8/8/2019 Evaluation of Leptospirillum ferrooxidans

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V o l . 5 8 , N o . 1P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , J a n . 1 9 9 2 , p . 8 5 - 9 20 0 9 9 - 2 2 4 0 / 9 2 / 0 1 0 0 8 5 - 0 8 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 9 2 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

E v a l u a t i o n o f L e p t o s p i r i l l u m f e r r o o x i d a n s f o r L e a c h i n gWOLFGANG SAND,* KA T R I N ROHDE, BIRGIT SO BO TKE , AND CLAUS ZENNECKM i k r o b i o l o g i e , U n i v e r s i t a t H a m b u r g , O h n h o r s t s t r a s s e 1 8 , D - 2 0 0 0 Hamburg 5 2 , Germany

R e c e i v e d 2 9 A p r i l 1 9 9 1 / A c c e p t e d 1 5 O c t o b e r 1 9 9 1T h e i m p o r t a n c e o f L e p t o s p i r i U l u m f e r r o o x i d a n s f o r l e a c h processes h a s b e e n e v a l u a t e d b y s t u d y i n g t h el i t h o t r o p h i c f l o r a o f t h r e e m i n e b i o t o p e s a n d a h e a p l e a c h i n g o p e r a t i o n , b y p e r c o l a t i o n e x p e r i m e n t s w i t hi n o c u l a t e d , s t e r i l i z e d ore, a n d b y m o r p h o l o g i c a l , p h y s i o l o g i c a l , an d g e n et i c i n v es t i g a t i on s o f pure an d mixedc u l t u r e s o f L . f e r r o o x i d a n s , T h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s , and T h io b a c i ll u s t h i o ox i d a n s . I n b i o t o p e s o f 2 0 C ora b o v e , L e p t o s p i r i l l u m - l i k e b a c t e r i a are as a b u n d a n t as T . f e r r o o x i d a n s . L e p t o s p i r i l l i r e p r e s e n t a t l e a s t o n e - h a l fo f t h e f e r r o u s - i r o n - o x i d i z i n g p o p u l a t i o n . P e r c o l a t i o n e x p e r i m e n t s c o n f i r m e d t h i s r e s u l t . L e p t o s p i r i l l i were as

n ume ro us as T . f e r r o o x i d a n s . A t r e d u c e d t e m p e r a t u r e s , t h e g e n e r a t i o n t i m e s o f l e p t o s p i r i l l i i n c r e a s e more sot h a n t h o s e o f T . f e r r o o x i d a n s . A t 1 4 C , L e p t o s p i r i l l u m grows s l o w l y a n d T . f e r r o o x i d a n s d o m i n a t e s t h e p o p u l a t i o n .P h y s i o l o g i c a l i n v e s t i g a t i o n s i n d i c a t e t h a t L . f e r r o o x i d a n s i s a s t r i c t c h e m o l i t h o a u t o t r o p h , m e t a b o l i z i n g o n l yf e r r ou s i r on a n d p y r i t e . E v e n an a d d i t i o n o f 0 . 0 5 % ( w t / v o l ) y e a s t e x t r a c t i n h i b i t e d i t s g r o w t h . The maximumf e r r o u s - i r o n - o x i d i z i n g a c t i v i t y o f L . f e r r o o x i d a n s amounts t o a b o u t 40% o f t h e a c t i v i t y o f T . f e r r o o x i d a n s . A f t e rg r o w t h on s u l f i d i c ore, b o t h s p e c i e s e x h i b i t r e d u c e d i r o n - o x i d i z i n g a c t i v i t i e s , L . f e r r o o x i d a n s e x h i b i t i n g o n e - t h i r da n d T . f e r r o o x i d a n s e x h i b i t i n g o n e- s e v e n t h o f t h e i r maximum a c t i v i t i e s . S u r p r i s i n g l y , t h e a b s o l u t e v a l u e s ares i m i l a r . F o r i n d i r e c t l e a c h i n g , L . f e r r o o x i d a n s i s as i m p o r t a n t as T . f e r r o ox i da n s . T h i s was c o n f i r m e d b y t h er e s u l t s o f p e r c o l a t i o n e x p e r i m e n t s . L . f e r r o o x i d a n s t o g e t h e r w i t h T . t h i o o x i d a n s m o b i l i z e d m e t a l s a t l e a s t as w e l las T . f e r r o o x i d a n s d i d . T h e b e s t r e s u l t s were o b t a i n e d w i t h a m i x e d c u l t u r e o f a l l t h r e e s p e c i e s .

V a r i o u s a c i d o p h i l i c i r o n - a n d / o r s u l f u r - o x i d i z i n g b a c t e r i aa r e r e s p o n s i b l e f o r t h e o x i d a t i o n o f m i n e r a l s u l f i d e s i n l e a c hb i o t o p e s . A t a m b i e n t t e m p e r a t u r e s , t h e m o s t i m p o r t a n tb a c t e r i a a r e T h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s , T h i o b a c i l l u s t h i o o x -i d a n s , a n d L e p t o s p i r i l l u m f e r r o o x i d a n s ( 2 6 ) . T h e i m p o r t a n c eo f t h i o b a c i l l i i s w e l l d o c u m e n t e d ( 6 , 7 , 1 1 , 1 3 , 3 2 ) . Y e a s t s ,f l a g e l l a t e s , m o l d s , a n d c h e m o o r g a n o t r o p h i c b a c t e r i a h a v eb e e n d e t e c t e d i n s u c h h a b i t a t s . H o w e v e r , l i t t l e i n f o r m a t i o ni s a v a i l a b l e o n t h e o c c u r r e n c e o f l e p t o s p i r i l l i i n s u c h e n v i -r o n m e n t s . S i n c e t h e f i r s t r e p o r t o f M a r k o s y a n ( 1 7 ) o n t h ee x i s t e n c e o f a m e s o p h i l i c , v i b r i o i d - s h a p e d , i r o n - o x i d i z i n gb a c t e r i u m t h r i v i n g i n a n e n v i r o n m e n t w h i c h w a s b e l i e v e d t ob e o c c u p i e d e x c l u s i v e l y b y l i t h o t r o p h i c b a c t e r i a o f t h e T .f e r r o o x i d a n s a n d T . t h i o o x i d a n s t y p e , a f e w r e p o r t s o fl e a c h i n g i n v o l v i n g L . f e r r o o x i d a n s h a v e b e e n p u b l i s h e d .U n t i l n o w , o n l y l i m i t e d i n f o r m a t i o n o n t h e i m p o r t a n c e o fL e p t o s p i r i l l u m s p p . i n n a t u r a l h a b i t a t s h a s b e e n a v a i l a b l e .E c o l o g i c a l s t u d i e s a r e m i s s i n g . F u r t h e r m o r e , t h e t a x o n o m i cs t a t u s o f t h e g e n u s L e p t o s p i r i l l u m i s u n c e r t a i n . I n t h e l a t e s te d i t i o n o f B e r g e y ' s M a n u a l , L . f e r r o o x i d a n s i s m e n t i o n e db u t n o t d e s c r i b e d a s a n a c k n o w l e d g e d g e n u s o r s p e c i e s ( 1 4 ) .A v a l i d d e s c r i p t i o n ( b y M a r k o s y a n ) i s s t i l l m i s s i n g .I n t h e p r e s e n t s t u d y , s e v e r a l l e a c h b i o t o p e s , n a m e l y , t h r e em i n e s a n d a d u m p , w e r e e x a m i n e d f o r t h i o b a c i l l i a n dl e p t o s p i r i l l i . P u r e c u l t u r e s o f s e l e c t e d s a m p l e s w e r e p r e -p a r e d . A f t e r c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e b a c t e r i a , l e a c h s t u d i e sw e r e i n i t i a t e d t o e v a l u a t e w h e t h e r l e p t o s p i n r l l i a r e o f i m p o r -t a n c e i n n a t u r a l l e a c h b i o t o p e s .

M A T E R I A L S AND M E T H O D SM i c r o o r g a n i s m s a n d g r o w t h c o n d i t i o n s . T . f e r r o o x i d a n sR l , R 5 , a n d R7 o r i g i n a t e d f r o m s a m p l e s f r o m t h e I l b a m i n ei n n o r t h w e s t R o m a n i a . T . t h i o o x i d a n s R 2 0 was a l s o i s o l a t e df r o m s a m p l e s f r o m t h e I l b a m i n e , a n d s t r a i n s K6 a n d K16* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

o r i g i n a t e d f r o m s e w a g e p i p e l i n e s i n H a m b u r g , G e r m a n y( 2 0 ) . L . f e r r o o x i d a n s R 3 a n d R 3 0 came f r o m t h e I l b a m i n e i nR o m a n i a , w h e r e a s s t r a i n P 3 A w a s i s o l a t e d f r o m a n e n r i c h -m e n t c u l t u r e o b t a i n e d b y D . H a i s c h ( L i m a , P e r u ) .F o r t h e f e r r o u s - i r o n - o x i d i z i n g b a c t e r i a , a n u t r i e n t s o l u t i o nc o n t a i n i n g 5 0 g o f F e S O 4 - 7H20 p e r l i t e r ( a b o u t 1 0 g o ff e r r o u s i o n s p e r l i t e r ) a t a pH o f 1 . 8 w a s u s e d ( 1 6 ) . T h es u l f u r - o x i d i z i n g b a c t e r i a w e r e c u l t i v a t e d i n S 5 medium s u p -p l e m e n t e d w i t h 1% s u l f u r ( 1 2 ) . S t o c k c u l t u r e s w e r e k e p t a t2 8 C i n t h e d a r k f o r 2 m o n t h s a n d t h e n t r a n s f e r r e d i n t o f r e s hm e d i u m ( 1 0 % i n o c u l u m ) . W o r k i n g c u l t u r e s w e r e e i t h e rs t i r r e d a n d a e r a t e d o r s h a k e n v i g o r o u s l y o n a s h a k e r .E n u m e r a t i o n o f o x i d i z e r s o f f e rr o u s i r o n a n d s u l f u r . S a m -p l e s w e r e s u s p e n d e d i n 1 0 0 - m l b o t t l e s c o n t a i n i n g 5 0 m l o fs t e r i l e , a c i d i f i e d t a p w a t e r ( p H 3 ) a n d i n c u b a t e d f o r 2 h o n ar o t a r y s h a k e r a t 2 5 0 r p m ( I n f o r s T R t y p e ) t o d e t a c h c e l l sf r o m t h e s u b s t r a t e s . To g e t r e l i a b l e r e s u l t s f o r t h e L .f e r r o o x i d a n s c e l l c o u n t s , 2 h was p e r m i t t e d f o r d e t a c h m e n tt o o c c u r . P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s h a d shown t h a t t h i s t i m ep e r i o d was n e c e s s a r y t o a c h i e v e a h i g h l e v e l o f c e l l r e c o v e r y ,s i n c e t h e s e c e l l s a d h e r e d m o r e t i g h t l y t o s u r f a c e s t h a n d i dc e l l s o f T . f e r r o o x i d a n s . T h e t u r b i d s u s p e n s i o n was d i l u t e d i n1 0 - f o l d s t e p s t o 1 0 - 8 . L i q u i d s a m p l e s ( f r om t h e r e s e r v o i r o ft h e p e r c o l a t o r o r m i n e w a t e r ) w e r e d i l u t e d i n t h e same w a y .F o r e s t i m a t i n g t h e n u m b e r s o f f e r r o u s - i r o n - o r s u l f u r - o x i d i z -i n g b a c t e r i a , a t h r e e - t u b e m o s t - p r o b a b l e - n u m b e r ( M P N )t e c h n i q u e was a p p l i e d . S i n c e m o s t c e l l s g r o w a t t a c h e d t o o r ep a r t i c l e s , o n l y a f e w c a n b e r e s u s p e n d e d b y known t e c h -n i q u e s a n d , t h u s , a r e a v a i l a b l e f o r c o u n t i n g b y t h e MPNp r o c e d u r e . H e n c e , m o s t MPN c o u n t s p r o v i d e r e l a t i v e c o n -c e n t r a t i o n s o f m i c r o b e s p e r u n i t o f s a m p l e . F o r r e l i a b i l i t y , ac a r e f u l l y s t a n d a r d i z e d p r o c e d u r e i s n e c e s s a r y . F o r f e r r o u s -i r o n o x i d i z e r s , 2 . 5 m l o f medium c o n t a i n i n g 1 0 g o f f e r r o u si o n s p e r l i t e r a t a pH o f 1 . 8 ( 1 6 ) was u s e d , w h e r e a s , f o r s u l f u ro x i d i z e r s , 2 . 5 m l o f m e d i u m w i t h a 1 0 g o f s u l f u r p e r l i t e r a ta pH o f 4 . 5 ( 1 2 ) was u s e d . The i n o c u l a t e d t u b e s were s h a k e nf o r 2 1 d a y s i n t h e d a r k a t 2 8 C . T e s t s f o r T . t h i o o x i d a n s werec o n s i d e r e d t o b e p o s i t i v e i f t h e pH d r o p p e d b e l o w 2 . F o r

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8/8/2019 Evaluation of Leptospirillum ferrooxidans

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A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

e v a l u a t i o n o f T . f e r r o o x i d a n s a n d L . f e r r o o x i d a n s , t h o s et u b e s w e r e c o u n t e d i n w h i c h f e r r i c i r o n f o r m e d a n d m i c r o s -c o p y r e v e a l e d t h e p r e s e n c e o f b a c t e r i a . D i f f e r e n t i a t i o n b e -t w e e n t h e s e t w o i r o n o x i d i z e r s w a s a l s o d e t e r m i n e d b y l i g h tm i c r o s c o p y . T h e h i g h e s t p o s i t i v e d i l u t i o n s t e p s w e r e a n a -l y z e d f o r r o d s ( i n d i c a t i n g T . f e r r o o x i d a n s ) o r c u r v e d a n dv i b r i o i d - s h a p e d c e l l s ( i n d i c a t i n g L . f e r r o o x i d a n s ) . C h e m o o r -g a n o t r o p h i c m i c r o o r g a n i s m s w e r e c o u n t e d b y p l a t i n g o nD E V g e l a t i n a g a r ( f o r b a c t e r i a ) o r S a b o u r a u d m a l t o s e a g a r( f o r f u n g i ) o f M e r c k ( D a r m s t a d t , G e r m a n y ) . D e t a i l s h a v eb e e n d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 8 ) .I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f f e r r o u s - i r o n o x i d i z e r s . T h eh i g h e s t p o s i t i v e d i l u t i o n s t e p s w e r e u s e d f o r p r e p a r a t i o n o fp u r e c u l t u r e s . From t h e s e s a m p l e s , s e r i a l d i l u t i o n s w e r em a d e i n 1 0 - f o l d s t e p s u p t o 1 0 - ' . T h e d i l u t i o n s t e p s w e r er e p e a t e d a t l e a s t e i g h t t i m e s . S e l e c t i o n f o r T . f e r r o o x i d a n swas d o n e b y r e p e a t i n g t h e t r a n s f e r r a p i d l y , b e c a u s e m i c r o s -c o p y h a d s h o w n t h a t t h e g r o w t h o f T . f e r r o o x i d a n s p r e c e d e dt h e g r o w t h o f L . f e r r o o x i d a n s . T h e s e r i e s o f t e s t s w e r ep e r f o r m e d a t t e m p e r a t u r e s b e l o w 2 0 C . A c c o r d i n g l y , s e l e c -t i o n was d o n e f o r L . f e r r o o x i d a n s b y u s i n g a l a t e t r a n s f e r . I na d d i t i o n , t h e i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e w a s r a i s e d a n d t h e pHw a s d e c r e a s e d . T h e p u r i t y o f t h e c u l t u r e s o b t a i n e d w a sc h e c k e d b y l i g h t m i c r o s c o p y d u r i n g e a c h s t a g e o f g r o w t h .F u r t h e r m o r e , c u l t u r e s o f L . f e r r o o x i d a n s w e r e c h ec k e d f o rl a c k o f s u l f u r - o x i d i z i n g c a p a c i t y . S c r e e n i n g f o r h e t e r o t r o -p h i c c o n t a m i n a n t s w a s d o n e b y t w o m e t h o d s , b y u s i n g e i t h e rt h e a b o v e - m e n t i o n e d DEV g e l a t i n a g a r a n d S a b o u r a u d m a l t -o s e a g a r ( M e r c k ) o r t h e A c i d i p h i l i u m m e d i u m ( 8 ) . T h u s ,c o n t a m i n a n t s g r o w i n g w i t h h i g h o r l o w c o n c e n t r a t i o n s o fn u t r i e n t s c o u l d b e d e t e c t e d . I f t h e s e p r o c e d u r e s r e s u l t e d i np u r e c u l t u r e s , c h a r a c t e r i z a t i o n w a s d o n e .F o r t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y , c e l l s w e r e f i x e d i n5% g l u t a r a l d e h y d e i n s o d i u m c a c o d y l a t e b u f f e r ( 2 7 ) a n d t h e nt r e a t e d f o r 4 h w i t h o s m i u m t e t r o x i d e . D e h y d r a t i o n w a s d o n eb y i n c r e a s i n g t h e e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n t o 1 0 0 % . T h e n e x ts t e p i n v o l v e d e m b e d d i n g t h e c e l l s i n E p o n . U l t r a t h i n s e c -t i o n s o f E p o n - e m b e d d e d c e l l s w e r e p l a c e d o n c o p p e r g r i d sa n d t r e a t e d w i t h u r a n i u m a c e t a t e a n d l e a d c i t r a t e . A P h i l i p s2 0 1 e l e c t r o n m i c r os c op e w a s u s e d .T h e g u a n i n e - p l u s - c y t o s i n e ( G + C ) c o n t e n t o f t h e p u r ec u l t u r e s was m e a s u r e d ( 1 8 ) w i t h a G i l f o r d 2 6 0 0 s p e c t r o p h o -t o m e t e r . R e f e r e n c e s w i t h k n o w n G+C c o n t e n t s w e r e E s c h -e r i c h i a c o l i K - 1 2 a n d T . f e r r o o x i d a n s ATCC 2 3 2 7 0 . D e t e r -m i n a t i o n s w e r e r e p e a t e d a t l e a s t t h r e e t i m e s .T e s t s f o r s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y w e r e made w i t h d i f f e r e n to r g a n i c a n d i n o r g a n i c s u b s t r a t e s i n w a s h i n g s o l u t i o n ( 1 6 )s u p p l e m e n t e d w i t h t e s t s u b s t a n c e s . V o l u m e s o f s o l u t i o n ( 5 0m l ) i n 1 0 0 - m l f l a s k s w e r e p l a c e d o n a r o t a r y s h a k e r i n t h ed a r k a t 2 8 C . S u l f u r ( S O , 1 0 g / l i t e r , pH 2 . 0 ) , s u l f i t e ( S O 3 2 - , 5g / l i t e r , pH 4 . 5 ) , p y r i t e ( F e S 2 , 1 0 g / l i t e r , pH 2 . 0 ) , t h i o s u l f a t e( N a 2 S 2 0 3 , 5 g / l i t e r , pH 4 . 5 ) , a n d t e t r a t h i o n a t e ( K 2 S 4 0 6 , 3 . 5g / l i t e r , pH 4 . 5 ) w e r e t e s t e d f o r s u p p o r t o f a u t o t r o p h i cg r o w t h .T h e s e s u b s t a n c e s w e r e a l s o s u p p l e m e n t e d w i t h y e a s te x t r a c t ( 0 . 0 5 % ) t o t e s t w h e t h e r m i x o t r o p h i c g r o w t h w a sp o s s i b l e . A c e t a t e , c i t r a t e , m a l a t e , p y r u v a t e , a n d g l u c o s e ( 1 0mM , pH 4 . 5 ) w e r e t e s t e d f o r s u p p o r t o f c h e m o o r g a n o t r o p h i cg r o w t h .G r o w t h w a s t e s t e d b y m i c r o s c o p y a n d d e t e r m i n a t i o n s o fpH v a l u e , r e d o x p o t e n t i a l ( 2 5 ) , s u l f a t e ( t u r b i d i m e t r y ) ( 5 ) ,f e r r o u s a n d f e r r i c i r o n ( p h e n a n t h r o l i n e ) ( 2 ) , p r o t e i n ( 4 , 3 1 ) ,t o t a l c e l l c o u n t b y H e l b e r c h a m b e r , a n d l i v e c e l l c o u n t b y t h et h r e e - t u b e MPN m e t h o d . M e t a l c o n c e n t r a t i o n s W k e r e a n a -l y z e d b y t h e a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t r y t e c h -n i q u e w i t h a m o d e l 1 1 0 0 B P e r k i n - E l m e r m a c h i n e .

E v a l u a t i o n o f t h e i m p o r t a n c e o f L . f e r r o o x i d a n s . ( i ) D e t e r -m i n a t i o n s o f c e l l c o u n t s i n l e a c h b i o t o p e s . T h r e e l e a c hb i o t o p e s w e r e s e l e c t e d f o r s a m p l i n g . S i t e 1 i s l o c a t e d i n t h eI l b a m i n e ( V e n e r a v e i n ) i n n o r t h w e s t R o m a n i a n e a r B a i aM a r e . I t c o n t a i n s a s u l f i d i c , c o m p l e x c o p p e r - z i n c o r e w i t h a na v e r a g e pH o f 3 . 3 a n d h a s a t e m p e r a t u r e o f 1 4 C . I t c o n t a i n sp y r i t e , c h a l c o p y r i t e , c o v e l l i t e , b o r n i t e , s p h a l e r i t e , g a l e n a ,a n d m a r c a s i t e . S i t e 2 i s l o c a t e d i n t h e B a i a S p r i e m i n e i nn o r t h w e s t R o m a n i a , a l s o n e a r B a i a M a r e . I t c o n t a i n s as u l f i d i c c o p p e r o r e o f m a i n l y c h a l c o p y r i t e , p y r i t e , a n d c o v -e l l i t e w i t h a n a v e r a g e pH o f 3 . 0 a n d h a s a t e m p e r a t u r e o f2 8 C . S i t e 3 i s l o c a t e d i n w e s t R o m a n i a n e a r R o s i a P o i e n i . I ti s a s u l f i d i c , c o m p l e x c o p p e r o r e l e a c h h e a p w i t h a n a v e r a g epH o f 2 . 5 . T h e t e m p e r a t u r e a t s i t e 3 v a r i e s t h r o u g h o u t t h ey e a r . I n w i n t e r , t h e s u r f a c e o f t h e dump i s f r o z e n a n d t h ep l a n t i s o u t o f o p e r a t i o n .( i i ) D e t e r m i n a t i o n o f c e l l c o u n t s i n p e r c o l a t o r s . G l a s s p e r -c o l a t o r s w i t h t h r e e s a m p l i n g s t u b s w e r e u s e d . E a c h p e r c o -l a t o r w a s f i l l e d a f t e r s t e r i l i z a t i o n w i t h 4 k g o f s t e r i l i z e d o r e ( 8h a t 1 6 0 C , c l o s e d v e s s e l s ) a n d i n o c u l a t e d w i t h 1 0 8 c e l l s o fp u r e a n d m i x e d c u l t u r e s o f T . f e r r o o x i d a n s , a n d / o r T .t h i o o x i d a n s , a n d / o r L . f e r r o ox i d a n s , p e r g o f o r e . T h e t e s t sw e r e r u n a t 2 8 C i n t h e d a r k . W a s h i n g s o l u t i o n ( 4 . 5 l i t e r s )w a s u s e d ( 1 6 ) . T h e p u m p i n g r a t e w a s 1 . 8 l i t e r s p e r h . T h e o r eo r i g i n a t e d f r o m t h e I l b a m i n e . I t w a s g r o u n d i n t o p i e c e ss m a l l e r t h a n 5 mm i n d i a m e t e r , a n d t h e p i e c e s b e t w e e n 1 a n d5 mm i n d i a m e t e r w e r e u s e d . T h e o r e a n a l y s i s y i e l d e d 4 . 7 %F e , 6 . 8 % S , 0 . 3 % C u , 0 . 1 4 % Z n , 0 . 2 3 % Mn, 2 . 3 % M g ,0 . 0 0 2 % C o , 0 . 0 5 % N i , a n d 0 . 1 % C a . T h e m a i n m i n e r a l s i nt h e h i g h l y d i s s e m i n a t e d , p a r t i a l l y o x i d i z e d o r e w e r e p y r i t e ,c h a l c o p y r i t e , g a l e n a , a n d s p h a l e r i t e .S a m p l i n g w a s d o n e s e v e r a l t i m e s d u r i n g t h e c o u r s e o f a ne x p e r i m e n t . S a m p l e s o f a b o u t 5 g w e r e t a k e n f r o m t h e o r eb o d y t h r o u g h t h e s t u b s . C e l l c o u n t s w e r e d e t e r m i n ed a sd e s c r i b e d a b o v e .

R E S U L T SF i e l d s t u d i e s f o r q u a n t i f i c a t i o n o f s u l f u r - a n d f e r r o u s - i r o n -

o x i d i z i n g b a c t e r i a . E i g h t y - f i v e s a m p l e s w e r e t a k e n f r o m t h eI l b a m i n e d u r i n g f i v e s a m p l i n g c a m p a i g n s . T h e s a m p l e s w e r ec h a r a c t e r i z e d a s e i t h e r d r y , w e t , m u d , o r m i n e w a t e r . T h er e s u l t s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 1 . I t i s e v i d e n t t h a t t h i o b a c i l l iw e r e p r e s e n t i n e a c h s a m p l e . T h e c e l l c o u n t s o f t h e a c i d o -p h i l e s w e r e c o m p a r a b l e ( w i t h i n t h e i n h e r e n t i n a c cu r a c y o ft h e MPN m e t h o d ) . E v e n w e a k l y a c i d o p h i l i c s p e c i e s s u c h a sT h i o b a c i l l u s i n t e r m e d i u s w e r e d e t e c t a b l e . L . f e r r o o x i d a n sc o u l d b e d e t e c t e d i n 1 1 o f 8 5 s a m p l e s b u t n o t i n m i n e w a t e r .R e g u l a r l y , m o r e c e l l s o f T . f e r r o o x i d a n s t h a n o f L . f e r r o o x -i d a n s w e r e f o u n d .C h e m o o r g a n o t r o p h i c m i c r o o r g a n i s m s w e r e o u t n u m b e r e db y l i t h o t r o p h s . C h e m o o r g a n o t r o p h s r e p r e s e n t e d l e s s t h a n10% o f t h e p o p u l a t i o n . T h e n i t r o g e n c o n t e n t r a n g e d b e t w e e n5 a n d 2 6 m g / k g o f s a m p l e a n d , t h u s , w a s n o t l i m i t i n g . F o rc o m p a r i s o n , s a m p l e s w e r e t a k e n f r o m a m i n e b i o t o p e w i t h ac a r b o n a c e o u s o r e ( P o t c o a v a - D u b o v a i n s o u t h w e s t Roma-n i a ) . T h e pH a t t h i s s i t e w a s 8 . 5 . T h i o b a c i l l i a n d l e p t o s p i r i l l iw e r e n o t d e t e c t a b l e ( r e s u l t s n o t s h o w n ) . T h u s , a c i d o p h i l i cl i t h o t r o p h s w e r e w i t h o u t i m p o r t a n c e i n t h i s a l k a l i n e b i o t o p e .An a d d i t i o n a l s a m p l i n g c a m p a i g n w a s p e r f o r m e d i n t h eB a i a S p r i e m i n e . T w e n t y s a m p l e s w e r e t a k e n a n d a n a l y z e df o r l i t h o t r o p h s . S a m p l e s w e r e d i v i d e d i n t o h u m i d a n d w e t . I na d d i t i o n , a s o f i d s t o n e w a s t a k e n a s a s a mp l e. T h e r e s u l t s a r ep r e s e n t e d i n T a b l e 2 . I n f o u r s a m p l e s , l i t h o t r o p h s w e r e n o td e t e c t a b l e ; i n t h e r e m a i n i n g 1 6 s a m p l e s , o x i d i z e r s o f f e r r o u si r o n w e r e r e g u l a r l y d e m o n s t r a t e d . The h u m i d s a m p l e s c o n -

8 6 SAND E T A L .

8/8/2019 Evaluation of Leptospirillum ferrooxidans

3/8

EVALUATION OF L . F ERROOXIDANS F OR LEACHING 8 7T A B L E 1 . Q u a n t i f i c a t i o n o f a c i d o p h i l i c l i t h o t r o p h s i n t h e s u l f i d i c I l b a m i n e ( R o m a n i a ) a

S a m p l e P r o t e i n N i t r a t e C e l l c o u n t o f :t y p e b 4 L( p . g / g o f s a m p l e ) ( p . g / g o f s a m p l e ) T . f e r r o o x i d a n s T . t h i o o x i d a n s T i ' L . f e r r o o x i d a n s C h e m o o r g a n o t r o p h s F u n g iD r y 3 . 3 7 2 1 1 5 x 1 0 3 5 x 1 0 3 1 X 1 0 5 4 x 1 0 3 2 x 1 0 4 2 x 1 0 4Wet 3 . 3 8 6 1 8 6 x 1 0 5 6 x 1 0 5 1 X 1 0 4 2 x 1 0 5 3 x 1 0 4 2 x 1 0 5M ud 3 . 4 1 2 9 5 3 x 1 0 3 3 x 1 0 5 9 X 1 0 4 2 x 1 0 3 3 x 1 0 4 7 x 1 0 4W a t e r 3 . 2 7 1 8 2 x106 8x105 1 X105 + d 4 x104 6 x104

a V a l u e s a r e m e a n s f o r e a ch s a m p l e t y p e .b D r y ( w a t e r n o t v i s i b l e ) , 4 0 s a m p l e s ; w e t ( w a t e r v i s i b l e ) , 2 9 s a m p l e s ; mud ( s l u r r y ) , 8 s a m p l es ; w a t er , 8 s a m p l e s .' T i , m o d e r a t e l y a c i d o p h i l i c t h i o b a c i l l i l i k e T . i n t e r m e d i u s , T . n o v e l l u s , a n d T . n e a p o l i t a n u s , e t c .d + , d e t e c t a b l e b u t n o t q u a n t i f i a b l e .

t a i n e d 6 x 1 0 5 c e l l s o f f e r r o u s - i r o n o x i d i z e r s a n d o f s u l f u ro x i d i z e r s p e r g o f o r e . A b o u t 2 x 1 0 4 c e l l s o f w e a k l ya c i d o p h i l i c t h i o b a c i l l i p e r g o f o r e w e r e a l s o p r e s e n t . M i c r o -s c o p i c e v a l u a t i o n o f t h e h i g h e s t d i l u t i o n s t e p s r e v e a l e d t h a tT . f e r r o o x i d & n s d o m i n a t e d i n 9 o f 1 6 s a m p l e s . I n t h e o t h e rs e v e n s a m p l e s , L . f e r r o o x i d a n s w a s t h e d o m i n a n t o r g a n i s m .T h e t h i r d s a m p l i n g c a m p a i g n w a s d o n e o n t h e h e a pl e a c h i n g a t R o s i a P o i e n i . A f t e r 2 y e a r s o f a c t i v e l e a c h i n g , t h eh e a p ( 2 0 b y 2 0 m i n a r e a ) h a d d e c r e a s e d f r o m a h e i g h t o f 4 mt o a b o u t 2 m b e c a u s e o f b i o d eg r a d a t i o n o f m i n e r a l s u l f i d e s( r e s u l t i n g i n s m a l l e r r o c k p a r t i c l e s ) . S a m p l e s we e t a k e nf r o m t h e s u r f a c e , f r o m a d e p t h o f 6 0 c m , f r o m a p u d d l e , a n df r o m t h e e f f l u e n t a t t h e b o t t o m o f t h e h e a p ( r e s u l t s n o ts h o w n ) . A b o u t 5 x 1 0 6 c e l l s o f s u l f u r - a n d f e r r o u s - i r o n -o x i d i z i n g b a c t e r i a p e r g o f o r e w e r e p r e s e n t . T h e c e l l c o u n to f t h e w e a k a c i d o p h i l e s a m o u n t e d t o a b o u t 4 x 1 0 3 c e l l s p e rg o f o r e . I n t h e e f f l u e n t s a m p l e , t h e c e l l c o n c e n t r a t i o n w a sr e d u c e d t o 1% o r l e s s o f t h o s e o f t h e o r e s a m p l e s . M o r e t h a n99% o f t h e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n i s l i v i n g i n t h e d u m p .M i c r o s c o p i c e v a l u a t i o n o f t h e h i g h e s t d i l u t i o n s t e p s d e m o n -s t r a t e d t h a t L . f e r r o o x i d a n s i s a s a b u n d a n t i n t h e h e a p a s T .f e r r o o x i d a n s . E v e r y s e c o n d s a m p l e c o n t a i n e d o n l y c e l l s o fL e p t o s p i r i l l u m - l i k e b a c t e r i a . On t h e s u r f a c e o f t h e h e a p ,w h e r e t h e t e m p e r a t u r e a t t h e s a m p l i n g t i m e w a s a b o u t 0 W C ,o n l y T . f e r r o o x i d a n s c o u l d b e d e t e c t e d . T h e p u d d l e a n de f f l u e n t s a m p l e s c o n t a i n e d o n l y T . f e r r o o x i d a n s . I t i s p o s s i -b l e t h a t L . f e r r o o x i d a n s a d h e r e s m o r e t i g h t l y t o s u r f a c e st h a n d o e s T . f e r r o o x i d a n s . S i m i l a r e v i d e n c e h a s b e e n g i v e np r e v i o u s l y ( 1 0 , 2 3 ) .L a b o r a t o r y s t u d i e s f o r c h a r a c t e r i z a t i o n o f f e r r o u s - i r o n -o x i d i z i n g p u r e c u l t u r e s . ( i ) M o r p h o l o g y . From s e v e r a l s a m -p l e s o f t h e I l b a m i n e , f o u r p u r e c u l t u r e s o f f e r r o u s - i r o n -

T A B L E 2 . Q u a n t i f i c a t i o n o f a c i d o p h i l i c l i t h o t r o p h s i n t h e s u l f i d i cB a i a S p r i e m i n e ( R o m a n i a ) 'C e l l c o u n t N o . o f s a m p l e s

S a m p l e o H : w i t h p r e v a l e n c e o f :t y p e b T . f e r r o o x i d a n s o r T . t h i o - T i ' T . f e r r o - L . f e r r o -L . f e r r o o x i d a n s o x i d a n s l o x i d a n s o x i d a n s

S t o n e 4 . 6 ND d ND NDHumid 3 . 4 + ( 3 ) e ND ND 3Wet 3 . 0 6x 1 0 5 6 x 1 0 5 2 x 1 0 4 6 7a V a l u e s a r e means f o r e a c h s a m p l e t y p e .b S t o n e ( s o l i d b l o c k ) , 1 s a m p l e ; h u m i d ( w a t e r n o t v i s i b l e ) , 6 s a m p l e s ; wet( w a t e r v i s i b l e ) , 1 3 s a m p l e s .c T i , m o d e r a t t l y a c i d o p h i l i c t h i o b a c i l l i l i k e T . i n t e r m e d i u s , T . n o v e l l u s , a n dT . n e a p o l i t a n u s , e t c .d ND , n o t d e t e c t a b l e .e + , d e t e c t a b l e b u t n o t q u a n t i f i a b l e ; ( 3 ) , t h r e e o f s i x s a m p l e s were e v a l u -a t e d .

o x i d i z i n g b a c t e r i a w e r e p r e p a r e d . An a d d i t i o n a l c u l t u r e w a sm a d e f r o m a n e n r i c h m e n t c u l t u r e f r o m P e r u . T h r e e c u l t u r e sw e r e o b t a i n e d w h i c h r e s e m b l e d T . f e r r o o x i d a n s , a n d t w oc u l t u r e s w e r e o b t a i n e d w h i c h w e r e s i m i l a r t o L . f e r r o o x i -d a n s . T . f e r r o o x i d a n s R l , R 5 , a n d R7 w e r e s t r a i g h t r o d s w i t ha d i a m e t e r o f 0 . 3 t o 0 . 6 p . m a n d a l e n g t h o f 1 t o 3 . 5 , u m . T h ec e l l s o f t w o L . f e r r o o x i d a n s s t r a i n s , R 3 a n d P 3 A , h a d ad i a m e t e r o f 0 . 3 t o 0 . 6 p . m a n d a l e n g t h o f u p t o 3 . 5 p . m . L .f e r r o o x i d a n s s h o w e d s t r o n g p l e o m o r p h i s m . Y o u n g c u l t u r e s( u p t o 4 d a y s o l d ) c o n s i s t e d m a i n l y o f v i b r i o l i k e c e l l s ,w h e r e a s o l d e r c u l t u r e s ( 1 t o 2 w e e k s o l d ) c o n t a i n e d m o s t l ys p i r a l c e l l s w i t h u p t o f o u r t u r n s . F i g u r e 1A t o C d e m o n -s t r a t e s t h e a p p e a r a n c e o f t h e t w o s t r a i n s . U l t r a t h i n s e c t i o n so f L . f e r r o o x i d a n s P 3 A s h o w t h a t t h i s s t r a i n c o n t a i n s ap e r i p l a s m i c s p a c e c h a r a c t e r i s t i c o f l i t h o t r o p h s . C a r b o x y -s o m e s , v i r u s l i k e i n c l u s i o n b o d i e s w i t h r i b u l o s e- b i s p ho s p h a tec a r b o x y l a s e ( 3 0 ) , w e r e n o t d e t e c t a b l e ( F i g . 2 ) , a n d i n t r a c y -t o p l a s m i c m e m b r a n e s w e r e n o t v i s i b l e .( i i ) P h y s i o l o g y . G r o w t h c u r v e s ( n o t s h o w n ) o f t h e s e f i v es t r a i n s p r o v e d t h a t a l l w e r e a b l e t o g r o w l i t h o a u t o t r o p h i c a l l yw i t h f e r r o u s i r o n a s t h e s o u r c e o f e n e r g y a n d c a r b o n d i o x i d ea s t h e s o u r c e o f c e l l c a r b o n . T a b l e 3 g i v e s a s u m m a r y o f t h er e s u l t s . I t i s e v i d e n t t h a t t h e p r o p e r t i e s o f T . f e r r o o x i d a n sa n d L . f e r r o o x i d a n s a r e s i m i l a r . One e x c e p t i o n i s t h e g e n e r -a t i o n t i m e o f 4 h f o r T . f e r r o o x i d a n s R l , w h i c h i s c o n s i d e r -a b l y l o w e r t h a n t h e g e n e r a t i o n t i m e s o f t h e o t h e r s t r a i n s . I ti s a l s o o b v i o u s t h a t t h e t w o s t r a i n s o f L . f e r r o o x i d a n s g r o wa t c o n s i d e r a b l y l o w e r pH v a l u e s t h a n T . f e r r o o x i d a n s . T h e r ei s a l s o s o m e e v i d e n c e t h a t T . f e r r o o x i d a n s g r o w s b e s t w i t hf e r r o u s i r o n c o n c e n t r a t i o n s t h a t a r e h i g h e r t h a n t h o s e f o r L .f e r r o o x i d a n s . T h i o b a c i l l i a s w e l l a s l e p t o s p i r i l l i a r e m e s o -p h i l e s . T h e o p t i m u m g r o w t h t e m p e r a t u r e s v a r y f r o m 2 2 t o3 5 C . H o w e v e r , c o n s i d e r a b l e d i f f e r e n c e s were n o t e d f o rg r o w t h a t r e d u c e d t e m p e r a t u r e s . T h e g e n e r a t i o n t i m e s o f t h et h r e e s t r a i n s o f T . f e r r o o x i d a n s i n c r e a s e d a t 1 5 C t o 4 4 , 3 3 ,a n d 3 2 h ( f o r R l , R 5 , a n d R 7 , r e s p e c t i v e l y ) . T h e g e n e r a t i o nt i m e s o f t h e t w o L e p t o s p i r i l l u m s t r a i n s i n c r e a s e d e v e nf u r t h e r , t o 6 3 h ( R 3 ) a n d 9 3 h ( P 3 A ) . E v e n s t r a i n Rl o f T .f e r r o o x i d a n s , w h i c h h a s a g r o w t h t e m p e r a t u r e o p t i m u m o f3 5 C w h i c h i s w e l l a b o v e t h o s e o f l e p t o s p i r i l l i , e x h i b i t s a t1 5 C a s h o r t e r g e n e r a t i o n t i m e t h a n t h e two L . f e r r o o x i d a n ss t r a i n s .A d d i t i o n a l t e s t s w e r e p e r f o r m e d t o a s s a y s u b s t r a t e s p e c -i f i c i t y . F i v e s u b s t r a t e s were u s e d t o t e s t f o r l i t h o t r o p h i cg r o w t h . F o r a s e c o n d t e s t s e r i e s , t h e s e s u b s t r a t e s weres u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 0 5 % y e a s t e x t r a c t t o t e s t f o r m i x -o t r o p h i c g r o w t h . T h e t h i r d t e s t s e r i e s wa s r u n w i t h o r g a n i cc o m p o u n d s t o t e s t f o r c h e m o o r g a n o t r o p h i c g r o w t h . T h er e s u l t s a r e g i v e n i n T a b l e 4 . I t i s e v i d e n t t h a t L . f e r r o o x i d a n si s a b l e t o g r o w o n p y r i t e . None o f t h e o t h e r s u b s t r a t e ss u p p o r t e d a u t o t r o p h i c o r m i x o t r o p h i c g r o w t h . T . f e r r o o x i -

V O L . 5 8 , 1 9 9 2

8/8/2019 Evaluation of Leptospirillum ferrooxidans

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8 8 S A N D ET A L .

F I G . 1 . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f c e l l s o f L . f e r r o o x i d a n s R 3 a f t e r 4 d a y s o f g r o w t h ( A ) , L . f e r r o o x i d a n s R 3 a f t e r 1 0 d a y s o fg r o w t h ( B ) , a n d L . f e r r o o x i d a n s P 3 A a f t e r 1 0 d a y s o f g r o w t h ( C ) . B a r s , 1 p . m .d a n s was a b l e t o g r o w a u t o t r o p h i c a l l y w i t h t h e f i v e s u b -s t r a t e s , b u t m i x o t r o p h i c g r o w t h was n o t d e t e c t a b l e . T h eo r g a n i c c o m p o u n d s d i d n o t s u p p o r t a n y g r o w t h o f e i t h e rs p e c i e s .F u r t h e r m o r e , G+C a n a l y s e s o f t h e f i v e s t r a i n s w e r ep r e p a r e d . F o r r e f e r e n c e , E . c o l i K - 1 2 a n d T . f e r r o o x i d a n sATCC 2 3 2 7 0 w e r e u s e d . T h e d e t e r m i n a t i on s o f t h e m e l t i n gp o i n t s y i e l d e d G + C c o n t e n t s f o r t h e T . f e r r o o x i d a n s s t r a i n s5 1 . 9 % ( R 5 ) , 5 8 . 8 % ( R i ) , a n d 6 3 . 1 % ( R 7 ) . ATCC 2 3 2 7 0 h a d aG+C c o n t e n t o f 5 8 . 1 % . T h e G+C c o n t e n t s f o r t h e L .f e r r o o x i d a n s s t r a i n s w e r e 5 3 . 9 % ( P 3 A ) a n d 5 6 . 4 % ( R 3 ) . T h es t a n d a r d d e v i a t i o n w a s a b o u t + 0 . 4 % f o r a t l e a s t s i x d e t e r -m i n a t i o n s e a c h . T h e v a l u e s f o r T . f e r r o o x i d a n s R l a n d R 7a r e i n a c c o r d a n c e w i t h o t h e r d a t a ( 9 ) f o r t h e G+C c o n t e n ts p e c t r u m o f T . f e r r o o x i d a n s . T h e v a l u e f o r s t r a i n R 5 i s b e l o wt h i s r a n g e , b u t , b e c a u s e o f i t s g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c , t h es t r a i n b e l o n g s t o t h e s p e c i e s T . f e r r o o x i d a n s . T h e d a t a f o r L .f e r r o o x i d a n s f a l l w i t h i n t h e r a n g e .L a b o r a t o r y s t u d i e s f o r e v a l u a t i o n o f l e a c h i n g c a p a c i t i e s . I na d d i t i o n t o t h e a b o v e - m e n t i o n e d f i v e s t r a i n s , L . f e r r o o x i d a n s

R 3 0 a n d T . t h i o o x i d a n s K6 a n d K16 w e r e u s e d . F o r l e a c he x p e r i m e n t s i n g l a s s p e r c o l a t o r s w i t h c r u s h e d s u l f i d i c o r ef r o m t h e I l b a m i n e ( R o m a n i a ) , 4 k g o f s t e r i l i z e d o r e ( p i e c e s1 t o 5 mm i n d i a m e t e r ) was n e e d e d . T h e o r e was i n o c u l a t e dw i t h d i f f e r e n t c o m b i n a t i o n s o f p u r e a n d m i x e d c u l t u r e s . L .f e r r o o x i d a n s w a s t e s t e d i n c o m b i n a t i o n w i t h T . t h i o o x i d a n s ,T . f e r r o o x i d a n s , o r b o t h . T h e c e l l c o u n t w a s 1 0 8 c e l l s p er g o fo r e f o r s u l f u r o r f e r r o u s - i r o n o x i d i z e r s . T h e h i g h c e l l c o u n tw a s c h o s e n t o a v o i d a n y l a g p h a s e b e f o r e t h e s t a r t o fl e a c h i n g . F i g u r e 3 s u m m a r i z e s t h e r e s u l t s o f a t y p i c a l e x p e r -i m e n t . T h e o r e h a d b e e n i n o c u l a t e d w i t h T . f e r r o x i d a n s , T .t h i o o x i d a n s , a n d L . f e r r o o x i d a n s . I t i s o b v i o u s t h a t t h ef e r r o u s - i r o n - o x i d i z i n g b a c t e r i a g r e w on t h e o r e . T h e c e l lc o u n t s o f T . f e r r o o x i d a n s a n d o f L . f e r r o o x i d a n s i n c r e a s e ds l i g h t l y t o 5 x 1 0 8 c e l l s p e r g o f o r e ( w i t h some d e v i a t i o n s )t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t . L . f e r r o o x i d a n s g r e w a s w e l l a sT . f e r r o o x i d a n s . I n c o n t r a s t , t h e a b i l i t y o f T . t h i o o x i d a n s t og r o w o n t h e o r e was l i m i t e d . To e v a l u a t e t h e i n f l u e n c e o ft e m p e r a t u r e o n t h e g r o w t h o f t h e m i x e d c u l t u r e , a n e x p e r i -m e n t a t a t e m p e r a t u r e o f 1 4 C ( i n s t e a d o f 2 8 C ) w a s i n -

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

8/8/2019 Evaluation of Leptospirillum ferrooxidans

5/8

E V A L U A T I O N O F L . F E R R O O X I D A N S FOR LEACHING 8 9

A

F I G . 2 . T r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s f r o m u l t r a t h i n s e c t i o n s o f c e l l s o f L . f e r r o o x i d a n s P 3 A . ( A ) V i b r i o l i k e c e l l ( a f t e r 4 d a y s o fg r o w t h ) . C Y , c y t o p l a s m a ; CM , c y t o p l a s m i c m e m b r a n e ; OM , o u t e r m e m b r a n e ; P S , p e r i p l a s m i c space. ( B ) S e c t i o n a l o n g t h e l o n g i t u d i n a l a x i so f a s p i r a l c e l l ( a f t e r 1 0 d a y s o f g r ow t h) . S e v e r a l p a r t s o f t h e s p i r a l c e l l ar e v i s i b l e . B a r s , 0 . 5 p L m .

c l u d e d . T h i s t e m p e r a t u r e i s c o m p a r a b l e t o t h e t e m p e r a t u r ei n t h e I l b a m i n e . T h e r e s u l t s ar e p r e s e n t e d i n F i g . 4 . I t i se v i d e n t t h a t l e a c h i n g p r o c e e d e d a t a l o w e r r a t e c o m p a r e d t ot he v a l u e s s h o w n i n F i g . 3 . T h e r e was a l s o a s t r i k i n gd i f f e r e n c e i n t h e c e l l c o u n t s : t h e c e l l c o u n t s o f T . f e r r o o x i -d a n s i n c r e a s e d u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , t h e c e l l c o u n t s o f T .t h i o o x i d a n s r e m a i n e d a t t h e i n o c u l a t i o n l e v e l , a n d t h e c e l lc o u n t s o f L . f e r r o o x i d a n s d e c r e a s e d t h r o u g h o u t t h e e x p e r i -ment ( f r o m 1 0 6 t o 1 0 4 c e l l s pe r g o f o r e ) . S u c h a r e d u c t i o nwas never n o t e d a t 2 8 C .T h e m e t a l o u t p u t was a n a l y z e d f o r a l l e x p e r i m e n t s , a n d

T A B L E 3 . P h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e t h r e e s t r a i n s R l ,R 5 , a n d R7 o f T . f e r r o o x i d a n s a n d t h e t w o s t r a i n s R 3 a n dP 3 A o f L . f e r r o o x i d a n sG e n e r a t i o n Cel~ t i H T e m p F e 2 +S t r a i n t i m e C e l l P r o t e i n p H o p t i m u m o p t i m u m( h ) c o u n t / m l ( m g / l i t e r ) o p t i m u m ( O C ) ( g / l i t e r )

R i 4 1 x 1 0 8 2 . 4 2 . 2 3 5 2 1 0R 5 1 2 8x107 1 . 7 2 . 3 2 2 8R7 1 3 8 x 1 0 7 1 . 6 2 . 0 2 2 - 1 0R 3 1 2 1 x 1 0 8 1 . 4 1 . 7 2 8 8P 3 A 1 0 8 x 1 0 7 1 . 3 1 . 5 3 0 6

V O L . 5 8 , 1 9 9 2

,w.i I

" N i A d -p m l k . ,

A. r

8/8/2019 Evaluation of Leptospirillum ferrooxidans

6/8

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

T A B L E 4 . C a p a c i t y f o r l i t h o a u t o t r o p h i c , m i x o t r o p h i c , a n d c h em o o r g a n o t r o p h i c g r o wt h o f T . f e r r o o x i d a n s a n d L . f e r r o o x i d a n sG r o w t h i n ' :

S t r a i n S o F e S 2 N a 2 S O 3 N a 2 S 2 0 3 K 2 S 4 0 6 O C bA l o n e +Y A l o n e +Y A l o n e +Y A l o n e +Y A l o n e +Y

R l ++ - ++ - + - + - ++ - -R5 ++ - ++ - + - ++ - ++ - -R7 + - + - + - + - ++ - -R 3 - - + - - - - - - -P3A - - + - - _ _ _ _ _ _

a + + , g o o d g r o w t h ; + , g r o w t h ; - , n o g r o w t h ; + Y , 0 . 0 5 % y e a s t e x t r a c t a d d e d . F o r f u r t h e r d e t a i l s , s e e M a t e r i a l s a n d M et h o d s .b O C , o r g a n i c c o m p o u n d s ( a c e t a t e , c i t r a t e , m a l a t e , p y r u v a t e , g l u c o s e ) .

t h e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 5 . T h e y c l e a r l y d e m o n -s t r a t e t h a t L . f e r r o o x i d a n s i n m i x e d c u l t u r e w i t h T . t h i o o x i -d a n s m o b i l i z e s m e t a l s a s w e l l a s T . f e r r o o x i d a n s .T h e h i g h e s t m e t a l m o b i l i z a t i o n w a s o b t a i n e d w i t h a m i x e dc u l t u r e o f a l l a c i d o p h i l e s . I n a s i m i l a r e x p e r i m e n t ( r e s u l t s n o ts h o w n ) , 1% p y r i t e w a s a d d e d t o t h e o r e . T h e Zn o u t p u ti n c r e a s e d t o 6 3 % , t h e Co o u t p u t i n c r e a s ed t o 3 2 % , a n d t h eM n o u t p u t i n c r e a s e d t o 1 6 % . A c o m p a r i s o n o f t h e e x p e r i -m e n t a t 2 8 C w i t h t h e o n e a t 1 4 W C c l e a r l y d e m o n s t r a t e s t h a tl e a c h i n g i s r e d u c e d a t t h e l o w e r t e m p e r a t u r e . I n t h e c a s e o fCo a n d Mn, l e a c h i n g c o u l d n o t b e n o t e d a t a l l .T h e o x i d a t i o n o f f e r r o u s t o f e r r i c i r o n i s a c c o m p a n i e d b ya n i n c r e a s e i n t h e r e d o x p o t e n t i a l . U n d e r o u r t e s t c o n d i t i o n s ,t h e p o t e n t i a l i n c r e a s e s f r o m 6 0 0 mV t o a b o u t 7 5 0 mV . S i n c ef e r r o u s - i r o n - o x i d i z i n g b a c t e r i a d i f f e r b y t h e i r o x i d a t i o n r a t e ,t h e c h a n g e o f t h e r e d o x p o t e n t i a l o v e r t i m e ma y b e u s e d a sa m e a s u r e o f a c t i v i t y ( 2 5 ) . T e s t s w e r e made w i t h T . f e r r o o x -i d a n s a n d L . f e r r o o x i d a n s . A b a t c h c u l t u r e o f T . f e r r o o x -

F I G . 3 . G r o w t h o f L . f e r r o o x i d a n s , T . f e r r o o x i d a n s , a n d T .t h i o o x i d a n s o n s u l f i d i c o r e a t 2 8 C i n p e r c o l a t i o n e x p e r i m e n t s . O r eu s e d w a s f r o m t h e I l b a m i n e ( R o m a n i a ) , 1 t o 5 mm i n d i a m e t e r . E h ,r e d o x p o t e n t i a l ; S O 4 , s u l f a t e c o n t e n t ; F e > ! > , f e r r o u s i r o n p l u sf e r r i c i r o n c o n t e n t ; F e , f e r r o u s i r o n c o n t e n t ; l o g N , l o g a r i t h m i -c a l l y d e r i v e d c e l l c o u n t s p e r g r a m o f o r e ; L , L . f e r r o o x i d a n s R 3 ; F ,T . f e r r o o x i d a n s R 7 ; T , T . t h i o o x i d a n s R 2 0 .

i d a n s R 5 w a s t e s t e d f o r i t s f e r r o u s - i r o n - o x i d i z i n g a c t i v i t yd u r i n g t h e l a g , l o g , a n d s t a t i o n a r y g r o w t h p h a s e s . As e x -p e c t e d , t h e h i g h e s t a c t i v i t y was d e t e c t e d d u r i n g t h e l o gp h a s e ( r e s u l t s n o t s h o w n ) . On t h e b a s i s o f t h e s e r e s u l t s , o n l yc e l l s o f t h e l o g p h a s e w e r e t e s t e d f u r t h e r . T h e e x p e r i m e n t sd e m o n s t r a t e d t h a t t h i o b a c i l l i h a v e a h i g h e r f e r r o u s - i r o n -o x i d i z i n g a c t i v i t y t h a n d o l e p t o s p i r i l l i . T h e v a l u e s f o r T .f e r r o o x i d a n s R l , R 5 , a n d R7 r a n g e f r o m 1 . 2 t o 1 . 3 t o 1 . 5 mVm i n - ' ( c h a n g e o f r e d o x p o t e n t i a l ) . T h e v a l u e s f o r b o t h L .f e r r o o x i d a n s R3 a n d P 3 A a r e 0 . 6 mV m i n - ' ( c h a n g e o f r e d o xp o t e n t i a l ) . F u r t h e r e x p e r i m e n t s w e r e d o n e w i t h p u r e c u l -t u r e s w h i c h h a d b e e n g r o w i n g w i t h I l b a o r e f o r 1 0 w e e k s .C e l l s w e r e d e t a c h e d f r o m t h e o r e b y b e i n g s h a k e n on ar o t a r y s h a k e r f o r a t l e a s t 6 0 m i n . T h e o r e was s e p a r a t e d f r o mt h e b a c t e r i a b y d i f f e r e n t i a l c e n t r i f u g a t i o n . T h e s e c e l l s weret e s t e d f o r t h e i r f e r r o u s - i r o n - o x i d i z i n g a c t i v i t y . As a r e s u l t , T .f e r r o o x i d a n s a n d L . f e r r o o x i d a n s e x h i b i t e d r e d u c e d a c t i v i -t i e s : T . f e r r o o x i d a n s R 5 p o s s e s s e d 1 4 % o f i t s o r i g i n a l a c t i v -

F I G . 4 . G r o w t h o f L . f e r r o o x i d a n s , T . f e r r o o x i d a n s , a n d T .t h i o o x i d a n s o n s u l f i d i c o r e a t 1 4 C i n p e r c o l a t i o n e x p e r i m e n t s . O r eu s e d w a s f r o m t h e I l b a m i n e ( R o m a n i a ) , 1 t o 5 mm i n d i a m e t e r . E h ,r e d o x p o t e n t i a l ; S 0 4 2 , s u l f a t e c o n t e n t ; F e 2 ' 3 + , f e r r o u s i r o n p l u sf e r r i c i r o n c o n t e n t ; F e , f e r r o u s i r o n c o n t e n t ; l o g N , l o g a r i t h m i -c a l l y d e r i v e d c e l l c o u n t s p e r g r a m o f o r e ; L , L . f e r r o o x i d a n s R 3 ; F ,T . f e r r o o x i d a n s R 7 ; T, T . t h i o o x i d a n s R 2 0 .

9 0 S A N D E T A L .

8/8/2019 Evaluation of Leptospirillum ferrooxidans

7/8

E V A L U A T I O N O F L . F E R R O O X I D A N S F O R LEACHING 9 1T A B L E 5 . M e t a l o u t p u t i n l e a c h t e s t s o f a R o m a n i a n o r ei n o c u l a t e d w i t h p u r e a n d m i x e d c u l t u r e s o f T . f e r r o o x i d a n s( A ) , T . t h i o o x i d a n s ( B ) , a n d L . f e r r o o x i d a n s ( C )

M e t a l o u t p u t ( %) f r o m c u l t u r e s o f :M e t a l A C B+C A+B+CS t e r i l e ( 2 8 0 C ) ( 2 8 0 C ) ( 2 8 0 C ) 28oC4 a c aCu 6 1 9 1 8 2 5 4 0 1 6Zn 1 6 5 5 2 8 4 4 5 6 4 0Co 1 4 3 0 1 7 2 8 2 6 1 4M n 1 1 1 4 1 0 1 3 1 3 1 0

a T o t h i s c u l t u r e w a s a d d e d 0 . 5 % s u l f u r .

i t y , a n d L . f e r r o o x i d a n s R3 p o s s e s s e d a b o u t 3 3 % . Thea b s o l u t e v a l u e i n b o t h cases was 0 . 2 mV m i n - ' . T h u s , t h et wo s p e c i e s h a d s i m i l a r f e r r o u s - i r o n - o x i d i z i n g a c t i v i t i e s .DISCUSSION

I n s u m m a r i z i n g t h e r e s u l t s , i t became o b v i o u s t h a t t h eb a c t e r i u m L . f e r r o o x i d a n s i s an i m p o r t a n t member o f t h eb i o c o e n o s i s i n l e a c h h a b i t a t s . Under a p p r o p r i a t e c o n d i t i o n s ,one o f every t wo o x i d i z e r s o f f e r r o u s i r o n b e l o n g s t o t h i sgenus ( a n d s p e c i e s ) . T h i s r e s u l t i s o f i m p o r t a n c e f o r s t u d i e son l e a c h i n g w i t h l i t h o t r o p h i c a c i d o p h i l e s . Most s t u d i e s ar ed o n e w i t h T . f e r r o o x i d a n s , s o m e t i m e s c o m b i n e d w i t h T .t h i o o x i d a n s ( i f pure c u l t u r e s ar e u s e d ) , or w i t h u n s p e c i f i e de n r i c h m e n t c u l t u r e s . I n t h e f o r m e r case, t h e r e s u l t s ar ei n co m p l e t e b e c a u s e o f t h e a b s e n c e o f t h e e f f e c t o f L .f e r r o o x i d a n s w h e r e a s i n t h e l a t t e r case L . f e r r o o x i d a n s mayh a v e i n a d v e r t e n t l y c o n t r i b u t e d t o t h e l e a c h i n g . Muyzer e t a l .( 2 1 ) r e p o r t ed s u c h a f i n d i n g when an i m m u n o f l u o r e s c e n c e -D N A - f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g t e c h n i q u e f o r m o n i t o r i n g a l e a c h -i n g e x p e r i m e n t on d e s u l f u r i z a t i on o f c o a l was u s e d . A t 1 6d a y s a f t e r t h e i n o c u l a t i o n o f n o n s te ri l e c o a l s a m p l e s , t h ea u t o c h t h o n o u s f l o r a h a d overgrown t h e i n o c u l a t e d T . f e r -r o o x i d a n s a n d e f f e c t i v e l y removed p y r i t e . S i n c e t h e i r a n t i -serum was shown not t o r e a c t w i t h L . f e r r o o x i d a n s , t h e s eb a c t e r i a may w e l l h a v e b e e n t h e d o m i n a n t l e a c h i n g organ-i s m s . A n i m p o r t a n t f a c t o r f a v o r i n g t h e presence o f T .f e r r o o x i d a n s a n d / o r L . f e r r o o x i d a n s seems t o b e t h e t e m p e r -a t u r e o f t h e h a b i t a t . A t 2 0 C or a b o v e , l e p t o s p i r i l l i h a v eg e n e r a t i o n t i m e s w h i c h ar e c o m p a r a b l e t o t h o s e o f t h i o b a -c i U i . H o w e v e r , a t r e d u c e d t e m p e r a t u r e s , t h e g e n e r a t i o nt i m e s o f t h e f o r m e r i n c r e a s e more so t h a n t h o s e o f t h e l a t t e r .T . f e r r o o x i d a n s can overgrow t h e l e p t o s p i r i l l i i n t h i s h a b i t a t ,as d e m o n s t r a t e d b y t h e p e r c o l a t i o n e x p e r i m e n t s . I t i s knownt h a t T . f e r r o o x i d a n s - t y p e b a c t e r i a s h o w s u b s t a n t i a l g r o w t heven a t temperatures as l o w as 4 C ( 1 ) . O u r f i e l d s t u d i e s a l s or e v e a l e d t h a t temperature i s o f i m p o r t a n ce . A t s i t e s w i t htemperatures o f 2 0 C or h i g h e r ( 2 8 C , B a i a S p r i e ) ,l e p t o s p i r i l l i were as a b u n d a n t as T . f e r r o o x i d a n s , s o m e t i m e seven o u t n u m b e r i n g t h e l a t t e r , w h e r e a s a t s i t e s w i t h t e m p e r -a t u r e s b e l o w 2 0 C , l e p t o s p i r i l l i were r a r e l y d e t e c t a b l e ( I l b am i n e ) . T h e p e r c o l a t i o n e x p e r i m e n t s w i t h pure a n d m i x e dc u l t u r e s c o n f i r m t h e r e s u l t s o f t h e f i e l d s t u d y . A t 1 4 C , atemperature w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e average t e m p e r a t u r ei n t h e I l b a m i n e , L . f e r r o o x i d a n s d i d n o t grow w e l l . T h e c e l lcounts o f L . f e r r o o x i d a n s d e c l i n e d , w h e r e a s t h o s e o f T .f e r r o o x i d a n s i n c r e a s e d .Much work on t h e use o f L e p t o s p i r i l l u m spp. i n l e a c h i n gprocesses h a s a l r ea d y b e e n d o n e ( 1 0 , 1 9 , 2 2 , 2 4 ) . I n t h eo p i n i o n o f t h e a u t h o r s o f t h o s e e a r l i e r w o r k s , L e p t o s p i r i l -l u m- l i k e b a c te r i a may b e u s e d as s u c c e s s f u l l y as T . f e r r o o x -

i d a n s . I n some c a s e s , t h e u s e o f L e p t o s p i r i l l u m s p p . s e e m st o b e p r e f e r a b l e b e c a u s e o f t h e i r b i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s . T h ei n h i b i t i n g c o n c e n t r a t i o n o f f e r r i c i r o n ( 2 3 ) f o r l e p t o s p i r i l l i i sm o r e t h a n 1 0 t i m e s h i g h e r t h a n t h a t f o r T . f e r r o o x i d a n s ( 4 2 . 8v e r s u s 3 . 1 mM F e 3 + ) . I n a d d i t i o n , t h e h i g h a c i d t o l e r a n c e o ft h e L e p t o s p i r i l l u m - l i k e b a c t e r i a may f a v o r t h e i r g r o w t h i na c i d i c b i o t o p e s ( 2 2 ) . O u r c o m p a r i s o n o f t h e o p t i m u m pHv a l u e s c o n f i r m s t h a t l e p t o s p i r i l l i h a v e a l o w e r pH o p t i m u mt h a n T . f e r r o o x i d a n s , a l t h o u g h i t h a s b e e n d e s c r i b e d t h a t T .f e r r o o x i d a n s s t r a i n s a r e s t i l l m e t a b o l i c a l l y a c t i v e a t a pH o f0 . 8 ( 2 9 ) . A n o t h e r r e m a r k a b l e p r o p e r t y o f L . f e r r o o x i d a n s i st h e s u b s t r a t e o p t i m u m . A g a i n t h e se d a t a a r e i n a c c o r d a n c ew i t h t h o s e o f N o r r i s e t a l . ( 2 3 ) . T h e y d e s c r i b e d a Km v a l u ef o r f e r r o u s i r o n o f L e p t o s p i r i l l u m s p p . w h i c h i s w e l l b e l o wt h a t o f T . f e r r o o x i d a n s . O b v i o u s l y t h e f e r r o u s - i r o n - o x i d i z i n gs y s t e m n e e d s l e s s s u b s t r a t e f o r s a t u r a t i o n t h a n t h e s y s t e m o fT . f e r r o o x i d a n s . T h e a b i l i t y o f L e p t o s p i r i l l u m s p p . t o l e a c ho r e i s r e f l e c t e d b y i t s s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y . F e r r o u s i r o n a n dp y r i t e s e r v e a s s u b s t r a t e s f o r g r o w t h . O t h e r s u l f u r com-p o u n d s a s w e l l a s y e a s t e x t r a c t - s u p p l e m e n t e d s u b s t r a t e s( m i x o t r o p h y ) f a i l e d t o s u p p o r t g r o w t h . C h e m o o r g a n o t r o p h i cg r o w t h a l s o was n o t d e t e c t a b l e . T h e d a t a a r e i n a c c o r d a n c ew i t h t h o s e o f t h e f i r s t w o r k o n L . f e r r o o x i d a n s ( 1 7 ) .

C o n s i d e r a b l e e v i d e n c e f o r t h e i m p o r t a n c e o f L . f e r r o o x i -d a n s c a n l i k e w i s e b e d e r i v e d f r o m t h e f a c t t h a t i t h a s t h es a m e f e r r o u s - i r o n - o x i d i z i n g a c t i v i t y a s T . f e r r o o x i d a n s wheng r o w i n g o n p y r i t e o r c o m p l e x s u l f i d i c o r e . M e a s u r e m e n t s o ft h e a c t i v i t i e s o f b o t h ( 2 5 ) y i e l d e d t h e same v a l u e s .L e p t o s p i r i l l i a r e a s i m p o r t a n t a s t h i o b a c i l l i a t l e a s t i n t h em e c h a n i s m o f i n d i r e c t l e a c h i n g v i a f e r r i c i r o n .I n a d d i t i o n , i t s e e m s t h a t l e p t o s p i r i l l i a d h e r e t o s u r f a c e sm o r e t i g h t l y t h a n d o T . f e r r o o x i d a n s c e l l s . As a n r e s u l t o ft h i s f i n d i n g , t h e i m p a c t o f L . f e r r o o x i d a n s w i l l u s u a l l y b eu n d e r e s t i m a t e d o r p e r h a p s n o t b e d e t e c t e d a t a l l b e ca u s e o fl o w c e l l c o u n t s .T h e G+C c o n t e n t s o f t h e o r i g i n a l s t r a i n a n d o f some o t h e ri s o l a t e s w e r e a n a l y z e d ( 1 0 ) ; t h e v a l u e s r a n g e d b e t w e e n 5 0a n d 5 7 % . O u r two s t r a i n s f i t w e l l i n t h i s r a n g e . T h e w i d er a n g e o f v a l u e s i n d i c a t e s t h e e x i s t e n c e o f a p h e n o s p e c i e sw i t h s e v e r a l g e n o s p e c i e s . T h i s h a s b e e n d e m o n s t r a t e d f o rt h e p h e n o s p e c i e s N i t r o s o m o n a s ( 1 5 ) a n d w i l l a l s o a p p l y t o L .f e r r o o x i d a n s a n d T . f e r r o o x i d a n s . I n t h e c a s e o f T . f e r r o o x -i d a n s , a G+C c o n t e n t r a n g e o f 5 7 t o 65% h a s b e e n d e s c r i b e d( 9 ) a n d , a c c o r d i n g l y , a s u b d i v i s i o n o f t h e s p e c i e s was p r o -p o s e d . A d d i t i o n a l d a t a on D N A - D N A h o m o l o g i e s i n d i c a t et h a t o u r t w o s t r a i n s o f L . f e r r o o x i d a n s b e l o n g t o twog e n o s p e c i e s ( 1 S a ) . F u r t h e r w o r k w i l l b e n e c e s s a r y t o e s t a b -l i s h t h e e v o l u t i o n a r y t r e e o f t h e a c i d o p h i l i c f e r r o u s - i r o n -o x i d i z i n g b a c t e r i a ( 9 , 1 0 , 3 3 ) . B e c a u s e o f t h e i r a c i d t o l e r a n c ea n d p o s s e s s i o n o f u n i q u e e n z y m e s y s t e m s f o r o xi d a t i o n o ff e r r o u s i r o n ( 3 ) , t h e s e b a c t e r i a a r e a b l e t o g r o w i n ane c o l o g i c a l n i c h e w h i c h i s p o i s o n o u s f o r most o t h e r m i c r o o r -g a n i s m s . T h e s e u n i q u e p r o p e r t i e s m a k e t h e m u s e f u l f o rm i c r o b i a l m e t a l l e a c h i n g .

A CK N O W L E D G M E N T ST h i s r e p o r t h a s b e e n p r e p a r e d w i t h i n t h e f r a m e w o r k o f s c i e n t i f i cc o o p e r a t i o n b e t w e e n t h e I n s t i t u t e f o r B i o l o g i c a l S c i e n c e s ( I o nL a z a r ) i n B u c h a r e s t , R o m a n i a ; t h e I n s t i t u t e f o r R e s e a r c h , E n g i n e e r -i n g , a n d N o n f e r r o u s M e t a l s ( S . C o s m a a n d V . O r o s ) i n B a i a M a r e ,R o m a n i a ; t h e M i n a I l b a ( I . D u l f u ) near B a i a M a r e a n d s e v e r a l o t h e rm i n e s i n R o m a n i a ; t h e T e c h n i c a l U n i v e r s i t y B r a u n s c h w e i g ( I n s t i -t u t e f o r M i c r o b i o l o g y , R . N a e v e k e a n d A . D o r r o n g ) ; t h e F e d e r a lI n s t i t u t e f o r G e o s c i e n c e s a n d N a t u r a l R e s o u r c e s ( K . B o s e c k e r ) ,H a n n o v e r , G e r m a n y ; a n d t h e U n i v e r s i t y o f H a m b u r g ( D e p a r t m e n to f M i c r o b i o l o g y , W . S a n d ) u n d e r t h e g u i d a n c e o f PLR/KFA J u l i c h( A . N o s k e a n d B . V i e r k o r n - R u d o l p h ) i n J u i l i c h , G e r m a n y . T h e

V O L . 5 8 , 1 9 9 2

8/8/2019 Evaluation of Leptospirillum ferrooxidans

8/8

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .r e s e a r c h a t t h e U n i v e r s i t y o f Hamburg w a s f u n d e d b y a g r a n t f r o mt h e F e d e r a l M i n i s t e r f o r R e s e a r c h a n d T e c h n o l o g y ( 0 3 R 0 8 9 A 5 ) t oW . S .W e a p p r e c i a t e t h e s u p p o r t o f E . B o c k , A . N o s k e , a n d B .V i e r k o r n - R u d o l p h .

R E F E R E NCE S1 . A h o n e n , L . , a n d 0 . H . T u o v i n e n . 1 9 8 9 . M i c r o b i o l o g i c a l o x i d a -t i o n o f f e r r o u s i r o n a t l o w t e m p e r a t u r e s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o -b i o l . 5 5 : 3 1 2 - 3 1 6 .2 . A n o n y m o u s . 1 9 8 4 . B e s t i m m u n g v o n E i s e n , E 1 , p . 1 - 1 0 . I nD e u t s c h e E i n h e i t s v e r f a h r e n z u r W a s s er -, A b w a s s er - u n dS c h l a m m u n t e r s u c h u n g . V e r l a g C h e m i e , W e i n h e i m , G e r m a n y .3 . B a r r , D . W . , W. J . I n g l e d e w , a n d P . R . N o r r i s . 1 9 9 0 . R e s p i r a -t o r y c h a i n c o m p o n e n t s o f i r o n - o x i d i z i n g , a c i d o p h i l i c b a c t e r i a .F E M S M i c r o b i o l . L e t t . 7 0 : 8 5 - 9 0 .4 . B r a d f o r d , M. M. 1 9 7 6 . R a p i d a n d s e n s i t i v e m e t h o d s f o r t h eq u a n t i t a t i o n o f m i c r o g r a m q u a n t i t i e s o f p r o t e i n u t i l i z i n g t h ep r i n c i p l e o f p r o t e i n - d y e b i n d i n g . A n n . B i o c h e m. 7 2 : 2 4 8 - 2 5 4 .5 . D u g a n , P . R . , a n d W. A . A p e l . 1 9 7 8 . M i c r o b i o l o g i c a l d e s u l f u r -i z a t i o n o f c o a l , p . 2 2 3 - 2 5 0 . I n L . A . M u r r , A . E . T o r m a , a n dJ . A . B r i e r l e y ( e d . ) , M e t a l l u r g i c a l a p p l i c a t i o n o f b a c t e r i a l l e a c h -i n g a n d r e l a t e d m i c r o b i o l o g i c a l p h e n o m e n a . A c a d e m i c P r e s s ,I n c . , N ew Y o r k .6 . E h r l i c h , H . L . 1 9 6 3 . M i c r o o r g a n i s m s i n a c i d d r a i n a g e f r o m ac o p p e r m i n e . J . B a c t e r i o l . 8 6 : 3 5 0 - 3 5 2 .7 . H a r r i s o n , A . P . , J r . 1 9 7 8 . M ic r ob i a l s u cc es s i on a n d m i n e r a ll e a c h i n g i n a n a r t i f i c i a l c o a l s p o i l . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .3 6 : 8 6 1 - 8 6 9 .8 . H a r r i s o n , A . P . , J r . 1 9 8 1 . A c i d i p h i l i u m c r y p t u m g e n . n o v . , s p .n o v . , h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i u m f r o m a c i d i c m i n e r a l e n v i r o n -m e n t s . I n t . J . S y s t . B a c t e r i o l . 3 1 : 3 2 7 - 3 3 2 .9 . H a r r i s o n , A . P . , J r . 1 9 8 2 . G e n o m i c a n d p h y s i o l o g i c a l d i v e r s i t ya m o n g s t s t r a i n s o f T h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s a n d g e n om i c c o m -p a r i s o n w i t h T h i o b a c i l l u s t h i o o x i d a n s . A r c h . M i c r o b i o l . 1 3 1 : 6 8 -7 6 .1 0 . H a r r i s o n , A . P . , J r . , a n d P . R . N o r r i s . 1 9 8 5 . L e p t o s p i r i l l u mf e r r o o x i d a n s a n d s i m i l a r b a c t e r i a : s o m e c h a r a c t e r i s t i c s a n dg e n o m i c d i v e r s i t y . F E M S M i c r o b i o l . L e t t . 3 0 : 9 9 - 1 0 2 .1 1 . H u t c h i n s , S . R . , M. S . D a v i d s o n , J . A . B r i e r l e y , a n d C . L .B r i e r l e y . 1 9 8 6 . M i c r o o r g a n i s m s i n r e cl a m a t i on o f m e t a l s . A n n u .R e v . M i c r o b i o l . 4 0 : 3 1 1 - 3 3 6 .1 2 . H u t c h i n s o n , M . , K . I . J o h n s t o n e , a n d D . W h i t e. 1 9 6 5 . T h e

t a x o n o m y o f c e r t a i n t h i o b a c i l l i . J . G e n . M i c r o b i o l . 4 1 : 3 5 7 - 3 6 6 .1 3 . K a r a v a i k o , G . I . , B . D . K h a l e z o v , V . V . A b a k u m o v , R . S .G o l o v a t c h e v a , T . V . K o v a l e n k o , V . P . P i s k u n o v , a n d L . N .S k r i p c h e n k o . 1 9 8 4 . D i s t r i b u t i o n a n d a c t i v i t y o f m i c r o o r g a n i s m si n n o n f e r r o u s m e t a l s l e a c h i n g i n t h e M i k o l a e v s k o y e d e p o s i t .M i k r o b i o l o g i y a 5 3 : 3 2 9 - 3 3 5 .1 4 . K e l l y , D . P . , a n d A . P . H a r r i s o n . 1 9 8 9 . G e n u s T h i o b a c i l l u sB e i j e r i n c k 1 9 0 4 b , 5 9 7 A L , p . 1 8 4 2 - 1 8 5 8 . I n J . T . S t a l e y , M . P .B r y a n t , N . P f e n n i g , a n d J . G . H o l t ( e d . ) , B e r g e y ' s m a n u a l o fs y s t e m a t i c b a c t e r i o l o g y , v o l . 3 . W i l l i a m s & W i l k i n s C o . , B a l t i -m o r e .1 5 . K o o p s , H . - P . , a n d H . H a r m s . 1 9 8 5 . D e o x y r i b o n u c l e i c a c i dh o m o l o g i e s among 9 6 s t r a i n s o f a m m o n i a - o x i di z i n g b a c t e r i a .A r c h . M i c r o b i o l . 1 4 1 : 2 1 4 - 2 1 8 .1 5 a . K o o p s , H . - P . , a n d A . P o m m e r e n i n g . U n p u b l i s h e d r e s u l t s .1 6 . M a c k i n t o s h , M. E . 1 9 7 8 . N i t r o g e n f i x a t i o n b y T h i o b a c i l l u s

f e r r o o x i d a n s . J . G e n . M i c r o b i o l . 1 0 5 : 2 1 5 - 2 1 8 .1 7 . M a r k o s y a n , G . E . 1 9 7 2 . A ne w i r o n - o x i d i z i n g b a c t e r i u mL e p t o s p i r i l l u m f e r r o o x i d a n s g e n . e t s p . n o v . B i o l . Z h . A r m .2 5 : 2 6 . ( I n R u s s i a n . )1 8 . M a r m u r , J . , a n d P . D o t y . 1 9 6 1 . D e t e r m i n a t i o n o f t h e b a s ec o m p o s i t i o n o f d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d f r o m i t s t h e r m a l d e n a t u r -a t i o n t e m p e r a t u r e . J . M o l . B i o l . 5 : 1 0 9 - 1 8 8 .1 9 . M e r r e t t i g , U . , P . W l o t z k a , a n d U . O n k e n . 1 9 8 9 . T h e r e m o v a l o fp y r i t i c s u l p h u r f r o m c o a l b y L e p t o s p i r i l l u m - l i k e b a c t e r i a . A p p l .M i c r o b i o l . B i o t e c h n o l . 3 1 : 6 2 6 - 6 2 8 .2 0 . M i l d e , K . , W . S a n d , W . W o l f f , a n d E . B o c k . 1 9 8 3 . T h i o b a c i l l i o ft h e c o r r o d e d c o n c r e t e w a l l s o f t h e H a m b u r g s e w e r s y s t e m . J .G e n . M i c r o b i o l . 1 2 9 : 1 3 2 7 - 1 3 3 3 .2 1 . M u y z e r , G . , A . C . d e B r u y n , D . J . M. S c h m e d d i n g , P . B o s , P .W e s t b r o e k , a n d G . J . K u e n e n . 1 9 8 7 . A c o m b i n e d i m m u n o f l u o -r e s c e n c e - D N A - f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g t e c h n i q u e f o r e n u m e r a t i o no f T h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s i n a p o p u l a t i o n o f a c i d o p h i l i cb a c t e r i a . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 3 : 6 6 0 - 6 6 4 .2 2 . N o r r i s , P . R . 1 9 8 3 . I r o n a n d m i n e r a l o x i d a t i o n w i t h L e p t o s p i r i l -l u m - l i k e b a c t e r i a , p . 8 3 - 9 6 . I n G . R o s s i a n d A . E . Torma ( e d . ) ,R e c e n t p r o g r e s s i n b i o h y d r o m e t a l l u r g y . A s s o c i a z i o n e M i n e r a r i aS a r d a , I g l e s i a s , I t a l y .2 3 . N o r r i s , P . R . , D . W . B a r r , a n d D . H i n s o n . 1 9 8 8 . I r o n a n d m i n e r a lo x i d a t i o n b y a c i d o p h i l i c b a c t e r i a : a f f i n i t i e s f o r i r o n a n d a t t a c h -m e n t t o p y r i t e , p . 4 3 - 5 9 . I n P . R . N o r r i s a n d D . P . K e l l y ( e d . ) ,B i o h y d r o m e t a l l u r g y . S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y L e t t e r s , K e w ,S u r r e y , U n i t e d K i n g d o m .2 4 . N o r r i s , P . R . , a n d D . P . K e l l y . 1 9 8 2 . T h e u s e o f m i x e d m i c r o b i a lc u l t u r e s i n m e t a l r e c o v e r y , p . 4 4 3- 4 7 4 . I n A . T . B u l l a n d J . H .S l a t e r ( e d . ) , M i c r o b i a l I n t e r a c t i o n s a n d C o m m u n i t i e s . A c a -d e m i c P r e s s L t d . , L o n d o n .2 5 . P e s i c , B . , D . J . O l i v e r , a n d P . W i c h l a c z . 1 9 8 9 . An e l e c t r o c h e m -i c a l m e t h o d o f m e a s u r i n g t h e o x i d a t i o n r a t e o f f e r r o u s t o f e r r i ci r o n w i t h o x y g e n i n t h e p r e s e n c e o f T h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s .B i o t e c h n o l . B i o e n g . 3 3 : 4 2 8 - 4 3 9 .2 6 . R o s s i , G . 1 9 9 0 . B i o h y d r o m e t a l l u r g y . M c G r a w - H i l l , H a m b u r g ,G e r m a n y .2 7 . S a b a t i n i , D . D . , K . B e n s c h , R . J . B a r r n e t t . 1 9 6 3 . C y t o c h e m i s t r ya n d e l e c t r o n m i c r o s c o p y o f t h e p r e s e r v a t i o n o f c e l l u l a r u l t r a -s t r u c t u r e a n d e n z y m a t i c a c t i v i t y b y a l d e h y d e f i x a t i o n . J . C e l lB i o l . 1 7 : 1 9 - 5 8 .2 8 . S a n d , W. 1 9 8 7 . I m p o r t a n c e o f h y d r o g e n s u l f i d e , t h i o s u l f a t e , a n dm e t h y l m e r c a p t a n f o r g r o w t h o f t h i o b a c i l l i d u r i n g s i m u l a t i o n o fc o n c r e t e c o r r o s i o n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 3 : 1 6 4 5 - 1 6 4 8 .2 9 . S a n d , W. 1 9 8 9 . F e r r i c i r o n r e d u c t i o n b y T h i o b a c i l l u s f e r r o o x i -d a n s a t e x t r e m e l y l o w p H - v a l u e s . B i o g e o c h e m i s t r y 7 : 1 9 5 - 2 0 1 .3 0 . S h i v e l y , J . M . , E . B o c k , K . W e s t p h a l , a n d G . C . C a n n o n . 1 9 7 7 .I c o s a h e d r a l i n c l u s i o n s ( c a r b o x y s o m e s ) o f N i t r o b a c t e r a g i l i s . J .B a c t e r i o l . 1 3 2 : 6 7 3 - 6 7 5 .3 1 . S p e c t o r , T . 1 9 7 8 . R e f i n e m e n t o f t h e C o o m a s s i e b l u e m e t h o d o fp r o t e i n q u a n t i t a t i o n . A n n . B i o c h e m . 8 6 : 1 4 2 - 1 4 6 .3 2 . T u o v i n e n , 0 . H . 1 9 9 0 . B i o l o g i c a l f u n d a m e n t a l s o f m i n e r a l l e a c h -i n g p r o c e s s e s , p . 5 5 - 7 7 . I n H . L . E h r l i c h a n d C . L . B r i e r l e y( e d . ) , M i c r o b i a l m i n e r a l r e c o v e r y . M c G r a w - H i l l B o o k C o . , N ewY o r k .3 3 . Y o k o t a , A . , Y . Y a m a d a , a n d K . I m a i . 1 9 8 8 . L i p o p o l y s a c c h a -r i d e s o f i r o n - o x i d i z i n g L e p t o s p i r i l l u m f e r r o o x i d a n s a n d T h i o b a -c i l l u s f e r r o o x i d a n s . J . G e n . A p p l . M i c r o b i o l . 3 4 : 2 7 - 3 7 .

9 2 SAND E T AL.