11/8/2007

1

Topik 9

METODE EVALUASI ANTIOKSIDAN SECARA IN VITRO DAN IN VIVO

Endang Prangdimurti

DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGANFAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR - 2007PPt e-Learning ENBP

Evaluasi AntioksidanEvaluasi Antioksidan

Dr.Ir. Endang Prangdimurti, MSiDr.Ir. Endang Prangdimurti, MSi

Staf Pengajar Ilmu dan Teknologi Pangan IPBStaf Pengajar Ilmu dan Teknologi Pangan IPB

Antioksidan adalah senyawa yang dapat menahan Antioksidan adalah senyawa yang dapat menahan terjadinya reaksi oksidasi makromolekul, seperti terjadinya reaksi oksidasi makromolekul, seperti lipid, protein, karbohidrat dan DNA, pada lipid, protein, karbohidrat dan DNA, pada konsentrasi yang lebih rendah daripada konsentrasi yang lebih rendah daripada konsentrasi makromolekul target oksidasi tersebut.konsentrasi makromolekul target oksidasi tersebut.

Antioksidan: ada yang dihasilkan dalam tubuh Antioksidan: ada yang dihasilkan dalam tubuh (endogen) maupun yang berasal dari makanan (endogen) maupun yang berasal dari makanan (eksogen). (eksogen).

11/8/2007

2

Komponen yang terlibat dalam sistem antioksidanKomponen yang terlibat dalam sistem antioksidan

Komponen endogen :• glutation (GSH) dan Se-glutation peroksidase• Fe-katalase• NADPH• ubiquinol-10 (koenzim Q10 tereduksi)• Mn, Cu, Zn-SOD (superoksida dismutase)• asam urat• asam lipoat• hormon-hormon dengan aktivitas antioksidan

(contoh: melatonin)• protein pengikat logam,

misalnya protein pengikat Fe dan Cu (transferin, seruloplasmin), protein pengikat Fe kompleks (heptoglobin, hemopexin)

Komponen yang terlibat dalam sistem antioksidanKomponen yang terlibat dalam sistem antioksidan

Antioksidan pangan dan antioksidan eksogen :

• tokoferol dan tokotrienol (vitamin E)• askorbat (vitamin C)• vitamin A dan karotenoid (-karoten, likopen, lutein, dll)• Se (dan logam esensial lainnya yang berperan dalam

fungsi enzim antioksidan)• senyawa-senyawa fitokimia dengan aktivitas antioksidan• komponen pangan lain (CoQ10, glutation, asam lipoat, dll)• antioksidan pangan (BTP) (BHA, BHT, propil galat, TBHQ,

ekstrak rosemary)

Penggolongan antioksidanPenggolongan antioksidan

Berdasarkan cara kerjanya :Berdasarkan cara kerjanya :

•• Antioksidan preventifAntioksidan preventif : menekan pembentukan radikal bebas: menekan pembentukan radikal bebas-- disebut juga antioksidan sekunderdisebut juga antioksidan sekunder

1.a. Dekomposisi hidroperoksida dan hidrogen peroksida1.a. Dekomposisi hidroperoksida dan hidrogen peroksida : peroksida : peroksida didekomposisi menjadi produk nonradikaldidekomposisi menjadi produk nonradikalKatalaseKatalase: d: dekomposisi hidrogen peroksida ekomposisi hidrogen peroksida Glutation peroksidase (seluler)Glutation peroksidase (seluler): d: dekomposisi hidrogen peroksida dan ekomposisi hidrogen peroksida dan hidroperoksida asam lemak bebashidroperoksida asam lemak bebasGlutation peroksidase (plasma)Glutation peroksidase (plasma): d: dekomposisi hidrogen peroksida dan fosfolipid ekomposisi hidrogen peroksida dan fosfolipid hidroperoksida hidroperoksida Fosfolipid hidroperoksida glutation peroksidaseFosfolipid hidroperoksida glutation peroksidase: d: dekomposisi ekomposisi fosfolipid fosfolipid hidroperoksidahidroperoksidaPeroksidase: dPeroksidase: dekomposisi lipid hidroperoksidaekomposisi lipid hidroperoksidaGlutation SGlutation S--transferase: dtransferase: dekomposisi lipid hidroperoksidaekomposisi lipid hidroperoksida

11/8/2007

3

1. b. Pengkelat logam1. b. Pengkelat logam

Transferin, laktoferinTransferin, laktoferin: : mengikat Femengikat Fe

HaptoglobinHaptoglobin: : mengikat hemoglobinmengikat hemoglobin

HemopexinHemopexin: : menstabilkan hememenstabilkan heme

Seruloplasmin, albuminSeruloplasmin, albumin: : mengikat Cumengikat Cu

1.c. Pendeaktifasi (quencher) SOA1.c. Pendeaktifasi (quencher) SOA (species oxygen active)(species oxygen active)

Superoxida dismutase (SOD): Superoxida dismutase (SOD): disproporsionasi superoksidadisproporsionasi superoksida

Karotenoid, vitamin EKarotenoid, vitamin E : : mendeaktifasi singlet oksigenmendeaktifasi singlet oksigen

2.2. Antioksidan peredam radikalAntioksidan peredam radikal (radical(radical--scavenging scavenging

antioxidants): bereaksi dengan senyawa radikal untuk memutus antioxidants): bereaksi dengan senyawa radikal untuk memutus

rantai propagasi rantai propagasi

-- umumnya antioksidan ini akan berubah menjadi antioksidan umumnya antioksidan ini akan berubah menjadi antioksidan

radikal setelah bekerja meredam senyawa radikalradikal setelah bekerja meredam senyawa radikal

-- disebut juga antioksidan primerdisebut juga antioksidan primer

-- berdasarkan sifat kelarutannya, dibedakan menjadi :berdasarkan sifat kelarutannya, dibedakan menjadi :

a. Golongan hidrofilik : va. Golongan hidrofilik : vitamin C, asam urat, bilirubin, albumin itamin C, asam urat, bilirubin, albumin

b. Golongan lipofilik : vb. Golongan lipofilik : vitamin E, ubiquinol, karotenoid, flavonoidsitamin E, ubiquinol, karotenoid, flavonoids

Enzim-enzim antioksidan utama (SOD, katalase, glutation peroksidase) saling bekerjasama mengeliminir anion superoksida yang terbentuk secara normal di dalam tubuh

11/8/2007

4

ANTIOKSIDAN DALAM PANGANANTIOKSIDAN DALAM PANGAN

Antioksidan : antioksidan gizi dan non giziAntioksidan : antioksidan gizi dan non gizi

Antioksidan non giziAntioksidan non gizi

vitamin E (tokoferol dan tokotrienol)vitamin E (tokoferol dan tokotrienol) vitamin C (asam askorbat)vitamin C (asam askorbat) vitamin A dan beta karoten (prekursor non gizi)vitamin A dan beta karoten (prekursor non gizi) zat gizi esensial untuk berfungsinya sistem antioksidan zat gizi esensial untuk berfungsinya sistem antioksidan

endogen, seperti mineral Cu, Mn, Zn, Fe (keempatnya endogen, seperti mineral Cu, Mn, Zn, Fe (keempatnya kofaktor enzim SOD), Se, dan vitamin riboflavin merupakan kofaktor enzim SOD), Se, dan vitamin riboflavin merupakan kofaktorkofaktor--kofaktor penting dalam sistem enzim antioksidan.kofaktor penting dalam sistem enzim antioksidan.

Vitamin EVitamin E

Vitamin E berada pada membran sel dan dalam LDL yang Vitamin E berada pada membran sel dan dalam LDL yang bersirkulasibersirkulasi

merupakan antioksidan non polar (antioksidan utama pada merupakan antioksidan non polar (antioksidan utama pada medium non polar)medium non polar)

αα--tokoferol efektif dalam sistem pangan, sedangkan tokoferol efektif dalam sistem pangan, sedangkan --tokoferol efektif dalam tokoferol efektif dalam in vivo.in vivo.

Vitamin E bekerja sebagai antioksidan pemutus rantai Vitamin E bekerja sebagai antioksidan pemutus rantai (mendonorkan atom H pada radikal) serta mendeaktifasi (mendonorkan atom H pada radikal) serta mendeaktifasi singlet oksigen singlet oksigen

Vitamin E radikal dapat diregenerasi oleh vitamin CVitamin E radikal dapat diregenerasi oleh vitamin C Sumber utama : sayuran, bijiSumber utama : sayuran, biji--bijian, minyak kacangbijian, minyak kacang--kacangankacangan RDA : 15 IURDA : 15 IU

Vitamin EVitamin Elaboratory and animal studieslaboratory and animal studies

Vitamin E Vitamin E the oxidation of LDLthe oxidation of LDL--CC

inhibit smoothinhibit smooth--muscle cell growthmuscle cell growth

inhibit platelet adhesioninhibit platelet adhesion

improves endothelial functionimproves endothelial function

reduced the number and severity of atherosclerotic reduced the number and severity of atherosclerotic lesions in rabbits fed highlesions in rabbits fed high--fat dietsfat diets

Clin Cardiol 1993;16:I16-18

11/8/2007

5

Vitamin CVitamin C

merupakan antioksidan utama pada medium polar merupakan antioksidan utama pada medium polar ((darah, cairan interstitial dan sitosol)darah, cairan interstitial dan sitosol)

bekerja mendonorkan atom H pada radikal, bekerja mendonorkan atom H pada radikal, mendeaktifasi anion superoksida dan singlet oksigen, mendeaktifasi anion superoksida dan singlet oksigen, meregenerasi radikal vitamin E. meregenerasi radikal vitamin E.

Namun dapat menjadi prooksidan dalam reduksi FeNamun dapat menjadi prooksidan dalam reduksi Fe3+3+

menjadi Femenjadi Fe2+2+ (reaksi Fenton)(reaksi Fenton) Sumber : buah dan sayurSumber : buah dan sayur RDA : 60 mgRDA : 60 mg

Vitamin CVitamin C

a watera water--soluble vitaminsoluble vitamin

found in many fruits and vegetablesfound in many fruits and vegetables

a less potent antioxidant than vit Ea less potent antioxidant than vit E

associated with lower LDLassociated with lower LDL--C, higher HDLC, higher HDL--C, C, and lower BPand lower BP

inhibits platelet aggregationinhibits platelet aggregation

recommended daily allowance 60 mgrecommended daily allowance 60 mg

Tokoferol mendonorkan atom H-nya kepada radikal lipid peroksida (LOO*). Radikal tokoferol yang terbentuk diregenerasi oleh vitamin C (asam askorbat).

11/8/2007

6

KarotenoidKarotenoid

Berada di dalam darah dan membranBerada di dalam darah dan membran

Karotenoid dan vitamin A bekerja mendeaktifasi singlet Karotenoid dan vitamin A bekerja mendeaktifasi singlet oksigen dan meredam SOA lain.oksigen dan meredam SOA lain.

Kemampuan mendeaktifasi singlet oksigen lebih besar Kemampuan mendeaktifasi singlet oksigen lebih besar dibandingkan asam askorbat maupun tokoferoldibandingkan asam askorbat maupun tokoferol

BetaBeta--carotenecarotene

A plantA plant--derived nutrientderived nutrient

contained in yellow and orange vegetables and contained in yellow and orange vegetables and fruits, and leafy green vegetablesfruits, and leafy green vegetables

provides up to half of dietary vit Aprovides up to half of dietary vit A

recommended daily allowance is 5,000 IUrecommended daily allowance is 5,000 IU

MineralMineral--mineralmineral

Zn, Cu, Mn Zn, Cu, Mn kofaktor enzim kofaktor enzim Superoxide Dismutases (SOD) Superoxide Dismutases (SOD)

Zinc/copper superoxide dismutaseZinc/copper superoxide dismutase MitochondriaMitochondria Superoxide (O2Superoxide (O2--) to O2 and water) to O2 and waterManganese superoxide dismutaseManganese superoxide dismutase Mitochondia and cytosolMitochondia and cytosol Superoxide to O2 and waterSuperoxide to O2 and water

Se Se kofaktor kofaktor Glutathione peroxidase (GPx)Glutathione peroxidase (GPx) MitochondiaMitochondia Peroxides to waterPeroxides to water

11/8/2007

7

Antioksidan non gizi Antioksidan non gizi

GolonganGolongan Contoh senyawaContoh senyawa

KarotenoidKarotenoid Likopen, lutein, astaxantinLikopen, lutein, astaxantin

BioflavonoidBioflavonoid Genistein, diadzein, quercetinGenistein, diadzein, quercetin

FitosterolFitosterol Sitosterol, stigmasterol, oryzanolSitosterol, stigmasterol, oryzanol

TanninTannin Katekin dan komponen polifenol lainnyaKatekin dan komponen polifenol lainnya

KlorofilKlorofil KlorofilKlorofil--a dan klorofilina dan klorofilin

TerpenoidTerpenoid Limonin dan limoneneLimonin dan limonene

Senyawa allylicSenyawa allylic Diallyl sulfida dan disulfidaDiallyl sulfida dan disulfida

IndolesIndoles IndoleIndole--33--carbinolcarbinol

11/8/2007

8

METODE EVALUASI ANTIOKSIDANMETODE EVALUASI ANTIOKSIDAN

Pengujian kapasitas antioksidan suatu senyawa dilakukan secara Pengujian kapasitas antioksidan suatu senyawa dilakukan secara bertahap sebagai berikut :bertahap sebagai berikut :

Uji in vitro menggunakan reaksi kimia, misalnya metilUji in vitro menggunakan reaksi kimia, misalnya metil--linoleat, DPPHlinoleat, DPPH

Uji in vitro menggunakan materi biologis, misalnya mengukur Uji in vitro menggunakan materi biologis, misalnya mengukur viabilitas sel (teknik kultur sel), pembentukan dien viabilitas sel (teknik kultur sel), pembentukan dien terkonjugasi dan kadar TBARS dari isolat LDL, dan lainterkonjugasi dan kadar TBARS dari isolat LDL, dan lain--lainlain

Uji in vivo pada model hewan percobaan, misalnya aktifitas Uji in vivo pada model hewan percobaan, misalnya aktifitas enzim antioksidan, kadar TBARSenzim antioksidan, kadar TBARS

Uji in vivo pada manusia Uji in vivo pada manusia

Pengujian in vitro menggunakan reaksi kimiaPengujian in vitro menggunakan reaksi kimia

DPPH atau ABTSDPPH atau ABTS

DPPH dan ABTS merupakan senyawa radikal yang relatif DPPH dan ABTS merupakan senyawa radikal yang relatif stabil. stabil.

DPPH berwarna ungu, namun apabila DPPH tereduksi oleh DPPH berwarna ungu, namun apabila DPPH tereduksi oleh suatu antioksidan akan mengakibatkan penurunan intensitas suatu antioksidan akan mengakibatkan penurunan intensitas warna ungu (memudar). warna ungu (memudar).

Semakin besar selisih absorbansi dibandingkan kontrol (tanpa Semakin besar selisih absorbansi dibandingkan kontrol (tanpa penambahan antioksidan) menunjukkan semakin tingginya penambahan antioksidan) menunjukkan semakin tingginya aktivitas antioksidan senyawa uji.aktivitas antioksidan senyawa uji.

Dien TerkonjugasiDien Terkonjugasi

Oksidasi asam lemak tidak jenuh mengubah ikatan rangkap menjadi Oksidasi asam lemak tidak jenuh mengubah ikatan rangkap menjadi konfigurasi dien terkonjugasi atau konfigurasi trien terkonjugasi. konfigurasi dien terkonjugasi atau konfigurasi trien terkonjugasi.

KonfigurasiKonfigurasi--konfigurasi ini dapat diukur dengan spektrofotometer konfigurasi ini dapat diukur dengan spektrofotometer UV langsung atau melalui kompleks turunan dengan spektra UV langsung atau melalui kompleks turunan dengan spektra absorpsi. absorpsi.

Untuk pengujian antioksidan suatu senyawa uji, senyawa tersebut Untuk pengujian antioksidan suatu senyawa uji, senyawa tersebut diinkubasi bersamadiinkubasi bersama--sama dengan asam linoleat, kemudian dioksidasi sama dengan asam linoleat, kemudian dioksidasi oleh CuSOoleh CuSO44. Kadar dien terkonjugasi diukur pada 245 nm setiap . Kadar dien terkonjugasi diukur pada 245 nm setiap interval waktu tertentu sejak penambahan CuSOinterval waktu tertentu sejak penambahan CuSO44 sehingga sehingga membentuk kurva oksidasi. membentuk kurva oksidasi. Semakin besar aktivitas antioksidan Semakin besar aktivitas antioksidan ditunjukkan oleh semakin panjangnya fase lag (dalam menit) ditunjukkan oleh semakin panjangnya fase lag (dalam menit) oksidasi.oksidasi.

Pengujian in vitro menggunakan reaksi Pengujian in vitro menggunakan reaksi kimiakimia

11/8/2007

9

Pengujian in vitro menggunakan materi biologisPengujian in vitro menggunakan materi biologis

Teknik kultur selTeknik kultur sel Senyawa uji dikultur bersama sel limfosit yang diisolasi dari Senyawa uji dikultur bersama sel limfosit yang diisolasi dari

hewan atau manusia, kemudian diukur tingkat proliferasi sel hewan atau manusia, kemudian diukur tingkat proliferasi sel tersebut setelah masa inkubasi tertentu. tersebut setelah masa inkubasi tertentu.

Sebagai pembanding digunakan model yang sama namun Sebagai pembanding digunakan model yang sama namun diberi stres oksidatif menggunakan senyawa oksidator diberi stres oksidatif menggunakan senyawa oksidator (misalnya H(misalnya H22OO22), dan sebagai kontrol adalah model tanpa ), dan sebagai kontrol adalah model tanpa penambahan senyawa uji. penambahan senyawa uji.

Agar dapat menerima respon/sinyal untuk berproliferasi, sel Agar dapat menerima respon/sinyal untuk berproliferasi, sel harus memiliki membran yang utuh. Adanya oksidasi pada harus memiliki membran yang utuh. Adanya oksidasi pada lipid penyusun struktur membran sel mengakibatkan sel tidak lipid penyusun struktur membran sel mengakibatkan sel tidak dapat merespon sinyal sehingga tingkat proliferasi sel dapat merespon sinyal sehingga tingkat proliferasi sel menurun. menurun.

Dengan kultur sel dapat diukur pula kadar TBARS sebagai Dengan kultur sel dapat diukur pula kadar TBARS sebagai indikator peroksidasi lipid.indikator peroksidasi lipid.

LDL teroksidasiLDL teroksidasi Model ini menggunakan LDL yang diisolasi dari Model ini menggunakan LDL yang diisolasi dari

hewan atau manusia. hewan atau manusia. Senyawa uji diinkubasi bersamaSenyawa uji diinkubasi bersama--sama dengan LDL, sama dengan LDL,

kemudian dioksidasi oleh CuSOkemudian dioksidasi oleh CuSO44. Kadar dien . Kadar dien terkonjugasi diukur pada 245 nm setiap interval terkonjugasi diukur pada 245 nm setiap interval waktu tertentu sejak penambahan CuSO4 sehingga waktu tertentu sejak penambahan CuSO4 sehingga membentuk kurva LDL teroksidasi. membentuk kurva LDL teroksidasi.

Semakin besar aktivitas antioksidan ditunjukkan oleh Semakin besar aktivitas antioksidan ditunjukkan oleh semakin panjangnya fase lag (dalam menit) oksidasi. semakin panjangnya fase lag (dalam menit) oksidasi.

Sebagai pembanding digunakan model yang sama Sebagai pembanding digunakan model yang sama namun tanpa penambahan senyawa uji. namun tanpa penambahan senyawa uji.

Pengujian in vitro menggunakan materi biologisPengujian in vitro menggunakan materi biologis

Pengujian in vivoPengujian in vivo(menggunakan hewan percobaan atau manusia)(menggunakan hewan percobaan atau manusia)

MulaMula--mula senyawa uji diberikan kepada subyek, kemudian mula senyawa uji diberikan kepada subyek, kemudian diukur keberadaan beberapa komponen yang terlibat dalam diukur keberadaan beberapa komponen yang terlibat dalam sistem antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, sistem antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, aktivitas enzim antioksidan dan lainnya) aktivitas enzim antioksidan dan lainnya)

Indikator lainnya yaitu dari pernafasan (hidrokarbon volatil, Indikator lainnya yaitu dari pernafasan (hidrokarbon volatil, HH22OO22), dari urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah ), dari urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah (TBARS, LDL teroksidasi, H(TBARS, LDL teroksidasi, H22OO22, glutation dan lainnya). , glutation dan lainnya).

Apabila menggunakan hewan percobaan dapat dibandingkan Apabila menggunakan hewan percobaan dapat dibandingkan dengan model yang diberi stres oksidatif. dengan model yang diberi stres oksidatif.

11/8/2007

10

Vitamin E (tokoferol)Vitamin E (tokoferol)

Status vitamin E dapat diperkirakan dengan pengukuran kadar tokoferol Status vitamin E dapat diperkirakan dengan pengukuran kadar tokoferol dan tokotrienol dalam plasma dan/atau jaringan adipose. dan tokotrienol dalam plasma dan/atau jaringan adipose.

Tokoferol utama dalam plasma, yaitu Tokoferol utama dalam plasma, yaitu αα dan dan , diukur dengan HPLC. , diukur dengan HPLC. Metode terdahulu yaitu dengan menggunakan GC.Metode terdahulu yaitu dengan menggunakan GC.

Untuk setiap 10 kali lipat peningkatan konsumsi Untuk setiap 10 kali lipat peningkatan konsumsi αα--tokoferol, menghasilkan tokoferol, menghasilkan peningkatan kadarnya dalam plasma sekitar 2 kali lipat.peningkatan kadarnya dalam plasma sekitar 2 kali lipat.

Level Level --tokoferol dalam plasma lebih tinggi daripada tokoferol dalam plasma lebih tinggi daripada --tokoferol meskipun tokoferol meskipun asupan asupan --tokoferol lebih tinggi. Hal ini terkait dengan peran protein tokoferol lebih tinggi. Hal ini terkait dengan peran protein pengikat pengikat --tokoferol. tokoferol.

Tokotrienol dan tokoferol lain juga mempunyai fungsi antioksidan yang Tokotrienol dan tokoferol lain juga mempunyai fungsi antioksidan yang penting. Oleh karena itu, estimasi status vitamin E dalam tubuh yang hanya penting. Oleh karena itu, estimasi status vitamin E dalam tubuh yang hanya berdasarkan kadar berdasarkan kadar --tokoferol saja adalah tindakan yang kurang tepat atau tokoferol saja adalah tindakan yang kurang tepat atau bahkan tidak tepat. bahkan tidak tepat.

Selenium (Se)Selenium (Se)

Selenium adalah kofaktor enzim antioksidan glutation Selenium adalah kofaktor enzim antioksidan glutation peroksidase (Seperoksidase (Se--GSHGSH--Px) yang memiliki bentuk yang Px) yang memiliki bentuk yang beragam. beragam.

Pengukuran status Se dapat dilakukan dengan mengukur kadar Pengukuran status Se dapat dilakukan dengan mengukur kadar Se plasma menggunakan Se plasma menggunakan graphitegraphite--furnace atomic absorptionfurnace atomic absorption. .

Enzim SeEnzim Se--GSHGSH--Px dapat diukur pada plasma, platelet, dan sel Px dapat diukur pada plasma, platelet, dan sel darah merah (eritrosit). darah merah (eritrosit).

Se eritrosit adalah indikator status Se jangka panjang yang Se eritrosit adalah indikator status Se jangka panjang yang baik, namun analisisnya rumit dikarenakan interferensi dari Fe baik, namun analisisnya rumit dikarenakan interferensi dari Fe dan Cu dalam hemolisat. Oleh karena itu tahap digesti basah dan Cu dalam hemolisat. Oleh karena itu tahap digesti basah menggunakan asam perklorat dan asam nitrit penting menggunakan asam perklorat dan asam nitrit penting dilakukan dalam analisis Se eritrosit. dilakukan dalam analisis Se eritrosit.

Askorbat (vitamin C)Askorbat (vitamin C)

Analisis askorbat dalam plasma dilakukan dengan menggunakan Analisis askorbat dalam plasma dilakukan dengan menggunakan

metode HPLC yang telah divalidasi. metode HPLC yang telah divalidasi.

Askorbat dalam plasma terdegradasi menjadi produk sekunder Askorbat dalam plasma terdegradasi menjadi produk sekunder

walaupun disimpan pada suhu walaupun disimpan pada suhu --7070ooC apabila tidak distabilkan dengan C apabila tidak distabilkan dengan

asam metafosforat pada saat kolektif.asam metafosforat pada saat kolektif.

Secara Secara in vitroin vitro, askorbat dapat juga berperan sebagai prooksidan, , askorbat dapat juga berperan sebagai prooksidan,

karena askorbat mereduksi ion feri menjadi fero dan mempromosikan karena askorbat mereduksi ion feri menjadi fero dan mempromosikan

terjadinya reaksi Fenton. Secara terjadinya reaksi Fenton. Secara in vivoin vivo, peran askorbat sebagai , peran askorbat sebagai

prooksidan masih kontroversial.prooksidan masih kontroversial.

11/8/2007

11

KarotenoidKarotenoid

Sebagai indikator status karotenoid dalam plasma umumnya Sebagai indikator status karotenoid dalam plasma umumnya berdasarkan kadar likopen dan berdasarkan kadar likopen dan --karoten dalam plasma. karoten dalam plasma.

Pengukuran status karotenoid akan lebih baik jika Pengukuran status karotenoid akan lebih baik jika berdasarkan pengukuran beberapa karotenoid dibandingkan berdasarkan pengukuran beberapa karotenoid dibandingkan hanya satu parameter. hanya satu parameter.

Pengukuran kompleks karotenoid dalam jaringan biologis Pengukuran kompleks karotenoid dalam jaringan biologis dapat dilakukan dengan menggunakan metode HPLC.dapat dilakukan dengan menggunakan metode HPLC.

Meskipun karotenoid bereaksi dengan cepat dengan singlet Meskipun karotenoid bereaksi dengan cepat dengan singlet oksigen dan juga bekerja efisien menangkap ROS lain secara oksigen dan juga bekerja efisien menangkap ROS lain secara in vitro, namun perannya secara in vivo sebagai antioksidan in vitro, namun perannya secara in vivo sebagai antioksidan belum terbukti secara penuh. belum terbukti secara penuh.

Glutation (GSH)Glutation (GSH)

Salah satu antioksidan larut air yang utama dalam tubuh Salah satu antioksidan larut air yang utama dalam tubuh manusia adalah tripeptida glutation (GSH), yang berperan manusia adalah tripeptida glutation (GSH), yang berperan sebagai kofaktor GSHsebagai kofaktor GSH--Px dan GSHPx dan GSH--SS--transferase. transferase.

Biosintesis GSH memerlukan asam amino sistein dan Biosintesis GSH memerlukan asam amino sistein dan metionin, sehingga kekurangan konsumsi asam amino tersebut metionin, sehingga kekurangan konsumsi asam amino tersebut berakibat pada defisiensi GSH. berakibat pada defisiensi GSH.

GSH dapat diukur dalam plasma, eritrosit, dan limfosit.GSH dapat diukur dalam plasma, eritrosit, dan limfosit. Pengukuran kadar GSH dapat dilakukan dengan kolorimetri Pengukuran kadar GSH dapat dilakukan dengan kolorimetri

dan HPLC. HPLC dapat mengukur baik GSH maupun GSSG dan HPLC. HPLC dapat mengukur baik GSH maupun GSSG (glutation tereduksi) dalam plasma, sel dan jaringan.(glutation tereduksi) dalam plasma, sel dan jaringan.

EnzimEnzim--enzim Antioksidanenzim Antioksidan

Analisis dilakukan dengan menggunakan sel darah Analisis dilakukan dengan menggunakan sel darah merah. merah.

Setelah dihemolisis, enzim antioksidan yang Setelah dihemolisis, enzim antioksidan yang umumnya diukur adalah aktivitas enzim :umumnya diukur adalah aktivitas enzim :-- superoksida dismutase (SOD)superoksida dismutase (SOD)-- katalase katalase -- glutation peroksidase (GSHglutation peroksidase (GSH--Px). Px).

11/8/2007

12

Enzim SOD Enzim SOD Berfungsi mempercepat dismutasi superoksida (*OBerfungsi mempercepat dismutasi superoksida (*O22

--). ). Untuk analisis enzim ini dibuat sistem yang Untuk analisis enzim ini dibuat sistem yang

menghasilkan radikal superoksida yaitu sistem menghasilkan radikal superoksida yaitu sistem xantin/xantin oksidase. xantin/xantin oksidase.

Superoksida mengoksidasi suatu senyawa (misalnya Superoksida mengoksidasi suatu senyawa (misalnya ferisitokrom, NBT) sehingga menghasilkan suatu ferisitokrom, NBT) sehingga menghasilkan suatu kromogen, misalnya ferisitokrom teroksidasi yang kromogen, misalnya ferisitokrom teroksidasi yang dapat diukur pada 430 nm atau formazan pada 560 dapat diukur pada 430 nm atau formazan pada 560 nm.nm.

Enzim katalase memecah HEnzim katalase memecah H22OO22 menjadi Hmenjadi H22O dan ½ O dan ½ OO22. .

Perubahan absorbansi HPerubahan absorbansi H22OO22 pada 240 nm diukur pada pada 240 nm diukur pada selang waktu tertentu selama waktu tertentu. selang waktu tertentu selama waktu tertentu.

Kemiringan (slope) kurva menggambarkan aktifitas Kemiringan (slope) kurva menggambarkan aktifitas katalase. Semakin tinggi aktifitas katalase maka katalase. Semakin tinggi aktifitas katalase maka slope semakin rendah. slope semakin rendah.

Enzim KatalaseEnzim Katalase

Enzim Enzim Glutation Peroksidase (GSHGlutation Peroksidase (GSH--Px)Px)

Enzim Glutation Peroksidase (GSHEnzim Glutation Peroksidase (GSH--Px) berperan Px) berperan mereduksi hidrogen peroksida (Hmereduksi hidrogen peroksida (H22OO22) maupun lipid ) maupun lipid peroksida (LOOH) dengan keberadaan GSH menjadi peroksida (LOOH) dengan keberadaan GSH menjadi GSSG. GSSG.

Pengukuran dilakukan dengan mengukur kadar GSH Pengukuran dilakukan dengan mengukur kadar GSH tersisa. GSH digenerasi dari sistem lain yang tersisa. GSH digenerasi dari sistem lain yang melibatkan glutation reduktase dan NADPH + Hmelibatkan glutation reduktase dan NADPH + H++. .

11/8/2007

13

Struktur FlavonoidsStruktur Flavonoids

TERIMA KASIHTERIMA KASIH