka ima od 40 - 100, prosečno

65,38 (Vuković i Ivanović, 1971). Diploidan broj hromozoma iznosi 84, mada je

primećeno znatno variranje među intraspecijskim formama. Po bokovima, leđima,

škržnim poklopcima i leđnom peraju nalaze se brojne tamne, crvene i/ili narandžaste pege

(Povž i sar., 1996). Boja tela veoma varira i zavisi od osobina staništa. Dužina je obično

oko 40 cm, težina do 800 gr.

Potočna pastrmka naseljava hladne vode i to obično gornje tokove reka umereno

kontinentalnog klimata, mada se može naći i u ravničarskim rekama borealne zone, kao i

u jezerima sa čistom i hladnom vodom. Polni dimorfizam je izražen u doba mresta: ženke

imaju zaobljen trbuh i crven nabubreli polni otvor, dok su mužjaci uskog trbuha i nemaju

nabubreli polni otvor, ali se odlikuju veoma razvijenom donjom vilicom u obliku kuke.

Mresti se krajem jeseni i početkom zime - od novembra do januara. RF ženke iznosi do

2000 jaja na kg telesne težine. Ikra se odlaže na kamenitom dnu sa brzim tokom vode.

Prečnik jaja je veliki i iznosi 4.5 do 5 mm. Inkubacioni period traje, zavisno od

temperature vode, od 60 do 90 dana. Larve izvaljene u januaru ili februaru imaju veliku

žumančanu kesicu, koja im omogućuje ishranu, ali otežava kretanje. Aktivan život larvi,

odnosno njihov izlazak iz skrovišta, nastaje sa trošenjem i smanjivanjem žumančane

kesice na 1/3 njene veličine. U prirodnim plodištima mlađ ostaje do početka jeseni, kada

naraste do 10 cm dužine. Ona se kasnije nizvodno seli u dublje i mirnije vode u potrazi za

hranom. Polnu zrelost dostižu u 2 - 3 godini. U prvoj godini jedinke narastu 10 do 14 cm.

Ove ribe imaju juvenilni kolorit, tzv. "mladalačko ruho", istaknuto sa desetak crnih

Uvod

13

vertikalnih mrlja na bokovima tela. Sa porastom mlađi nestaju ova obeležja. Totalna

dužina dvogodišnjih jedinki može dostići 20 do 25 cm, a težina 150 do 200 g (Jevtić,

1989). Rastu dosta sporo. U akumulacionom jezeru Lokvara (blizu Delnica), koje pripada

dunavskom slivu, ulovljena je 1968. godine potočna pastrmka dužine 124 cm i težine od

25.5 kg, stara 15 ili 16 godina (Pažur, 1969).

Potočna pastrmka se hrani različitim organizmima: ribama, larvama vodenih

insekata, ikrom drugih riba, insektima koji lete nad površinom vode i padaju na vodu,

račićima i drugim beskičmenjacima (Aganović, 1979).

Od uvođenja binomijalne nomenklature do danas, opisana je, na osnovu

morfologije, 1931 vrsta evropskih salmonida. Ovako veliki broj vrsta javlja se kao

posledica nedovoljnog poznavanja pravila nomenklature i morfologije riba, kao i primene

različitih koncepata vrste. U poslednjih dvesta godina dato je 57 naučnih imena za

potočnu pastrmku Salmo trutta sensu stricto (Kottelat, 1997).

Pastrmka je izuzetno prilagodljiva različitim uslovima staništa spram kojih

pokazuje visok nivo fenotipske plastičnosti. Zbog toga danas postoji veliki broj

geografski specifičnih populacija, sa karakterističnim morfološkim odlikama, i to je

glavni razlog zašto je za jednu vrstu dato toliko naučnih imena.

Postoje tri različita ekološka oblika koje potočna pastrmka razvija u zavisnosti od

uslova staništa:

Salmo trutta forma fario – rečni oblik (Slike 10, 11, 12 i 13)

Salmo trutta forma lacustris – jezerski oblik (Slika 8)

Salmo trutta forma trutta – morski oblik (Slika 9)

Morski i jezerski oblik predstavljaju migratorne populacije, dok rečni oblik uvek

naseljava rečno stanište u okviru koga može preduzimati manje ili veće migratorne

pokrete. Morska forma živi i hrani se u moru, kada postane polno zrela migrira u reke na

mrest, a nakon mresta mladi se vraćaju u more. Jezerska forma naseljava jezera, a na

mrest, kao i morska forma, migrira u reke, ili pak u pliće delove jezera (Elliott, 1994).

Migratorne i stalne populacije mogu istovremeno naseljavati neku reku i pojedine studije

pokazuju da se mogu nesmetano ukrštati (Hindar i sar., 1991), mada mehanizam

nasleđivanja migratornosti/stacionarnosti još uvek nije poznat.

Uvod

14

Na osnovu rezultata dobijenih sekvencioniranjem mtDNA utvrđeno je da različiti

ekološki oblici nisu genetički uslovljeni, a samim tim ne moraju predstavljati

monofiletske grupe (Ryman 1983; Bernatchez i sar., 1992; Cross i sar., 1992).

Jezerska forma zbog uslova staništa može narasti i preko 20 kg, na bokovima tela

dominiraju crne krupne tačke, crvene su vrlo retke ili ih uopšte nema.

Slika 8. Salmo trutta forma lacustris – jezerski oblik

Slika 9. Salmo trutta forma trutta – morski oblik

Morska forma je veoma slična atlantskom lososu. Po bokovima tela ima veliki

broj crnih piknji nepravilnog oblika. Prvi o njoj je pisao Chiereghini (1818) i dao joj ime

Salmo cenerinus, a posle njega Kolombatović (1890) koji ju je preimenovao u Trutta

adriatica. Snoj i sar. (2002) su, na osnovu rezultata dobijenih sekvencioniranjem mtDNA,

utvrdili da morska forma pripada atlantskoj liniji, pri čemu se smatra da su analizirani

uzorci iz severnog Jadrana alohtonog (ribnjačkog) porekla.

Uvod

15

Na osnovu genetičkih analiza (RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism), alozimski polimorfizam, sekvenciranje mtDNA) koje su rađene u

poslednjih 20 godina, došlo se do zaključka da pastrmke određenog geografskog područja

pokazuju značajne specifične sličnosti i na genetičkom nivou. Utvrđene genetičke

sličnosti se povezuju isključivo sa geografskim područjima (basenima) i nemaju nikakve

veze sa ekološkim formama (Guyomard i Krieg, 1983; Bernatchez i sar., 1992; Giuffra i

sar., 1996; Largiader i Scholl, 1996; García-Marín i Pla, 1996; García-Marín i sar., 1999;

Vollestad i Hindar, 1997; Berrebi i sar., 2000).

Bernatchez i sar. (1992) su se bavili utvrđivanjem nukleotidnog redosleda unutar

640 bp dugog kontrolnog regiona mtDNA. U analizu su uključili sve tri ekološke forme

(rečnu, jezersku i morsku), glavaticu (Salmo marmoratus), gardsku (Salmo carpio) i

korzikansku pastrmku (Salmo macrostigma). U analizu su uključene, geografski

posmatrano, ukupno 24 populacije pastrmki iz atlantskog, dunavskog, sredozemnog i

jadranskog sliva. Cilj je bio da se na osnovu dobijenih rezultata utvrde filogenetski odnosi

morfološki i geografski različitih populacija pastrmki u Evropi. Autori su utvrdili 21

polimorfno mesto i ukupno 12 haplotipova (haploidni genotip – genetička varijanta) koje

su po obradi podataka razvrstali u pet filogenetskih grupa – linija, koje su se uglavnom

poklapale sa specifičnim geografskim poreklom uzorka:

1. jadranska linija (Ad) (Slika 10)

2. sredozemna (mediteranska) linija (Me) (Slika 11)

3. dunavska linija (Da) (Slika 12)

4. atlantska linija (At) (Slika 13)

5. marmoratus linija (Ma) (Slika 14)

Populacije potočne pastrmke koje pripadaju istoj liniji poseduju neke zajedničke

morfološke osobine.

Karakteristike spoljašnjeg izgleda mediteranske i jadranske linije su veliki broj

sitnih crvenih i crnih tačaka koje su nepravilno raspoređene po celom telu, kao i četiri

široka tamna pojasa, koji kao obruči obavijaju telo i to jedan u nivou glave, dva u nivou

trupa i jedan u nivou repa. Širina pojaseva je individualna (Odak, 2004).

Uvod

16

Slika 10. Jadranska linija potočne pastrmke

Slika 11. Sredozemska (mediteranska) linija potočne pastrmke

Dunavska linija ima krupnije crvene i crne tačke podjednako zastupljene i

ravnomerno raspoređene po celom telu.

Slika 12. Dunavska linija potočne pastrmke

Atlantska domestifikovana linija ima karakterističnu crnu pigmentaciju koja

preovladava nad crvenom i nalazi se uglavnom na trupnom delu neposredno iza glave

(Giuffra i sar., 1996).

Uvod

17

Slika 13. Atlantska linija potočne pastrmke

Marmoratus linija (glavatica), ima karakteristične mramorne šare po kojima je i

dobila ime. Osnovna boja tela je maslinasto zelena ili braonkasta, a šare se nalaze na

leđima i bokovima tela i nešto su tamnije od osnovne boje. Pojedini primerci mogu imati i

četiri široka tamna pojasa.

Slika 14. Marmoratus linija potočne pastrmke

Prema teoriji molekularnog sata, gde razlika u sekvenci nukleotida od 1% do 2%

predstavlja milion godina (Smith, 1992; Bernatchez, 2001) smatra se da su se pre

približno 10 miliona godina od zajedničkog pretka razdvojile dve vrste, losos (Salmo

salar) i pastrmka (Salmo trutta). Bernatchez (2001) smatra da se razdvajanje pastrmskih

filogenetskih linija od zajedničke predačke populacije dogodilo se u periodu od pre 0,5 do

2 miliona godina, što ukazuje da su veoma značajnu ulogu pri formiranju filogeografskih

linija imale klimatske promene koje su se desile tokom pleistocenskih glacijacija (700 –

10 (14) hiljada godina). Poslednja velika pomeranja unutar linija desila su se po

poslednjoj glacijaciji (pre oko 20000 – 14000 godina).

Uvod

18

Pošto je atlantski basen najduže bio izložen uticaju ledenog doba smatra se da je

atlantska linija imala najskoriju demografsku ekspanziju koja se dogodila pre 26000 –

13000 godina, što se poklapa sa početkom kraja poslednje glacijacije (pre oko 18000

godina). Dunavska linija imala je stariju najznačajniju demografsku ekspanziju mnogo

pre At linije, pošto na nju ledena doba nisu posebno uticala i to pre 300000 – 150000

godina, što se poklapa sa najznačajnjim interkonekcijama (Crno more, Kaspijsko i

Aralsko jezero) i širenjem mora (pre oko 28000 godina). Vreme demografske ekspanzije

unutar jadranske linije najverovatnije se desilo između At i Da linije, pre 77000 – 135000.

Smatra se da ledeno doba nije imalo uticaja na mediteransku i marmoratus liniju

(Bernatchez i sar., 1992; Bernatchez, 2001).

Slika 15. Geografska distribucija pet glavnih mtDNA evolutivnih linija potočne pastrmke

u Evropi (Bernatchez, 2001).

- atlantska linija, - dunavska linija, - jadranska linija

- marmoratus linija - mediteranska linija

Uvod

19

Pet filogenetskih linija koje je opisao Bernatchez i sar. (1992), grupa naučnika koja

je udružena u konzorcijum «TROUTCONCERN» (Laikre i sar., 1999) objedinila je u tri

grupe:

• pastrmke mediteransko – jadranskog regiona

• pastrmke crnomorskog, kaspijskog i aralskog basena

• pastrmke atlantskog regiona

Mediteransko – jadranski region predstavlja oblast u kojoj Salmo trutta – complex

pokazuje najveću fenotipsku raznolikost (Behnke, 1968). Nekoliko oblika potočne

pastrmke sa promenljivim taksonomskim statusom, u zavisnosti od autora, karakteristično

je upravo za ovaj region, a posebno za oblast Balkana i Turske (S. macrostigma, S.

dentex, S peristericus, S. marmoratus, S. carpio, S. obtusirostris, S pelagonicus, S.

farioides, S. macedonicus, S. lumi, S. letnica). Popisi navodnih vrsta ili podvrsta mogu se

pronaći kod Behnke (1965; 1968); Banarescu i sar. (1971); Economidis i Banarescu

(1991); Kottelat (1997); i Dorofeeva (1998). Genetičke studije zasnovane na jedarnoj i

mitohondrijalnoj DNA pokazuju visok nivo genetičke raznovrsnosti (kvantitativno (npr.

veliki broj različitih haplotipova), ali ne i kvaltativno (sa malim međusobnim razlikama))

između populacija potočne pastrmke ovog regiona. Kao rezultat genetičkih analiza

utvrđena su samo dva jasno različita entiteta: mediteranske populacije potočne pastrmke

(Salmo trutta) i glavatica (Salmo marmoratus). Primena novih molekularnih tehnika nije

potvrdila taksonomski položaj populacija fenotipski karakterističnih za Balkansko

poluostrvo, u sistemu klasifikacije zasnovanom na fenotipskim karakteristikama koje su

pod uticajem kompleksa biogeografskih faktora (Karakousis i Triantaphyllidis, 1990;

Apostolidis i sar., 1997). Patarnello i sar. (1994) su na osnovu sekvencioniranja delova

mtDNA otkrili izuzetno nisku stopu genetičkih razlika kod populacija koje su fenotipski

veoma različite (Salmo macrostigma, Salmo carpio i Salmo fibreni).

Crnomorski, kaspijski i aralski basen predstavljaju više od 50% ukupne teritorije

koju naseljava potočna pastrmka u Evropi. Iako se radi o izuzetno velikoj teritoriji, broj

genetički analiziranih populacija je svega desetak i to sa teritorije bivšeg Sovjetskog

Saveza (Bernatchez i sar., 1992; Bernatchez i Osinov, 1995; Riffel i sar., 1995; Largiadèr

i Scholl, 1995; Osinov i Bernatchez, 1996). Sekvencioniranjem mtDNA unutar ovog

regiona pronađene su dve od pet filogenetskih linija: dunavska i atlantska. Dunavska

Uvod

20

linija značajno preovlađuje, dok je svega nekoliko jedinki određeno kao pripadnici

atlantske linije. Autori smatraju da nije moguće sa sigurnošću zaključiti da li je prisustvo

atlantske linije posledica prirodne kolonizacije ili introdukcije (Osinov i Bernatchez,

1996).

Na bazi morfoloških i ekoloških razlika, populacije crnomorskog, kaspijskog i

aralskog basena bile su klasifikovane u posebne taksone (Berg, 1948). Populacije

crnomorskog basena su prepoznate kao Salmo trutta labrax, kaspijskog basena kao Salmo

trutta caspius, a populacije aralskog basena kao Salmo trutta oxianus. Posebna

ekofenotipska forma iz jezera Sevan (kaspijski basen) prepoznata je kao posebna podvrsta

Salmo trutta ischchan. Kombinacijom dobijenih rezultata analize alozima i mtDNA,

Bernatchez i Osinov (1995) i Osinov i Bernatchez (1996), smatraju da se ne može dati

podrška za predhodno iznetu taksonomsku originalnost.

Iako je obrađeno vrlo malo uzoraka dunavske linije iz crnomorskog, kaspijskog i

aralskog basena, utvrđen je visok nivo genetičke diferencijacije populacija (Bernatchez i

Osinov, 1995; Osinov i Bernatchez, 1996).

Atlantska filogeografska linija naseljava reke atlantskog basena od Islanda i

Norveške na severu do Iberijskog poluostrva i Atlas planine u Maroku na jugu, takođe

naseljava reke sliva Baltičkog i Severnog mora. Na osnovu genetičkih rezultata došlo se

do zaključaka da su populacije atlantske linije prilično homogene i da je nivo genetičke

diferencijacije manji u odnosu na mediteranske i dunavske populacije. Utvrđene su

značajne razlike na osnovu analize nuklearne i mtDNA između južnih iberijskih i

severnih populacija (Moran i sar., 1995; Antunes i sar., 1999; Bouza i sar., 1999; García-

Marín i sar., 1999; Weiss i sar., 2000). Utvrđene razlike smatraju se posledicom

neistovremenog naseljavanja severnih delova atlantskog basena nakon poslednje

glacijacije. Na bazi diskontinuiteta u učestalosti alela LDH-C1*(=LDH-5*)100 i *90

Ferguson i Fleming (1983) smatraju da su Velika Britanija i Irska rekolonizovane u

postglacijalnom periodu sa dve «grupe» potočne pastrmke. Prva rekolonizaciona grupa

nazvana je «ancestralna» i odlikovala se prisustvom LDH-C1*100 alela, dok je druga

rekolonizaciona grupa nazvana «moderna» i odlikovala se prisustvom alela LDH-C*90.

Hamilton i sar. (1989), na osnovu dopunskih analiza, proširuju hipotezu o dve nezavisne

rekolonizacije na preostali deo severo-zapadne Evrope potočnom pastrmkom. Filogenija

mtDNA haplotipova i njihov geografski raspored sugerišu da je postglacijalna

rekolonizacija severo-zapadne Evrope bila znatno složenija; pretpostavlja se da je bilo

Uvod

21

više od dve rekolonizacije, kako je prethodno predloženo (Hynes i sar., 1996; García-

Marín i sar., 1999). Atlantska linija je pronađena i u dunavskom slivu, ali nema podataka

da li se radi o prirodnom ili veštačkom procesu (Duftner i sar., 2003). Bernatchez i sar.

(1992), smatraju da je moguće da se radi o prirodnoj kolonizaciji, koja se mogla desiti u

periodu interglacijacija. Osim u dunavskom, atlantska linija je pronađena u

mediteranskom basenu, što se smatralo posledicom čovekove aktivnosti (Poteaux i sar.,

1998). Međutim, na Siciliji su nedavno pronađene autohtone populacije atlantske linije

koje najverovatnije vode poreklo iz severne Afrike (usmeno saopštenje Aleš Snoj).

1.2.5. METODE RAZLIKOVANJA RIBLJIH POPULACIJA

Metode razlikovanja ribljih populacija podeljene su u dve osnovne grupe:

1. Morfološke metode

2. Genetičke metode

1.2.5.1. Morfološke metode razlikovanja ribljih populacija

Morfometrija i meristika su najčešće primenjivane morfološke metode. Ove

metode se koriste pre svega zbog lake primene i ekonomskih razloga. Ako se odabere

pravi set karaktera i ako se pravilno izvrše analize, dobijeni rezultati će biti bez sumnje

validni.

Morfometrija jeste oblast bioloških istraživanja u kojoj se kvantitativnim

analizama opisuje forma (oblik i veličina) nekog morfološkog entiteta, bića ili

pojedinačne karakteristike (Oxnard, 1978). Osnovu ovakvih analiza čini statistički pristup

obradi geometrijskih informacija o istraživanom morfološkom objektu. Morfometrijske

karakteristike koje se najčešće koriste u razmatranju veličine i oblika tela jesu rastojanja

između anatomskih tačaka smeštenih na longitudinalnoj osi (opšte dužinske

karakteristike), dorzo-ventralnoj osi (karakteristike visine) i osi koja povezuje levu i

desnu stranu tela (karakteristike širine). U cilju što tačnijeg određenja oblika morfoloških

struktura koriste se i takve karakteristike koje predstavljaju udaljenost između anatomskih

tačaka postavljenih na neortogonalnim (kosim) osama, čiji su uglovi manji ili veći od

pravog u odnosu na pomenute ose (Sttraus i Bookstein, 1982; Bookstein i sar., 1985).

Morfološka istraživanja, kako ona koja se bave spoljašnjom morfologijom, tako i

Uvod

22

osteološka, često su izvor podataka za analizu filogenetskih odnosa pojedinih vrsta riba

(Klykanov, 1975; Shaposhnikova, 1975), bez obzira na nivo klasifikacije. Zadatak takvih

istraživanja je utvrđivanje stanja karakteristika i njihove učestalosti u istraživanim

taksonima. Time se utvrđuje status pojedinih stanja karakteristika u filogenetskom smislu,

tj. jesu li stanja predačka (pleziomorfna) ili izvedena (apomorfna) (Hennig, 1966), a i

rekonstruišu filogenetski odnosi na osnovu ocene stanja tih karakteristika.

Merističke osobine imaju jednostavniju naslednu osnovu u odnosu na

morfometrijske, pa su stoga lakše za analizu ribljih populacija. Meristički karakteri su

diskretni ili brojivi i u merističkim analizama ribljih populacija najčešće se koriste

karakteri kao što su: broj žbica (tvrdih i mekih) u perajima, broj krljušti u bočnoj liniji,

broj piloričnih nastavaka, broj kičmenih pršljenova, broj branhiospina i dr. (Alegria -

Hernandez, 1985)

1.2.5.2. Genetičke metode razlikovanja ribljih populacija

Kao rezultat brzog razvoja molekularne genetike u poslednjih 20 godina, danas

imamo nekoliko laboratorijskih tehnika koje su upotrebljive za akumulaciju genetičkih

podataka na populacijama potočne pastrmke, kao i za druge vrste. Upotrebu molekularnih

metoda pratio je nastanak molekularne sistematike koja se bavi analizom strukture

makromolekula, na osnovu dobijenih rezultata rekonstruiše evoluciju gena i organizama, a

samim tim i objašnjava genetičku raznovrsnost (Moritz i Hillis, 1996). Genetička

raznovrsnost populacija može se utvrditi korišćenjem molekularnih markera koji

predstavljaju sekvencu na molekulu DNA ili proteinu koja se može lako detektovati i čije

je nasleđivanje moguće pratiti (Ford-Lloyd, 1996). Polimorfizam na molekulu DNA javlja

se kao posledica mutacija koje se manifestuju kao supstitucije, a ređe kao insercije ili

delecije, ili pak grešaka prilikom replikacije. Izučavanje polimorfizma je omogućeno

otkrićem DNA tehnika, na prvom mestu lančane reakcije polimeraze, a nakon toga

primene restrikcionih endonukleaza koje seku molekul DNA na fragmente određene

dužine (Ryman i Utter, 1987).

Najčešće korišćene metode molekularne genetike u ispitivanju varijabilnosti

ribljih populacija su alozimi i noviji genetički markeri kao što su ponavljajuće sekvence

jedarne DNA – mikrosateliti i mitohondrijska DNA.

Uvod

23

Upotrebom različitih genetičkih markera, kako mitohondrijskih tako i jedarnih,

selektivno neutralnih lokusa (mikrosatelita), kao i lokusa koji su pod uticajem selekcije

(pojedini alozimi), možemo najlakše utvrditi genetičku strukturu populacije. Što više

markera upotrebljavamo, dobijamo potpuniju sliku genetičkog polimorfizama (Berrebi i

sar., 1999).

1.2.5.2.1. Alozimi

Do pred kraj prošloga veka široko primenjivana metoda za utvrđivanje genetičke

raznovrsnosti u molekularnoj genetici bila je elektroforeza alelskih varijanti proteina

(alozima) (Aebersold i sar., 1987; Utter i sar., 1987; Morizot i Schmidt, 1990; May,

1992). Upotreba alozima omogućava utvrđivanje alelskih varijanti, što se može iskoristiti

za ocenjivanje genetičke varijabilnosti prirodnih populacija, praćenje protoka gena,

rešavanje problema hibridizacije, kao i za utvrđivanje filogenetskih odnosa (Ferguson i

Masson, 1981; Murphy i sar., 1996). Mada su danas razvijene mnoge savremenije

tehnike, alozimska elektroforeza je još uvek cenjena i vrlo korisna metoda za utvrđivanje

značajnog nivoa genetičke varijabilnosti na populacijama potočne pastrmke, pre svega

zbog svoje niske cene u poređenju sa drugim savremenim molekularnim metodama i zbog

relativno lake upotrebe(Ferguson, 1989). Posebna prednost je u tome što postoji veliki

broj dostupnih podataka o alozimskoj varijabilnosti, što omogućava upoređivanje uzoraka

iz populacija koje poseduju značajnu vremensku i prostornu udaljenost. Osim prednosti

koje ima upotreba alozimskih markera, postoje i određene mane na koje ukazuju

Gyllensten i Wilson (1987) i Billington i Hebert (1991). Smatra se da su alozimski

markeri pod uticajem selekcije, da zbog degeneracije genetičkog koda ne pokazuju realni

nivo polimorfizma, često se nalaze na vrlo malom kodirajućem delu genoma tako da ih je

vrlo teško detektovati elektroforezom i različite genetičke varijante mogu imati istu

mobilnost na gelu. Lewontin (1974), smatra da je elektroforezom moguće utvrditi samo

trećinu svih aminokiselinskih supstitucija, koje u stvari predstavljaju refleksiju

nukleotidnih supstitucija. Iz svega rečenog zaključuje se da na osnovu rezultata

elektroforetske analize nije uvek pouzdano donositi zaključke o genotipskoj

varijabilnosti. U današnje vreme ovoj metodi pripisuju još jednu veliku zamerku, a to je

žrtvovanje životinja koje je neophodno da bi se došlo do veće količine tkiva koju ova

metoda zahteva.

Uvod

24

U poslednjih 30 godina prošloga veka urađen je veliki broj alozimskih analiza na

pastrmskim populacijama iz različitih geografskih područja Evrope. Prve analize su

urađene na pastrmskim populacijama atlantskog područja, i utvrđen je nizak nivo

genetičke varijabilnosti. Homogenost populacija ovog područja objašnjava se veoma

dugim zadržavanjem leda u severnim delovima atlantskog basena za vreme poslednje

glacijacije. Kao rezultat toga dolazi do znatnog sužavanja areala, migracija severnih

populacija ka jugu i ujedinjenja sa tamošnjim populacijama (Allendorf i sar., 1976;

Ryman i sar., 1979; Crozier i Ferguson, 1986; Hansen i sar., 1993). Slične alozimske

analize rađene su na utvrđivanju dijagnostičkih alela između atlantskih i mediteranskih

populacija, (Apostolidis i sar., 1996; García-Marín i sar., 1991) kao i na utvrđivanju

genetičke varijabilnosti unutar mediteranskih pastrmskih populacija (Guyomard i Krieg,

1983). Osinov (1984; 1989) je radio alozimske analize između populacija crnomorskog i

kaspijskog basena i uočio je određeni nivo genetičke varijabilnosti. Veći broj autora je

pokušao da, na osnovu alozimskih analiza, tj utvrđivanja alelskih varijanti koje su

karakteristične samo za ovu vrstu (Giuffra i sar., 1996), odredi sistematski status glavatice

(Salmo marmoratus). Na osnovu dobijenih rezultata autori određuju glavaticu kao

samostalnu, prvobitnu i u odnosu na potočnu pastrmku parapatričnu vrstu (Berrebi i sar.,

2000).

1.2.5.2.2. Savremeni genetički markeri

Relativno skorašnji razvoj novih i visoko varijabilnih genetičkih markera kao što

je materinski nasleđena mitohondrijalna DNA (Avise, 1994) i hipervarijabilni mini- i

mikrosateliti (Estoup i Angers, 1998; Goldstein i Schlötterer, 1998), pružili su nova

saznanja u ispitivanju varijabilnosti populacija potočne pastrmke, koja nisu bila dostupna

primenom samo alozimskih tehnika.

Uvod

25

1.2.5.2.2.1. Ponavljajuća DNA

Ponavljajuću DNA nalazimo u dva oblika:

• raspršena ponavljajuća DNA

• tandemski ponavljajuća DNA

Raspršenu ponavljajuću DNA delimo prema broju ponavljanja na:

• duge rasute elemente (LINE) – koji su duži od 1000 baza

• kratke rasute elemente (SINEs) – koji su kraći od 500 baza

Tandemski ponavljajuća DNA je sinonim za satelite, kod kojih se ponovljivost

tandemskih jedinica kreće između 103 i 107 ponavljanja po lokusu. Kada je broj

ponavljanja tandemskih jedinica znatno manji (do 100 po lokusu), koristimo termine

minisateliti i mikrosateliti.

1.2.5.2.2.1.1. Mikrosateliti

Mikrosateliti su otkriveni kod svih do sada proučavanih eukariota, kod kojih su

ravnomerno raspoređeni po celom genomu, ali su uglavnom ograničeni na euhromatin.

Pronađeni su kako u kodirajućim tako i u nekodirajućim regionima, manji broj ih se

nalazi na telomernim i centromernim regijama (Tautz i sar., 1986; Tautz, 1993).

Učestalost pojave mikrosatelita je najmanje jednom na svakih 10 kb. Pronađeni su takođe

kod pojedinih eubakterija i prokariota, ali sa manjom učestalošću (Tautz, 1989).

Mikrosateliti predstavljaju jednostavne nukleotidne nizove koji se sastoje iz ponovljenih

osnovnih motiva, dugih od 1 – 6 baznih parova (bp), koji se unutar lokusa ponavljaju od 5

pa do preko 100 puta (Stallings i sar., 1991). Mikrosateliti kičmenjaka najčešće se javljaju

kao di-, tri- , i tetranukleotidne replike, sastavljene iz svih mogućih kombinacija

nukleotida u osnovnom motivu (Tautz, 1989). Najčešće ponavljajući motiv je CA, a posle

njega AG, AAC, AAG i AAT (Glenn, 1995). Mikrosateliti sadrže veliki broj replika

osnovnog motiva i veoma su podložni mutacijama (10-3 do 10-4 po lokusu u generaciji

kod dinukleotidnih mikrosatelita) koje se javljaju zbog grešaka pri replikaciji DNA, što se

izuzetno odražava u dužinskom polimorfizmu (Amos i sar., 1993). Stopa mutacija

mikrosatelita razlikuje se između replika sa različitim osnovnim motivom, između

različitih lokusa sa replikama istog motiva i između alela istog lokusa (Schlötterer, 1998).

Stopa polimorfizma je uglavnom srazmerna broju replika osnovnog motiva. Kod

Uvod

26

korišćenja mikrosatelita kao markera kod kojih razlikujemo alele na osnovu različitog

broja ponavljanja osnovnog motiva može se javiti problem u neslaganju dužine

mikrosatelitskih fragmenata i njihovog nukleotidnog redosleda. Angeres i sar. (1995) su

analizirali nukleotidni redosled mikrosatelitnih alela jednoga lokusa kod dvanaest

salmonidnih vrsta i zaključili su da pojedini mikrosatelitni aleli kod različitih vrsta mogu

imati jednaku dužinu, ali različit nukleotidni redosled. Autori upozoravaju da se zaključci

o evolutivnim odnosima ne mogu izvoditi isključivo na osnovu dužine mikrosatelitnih

alela, jer različite mutacije vrlo lako mogu rezultirati jednakom konačnom dužinom alela.

Za mikrosatelite se još uvek ne zna način nastanka, odnosno njihova evolucija, zbog čega

se i ne mogu koristiti kao filogenetski markeri.

Mikrosateliti su veoma informativni kao genetički markeri iz više razloga: zbog

visoke stope genetičke varijabilnosti, jednostavnog kodominantnog mendelističkog

nasleđivanja, sačuvanosti mikrosatelitskih lokusa među srodnim vrstama. Spadaju u grupu

neutralnih genetičkih markera jer nisu podložni jakom selekcionom pritisku (Queller i sar.,

1993; Dowling i sar., 1996; Goldstein i Pollock, 1997). Jednostavno se mogu izolovati iz

materijala koji ne zahteva žrtvovanje životinja (krvi, dlake, slina, izmeta (Constable i sar.,

1995), krljušti (Miller i Kapuscinski, 1996), i arheološkog materijala (Bruford i sar., 1998).

Pri analizama možemo upotrebiti veliki broj lokusa, a jednostavna optimizacija lančane

reakcije polimeraze omogućava amplifikaciju više različitih lokusa u jednoj reakciji (Jug,

2002).

Zbog svih predhodno nabrojanih osobina mikrosateliti imaju veoma široku

upotrebu. Koriste se za utvrđivanje genetičke varijabilnosti i populacione strukture u

okviru mnogo kraćih geografskih udaljenosti nego što je to ranije bilo moguće (Estoup i

sar., 1998). Koriste se pri utvrđivanju porekla i srodničkih odnosa između jedinki

(Marshall i sar., 1998; Queller i sar., 1993; Hansen i sar., 1997; Fontaine i Dodson, 1999),

koriste ih pri kartiranju gena (Weissenbach i sar., 1992; Hearne i sar., 1992), kao i pri

proceni efektivne veličine populacije (Edwards i sar., 1992). Veoma značajnu ulogu

mikrosateliti imaju pri analizama muzejskog materijala (krljušti), jer na taj način možemo

dobiti podatke o genetičkoj strukturi populacije za dugi vremenski period (Nielsen i sar.,

1997; 1999a; b; Miller i Kapuscinski, 1997; Tessier i Bernatchez, 1999).

Mikrosatelitski markeri počinju intezivnije da se koriste u izučavanju salmonidnih

populacija početkom devedesetih godina prošloga veka. Ovi markeri su se pokazali kao

znatno uspešniji u odnosu na alozimske. Alozimski markeri se mogu koristiti za

razlikovanje populacija između basena (dunavski, mediteranski, atlantski), dok se

Uvod

27

mikrosateliti koriste za utvrđivanje mikrogeografskih diferencijacija između nedavno

razdvojenih populacija. Brunner i sar. (1998) i Angers i sar. (1995) su preko

mikrosatelitskih markera utvrdili visok nivo interpopulacione raznolikosti na izolovanim

populacijama roda Salvelinus. Rezultati ovih ispitivanja se mogu iskoristiti za očuvanje

biološke raznovrsnosti. Mikrosateliti se koriste za utvrđivanje stepena introdukcije

neautohtonih populacija u neki vodotok, kao i za praćenje dinamike obnavljanja

autohtonih populacija (Hansen i sar., 2000; Poteaux i sar., 1999). Estoup i sar. (1993) su

preliminarno objavili pregled polimorfizama mikrosatelitskih lokusa kod geografski

izolovanih populacija potočne pastrmke, a nešto kasnije pronađeni su i mikrosatelitski

markeri za razlikovanje glavatice (Salmo marmoratus) od ostalih pastrmskih linija (Snoj i

sar., 1997; Sušnik i sar., 1997).

1.2.5.2.2.2. Mitohondrijalna DNA

Mitohondrije su semiautonomne ćelijske organele koje su zbog posedovanja

sopstvene DNA (mitohondrijalna DNA – mtDNA), sposobne za autonomnu replikaciju

DNA, kao i za transkripciju i translaciju genetičke informacije u proteine. Mitohondrije

su prisutne u svim ćelijama kičmenjaka osim u eritrocitima sisara. Sličnost između

mtDNA i bakterijske DNA navodi na sumnju da su mitohondrije evolutivni potomci

slobodno živećih bakterija koje su postale subcelularne organele. U procesu integracije u

ćeliju izgubile su mnoge svoje gene ili su ovi prenešeni u jedarni genom. Današnja

mitohondrijalna DNA predstavlja samo deo nekada znatno većeg genoma, čiji su geni

gusto raspoređeni jedan uz drugi bez umetnutih introna, osim u kontrolnom regionu koji

predstavlja jedinu regulatornu sekvencu unutar genoma mtDNA (Harison, 1989).

Mitohondrijalna DNA je prvi put konstatovana kod abnormalnih fibroblasta pileta i u

kinetoplastima tripanozoma. Biofizička istraživanja su pokazala da se mtDNA razlikuje

od nukleusne po mnogim osobinama, pa i po baznom sastavu (Grozdanović-

Radovanović, 2000). Ispitivanja mtDNA na različitim životinjskim taksonima pokazala

su da postoje varijacije duž sekvence, kako u redosledu nukleotida, tako i u veličini gena

(Harrison, 1989).

Uvod

28

1.2.5.2.2.2.1. Osobine mitohondrijalne DNA

Mitohondrijalna DNA predstavlja važan genetički marker koji se koristi za

utvrđivanje genetičke strukture populacije, taksonomskih razmatranja, filogenetskih

odnosa, ukrštanja, introgresije i praćenja procesa nastanka novih vrsta. Osnovne osobine

mtDNA zbog kojih se i pokazala kao veoma dobar genetički marker su: jednostavna

organizacija, materinsko nasleđivanje, odsustvo rekombinacija i srazmerno visoka stopa

mutacija (Avise i sar., 1987; Avise, 1994).

Mitohondrijska DNA kičmenjaka je zatvoreni kružni molekul, veličine između 14

– 26 kb (Billington i Herbert, 1991), a kod salmonida je utvrđena dužina od 16670 bp

(Berg i Ferris, 1984). mtDNA predstavlja značajan deo genoma koji čini do 1% ukupne

ćelijske mase DNA (Cables, 2001). Najveći deo mitohondrijskog genoma čine kodogene

regije, sastavljene iz ukupno 37 gena, od kojih su dva za kodiranje ribozomalne RNA, 22

gena koji kodiraju tRNA i 13 gena za kodiranje polipeptida angažovanih u transportu

elektrona i oksidativnoj fosforilaciji (Avise, 1994; Curole i Kocher, 1999). Na mtDNA

kodiraju se sledeći proteini: citohrom b, tri podjedinice citohrom oksidaze, dve

podjedinice ATP sintetaze i sedam podjedinica NADH dehidrogenaze (Gillham, 1994;

Montoya i sar., 1983). Pri prevođenju specifičnog genskog koda u mitohondrijske

proteine učestvuju molekuli rRNA i tRNA, kodirani sa mtDNA. Pored 37 gena na

mtDNA nalazi se i kontrolna regija (eng. D-loop region) dužine oko 1000 bp sa

sekvencama koje imaju ulogu u regulaciji replikacije i transkripcije. Procesi replikacije i

translacije su potpuno autonomni u odnosu na iste procese u jedarnoj DNA (Borst i

Grivell, 1981). Ako razmotrimo nukleotidni raspored mtDNA kod različitih kičmenjaka,

možemo utvrditi da su organizacija i položaj gena veoma dobro očuvani tokom evolucije,

kao da postoje razlike u genetskom kodu, što se može iskoristiti pri filogenetskim

studijama (Curole i Kocher, 1999).

Uvod

29

Slika 16. Raspored gena na mtDNA, sa prikazom restrikcijskih mesta za pojedine

endonukleaze kod atlantskog lososa (Salmo salar).

Molekuli mtDNA su prisutni sa oko 1000 kopija u somatskim ćelijama, zrele jajne

ćelije poseduju oko milion a spermatozoidi oko 50 kopija. Mitohondrijska DNA se kod

najvećeg broja životinja nasleđuje po materinskoj liniji, mada ima nekih primera

biparentalnog nasleđivanja kod beskičmenjaka (Hoeh i sar., 1991). Kod materinskog

nasleđivanja samo ženski deo populacije prenosi mtDNA na potomstvo, zbog toga što pri

oplođenju jajne ćelije obično dolazi do razgradnje mitohondrija prispelih iz spermatozoida

(Harrison, 1989). Zbog haploidnosti mitohondrijalnog genoma efektivna veličina

populacije za mtDNA iznosi samo jednu četvrtinu jedarne DNA (Birky, 1983). Pošto se

mtDNA jednostrano nasleđuje, između molekula obično ne dolazi do rekombinacija, kao

što je slučaj sa jedarnom DNA, što znači da se mtDNA nepromenjena prenosi sa roditelja

na potomstvo. Pojava kada potomstvo u svim svojim ćelijama ima isti haplotip mtDNA

naziva se homoplazmija, međutim može se dogoditi da u jednom organizmu postoje

različiti haplotipovi mtDNA, gde se ovakva pojava naziva heteroplazmija, vrlo je retka i

prisutna samo u nekim generacijama (Avise, 2000). Heteroplazmija do sada nije zabeležena

kod salmonida, ali kod nekih drugih vrsta riba jeste, i javlja se kao posledica biparentalnog

nasleđivanja ili pak mutacionih promena na delu molekula mtDNA u organizmu

(Lightowlers i sar., 1997).

Uvod

30

Mitohondrijsku DNA karakteriše vrlo visok stepen mutacija, što je veoma

značajno pri njenoj upotrebi kao genetskog markera. Utvrđeno je da stepen supstitucija

iznosi 5,7 x 10-8 za pojedinačno nukleotidno mesto za godinu dana, što znači da mtDNA

akumulira 2 – 4% mutacija na milion godina (Brown i sar., 1982; Lewin, 2000). Smatra

se da je uzrok visoke stope mutacija mtDNA njena intenzivnija dinamika i mogućnost

replikacije za 5 – 10 puta brže u odnosu na jedarnu DNA, a samim tim je i stepen zamene

nukleotida za 5 – 10 puta veći nego kod jedarne DNA (Brown i sar., 1979). Na visok

stepen mutacija u mtDNA utiču sledeći razlozi: neefikasnost mehanizama popravke

(Tomkinson i Linn, 1986; Lopez i sar., 1997), visoke koncentracije mutagenih materija

(superoksidni radikali, O-2), koji nastaju pri visokoj metaboličkoj aktivnosti mitohondrija

(Li i Grauer, 1991; Lopez i sar., 1997), nepouzdanost procesa replikacije DNA (Li i

Grauer, 1991), slabiji selekcioni pritisak u određenim regijama, koji zajedno sa

klonalnom selekcijom vrlo brzo dovodi do fiksacije mutacija (Cann i sar., 1984). Između

evolutivno udaljenih linija utvrđene su razlike u stepenu supstitucija istog gena. Kao

najznačajniji razlog za različite stope mutacija su oštećenja DNA koja nastaju kao

posledica sporednih produkata metabolizma (Martin, 1999). Na osnovu rezultata

restrikcije i sekvenciranja mtDNA utvrđeno je da frekvencija mutacija nije ista duž celog

genoma. Najnižu frekvenciju mutacija na genomu mtDNA imaju regije koje kodiraju

rRNA molekule (Ferris i Berg, 1988). Kontrolna regija predstavlja najvarijabilniji deo

mtDNA, koji zbog manjeg funkcionalnog pritiska poseduje najviše mutacija posebno na

3'- i 5'-kraju, a to su regije genoma koji nose zapise za tRNAPro i tRNAPhe.

Najkonzervativniji deo kontrolne regije je centralni deo koji broji oko 300 bp i odgovoran

je za početak replikacije, i ovaj deo poseduje veliki broj citozinskih i guaninskih baza

(Shedlock i sar., 1992). U kontrolnoj regiji roda Salmo javljaju se uglavnom tačkaste

mutacije u obliku supstitucija (tranzicije i transverzije), dok su insercije i delecije vrlo

retke.

Nesklad u relativnoj stopi evolucije između mtDNA i jedarne DNA je jasan dokaz

da su genomi u različitim subćelijskim strukturama unutar organizama pod različitom

kontrolom i pod različitim evolutivnim pritiskom, koji se razlikuje između taksona (Brown

i sar., 1979).

Uvod

31

1.2.5.2.2.2.2. Mitohondrijska DNA kao genetski marker

Zbog svojih osobina pomenutih u predhodnom poglavlju mtDNA se koristi kao

genetski marker pri filogenetskim studijama, zbog materinskog jednostranog nasleđivanja

koristi se za rekonstrukciju evolutivnih događaja uključujući migracije, introdukcije i

efekat «uskih grla» populacija. mtDNA se pokazala kao dobar marker za praćenje

efikasnosti uvođenja novih linija u akvakulturu, kao i za praćenje delovanja uvedenih

linija na autohtone populacije (Li i Grauer, 1991). Zahvaljujući mogućnosti izolaovanja

mtDNA čak i iz fosilnog materijala, omogućeno nam je upoređivanje izumrlih populacija

sa današnjim. U ovoj studiji koristili smo mtDNA kao marker pomoću koga je moguće

pratiti intraspecijsku genetičku varijabilnost između geografski odvojenih populacija,

odnosno populacija koje pripadaju istom ili različitim morskim slivovima.

Iako je utvrđivanje odnosa među srodnim vrstama na osnovu mtDNA u velikom

broju slučajeva u skladu sa morfološkim, alozimskim i drugim molekularnim metodama,

povremeno dolazi do neslaganja dobijenih rezultata (Harrison, 1989).

Giuffra i sar. (1996) su upoređivali rezultate dobijene upotrebom tri najčešće

korišćena genetska markera: alozimi, mtDNA i mikrosateliti. Na osnovu rezultata

interpopulacionog polimorfizma pastrmki za odgovarajući markerski sistem dobijena su

filogenetska stabla koja su se međusobno razlikovala, pa je i ocena filogenetskih odnosa

među populacijama pastrmki (morfološkim oblicima) različita. Kao razlozi zavisnosti

rezultata od vrste molekularnih podataka navode se: različite evolutivne stope, različite

stope homoplazije kod različitih markera, prisustvo introgresije među lokusima usled

nepotpune reproduktivne izolacije populacija. Različiti načini nasleđivanja i evolucija

mitohondrijskih i jedarnih gena, teoretski može dovesti do nesklada u rezultatima

korišćenjem ova dva markerska sistema (Bernatchez i sar., 1992)

Vrlo je malo studija u kojima su se uporedno pratile morfološke osobine i

genetički polimorfizam. Bernatchez i sar. (1992) i Giuffra i sar. (1994) su pokušali

utvrditi povezanost između haplotipova mtDNA i morfološki diferenciranih populacija

pastrmki. Kao rezultat dobili su da su se morfološki veoma slične populacije

raspoređivale u vrlo različite evolutivne linije. Patarnello i sar. (1994) su, tokom

istraživanja, utvrdili da su relativno male razlike na nivou mtDNA povezane sa relativno

velikim fenotipskim razlikama.

Uvod

32

Pored svih pozitivnih osobina koje poseduje mtDNA kao genetički marker,

postoje i neke negativne. Maternalno nasleđivanje mtDNA onemogućava korišćenje ovog

markera pri razlikovanju hibrida u populacijama gde je eventualno došlo do introdukcije.

U tim slučajevima se preporučuje korišćenje informativnijih markera preko kojih

možemo pratiti i maternalno i paternalno nasleđivanje. Takođe, pri analizama vrlo

srodnih jedinki, upotreba mtDNA kao genetičkog markera se ne preporučuje zbog njene

premale varijabilnosti za tu vrstu studija.

Kako se mtDNA nasleđuje kao jedan gen, treba biti posebno oprezan pri

donošenju zaključaka na nivou čitave populacije, jer se evolucija pojedinačnog gena

može razlikovati od evolutivnog proseka celog genoma. Upotreba isključivo mtDNA kao

genetskog markera nosi sa sobom rizik od netačne rekonstrukcije filogenije (Zhang i

Hewitt, 2003).

Većina autora se slaže da je za utvrđivanje što tačnijih filogenetskih odnosa

između taksona potrebno uključiti što više genetičkih sistema, i dobijene rezultate

uporediti sa rezultatima morfoloških analiza.

1.2.5.2.2.2.3. Upotreba mtDNA za proučavanje vrsta i populacija salmonida

Tokom osamdesetih godina prošloga veka većina analiza mtDNA na salmonidama

zasnivala se na utvrđivanju inter- i intraspecijskog polimorfizma korišćenjem

restrikcionih endonukleaza (RFLP – tehnika).

Berg i Ferris (1984) prvi su analizirali mitohondrijalni genom kod salmonida

upotrebom restrikcionih enzima na četiri vrste iz porodice Salmonidae: pacifički losos

(Oncorhynchus tchawitcha), dužičasta pastrmka (Oncorhynchus mykiss), potočna

pastrmka (Salmo trutta) i potočna zlatovčica (Salvelinus fontinalis). Autori su procenili

dužinu genoma mtDNA na 16670 bp, i utvrdili su filogenetske odnose za date vrste, pri

čemu su zaključili da su pacifički losos i dužičasta pastrmka filogenetski bliže u odnosu

na potočnu pastrmku. Autori su utvrdili da se intraspecijski polimorfizam mtDNA kod

salmonida kreće od 0,1 do 2%, što je uočeno i kod većine drugih grupa kičmenjaka, dok

su razlike između vrsta od 3 do 14%.

Gyllesten i Wilson (1988) su radili slična istraživanja kao i Berg i Ferris (1984). U

analizu su uključili populacije potočne pastrmke iz različitih geografskih područja,

atlantskog lososa (Salmo salar), dve vrste iz roda Oncorhynchus (Oncorhynchus mykiss i

Uvod

33

Oncorhynchus clarki) i potočnu zlatovčicu. Restrikcionom analizom cele mtDNA utvrdili

su bliske srodničke veze između populacija potočne pastrmke i atlantskog lososa na

jednoj strani i vrsta roda Oncorhynchus na drugoj strani.

Taylor i sar. (1999) su vršili ispitivanja na 47 populacija vrste Salvelinus

confluentus, koristeći RFLP – tehniku, i konstatovali su veoma malu varijabilnost

mtDNA, sa divergencijom od 1,2%. Brunner i sar. (1998) su, kao i njihovi prethodnici,

upotrebili RFLP tehniku, na dva regiona mtDNA vrste Salvelinus alpinus iz 12 jezera

alpske regije, i potvrdili su vrlo malu genetičku varijabilnost i nediferenciranost

populacija. Malu varijabilnost su objasnili posledicom nedavne diferencijacije populacija

iz jedne iste grupe, verovatno po završetku ledenog doba.

Početkom devedesetih godina prošloga veka počinje se sa utvrđivanjem redosleda

nukleotida (sekvencioniranjem) vezanim za posebne regione na mtDNA.

Shedlock i sar. (1992) su uradili prva detaljnija istraživanja kontrolnog regiona

kod salmonida. Sekvencionirali su ceo kontrolni region kod 6 vrsta iz roda

Oncorhynchus, atlantskog lososa i arktičkog lipljana (Thymallus arcticus). Zaključili su

da su delovi kontrolnog regiona koji su kod drugih kičmenjaka važili za konzervativne,

takođe očuvani i kod salmonida, kao i da su različiti delovi kontrolnog regiona pod

različitim selekcionim pritiskom.

Bernatchez i sar. (1992) radili su na utvrđivanju nukleotidnog redosleda unutar

640 bp dugog kontrolnog regiona mtDNA (strana 15). U analizu su uključene geografski

posmatrano ukupno 24 populacije pastrmki iz atlantskog, dunavskog, sredozemnog i

jadranskog sliva. Na osnovu dobijenih rezultata autori su utvrđene haplotipove razvrstali

u pet filogenetskih grupa - linija: sredozemna (mediteranska), jadranska, dunavska,

atlantska i marmoratus linija. Autori zaključuju da, na osnovu dobijenih rezultata,

pastrmka predstavlja jednu od najbolje genetički struktuiranih vrsta koju su proučavali.

Giuffra i sar. (1994) su sekvencionirali 5'- deo kontrolnog regiona, fragment gena

za citohrom b i gen za ATP-aznu podjedinicu VI, na populacijama pastrmki

severnoitalijanskih voda. Analizirali su devet geografski različitih populacija potočne

pastrmke, osam geografski različitih populacija glavatice i gardsku pastrmku. Na osnovu

dobijenih rezultata potvrđuju pet filogenetskih grupa koje su utvrdili Bernatchez i sar.

(1992).

Apostolidis i sar. (1996a) bavili su se proučavanjem varijabilnosti istih delova

mtDNA na 11 grčkih populacija potočne pastrmke, na atlantskoj i populaciji ohridske

pastrmke. Sekvencioniranjem kontrolnog regiona pronađeno je 10 haplotipova sa

Uvod

34

interpopulacionim polimorfizmom od 0,32% do 2,31%. Autori zaključuju da je

interpopulacioni polimorfizam haplotipova kod pastrmki veoma visok.

Phillips i sar. (2000) su se bavili utvrđivanjem sistematskog položaja vrste

Acantholingua ohridana, između ostalog i sekvencioniranjem gena za citohrom b, dok su

se istim problemima vezanim za vrstu Salmothymus obtusirostris bavili Snoj i sar. (2002),

sekvencioniranjem kontrolnog regiona i citohroma b. Na osnovu dobijenih rezultata

utvrđeno je da obe vrste poseduju specifične mtDNA haplotipove koji ne spadaju u

prethodno pomenute linije.

Weiss i sar. (2000), sekvencioniranjem 5' kraja kontrolnog regiona mtDNA na

sedam portugalskih populacija potočne pastrmke, pronalaze pet novih haplotipova u

okviru At linije, koji su se razlikovali od opšteg severnog At1 haplotipa za dva do tri

mutaciona koraka. Na osnovu dobijenih rezultata predlažu re-evaluaciju postglacijalne

rekolonizacije severne Evrope, za koju se, do objavljivanja ovih rezultata, smatralo da je

rekolonizovana iz dva glavna glacijalna refugijuma (jugozapadnog atlantskog i ponto-

kaspijskog).

Weiss i sar. (2001) sekvencionirali su 5' kraj kontrolnog regiona mtDNA na 27

populacija potočne pastrmke u Austriji. Sve analizirane populacije pripadale su

dunavskom slivu, mada je 44% analiziranih jedinki imalo haplotipove iz At linije.

Pronalazak tako visokog procenta haplotipova At linije u dunavskom slivu otvorio je

pitanje eventualne prirodne kolonizacije, mada je poznato da je u Austriji bilo

poribljavanja upravo materijalom At linije.

Suárez i sar. (2001) sekvencionirali su ceo kontrolni region mtDNA populacija

potočne pastrmke Iberijskog poluostrva i severne Afrike. Na osnovu rezultata identifikuju

četiri glavne grupe haplotipova na Iberijskom poluostrvu: atlantsku, Duero, mediteransku

i andaluzijsku. Na osnovu opisane četiti iberijske grupe, povećavaju broj do tada poznatih

pet glavnih evropskih mtDNA grupa na šest: 1. Atlantska grupa koja uključuje dva

različita grozda - južno evropski i severno atlantski; 2. Endemična grupa ograničena na

Duero basen Iberijskog poluostrva; 3. Jadransko – Andaluzijska grupa koja uključuje

Jadransko – Jonske populacije u Mediteranu i Andaluzijske populacije na jugu Iberijskog

poluostrva; 4. Mediteranska grupa koja je rasprostranjena od jugo-zapadnog basena

Iberijskog poluostrva do Jonskog basena; 5. Dunavska grupa koja je rasprostranjena u

basenu Crnog mora, Kaspijskog i Aralskog jezera; 6. marmoratus grupa ograničena na

basen Jadranskog mora.

Uvod

35

Sušnik i sar. (2004), na osnovu rezultata sekvencioniranja kontrolnog regiona i

citohroma b mtDNA, zaključuju da vrste Salmo marmoratus i Salmo (Platysalmo)

platycephalus ulaze u sastav filogenetskog kompleksa Salmo trutta, s tim da Salmo

marmoratus spada u liniju marmoratus, što je istakao i Bernatchez i sar. (1992), a Salmo

platycephalus u jadransku liniju.

Cortey i sar. (2004), sekvencioniranjem celog kontrolnog regiona mtDNA, opisuju

filogenetske odnose populacija potočne pastrmke u mediteranskom basenu Iberijskog

poluostrva sa osvrtom na istorijsku biogeografiju. U filogenetsku analizu uključuju svih

pet glavnih mtDNA linija, i zaključuju da je dunavska linija najancestralnija.

Nilsson i sar. (2001) utvrđuju, na osnovu polimorfizma mtDNA, dve glavne linije

atlantskog lososa (Salmo salar) - severnoameričku i evropsku.

1.2.6. UGROŽENOST POTOČNE PASTRMKE (SALMO TRUTTA) U EVROPI

Potočna pastrmka predstavlja jednu od najbolje proučenih slatkovodnih vrsta riba.

Dosadašnje analize pokazuju da je veliki deo intraspecijske varijabilnosti potočne

pastrmke izgubljen, a da je preostali deo veoma ugrožen (Laikre i sar., 1999).

Veliki broj populacija potočne pastrmke ugrožen je različitim tipovima ljudskih

aktivnosti, koje mogu biti podeljene u tri opšte kategorije: degradacija staništa, ribolov i

poribljavanje (Allendorf, 1988; Laikre i Ryman, 1996; Laikre i sar., 1999).

Degradacija staništa može biti direktna i indirektna. Direktna degradacija

podrazumeva fizičke promene staništa, na primer, podizanje hidroelektrana koje mogu

sprečavati migracije pri mrestu, ili pak regulacija rečnog korita. Indirektna degradacija

podrazumeva promenu hemijskih svojstava vode kroz razne vidove zagađenja (kisele

kiše, ispuštanje hemijskih materija u vodotokove i dr.). Degradacija staništa takođe

uključuje i promenu sastava ribljih zajednica (introdukcija egzotičnih ribljih vrsta ili

istrebljenje postojećih vrsta sa kojima je potočna pastrmka prirodno koegzistirala).

Ribolov, kako komercijalni tako i sportski, dovodi do smanjenja brojnosti, do

opadanja intrapopulacionog genetičkog diverziteta, a samim tim i do opadanja vijabilnosti

populacija.

Poribljavanje materijalom iz veštačkog mresta ili prenošenje jedinki sa drugih

lokaliteta sve je češća praksa upravljanja vodama. Do poribljavanja najčešće dolazi zbog

smanjenja brojnosti autohtonih populacija, što je uglavnom rezultat prevelikog ribolovnog

Uvod

36

opterećenja. Poribljavanje predstavlja naročito ozbiljnu pretnju otkako se posmatra kao

blagotvoran način da se pomogne autohtonim populacijama, ali u stvarnosti veoma često

dovodi do izumiranja lokalnih autohtonih genskih fondova (Ryman i Utter, 1987;

Allendorf i Leary, 1988; Ferguson, 1989; Hindar i sar., 1991a; Waples, 1991; Taylor,

1991; Leary i sar., 1993; Hansen i Loeschcke, 1994; Ryman i sar., 1995; Allendorf i

Waples, 1996).

Glavni ugrožavajući faktori po populacije potočne pastrmske u Srbiji su: preveliko

ribolovno opterećenje, degradacija staništa i poribljavanje.

Najznačajniji ugrožavajući faktor predstavlja preveliko ribolovno opterećenje,

koje uključuje ne samo legalan ribolov, već na prvom mestu krivolov. Glavni razlog

izuzetno velikog ribolovnog pritiska je nedovoljno i neprofesionalno sprovođenje

ribolovne kontrole do 2003 godine, kao i neprimenjivanje legislativno regulisanih

zaštitnih mera u ribarstvu.

Drugi po značaju ugrožavajući faktor predstavlja direktna degradacija staništa u

vidu formiranja vodozahvata za potrebe elektroprivrede (Božica, Vrla, Vlasina), za

vodosnabdevanje (Lopatnica, Mlava), za industrijska i rudarska postrojenja (Resava,

sokobanjska Moravica, Lopatnica), kao i izgradnja fabrika flaširane vode (Vrla) – primeri

su samo ilustracija i sigurno su daleko brojniji, ali i o tome nema sređenih i dostupnih

podataka. Socio-ekonomski aspekti korišćenja vode ovih reka kao resursa su nepobitno

važni, ali rešenje problema do kojih to korišćenje dovodi, pre svega problema po

očuvanje autohtonog diverziteta pastrmke u Srbiji, i pored kako-tako zakonom propisane

obaveze (Anonimno 1994; 2004) nije adekvatno u administrativno-upravljačkoj praksi

sektora zaštite životne sredine i zaštite prirode. Indirektna degradacija staništa svodi se na

eventualno zagađenje raznim vrstama hemikalija koje se koriste u poljoprivredi. Zbog sve

manje naseljenosti brdsko-planinskih krajeva kao i ekstenzivne poljoprivrede, ovaj tip

degradacije staništa ne predstavlja posebno značajan ugrožavajući faktor po pastrmske

populacije.

Treći po značaju faktor ugrožavanja populacija potočne pastrmke je poribljavanje.

Ova aktivnost još uvek nije uzela previše maha, i do sada su poribljavane samo ribolovno

atraktivne vode, koje trpe veliki ribolovni pritisak. Evidencije o izvršenim

poribljavanjima na teritoriji Srbije uglavnom ne postoje, ali je poznato da je materijal za

poribljavanje nabavljan širom bivše Jugoslavije, ne vodeći računa čak ni o poribljavanju

materijalom koji pripada barem istom slivnom području, a kamoli o poribljavanju

materijalom autohtonog porekla, poznate genetičke strukture. Postoje negativna iskustva

Uvod

37

u drugim državama (Slovenija) gde se vršilo poribljavanje neautohtonim linijama. U Soču

je unešena potočna pastrmka (za koju se smatra da nije autohtona za sliv pomenute reke)

atlantske i dunavske linije, koja se nesmetano ukrštala sa marmoratus linijom dajući

plodne hibride i preteći da vremenom može doći do potpunog uništenja genetičke

originalnosti marmoratus linije.

Degradacija staništa, ribolov i poribljavanje mogu biti okidač za tri glavna procesa

koji dovode do smanjenja ili gubljenja intraspecijske raznolikosti, a to su: izumiranje

lokalnih populacija, hibridizacija i gubitak genetičke varijabilnosti unutar populacije

(Ryman i sar., 1995a; Laikre i Ryman, 1996). Ovi procesi se mogu odraziti na različite

hijerarhijske nivoe intraspecijske genetičke raznolikosti, na primer, između alela unutar

individue, između individua unutar populacije, između populacija unutar geografskog

regiona. Genetička raznolikost na bilo kom hijerarhijskom nivou biće smanjena ako

specifični aleli, genotipovi ili genski fondovi populacija prestanu da egzistiraju ili ako je

njihov integritet ugrožen hibridizacijom. Značaj genetičke raznolikosti ogleda se u boljem

prilagođavanju na sredinske promene.

Izumiranje lokalnih populacija može rezultirati potpunim gubitkom pojedinih

alela ili alelskih kombinacija. Degradacija staništa je glavni uzrok izumiranja lokalnih

populacija. Preteran izlov i nepromišljeno poribljavanje takođe mogu dovesti do istih

rezultata (Laikre i sar., 1999). Nepromišljeno poribljavanje dovešće, na prvom mestu, do

introgresivne hibidizacije, a na drugom mestu i do kompeticije za osnovne životne

resurse.

Dve najosnovnije preporuke genetičke konzervacije svode se na maksimalno

obraćanje pažnje ka očuvanju ekosistema i na utvrđivanje genetičke strukture populacije,

kao i minimalne vijabilne veličine populacije. Možemo zaključiti da praktično vrlo malo

znamo o ekonomskoj, ekološkoj i evolutivnoj vrednosti pojedinih gena i populacija.

Stoga fokus genetičke konzervacije mora biti usmeren na ispitivanje genetičkog

diverziteta između i unutar populacija unutar svake vrste (Frankel, 1970; 1974; Ryman i

Ståhl, 1980; Utter, 1981; Meffe, 1986; Ryman, 1991).

Uvod

38

1.3. CILJEVI RADA

U okviru ovoga rada postavljeni su sledeći ciljevi:

Utvrditi genetičku raznovrsnost populacija potočne pastrmke na teritoriji

Republike Srbije, upotrebom molekularno genetičkih metoda.

Pronađene genetičke varijante (haplotipove) uporediti sa već poznatim i

razvrstati ih u postojeće filogeografske linije (Bernatchez, 1992).

Na osnovu dobijenih rezultata i korišćenjem postojećih, rekonstruisati

evolutivnu istoriju potočne pastrmke na teritoriji Republike Srbije.

Utvrditi ugrožavajuce faktore i efekte njihovog delovanja na autohtone

populacije

Dati predlog mera zaštite autohtonih populacija.

Materijal i metode

39

2. MATERIJAL I METODE 2.1. MATERIJAL 2.1.1. PRIKUPLJANJE I ČUVANJE UZORAKA Uzorci potočne pastrmke koji su analizirani u ovom radu sakupljeni su u periodu

od juna 1997. do juna 2004. godine. Sakupljanje materijala je vršeno na 35 lokaliteta u

okviru sva tri morska sliva (crnomorskog, egejskog i jadranskog) na teritoriji Republike

Srbije. Najveći broj analiziranih jedinki prikupljen je elektroribolovom koji se obavljao

uz pomoć elektroagregata marke Suzuki – Bosch, snage 2100W, izlazne struje 220V DC,

frekvencije 40 Hz i jačine u zavisnosti od osobina vode, maksimalno 8.5 A. Manji broj

analiziranih jedinki prikupljen je udičarskim alatom koji se koristi u rekreativnom

ribolovu.

Nakon izlova, jedinkama je odsečen deo analnog peraja (oko 0.5 cm2) koje ima

mogućnost regeneracije, i sačuvan u 96% etanolu, a jedinke su vraćene nazad u vodu.

Svaki uzorak je sačuvan u posebnoj epruveti sa obeleženim rednim brojem i nazivom

lokaliteta. Delić uzorkovanog peraja dalje je korišćen za molekularne analize.

Slika 17. Način uzimanja uzoraka (odsecanje analnog peraja i odlaganje u etanol).

Materijal i metode

40

2.1.2. RASPORED LOKALITETA I BROJNOST ANALIZIRANIH UZORAKA

Tabela 1. Pregled analiziranih uzoraka po morskim slivovima, lokalitetima i vrsti

molekularnih analiza mtDNA.

Lokaliteti N Analizirani broj uzoraka po lokalitetu

Sliv Crnog mora Sekvencioniranje RFLP 1. Zmajevac 3 3 - 2. Gradac 3 3 - 3. Godljevača 6 2 4 4. Crni potok 7 2 5 5. Trudovačka reka 3 3 - 6. Bresnička reka 3 3 - 7. Brevina 3 3 - 8. Jošanica 3 3 - 9. Prolomska reka 3 3 - 10. Rečka 3 3 - 11. Vratna 2 2 - 12. Resava 6 2 4 13. Buk 7 2 5 14. Radovanjska reka 3 3 - 15. Golema reka 3 3 - 16. Studenačka reka 3 3 - 17. Dojkinačka reka 2 2 - 18. Rosomačka reka 3 3 - 19. Jerma 4 4 - 20. Vlasina 2 2 - 21. Džepska reka 1 1 - 22. Vrla 3 3 - 23. Jelašnička reka 3 3 -

∑ 79 61 18 Sliv Egejskog mora -

24. Dejanov potok 6 3 3 25. Lisina 2 2 - 26. Božica 8 2 6 27. Ljubata 2 2 - 28. Brankovačka reka 7 2 5 29. Tripušnica 5 5 - 30. Tisova reka 7 2 5 31. Čerenačka reka 7 2 5

∑ 44 20 24 Sliv Jadranskog mora -

32. Prizrenska Bistrica 11 6 5 33. Pećka Bistrica 13 8 5 34. Bogska reka 3 3 - 35. Alagina reka 3 3 -

∑ 30 20 10 Ukupno 153 101 52

Materijal i metode

41

Slika 18. Prostorni raspored analiziranih lokaliteta na teritoriji Republike Srbije (broj i

naziv lokaliteta iz tabele odgovara broju i položaju lokaliteta na karti).

Sliv Crnog mora Sliv Egejskog mora Sliv Jadranskog mora

Materijal i metode

42

2.1.3. HEMIKALIJE agaroza FMC amonijum acetat Sigma borna kiselina Sigma EDTA Sigma etidijum bromid Sigma etanol 96% i 70% Merck fenol Fluka formamid Applied Biosystems hlorovodonična kiselina Merck izoamil-alkohol Merck - Alkaloid kalijum acetat Kemika kalijum hlorid Kemika sirćetna kiselina Merck- Alkaloid magnezijum sulfat Merck mineralno ulje Sigma natrijum acetat Merck - Alkaloid natrijum hlorid Merck Na-dodecil sulfat (SDS) Merck natrijum hidroksid Merck magnezijum hlorid Merck - Alkaloid Tris-baza GATC TSR Applied Biosystems voda za ćelijske kulture Sigma 2.1.3.1. Pripremljeni setovi hemikalija DNA sequencing Kit, Big DyeTM Terminator Perkin Elmer Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction

Wizard® Genomic DNA Purification Kit Perkin Elmer Jet quik tissue DNA spin kit/250 Genomed

2.1.3.2. Enzimi endonukleaze AluI Fermentas rekombinantna Taq DNA-polimeraza Fermentas proteinaza-K Life Technologies RNA-za Fermentas

Materijal i metode

43

2.1.3.3. Početni oligonukleotidi (prajmeri) Tabela 2. Početni oligonukleotidi koji su korišćeni pri amplifikaciji celog kontrolnog

regiona mtDNA (28Riba i cytR).

Oznaka Nukleotidni redosled Referenca

28Riba CACCCTTAACTCCCAAAGCTAAG Snoj i sar., 2000. cytR GTGTTATGCTTTAGTTAAGC Bernatchez i

Danzmann, 1993. 2.1.3.4. Markeri

100 bp Fermentas sadrži fragmente DNA koji su dugi 80, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 i 1031 bp 1 kbp Fermentas sadrži fragmente DNA koji su dugi

250, 500, 700 bp, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 6, 8 i 10 kbp 2.1.3.5. Puferi amplifikacijski pufer 0,25% bromfenol plavo 0,25% ksilen cianol 30% glicerol 50 x pufer TAE 2 M tris acetat 0,1 M EDTA (pH 8,0) 10 x pufer TBE 0,5 M Tris baza 0,5 M borna kiselina 10 mM EDTA (pH 8,3) pufer TEN 1 M Tris-HCl 0,5 M EDTA 2 M NaCl 2.1.4. LABORATORIJSKA OPREMA ABI PRISMTM 310 Perkin Elmer ABI PRISMTM 3100 Perkin Elmer automatske pipete (10-1000 µl) Gilson centrifuga 5417C Eppendorf vakumski koncentrator Eppendorf Gel Doc 1000 BioRad inkubator Tehtnica, Eppendorf kadice za elektroforezu Pharmacia mešalica (vortex) Retsch magnetna mešalica Tehtnica mikroprocesorski vodeni termostat MJ Research UV – transiluminator Camag

Materijal i metode

44

2.2. METODE 2.2.1. IZOLACIJA DNA DNA je izolovana iz tkiva analnog peraja na tri različita načina. Bez obzira na koji

je način vršena izolacija, prvo je odsečeni deo tkiva analnog peraja (oko 2mm2), opran

destilovanom vodom od alkohola i nakon toga je prenet u posudicu (eppendorf) od 1,5

ml.

2.2.1.1. Fenolna ekstrakcija

Nakon pranja i prenošenja dela tkiva analnog peraja u posudicu od 1,5 ml, dodato

je 200 µl TEN pufera, 7 µl 10% SDS i 5 µl proteinaze - K. Sadržaj posudice je promešan

obrtanjem, nakon toga posudica je stavljena na inkubiranje preko noći na 37oC.

Nakom inkubacije, dobijeni lizat je prečišćen fenolnom ekstrakcijom. Lizat

(sadržaj bez skeletnih elemenata peraja) prenet je u novu posudicu od 1,5 ml i dodato je

300 µl fenola, hloroforma i izoamil alkohola (25:24:1). Sadržaj posudice je promešan i

centrifugiran 5 min na 10000g.

Posle centrifugiranja, u posudici je uočena gornja i donju frakcija. Gornja frakcija

u kojoj je rastopljena DNA odpipetirana je u novu posudicu, vodeći računa da ne dođe do

uzimanja dela belog taloga donje frakcije u kome se nalaze proteini.

U sledećem koraku dodato je 300 µl hloroforma i izoamil alkohola (24:1), sadržaj

je promešan i centrifugiran 5 min na 10000g.

Po centrifugiranju, gornja frakcija je odpipetirana u novu posudicu, u koju je

dodat 2,5 puta veći volumen 96% etanola ohlađenog na – 20oC, da bi došlo do obaranja

genomske DNA. Sadržaj posudice je promešan obrtanjem iste nekoliko puta, dok nisu

primećene bele niti DNA.

Uzorak je stavljen da se inkubira 1h na – 20oC. Nakon ovog vremena izvršeno je

centrifugiranje uzorka 10 min na 10000 g.

Po centrifugiranju, iz posudice je odpipetiran supernatant i dobijeni talog DNA

osušen je na vazduhu.

DNA je rastopljena u 20 µl vode za ćelijske kulture (Sigma), i sačuvana u frižideru na + 4oC.

Materijal i metode

45

2.2.1.2. Wizard® Genomic DNA Purification Kit Druga metoda izolacije DNA je izolacija uz pomoć specijalizovanog kita Wizard®

Genomic DNA Purification Kit. Izolacija je urađena prateći uputstva proizvođača,

koristeći protokol za izolaciju DNA iz mišjeg repa.

2.2.1.3. Jet quick tissue DNA spin kit/250 Treća metoda izolacije DNA je izolacija uz pomoć specijalizovanog kita firme

Genomed, Jet quik tissue DNA spin kit/250. Izolacija je urađena prateći uputstva

proizvođača, koristeći protokol za izolaciju DNA iz životinjskih tkiva.

2.2.2. PROVERA USPEŠNOSTI IZOLACIJE DNA Provera uspešnosti izolacije DNA, kao i određivanje dužine PCR, RFLP

produkata, te izolacija fragmenata DNA za sekvencioniranje, može se obaviti

elektroforezom na agaroznom gelu, zahvaljujući tome što se molekuli DNA mogu kretati

u električnom polju. Brzina kretanja zavisi od veličine fragmenta DNA, gustine medijuma

i jačine struje.

Provera izolacije DNA je izvršena na 1% agaroznom gelu. Agarozni gel je

napravljen od agaroze i 0,5 x TBE pufera. Smeša agaroze i pufera zagrejana je u

mikrotalasnoj pećnici do tačke ključanja, a nakon toga smeša je ohlađena u vodenom

kupatilu na elektromagnetnoj mešalici. Dok se smeša hladila, u nju je dodato 0,5 µl

etidijum bromida. Nakon hlađenja, gel je nasut u modele za elektroforezu i ostavljen oko

30 min da se stegne. Posle stezanja gela, modeli sa gelom preneti su u kadice za

elektroforezu u kojima se nalazio 0,5 x TBE pufer.

Pre nanošenja na gel, uzorku DNA (4 µl) dodat je amplifikacijski pufer (0,25%

brom – fenol plavo, 0,25% ksilen cianol i 30% glicerol). Smeša DNA i pufera

odpipetirana je u rupice na gelu.

U 0,5 x TBE puferu, pri naponu od 120 V, elektroforeza je trajala oko 30 min. Za

to vreme etidijum bromid se interkalirao između baza DNA i fluorescirao pri emitovanoj

svetlosti talasne dužine 302 nm, što je omogućilo vizuelizaciju gelova po elektroforezi

pomoću UV – transiluminatora.

Materijal i metode

46

Slika 19. Provera izolacije DNA na agaroznom gelu

Kada je utvrđeno da je koncentracija izolovane DNA dobra, napravljena je radna

koncentracija tako što je osnovna razblažena 10 x dodavanjem Sigma vode. Dobijeno

razblaženje (∼10 - 50 ng/µl) korišćeno je dalje za pripremu PCR reakcije.

2.2.3. LANČANA REAKCIJA POLIMERAZE (PCR) Lančana reakcija sinteze DNA pomoću DNA polimeraze u in vitro uslovima je

metoda za amplifikaciju nukleinskih kiselina. PCR (eng. Polymerase Chain Reaction) je

otkrio Karl Mullis 1985 godine (Saiki i sar., 1988). Pomoću ove metode može se

umnožiti željeni segment DNA u velikom broju kopija.

Lančanom reakcijom polimeraze umnožen je kontrolni region (D-loop)

mtDNA dužine oko 1100 bp. Reakcija je tekla u tri koraka na različitim

temperaturama. U prvom koraku, pri visokoj temperaturi dolazi do denaturacije

dvolančanog molekula uzoračke DNA. Snižavanjem temperature u drugom koraku,

početni oligonukleotidi naležu uz komplementarna mesta na jednolančanom molekulu

uzoračke DNA. U trećem koraku uz prisustvo enzima polimeraze sintetizuje se

komplementarni lanac DNA između početnih oligonukleotida.

Tabela 3. Sastav reakcijske smese zapremine od 20 µl:

∑ 20 µl

10,8 µl vode (Sigma) 2 µl 10 x pufera PCR (Fermentas) 1,2 µl 2 mM smeše dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 1 µl 25 mM MgCl2 1 µl 10 pmol/µl početnog oligonukleotida (28Riba) 1 µl 10 pmol/µl početnog oligonukleotida (cytR) 1 µl Taq DNA – polimeraze 5 U/µl 2 µl uzoračke DNA

DNA

Materijal i metode

47

Pripremljena PCR reakcija stavljena je u PCR mašinu MJ Research PTC - 100

(mikroprocesorsko vodeni termostat) na temperaturno - vremenski program 28RCYTR,

koji počinje denaturacijskim korakom (5 min na 95oC) i završava se korakom sinteze

komplementarnog lanca DNA (5 min na 72oC).

Tabela 4. Opis temperaturno vremenskog programa 28RCYTR

Nakon završetka PCR reakcije, izvršena je provera kvaliteta i dužine PCR

produkata na 1,5% agaroznom gelu u 0,5 x TBE puferu. Dužina fragmenata je utvrđena

koristeći markere od 100 bp ili 1kb. (Priprema gela je ista kao u poglavlju 2.2.2.).

Slika 20. Provera PCR produkta na agaroznom gelu

Ime programa Denaturacija Vezivanje početnih oligonukleotida

Sinteza komplementarnog lanca

Broj ciklusa

28RCYTR 95oC, 45 s 52oC, 45 s 72oC, 45 s 32

Materijal i metode

48

2.2.4. RESTRIKCIONA ANALIZA KONTROLNOG REGIONA MTDNA (TEHNIKA RFLP – RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM)

U restrikcionoj analizi tretiran je PCR produkt endonukleazom Alu I, koja reže

kontrolni region mtDNA na prepoznatljivoj sekvenci ag/ct, na fragmente karakteristične

dužine za linije potočne pastrmke koji su očekivani na analiziranom području.

U posudici od 0,5 ml pripremljena je restrikciona reakcija zapremine 20 µl koja

sadrži:

5 µl PCR produkt

2 µl odgovarajućeg restrikcionog pufera

0,5 µl (5 U) endonukleaze

12,5 µl vode (Sigma)

Napravljena reakcija je inkubirana 3h na temperaturi od 37oC. Po završenoj

inkubaciji naneti su reakcija (uzorci) i marker (100 bp) na 1,5% agarozni gel u 0,5 x

TBE puferu. Nakon toga otpočeta je elektroforeza 5 min na 80 V, a nakon toga još 10

min na 120 V. Rezultati restrikcije provereni su po elektroforezi pomoću UV –

transiluminatora.

2.2.5. SEKVENCIONIRANJE MITOHONDRIJALNE DNA Sekvencioniranje je metoda kojom se utvrđuje redosled nuleotida na fragmentu

DNA određene dužine. Za sekvencioniranje i analizu fragmenata mtDNA

upotrebljavani su automatski sekvenatori ABI PRISMTM 310 (sa jednom kapilarom) i

ABI PRISMTM 3100 (sa 16 kapilara).

2.2.5.1. Izolacija fragmenata DNA iz agaroznog gela Nakon elektroforeze PCR produkata na agaroznom gelu (Slika 20), odmah

ispod fragmenata DNA skalpelom su izrezane rupice pravougaonog oblika, koje su

napunjene 0.5 x TAE puferom. Nastavljena je elektroforeza ali na 200 V u trajanju

od 2 x 1 min. Za to vreme DNA fragmenti su eluirali u pufer, koji je odpipetiran u

posudice od 1,5 ml. Da bi DNA bila oborena, u posudice je dodat 6M NaCl i 96%

etanol ohlađen na -20oC (8 µl 6M NaCl / 50 µl 0,5 x TAE i 2,5 x volumen etanola).

Obaranje je trajalo preko noći na -20 oC ili 1h na -70 oC. Nakon obaranja

(inkubacije) uzorci su centrifugirani 25 min na 20000 g, alkohol je odpipetiran i

Materijal i metode

49

talog DNA osušen na vazduhu. Posle sušenja talog je rastopljen u 20 µl vode

(Sigma).

Svrha izolacije fragmenata DNA iz agaroznog gela je odstranjivanje ostataka

početnih nukleotida i dNTP-a koji se nisu ugradili u PCR produkt, kao i drugih

nečistoća.

Uspešnost izolacije fragmenata iz agaroznog gela može se proveriti

spektrofotometrijski ili na 1,5 % agaroznom gelu u 0,5 x TBE puferu. (Priprema gela je

ista kao u poglavlju 2.2.2.).

Slika 21. Provera izolacije DNA fragmenata iz agaroznog gela

2.2.5.2. Priprema reakcije za automatski sekvenator

Sekvencijska reakcija je imala volumen od 15µl. U specijalne posudice

prilagođene PCR mašini odpipetirano je od 3 – 6 µl prečišćenog PCR produkta iz

agaroznog gela, 4,5 µl razblaženog rastvora BigDye, 0,3 µl početnog oligonukleotida i do

15 µl dosuta je voda (Sigma).

Tabela 5. Nukleotidni redosled početnih nukleotida korišćenih za sekvencioniranje

segmenata kontrolnog regiona.

Oznaka Nukleotidni redosled Referenca 28Riba CACCCTTAACTCCCAAAGCTAAG Snoj i sar., 2000. vHF-F TCCGTCTTTACCCACCAACT Snoj i sar., 2002. RCSB3-F AAGCCGGGCGTTCTCTTATATGC Snoj i sar., 2002.

Materijal i metode

50

Pripremljena sekvencijska reakcija stavljena je u PCR mašinu MJ Research PTC -

100 (mikroprocesorsko vodeni termostat) na temperaturno - vremenski program HEL2

koji počinje denaturacijskim korakom (5 min na 96oC).

Tabela 6. Opis temperaturno vremenskog programa HEL2

2.2.5.3. Priprema DNA fragmenata za sekvencioniranje

Produkt sekvencijske reakcije (15 µl) odpipetiran je u posudicu od 1,5 ml u kojoj

je predhodno pomešan 2 µl Na – acetata (3 M, pH 4,6) i 50 µl 96% etanola ohlađenog na

-20oC. Rastvor je dobro promešan na Vortexu i inkubiran na ledu 10 min. Nakon toga

usledilo je centrifugiranje u trajanju od 25 min na 20800 g. Po centrifugiranju odpipetiran

je supernatant, a talog koji se nalazio uz zid posudice prosušen je na vazduhu. Potom je

talog rastvoren u 15 µl rastvora Template Suppression Reagent, dobro je sve promešano

na Vortexu i nekoliko sekundi centrifugirano. Rastvorena DNA je denaturisana 3 min na

95oC, posle toga je rastvor ohlađen na ledu i prenet u posebne posudice za

sekvencioniranje koje su stavljene u automatski sekvenator na utvrđivanje redosleda

nukleotida.

2.2.5.4. Sekvencioniranje DNA fragmenata

Sekvencijska reakcija u kojoj se nalazi DNA čiji se nukleotidni raspored želi

utvrditi na sekvenatoru, sadrži jedan početni oligonukleotid, smešu nukleotida koji sadrže

i dideoksiribonukleozid – trifosfate (ddNTP) sa fluorescirajućom molekularnom grupom.

Polimeraza takođe ulazi u sastav reakcije, i njena funkcija je da sintetizuje

komplementarni lanac uzoračkoj DNA vezujući iza početnog obične nukleotide sve dok

se ne ugradi prvi ddNTP. Jednolančani molekuli DNA koji sadže (ddNTP) na svome

kraju, putuju kroz električno polje i raspoređuju se po dužini. Svetlost određene talasne

dužine koju emituje laser pada na fluorescirajuće grupe molekula DNA i menja svoju

prvobitnu talasnu dužinu, što beleži detektor. Pošto postoje četiri različite fluorescirajuće

grupe za svaki od četiri molekula ddNTP, možemo na osnovu talasne dužine

fluorescirajuće svetlosti utvrditi nukleotidni raspored uzoračke DNA.

Ime programa Denaturacija Vezivanje početnih oligonukleotida

Sinteza komplementarnog lanca

Broj ciklusa

HEL2 95oC, 30 s 50oC, 15 s 60oC, 4 min 35

Materijal i metode

51

2.2.6. PROGRAMSKA ANALIZA KONTROLNOG REGIONA MTDNA

Za utvrđivanje grešaka i polimorfnih mesta na 5`- kraju kontrolnog regiona

mtDNA (561 bp) upotrebljen je program Chromas 2.23 ©Technelysium Pty. Ltd..

Upoređivanje dobijenih sekvenci sa sekvencama koje postoje u bazi podataka “GenBank”

urađeno je u programu Clustal_X (Thompson i sar., 1997). Filogenetska stabla nacrtana su koristeći dve vrste metoda za obradu

genetičkih podataka. “Neighbour-Joining” (NJ) spada u nediskretne metode (metode

distanci) koje za oblikovanje filogenetskog stabla koriste matrice parnih distanci.

Parne distance između pojedinih haplotipova izračunate su koristeći Kimura-2

parametarsku metodu. “Neighbour-Joining” (NJ) se drugačije naziva metoda

pridruživanja suseda, koja za formiranje filogenetskog stabla koristi uzastopno

pridruživanje operacionalno taksonomskih jedinica (suseda) u parove, tako da

smanjuje ukupnu dužinu grana za svaki nivo grupisanja. Dužina grananja se utvrđuje

po dodavanju pojedinih operacionalno taksonomskih jedinica. Metoda NJ korišćena

je iz genetičkog programskog paketa MEGA3 (Kumar i sar., 2004) sa potporom

formiranja čvorišta od 10000 bootstrap ponavljanja i programskog paketa PAUP

(Swofford, 2000) sa 1000 bootstrap ponavljanja. “Maximum parsimony” (MP) – metoda najveće štedljivosti - spada u grupu

diskretnih metoda (“Character State” metode) koje formiraju filogenetsko stablo ne

uzimajući u obzir distance između polimorfnih mesta već ostale promene na

sekvencama tipa supstitucija, insercija i delecija. Kod ove metode primenjen je

heuristički princip sa TBR (Tree Branch Replications) zamenom grana kako bi se

pronašao put do najkraćeg stabla. Drugim rečima, “Maximum parsimony” je

karakter zasnovana metoda koja izvodi konačnu sliku filogenetskog stabla

minimizacijom ukupnog broja evolutivnih koraka potrebnih za objašnjavanje

dotičnog seta podataka. Ova metoda u prvoj fazi formira konsenzus stablo sa

čvorištima koja se javljaju u najmanje 50% slučajeva (Majority Rule 50% Consensus

Tree), a u drugoj fazi dodaje bootstrap vrednosti nakon 1000 ponavljanja. Metoda

MP korišćena je iz programskog paketa PAUP (Swofford, 2000).

Upotrebom statističkog “parsimony” kriterijuma u programu TCS 1.3 (Clement i

sar., 2000) slikovito su prikazani, u obliku mreže, osnovni filogenetski odnosi

analiziranih haplotipova.

Materijal i metode

52

Genetička varijabilnost utvrđena je korišćenjem analize molekularne varijanse

(AMOVA testa) iz programskog paketa “ARLEQUIN” (Schneider i sar., 2000) na tri

hijerarhijska nivoa: između slivova, između populacija unutar slivova i unitar populacija.

Značajnost komponenti varijanse i Φ-statistike testirana je višestrukim permutacijama

(1000×) originalnog seta podataka.

Da bi se dobila šira filogenetska slika, haplotipovi pronađeni u Srbiji analizirani

su skupa sa nekoliko već pronađenih haplotipova sa drugih teritorija iz različitih mtDNA

linija.

Rezultati

53

3. REZULTATI

3.1. ANALIZA KONTROLNOG REGIONA mtDNA UPOTREBOM RFLP TEHNIKE (Restriction Fragment Length Polimorphism)

Upotrebom RFLP tehnike odnosno restrikcionog enzima Alu I dobijeni su

preliminarni rezultati zastupljenosti osnovnih mtDNA linija potočne pastrmke unutar sva

tri sliva na teritoriji Srbije. Restrikcioni enzim Alu I rezao je kontrolni region mtDNA

dužine oko 1100 bp na fragmente karakteristične dužine za dva različita restrikciona

profila.

Kontrolni region uzoraka iz crnomorskog sliva restrikcioni enzim Alu I je rezao na

četiri mesta formirajući pet fragmenata dužine 464, 311, 252, 37 i 4 bp (Slika 22a), dok je

uzorke iz egejskog i jadranskog sliva isti enzim rezao na tri mesta formirajući četiri

fragmenta dužine 563, 464, 37 i 4 bp (Slika 22b). Fragmenti od 4 i 37 bp vrlo su kratki i

ne mogu se uočiti na gelu.

Slika 22. Restrikcija kontrolnog regiona mtDNA sa endonukleazom Alu I. Uzorci sa

lokaliteta crnomorskog sliva označeni su sledećim brojevima: 1. Resava, 2.

Godljevača, 3. Buk, 4. Crni potok, 5. Brevina i 9. Gradac. Uzorak broj 6. Božica,

pripada egejskom slivu, a uzorci 7. Pećka Bistrica i 8. Prizrenska Bistrica pripadaju

jadranskom slivu. Poslednja kolona desno na obe slike predstavlja marker od 1 kbp.

a) b)

Rezultati

54

3.2. ANALIZA SEKVENCIONIRANJA KONTROLNOG REGIONA mtDNA

Analiza sekvencioniranja kontrolnog regiona mtDNA urađena je na ukupno 101

uzorku iz sva tri sliva, pri čemu je iz crnomorskg sliva sekvencioniran 61 uzorak, a iz

egejskog i jadranskog sliva po 20 uzoraka (Tabela 1). Sekvencioniranjem je utvrđen

nukleotidni redosled kontrolnog regiona mtDNA u dužini od 561 bp, počevši od 5’ kraja

do mesta “poli T” koje se nalazi oko polovine ukupne dužine kontrolnog regiona.

Na osnovu dobijenih rezultata sekvencioniranja identifikovano je ukupno 18

polimorfnih mesta (Tabela 10) na osnovu kojih je u sva tri sliva pronađeno 15 različitih

haplotipova koji pripadaju Da – dunavskoj (8 haplotipova), «južnoj»1 (6 haplotipova) i At

– atlantskoj filogenetskoj grupi (1 haplotip) (Tabela 9). Od 15 pronađenih haplotipova 6

je novih za nauku, i to 3 dunavska i 3 jadranska (dva iz egejskog i jedan iz jadranskog

sliva). Haplotip Ad+Prz koji je pronađen u Prizrenskoj Bistrici kao autohtoni, zajedno sa

naknadno analiziranim haplotipovima iz Rijeke Crnojevića Ad+RC i iz Neretve Ad+N

formira potpuno novu, do sada nepoznatu liniju, kojoj je dodeljena oznaka Ad+ i ime

farioides. Novo otkrivena linija je geografski ograničena na reke jadranskog sliva jugo-

zapadnog Balkana.

Pronađeni dunavski (Da) i «južni» jadransko – egejski (Ad i Ad+) haplotipovi

pokazuju izrazitu geografsku pravilnost u distribuciji. Da haplotipovi bili su striktno

ograničeni na dunavski sliv, dok su «južni» haplotipovi bili dominantni u jadransko –

egejskom slivu, sa izuzetkom pet jedinki koje su bile pronađene u dunavskom slivu (4

jedinke su pronađene u Jermi i 1 u Vrli, i sve pripadaju haplotipu ADcs1). Genetička

segmentacija primećena je i između «južnih» haplotipova. Prostorni raspored 5 od 6

pronađenih haplotipova bio je striktno povezan sa jadranskim ili egejskim slivom, samo

je haplotip Ad+Prz bio ravnomerno raspoređen u oba sliva (Tabela 9).

Radi kompletnije i preciznije slike o evolutivnoj istoriji 15 pronađenih

haplotipova potočne pastrmke na teritoriji Srbije, analizirano je još 8 haplotipova, pre

svega iz linija koje nisu autohtone za istraživano područje (At, Ma, Me – po dva haplotipa

za svaku liniju), kao i dva Ad+ haplotipa (Crna Gora i Bosna i Hercegovina) (Tabela 13).

1 «Južna» grupa obuhvata haplotipove 1Ad i novo opisane 2Ad+ linije (1, 2 pronađeni su na analiziranom području), kao i haplotpove koji su naknadno uključeni u analizu iz Ma i Me linije.

Rezultati

55

Tabela 9. Prikaz pronađenih haplotipova po lokalitetima i njihova frekvenca. Haplotipovi koji su obeleženi zvezdicom (*) pronađeni su po prvi put, dok haplotip obeležen znakom + pripada novo opisanoj Ad+ (farioides) liniji.

Dunavski haplotipovi »Južni« haplotipovi (Ad i Ad+) Atlantski haplotip Lokaliteti N

Da1 Da2 Da23b Da*Vl Da*Dž Da22 Da-s6 Da*Vr ADcs1 ADcs11 Ad*Pe Ad*Ti Ad*Bož Ad+Prz At1

Dunavski sliv Σ 61 1. Zmajevac 3 1 2 2. Gradac 3 1 1 1 3. Godljevača 2 2 4. Crni potok 2 2 5. Trudovačka reka 3 3 6. Bresnička reka 3 3 7. Brevina 3 3 8. Jošanica 3 3 9. Prolomska reka 3 3 10. Rečka 3 2 1 11. Vratna 2 2 2 12. Resava 2 1 1 13. Buk 2 2 14. Radovanjska reka 3 1 2 15. Golema reka 3 3 16. Studenačka reka 3 3 17. Dojkinačka reka 2 2 18. Rosomačka reka 3 2 1 19. Jerma 4 4 20. Vlasina 2 2 21. Džepska reka 1 1 22. Vrla 3 2 1 23. Jelašnička reka 3 3

% hapl. unutar sliva 59 8 8 3 2 2 5 3 8 2 Egejski sliv Σ 20

24. Dejanov potok 3 1 2 25. Lisina 2 1 1 26. Božica 2 2 27. Ljubata 2 2 28. Brankovačka reka 2 1 1 29. Tripušnica 5 5 30. Tisova reka 2 2 31. Čerenačka reka 2 2

% hapl. unutar sliva 15 20 35 25 5 Jadranski sliv Σ 20

32. Prizrenska Bistrica 6 6 33. Pećka Bistrica 8 4 4 34. Bogska reka 3 3 35. Alagina reka 3 3

% hapl. unutar sliva 50 20 30 Ukupno 101 36 5 5 2 1 1 3 2 8 10 4 4 7 11 2

% hapl. u ukupnom uzorku 35 5 5 2 1 1 3 2 8 10 4 4 7 11 2

Rezultati

56

Iz prethodne tabele može se videti da je sa 35 lokaliteta iz sva tri sliva

identifikovano ukupno 15 haplotipova. Na 23 lokaliteta crnomorskog sliva pronađeno je

10 haplotipova od kojih je 8 autohtono za crnomorski sliv. Od tih 8, tri su nova za nauku:

Da*Vl (Vlasina), Da*Dž (Džepska) i Da*Vr (Vrla)), pet je bilo već poznato od ranije

Da1, Da2, Da-s6, Da23b i Da22, a dva pronađena haplotipa ADcs1 (jadranski) i At1

(atlantski) nisu autohtona za ovo slivno područje.

Slika 23. Brojčana i procentualna zastupljenost haplotipova crnomorskog sliva.

36, 59%

5, 8%

2, 3%

2, 3%

1, 2%

1, 2%

3, 5%

5, 8%

5, 8%

1, 2%

Da1

Da2

Da*Vr

Da*Vl

Da*Dž

Da22

Da-s6

Da23b

ADcs1

At1

Brojčano i procentualno najzastupljeniji haplotip crnomorskog sliva je Da1, koji

je identifikovan na 16 od 23 analizirana lokaliteta i predstavlja 59% zastupljenosti svih

pronađenih dunavskih haplotipova. Posle Da1 haplotipa, sa po 8% u ukupnoj

zastupljenosti učestvuju haplotipovi Da2 (pronađen na 4 lokaliteta), Da23b (pronađen na

3 lokaliteta) i ADcs1 (pronađen na 2 lokaliteta). Sa 5% zastupljen je haplotip Da-s6

(pronađen na 1 lokalitetu), sa po 3% haplotipovi Da23b i Da*Vl (pronađeni na po 1

lokalitetu). Sa po 2% zastupljeni su haplotipovi Da*Dž, Da22 i At1 (svaki je pronađen na

posebnom lokalitetu).

Rezultati

57

U egejskom slivu, na 8 analiziranih lokaliteta pronađeno je 5 haplotipova od kojih

su dva: Ad*Bož (sliv Božice) i Ad*Ti (Tisova i Čerenačka reka) nova za nauku, dok su

haplotipovi ADcs1, Ad+Prz, At1poznati od ranije.

Slika 24. Brojčana i procentualna zastupljenost haplotipova egejskog sliva.

3, 15%

5, 25%

4, 20%

7, 35%

1, 5%ADcs1

Ad+Prz

Ad*Ti

Ad*Bož

At1

Brojčano i procentualno najzastupljeniji haplotip egejskog sliva je Ad*Bož, koji je

idetifikovan na 4 od 5 analiziranih lokaliteta u slivu reke Dragovištice i predstavlja 35%

zastupljenosti svih haplotipova pronađenih na ovom slivnom području. U slivu iste reke

sa 15% zastupljen je haplotip ADcs1 (pronađen na 3 lokaliteta) i haplotip At1 sa 5%

(pronađen na 1 lokalitetu). U slivu reke Vardar koja pripada istom slivnom području

obrađene su leve i desne pritoke. U levoj pritoci pronađen je haplotip Ad+Prz (pronađen

na jednom lokalitetu - Pčinja), koji predstavlja 25% ukupne zastupljenosti haplotipova

ovog sliva, a od desnih pritoka obrađena su dva lokaliteta (Tisova i Čerenačka reka) na

kojima je pronađen haplotip Ad*Ti koji učestvuje sa 20% u ukupnoj zastupljenosti.

U jadranskom slivu na 4 analizirana lokaliteta pronađena su 3 haplotipa, od kojih

je jedan novi za nauku Ad*Pe (Pećka Bistrica), a dva su već poznata od ranije Ad+Prz i

ADcs11.

Slika 25. Brojčana i procentualna zastupljenost haplotipova jadranskog sliva.

10, 50%

6, 30%

4, 20%

ADcs11

Ad+Prz

Ad*Pe

Brojčano i procentualno najzastupljeniji haplotip jadranskog sliva je ADcs11, koji

je identifikovan na sva 3 obrađena lokaliteta u slivu Pećke Bistrice i zastupljen je sa 50%.

Novi haplotip Ad*Pe koji je pronađen samo u Pećkoj Bistrici zastupljen je sa 20%, a

Rezultati

58

haplotip Ad+Prz koji je pronađen u Prizrenskoj Bistrici sa 30% u ukupnom broju svih

haplotipova na slivnom području.

Slika 26. Brojčana i procentualna zastupljenost svih pronađenih haplotipova na

analiziranom području.

36, 35%

5, 5%

5, 5%

2, 2%

1, 1%

1, 1%

3, 3%

2, 2%

8, 8%

10, 10%

11, 11%

4, 4%

7, 7%

4, 4%

2, 2%

Da1

Da2

Da23b

Da*Vl

Da*Dž

Da22

Da-s6

Da*Vr

ADcs1

ADcs11

Ad+Prz

Ad*Ti

Ad*Bož

Ad*Pe

At1

Procentualne vrednosti zastupljenosti haplotipova u ukupnom uzorku uglavnom se

slažu sa brojčanim vrednostima zbog broja analiziranih jedinki (101 jedinka). Po

brojnosti, u ukupnom uzorku dominira haplotip Da1 (36 jedinki), a prate ga Ad+Prz (11

jedinki) i ADcs11 (10 jedinki), ADcs1 (8 jedinki), Ad*Bož (7 jedinki), dok su ostali

haplotipovi zastupljeni sa pet i manje jedinki.

Rezultati

59

Slika 27. Sekvenca 5’ kraja kontrolnog regiona mtDNA (561bp), najbrojnijeg haplotipa Da1 na analiziranom području. Broj i zvezdica (*) iznad

sekvence pokazuju varijabilna nukleotidna mesta između analiziranih haplotipova (pronađenih i naknadno uključenih) iz svih pet glavnih linija

(Bernatchez i sar., 1992).

2 26 61 80

* * * *

ACTTTTCAGC TATGTACAAT AACAAATGTT GTACCTTGCT AACCCAATGT TATACTACAT CTATGTATAA TATTACATAT 80

113 126 146

* * *

TATGTATTTA CCCATATATA TAATATAGCA TG-TGAGTAG TACATCATAT GTATTATCAA CATTAGTGAA TTTAACCCCT 160

178 196 228 235 236

* * * **

CATACATCAG CACTAACTCA AGGTTTACAT AAAGCAAAAC ACGTGATAAT AACCAACTAA GTTGTCTTAA CCCGAGTAAT 240

243 262 263

* **

TGTTATATCA ATAAAACTCC AGCTAACACG GGCTCCGTCT TTACCCACCA ACTTTCAGCA TCAGTCCTGC TTAATGTAGT 320

387 389 390

* **

AAGAACCGAC CAACGATATA TCAGTAGGCA TACTCTTATT GATGGTCAGG GACAGATATC GTATTAGGTC GCATCTCGTG 400

403

*

AATTATTCCT GGCATTTGGT TCCTATATCA AGGGCTATCC TTAAGAAACC ACCCCCTGAA AGCCGAATGT AAAGCATCTG 480

484 530 542 543 548

* * ** *

GTTAATGGTG TCAATCTTAT TGCCCGTTAC CCACCAAGCC GGGCGTTCTC TTATATGCAT AACGTTCTCT TTTTTTTTTT 560

TT

Rezultati

60

Tabela 10. Polimorfna mesta na 5’ kraju kontrolnog regiona mtDNA za 15 haplotipova

pronađenih na teritoriji Srbije. Polimorfna mesta analiziranih haplotipova predstavljena su

u odnosu na haplotip At1, gde crtica ( - ) predstavlja ponovljeni nukleotid iz pvog reda, a

kosa crta ( / ) deleciju.

Kod mutacija haplotipova pronađenih u Srbiji tranzicije su zabeležene u 12

slučajeva (polimorfna mesta obeležena crnom bojom), transverzije u 4 (polimorfna mesta

obeležena crvenom bojom), a na 2 polimorfna mesta (obeležena plavom bojom), zbog

specifičnih mutacija na obeleženim pozicijama, a karakterističnih za pojedine haplotipove,

može se reći da postoji «kombinacija tranzicija i transverzija» za dato mesto. Haplotip Da-

s6 ima tranziciju na poziciji broj 26, u odnosu na sve ostale dunavske haplotipove (A→G).

Na istoj poziciji postoji transverzija između dunavskih i ostalih haplotipova (At i «južnih»).

Na poziciji broj 235 postoji očigledna tranzicija između prva tri dunavska (Da2, Da23b i

Da*Vl) i svih ostalih haplotipova (G→A), osim u slučaju haplotipa Da22 koji ima

transverziju na toj poziciji u odnosu na sve druge haplotipove (Tabela 10).

U Da liniji pronađena su tri nova haplotipa (Da*Vl, Da*Dž and Da*Vr), koji se

karakterišu mutacionim događajima na sledećim pozicijama: Da*Vl 390 (T), haplotip

Da*Dž 61 (T), 530 (T), 542 (G), i 548 (C), haplotip Da*Vr 228 (G), i 543 (G), dok su

polimorfizmi na pozicijama 530, 542, i 548 isti kao i kod haplotipa Da*Dž.

U Ad liniji prvi put su opisana tri haplotipa Ad*Bož, Ad*Pe i Ad*Ti koja se

karakterišu mutacionim događajima na sledećim pozicijama: Ad*Bož 26 (T), Ad*Pe 387

(A) i Ad*Ti 543 (C) (Tabela 10).

Polimorfna mesta Haplotipovi 2 26 61 80 126 146 228 235 236 262 387 389 390 403 530 542 543 548

At1 T T C T C G T A T G G C T T T G G C Da2 C A - - - - - G G - - T C - C A C T Da23b C A - - - A - G G - - T C - C A C T Da*Vl C A - - - - - G G - - T - - C A C T Da22 C A - - - - - T G - - T C - C A C T Da1 C A - - - - - - G - - T C - C A C T Da-s6 C G - - - - - - G - - T C - C A C T Da*Dž C A T - - - - - G - - T C - - - C - Da*Vr C A - - - - G - G - - T C - - - - - ADcs1 - C - - - - - - - C - T C C - - - - ADcs11 - C - C - - - - - C - T C C - - - - Ad*Pe - C - - - - - - - C A T C C - - - - Ad*Ti - C - - - - - - - C - T C C - - C - Ad*Bož - - - - - - - - - C - T C C - - - - Ad+Prz - C - - T - - - - T - T C C - - - -

Rezultati

61

Tabela 11. Procentualne vrednosti divergencija između parova haplotipova (ispod dijagonale), i broj polimorfnih mesta između njih na analiziranom fragmentu kontrolnog regiona mtDNA(iznad dijagonale).

Srodnički odnosi između pojedinih parova haplotipova određivani su

upoređivanjem haplotipova putem dvoparametarskog Kimura modela sa odnosom

tranzicije/transverzije = 2. Procentualne vrednosti distanci za haplotipove pronađene u

Srbiji kreću se od 0,18% do 2,12% (X= 1.2 SD = ±0.68 ). Što se tiče razlika u

polimorfnim mestima, haplotipovi se među sobom razlikuju za od 1 do 12 supstitucija.

Genetička divergencija unutar Da linije je znatno izraženija i za oko tri puta veća (0,6%

od unutar grupne srednje genetičke distance) u poređenju sa divergencijom unutar

«južne» grupe linija (Ad i Ad+).

Tabela 12. Rezultati AMOVA testa.

Vrednosti Φ statistike AMOVA testa pokazuju da je genetička divergencija

povezana sa geografskim rasporedom odnosno hidrološkim paternom (68.80% od ukupne

varijabilnosti između slivova, Φ CT = 0.68798, p < 0.001). Rezultati ukazuju da je visok

nivo populacione strukturiranosti (Φ ST = 0. 91565, p < 0.001) u ukupnom uzorku (sve

Haplotipovi Da2

Da23b

Da*Vl

Da22

Da1

Da-s6

Da*Dž

Da*Vr

At1

ADcs1

ADcs11

Ad*Pe

Ad*Ti

Ad*Bož

Ad+Prz

Da2 1 1 1 1 2 5 6 10 10 11 11 9 10 11 Da23b 0,18 2 2 2 3 6 7 11 11 12 12 10 11 12 Da*Vl 0,18 0,35 2 2 3 6 7 9 11 12 12 10 11 12 Da22 0,18 0,35 0,35 1 2 5 6 10 10 11 11 9 10 11 Da1 0,18 0,35 0,35 0,18 1 4 5 9 9 10 10 8 9 10 Da-s6 0,35 0,53 0,53 0,35 0,18 5 6 9 9 10 10 8 9 10 Da*Dž 0,88 1,05 1,05 0,88 0,70 0,88 3 7 7 8 8 6 7 8 Da*Vr 1,05 1,23 1,23 1,05 0,88 1,05 0,53 6 6 7 7 7 6 7 At1 1,76 1,94 1,59 1,76 1,59 1,59 1,23 1,05 5 6 6 6 4 6

ADcs1 1,76 1,94 1,94 1,76 1,59 1,59 1,23 1,05 0,88 1 1 1 1 2 ADcs11 1,94 2,12 2,12 1,94 1,76 1,76 1,41 1,23 1,05 0,18 2 2 2 3 Ad*Pe 1,94 2,12 2,12 1,94 1,76 1,76 1,41 1,23 1,05 0,18 0,35 2 2 3 Ad*Ti 1,59 1,76 1,76 1,59 1,41 1,41 1,05 1,23 1,05 0,18 0,35 0,35 2 3 Ad*Bož 1,76 1,94 1,94 1,76 1,59 1,59 1,23 1,05 0,70 0,18 0,35 0,35 0,35 3 Ad+Prz 1,94 2,12 2,12 1,94 1,76 1,76 1,41 1,23 1,05 0,35 0,53 0,53 0,53 0,53

Izvori

varijabilnosti df

Sume

kvadrata

Komponente

varijanse

Procenat

varijabilnosti φφφφ - statistika

Između slivova 2 165.779 2.80100 68.80 0.72965 (φsc) Između populacija unutar slivova

32 93.851 0.92690 22.77 0.91565 (φst)

Unutar populacija 66 22.667 0.34343 8.43 0.68798 (φct) Ukupno 100 282.297 4.07133 100

Rezultati

62

lokalne populacije) posledica velike različitosti haplotipova između populacija unutar

različitih slivova. Svaka lokalna populacija predstavljena je najčešće sa jednim ili retko sa

dva ili tri haplotipa, što je rezultiralo visokim vrednostima za oba Φ ST i Φ SC statistička

parametra (Φ SC = 0.72965, p < 0.001).

Utvrđivanje stepena srodnosti između pronađenih haplotipova na teritoriji Srbije

predstavljeno je filogenetskim stablom koje je urađeno po metodi "Neighbour-Joining"

(NJ), koja spada u metode distanci. Filogenetsko stablo napravljeno je i po metodi

"Minimum evolution" (ME), ali se ono nije bitno razlikovalo od stabla napravljenog

predhodnom (NJ) metodom.

Slika 28. Filogenetsko stablo haplotipova pronađenih na teritoriji Srbije, urađeno na

osnovu sekvenci 5' kraja kontrolnog regiona mtDNA metodom "Neighbour-Joining" (NJ)

u programu "MEGA 3". Brojevi uz čvorišta predstavljaju procentualne vrednosti

ponavljanja grananja u 10000 ponavljanja. Kao "outgroup" uključene su dve vrste Salmo

ohridanus i Salmo salar.

Na osnovu dobijenog stabla evidentno je da su dunavski i «južni» (Ad i Ad+)

egejski i jadranski haplotipovi monofiletske grupe, a da se između njih nalazi At1

haplotip koji pripada atlantskoj liniji.

Rezultati

63

3.2.1. UPOREĐIVANJE SEKVENCI KONTROLNOG REGIONA mtDNA PRONAĐENIH

HAPLOTIPOVA NA TERITORIJI SRBIJE SA VEĆ POZNATIM

HAPLOTIPOVIMA POTOČNE PASTRMKE IZ SVIH FILOGENETSKIH LINIJA

Da bi se dobila kompletnija slika filogenetskih odnosa, u dalju analizu, osim

haplotipova pronađenih u Srbiji, uključeno je još osam haplotipova iz četiri filogenetske

linije: atlantske, mediteranske, marmoratus i farioides (Ad+). Iz dunavske linije nisu

uključeni dodatni haplotipovi jer je pronađen veliki broj različitih haplotipova na teritoriji

Srbije.

Iz atlantske linije analizirana su još dva haplotipa iz Austrije čije su sekvence za

kontrolni region mtDNA preuzete iz Banke gena: At-11a (AY185 578) i At-10 (AY185

577). Iz farioides linije analizirana su još dva haplotipa čije sekvence nisu do sada

objavljene u Banci gena (Ad+N – Neretva i Ad+RC-Rijeka Crnojevića; usmeno

saopštenje Aleš Snoj). Iz mediteranske linije analizirana su dva haplotipa čije su sekvence

zavedene u Banci gena: MEcs1 (AY 836350) i MEcs7 (AY 836356) (Španija). Iz

marmoratus linije analizirana su dva haplotipa iz Slovenije: MAcs1 (AY 836365) i Ma-s2

čija cela sekvenca još nije objavljena (usmeno saopštenje Aleš Snoj).

Kao "outgroup" analizirane su dve vrste čije su sekvence zavedene u Banci gena

Salmo ohridanus (AY260 512) i Salmo salar (U12143).

Rezultati

64

Imena haplotipova Polimorfna mesta u Srbiji van Srbije 2 26 61 80 113 126 146 178 196 228 235 236 243 262 263 387 389 390 403 484 530 542 543 548

At1 T T C T / C G T A T A T T G C G C T T A T G G C At11a - - - - / - - C - - - - - - - - - - - - - - - - At10 - - - - / - A - - - - - - - - - - - - - - - - - Da2 C A - - / - - - - - G G - - - - T C - - C A C T Da23b C A - - / - A - - - G G - - - - T C - - C A C T Da*Vl C A - - / - - - - - G G - - - - T - - - C A C T Da22 C A - - / - - - - - T G - - - - T C - - C A C T Da1 C A - - / - - - - - - G - - - - T C - - C A C T Da-s6 C G - - / - - - - - - G - - - - T C - - C A C T Da*Dž C A T - / - - - - - - G - - - - T C - - - - C - Da*Vr C A - - / - - - - G - G - - - - T C - - - - - - ADcs1 - C - - / - - - - - - - - C - - T C C - - - - - ADcs11 - C - C / - - - - - - - - C - - T C C - - - - - Ad*Pe - C - - / - - - - - - - - C - A T C C - - - - - Ad*Ti - C - - / - - - - - - - - C - - T C C - - - C - Ad*Bož - - - - / - - - - - - - - C - - T C C - - - - - Ad+Prz - C - - / T - - - - - - - T - - T C C - - - - - Ad+N - C - - / T - - - - - - C T - - T C C - - - - - Ad+RC - - - - / T - - - - - - - T - - T C C - - - - - MAcs1 - C - - A - - - - - - - - A - - T C C - - - - - Ma-s2 - C - - A - - - - - - - - A T - T C C - - - - - MEcs1 - C - - / - A - C - - - - - - - T C C - - - - - MEcs7 - C - - / - A - C - - - - - - - T C C T - - - -

Tabela 13. Polimorfna mesta na 5’ kraju kontrolnog regiona mtDNA za 15 pronađenih haplotipova na teritoriji Srbije (levo ravnanje), kojima je priključeno još 8 haplotipova iz atlantske, farioides, marmoratus i mediteranske linije (desno ravnanje). Polimorfna mesta analiziranih haplotipova predstavljena su u odnosu na haplotip At1, gde crtica ( - ) predstavlja ponovljeni nukleotid iz pvog reda a kosa crta ( / ) deleciju. Nomenklatura haplotipova data je po (Bernatchez, 2001), (Duftner i sar., 2003), (Cortey i sar., 2004) i (Razpet i sar., u štampi).

Rezultati

65

U prethodnoj tabeli upoređena su polimorfna mesta na 5’ kraju kontrolnog regiona

mtDNA haplotipova pronađenih u Srbiji sa još osam haplotipova koji pripadaju

atlantskoj, farioides, mediteranskoj i marmoratus liniji, a nisu pronađeni na analiziranom

području. Iz tabele se može videti da haplotipovi svake linije poseduju nukleotidne

sinapomorfizme na određenim pozicijama.

Analizirani haplotipovi atlantske linije poseduju dva sinapomorfizma na

pozicijama 389 (C) i 390 (T).

Haplotipovi dunavske linije poseduju veći broj sinapomorfizama i to na

pozicijama: 2 (C), 26 (A) sa izuzetkom Da-s6 koji poseduje tranziciju (A→G), pozicija

236 (G), pozicija 530 (C) sa izuzecima Da*Dž i Da*Vr koji poseduju tranziciju (C→T),

pozicija 542 (A) sa izuzecima Da*Dž i Da*Vr koji poseduju tranziciju (A→G), pozicija

543 (C) sa izuzetkom Da*Vr koji poseduje transverziju (C→G) i pozicija 548 (T) sa

izuzecima Da*Dž i Da*Vr koji poseduju tranziciju (T→C). Poslednja četiri polimorfizma

kod haplotipa Da*Dž i Da*Vr zajednička su za najveći broj haplotipova koji pripadaju

drugim linijama (At, Ad, Ad+ Ma i Me) (Tabela 13).

Haplotipovi Ad i Ad+ linije poseduju takve sinapomorfizme da se mogu jasno

razlikovati. Zajednički sinapomorfizam za najveći broj haplotipova obe grupe je prisustvo

(C) na poziciji broj 26, a to su svi prikazani haplotipovi izuzev Ad*Bož i Ad+RC koji na

istoj poziciji imaju tranziciju (C→T). Sinapomorfizam bitan za prvu grupu (Ad) je na

poziciji 262 (C). U drugu grupu (Ad+) spadaju haplotipovi koji na poziciji 126 i 262

imaju (T), a to su Ad+Priz, Ad+N i Ad+RC.

Haplotipovi linije marmoratus (Ma) poseduju sinapomorfizam koji se ogleda u

prisustvu insercije na poziciji 113 (A) i prisustvu (A) na poziciji 262.

Haplotipovi mediteranske (Me) linije poseduju sinapomorfizme na pozicijama 146

(A) i 196 (C).

Haplotipovi iz Ad+ grupe, i iz Ma i Me linije pokazuju po dva interkladna

sinapomorfizma po kojima se razlikuju, što ukazuje na sličnu dubinu divergencije ovih

klada (Tabela 13).

Rezultati

66

Slika 29. Filogenetsko stablo haplotipova pronađenih na teritoriji Srbije uz dodatak 8

haplotipova iz atlantske, farioides, marmoratus i mediteranske linije, sa dva "outgroup"

haplotipa Salmo ohridanus i Salmo salar, urađeno na osnovu sekvenci 5' kraja kontrolnog

regiona mtDNA metodom "Neighbour-Joining" (NJ) u programu "MEGA 3". Brojevi uz

čvorišta predstavljaju procentualne vrednosti ponavljanja grananja u 10000 ponavljanja.

Na osnovu dobijenog stabla evidentno je da su haplotipovi grupisani u već

poznate linije (dunavsku, atlantsku, mediteransku, marmoratus i jadransku) i novu Ad+

(farioides) liniju, pri čemu su haplotipovi Da i At linije posebno grupisani u odnosu na

ostale «južno» – evropske haplotipove (Me, Ma, Ad i Ad+). U okviru Ad linije grupisani

su sledeći haplotipovi: Ad*Bož, Ad*Pe, Ad*Ti, ADcs1 i Adcs11, dok Ad+ grupu čine tri

haplotipa: Ad+Prz, Ad+N i Ad+RC.

Rezultati

67

Slika 30. Filogenetsko stablo haplotipova pronađenih na teritoriji Srbije uz dodatak 8

haplotipova iz atlantske, farioides, marmoratus i mediteranske linije, sa dva "outgroup"

haplotipa Salmo ohridanus i Salmo salar. Stablo je urađeno u programu "PAUP 4" na

osnovu sekvenci 5' kraja kontrolnog regiona mtDNA metodom "Maximum parsimony

(MP) Majority role consensus 50%". Brojevi uz čvorišta predstavljaju procentualne

vrednosti ("bootstrap") ponavljanja grananja u 1000 ponavljanja. Vrednosti iznad grana

date su za "MP Majority role consensus 50%", prva vrednost ispod grana predstavlja MP

"bootstrap" i druga vrednost ispod grana predstavlja NJ "bootstrap".

Rezultati

68

Stablo koje je dobijeno metodom "MP Majority rule consensus 50%", vrlo je

slično stablima koja su dobijena korišćenjem metoda MP i NJ u programu "PAUP 4"‚

zato je upotrebljeno jedno stablo da se prikažu rezultati za sve tri metode. Dobijeno

stablo, prema položaju haplotipova i rasporedu u filogenetske linije, veoma je slično

stablu dobijenom u programu "MEGA 3" metodom "Neighbour-Joining" (NJ) (slika 29).

Konsensus stablo takođe prikazuje jasno razdvajanje dve glavne klade (Da i At klada plus

«južno» – evropska klada). Uključivanjem dva "outgroup" haplotipa Salmo ohridanus i

Salmo salar omogućeno je utvrđivanje statističke značajnosti prvog grananja koje se

pokazalo kao vrlo značajno. Unutrašnja topologija u okviru dve glavne grupe (Da i At

plus «južno» – evropska) bila je podržana nešto nižim "bootstrap" vrednostima, što

posebno važi za haplotip Ad*Bož, koji na ovom stablu zauzima ancestralni položaj u

odnosu na ostale «južno» – evropske haplotipove, ali bez podrške za MP analizu i sa

niskom "bootstrap"vrednošću za NJ analizu. Grupisanje u okviru «južno» – evropske

grupe haplotipova u Ad, Ma i Me i dopunsku Ad+ grupu (Ad+Prz, Ad+N i Ad+RC) isto

je kao i pri NJ analizi u programu "MEGA 3" (Slika, 29). Haplotipovi Da*Dž i Da*Vr

zauzimaju na svim filogenetskim stablima bazalni položaj unutar Da linije, što je i

statistički podržano.

Rezultati

69

Slika 31. Kladogram (mreža) haplotipova pronađenih na

lokalitetima sva tri sliva na teritoriji Srbije, uz dodatak

haplotipova koji su naknadno uključeni u analizu (crveni

krugovi iste veličine). Veličina krugova haplotipova

pronađenih na teritoriji Srbije odgovara njihovoj

frekvenci, a dvobojnost označava da je haplotip pronađen

na dva slivna područja. Haplotipovi pronađeni u

dunavskom slivu označeni su različitim nijansama zelene

boje, u egejskom nijansama žute i u jadranskom različitim

nijansama plave boje. Svaka linija koja učestvuje u

povezivanju haplotipova predstavlja jedan mutacioni

korak po algoritmu programa «TCS», a crni krugovi

predstavljaju teoretski nedostajuće haplotipove.

Rezultati

70

Na osnovu kladograma (mreže) haplotipova (Slika 31) uočava se grupisanje

haplotipova u odgovarajuće linije. Preko broja algoritamskih mutacionih koraka (spojnih

linija) moguće je utvrditi tačan broj polimorfizama (mutacija) između haplotipova koji

pripadaju istoj liniji.

Na osnovu kladograma mogu se utvrditi genealoški odnosi između haplotipova.

Posmatranjem kladograma u celini, centralnu poziciju zauzima haplotip Da*Vr koji je

približno podjednako udaljen od Da (≥ 5 mutacionih koraka), At (≥ 5 mutacionih koraka)i

«južne» klade (≥ 6 mutacionih koraka). Unutar Da klade centralnu poziciju zauzima

haplotip Da1 koji se od hapotipova Da-s6, Da22 i Da2 razlikuje za jedan mutacioni korak,

dok se od haplotipova Da23b i Da*Vl razlikuje za dva mutaciona koraka. Najudaljeniji

haplotipovi u okviru Da linije su Da*Dž i Da*Vr koji se razlikuju od centralnog haplotipa

za 4 odnosno 5 mutacionih koraka. Unutar linija koje pripadaju južnoj kladi (Ad, Ad+,

Ma i Me) haplotip ADcs1 zauzima centralno mesto. Ostali Ad haplotipovi razlikuju se od

centralnog ADcs1 haplotipa za jedan mutacioni korak, dok se haplotipovi iz Ma, Me i

Ad+Prz linija razlikuju od centralnog za ≥2 mutaciona koraka.

Na osnovu rezultata dobijenih analizama isključivo na haplotipovima koji su

pronađeni na teritoriji Srbije (Slike 22b i 28) nije se moglo uočiti jasno razdvajanje unutar

jadranske linije. Međutim, dopunskim uključivanjem u filogenetsku analizu haplotipova

Ad+N i Ad+RC, koji su sa haplotipom Ad+Prz formirali na filogenetskim stablima novu

grupu, statistički visoko značajnu (Slika 29 i 30), kao i posebnu grupu na kladogramu

haplotipova (Slika 31), omogućen je uvid u razdvajanje prvobitne Ad linije i novo

otkrivene Ad+ (farioides) linije.

Diskusija

71

4. DISKUSIJA

Bernatchez i sar. (1992) smatraju da, bez obzira na izuzetno veliki broj rezultata

koji su dobijeni u poslednjih 20 godina, za rasvetljavanje filogeografske strukture

populacija potočne pastrmke još uvek nedostaju rezultati sa vrlo značajnih geografskih

područja kao što su severna Afrika i istočna Evropa. Kottelat (1997) naglašava da je

veliki problem u rešavanju taksonomije pastrmskih populacija Balkanskog poluostrva

upravo nedostatak informacija sa područja republika bivše Jugoslavije. Poseban značaj u

izučavanju balkanskih pastrmskih populacija je upravo u tome što se smatra da je

Balkansko poluostrvo, pored Apeninskog i Iberijskog, bilo refugijalni centar, a samim tim

i centar diverziteta za vreme glacijacija (Hewitt, 1996; 1999).

U najbližoj okolini Srbije samo na teritoriji Austrije, Slovenije i Grčke utvrđena je

genetička diferenciranost pastrmskh populacija (Duftner i sar., 2003; Snoj i sar., 2004;

Apostolidis i sar., 1996; 1996a; 1997). Poslednjih godina sakupljan je materijal iz Bosne i

Hercegovine, Hrvatske i Crne Gore, ali rezultati još nisu objavljeni.

Ako se uporede rezultati istraživanja sa pomenutih teritorija, kao i rezultati koje je

objavio Bernatchez (1992), sa rezultatima koji su dobijeni na teritoriji Srbije (101

jedinka/15 haplotipova), uočava se vrlo sličan diverzitet haplotipova. Bernatchez i sar.

(1992) pronašli su, analizom 310 bp kontrolnog regiona mtDNA, 12 haplotipova na 154

analizirane jedinke iz 24 populacije zapadne Evrope. Duftner i sar. (2003) su na teritoriji

Austrije opisali 16 haplotipova iz uzorka od 123 jedinke sa 20 lokaliteta (crnomorski

sliv), analizom kompletnog kontrolnog regiona mtDNA, gde 7 haplotipova pripada

atlantskoj liniji, čiju autohtonost na analiziranom području tek treba utvrditi. Apostolidis i

sar. (1997) su za teritoriju Grčke opisali 10 haplotipova iz uzorka od 76 jedinki sa 12

lokaliteta (egejski, jonski i jadranski sliv), analizom kontrolnog regiona mtDNA u dužini

od 310 bp. Snoj i sar. (2004) su na teritoriji Slovenije opisali 12 haplotipova iz uzorka od

364 jedinke sa 20 lokaliteta (crnomorski i jadranski sliv), analizom kontrolnog regiona

mtDNA u dužini od 420 bp.

Analizom celog kontrolnog regiona mtDNA i obradom većeg broja uzoraka sa

lokaliteta na teritoriji Kosova i Metohije (razvođe slivova), verovatno bi genetički

diverzitet pastrmskih populacija na teritoriji Srbije bio veći od prikazanog.

Diskusija

72

4.1. ANALIZA KONTROLNOG REGIONA mtDNA

Na osnovu rezultata RFLP tehnike, korišćenjem restrikcionog enzima Alu I

dobijena je prva informacija o zastupljenosti mtDNA linija potočne pastrmke na

analiziranom području. Upotrebom enzima Alu I dobijene su dve različite dužine

fragmenata, koje su odgovarale haplotipovima Da i Ad linije. Da haplotipovi pronađeni

su na analiziranim lokalitetima crnomorskog sliva, dok su Ad haplotipovi pronađeni na

lokalitetima jadranskog i egejskog sliva. Ranija istraživanja su pokazala da su u egejskom

slivu najzastupljeniji haplotipovi Ad linije (Apostolidis i sar., 1996a; 1997). Enzim Alu I

ne može razdvojiti haplotipove Da i At, kao ni Ad i novo opisane Ad+ (farioides) linije,

jer imaju potpuno ista restrikciona mesta.

Sekvenciranjem dela kontrolnog regiona mtDNA dobijen je precizan pregled (koji

restrikciona analiza nije mogla pružiti) pronađenih haplotipova na analiziranom području,

koji je omogućio detekciju genetičkog diverziteta potočne pastrmke u okviru tri već

poznate mtDNA linije (Da, Ad i At) kao i četvrte nove Ad+, koje naseljavaju gornje

tokove reka određenih slivova na teritoriji Srbije. Haplotipovi Da, i «južnih» linija su

generalno autohtoni za lokalitete crnomorskog odnosno jadranskog i egejskog sliva, dok

je At haplotip alohtonog porekla za analizirano područje.

Ako se uporede rezultati istraživanja iz crnomorskog sliva na teritoriji Srbije sa

dobijenim rezultatima iz uzvodnog dela istog sliva (Slovenija i Austrija) uočava se da je

diverzitet haplotipova veoma sličan. U crnomorskom slivu Srbije pronađeno je 8

haplotipova naspram 7 Da haplotipova iz Slovenije (Snoj i sar., 2004) i 8 Da haplotipova

iz Austrije (od 5' kraja do poli T bloka kontrolnog regiona mtDNA) (Duftner i sar., 2003).

Najučestaliji haplotip u okviru sva tri analizirana područja je Da1. Od zajedničkih

haplotipova koji se sreću u Srbiji i u uzvodnim delovima crnomorskog sliva, osim

haplotipa Da1 pronađeni su Da2, Da22, Da23b haplotipovi sa vrlo sličnim učestalostima

u okviru analiziranih područja. Haplotipovi Da22 i Da23b su vrlo retki i svaki je, osim u

Srbiji, pronađen na malom broju lokaliteta (Da22 u Sloveniji i u Austriji (na po 2

lokaliteta), Da23b u Austriji (1 lokalitet/1 primerak)). Haplotip Da22 je jedini u Da liniji

koji na poziciji 235 poseduje transverziju G→T, dok haplotip Da23b poseduje tranziciju

G→A na poziciji 146, što je karakteristika najvećeg broja mediteranskih i vrlo malog

broja atlantskih haplotipova. Da23b haplotip pronađen je na tri lokaliteta u Istočnoj Srbiji

Diskusija

73

(Rečka, Vratna i Radovanjska reka - pritoka Timoka), a to su reke koje imaju neposrednu

komunikaciju sa Dunavom. Isti haplotip pronađen je u Austriji na lokalitetu Lohnbach

koji je takođe u neposrednoj vezi sa Dunavom.

Od haplotipova koji su pronađeni nizvodno i istočnije (basen Crnog mora,

Kaspijskog i Aralskog jezera), sa visokom učestalošću se takođe javlja haplotip Da1,

nešto ređe Da2, i Da-s6 (jedini Da haplotip koji na poziciji 26 poseduje tranziciju A→G).

Da-s6 haplotip je veoma redak i pripada posebnim ekofenotipskim formama iz jezera

Sevan (Jermenija, sliv - Kaspijskog jezera), prepoznatim kao posebna vrsta Salmo

ischchan. Behnke (1986) je dao hipotezu da se radi o pastrmci izvedenoj od primitivnog

pretka svih ostalih populacija potočne pastrmke. Bernatchez i Osinov (1995) i Osinov i

Bernatchez (1996) odbacuju pomenutu hipotezu na osnovu kombinovanih rezultata

alozima i mitohondrijalnih markera i zaključuju da Salmo ischchan predstavlja

morfološki i ekološki jedinstvenu formu pastrmki koja se razvila relativno skoro i pripada

istoj evolutivnoj liniji kao i ostale pastrmke iz basena Crnog mora, Kaspijskog i Aralskog

jezera. Pronalazak haplotipa Da-s6 na teritoriji Srbije u Studenačkoj reci (sliv Visočice i

Nišave) predstavlja prvi nalaz ovog haplotipa van jezera Sevan, što daje potvrdu gore

iznešenim tvrdnjama Bernatchez i Osinov (1995) i Osinov i Bernatchez (1996).

Slika 32. Pastrmke kod kojih je pronađen haplotip Da-s6.

Salmo ischchan - jezero Sevan (Jermenija)

Salmo trutta – Studenačka reka (Srbija)

Diskusija

74

Tri nova Da haplotipa (Da*Vl, Da*Dž, Da*Vr) pronađena su na razvođu

crnomorskog – dunavskog sliva (Južna Morava) i egejskog (Dragovištica/Struma) sliva

(Slika 1). Da*Vl je prvi dunavski haplotip koji na poziciji 390 poseduje tranziciju C→T,

što je odlika haplotipova At linije i jednog do sada pronađenog haplotipa Ad linije

(ADcs3) (Cortey i sar., 2004). Haplotip Da*Dž poseduje novo polimorfno mesto na

poziciji 61 (tranzicija, C→T), dok haplotip Da*Vr poseduje novi polimorfizam na

poziciji 228 (transverzija, G→T). Haplotipovi Da*Dž i Da*Vr se značajno odvajaju od

ostale grupe Da haplotipova (Slika 31) zbog polimorfizama na pozicijama 530 (tranzicija,

C→T), 542 (tranzicija, A→G), 543 (transverzija, C→G, važi samo za Da*Vr, dok Da*Dž

ima C kao i ostali Da haplotipovi) i 548 (tranzicija, T→C) (Tabela 13). Oba haplotipa

imaju na pozicijama 530, 542, 543 i 548 raspored baza karakterističan za pojedine

haplotipove ostalih linija. Za pomenute pozicije postoje sinapomorfizmi između Da*Dž i

Ad*Ti kao i između Da*Vr i najvećeg broja haplotipova svih ostalih linija (At, Ad, Ad+,

Me i Ma). Prema filogenetskom položaju klada za haplotipove Da*Dž i Da*Vr, može se

videti da je njihov položaj ancestralni u okviru Da linije (Slika 30) i istovremeno da su to

Da haplotipovi koji su najbliži haplotipovima svih ostalih linija (Slika 30 i 31). Ovakav

položaj pomenutih Da haplotipova podržava tvrdnju Cortey i sar. (2004) da, analizom

celog kontrolnog regiona mtDNA, topološki Da haplotipovi zauzimaju ancestralni položaj

u odnosu na ostale linije, što se slaže sa stanovištem Bernatchez i sar. (1992), Bianco

(1990) i Durand i sar. (2003) da recentna slatkovodna fauna Evrope ima istočnjačko

poreklo (Azija).

Na lokalitetima Jerma (br. 19) i Vrla (br. 22) koji se nalaze na razvođu dunavskog

i egejskog sliva, pronađen je haplotip ADcs1 koji je u Jermi jedini haplotip, a u Vrli je

pronađen zajedno sa novim dunavskim haplotipom Da*Vr. Objašnjenje za prisustvo

haplotipa ADcs1 u Jermi je njeno poribljavanje u gornjem delu toka kroz Bugarsku, kao i

njenih desnih pritoka koje izviru takođe na teritoriji Bugarske (usmeno saopštenje Saša

Panić, Pirot). Poribljavanje je izvršeno matičnim materijalom iz sliva Strume (egejski

sliv) koji pripada Ad liniji. Upravo haplotip ADcs1 pronađen je u rekama sliva

Dragovištice/Struma (Tabela 9), što ide u prilog pomenutom usmenom saopštenju.

Prevođenje voda iz sliva Dragovištice u sliv Južne Morave za potrebe akumuliranja vode

radi proizvodnje električne energije (Ocokoljić, 1987), smatra se uzrokom prisustva

haplotipa ADcs1 u Vrli. Prevođenje vode sistemom cevi najverovatnije je omogućilo

prenošenje oplođene ikre ili čak mlade ribe iz jednog slivnog područja u drugo. Iz svega

navedenog, najverovatnije da je haplotip ADcs1 alohtonog porekla za oba lokaliteta.

Diskusija

75

Na lokalitetu Gradac (br. 2) pronađen je haplotip At linije (At1), koji je alohtonog

porekla za deo crnomorskog sliva na teritoriji Srbije. Reka Gradac je više puta

poribljavana jer trpi veliki ribolovni pritisak, a jedno od poribljavanja vršeno je i

materijalom sa Vrela Bune gde se uzgajala potočna pastrmka At linije (usmeno saopštenje

Sreten Đorđević). Materijal koji se koristi za poribljavanje vrlo često je alohtonog porekla

i pripada komercijalnim linijama kao što je At, pre svega zbog prilagodljivosti

ribnjačkom uzgoju. U uzvodnom delu sliva Dunava u zoogeografskoj kontakt zoni

crnomorskog i atlantskog sliva pronađeni su haplotipovi At linije. Poznato je da je u

vodama Austrije, Švajcarske i Nemačke bilo masovnog poribljavanja upravo materijalom

At linije, ali pojedini autori smatraju da mogućnost post-glacijalne kolonizacije gornjih

delova sliva Dunava u oblasti kontakt zone od strane At haplotipova ne može biti u

potpunosti odbačena (Duftner i sar., 2003).

Bernatchez i Osinov (1995) i Osinov i Bernatchez (1996) smatraju da populacije

Da linije unutar basena Crnog mora i Kaspijskog i Aralskog jezera odlikuje prisutnost

posebnih alela ili mtDNA genotipova, kao i visok nivo genetičke diferenciranosti što

treba uzeti u obzir prilikom programa konzervacije. Rezultati dobijeni na pastrmskim

populacijama crnomorskog sliva iz Slovenije, Austrije i Srbije u potpunosti podržavaju

stavove pomenutih autora.

Apostolidis i sar. (1997) podelili su vode slivova Grčke u dve zone Južno –

Jadransko Jonsku zonu i Ponto – Egejsku zonu. Analizirani deo jadranskog sliva (Beli

Drim) na teritoriji Srbije pripada po pomenutoj podeli severnom delu Južno – Jadransko

Jonske zone. Na ovom delu analizirane teritorije, od tri pronađena haplotipa Ad*Pe je

novi, a dva su već od ranije poznata: ADcs11 i Ad+Prz (Slika 1; Tabela 10). Haplotip

Ad*Pe je jedinstven po tranziciji (G→A) na 387 mestu, koja do sada nije bila opisana i

pronađen je samo u Pećkoj Bistrici. Haplotip ADcs11 (Cortey i sar., 2004) ili AD-s7 po

Bernatchez (2001), pronađen je u Pećkoj Bistrici ali i njenim pritokama (Tabela 10) i

prvobitno je bio opisan od strane Apostolidis i sar. (1997) u slivu Jonskog mora kao

ADs7r9. To je jedini haplotip koji na poziciji 80 poseduje tranziciju T→C.

Haplotip Ad+Prz pronađen je u Mrtvici (pritoka Morače) (usmeno saopštenje Aleš

Snoj), ali nije još zvanično objavljen. Na teritoriji Srbije pronađen je na dva lokaliteta u

jadranskom (Prizrenska Bistrica; br. lok. 32/Beli Drim) i egejskom slivu (Tripušnica; br.

lok. 29/Vardar). Haplotip Ad+Prz poseduje tranziciju C→T na poziciji 126 i 262 što je

karakteristika samo još dva poznata haplotipa iz Ad linije, jedan je iz Neretve (Ad+N) a

Diskusija

76

drugi je iz Rijeke Crnojevića (Ad+RC) (usmeno saopštenje Aleš Snoj). Haplotip AdN

jedino poseduje C na poziciji 243, dok AdRC haplotip poseduje T na poziciji 26, i to su

dva mesta po kojima se ovi haplotipovi razlikuju od Ad+Prz.

Zbog specifičnih sinapomorfizama (pozicije 126 i 262), haplotipovi Ad+Prz,

Ad+N i Ad+RC formiraju posebnu grupu sa visokom bootstrap potporom za sve tri

urađene analize. Ova grupa je pozicionirana kao sestrinska u odnosu na ostale jadranske,

mediteranske i marmoratus haplotipove (Slika 30), pa je zato i označena kao nova Ad+

linija. Pošto sva tri haplotipa naseljavaju reke u slivu južnog Jadrana, i jasno se grupišu

kao i ostale linije sa visokim bootstrap vrednostima, možda možemo predpostaviti da se

radi o Salmo fariodes (Karaman, 1937), za koju je opisano da naseljava pritoke srednjeg i

južnog Jadrana (Krka, Neretva, Beli Drim, pritoke Ohridskog i Skadarskog jezera).

Međutim, nalaz istog haplotipa u slivu Vardara (Tripušnica) izvan je areala u kome je

opisan, što je najverovatnije posledica poribljavanja.

U Ponto – Egejskoj zoni na teritoriji Srbije analizirali smo izvorišne delove reka u

slivovima Vardara i Strume.

Na analiziranim lokalitetima pronađeno je pet haplotipa, od kojih su dva nova

(Ad*Ti i Ad*Bož), a tri su već bila poznata (ADcs1, Ad+Prz i At1) (Slika 1; Tabela 10).

Na lokalitetima Tisova i Čerenačka reka (br. lok. 30 i 31/desne pritoka Vardara),

pronađen je novi haplotip Ad*Ti koji se za samo jednu transverziju (G→C) na poziciji

543 razlikuje od haplotipa ADcs1. U okviru iste zone, samo u levoj pritoci Vardara

(Tripušnica) ponađen je haplotip Ad+Prz koji je predhodno pomenut u jadranskom slivu.

Prisustvo Ad+Prz haplotipa u Tripušnici najverovatnije je posledica poribljavanja koje je

izvedeno 1978. godine putem mlađi koja je nabavljena u Konjicu (Neretva – jadranski

sliv). Pošto je haplotip Ad+Prz pronađen u slivu Belog Drima i Skadarskog jezera,

najverovatnije ga ima i u slivu Neretve, odakle je prenet u Tripušnicu, u kojoj do tada

pastrmke nije bilo (usmeno saopštenje «Ribolovačko društvo Trgovište»).

U slivu Strume identifikovan je ranije pomenuti haplotip ADcs1 (Cortey i sar.,

2004) ili AD-s1 po Bernatchezu (2001), koji je već pronađen na više lokaliteta u okviru

egejskog sliva u Grčkoj (Apostolidis i sar., 1997), ali i u slivovima Jadranskog, Jonskog i

Sredozemnog mora, kao i Atlantskog okeana (Bernatchez, 2001). Za ADcs1 haplotip

može se reći da je jedan od Ad haplotipa sa najširim rasprostranjenjem, što se može

objasniti njegovom izuzetnom sposobnošću kolonizacije. U istom slivu pronađen je novi

haplotip Ad*Bož koji na pozicijama 26 ima timin kao i haplotipovi ADcs16 i Ad+RC, ali

se od prvog razlikuje po citozinu na poziciji 262, a od drugog po citozinu na poziciji 126 i

Diskusija

77

262. Pošto se u istom slivu nalaze haplotipovi ADcs1 i Ad*Bož, najverovatnije su oni

naseljeni tokom dve nezavisne kolonizacije, pri čemu je haplotip Ad*Bož verovatno

stariji, pre svega zbog njegove topologije na filogenetskom stablu (Slika 30). Prema

neobjavljenim rezultatima najskorijih ispitivanja kraćih sekvenci (390 bp) kontrolnog

regiona mtDNA uzoraka iz Rilske reke (sliv Strume) i Arde (sliv Marice), utvrđeno je

prisustvo haplotipa koji do 390 bp odgovara haplotipu Ad*Bož. Ako ostatak sekvence

bude identičan kao kod haplotipa Ad*Bož, ovaj haplotip biće karakterističan za egejski

sliv. Međutim, ista sekvenca kao za Rilsku reku i Ardu pronađena je analizom uzoraka iz

Krke (jadranski sliv), koja je verovatno različit haplotip od Ad*Bož, što će se,

predpostavljamo, utvrditi budućim sekvencioniranjem još nedostajućih 170 bp do poli T

bloka. Podudarnost između sekvenci egejskog i jadranskog sliva verovatno je posledica

paralelizma (paralelne slučajne mutacije) na poziciji 26 (Tabela 10) po kojoj se ovaj

haplotip i razlikuje od najrasprostranjenijeg haplotipa jadranske linije ADcs1 (usmeno

saopštenje Aleš Snoj).

Ad*Bož haplotip zauzima ancestralni položaj u odnosu na sve ostale haplotipove

“južnih” – mediteranskih linija (Ad, Ad+ (farioides), Me, i Ma) (Slika 30). Haplotip

Ad*Bož se razlikuje od haplotipova Me linije po četiri mutacije, od farioides i Ma

haplotipova po tri, i od svih Ad haplotipova po dve mutacije, izuzev od ADcs1 od koga se

razlikuje po samo jednoj mutaciji (Slika 31). Ancestralni položaj haplotipa Ad*Bož treba

dokazati i rezultatima drugih DNA analza, ali i analizom drugih tipova kararaktera

(morfološki), zbog nedetektabilno niskih “bootstraping” verovatnoća za NJ i MP analize,

i zbog toga što postoje tri druga haplotipa (ADcs11, AD*Pe and Ad*Ti) koja su barem

podjednako udaljena od Ma, Me i drugih Ad haplotipova po broju mutacija (Slika 31).

Vrlo je teško dodeliti taksonomski status nekom od pronađenih egejskih

haplotipova. Karaman (1924) je opisao samo jednu vrstu, Salmo macedonicus, u reci

Treski (sliv Vardara), čije ime je kasnije primenjeno i na potočnu pastrmku iz reke

Strume. Posebnu poteškoću pri rešavanju taksonomskih problema predstavlja postojanje

dva haplotipa u slivu Strume (ADcs1 i Ad*Bož) koji se fenotipski razlikuju, što pravi

dodatnu nomenklaturnu komplikaciju.

U slivu Strume na lokalitetu Brankovačka reka (br. 28) pronađen je haplotip At

linije (At1), isti kao i na lokalitetu Gradac u crnomorskom slivu. Haplotipovi At linije

nisu autohtoni za egejski sliv i njihovo prisustvo u Brankovačkoj reci najverovatnije je

posledica poribljavanja Dragovištice u delu toka kroz Bugarsku, mada se ne isključuju i

Diskusija

78

poribljavanja u Srbiji o kojima nema ni pismenih ni usmenih dokaza, zbog loše

organizovanog administrativno-ribarstvenog upravljanja.

Rezultati istraživanja populacija potočne pastrmke na obrađenim lokalitetima

egejskog i jadranskog sliva u potpunosti su u skladu sa dosadašnjim saznanjima da

mediteransko – jadranska oblast predstavlja poseban region Evrope u kome Salmo trutta

kompleks ispoljava najviši fenotipski diverzitet (Behnke 1968), što je praćeno takođe

visokom genetičkom raznovrsnošću, koja je utvrđena studijama na jedarnoj i

mitohondrijalnoj DNA (Laikre i sar., 1999). Najveći broj ranijih taksonomskih

klasifikacija bio je zasnovan na fenotipskoj varijabilnosti, što je rezultiralo kompleksnom

biogeografskom strukturom posebno populacija Balkanskog poluostrva, a što nije

potvrđeno rezultatima dobijenim upotrebom savremenih molekularnih tehnika

(Karakousis i Triantaphyllidis 1990, Apostolidis i sar., 1997).

Generalno, može se reći da je očekivano velika varijabilnost linija potočne pastrmke

Bernatchez (1992) između slivova na teritoriji Srbije (Tabela 12) praćena veoma značajnom

međupopulacionom varijabilnošću unutar slivova, što je najverovatnije posledica skorašnje

izolacije i lokalne diferencijacije unutar svake od linija.

Evropske populacije potočne pastrmke pokazuju biogeografska razgraničenja koja

su poslužila pri definisanju rečnih basena i slivova kao diskretnih jedinica (Apostolidis i

sar., 1997; Bernatchez i sar., 1992; Giuffra i sar., 1994). Pripadnost haplotipova

pojedinim linijama (što je uglavnom praćeno i pripadnošću određenim rečnim basenima),

može se uvideti preko filogenetskih stabala (Slika 29 i 30) urađenih različitim metodama

(NJ, MP, Majority role consensus 50%), analizom haplotipova iz svih mtDNA linija

(Bernatchez i sar., 1992). Rezultati koji se mogu izdvojiti kao posebno značajni su:

• diferenciranost haplotipova u linije

• razdvajanje Da i At klade od klade ostalih «južnih» linija (Ad, Ad+ Ma i Me)

• ancestralni položaj haplotipova Da*Dž i Da*Vr u Da kladi

• formiranje posebne “farioides” (Ad+) grupe (linije), koja ima potpuno istu značajnost

kao i grupe ostalih južno evropskih linija

Diskusija

79

U oba slučaja (Slika 29 i 30), dobijeni rezultati su posledica već pomenutih

sinapomorfizama (Tabela 13). Međutim, striktna interpretacija filogenetskih stabala je da

Da-At klada zauzima sestrinski položaj u odnosu na ostale «južno» evropske linije.

Upotrebom pomenutih metoda do sada nije dobijena ovakva topologija stabla, ali može se

reći da se ona slaže sa predloženim evolutivnim modelom Salmo trutta – kompleksa, po

kome su najstarija filogeografska razdvajanja povezana sa alopatričkom fragmentacijom

u gornjem i srednjem pleistocenu između tri glavna evropska basena: atlantskog (At

linija), ponto – kaspijskog (Da linija) i mediteranskog (Ad, Ma i Me linija). Kasnija

divergencija ili subsegmentacija u mediteranskom basenu dovela je do nastanka Ad, Ma i

Me linija (Bernatchez i sar., 1992; Patarnello i sar., 1994; Snoj i sar., 2002), a rezultati

ove studije promovišu još jednu liniju (farioides ili Ad+) unutar ovog basena.

Pripadnost haplotipova određenim linjama kao i broj polimorfizama između njih

može se utvrditi i preko kladograma (mreže) (Slika 31), s tim što utvrđivanje broja

mutacija između haplotipova koji pripadaju različitim linijama preko broja algoritamskih

mutacionih koraka nije potpuno precizno. Rezultati dobijeni na osnovu kladograma

uglavnom se podudaraju sa rezultatima filogenetskih analiza (Slika 29 i 30). Jedina

značajnija razlika je što su Da haplotipovi na mreži zauzeli ancestralni položaj u odnosu

na sve ostale haplotipove, dok na filogenetskim stablima (Slika 29 i 30) nije moguće

utvrditi koja je linija u okviru Salmo trutta kompleksa ancestralna. Da i At haplotipovi

čine sestrinsku kladu u odnosu na kladu «južnih» haplotipova, s tim što je u okviru Da i

At klade, At linija započela nešto kasniju diferencijaciju na haplotipove. U «južnoj» kladi

sve linije (Ad, Ad+, Me i Ma) pokazuju sličnu starost (vreme diferencijacije), koje je pri

dobijenoj rezoluciji stabla nešto između vremena diferencijacije Da i At haplotipova, što

se podudara i sa tvrdnjom Bernatcheza (2001). Izrazita ancestralnost haplotipa Aa*Bož u

okviru «južne» klade, kao što je već rečeno, tek mora biti ispitana.

Cortey i sar. (2004) sekvencioniranjem celog kontrolnog regiona mtDNA i

upotrebom istih filogenetskih analiza dobija takvu rezoluciju stabla pri kojoj Da linija

zauzima izrazito bazalni položaj u odnosu na ostale linije, kao što je to slučaj i na našem

kladogramu (Slika 31). Smatramo da bi i naša filogenetska stabla potvrdila ancestralniji

položaj Da linije sekvencioniranjem celog kontrolnog regiona mtDNA analiziranih uzoraka.

Na osnovu rezultata sekvencioniranja, osim detekcije haplotipova, utvrđena je i

varijabilnost unutar 5' kraja nekodirajućeg kontrolnog regiona mtDNA. Unutar fragmenta

kontrolnog regiona dužine 561 bp pronađeno je 18 polimorfnih mesta, što je u proseku

jedno polimorfno mesto na svakih 31,2 nukleotida. Utvrđena varijabilnost unutar

Diskusija

80

kontrolnog regiona mtDNA analiziranih uzoraka nešto je manja u odnosu na rezultate

Bernatchez i sar. (1992), koji su analizom fragmenta dužine 310 bp pronašli 13

polimorfnih mesta, što je u proseku jedno polimorfno mesto na 23,8 nukleotida. Razlog

za manju varijabilnost uzoraka koji su analizirani je neravnomeran raspored polimorfnih

mesta. Najveći broj polimorfnih mesta se upravo nalazi u prvoj trećini 5' kraja kontrolnog

regiona, dok se dalje prema sredini njihov broj smanjuje.

Salmonide odlikuje približno jednaka varijabilnost kodogenih i nekodogenih

regiona molekula mtDNA (Giuffra i sar., 1994), što je razlika u odnosu na ostale

kičmenjake, kod kojih je varijabilnost kontrolnog regiona 5 do 15 puta veća od

varijabilnosti u kodirajućim regionima (Aquadro i Greenberg, 1983).

U kontrolnom regionu mtDNA najčešće se javljaju tačkaste mutacije, koje

nastaju kao rezultat supstitucija, delecija ili insercija. Do pojave tačkastih mutacija

najčešće dolazi usled pogrešnog sparivanja nukleotida prilikom replikacije, ili kao

rezultat spontanih mutacija koje nisu vezane sa replikacijom, i koje nastaju najčešće

zbog nukleotidne depurinizacije i/ili deaminacije (Alberts i sar., 1994). Pogrešno

spareni nukleotidi mogu biti uklonjeni pomoću posebnog mehanizma koji vrši

popravku na DNA, na taj način što prepoznaje i izrezuje pogrešno sparene nukleotide

prilikom polimerizacije i ligacije novog lanca (Lewin, 2000). Mehanizmi za

uklanjanje grešaka su efikasni ali nisu stoprocentno sigurni, tako da se neke mutacije

mogu fiksirati i dalje prenositi na potomstvo, što dovodi do genetskih promena

narednih generacija (Snoj, 1997).

U kontrolnom regionu mtDNA kao najčešće greške pri sparivanju nukleotida

javljaju se supstitucije, dok su delecije i insercije znatno ređe. Među supstitucijama,

tranzicije su mnogo češće u odnosu na transverzije, a među tranzicijama dominiraju

supstitucije C→T (Li i Grauer, 1991), što su i rezultati ovog rada pokazali (Tabela 10).

Transverzije G↔C su vrlo retke među supstitucijama, i zbog toga imaju veoma

veliki značaj pri utvrđivanju srodnosti između različitih sekvenci. Zbog težine

nastanka takve supstitucije, najverovatnije da je većina takvih zamena posledica

višestrukih supstitucija na istom mestu (npr.: G→A→C). Takav tip supstitucija javlja

se i u rezultatima ovoga rada na tri polimorfna mesta (26, 262, 543). Prema dobijenim

rezultatima, odnos tranzicija i transverzija je 14:7, a broj transverzija je nešto povećan

zbog polimorfne pozicije (26) na kojoj se javljaju dve transverzije (Tabela 10).

Bernatchez i sar. (1992) dobili su odnos tranzicija i transverzija (17:6) na 12

Diskusija

81

haplotipova potočne pastrmke, dok je odnos tranzicija i transverzija na lipljanu

identičan sa rezultatima ovoga rada - 14:7 (Sušnik, 2001). Za razliku od Salmonida,

kod većine drugih kičmenjaka na intraspecijskom nivou preovlađuju tranzicije nad

transverzijama (10 do 32 puta), kako u kodirajućim tako i u nekodirajućim regionima

mtDNA (Moritz i sar., 1987).

Snoj (1997) smatra, da što je stepen divergencije između dve nukleotidne

sekvence manji, mogućnost da na određenom mestu dođe do više od jedne supstitucije

gotovo je zanemarljiva i broj uočenih supstitucija između takve dve sekvence trebalo bi

da koincidira sa stvarnim brojem supstitucija. U suprotnom slučaju, kada postoji velika

razlika između sekvenci, uočeni broj razlika je manji od stvarnog, što je posledica

višestrukih supstitucija na istom mestu.

4.2. PALEOZOOGEOGRAFSKA RAZMATRANJA, SA OSVRTOM NA KOLONIZACIJU EVROPE POTOČNOM PASTRMKOM

Da bi se dobio uvid u današnje rasprostranjenje i poreklo slatkovodnih riba

Evrope, samim tim i potočne pastrmke, neophodno je izvršiti rekonstrukciju

paleogeografskih događaja koji su imali veoma značajan uticaj na hidrografiju Evrope i

Mediterana tokom srednjeg i donjeg miocena, pliocena i pleistocena.

Tokom jure i krede Tetis je bio otvoreno ekvatorijalno more koje je razdvajalo

Evroaziju i Afriku, i spajalo prvobitni Atlantik sa Indopacifičkim okeanom. Pomeranjem

Evroazijske i Afričke ploče morski put između pomenutih okeana i Tetisa bio je

redukovan ili prekinut, a kao rezultat toga, tokom gornjeg i srednjeg miocena, formirala

su se dva glavna unutrašnja basena: Mediteran i Paratetis (Hsü i sar., 1977).

Za vreme srednjeg miocena (pre 15 miliona godina) dolazi do orogeneze Alpskog,

Dinarskog, Balkanskog i Pindskog planinskog masiva, što dovodi do formiranja izrazite

barijere između Mediterana i Paratetisa. Kao rezultat formiranja ovakve barijere, dolazi

do preusmeravanja velikog broja bivših centralno evropskih rečnih slivova u Paratetis,

koji takođe prima slatku vodu sa šireg područja centralnog Palearktika. Višak vode koji se

javljao u Paratetisu rezultirao je pozitivnim vodnim bilansom što je dovelo do prelivanja

vode u susedna mora Mediterana preko transalpijske, panonske i transegejske veze (Slika

Diskusija

82

33). Analizom sedimenata dna na području današnjeg Crnog mora, a predačkog

Paratetisa, navodi se da je u periodu 15 – 5 miliona godina Paratetis bio oligosalino

(bočatno) ili čak slatkovodno «more». U istom periodu Mediteran je posedovao slanu

vodu i funkcionisao je kao otvoreno more, usled postojanja široke veze sa Atlantskim

okeanom (Hsü, 1978). Pored formiranja prirodnih barijera u vidu pomenutih planinskih

masiva ipak je između Paratetisa i Mediterana postojala komunikacija do kraja miocena.

Slika 33. Rekonstrukcija geografije Mediterana i Paratetisa tokom srednjeg miocena.

Moguće morske veze: A i B - veze Mediterana i Atlantika; C – Transalpijska brazda; D –

Jadransko - Panonska veza; E – Transegejska veza; F – Paratetis Baltička veza; G -

Paratetis Arktička veza (Hsü, 1978; modifikovano).

Najveći broj fosilnih ostataka riba iz srednjeg miocena pronađenih u Evropi

predpostavlja se da potiče iz Sibira i istočne Azije (Banarescu, 1960; 1977). Smatra se da

je kolonizacija Evrope izvršena preko mreže rečnih veza između basena Lene, Jeniseja i

Oba sa Paratetisom, odakle je preko Tauranskih vrata omogućena kolonizacija istočne

Evrope, a opadanje saliniteta u Paratetisu praćeno je daljom kolonizacijom ka zapadnoj

Evropi i Engleskoj (Bianco, 1990).

Diskusija

83

Krajem miocena (6,1 do 5,1 miliona godina), u tzv. mesinskom periodu, desila su

se dva veoma važna geološka događaja:

1. Značajno povećanje zapadno Antarktičke ledene mase, koje je praćeno

opadanjem nivoa svetskog mora.

2. Približavanje afričke i evropske ploče, u kombinaciji sa opadanjem nivoa mora,

rezultira izolacijom Mediterana od Atlantika.

Kao posledica navedenih događaja, Mediteran postaje evaporativni basen

(McKenzie i Oberhansli, 1985; Cita i McKenzie, 1986), koji zbog izdizanja planinskih

lanaca Alpskog, Dinarskog, Balkanskog i Pindskog masiva gubi vezu i sa Paratetisom

(Slika 34). Od momenta izolacije Mediterana od Paratetisa svaki od basena prolazi kroz

različitu istoriju koja je uglavnom izazvana različitim hidrološkim statusom. Isušivanje

Mediterana poznato je kao «mesinska kriza saliniteta», koja je trajala oko milion godina

(Slika 35).

Slika 34. Događaji koji su doveli do krize saliniteta: razdvajanje Mediterana od Atlantika

i od Paratetisa (Hsü, 1978; modifikovano).

Za vreme mesinskog perioda Paratetis je bio bočatna ili slatkovodna sredina, čiji

se nivo vode povećavao posebno u vlažnim periodima, što je uzrokovalo povremeno

povezivanje evropskih rečnih sistema, a samim tim i mogućnost za širenje ili pak

izolaciju slatkovodnih riba.

Diskusija

84

Slika 35. Mesinska kriza saliniteta, uzrok isušivanja Mediterana. (Hsü, 1978).

Krajem mesinskog perioda, slatka voda iz Paratetisa prodire u Mediteran koji je

do tada bio suv, pri čemu se basen Paratetisa redukuje na mrežu jezera (panonski,

dakijski, pontski i kaspijski basen), a voda koja je dospela u Mediteran ispunjava

depresije, takođe formirajući mrežu jezera (Hsü i sar., 1977; Rögl i Steininger, 1983).

Ovaj događaj poznat je kao «Lago Mare» faza Mediterana i Paratetisa (Slika 36).

Mediteran je bio ispunjen slatkom vodom oko 100 000 godina, do pred sam početak

pliocena, kada je došlo do otvaranja Gibraltarskog moreuza i ulaska slane vode iz

Atlantika u Mediteran.

Slika 36. Mesinska «Lago Mare» faza Mediterana i Paratetisa (Hsü, 1978; mod.).

Period «Lago Mare» nesumnjivo je odigrao veoma važnu ulogu u ranom prolasku

primarno slatkovodne faune riba iz Paratetisa u Mediteran, kao i u disrtibuciji pomenute

faune u peri-mediteranske rečne sisteme. Potvrdu ovakvom scenariju daju brojni fosilni

ostaci koji potiču iz mesinskog perioda.

Diskusija

85

Morska voda koja iz Atlantika ulazi u Mediteran postepeno počinje da se preliva i

u Paratetis, posebno u njegov zapadni deo (oblast današnjeg Crnog mora, Kaspijskog i

Aralskog jezera), što dovodi do katastrofalnih posledica po specijalizovane zajednice

slatkovodnih riba (Slika 37) (Bianco, 1990).

Slika 37. Ponovno uspostavljanje saliniteta (morskih uslova) u basenima Mediterana i

Paratetisa. Crvene tačke predstavljaju hipotetičke prvobitne reke u kojima je mogla

preživeti primarno slatkovodna fauna riba Paratetisa (Hsü, 1978; modifikovano).

Najstariji fosilni ostaci roda Salmo iz područja Paratetisa pronađeni su u Hrvatskoj

u blizini Samobora (Samoborska Gora). Predpostavlja se da se radi o vrsti Salmo

immigratus (Gorjanović – Kramberger, 1891) koja je zauzimala stratigrafsku poziciju

donjeg Sarmata u okviru centralno-panonskog basena (Anđelković, 1989). Na osnovu

ovog nalaza može se zaključiti da je rod Salmo naseljavao Paratetis još u srednjem

miocenu, pre oko 13 miliona godina, a verovatno i ranije. Banarescu (1973) smatra da su

predstavnici familije Salmonidae kolonizirali evropske prostore iz voda Sibira, što može

biti vrlo verovatno pošto je Paratetis tokom srednjeg i donjeg miocena bio ispunjen

bočatnom ili slatkom vodom i povezan sa istočno-sibirskim rekama (Jenisej, Lena i Ob)

(Bianco, 1990). Kasnije širenje Salmonida iz Paratetisa omogućeno je ka severu preko

veza sa Baltikom i ka zapadu preko veze sa Rajnom.

Fosilni nalaz vrste Salmo immigratus u panonskom basenu Paratetisa iz srednjeg

miocena može imati ključnu ulogu za razrešenje porekla roda Salmo u evropskim

vodama. Najverovatnije da je Salmo immigratus bio predstavnik istočno-azijskih

salmonida koji se naselio u Paratetisu. Kako je postojala miocenska veza Paratetisa i

Baltika, verovatno je deo populacije Salmo immigratus koji je migrirao ka severu bio

Diskusija

86

predački za atlantskog lososa (Salmo salar), dok je populacija koja je ostala u Paratetisu i

njegovim pritokama bila predačka za evropske pastrmke. Nakon davanja predačke osnove

za dve grupe roda Salmo (losos i pastrmka), Salmo immigratus izumire.

Atlantski losos danas naseljava isključivo severna mora i obale istočnog

Atlantika, i uopšte ga nema u današnjim basenima bivšeg Paratetisa (Crno more,

Kaspijsko i Aralsko jezero), što ukazuje na nastanak lososa upravo u morima severne i

zapadne Evrope. Činjenice da je Patatetis u Saramatskom katu bio ispunjen uglavnom

bočatnom vodom koja po svojim osobinama jako nalikuje vodi današnjih severnih

mora, kao i da su ga naseljavale ribe sa jako širokom ekološkom valencom u odnosu

na salinitet (Anđelković, 1989), uz pojavu anadromije («zavičajno ponašanje») koja je

karakteristična za lososa, mogu predstavljati dodatne argumente koji idu u prilog

iznetoj hipotezi da je predak lososa (Salmo immigratus) živeo u Paratetisu odakle je

migrirao ka severnim morima za koja predpostavljamo da su i bila mesto njegovog

nastanka, nakon prekida veze preko basena Rone i/ili Rajne sa basenom Atlantika i

njegovih priobalnih mora.

Najstariji fosilni ostaci potočne pastrmke pronađeni su na Kavkazu, datiraju sa

početka pleistocena i procenjuje se da su stari oko 2 miliona godina (Osinov i

Bernatchez, 1996), s tim što se smatra da je potočna pastrmka kao vrsta znatno starija.

Pošto se radi o fosilnom nalazu iz basena bivšeg Paratetisa, može se predpostaviti da

pastrmka vodi poreklo od Salmo immigratus kao jedine vrste roda Salmo koja je

naseljavala Paratetis u doba srednjeg i donjeg miocena. Derzhavin (1934) i Vladimirov

(1944; 1948) smatraju upravo populacije potočne pastrmke sa područja Kavkaza

najprimitivnijim formama, od kojih su širenjem svoga areala nastale sve ostale

populacije pastrmki koje naseljavaju južna mora. Antunes i sar. (2002) analizom

geneologije gena za transferin dolaze do zaključka da najancestralnije populacije

potočne pastrmke naseljavaju pritoke Crnog mora, Kaspijskog i Aralskog jezera. Cortey

i sar. (2004) navode da korišćenjem filogenetskih metoda NJ i MP, haplotipovi

dunavske linije zauzimaju ancestralni položaj u odnosu na haplotipove ostalih linija. Iz

svega navedenog može se uvideti da postoje argumenti koji idu u prilog napred iznetoj

hipotezi o poreklu evropskih pastrmki od pretka koji je naseljavao Paratetis i njegove

pritoke u doba miocena.

Tokom pliocena (5 - 1.8 miliona godina), Paratetis prolazi kroz fazu redukcije svoje

veličine, prvo raspadom na manje pojedinačne međusobno povezane basene, da bi kasnije

Diskusija

87

došlo do potpunog isčezavanja panonskog i dakijskog basena, čime se uspostavio današnji

sliv Dunava (Hsü, 1978). Po završetku pliocena, od Paratetisa ostaju samo Crno more,

Kaspijsko i Aralsko jezero (Rabrenović i sar., 2003), što vodi ka značajnoj izolaciji

pastrmskih populacija Paratetisa.

U drugoj polovini pliocena (3,1 miliona godina) desile su se značajne

klimatske oscilacije. Globalno pan-okeansko postepeno opadanje temperature

započelo je pre oko 2,4 miliona godina, što je nagoveštavalo veliko zahlađenje tokom

pleistocena (Rage i Roček, 2003).

Početkom pleistocena dolazi do formiranja ledenog pokrivača koji se povremeno

širio (glacijacija) ili povlačio (interglacijacija). U poslednjih 0,9 miliona godina, glacijacije

su se javljale u ciklusima od oko 100 000 godina (Roy i sar., 1996). Analizom genetičkih

podataka životinjskih populacija Evrope i Severne Amerike, došlo se do zaključka da

genetička diferencijacija današnjih populacija predstavlja, između ostalog, odraz uslova za

vreme pleistocenskih glacijacija, kao i kolonizacija koje su pratile povlačenje ledenog

pokrivača (Avise, 1992; Hewitt, 1996; Bernatchez i Wilson, 1998; Taberlet i sar., 1998).

Slatkovodne i anadromne ribe predstavljaju važnu grupu organizama u zoogeografskim

studijama, na osnovu kojih je sugerisano da postoji značajan glacijalni uticaj na

geografsku distribuciju intraspecijskog genetičkog polimorfizma.

Bernatchez (2001) smatra da svih pet mtDNA linija potočne pastrmke (Bernatchez,

1992) imaju monofiletsko poreklo, a da su se razvile nezavisno kao rezultat predačke

alopatričke fragmentacije. Na osnovu širokog opsega divergencije (1 – 2% na milion

godina), pretpostavlja se da je do razdvajanja linija od predačke populacije došlo u periodu

između 0,5 i 2 miliona godina, što ukazuje da je formiranje glavnih filogeografskih grupa

povezano sa klimatskim promenama, kao i promenama staništa, što se podudara sa

pleistocenskim glacijacijama. Poseban akcenat je stavljen na klimatske promene u

poslednjih 700 000 godina (Anderson i Borns, 1994) koje su verovatno imale značajan

uticaj u izolaciji nekoliko velikih rečnih sistema (danas slivova različitih basena: Rona,

Rajna i Dunav) (Villinger, 1986). Najstarije razdvajanje na linije potočne pastrmke

povezano je sa alopatričkom fragmentacijom između tri glavna basena: atlantskog (At –

linija), ponto – kaspijskog (Da – linija) i mediteranskog, s tim da je u mediteranskom

basenu verovatno kasnije došlo do istovremenih fragmentacija koje su dovele do

razdvajanja Me, Ma i Ad linije (Bernatchez, 2001).

Diskusija

88

Razmatranjem pleistocenskih dešavanja i globalne geografske slike distribucije i

genetičkog diverziteta za svaku od linija, moguće je izvesti zaključak o hipotetičkim

centrima porekla za mtDNA linije potočne pastrmke.

Reke u slivu atlantskog basena predstavljaju centar porekla At linije. Međutim,

pošto je severni deo atlantskog basena bio pod jakim uticajem širenja ledene kape tokom

pleistocenskih glacijacija, smatra se da je ancestralni centar porekla At linije bio više južno,

verovatno u obalnim pritokama Iberijskog poluostrva ili čak severne Afrike (Bernatchez,

2001). Utvrđivanje centra porekla Da linije je prilično problematično zbog veoma brojnih

interkonekcija, kao i povećanja i smanjenja nivoa Crnog mora, Kaspijskog i Aralskog

jezera za vreme pleistocenskih glacijacija, koje ipak nisu imale toliko izrazit uticaj na

gubitak staništa kao u slučaju At linije (Arkhipov i sar., 1995). Na osnovu kavkaskih

fosilnih ostataka potočne pastrmke, smatra se da je ancestralna populacija od koje su

nastale sve ostale populacije Da linije naseljavala pritoke Crnog mora (Bernatchez, 2001).

Karakteristična slika geografske distribucije tri preostale linije (Me, Ma i Ad) značajno

potkrepljuje realnost poznatih mediteranskih refugijuma: jugozapadni (iberijsko –

mediteranski), centralni (jadransko – mediteranski) i istočni (balkansko – anadolijski)

(Keith, 1998). Me linija je pretežno pronalažena u slivu reka zapadnog Mediterana, zbog

čega se pretpostavlja da vodi poreklo upravo iz istog regiona. Ma linija je uglavnom

ograničena na sliv reke Po, ali naseljava i reke jadranskog sliva Slovenije i Bosne i

Hercegovine koje su mogle biti povezane za vreme faza maksimalnih interglacijacija

(Bianco, 1990). Alozimske studije takođe su potvrdile severno jadransko poreklo Ma linije

(Giffura i sar., 1996). Ad linija je predominantna u pritokama istočnog Mediterana u

odnosu na Ma i Me liniju, što ukazuje da verovatno vodi porelo iz Balkansko –

Anadolijskog refugijuma (Bernatchez, 2001), dok Ad+ linija najverovatnije vodi poreklo iz

refugijuma jugozapadnog Balkana, gde je i danas rasprostranjena.

Na osnovu alozimskih istraživanja utvrđeno je da je slika geografske distribucije

linija povezana sa postglacijalnim geološkim događajima, pri čemu je predstavljen model

rekolonizacije deglacijalnih područja severo-zapadne Evrope od tri preglacijalne linije (I, II

i III). Za vreme povlačenja leda smatra se da je došlo do rekolonizacije uglavnom u

graničnim područjima i to iz tri smera: 1. severo – zapadna migracija iz mediteransko –

kaspijskog refugijuma (linija III), 2. migracija ka severu iz refugijuma atlantskog sliva

(Iberijsko poluostrvo i južna Francuska - linija II) i 3. severno i istočno širenje iz

refugijuma sa središtem u blizini Engleskog Kanala (Lamanš - linija I). Rekolonizacija

deglacijalnih područja severo-zapadne Evrope iz četvrtog mediteranskog refugijuma,

Diskusija

89

smatra se da nije vršena (linija IV) (García - Marín i sar., 1999), (Slika 38). Linije I, II i III

odlikuju se različitim kombinacijama fiksiranih genotipova na lokusima LDH-C* i CK-A1,

koji su danas prisutni u pastrmskim populacijama deglacijalnih područja, dok linija IV

poseduje alel LDH - A2*100QL, koji odsustvuje kod populacija iz postglacijalno

kolonizovanih regiona. Sadašnje populacije koje naseljavaju deglacijalna područja, smatra

se da predstavljaju mešovite ili čiste potomke navedene tri migratorne grupe.

Slika 38. Distribucija predpostavljenih glavnih linija (I, II, III i IV) i pravci migracija

populacija potočne pastrmke za vreme postglacijalne rekolonizacije za linije I, II i III.

Isprekidana linija predstavlja granicu leda za vreme poslednje glacijacije (pre oko 13 000

godina), (García - Marín i sar., 1999 - modifikovano).

García - Marín i sar. (1999) i Bernatchez (2001) predlažu sličan model

rekolonizacije koji se zasniva na brzom, istovremenom širenju populacija potočne pastrmke

iz glacijalnih refugijuma, kao što je sugerisao i Hewitt (1999) za druge organizme. Do

rekolonizacije bi došlo širenjem «prednjeg ruba» populacija migranata na veće distance

koje bi ustanovile «kolonije» daleko ispred glavnog talasa populacije. Ovi migranti bi se

naglo širili i zauzimali staništa pre ostalih, čime bi njihovi geni postali dominantni u

genofondu novouspostavljene populacije. Ovakav tip rekolonizacije može dovesti do

pojave velikog stepena homozigotnosti, kao i efekta «uskog grla» (eng. bottleneck) koji

može usloviti gubitak genetičkog diverziteta (Nei i sar., 1975). Severno atlantski basen

koji naseljava At linija potočne pastrmke odlikuje se malim genetičkim diverzitetom što

bi se moglo objasniti ovakvom hipotezom o načinu rekolonizacije faune. Prema scenariju,

populacije potočne pastrmke koje su već prisutne u refugijumu datog basena ili

geografskog prostora, bile bi prve koje bi se proširile i zauzele dostupne ekološke niše,

Diskusija

90

ostavljajući malu verovatnoću za osnivanje populacijama koje su preživele glacijacije u

udaljenijim delovima refugijuma. Ovaj proces bi bio još izrazitiji ako bi vreme

geografske izolacije (i/ili selekcije u različitim sredinama) bilo prilično značajno za

akumulaciju genetičkih i ekoloških razlika (Bernatchez, 2001). Naseljavanjem novog

područja populacijama sa «prednjeg ruba», populacije koje se nalaze iza njih vrlo malo

mogu uticati na genetičku strukturu populacije na «pionirskom» području - u pitanju je

jednostavno gustina populacije. Kao rezultat ovog načina rekolonizacije desilo bi se da

populacije koje se nalaze «iza» populacija sa severne granice širenja (u centru ili na jugu

refugijuma) neće biti u mogućnosti da brzo napreduju, što znači da se one moraju

povlačiti na druga staništa ili opstati gde jesu. Pomenuti proces, uz fizičku izolaciju i

biološke faktore, može biti «generator» procesa nastanka specifičnih genoma i podvrsta u

južnim refugijumima (Hewitt, 1993).

Raspored kopna i mora kroz pleistocen postepeno se približava današnjem

rasporedu. Međutim, u starijem pleistocenu ima velikih odstupanja od današnjeg izgleda

obalskih linija. Takođe su velika odstupanja u odnosu na današnje stanje bila za vreme

velikih zahlađenja (glacijacija), uključujući i ona u mlađem pleistocenu (virm), kada je

usled povećanja kontinentalnih i planinskih lednika smanjena količina vode u okeanima i

snižen nivo mora (Rabrenović i sar., 2003).

Razmena primarno slatkovodne faune, a samim tim i pastrmskih populacija,

između reka različitih oblasti, bila je verovatno omogućena opadanjem nivoa mora za

vreme glacijacija (Bianco, 1990). Procene opadanja nivoa mora u Mediteranu su

različite za određene faze glacijacija. Za vreme Virm glacijalne faze smatra se da je

nivo Mediterana bio niži za maksimalno 130 m, dok je za vreme Mindel i Ris

glacijalnih faza nivo mora bio za oko 200 m niži u odnosu na današnji nivo (Bianco,

1990; Pielou, 1979). Postoje mišljenja da opadanje nivoa mora u Mediteranu za oko

200 m pre oko 250 000 godina, za vreme Ris faze glacijacije (Brown i Gibson, 1983)

uslovljava sužavanje Gibraltarskog moreuza na 1/5 današnje širine. Kao posledica

ovih dešavanja dolazi do smanjenog dotoka vode u Mediteran iz Atlantika, što izaziva

sekundarnu krizu saliniteta i pad nivoa vode u Mediteranu za oko 500 m, za šta je bilo

potrebno oko 500 godina. Opadanjem nivoa vode u Mediteranu za 500 m može se

objasniti prisustvo slatkovodnih riba na Rodosu koje su porekom iz Turske, kao i

razmena slatkovodne riblje faune između severo – zapadne Afrike i Španije (Bianco,

1990). Ovom pojavom se može objasniti i izuzetna širina areala Ad i Me linije u

Diskusija

91

Mediteranu, koja se najverovatnije javlja kao posledica uspostavljanja veza između

rečnih slivova različitih oblasti. Takođe treba pomenuti i rasprostranjenje At linije u

Mediteranu koja je pronađena u istočnoj Španiji, na severo – zapadu Afrike i na

Siciliji (usmeno saopštenje Aleš Snoj).

Slika 39. Narandžasta i crvena linija duž jadranske, jonske i egejske obale prikazuju

sniženje mora od 100 m (Virm faza) i 200 m (Ris i Mindel faza), kao i posledice tih

dešavanja u različitim regionima (1 – 7) (Bianco, 1990 – modifikovano).

U regionu 1 (Slika 39), kao posledica povlačenja nivoa mora, dolazi do značajnog

proširenja reke Po, u regionu 2 dolazi do uspostavljanja veza između dalmatinskih reka, u

regionu 3 dolazi do uspostavljanja transjadranske komunikacije (opadanjem nivoa mora

od najmanje 160 m), u regionu 4 dolazi do uspostavljanja veza između albanskih reka

(Drim ↔ Vjose), u regionu 5 dolazi do uspostavljanja veza između reka jonskog sliva

(Taimis ↔ Aheron), u regionu 6 dolazi do uspostavljanja veza između reka sa suprotnih

strana Patras - korintskog zaliva, i u regionu 7 dolazi do uspostavljanja slatkovodne veze

između gornjeg dela Egejskog i Crnog mora.

Osim brojnih rečnih veza koje su se uspostavile opadanjem nivoa mora za vreme

glacijacija i koje su omogućile migriranje pastrmskih populacija, treba pomenuti i brojne

međurečne veze, ledene ustave i slatkovodna jezera koje su uspostavljene u doba

interglacijacija otapanjem ledenog pokrivača u zapadnom Sibiru i istočnoj Evropi. Kao

posledica otapanja lednika dolazi do akumulacije i prelivanja vode iz jednog u drugi

Diskusija

92

basen bivšeg Paratetisa (Aralsko → Kaspijsko jezero → Crno more), koji je preko Crnog

mora komunicirao sa gornjim delom Egejskog mora. Ceo pomenuti sistem, uključujući i

gornji deo Egejskog mora, najverovatnije je posle svake glacijacije – interglacijacije

posedovao slatku ili bočatnu vodu (Slika 39), (Thunell i Williams, 1983). Kao potvrdu

veze između ponto – kaspijskog i mediteranskog basena, imamo nalaz Da haplotipova, za

koje se smatra da su autohtonog porekla u egejskom slivu Grčke (Apostolidis i sar.,

1997), i Turske (Bernatchez, 2001). Takođe je postojala komunikacija između ponto –

kaspijskog basena i basena Tigrisa i Eufrata (Persijski zaliv), što potvrđuje pronalazak

dunavskog haplotipa Da25 (Sušnik i sar., 2005). Osim pomenutih veza između ponto –

kaspijskog basena sa mediteranskim i basenom Indijskog okeana (Persijski zaliv),

postojala je, za vreme različitih faza glacijacija, veza ponto – kaspijskog i atlantskog

basena (Bernatchez, 2001). Veze Kaspijsko jezero – Baltik i Kaspijsko jezero – Arktik

(Ekman, 1957), kao i veza između gornjeg Dunava i gornje Rajne (Balon, 1968;

Englbrecht i sar., 2000) potvrđena je i prisustvom At haplotipova u slivu gornjeg Dunava,

za koje se sumnja da su autohtonog porekla (Weiss i sar., 2001), kao i nalaz jedne

populacije potočne pastrmke u pritoci gornje Volge (kaspijski basen), (Osinov i

Bernatchez, 1996). Današnje filogeografske studije (Durand i sar., 1999; Nesbo i sar.,

1999), kao i tradicionalne biogeografske studije (Banarescu, 1990) potvrđuju ponto –

kaspijsko poreklo drugih slatkovodnih riba u atlantskom basenu koje su tu dospele za

vreme pleistocenskih glacijalnih događaja.

Kako su postojale pleistocenske veze između basena Crnog mora, Kaspijskog i

Aralskog jezera sa Atlantikom na jednoj i sa Mediteranom i Indijskim okeanom na drugoj

i trećoj strani, naša predpostavka da su populacije potočne pastrmke iz basena bivšeg

Paratetisa ancestralne za sve ostale populacije koje naseljavaju severna i južna mora

postaje realna. Realnost ove hipoteze ogleda se u postojanju haplotipova Da*Vr i Da*Dž

koji su pronađeni u slivu Južne Morave (Dunav → Crno more), koji zauzimaju

ancestralni položaj u okviru Da klade na filogenetskim stablima (Slika 29 i 30), kao i

haplotipa Da24 koji je pronađen u reci Waldaist u Austriji (dunavski sliv), (Duftner i sar.,

2003). Haplotipovi Da*Vr, Da*Dž i Da24 imaju poslednja četiri polimorfna mesta 530,

542, 543 i 548 do poly «T» regiona sinapomorfna sa haplotipovima iz Ad, Ad+ At, Ma i

Ma linije. Kao posledica pomenutih sinapomorfizama, haplotipovi Da*Vr, Da*Dž

zauzimaju centralni položaj na kladogramu – mreži (Slika 31), (posebno haplotip Da*Vr)

u odnosu na sve haplotipove iz ostalih linija. Haplotip Da*Vr zauzima centralni položaj i

po procentualnim vrednostima divergencije između haplotipova različitih linija (Tabela

Diskusija

93

11). Između haplotipa Da*Vr i najbližih haplotipova «južne» i At linije distance se kreću

od 1,05 do 1,23%, dok je vrednost distanci između Da*Vr i Da haplotipova između 0,88 i

1,23%, izuzev haplotipa Da*Dž koji mu je najbliži i distanca između njih je 0,53%. Na

osnovu iznetih činjenica može se zaključiti da haplotip Da*Vr (kao i njemu najbliži

haplotipovi Da24 i Da*Dž) spadaju u grupu ancestralnih haplotipova ne samo za ostale

Da haplotipove, već i za haplotipove ostalih linija.

Unutar Da linije prikazana je duboka genetička divergencija, koja prema

genetičkoj distanci skoro tri puta pravazilazi genetičku divergenciju između

haplotipova Ad, Me i Ma linija. Duboka divergencija unutar Da linije (Tabela 11), kao

i njena bazalna pozicija na filogenetskom stablu (Cortey i sar., 2004) i na kladogramu

(mreži) haplotipova (Slika 31), sugerišu da Da populacije predstavljaju najstarije

odvojenu liniju iz Salmo trutta kompleksa, a samim tim i ancestralnu za druge

haplotipove (linije) unutar kompleksa.

Haplotipovi koji su pronađeni u slivu Neretve i Skadarskog jezera (Ad+N i

Ad+RC), a koji zajedno sa Ad+Prz formiraju jugo-zapadno balkansku farioides (Ad+)

liniju, verovatno predstavljaju ostatke ancestralnog polimorfizma «južne» klade.

Nakon prihvatanja stanovišta o postojanju pet glavnih evolutivnih linija (Da, At,

Ad, Me i Ma) potočne pastrmke (Bernatchez i sar., 1992), sumnjalo se u mogućnost

postojanja novih linija slične dubine divergencije, jer je smatrano da je distribuciono

područje Salmo trutta kompleksa bar u pogledu pronalaska novih linija adekvatno

istraženo (Bernatchez, 2001). Međutim, ispostavilo se da pojedini regioni nisu dovoljno

istraženi, i da još uvek ne postoje podaci za pojedina područja u okviru prirodnog areala

potočne pastrmke. Najnovija detaljna istraživanja populacija potočne pastrmke na

Iberijskom poluostrvu otkrila su postojanje bitnih polimorfizama unutar At klade (Suárez

i sar., 2001; Weiss i sar., 2000) na osnovu kojih je predloženo opisivanje nove evolutivne

linije «Duero» (Suárez i sar., 2001; Cortey i Garcia-Marin, 2002). Pošto Balkansko

poluostrvo, kao i Iberijsko, predstavlja «vruću tačku» biodiverziteta (Kryštufek i sar.,

2004), veoma bitnu za post-glacijalnu evoluciju faune i kolonizaciju Evrope, a pri tome je

slabo istraženo, pronalazak Salmo farioides (Ad+) linije u rekama jadranskog sliva jugo-

zapadnog Balkana, s obzirom na sve okolnosti područja i nedostatka informacija, postaje

sasvim realan.

Dobijeni rezultati nukleotidnih divergencija na kontrolnom regionu mtDNA od

0,18% do 2,12% (Tabela 11), uglavnom se slažu sa ocenom Gyllestena i Wilsona (1988)

da je intraspecijska nukleotidna divergencija mtDNA kod Salmonida između 0.1% i 2 %.

Diskusija

94

Primena molekularnog sata na kontrolni region mtDNA veoma je problematična zbog

neprecizne kalibracije koja se po različitim autorima kreće od 0,5% do 2% na milion

godina. Smith (1992) procenjuje stopu mutacija za mtDNA od 1% na milion godina za

Salmonide. Ako bi se vrednosti distanci za haplotipove pronađene na teritoriji Srbije

obračunale po mutacionoj stopi Smita od 1% na milion godina, dobile bi se vrednosti

divergencije između 180 000 i 2,12 miliona godina, što korespondira sa geološkim

epohama kraja pliocena i gotovo celog pleistocena. Iz ovoga proizilazi da su

pleistocenske glacijacije odigrale veoma važnu ulogu u oblikovanju genetičkog

diverziteta populacija potočne pastrmke. Međutim, treba pomenuti i procenu Apostolidis i

sar. (1997) koji smatraju da se divergencija glavnih mtDNA linija desila od zajedničkog

pretka u slično geološko vreme i to u doba mesinske periode i ranog pliocena, u periodu

od pre 2,5 – 6 miliona godina. U ovom periodu desila su se dva veoma važna geološka

događaja: 1. dolazi do izolacije Mediterana od Atlantika, kao i od basena Paratetisa (Slika

34), 2. krajem mesinskog perioda Mediteran i Paratetis bivaju redukovani na mrežu

povezanih jezera poznatu pod nazivom «Lago Mare» faza (Slika 36), (Bianco, 1990).

Pomenuti autori smatraju da je «Lago Mare» faza verovatno odigrala veoma važnu ulogu

u izolaciji pastrmki Mediterana, kao inicijalnih panmiktičnih populacija koje su bile

razdvojene u posebnim jezerima, iz kojih su se kasnije širile u peri-mediteranske rečne

sisteme (Slika 37). Međutim, postoje mišljenja koja odbacuju hipotezu Apostolidis i sar.

(1997) iz sledećeg razloga: pošto je u periodu krajem miocena i tokom prvog dela

pliocena klima postala toplija i humidnija, u Mediteranu su vladali tropsko - subtropski

uslovi (Rage, 1997), koji su verovatno sprečavali mediteransku ekspanziju salmonidnih

riba sve do pojave zahlađenja krajem pliocena i u pleistocenu (pre oko 2,5 miliona

godina) koje je zahvatilo i ovaj region (Cortey i sar., 2004), što i rezultati ovog rada u

potpunosti podržavaju.

Tokom pleistocena javljaju se orogeni pokreti na severnom obodu Mediterana

(Tirensko, Jonsko, Jadransko, Egejsko more, Makedonija, Trakija, Anadolija), što dovodi

do rasedanja u oblasti Makedonije, Skadarskog basena i na južnom obodu panonskog

basena (Stevanović, 1982). Pleistocenski orogeni pokreti, uz uticaj glacijalnih i

interglacijalnih kolebanja nivoa mora, koja su praćena uspostavljanjem rečnih veza, imaju

veoma značajan uticaj na rasprostranjenje i diverzitet pastrmskih populacija na području

Balkanskog poluostrva. Jasno geografsko i filogenetsko razdvajanje Da haplotipova koji

su pronađeni isključivo u crnomorskom slivu, od Ad i Ad+ haplotipova koji su kao

Diskusija

95

autohtoni pronađeni u egejskom i jadranskom slivu (u zavisnosti od haplotipa) na teritoriji

Srbije, uz analizu molekularnog sata i geološke istorije šireg područja Balkana,

objašnjava razvoj pomenutih linija najverovatnije alopatričkom fragmentacijom za vreme

Pleistocena. Veliki diverzitet pronađenih haplotipova u okviru linija na analiziranom

području, korenspondira sa fizičkom izolacijom kao i biološkim faktorima koji su

doprineli njihovom ograničenom rasprostranjenju.

4.3. KONZERVACIJA GENETIČKE RAZNOVRSNOSTI POPULACIJA POTOČNE PASTRMKE

4.3.1. SPECIFIČNOSTI KONZERVACIJE POTOČNE PASTRMKE

Potočna pastrmaka, zbog veoma važnog socio-ekonomskog značaja, koji se

ogleda ne samo u ekološkoj vrednosti vrste već i u značaju za sportski i komercijalni

ribolov, predstavlja veoma ugroženu vrstu sa gledišta gubitka intraspecijske genetičke

varijabilnosti, najčešće kao posledice čovekovih aktivnosti (degradacija staništa,

prekomeran izlov, poribljavanje), (Laikre i Ryman 1996).

Specifičnost konzervacije potočne pastrmke ogleda se u sledećem:

Opsežnim genetičkim istraživanjima u poslednjih 20 godina na taksonu

koji je poznat kao «potočna pastrmka» otkriven je veoma značajan nivo

genetičke raznovrsnosti, koji se ogleda u postojanju više evolutivnih linija

(Bernatchez, 1992), kao i daljoj genetičkoj diferencijaciji između lokalnih

populacija unutar svake od linija. Veoma značajan deo genetičke

varijabilnosti predstavljen je na među-populacionom nivou, i to je glavni

razlog što se konzervacione mere, ribarstveno i konzervaciono upravljanje

ovom vrstom, moraju fokusirati na lokalne populacije (Frankel, 1970;

1974; Ryman i Ståhl, 1980; Utter, 1981; Meffe, 1986; Ryman, 1991).

Degradacija staništa dovodi do istrebljenja ili redukcije brojnosti lokalnih

populacija, a samim tim i do gubitka značajnog intraspecijskog diverziteta.

Najveći broj preostalih, pre svega ribolovno atraktivnih, populacija

potočne pastrmke veoma su ugrožene zbog svoga ekonomskog značaja,

pre svega zbog aktivnosti kao što su: prekomeran izlov i poribljavanje.

Diskusija

96

Ove aktivnosti se smatraju bezopasnim ili čak korisnim, ali su najčešće

katastrofalne po genofond autohtonih populacija (Laikre i sar., 1999).

Osnovni faktori ugroženosti populacija potočne pastrmke koji dovode do gubitka

genetičke varijabilnosti obrazloženi su u poglavlju Uvod (1.2.6.), a mogu se videti i iz

tabele 14.

Tabela 14. Prikaz tri glavne kategorije aktivnosti koje ugrožavaju intraspecijsku

varijabilnost potočne pastrmke, kao i njihov odnos sa tri glavna procesa koja dovode do

gubitka genetičkog diverziteta (Laikre i sar., 1999). Aktivnost Izumiranje Hibridizacija Gubitak

varijabilnosti unutar

populacija Ribolov X X Poribljavanje X X X Degradacija staništa

X (X) X

Aktivnosti koje utiču na degradaciju staništa kao i na prekomeran izlov,

nesumljivo prouzrokuju i treći vid aktivnosti, a to je poribljavanje. Poribljavanje se

uglavnom smatra glavnom ribarstvenom merom za povećavanje brojnosti pastrmskih

populacija. Odgovarajuće izvedeno poribljavanje može biti razmatrano kao značajna

mera pružanja «prve pomoći» populacijama koje su u neposrednoj opasnosti od

izumiranja prouzrokovanog demografskim faktorima. Samo dva tipa poribljavanja mogu

omogućiti dugoročna pozitivna rešenja:

Poribljavanje iz konzervacionih razloga

Poribljavanje radi ponovnog uspostavljanja populacije (reintrodukcija),

s tim sto se mora imati u vidu da pomenuta poribljavanja mogu biti pozitivna samo uz

utvrđivanje i otklanjanje faktora koji su doveli do redukovanja ili izumiranja

populacije. U ostalim slučajevima (najčešće radi poboljšanja ribolova), poribljavanje

predstavlja glavnu pretnju genetičkom integritetu populacije (Hindar i sar., 1991a).

Riblja mlađ koja se koristi za poribljavanje najčešće je genetički različita od

autohtonih populacija, i predstavlja uglavnom domestifikovane - ribnjačke populacije.

Rezultati do kojih su došli Apostolidis i sar. (1996a, 1997) pokazuju da je

poribljavanje reke Nestos (egejski sliv) neautohtonim materijalom iz reke Aheloos

(Jonski sliv), radi poboljšanja sportskog ribolova, imalo veoma mali doprinos u

poboljšanju ribolova. Preko mtDNA markera procenjeno je da je oko 75% autohtone

populacije bilo zamenjeno poribljenom pastrmkom.

Diskusija

97

4.3.2. STATUS UGROŽENOSTI POTOČNE PASTRMKE U EVROPI

Značajan problem koji se javlja pri konzervaciji potočne pastrmke vezan je upravo za

taksonomsku konfuziju unutar pomenutog taksona (pogledati Uvod 1. 2. 4). Glavni razlog

pojave taksonomskih problema su nedoumice oko klasifikovanja različitih morfoloških i/ili

genetičkih grupa, koje se prema nekim autorima smatraju vrstama, a prema drugim podvrstama

ili specifičnim genetičkim formama unutar vrste (Laikre i sar., 1999). Međutim, taksonomska

konfuzija ne sme imati presudan uticaj na određivanje konzervacionih mera i samog

gazdovanja ovim taksonom. Efikasna konzervacija potočne pastrmke može se realizovati samo

na jedan način, a to je posvećivanje pažnje genetičkim razlikama između populacija, bez obzira

da li ove populacije nazivamo vrste, podvrste ili lokalne populacije.

Eksperti «TROUTCONCERN» mreže složni su u stavu da se trenutna ugroženost

potočne pastrmke ne shvata dovoljno ozbiljno, kao i da je sadašnji konzervacioni napor

fokusiran samo na nivo vrste, ne uzimajući pri tome u obzir genetički diverzitet unutar vrste. U

slučaju da se ovakav trend nastavi, veoma brzo će doći do gubitka dragocenih bioloških resursa

u vidu lokalnih populacija potočne pastrmke, koje će izumirati neslućenom brzinom (Laikre i

sar., 1999).

Pored toga što trenutni klasifikacioni sistem ne uzima u obzir intraspecijsku genetičku

strukturu, veoma veliki nedostak koji onemogućava konzervaciju ne samo potočne pastrmke

već i ostalih vrsta riba, jeste što je generalno konzervacioni status do sada ustanovljen za

relativno mali broj taksona riba. Upavo pomenuta dva nedostatka predstavljaju glavnu manu

raznih lista ugroženih životinjskih vrsta (Ryman i sar., 1995a; Leidy i Moyle, 1998). Potočna

pastrmka nije uvrštena na listu Bernske konvencije, kao ni na Crvenu Listu (IUCN) ugroženih

životinjskih vrsta na internacionalnom nivou. Na Crvenoj Listi status ugroženih taksona dobili

su: Salmo carpio, Salmo letnica, i Salmo platycephalus, dok su dva druga taksona Salmo

marmoratus i Salmo dentex uvrštena u kategoriju vrsta sa nedovoljno podataka. Taksoni Salmo

marmoratus i Salmo macrostigma uključeni su na listu «EU Habitat Directive» kao vrste od

opšteg interesa koje zahtevaju primenu posebnih konzervacionih mera. Eksperti

«TROUTCONCERN» mreže saglasni su da sadašnja Crvena Lista u najvećem broju slučajeva

neadekvatno procenjuje ugroženost potočne pastrmke, iz razloga što se glavni ugrožavajući

faktori ne uzimaju sa dovoljnom ozbiljnošću.

Allendorf (1988) smatra da Crvena Lista ugroženih riba u velikoj meri reflektuje

geografsku distribuciju ihtiologa, a ne ugroženih vrsta.

Diskusija

98

4.3.3. DEFINISANJE KONZERVACIONIH JEDINICA

Pri svakoj konzervacionoj aktivnosti postavlja se osnovno i krucijalno pitanje: Šta

treba da bude predmet biološke konzervacije? Iz prethodno iznešenih stavova jasno je da

konzervacija vrste predstavlja zastareli princip, i da svakako nije dovoljna jer ne uzima u

obzir genetičku varijabilnost između i unutar populacija, koja takođe mora biti sačuvana

(Frankel i Soulé 1981). U poslednjih 20 godina vođene su debate na temu utvrđivanja

odgovarajuće jedinice za konzervaciju. Najveći broj autora složio se da konzervacioni

napor treba usmeriti ka nivou evolutivnih linija unutar vrste (Ryder, 1986; Waples,

1991a; 1995; Moritz, 1994; 1995; 1999). Evolutivne linije unutar vrste nazvane su

«Evolutionary Significant Units» ili ESU. Ovaj princip je prvo bio primenjen na

pacifičkom lososu (Waples, 1991a), ali je sugerisano da je primenjiv za bilo koju vrstu

(Ryder, 1986).

Waples (1991a) definiše «Evolutionary Significant Units» kao populaciju ili

grupu populacija koje su suštinski reproduktivno izolovane od drugih konspecijskih

populacionih jedinica, i koje predstavljaju važnu komponentu evolutivnog nasleđa vrste.

Evolutivno nasleđe vrste čini genetička varijabilnost kao produkt prošlih evolucionih

događaja, koja predstavlja osnovu od koje će zavisiti buduća evolucija vrste.

U pogledu nivoa minimalne značajnosti koja bi bila neophodna za dodeljivanje

ESU ne postoji određeni standard (Nielsen, 1995), tako da odluka šta može biti smatrano

kao biološki – evolutivno značajno mora biti rešavana od slučaja do slučaja (Waples,

1995). Metode za utvrđivanje ESU uključuju sakupljanje genetičkih i ekoloških podataka,

kao i njihovu analizu fenetičkim i kladističkim tehnikama radi utvrđivanja hijerarhijskih

genetičko – ekoloških odnosa između populacija (Waples, 1991a; 1995; Nielsen, 1995).

Kada se odnosi između populacija utvrde, neophodno je doneti odluku o nivou na koji će

biti fokusiran konzervacioni napor (Dodson i sar., 1998), a to je onaj nivo koji nosi

značajnu komponentu evolutivnog nasleđa vrste.

Rešavanje pitanja konzervacije od slučaja do slučaja, uvođenjem koncepta ESU,

predstavlja pokušaj da konzervacija ignoriše filogenetski (pragmatični) koncept vrste

(Cracraft, 1987), kako bi preskočila taksonomske diskusije.

Trenutno u Evropi nije zauzet jasan stav oko definisanja ESU za potočnu

pastrmku.

Diskusija

99

U velikom broju realnih situacija odluka o konzervacionom naporu neće biti

zasnovana isključivo na biološkim aspektima, iako su oni primarnog značaja, jer

izražavaju ugroženost ESU kao osnovne - najniže jedinice biološke raznovrsnosti.

Ekonomski, socijalni i pravni aspekti su veoma značajni faktori u ovom procesu. U

slučaju postojanja izrazitih socio-ekonomskih implikacija, biološki aspekt sam po sebi

nije dovoljan za definisanje ESU. Koncept «Operational Conservation Units» (OCUs)

uveden je da opiše jedinicu konzervacije koja bi bila rezultat interakcije između bioloških

i socio-ekonomskih faktora (Dodson i sar., 1998). Biološki zahtevi su u velikoj meri

ustanovljeni unutar ESU. Prema tome, OCU predstavlja konstitutivni činilac ESU i

njegovu interakciju sa socio-ekonomskim pitanjima.

Privremena operativna konzervaciona jedinica može biti definisana u slučaju kada

je neophodno brzo izvršiti konzervacione aktivnosti, a još uvek ne postoji dovoljno

bioloških podataka za opisivanje preciznih evolutivnih odnosa između populacija.

4.3.4. KRAJNJA PREPORUKA U KONZERVACIJI POTOČNE PASTRMKE

Potočna pastrmka predstavlja ekološki, ekonomski, estetski i naučno izuzetno

vrednu riblju vrstu čiji nezadovoljavajući konzervacioni status u evropskim zemljama

poziva na posvećivanje dodatne pažnje i preduzimanje konkretnih mera zaštite. Jedan

od glavnih razloga neadekvatne zaštite i konzervacije ove vrste u Evropi je generalna

neobaveštenost o aspektu biološkog diverziteta koji predstavlja genetička

varijabilnost unutar vrste. Zaštita isključivo vrste nije dovoljna, već se mora obratiti

pažnja na postojanje razlika na genetičkom nivou unutar i između lokalnih populacija,

koje takođe moraju biti konzervirane. Opšti cilj konzervacije biološkog diverziteta na

svim nivoima, od gena do ekosistema, ustanovljen je internacionalno i primenjuje se u

svim državama (među kojima je i SCG) koje imaju ratifikovanu Konvenciju o

Biološkom Diverzitetu (Rio de Janeiro 1992). Međutim, pomenute obaveze zaštite na

genetičkom nivou u najvećem broju zemalja još nisu transformisane u adekvatne

akcije. Prepoznavanje važnosti konzervacije genetičkog diverziteta je posebno važno

za vrste kao što je potočna pastrmka, koje se karakterišu velikom genetičkom

diferenciranošću lokalnih populacija. Gubitak lokalnih populacija potočne pastrmke

može rezultirati u iskorenjivanju relativno velikog dela genetičke varijabilnosti unutar

vrste (Laikre i sar., 1999).

Diskusija

100

4.3.5. KONZERVACIJA DIVERZITETA HAPLOTIPOVA U SRBIJI I ZNAČAJ ZA RIBARSTVO

Problem konzervacije fonda potočne pastrmke veoma je slojevit i stoga veoma

složen, što se može zaključiti iz prethodno iznetih činjenica.

Tabela 15. Primeri glavnih aktuelnih pretnji po populacije potočne pastrmke u nekim

zemljama Evrope (Laikre i sar., 1999).

Država Degradacija staništa Ribolov Poribljavanje

Brane Regulacija

reka Zagađenje

Širenje

bolesti

i

parazita

Prekomeran

ribolov Lovokrađa

Puštanje

domestifikovanih

i/ili ne

autohtonih

populacija

Danska X X X X

Estonija X X X X X

Finska X X X

Francuska X X X

Nemačka X X

Grčka X X X X X X

Republika

Irska X X X X X

Norveška X X X X

Portugal X X X X X

Rusija X X X

Španija X X X X

Švedska X X X

Švajcarska X X X X

Velika

Britanija X X X X X

U različitim zemljama Evrope, na osnovu molekularno-genetičkih studija,

ukazano je na postojanje različitog broja glavnih evolutivnih linija (Bernatchez, 1992),

kao i preostalih autohtonih populacija, što sugeriše da su pojedini prostori mogli sačuvati

veći deo preostalog genetičkog diverziteta vrste. U zemljama Evope konzervacija

genetičkog diverziteta potočne pastrmke veoma varira, pre svega iz razloga što su

evolutivni faktori rezultirali u različitoj količini i strukturi genetičkog diverziteta vrste u

pojedinim zemljama.

Diskusija

101

Ako iz tabele 15. uporedimo glavne ugrožavajuće faktore po evropske

populacije potočne pastrmke, kao i populacije u Srbiji (pogledati Uvod), najviše

sličnosti po vrsti i značaju ugrožavajućih aktivnosti naći ćemo između Grčke i

Srbije. U Grčkoj najozbiljniju pretnju po populacije potočne pastrmke ima preveliko

ribolovno opterećenje, koje uključuje i sve vidove krivolova (eksplozivna sredstva,

otrovi i različite klopke). Uništenje staništa je drugi veoma značajan razlog

ugroženosti, i obuhvata izgradnju brana, regulaciju tokova i izgradnju sistema

kanala, kao i zagađenje poljoprivrednim i kućnim otpadnim produktima. Na trećem

mestu nalazi se poribljavanje, mada, kao i u najvećem broju drugih zemalja, ne

postoji sistematična informacija o stepenu poribljavanja kao i o njegovim efektima

na autohtone populacije (Laikre i sar., 1999). Redosled i značajnost ugrožavajućih

faktora na pastrmske populacije Grčke u potpunosti koincidira sa trenutnim stanjem

ugroženosti populacija potočne pastrmke u Srbiji.

Kada su nam poznati ugrožavajući faktori koji predstavljaju potencijalnu,

ako ne i realnu opasnost da vremenom dođe do istrebljenja jedinstvenih pastrmskih

populacija na teritoriji Srbije, neophodno je izvršiti uklanjanje negativnih

(ugrožavajućih) aktivnosti, kao i administrativno upravljački odrediti konzervacionu

jedinicu na koju će biti usmeren konzervacioni napor. Ratifikacijom Konvencije o

Biološkom Diverzitetu naša zemlja se obavezala da će primenjivati konzervacione

mere na svim nivoima, od gena do ekosistema, što se u potpunosti slaže sa dve

glavne preporuke genetičke konzervacije:

1. sačuvati što je više moguće prirodnih ekosistema

2. utvrditi genetičku strukturu populacije

Rezultati ove teze započeli su identifikaciju genetičkog diverziteta pastrmskih

populacija, predstavljenog sa 15 mtDNA haplotipova u okviru tri evolutivne linije

(Bernatchez i sar., 1992), uzorkovanjem na 35 lokaliteta u okviru sva tri slivna područja

Republike Srbije. Na osnovu dobijenih rezultata haplotip se može odrediti za

konzervacionu jedinicu na koju će biti usmeren konzervacioni napor.

Na osnovu saznanja dobijenih na terenu prilikom prikupljanja materijala može

se reći da je ugroženost populacija potočne pastrmke izuzetno velika, i da je

neophodna hitna primena konzervacionih mera u vidu dodeljivanja konzervacionih

statusa, kako staništu, tako i haplotipovima. Posebna pažnja mora biti posvećena

Diskusija

102

haplotipovima koji su pronađeni po prvi put u okviru areala vrste. Populacije

novopronađenih haplotipova dunavskog sliva (Da*Vl, Da*Vr i Da*Dž) izuzetno su

malobrojne. U izvorišnom delu reke Vlasine na uzorkovanih 100 m toka pronađene su

samo dve ribe i obe su posedovale haplotip Da*Vl, dok je donji deo reke već

poribljavan neautohtonom pastrmkom. U gornjem delu reke Vrle pronađen je haplotip

Da*Vr koji već deli stanište sa introdukovanim haplotipom ADcs1, a samo stanište je

ugroženo izgradnjom fabrike vode na obali reke. Haplotip Da*Dž pronađen je na 1

primerku u Džepskoj reci analizom oko 100 m toka. Novi haplotip jadranskog sliva

Ad*Pe, kao i ostali koji su pronađeni u okviru istog slivnog područja (Ad+Prz i

ADcs11), kao i dela egejskog sliva Ad*Ti (Lepenac sa pritokama), trenutno nisu pod

našim uvidom zbog nemogućnosti pristupa pomenutom području. Novopronađeni

haplotip Ad*Bož uzorkovan je u slivu Dragovištice i, u odnosu na ostale nove

haplotipove, njegova brojnost je na zavidnom nivou. Međutim, i on je ugrožen

poribljavanjem Dragovištice u donjem delu toka kroz Bugarsku materijalom At linije.

Posebno je bitno pomenuti da je na lokalietima Vlasina, Vrla i Božica prisutna

izrazita degradacija staništa, zbog formiranja akumulacionih jezera, dok se iz

Ljubatske reke značajan deo vode prevodi u sliv Južne Morave. Takođe, izuzetno

mala brojnost primećena je na ostalim uzorkovanim lokalitetima, izuzev lokaliteta gde

je uzorkovan haplotip Da1.

U Srbiji je do sada, na nacionalnom nivou, jedino populacijama potočne pastrmke

u slivu Dragovištice bio dodeljen konzervacioni status na bazi IUCN kriterijuma. Još pre

utvrđivanja novog mtDNA haplotipa (Ad*Bož), iz literaturnih podataka bilo je poznato

da egejski sliv jugo-istočne Srbije naseljava vrsta Salmo macedonicus (Karaman, 1924).

Ispitivanjima koja su obavili Marić i sar. (2004), utvrđena je i biomasa pastrmskih

populacija sliva Dragovištice koja je iznosila 8,8 kg km-1, što je bilo za oko četiri puta

manje u odnosu na biomasu populacija potočne pastrmke u reci Mlavi (istočna Srbija).

Populacije potočne pastrmke u slivu Dragovištice zbog njihove taksonomske

specifičnosti, kao i veoma malog areala na teritoriji Srbije koji naseljavaju, uz utvrđenu

malu biomasu, dobile su operativni status Lower Risk (conservation dependent).

Trenutno, ugroženost potočne pastrmke pokušava se legislativno regulisati

određenim zaštitnim merama u ribarstvu, kao što su minimalna dozvoljena dužina ulova,

period lovostaja u vreme mresta, strogo propisan režim ribolova u pogledu mogućnosti i

količine ulovljenih pastrmki, broja ribolovnih dana tokom sezone, itd. Sve pobrojane

Diskusija

103

mere su veoma dobre, ali one do sada nisu dale pozitivne rezultate u zaštiti, pre svega

zbog njihovog nepotpunog sprovođenja.

Za potpunu zaštitu pastrmskih populacija neophodno je primeniti sledeće

preporuke:

1. Utvrđivanje stanja populacije

2. Utvrđivanje i otklanjanje ugrožavajućih faktora koji su doveli do smanjenja

brojnosti populacije

3. Utvrđivanje genetičke strukture populacije

4. U slučaju pronalaska novih genetičkih varijanti izvršiti dodelu konzervacionog

statusa populaciji i staništu

Na osnovu dobijenih rezultata svi lokaliteti na kojima su pronađeni novi

haplotipovi, kao i lokaliteti na kojima su pronađeni vrlo retki haplotipovi (Tabela

9), trebalo bi da dobiju poseban konzervacioni status kao stanište (određenu

kategoriju i stepen zaštite), uz dodelu konzervacionog statusa na nacionalnom

nivou haplotipovima koji su na datim lokalitetima pronađeni. Iako potočna

pastrmka nije uvrštena na Crvenu Listu (IUCN) ugroženih životinja na

internacionalnom nivou, pojedine države su joj dodelile status ugroženih vrsta na

nacionalnom nivou (Grčka - Endangered, Španija – Vulnerable i Švedska - Lower

risk, near threatened). Pošto su ugrožavajući faktori u Grčkoj i kod nas vrlo slični,

logično bi bilo da i mi sledimo primer Grčke i da bar našim jedinstvenim

populacijama (teritorija uže Srbije) dodelimo istu kategoriju ugroženosti. Pri

dodeljivanju nacionalnog konzervacionog statusa moramo uzeti u obzir i ribolovnu

atraktivnost pomenutih voda, kao i njihov potencijalni socio-ekonomski značaj.

Vodama koje nisu posebno ribolovno atraktivne u izvorišnim delovima (Vrla,

Vlasina i Džepska), a koje predstavljaju staništa jedinstvenih genetičkih formi

(Da*Vr, Da*Vl i Da*Dž), treba kao staništu dodeliti I stepen zaštite (od izvorišta u

dužini od 4 km), a haplotipovima status ugroženosti (Endangered). Reke u slivu

Dragovištice u kojima je pronađen haplotip Ad*Bož (Lisina, Božica, Ljubata i

Brankovačka reka (potencijalno)) koje su ribolovno atraktivne, a samim tim mogu

imati i ekonomski značaj, moraju dobiti specijalni režim zaštite koji bi omogućio

očuvanje genetičke jedinstvenosti pastrmskih populacija, kao i održivi ribolov kao

jedan od izvora prihoda lokalnoj zajednici. Pastrmske populacije koje naseljavaju

Diskusija

104

pomenute reke sliva Dragovištice dobile bi konzervacioni status Lower risk, near

threatened. Izvorišni delovi navedenih reka u dužini od 4 km morali bi dobiti kao

stanište I stepen zaštite, dok bi ostali deo toka pomenutih reka do ušća u

Dragovišticu, kao i sama Dragovištica, bio pod II stepenom zaštite. Dodela

navedenog konzervacionog statusa uz primenu strogih mera kontrole i upravljanja

(lov po pravilu “uhvati-i-pusti” uz mogućnost nošenja jedne ribe preko 40 cm)

obezbedio bi stalnost korišćenja, posebno ukoliko bi se adekvatnim poribljavanjem

kroz neki period restaurirala genetička struktura populacije približna originalnoj.

Perspektive haplotipa Ad*Bož u pogledu opstanka biće vrlo optimistične, naročito

ako se obistine sumnje da je areal ovog haplotipa vezan i za ostale reke egejskog

sliva, što će pokazati rezultati budućih istraživanja (Diskusija str. 79).

Rekreativni («sportski») ribolov, koji se u velikom delu areala pastrmke

smatra najelitnijim vidom rekreativnog ribolova, upražnjava se intenzivno. Intenzitet

ribolova (a kod nas se pod ovim mora obuhvatiti i krivolov) je veliki, jer je cena

takvog ribolova znatna i donosi upravljačima ili vlasnicima ribolovnih voda na

kojima se vrši velike prihode u svetu, a ponegde i kod nas. Ovaj ribarstveno –

komercijalni pritisak je pod uslovima kada nije bilo moguće zaokruženo odrediti i

sprovoditi adekvatne konzervacione mere u većem delu areala pastrmke, a posebno

kod nas i u bližem okruženju, snažan ugrožavajući faktor po pastrmski (geno)fond.

Kao posledica velikog ribolovnog pritiska, najčešće se pribegava poribljavanju kao

meri upravljanja pastrmskim fondom, što je uglavnom kontraproduktivno po

originalnost pastrmskih populacija. Kod nas se poribljavanje najčešće vršilo i vrši

onim materijalom koji je u datom trenutku dostupan, bez obzira na činjenicu koliko

je odgovarajući, bez skoro bilo kakvih ograničenja i kontrole. Za područje stare

SFRJ (izuzev Slovenije), a posebno za Srbiju, ne postoji precizno vođena evidencija

o poribljavanju pastrmskih reka, osim u nekoliko pojedinačnih slučajeva. Zna se da

je materijal za poribljavanje nabavljan iz mrestilišta u Ivanjici, Konjicu, Vrelu Bune

i Blagaju, kao i iz Slovenije i sa Ohrida, i da su poribljavanja vršena širom Srbije.

Srećom po pastrmski fond kod nas, ta poribljavanja su uglavnom vršena na

ribolovno atraktivnim vodama: Mlavi, Krupaji, Gradcu, Moravici, Drini i ponegde

drugde, ali su još preostale vode (koje su bile u fokusu uzorkovanja ove teze) koje

su i / ili ribolovno neatraktivne, i / ili fizičkim preprekama odvojene od delova,

obično nizvodnih, koji su ribolovno atraktivni svojom lakom dostupnošću ili

veličinom pastrmke u njima (Marić, 2002). Prepoznavanje genetičkog identiteta

Diskusija

105

pastrmki omogućava uspostavljanje sistema konzervacije uključenog u mere

održivog ribolovnog korišćenja pastrmskog fonda i po obimu te aktivnosti, i po

dubini implementacije. Ovakav vid ribarstvenog korišćenja pastrmskog fonda biće

od značaja tek kada budemo imali s jedne strane potrebne parametre (stanje

populacije, ribolovno opterećenje, genetičku strukturu), a sa druge uređen sistem

proizvodnje autohtonog materijala za poribljavanje, u slučajevima kada je ova mera

neophodna. Da bi se proizvodnja autohtonog materijala za poribljavanje mogla

realizovati, za početak je neophodno ustanoviti referentnu laboratoriju koja bi se

bavila utvrđivanjem genetičke strukture populacija, na osnovu koje bi se za

specifične i ugrožene populacije formiralo matično jato koje bi služilo za dobijanje

materijala za poribljavanje. Pošto je formiranje referentne laboratorije neophodan

uslov za proveru genetičke strukture populacije, a samim tim i za konzervaciju

retkih i ugroženih (autohtonih) populacija, cela procedura morala bi biti i zakonski

regulisana. Ako se u ovom smislu u dogledno vreme ne promeni zakonska

regulativa, i ne omogući utvrđivanje genetičke strukture populacija, najbolje bi bilo

ne vršiti poribljavanja genetički neproverenim materijalom, već posebnu pažnju

obratiti na zaštitu ugroženih populacija uz strogu zakonsku primenu zaštitnih mera u

ribarstvu, ili pak, ako je neophodno, zabraniti izlov, pa u krajnjem slučaju i ribolov

u periodu neophodnom za oporavak populacije.

Kako oba aspekta konzervacionih i ribarstvenih aktivnosti zaslužuju najveću

pažnju, u sadašnjim uslovima, u kojima se ribarstvo kao privredna delatnost kod

nas nalazi (a u okviru nje i rekreativni ribolov), zahtevaju korenite promene i u

zakonskom smislu i u pogledu dosledne implementacije u budućoj ribarstvenoj i

konzervacionoj praksi. Sa zakonske strane, potreba za harmonizacijom naših

ribolovnih propisa i konzervacione prakse sa istima u zemljama EU doprineće

uvođenju pravila primerenijih vremenu i stanju u oblasti koja bi se time regulisala,

dok bi, sa ribarstvene strane, uređenje celog sistema višestruko povećalo

produktivnost pastrmskog ribolova i omogućilo upravljačima pastrmskih ribolovnih

voda obavljanje delatnosti koja bi po profitabilnosti bila približna onoj u zemljama

u kojima je to odgovarajuće regulisano. Time bi se jasno pomogli interesi nadležnih

državnih organa iz oblasti zaštite životne sredine i ribarstva s jedne strane (kao

propisivača, kontrolora i implementatora zakona) i najrazličitijeg opsega

ribarstvenih subjekata kao upravljača pastrmskih ribolovnih voda, što otvara i put

ka odgovoru na pitanje subjekata koji bi trebalo da se oko ove teme (i drugih, šire

Diskusija

106

posmatrano) angažuju. Pri tome, uzimajući u obzir broj pastrmskih voda i ribolovni

prtisak, sasvim je izvesno da bi se konzervacione aktivnosti vezane za pastrmski

fond u Srbiji odvijale niskim intenzitetom, ali obavezno konstantno, što bi trebalo

da bude finansijski održiva aktivnost u sklopu ribarstveno-finansijskog obima, dok

bi ribarstvene aktivnosti, pre svega one vezane za zaštitu ribljeg fonda u ribarstvu,

trebalo da budu višestruko intenzivirane u praksi. Ovo je pre svega značajno stoga

sto bi pozitivne efekte ovako uređene održive ribarstvene i konzervacione prakse

osetili stanovnici ruralnih, trenutno slabo razvijenih i raznovrsnošću delatnosti

ograničenih područja Srbije i što bi, u sklopu ostalih vidova konzervaciono zavisnih

aktivnosti, to moglo predstavljati zamajac njihovom održivom privrednom razvoju

u celini.

Zaključci

107

5. ZAKLJUČCI

Na osnovu rezultata ove studije utvrđeno je postojanje tri glavne

filogeografske grupe potočne pastrmke na teritoriji Srbije: dunavske (Da),

«južne» (Ad; Ad+) i atlantske (At). U okviru sve tri grupe identifikovano je,

na osnovu 18 polimorfnih mesta, ukupno 15 haplotipova, od kojih je šest po

prvi put opisano untar areala vrste. Od šest novo opisanih haplotipova, tri su

iz dunavske linije i pronađena su u slivu Južne Morave (Da*Vl (Vlasina),

Da*Vr (Vrla) i Da*Dž (Džepska reka)), dok su dva od preostala tri koja

pripadaju Ad liniji, pronađena u egejskom slivu (Ad*Bož (sliv Dragovištice) i

Ad*Ti (sliv Lepenca), a jedan je pronađen u jadranskom slivu Ad*Pe (Pećka

Bistrica).

Rekonstrukcijom filogenije NJ i MP metodama dobijena je vrlo slična

topologija stabla, pri kojoj haplotipovi pokazuju pripadnost filogenetskim

linijama potočne pastrmke. «Majority role consensus 50% tree» otkriva jasno

razdvajanje sa visokom potporom na dve glavne klade (Da i At klada + «južna

klada» (Ad, Ad+, Ma i Me)). U «južnoj» kladi haplotip Ad*Bož zauzima

ancestralnu poziciju (Slika 30), ali zbog niskih “bootstraping” verovatnoća za

NJ i MP analize njegovu ancestralnost tek treba dokazati rezultatima drugih

DNA analiza, ali i analiziranjem drugih tipova kararaktera (morfoloških). U

«južnoj» kladi, pored Ad haplotipova (ADcs1, ADcs11, Ad*Pe i Ad*Ti) koji

nisu jasno grupisani u kladu, javljaju se dve već poznate podgrupe

(mediteranska i marmoratus) i treća, dopunska, koja je prvi put identifikovana

(Ad+). Članovi Me, Ma i Ad+ klade karakterišu se istim brojem intra- kladnih

sinapomorfizama (pozicije 113 i 262 za Ma, 146 i 196 za Me, 126 i 262 za

Ad+; Tabela 13) što sugeriše isti nivo divergencije ovih klada. Novu (Ad+)

kladu čine haplotipovi Ad+Prz, Ad+N i Ad+RC, i ona je statistički poduprta

istim nivoom verovatnoće kao i već ustanovljene podgrupe (klade Me i Ma).

Haplotip Ad+Prz pronađen je u Prizrenskoj Bistrici, Mrtvici i Tripušnici (u

koju je, kako pretpostavljamo, introdukovan iz Neretve), Ad+N je pronađen u

Neretvi, a Ad+RC u Rijeci Crnojevića. Geografska distribucija pomenutih

haplotipova vezana je za reke jadranskog sliva jugo-zapadnog Balkana i

Zaključci

108

poklapa se sa distribucijom vrste Salmo farioides (Karaman, 1937), što i

navodi na zaključak da Ad+ klada ustvari predstavlja Salmo farioides.

Unutar Da klade uočen je veliki nivo genetičke divergencije (Tabela

11). Ovaj podatak, kao i sinapomorfne pozicije (Tabela 13) najbazalnijih

haplotipova Da klade (Da*Vr i Da*Dž) (Slika 30) i haplotipova iz svih ostalih

linija, ide u prilog stavu da dunavske populacije predstavljaju najstariju

fragmentiranu liniju Salmo trutta kompleksa. Ancestralna pozicija Da linije

prikazana je i sekvencioniranjem celog kontrolnog regiona mtDNA (Cortey i

sar., 2004; Templeton, 2004). Ovakvi rezultati navode na zaključak da je

potočna pastrmka, najverovatnije, poreklom iz Paratetisa, odakle se, preko

pleistocenskih veza, širila iz basena Crnog mora, Kaspijskog i Aralskog jezera

prema Atlantiku na jednoj i Mediteranu na drugoj strani. Prilog ovoj hipotezi

predstavlja pronalazak ekstremno divergentnih haplotipova kao što su Da*Vr i

Da*Dž, koji zauzimaju intermedijarni položaj na mreži (Slika 31) između Da,

At i «južne grupe» (Ad, Ad+, Ma i Me) haplotipova, što je posebno

karakteristično za haplotip Da*Vr, čija se centralna pozicija može uočiti i

preko vrednosti genetičkih distanci između pomenutih grupa. Sve navedeno

dodatno potvrđuje dugo postojanje i ancestralno poreklo Da linije u evoluciji

potočne pastrmke.

Na analiziranom području, u zavisnosti od sliva, bilo je očekivano

prisustvo autohtonih haplotipova dunavske i Ad linije. Međutim, analizom je

utvrđeno i prisustvo haplotipa At1 koji pripada atlantskoj liniji. Nalaz

pomenutog haplotipa na dva lokaliteta, Gradac i Brankovačka reka, posledica

je poribljavanja, jer se radi o haplotipu atlantske linije koji preovladava u

ribnjačkoj proizvodnji mlađi potočne pastrmke. Takođe, bitno je pomenuti i

nalaz haplotipa Ad linije ADcs1 na dva lokaliteta unutar dunavskog sliva

(Jerma i Vrla), za koga smatramo da je na ove lokalitete dospeo antropogenom

aktivnošću iz sliva Dragovištice (Jerma – poribljavanje, Vrla – ispumpavanje

vode u sliv Južne Morave). Između egejskog i jadranskog sliva utvrđena je

jasna genetička raspodela haplotipova, koju jedino narušava haplotip Ad+Prz

pronađen u Tripušnici (egejski sliv), koji je u ovaj sliv dospeo kao posledica

poribljavanja materijalom iz sliva Neretve.

Zaključci

109

Visok nivo genetičkog diverziteta koji je otkriven opisivanjem nekoliko

novih polimorfizama unutar različitih linija potočne pastrmke, izrazita

divergencija unutar dunavskih populacija na teritoriji Srbije, kao i

pretpostavka postojanja evolutivno zasebne linije (Ad+; Salmo farioides) u

jadranskom slivu, sugerišu da bi u narednom periodu trebalo preduzeti

opsežne analize pastrmskih populacija na preostalom delu Balkana (Crna

Gora, Makedonija, Albanija, Bosna i Hercegovina, Bugarska). Pošto

analizirani prostor Srbije predstavlja samo mali deo Balkanskog poluostrva, za

očekivati je da je genetički polimorfizam potočne pastrmke unutar celog

regiona znatno veći.

Ova studija je pokazala da autohtone populacije još uvek postoje u

Srbiji, barem u izvorišnim delovima reka. Ova informacija je od posebne

važnosti za pravilno gazdovanje u cilju održanja autohtonog genetičkog

diverziteta potočne pastrmke u Srbiji. Gazdovanje mora prepoznati biološku

realnost postojanja genetičkog diverziteta i pronaći odgovarajuće strategije na

bazi ove realnosti za efikasnu konzervaciju genetičke varijabilnosti (Ryman,

1991).

Pošto su novo pronađeni haplotipovi na teritoriji Srbije malobrojni i

pod stalnom su pretnjom ugrožavajućih aktivnosti, neophodno im je, na

nacionalnom nivou, dodeliti odgovarajuće konzervacione statuse.

Novopronađenim haplotipovima (Da*Vr, Da*Vl i Da*Dž) u vodama koje nisu

ribolovno atraktivne, u izvorišnim delovima (Vrla, Vlasina, Džepska),

predložena je dodela statusa ugroženosti (Endangered), dok onima koji se

nalaze u ribolovno atraktivnim vodama (reke sliva Dragovištice) u kojima je

pronađen haplotip Ad*Bož predlaže se dodela konzervacionog statusa Lower

risk, near threatened, koji bi trebao da zadovolji očuvanje genetičke

jedinstvenosti, sa jedne strane, a sa druge održivi ribolov. Takođe, neophodno

je dodeliti staništima na kojima su pronađeni novi haplotipovi, a to su gornji

tokovi reka (Vrla, Vlasina, Džepska i reke sliva Dragovištice), odgovarajuću

kategoriju i I stepen zaštite u prva 4 km toka.

Zaključci

110

Oba aspekta konzervacionih i ribarstvenih aktivnosti na populacijama

potočne pastrmke zahtevaju vrlo brze i korenite promene, kako u zakonskom

smislu, tako i u doslednoj primeni u budućoj konzervacionoj i ribarstvenoj

praksi.

Summary

111

6. SUMMARY

Upon results of this study, the occurrence of three main phylogeographic groups of the brown

trout was confirmed at the territory of Serbia: Danube (Da), “southern” (Ad; Ad+) and Atlantic (At).

Within all groups, 15 haplotypes based on 18 polymorphic places were identified; six of them were

recorded for the first time. Three new haplotypes belong to Danube group and were found in Južna Morava

drainage (Da*Vl (Vlasina), Da*Vr (Vrla) i Da*Dž (Džepska River)), while within three others, belonging

to Ad group, two were found in Aegean Sea basin (Ad*Bož (Dragovištica River drainage) and Ad*Ti

(Lepenac River drainage); one was found in Adriatic Sea basin Ad*Pe (Pećka Bistrica River).

Phylogeny reconstruction based on NJ and MP showed very similar tree topology. «50%

Majority role consensus tree» revealed clear division of three main clades with high support level (Da and

At clade + «southern clade» (Ad, Ad+, Ma and Me). Haplotype Ad*Bož have the ancestral position in the

«southern» clade (Fig 30), but because of the low “bootstrapping” probabilities for NJ i MP analyses, this

ancestral state should be additionaly proved with other DNA analyses and analyses of morphologic

characters. Within «southern» clade, in addition to Ad haplotypes (ADcs1, ADcs11, Ad*Pe i Ad*Ti) that

were not apparently grouped together, the presence of two well known subdivisions was confirmed

(Mediterranean and marmoratus); the third additional subdivision Ad+ was identified for the first time. The

members of the Me, Ma i Ad+ clades are characterized with the same numbers of intra-clade

synapomorphies (positions 113 and 262 for Ma, 146 and 196 for Me, 126 and 262 for Ad+; Table 13); this

suggest the same level of divergence of these clades. The new clade (Ad+) includes haplotypes Ad+Prz,

Ad+N and Ad+RC, and has the same level of support as other (previously known) subdivisions (clades Me

and Ma). Haplotype Ad+Prz was found in Prizrenska Bistrica River, Mrtvica River and Tripušnica River

(we think that this haplotype was introduced from the Neretva River into Tripušnica River); Ad+N was

found in Neretva River and Ad+RC in Rijeka Crnojevića River. Geographic distribution of those

haplotypes is connected with the rivers of the Adriatic basin of the south-western Balkan peninsula and

corresponds with the distribution of Salmo farioides (Karaman, 1937); this suggests that Ad+ clade

represents Salmo farioides, and could belong to the new line within the “southern” group.

Strong genetic divergence was found within the Da clade, that was based on the genetic distances

(Table 11). Strong divergence, synapomorphic positions (Table 13) of the most basal haplotypes belonging

to Da clade (Da*Vr and Da*Dž) (Fig 30), as well as position of the haplotypes of all other lineages, suggest

that Danube populations represent the oldest fragmental line of Salmo trutta complex. Ancestral position of

Da line was also shown by sequencing of the whole mtDNA control region (Cortey at al., 2004;

Templeton, 2004). These results suggest that brown trout originated from the Parathetis and spred from the

Summary

112

Paratethis through the Pleistocene connections from the Black See basin, Caspian and Aral lakes toward the

Atlantic Ocean and Mediterranean See. Extremely divergent haplotypes like Da*Vr and Da*Dž have

intermediate positions in the network (Fig 31) between Da, At and «southern group» (Ad, Ad+, Ma i Me)

of haplotypes. That specially accounts for the Da*Vr haplotype, that holds central position judging from its

genetic distances to the rest of haplotypes. All these facts confirm the long term presence and ancestral

origin of Da lineage in evolution of the brown trout.

In spite of expectation that only wild haplotypes of Ad and Da lineages occur in Serbia, the

analyses confirmed presence of haplotype At1 which belongs to Atlantic line. The finding of this haplotype

in two localities, Gradac River and Brankovačka River, is a fisheries-related impact that predomintes in

hatcheries’ production of brown trout fry for stocking. The occurrence of haplotype ADcs1 of the Ad

lineage in two localities in the Danube River basin (Jerma and Vrla Rivers) could be a consequence of

sotcking and transfer of water from the Dragovistica River drainage, respectively. The clear genetic

dispersion of haplotypes was recorded between basins of Aegean and Adriatic Seas. It was disturbed only

by Ad+Prz haplotype, which occured in Tripusnica River (Aegean Sea basin) after the stocking from the

Neretva River drainage.

Since the territory of Serbia represents only the small part of the Balkan Peninsula, the higher lever

of genetic polymorphism of the brown trout from the whole region of the Balkans (Montenegro,

Macedonia, Albania, Bosnia and Herzegovina, Bulgaria) could be expected, considering the recorded high

level of genetic diversity, finding of new polymorphic places within different lines of the brown trout,

strong divergence within Danube populations in the territory of Serbia, as well as suspected presence of

evolutionary divergent line (Ad+; Salmo farioides) in the Adriatic basin.

This study showed that aboriginal, i.e., populations still exist in Serbia, at least in spring sections of

streams and rivers. This is very important for the conservation of autochthonous genetic diversity of the

brown trout in Serbia. The efficient conservation of existing genetic variability, i.e., diversity, is to be taken

into account in the strategy of fisheries management (Ryman, 1991).

Since the new haplotypes are not very frequent in Serbia and are under the constant threat, proper

conservation status in national legislation is needed. The conservation status of three new haplotypes from

Da group (Da*Vr, Da*Vl and Da*Dž) in the headwaters of Vrla, Vlasina and Džepska Rivers should be

set as EN, whereas for AD*Bož haplotype it should be set as LRnt in particular waters of the Dragovistica

River drainage where some brown trout, attractive for fishing, occur. That would enable both maintenance

of existing genetic uniqueness and sustainable fisheries utilization. However, the first four kilometers of

each of those rivers should be assigned in the highest protection category. Both conservational and fisheries

practice concerning the brown trout are in strong and urgent necessity for changes in legislation, as well as

in consistent and harmonized application.

Literatura

113

7. LITERATURA

Aebersold, P. B., Winans, G. A., Teel, D. J., Milner, G. B., Utter, F. M. 1987. Manual for starch gel electrophoresis: a method for the detection of genetic variation. NOAA Technical Report NMFS 61, U.S. Department of Commerce, National Oceanic and Atmospheric Administration, National Marine Fisheries Service, U.S.A.

Aganović, M. 1979. Salmonidne vrste riba i njihov izgoj. IGKRO "Svijetlost", Sarajevo. Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J. D. 1994. DNA repair.

V: Molecular biology of the cell. New York, Gerland Publishing, pp. 242-251. Alegria Hernandez V. 1985. A contribution to the study of heterogeneity of the Adriatic

sardine (Sardina pilchardus Walb.) population. Acta Adriatica, 26: 109-122. Allendorf, F. W. 1988. Conservation biology of fishes. Conservation Biology, 2: 145-148. Allendorf, F. W., Leary, R. F. 1988. Conservation and distribution of genetic variation in

a polytypic species, the cutthroat trout. Conservation Biology, 2: 170-184. Allendorf, F. W., Ryman, N., Stennek, A., Stähl, G. 1976. Genetic variation in

Scandinavian brown trout (Salmo trutta L.): evidence of distinct sympatric populations. Hereditas, 83: 73-82.

Allendorf, F. W., Waples, R. S. 1996. Conservation and Genetics of Salmonid Fishes. In:

Avise, J. C. & Hamrick, J. L. (eds.) Conservation Genetics. Case Stories from Nature, Chapman & Hall, New York, pp. 238-280.

Amos, B., Schlöterer, C., Tautz, D. 1993. Social structure of pilot whales revealed by

analytical DNA profiling. Science, 260: 670-672. Anderson, B. G., Borns, H. W. Jr. 1994. The Ice Age world. Scandinavian Univ. Press,

Oslo, Norway. Anđelković, S. J. 1989. Tercijarne ribe Jugoslavije stratigrafsko – paleontološko

paleoekološka studija. Paleontologica Jugoslavica. Jugoslovenska Akademija Znanosti i Umjetnosti Zagreb, 38: 1-121.

Angeres, B., Bernatchez, L., Angers, A., Desgroseillers, L. 1995. Specific microsatellite

loci for brook charr reveal strong population subdivision on a micrographic scale. Journal of Fish Biology, 47 (Suppl. A): 177-185.

Anonimni autori. 1994. «Zakon o ribarstvu». Službeni glasnik Republike Srbije, 35, pp. 2342-2346.

Anonimni autori. 2004. «Zakon o zaštiti životne sredine». Službeni glasnik Republike Srbije, 135, pp. 29-43.

Literatura

114

Antunes, A., Alexandrino, P., Ferrand, N. 1999. Genetic characterization of Portuguese brown trout (Salmo trutta L.) and comparison with other European populations. Ecology of Freshwater Fish, 8: 194-200.

Antunes, A., Templeton, R. A., Guyomard, R., Alexandrino, P. 2002. The role of Nuclear Genes in Intraspecific Evolutionary Inference: Geneology of the transferin Gene in the Brown Trout. Molecular Biology and Evolution, 19 (8): 1272-1287.

Apostolidis, A., Karakousis, Y., Triantaphyllidis, C. 1996. Genetic divergence and

phylogenetic relationships among Salmo trutta L. (brown trout) populations from Greece and other European countries. Heredity, 76: 551-560.

Apostolidis, A., Karakousis, Y., Triantaphyllidis, C. 1996a. Genetic differentiation and

phylogenetic relationships among Greek Salmo trutta L. (brown trout) populations as revealed by RFLP analysis of PCR amplified mitochondrial DNA segments. Heredity, 77: 608-618.

Apostolidis, A. P., Triantaphyllidis, C., Kouvatsi, A., Economidis, P.S. 1997.

Mitochondrial DNA sequence variation and phylogeography among Salmo trutta L (Greek brown trout) populations. Molecular Ecology, 6:531-542.

Aquadro, C. F., Greenberg, B. D. 1983. Human mitochondrial DNA variation and

evolution: analysis of nucleotide sequences from seven individuals. Genetics, 103: 287-312.

Arkhipov, S. A., Ehlers, J., Johnson R. G., Wright H. E. Jr. 1995. Glacial drainages

towards the Mediterranean during middle and late Pleistocene. Boreas, 24: 196-206.

Avise, J. C. 1992. Molecular population structure and the biogeographic history of a

regional fauna: a case history with lessons for conservation biology. Oikos, 63: 62-76.

Avise, J. C. 1994. Molecular tools. V: Molecular markers, natural history and evolution.

Chapman & Hall, New York, pp. 44 - 91. Avise, J. C. 1998. The history of phylogeography: a personal reflection. Molecular

Ecology, 7: 371-379. Avise, J. C. 2000. Phylogeography. The history and Formation of Species. Harvard

University Press, Cambridge, MA. Avise, J. C., Arnold, J., Ball, R. M., Bermingham, E., Lamb, T., Neigel J. E. Reeb, C. A.

Saunders, R. C. 1987. Intraspecific phylogeography: The mitochondrial DNA and bridge between population genetics and systematics. Annual Review of Ecology and Systematics, 18: 489-522.

Balon, K. E. 1968. Notes to origin and evolution of trouts and salmons with special

reference to the Danubian trouts. Acta Societatis Zoologicae Bohemoslovacae, 32 (1): 1-21.

Literatura

115

Banarescu, P. 1960. Einige Fragen zur Herkunft und Verbreitung der Süsswasserfishfauna der europäisch – mediterranen Unterregion. Archiv fuer Hydrobiologie, 57: 16-134.

Banarescu, P. 1973. Origin and affinities of the freshwater fish fauna of Europe.

Ichthyologia, Beograd 5: 1-8. Banarescu, P. 1977. Position zoogéographique de l'ichthyo – faune d'eau douce d'Asie

occidentale. Cybium, 2: 35-55. Banarescu, P. 1990. Zoogeography of freshwater: general distribution and dispersal of

freshwater animals. Aula Verlag ed. Wiesbaden, 1: 1-511.

Banarescu, P., Blanc, M., Gaudet, J. L., Mureau, J. C. 1971. European inland water fish, multilingual catalogue. Fish News Books, London, pp. 170.

Behnke, R. J. 1965. A systematic study of the family Salmonidae with special reference to the genus Salmo. Ph.D. thesis, University of Berkley, California, U.S.A., pp. 273.

Behnke, R. J. 1968. A new subgenus and species of trout, Salmo (Platysalmo) platycephalus from south central Turkey, with comments on the classification of the subfamily Salmonidae. Mitteilungen Hamburgisches Zoologisches Museum und Institut, 66: 1-15.

Behnke, R. J. 1986. Brown trout. Trout, 27: 42-47.

Berg, L. S. 1948. Freshwater fishes of the USSR and adjacent countries. Zoological Institute Akademy Nauk Moscow USSR 1(27), volume 1. In Russian, English translation, 1962: Office of Technical Services, Department of Commerce, Washington, DC.

Berg, W. J., Ferris, S. D. 1984. Restriction endonuclease analysis of salmonid mitochondrial DNA. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 41: 1041-1047.

Bernatchez, L. 1995. A role for molecular systematics in defining significant evolutionary

units. In Nielsen, J.L. and Powers, D.A. (eds.). Evolution and the aquatic ecosystem: defining unique units in population conservation. American Fisheries Society Symposium 17, American Fisheries Society, Bethesda, Maryland, USA, pp. 114-132.

Bernatchez, L. 2001. The evolutionary history of brown trout (Salmo trutta L.) interred

from phylogenetic, nested clade, and mismatch analyses of mitochondrial DNA variation. Evolution, 55 (2): 351-379.

Bernatchez, L., Danzmann, R. G. 1993. Congrugence in control - region sequence and

restriction – site variation in mitochondrial DNA of brook charr (Salvelinus fontinalis Mitchill). Molecular Biology and Evolution, 10: 1002-1014.

Literatura

116

Bernatchez, L., Guyomard, R., Bonhomme, F. 1992. DNA sequence variation of the mitochondrial control region among geographically and morphologically remote European brown trout Salmo trutta populations. Molecular Ecology, 1: 161-173.

Bernatchez, L., Osinov, A. G. 1995. Genetic diversity of trout (genus Salmo) from its most eastern native range based on mitochondrial DNA and nuclear gene variation. Molecular Ecology, 4: 285-297.

Bernatchez, L., Wilson, C. C. 1998. Comparative phylogeography of Nearctic and Palearctic fishes. Molecular Ecology, 7: 431-452.

Berrebi, P., Povž, M., Jesenšek, D., Cattaneo – Berrebi, G., Crivelli, A. J. 2000. The

genetic diversity of native, stocked, and hybrid populations of marble trout in Soča river, Slovenia. Heredity, 85 (3): 277-287.

Bianco, P. G. 1990. Potential role of paleohistory of the Mediterranean and Parathetys

basins on the early dispersal of Euro-Mediterranean freshwater fishes. Ichthyological Exploration of Freshwaters, 1: 167-184.

Billington, B., Herbert, P. D. N. 1991. Mitochondrial DNA diversity in fishes and its

implications for introductions. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 48: 80-94.

Birky, C. W. 1983. Relaxed cellular controls and organelle heredity. Science, 222: 468-

475. Bookstein, F. L., Chernoff, B. L., Humphries, J. M., Smith, G. R., Strauss, E. R. 1985.

Morphometrics in evolutionary biology. The Academy of Natural Sciences of Philadelphia, Special Publication, 15 pp. 277.

Borst, P., Grivell, L. A. 1981. Small is beautiful-porterait of a mitochondrial genome.

Nature, 290: 443-444. Bouza, C., Arias, J., Castro, J., Sánchez, L., Martínez, P. 1999. Genetic structure of

brown trout, Salmo trutta L., at the southern limit of the distribution range of the anadromous form. Molecular Ecology, 8: 1991-2002.

Brown, W. M., George, M., Wilson, A. C. 1979. Rapid evolution of animal mitochondrial

DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 76: 1967-1971. Brown, J. H., Gibson, A. C. 1983. Biogeography. Mosby, St Louis, Toronto & London,

643 pp. Brown, W. M., Prager, E. M., Wang, A., Wilson, A. C. 1982. Mitochondrial DNA

sequences of primates: tempo and mode of evolution. Journal of Molecular Evolution, 18: 225-239.

Bruford, M. W., Ciofi, C., Funk, S. M. 1998. Characteristics of Microsatellites. U:

Molecular Tools for Screening Biodiversity. Chapman & Hall, New York, pp. 202-205.

Literatura

117

Brunner, P. C., Douglas, M. R., Bernatchez, L. 1998. Microsatellite and mitochondrial DNA assessment of population structure and stocking effects in Arctic charr Salvelinus alpinus (Teleostei: Salmonidae) from central Alpine lakes. Molecular Ecology, 7: 209-223.

Cables, L. 2001. Mitochondria. Horsepower.

http://homepages.ihug.co.nz/~lcables/mitochondria.htm Cann, R. L., Brown, W. M., Wilson, A. C. 1984. Polymorphic sites and the mechanisms

of evolution in human mitochondrial DNA. Genetics, 106: 479-499. Chiereghini, A. S. 1818. Descrizoine de’testacei e de’pesci she abitano le lagune e golfo

Vento: pp 128. Cita, M. B., McKenzie, J. A. 1986. The terminal Miocene event. International Geological

Correlation Programme, Messinian Project, 96: 123-143. Clement, M. Posada, D. Crandall, K. 2000. TCS: A computer program to estimate gene

genealogies. Molecular Ecology, 9(10): 1657-1660 Constable, J. J., Packer, C., Collins, D. A., Pusey, A. E. 1995. Nuclear DNA from primate

dung. Nature, pp. 373-393.

Cortey M., García-Marín J. L. 2002. Evidence for phylogeographically informative seqence variation in the mitochondral control region of Atlantic brown trout. Journal of Fish Biology, 60: 1058-1063.

Cortey, M., Pla, C., García-Marín, J. L. 2004. Historical biogeography of Mediterranean trout. Molecular Fhylogenetics and Evolution, 33: 831-844.

Cracraft, J. 1987. Species concept and the analogy of evolution. Biology and Phylosophy,

3: 329-346.

Crivelli, A. J. 1996. The freshwater fish endemic to the northern Mediterranean region. Le Sambuc, Arles, France.

Cross, T. F., Mills, C. P. R., Courcy Williams, M. 1992. An intensive study of allozyme variation in freshwater resident and anadromous trout, Salmo trutta L., in Western Ireland. Journal of Fish Biology, 40: 25-32.

Crozier, W. W., Ferguson, A. 1986. Electrophoretic examination of the population structure of brown trout, Salmo trutta L., from the Lough Neagh catchment, Northern Irland. Journal of Fish Biology, 28: 459-477.

Curole J. P., Kocher, T. D. 1999. Mitogenomics: digging deeper with complete

mitochondrial genomes. TREE, 14: 394-398. Delling, B. 2003. Species diversity and phylogeny of Salmo with emphasis on southern

trouts (Teleostei, Salmonidae). Department of Zoology, Stockholm University: pp. 142.

Literatura

118

Derzhavin, A. N. 1934. Freshwater fishes from the south coast of the caspian. Transactions Azerb. Otd. Zakavkaz. Filiala AN SSR, 7: 91-126.

Dodson, J. J., Gibson, R. J., Cunjak, R. A., Friedland, K. D., Garcia de Leaniz, C., Gross,

M. R., Newburym, R., Nielsen, J. L., Power, M. E., Roy, S. 1998. Elements in the development of conservation plans for Atlantic salmon (Salmo salar). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 55: 312-323.

Dorofeeva, E. A. 1989. The basic principles of classification and phylogeny of the

salmonid fishes (Salmoniformes, Salmonoidei, Salmonidae). Biology and Phylogeny of Fishes, (Korovina, V. M., ed.). St. Petersburg: Proceedings of Zoologikal Institute, USSR Academy of Sciences (in Russian), pp. 5-16.

Dorofeeva, E. D. 1998. Systematics and distribution history of European Salmonid fishes of the genus Salmo. Journal of Ichthyology, 38: 419-429.

Dowling, T. E., Moritz, C., Palmer, J. D., Riesberg, L. H. 1996. Nucleic AcidsIII: Analysis of fragments and restriction sites. V. Molecular systematics. Sunderland, Sinauer, pp. 249-320.

Duftner, N., Weiss, S., Medgyesy, N., Sturmbauer, C. 2003. Enhanced phylogeographic information about Austrian brown trout populations derived from complete mitochondrial control region secuences. Journal of Fish Biology, 62: 427-435.

Durand, J. D., Bianco, P. G., Laroche, J., Gilles, A. 2003. Insight into the origin of endemic Mediterranean ichthyofauna: Phylogeography of Chondrostoma Genus (Teleostei: Cyprinidae). The Journal of Heredity, 94: 315-328.

Durand, J. J., Persat, H., Bouvet, Y. 1999. Phylogeography and postglacial dispersion of

the chub (Leuciscus cephalus) in Europe. Molecular Ecology., 8: 989-998.

Economidis, P. S., Banarescu, P. M. 1991. The distribution and origins of freshwater fishes in the Balkan peninsula, especially in Greece. Internationale revue der gesamten hydrobiologie, 76: 257-283.

Edwards, A., Hammond, H. A., Jin, L., Caskey, C. T., Chakraborty, R. 1992. Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four human population groups. Genomics, 12: 241-253.

Ekman, S. 1957. Zoogeography of the sea. Sidgwic & Jackson, London, pp. 417.

Elliott, J. M. 1994. Quantitative ecology and the brown trout. Oxford Series in Ecology and Evolution, Oxford University Press, Oxford, Great Britain, 286 pp.

Englbrecht, C. C., Freyhof, J., Nolte, A., Rassmann, K., Schliewen, U., Tautz, D. 2000. Phylogeography of the bullhead Cottus gobio (Pisces: Teleostei: Cottidae) suggests a pre-Pleistocene origin of the major central European populations. Molecular Ecology, 9: 709-722.

Literatura

119

Estoup, A., Angers, B. 1998. Microsatellites and minisatellites for molecular ecology: Theoretical and empirical considerations. In Carvalho, G.R. (ed.). Advances in Molecular Ecology. IOS Press, Amsterdam, pp. 55-86.

Estoup, A., Presa, P., Krieg, F., Vaiman, D., Guyomard, R. 1993. (CT)n and (GT)n microsatellite: a new class of genetic markers for Salmo trutta L. (brown trout). Heredity, 71: 488-496.

Estoup, A., Rousset, F., Michalakis, Y., Cornuet, J.-M., Adriamanga, M., Guyomard, R.

1998. Comparative analysis of microsatellite and allozyme markers: a case study investigating microgeographic differentiation in brown trout (Salmo trutta). Molecular Ecology, 7: 339-353.

Ferguson, A. 1989. Genetic differences among brown trout, Salmo trutta L., stocks and their importance for the conservation and menagment of the species. Freshwater Biology, 21: 35 - 46.

Ferguson, A., Fleming, C. C. 1983. Evolutionary and taxonomic significance of protein

variation in the brown trout (Salmo trutta L.) and other salmonid fishes. In Protein Polymorphism: Adaptive and Taxonomic Significance, Vol. 24 (Oxvord, G. S. & Rollinson, D., eds) London: Academic Press, pp. 84-99.

Ferguson, A., Mason F. M. 1981. Allozyme evidence for reproductively isolated sympatric populations of brown trout Salmo trutta L. in Lough Melvin, Ireland. Journal of Fish Biology, 18: 629-642.

Ferris, S. D., Berg, W. J. 1988. The utility of mitochondrial DNA in fish genetics and fishery managment. V: Population genetics and fishery management. Seattle, Washington press, pp. 277-299.

Fontaine, P. M., Dodson, J. J. 1999. An analysis of the distribution of juvenile Atlantic salmon (Salmo salar) in nature as a function of relatedness using microsatellites. Molecular Ecology, 8: 189-198.

Ford-Lloyd, G. 1996. Measuring genetic variation using molecular markers. University of Brimingham, Kevin Painting, IPGRI, Rome.

Frankel, O. H. 1970. Sir William Macleay memorial lecture 1970. Variation - the essence

of life. Proceedings of the Linneana Society of New South Wales 95: 158-169. Frankel, O. H. 1974. Genetic conservation: our evolutionary responsibility. Genetics, 78:

53-65. Frankel, O. H., Soulé, M. E. 1981. Conservation and evolution. Cambridge University

Press, Cambridge, pp. 327. Garcia-Marin, J. L., Jorde, P. E., Ryman, N., Utter, F., Pla, C. 1991. Management

implications of genetic differentiation between native and hatchery populations of brown trout (Salmo trutta) in Spain. Aquaculture, 95: 235-249.

Literatura

120

Garcia-Marin, J. L., Pla C. 1996. Origins and relationships of native populations of brown trout (Salmo trutta) in Spain. Heredity, 76: 313-323.

Garcia-Marin, J. L., Utter, F. M., Pla, C. 1999. Postglacial colonization of brown trout in Europe based on distribution of allozyme variants. Heredity, 82: 46-56.

Gavrilović, LJ., Dukić, D. 2002. Reke Srbije. Zavod za uđžbenike i nastavna sredstva. Beograd.

Gillham, W. N. 1994. Organelle genome organization and gene content. V: Organelle

genes and genomes. New York, Oxford University Press: 50-91.

Giuffra, E., Bernatchez, L., Guyomard, R. 1994. Mitochondrial control region and protein coding genes sequence variation among phenotypic forms of brown trout Salmo trutta from Northern Italy. Molecular Ecology, 3: 161-172.

Giuffra, E., Guyomard, R., Forneris, G. 1996. Phylogenetic relationships and introgression patterns between incipient parapatric species of Italian brown trout (Salmo trutta L. complex). Molecular Ecology, 5: 207-220.

Glenn, T. C. 1995. Microsatellite manual, Version 6, Unpubished manuscript, FTP: onyx.si.edu/protocols/msatmanV#rtf

Goldstein, D. B., Pollock, D. D. 1997. Launching microsatellites: A review of mutation

processes and methods of phylogenetic inference. The Journal of Heredity, 88: 335-342.

Goldstein, D. B., Schlötterer, C. 1998. Microsatellites. Evolution and Applications. Oxford University Press, Oxford, pp. 352.

Gorjanović – Kramberger, D. 1891. Paleoihtioložki pilozi III. Rad Jugoslovenske Akademije Znanosti i Umjetnosti, Zagreb, 106: 59-129.

Grozdanović - Radovanović, J. 2000. Citologija. Zavod za udžbenike i nastavna sredstva,

Beograd. Guyomard, R., Krieg, F. 1983. Electrophoretic variation in six populations of brown trout

(Salmo trutta L.). Canadian Journal of Genetics and Cytology, 25: 403-413. Gyllensten, U., Wilson, A. C. 1988. Mitochondrial DNA of salmonids. V: Population

genetics and fishery management. Seattle, Washington press, pp. 301-317. Hamilton, K. E., Ferguson, A., Taggart, J. B., Tomasson, T., Walker, A., Fahy, E. 1989.

Post-glacial colonization of brown trout, Salmo trutta L.: Ldh-5 as a phylogeographical marker locus. Journal of Fish Biology, 35: 651-664.

Hansen, M. M., Loeschcke, V. 1994. Effects of releasing hatchery-reared brown trout to

wild trout populations. In Loeschcke, V., Tomiuk, J. & Jain, S. K. (eds.). Conservation Genetics. Birkhäuser Verlag, Basel. pp. 273-289

Literatura

121

Hansen, M. M., Loeschcke, V., Rasmussen, G., Simonsen, V. 1993. Genetic differentiation among Danish brown trout (Salmo trutta) populations. Hereditas, 118: 177-185.

Hansen, M. M., Nielsen, E. E., Mensberg, K.-L.D. 1997. The problem of sampling families rather than populations: Relatedness among individuals in samples of juvenile brown trout (Salmo trutta L.). Molecular Ecology, 6: 469-474.

Hansen, M. M., Ruzzante, D. E., Nielsen, E. E., Mensberg, K-L. D. 2000. Microsatellite and mitochondrial DNA polymorphism reveals life – history dependent interbreeding between hatchery and wild brown trout (Salmo trutta L.) Molecular Ecology., 9: 583-594.

Harrison, R. G. 1989. Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in population and

evotutionary biology. Trends in Ecology and Evolution, 4: 6-11. Hearne, C. M., Ghosh, S., Todd, J. A. 1992. Microsatellites for linkage of genetic analysis

of genetic traits. Trends in Genetics, 8: 288-294. Hennig, W. 1966. Phylogenetic systematics. Univ. Illinois Pres, Urbana, pp. 263. Hewitt, G. M. 1993. Post - glacial distribution and species substructure: lessons from

pollen, insects and hybrid zones. In: Evolutionary Patterns and Processes, 97-123. Linnean Society Symposium Series 14. Lees, D. R. & Edwards, D. (Eds.). Academic Press, London.

Hewitt, G. M. 1996. Some genetic consequences of ice ages, and their role in divergence and speciation. Biological Journal of Linnean Society, 58: 274-276.

Hewitt, G. M. 1999. Post-glacial re-colonization of European biota. Biological Journal of Linnean Society, 68: 87-112.

Hewitt, G. M. 2001. Speciation, hybrid zones and phylogeography – or seeing genes in space and time. Molecular Ecology, 10: 537-549.

Hindar, K., Jonsson, B., Ryman, N., Ståhl, G. 1991. Genetic relationships among landlocked, resident, and anadromous brown trout, Salmo trutta L. Heredity, 66: 83-91.

Hindar, K., Ryman, N., Utter, F. M. 1991a. Genetic effects of cultured fish on natural fish populations. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Science, 48: 945-957.

Hoeh, W.R., Blakley, K. H., Brown, W. M. 1991. Heteroplasmy suggests limited

biparental inheritance of Mytilis mitochondrial DNA. Science, 251: 1488-1490. Hsü, K. 1978. When the Black sea was drained. Scientific American, 238: 52-63.

Hsü, K., Montadert, L., Bernouilli. D., Cita, M. B., Erikson, A., Garrison, R. E., Kidd, R. B., Melieres, F., Müller, C., Wright, R. 1977. History of the Mediterranean salinity crisis. Nature, 267: 399-403.

Literatura

122

Hynes, R. A., Ferguson, A., McCann, M. A. 1996. Variation in mitochondrial DNA and post-glacial colonisation of north-west Europe by brown trout (Salmo trutta L.). Journal of Fish Biology, 48: 4-67.

ITIS, 2004. Integrated taxonomic information system. Smithsonian Institution, Washington D. C. www.itis.usda.gov

Jevtić, J. 1989. Ribarstvo. Praktikum. Naučna knjiga, Beograd. Johnson, G. D. C., & Patterson, C. 1996. Relationshipses of lower euteleostean fishes. In:

Interrelations of Fishes. Stiassny , M. L. J., L. R. Parenti, G. D. Johnson (eds.). Academic Press, San Diego pp. 251-332.

Jug, T. 2002. Genetska raznolikost soške postrvi (Salmo marmoratus) v Sloveniji.

Magistarsko delo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani. Karakousis, Y., Triantaphyllidis, C. 1990. Genetic structure and differentiation among

Greek brown trout (Salmo trutta L.) populations. Heredity, 64: 297-304. Karaman, S. 1924. Pisces Macedoniae. Derzeit am institut Z. Erforschung und

Beksampfung D. Malaria, Trogir (Dalmatien) Split. Karaman, S. 1937. Beitrag zur Kenntnis der Süsswasserfische Jugoslaviens. Glasnik

Skopskog naučnog društva, 18: 131-139. Keith, P. 1998. Evolution des peuplements ichtyologiques de France et stratégies de

conservation. Ph. D. diss., Université de Rennes I, France. Kendall, A. W., Behnke, R. J. 1984. Salmonidae: developments and relationships. In

Ontogeny and Systematics of Fishes (Moser, H. G., ed.) American Society of Ichthiologysts and Herpetologists Spetial Publikation, 1: 142-149.

Klykanov, V. A. 1975. Systematic interrelations of the smelts of genera Osmerus

Hypomesus of family Osmeridae. Ichthyologia, 7 (I): 31-40. Kolombatović, G. 1890. Notizie ittiologiche. Glasnik prirodnjačkog društva, Zagreb.

Kottelat, M. 1997. European freshwater fishes. An heuristic checklist of the freshwater fishes of Europe (exclusive of former USSR), with an introduction for non-systematists and comments on nomenclature and conservation. Biologia, Section Zoology 52 Suppl. 5: 1-271.

Krieg, F., Guyomard, R. 1985. Population genetics of French brown trout (Salmo trutta L.): large geographical differentiation of wild populations and high similarity of domesticated stocks. Génétique, Sélection et Evolution, 17: 225-242.

Kryštufek B., Reed J. M. 2004. Pattern andProcess in Balakn Biodiversity - an Overview, in:. Griffiths H.I., Kryštufek B., Reed J.M. (Ed), Balkan Biodiversity, Pattern and Process in the European Hotspot, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 203-217.

Literatura

123

Kumar, S. Tamura, K. Nei, M. 2004. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics, 5: 2 150-164.

Lagler, K. F. 1977. Freshwater fishery biology. Dubuque, WM. C. Brown Company

Publishers, pp.19-35. Laikre, L., Antunes, A., Apostolidis, A., Berrebi, P., Duguid, A., Ferguson, A., Garcia –

Marin, J. L., Guyomard, R., Hansen, M. M., Hindar, K., Koljonen, M. – L., Largiader, C., Martinez, P., Nielsen, E. E., Palm, S., Ruzzante, D. E., Ryman, N., Trianthaphyllidis, C. 1999. Conservation genetic management of brown trout (Salmo trutta) in Europe. Report by the concerted action on identification, management and exploitation of genetic resources in the brown trout (Salmo trutta), "TROUTCONCERT"; EU FAIR CT97-3882. Silkeborg, Danmarks fiskeriundersrgelser: pp. 91.

Laikre, L., Ryman, N. 1996. Effects on intraspecific biodiversity from harvesting and

enhancing natural populations. Ambio, 25: 504-509.

Largiadèr, C. R., Scholl, A. 1996. Genetic introgression between native and introduced brown trout (Salmo trutta L.) populations in The Rhône River Basin. Molecular Ecology, 5: 417-426.

Leary, R. F., Allendorf, F. W., Forbes, S. H. 1993. Conservation genetics and bull trout in the Columbia and Klamath River drainages. Conservation Biology, 7: 856-865.

Leidy, R. A., Moyle, P. B. 1998. Conservation status of the world's fish fauna: an

overview. In Fiedler, P.L. and Kareiva, P.M. (eds.). Conservation Biology for the coming decade. Second edition. Chapman & Hall, International Thomson Publishing, USA, pp. 187-227.

Lewin, B. 2000. Genus VII. Oxsfod University Press, University of Oxsfod, Oxsfod,

United Kindom. Lewontin, R. C. 1974. The genetic basis of evolutionary change. Columbia University

Press, New York. Li, W. H., Grauer, D. 1991. Fundamentals of Molecular Evolution. Sinauer Associates,

Sunderland, MA. Lightowlers, R. N., Chinnera, P. F., Turnbull, D. M., Howell, N. 1997. Mammalian

mitochondrial genetics: heredity, heteroplasmy and disease. Trends in genetics, 13: 450-455.

Lopez, J. V., Culver, M., Stephens, J. C., Johnson, W. E., O'Brien, S. J. 1997. Rates of

nuclear and cytoplasmic mitochondrial DNA sequence divergence in mammals. Molecular Biology and Evolution., 14: 277-286.

Maitland, P. S. 1995. The conservation of freshwater fish: past and present experience.

Biological Conservation, 72: 259-270.

Literatura

124

Marić, S. 2002. Morfološka varijabilnost pastrmki (subfamilia Salmoninae) – značaj za biološku konzervaciju. Magistarski rad, Biološki fakultet, Univerziteta u Beogradu.

Marić, S., Hegediš, A., Nikolić, V., Simonović, P. 2004. Conservation status of two

eastern Balkan endemic fish species in Serbia and a proposal for their protection. Acta Zoologica Bulgarica 56 (2): 213-222.

Marshall, T. C., Slate, J., Kruuk, L. B., Pemberton, J. B. 1998. Statistical confidence for likelihood-based paternity inference in natural populations. Molecular Ecology, 7: 639-655.

Martin, A. P. 1999. Substitution rates of organelle and nuclear genes in sharks: implicating metabolic rate. Molecular Biology and Evolution., 16: 996-1002.

May, B. 1992. Starch gel electrophoresis of allozymes. In Hoelzel, A.R. (ed.). Molecular Genetic Analysis of Populations. A Practical Approach. IRL Press, Oxford, pp. 1-27.

McKay, S. J., Devlin, R. H., Smith, M. J. 1996. Phylogeny of Pacific salmon and trout based on growth hormone type-2 and mitohondrial NADH dehydrogenase subunit 3 DNA sequences. Canadian Journal of Fisheries and Aqatic Sciences, 53: 1156-1176.

McKenzie, J. A., Oberhansli, H. 1985. Paleoceanography expressions of the Messinian

salinity crisis, p. 99 – 123. In Hsü, K., Weissert, H. J. (eds), South Atlantic Paleoceanography. Cambridge University Press, Cambridge.

Meffe, G. K. 1986. Conservation genetics and the management of endangered fishes.

Fisheries, 11: 14-23. Miller, L. M., Kapuscinski, A. R. 1996. Microsatellite DNA Markers Reveal New Levels

of Genetic Variatio in Northen Pike. Transactions of the American Fisheries Society, 125: 971-977.

Miller, L. M., Kapuscinski, A. R. 1997. Historical analysis of genetic variation reveals low effective population size in a northern pike (Esox lucius) population. Genetics, 147: 1249-1258.

Mitrović, J., Pavlović, M. 1980. Paleozoogeorafija. Rudarsko geološki fakultet – OOUR Grupa za regionalnu geologiju i paleontologiju. Beograd.

Montoya, J., Gaines, G. L., Attardi, G. 1983. The pattern of transcription of the human

mitochondrial rRNA genes reveals two overlapping transcription units. Cell, 34: 151-159.

Morán, P., Pendás, A. M., García-Vásquez, E., Izquierdo, J. I., Lobon-Cervia, J. 1995.

Estimates of gene flow among neighbouring populations of brown trout. Journal of Fish Biology, 46: 93-602.

Literatura

125

Moritz, C. 1994. Applications of mitochondrial DNA analysis in the conservation: a critical review. Molecular Ecology, 3: 401-411.

Moritz, C. 1995. Uses of molecular phylogenies for conservation. Philosophical

Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences, 349: 113-118.

Moritz, C. 1999. Conservation units and translocations: strategies for conserving

evolutionary processes. Hereditas, 130: 217-228. Moritz, C., Dowling, T. E., Brown, W. M. (1987). Evolution of animal mitochondrial

DNA: relevance for population biology and systematics. Annual Review of Ecology and Systematics, 18: 269-292.

Moritz, C., Hillis, D. M. 1996. Molecular Systematics: Context and Controversis. V:

Molecular systematics. Sunderland, Sinauer, pp. 1-13.

Morizot, D. C., Schmidt, M. E. 1990. Starch gel electrophoresis and histochemical visualization of proteins. In Whitmore, D.H. (ed.). Electrophoretic and Isoelectric Focusing Techniques in Fishery Management. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, pp. 23-80.

Murphy, R. W., Sites, J. W., Buth, D. G., Haufler, C. H. 1996. Proteins: Isozyme electrophoresis. V: Molecular systematics. Sunderland, Sinauer, pp. 51-120.

Neave, F. 1958. The origin and speciation of Oncorhynchus. Transaction of the Royal

Society of Canada, Series 3, 52, (5): 25-49. Nei, M., Maruyama, T., Chakraborty, R. 1975. The bottleneck effect and genetic

variability in populations. Evolution, 29: 1-10. Nelsen, J. S. 1984. Fishes of the world. Wiley, New York. Nesbo, C. L., Fossheim, T., Vollestad, L. A., Jakobsen, K. S. 1999. Genetic divergence

and phylogeographic relationships among European perch (Perca fluviatilis) populations reflect glacial refugia and postglcial colonization. Molecular Ecology, 8: 1387-1404.

Nielsen, E. E., Hansen, M. M., Loeschcke, V. 1997. Analysis of microsatellite DNA from old scale samples of Atlantic salmon: A comparison of genetic composition over sixty years. Molecular Ecology, 6: 487-492.

Nielsen, E. E., Hansen, M. M., Loeschcke, V. 1999a. Genetic variation in time and space: Microsatellite analysis of extinct and extant populations of Atlantic salmon. Evolution, 53: 261-268.

Nielsen, E. E., Hansen, M. M., Loeschcke, V. 1999b. Analysis of DNA from old scale samples: Technical aspects, applications and perspectives for conservation. Hereditas, 130: 265-276.

Literatura

126

Nielsen, J. L. (ed.). 1995. Evolution and the aquatic ecosystem: defining unique units in population conservation. American Fisheries Society Symposium 17, pp. 435.

Nilsson, J., Gross, R., Asplund, T., Dove, O., Jansson, H., Kelloniemi, J., Kohlmann, K., Löytynoja, A., Nielsen, E. E., Paaver, T., Primmer, C. R. Titov, S., Vasemägi, A., Veselov, A., Öst, T., Lumme, J. 2001. Matrilinear phylogeography of atlantic salmon (Salmo salar L.) in Europe and postglacial colonization of Baltic sea area. Molecular Ecology, 10: 89-102.

Norden, C. R. 1961. Comparative osteology of representative salmonide fish with

particular reference to the grayling (Thymallus arcticus) and phylogeny. Journal of the Fisheries Research Board of Canada, 18: 679-791.

Oakley, T. H., Phillips, R. B. 1999. Phylogeny of salmonine fishes based on growth

hormone inrons: Atlantic (Salmo) and Pacific (Oncorhynchus) salmon are not sister taxa. Molecular Phylogenetics and Evolution, 11: 381-393.

Ocokoljić, M. 1987. Visinsko zoniraje voda u slivu Velike Morave i neki aspekti njihove

zaštite. Posebna izdanja Srpskog geografskog društva. Sveska 64, Beograd. Odak, T. 2004. Molekularno – biološka obilježja endemske mekousn pastrve

(Salmothymus obtusirostris salontiana). Magistarski rad, Agronomski fakultet, Sveučilišta u Zagrebu.

Oleynik, A. G. 1997 Molecular phylogeny of salmonid fishes: concordance of results

from nuclear and mitohondrial DNA analyses. Genetika, 33: 229-234 (in Russian). Osinov, A. 1984. Zoogeographical origins of brown trout , Salmo trutta (Salmonidae):

data from biochemical genetic markers. Journal of Ichtyology., 24: 10-23. Osinov, A. 1989. Brown trout (Salmo trutta L., Salmonidae) in basins of the Black and

Caspian Seas: A population genetic analysis. Genetika, 24: 1523-1534. Osinov, A. G. 1999. Salmonid fishes of the genera Salmo, Parasalmo, and

Oncorhynchus: genetic divergence, phylogeny, and classification. Journal of Ichtyology, 39: 571-578.

Osinov, A., Bernatchez, L. 1996. Atlantic and Danubean phylogenetic groupings of brown trout (Salmo trutta L.) complex: genetic divergence, evolution, and conservation. Journal of Ichthyology, 36: 762-786.

Oxnard, C. E. 1978. One biologist’s view of morphometrics. Annual Review of Ecology and Systematics, 9: 219-241.

Patarnello, T., Bargelloni, L., Caldara, F., Colombo, L. 1994. Cytohrome b and 16 rRNA

sequence variation in the Salmo trutta (Salmonidae, Teleostei) species coplex. Molecular Phylogenetics and Evolution, 3: 69-74.

Pažur, K. 1969. Divovske pastrve u jezeru Lokvare. Ribarstvo Jugoslavije, God. XXIV, 2,

Zagreb.

Literatura

127

Phillips, R. B., Matsuoka, M. P., Konon, I., Reed, K. M. 2000. Phylogenetic analysis of mitochondrial and nuclear sequences supports inclusion of Acantholingua ochridana in the genus Salmo. Copeia, 2: 546-550.

Phillips, R. B., Oakley, T. H. 1997. Phylogenetics relationships among the Salmoninae

based on nuklear and mitochondrial DNA sequences. In Molecular Systemaatics of Fishes (Kocher, T. D. & Stepien, C. A.; eds), Academic Prees, San Diego pp. 145-162.

Phillips, R. B., Plate, K. A. 1991. Nuklear DNA and salmonid phylogenetics. Journal of

Fish Biology, 39 (Suppl. A): 259-275. Pielou, E. C. 1979. Biogeography. Wiley, New York, pp. 351.

Poteaux, C., Beaudou, D., Berrebi, P. 1998. Temporal variations of genetic introgression in stocked brown trout populations. Journal of Fish Biology 53: 701-713.

Poteaux, C., Bonhomme, F., Berrebi, P. 1999. Microsatellite polymorphism and genetic impact of restocking in Mediterranean brown trout (Salmo trutta L.). Heredity, 82: 645-653.

Povž, M., Jesenšek, D., Berrebi, P., Crivelli, A. J. 1996. Soška postrv Salmo trutta

marmoratus, Cuvier 1817, v porečju Soče v Sloveniji. Arles, Tour du Valat, pp. 65.

Povž, M., Sket, B. 1990. Naše sladkovodne ribe. Mladinska knjiga, Ljubljana, pp 85-86. Queller, D. C., Strassmann, J. E., Hughes, C. R. 1993. Microsatellites and kinship. Trends

in Ecology and Evolution., 8: 258-288. Rabrenović, D., Knežević, S., Rundić, Lj. 2003. Istorijska geologija. Rudarsko – Geološki

fakultet Univerziteta u Beogradu, Beograd. Rage, J. C. 1997. Palaeobiological and palaeogeographical background of the European

herpetofauna. In: Atlas of Amphibians and Reptiles in Europe. Gasc, J. - P., Cabela, A., Crnobrnja - Isailović, J., Dolmen, D., Grossenbacher, K., Haffner, P., Lescure, J., Martens, H., Martinez Rica, J. P., Maurin, H., Oliveira, M. E., Sofianidou, T. S., Veith, M. & Zuiderwijk, A. (Eds.). Paris: Societas Europaea Herpetologica and Museum National d'Histoire Naturelle, pp. 23-27.

Rage, J. C., Roček, Z. 2003. Evolution of Anuran assemblages in the Tertiary and

Quaternary of Europe, in the context of palaeoclimate and palaeogeography. Amphibia-Reptilia, 24: 133-167.

Riffel, M., Storch, V., Schreiber, A. 1995. Allozyme variability of brown trout (Salmo trutta L.) populations across the Rhenanian-Danubian watershed in southwest Germany. Heredity, 74: 241-249.

Literatura

128

Rögl, F., Steininger, F. F. 1983. Vom Zerfall der Tethys zu Mediterran und Paratethys. Die neogene Paläogeographie und Palinspastik der zirkum - mediterranen Raumes. Annalen des Naturhistorischen Museum Wien A 85, 135-163.

Roy, K., Valentine, J. W., Jablonski, D., Kidwell, S. M. 1996. Scales of climatic

variability and time averaging in Pleistocene biotas: implications for ecology and evolution. Trends in Ecology and Evolution, 11: 458-453.

Ryder, O. A. 1986. Species conservation and systematics: the dilemma of subspecies.

Trends in Ecology and Evolution, 1: 9-10.

Ryman, N. 1983. Patterns of distribution of biochemical genetic variation in salmonids: differences between species. Aquaculture, 33: 1-21.

Ryman, N. 1991. Conservation genetics considerations in fishery management. Journal of Fish Biology, 39 (Supplement A): 211 - 224.

Ryman, N., Allendorf, F. W., Stähl, G. 1979. Reproductive isolation with little genetic

divergence in sympatric populations of brown trout (Salmo trutta). Genetics, 92: 247-262.

Ryman, N., Jorde, P. E., Laikre, L. 1995. Supportive breeding and variance effective

population size. Conservation Biology, 9: 1619-1628. Ryman, N., Ståhl, G. 1980. Genetic changes in hatchery stocks of brown trout (Salmo

trutta). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 37: 82-87. Ryman, N., Utter, F. (eds.). 1987. Population Genetics and Fishery Management.

Washington Sea Grant Publications/University of Washington Press, Seattle and London, pp. 420.

Ryman, N., Utter, F., Laikre, L. 1995a. Protection of intraspecific biodiversity of

exploited fishes. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 5: 417-446. Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K. B., Horn, G. T., Erlich, H. A., Arnheim, N.

1988. Enzymatic amplification of b – globin genomic sequences and restriction site analysa for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 4: 1350-1354.

Saunders, R. L., Schom, C. B. 1985. Importance of the variation in the life history

parameters of atlantic salmon (Salmo salar). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciencis, 42: 625-618.

Schlötterer, C. 1998. Genome evolution: Are microsatellites really simple sequences?.

Current Biology, 8: 132-134

Schmidt, D. Y. 1947. Migrations of Fishes. USSR Academy of Sciences, Leningrad. Schneider, S. Roessli, D. Excoffier, L. 2000. Arlequin: A software for population genetics

data analysis. Ver 2.000. Genetics and Biometry Lab, Dept. of Anthropology, University of Geneva.

Literatura

129

Shaposhnikova, G. Ch. 1975. Systematic relation of some representatives of the family Salmonidae. - Ichthyologia, Vol. 7, No. 1, 61-70.

Shed'ko, S. V., Ginatulina, L. K., Parpura, I. Z., Ermolenko, A. V. 1996. Evolutionary and

taxonomic relationships among Far-Eastern salmonid fishes inferred from mitichondrial DNA divergence. Journal of Fish Biology, 49: 815-829.

Shedlock, A. M., Parker, J. D., Crispin, D. A., pietsch, T. W., Burmer, G. C. 1992.

Evolution of the salmonid mitochondrial control region. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1: 179-192.

Smith, S. R. 1992. Introgression in fishes: significance for paleontology, cladistics, and

evolutionary rates. Systematic Biology, 41: 41-57. Snoj, A. 1997. Molekularno biološka karakterizacija soške postrvi (Salmo marmoratus,

Cuvier 1817). Doktorska disertacija, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani. Snoj, A. 2003. Molecular phylogeny of «arhaic trouts» and their taxonomic classification.

3rd congress of the genetics society of Slovenija, Bled. Zbornik sažetaka, pp. 73-74.

Snoj, A. 2004. Filogenetska struktura postrvi (Salmo trutta L.) v Sloveniji. Ribič, Glasilo

Slovenskog ribištva. Ribiška sveza Slovenije, 10: 239-243. Snoj, A., Jug, T., Melkič,. E., Sušnik, S., Pohar, J., Dovč,. P., Budihna, N. 2000.

Mitochondrial and mirosatellite DNA analysis of marble trout in Slovenia. Journal of Fish Biology (Quaderni ETP), 29: 5-11.

Snoj, A., Melkič,. E., Sušnik, S., Muhamedagić, S., Dovč, P. 2002. DNA phylogeny

supports revised classification of Salmothymus obtusirostris. Biological Journal of the Linnean Society, 77: 399-411.

Snoj, A., Pohar, J., Dovč, P. 1997. The first microsatellite DNA marker for marble trout,

BFRO001. Journal of Animal Science, 75: 1983. Stalling, R. L., Ford, A. F., Nelson, D., Torney, D. C., Hildebrand, C. E., Moyzis, R. K.

1991. Evolution and distribution of (GT)n repetitive sequences in Mammalian genomes. Genomics, 10: 807-815.

Stearley, R. F., Smith, G. R. 1993. Phylogeny of the Pacific trouts and salmons

(Oncorhynchus) and genera of the family Salmonidae. Transactions of the American Fisheries Society, 122: 122 - 133.

Stevanović, M. P. 1982. Istorijska geologija. Rudarsko – Geološki fakultet Univerziteta u

Beogradu, Beograd. Strauss, R. E., Bookstein F. L. 1982. The truss: body form reconstructions in

morphometrics. Systematic Zoology, 31: 113-135.

Literatura

130

Suárez J., Bautista J. M., Almodóvar A., Machordom A. 2001. Evolution of mitochondrial control region in Palaeartic brown trout (Salmo trutta) populations: the biogeographical role of the Iberian Peninsula. Heredity, 87: 198-206.

Sušnik, S. 2001. Polimorfizem kromosomske in mitohondrijske DNA lipana (Thymallus

thymallus) in filogenetski odnosi med njegovimi geografsko ločenimi populacijami. Doktorska disertacija, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani.

Sušnik, S., Schöffman, J., Snoj, A. 2004. Phylogenetic position of Salmo (Platisalmo)

platicephalus Behnke 1968 from south – central Turkey, evidenced by genetic data. Journal of Fish Biology, 64: 947-960.

Sušnik, S., Schöffman, J., Weiss, S. 2005. Genetic verification of native brown trout fom

the Persian Gulf (Catak Cay River, Tigris basin). Journal of Fish Biology, 66: 1-6. Sušnik, S., Snoj, A., Pohar, J., Dovč, P. 1997 The microsatellite marker (BFRO 002)

characteristic for different geographically remote brown trout, Salmo trutta L., population. Animal Genetics, 28, 5: 372.

Swofford, D. L. 2000. PAUP*, b-VERSION 4.0. Sunderland, MA: Sinauer. Taberlet, P., Fumagalli, L., Wust - Saucy, A. - G., Cosson, J. - F. 1998. Comparative

phylogeography and postglacial colonization routes in Europe. Molecular Ecology, 7: 453-464.

Tautz, D. 1989. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic

DNA markers. Nucleic Acid Research, 17: 6463-6471. Tautz, D. 1993. Notes on the definition and nomenclature of tandemly repetitive DNA

sequences. V: DNA fingerprinting: State of the science. Basel, Birkhäuser Verlag, pp. 21-28.

Tautz, D., Trick, M., Dover, G. A. 1986. Cryptic simplicicity in DNA is a major source of

genetic variation. Nature, 322: 652-656. Taylor, E. B. 1991. A review of local adaptation in Salmonidae, with particular reference

to Pacific and Atlantic salmon. Aquaculture, 98: 185-207. Taylor, E. B., Pollard, S., Louie, D. 1999. Mitochondrial DNA variation in bull trout

(Salvelinus confluentus) from northwestern North America: implications for zoogeography and conservation. Molecular Ecology, 8: 1155-1170.

Templeton, A. R. 2004. Using haplotype trees for phylogeographic and species inference

in fish populations. Environmental Biology of Fishes, 69: 7-20.

Tessier, N., Bernatchez, L. 1999. Stability of population structure and genetic diversity across generations assessed by microsatellites among sympatric populations of landlocked Atlantic salmon (Salmo salar L.). Molecular Ecology, 8: 169-179.

Literatura

131

Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. 1997. The Clustal_X windows interface: flexibile strategies for multiple sequence aligment aided by quality analysis tools. Nucleic Acid Research, 25, 24: 4876-4882.

Thunell, R. C., Williams, D. F. 1983. Paleotemperature and paleosalinity history of the

eastern Mediterranean during the Late Quaternary. Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology, 44: 23-39.

Tomkinson, A. E., Linn, S. 1986. Purification and properties of a strand specific endonuclease from mouse cell mitochondria. Nucleic Acid Research, 14: 9579-9593.

Utter, F. M. 1981. Biological criteria for definition of species and distinct intraspecific

populations and salmonids under the U.S. Endangered Species Act of 1973. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 38: 1626-1635.

Utter, F., Aebersold, P., Winans, G. 1987. Interpreting genetic variation detected by electrophoresis. In Ryman, N. and Utter, F. (eds.) Population Genetics and Fishery Management. Washington Sea Grant Program/University of Washington Press, Seattle, USA.

Villinger, E. 1986. Untersuchungen zur Flussgeschichte von Aare-Donau/Alpenrhein und zur Entwicklung des Malm-Karts in Su¨dwestdeutschland. Germany.

Vladimirov, V. I. 1944. Brook from of Sevan trout: Salmo ischchan Kessler morpha

alabalach nova. Izv Akademy Nauk Arm. SSR, 3: 61-72. Vladimirov, V. I. 1948. Brook trout in Armenia and its relationship to other

representatives of the Salmo genus. Transactions sevan Gigrobiology Stantsii., 10: 87-178.

Vladykov, V. D. 1963. A review of salmonid genera and their broad geographical distribution. Transaction of the Royal Society of Canada, Series IV, Section III, 1: 459-504.

Vollestad, L. A., Hindar, K. 1997. Developmental stability and environmental stress in

Salmo salar (Atlantic salmon). Heredity, 78: 215-222. Vuković, T., Ivanović, B. 1971. Slatkovodne ribe Jugoslavije. Zemaljski muzej BIH,

Sarajevo. Waples, R. S. 1991. Genetic interactions between hatchery and wild salmonids - lessons

from the Pacific Northwest. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 48 (Suppl. 1): 124-133.

Waples, R. S. 1991a. Pacific salmon, Oncorhynchus spp., and the definition of "species"

under the Endangered species Act. US National Marien Fisheries Service, Marine Fisheries Review, 53: 11-22.

Waples, R. S. 1995. Evolutionary significant units and the conservation of biological

diversity under the endangered species act. American Fisheries Society Symposium, 17: 8-27.

Literatura

132

Weiss, S., Antunes, A., Schlötterer, C., Alexandrino, P. 2000. Mitochondrial haplotype diversity among Portuguese brown trout Salmo trutta L. populations: relevance to the post-Pleistocene recolonization of northern Europe. Molecular Ecology, 9: 691-698.

Weiss, S., Schlötterer, C., Waidbacher, H., Jungwirth, M. 2001. Haplotype (mtDNA) diversity of brown trout Salmo trutta in tributaries of the Austrian Danube: massive introgresion of Atlantic basin fish – by man or nature. Molecular Ecology, 10: 1241-1246.

Weissenbach, J., Gypapy, G., Dib, C., Vignal, A., Morissette, J., Millasseau, P., Vaysseix,

G., Lathrop, M. 1992. A second-generation linkage map of the human genome. Nature, 359: 794-801.

Wheeler, A. 1992. Freshwater fishes of Britain and Europe. Rainbow Books, London, pp.

54-55. Zhang, D.-X., Hewitt, G. M. 2003. Nuclear DNA analyses in genetic studies of

populations: practice, problems and prospects. Molecular Ecology, 12: 563-584.