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EVALUACIÓN DEL EFECTO NEUROPROTECTOR DE LOS EXTRACTOS
METANÓLICOS DE Acalypha diversifolia Y Alchornea calophylla
EUPHORBIACEAE CONTRA LA TOXICIDAD INDUCIDA POR ROTENONA EN
Drosophila melanogaster DROSOPHILIDAE
LINA MARCELA PEDRAZA ORTIZ
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE TECNOLOGÍA
ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA
PEREIRA
2014
2
EVALUACIÓN DEL EFECTO NEUROPROTECTOR DE LOS EXTRACTOS
METANOLICOS DE Acalypha diversifolia Y Alchornea calophylla
(EUPHORBIACEAE) CONTRA LA TOXICIDAD INDUCIDA POR ROTENONA EN
Drosophila melanogaster DROSOPHILIDAE.
LINA MARCELA PEDRAZA ORTIZ
CODIGO: 1.087.991.790
TRABAJO DE GRADO
Requisito Parcial para optar al título de Químico Industrial
DIRECTOR DEL PROYECTO
OSCAR MARINO MOSQUERA MARTINEZ
Profesor Titular
Universidad Tecnológica de Pereira
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA
FACULTAD DE TECNOLOGÍA
ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA
PEREIRA
2014
3
Tabla de contenido RESUMEN ............................................................................................................ 10
ABSTRACT ........................................................................................................... 11
AGRADECIMIENTOS ........................................................................................... 12
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 13
2. MARCO TEÓRICO ......................................................................................... 14
2.1. Enfermedad de Parkinson (EP) .................................................................................... 14
2.2. Factores implicados en la degeneración progresiva de las neuronas
dopaminérgicos nigroestriatales en la enfermedad de Parkinson. ..................................... 15
2.2.1. Estrés oxidativo ....................................................................................................... 15
2.2.1.1. Fuentes de especies reactivas de oxigeno causantes de estrés
oxidativo. 17
2.2.1.1.1. Metales, estrés oxidativo y neurodegeneración. ................................... 17
a. Hierro .................................................................................................................... 17
b. Disfunción mitocondrial ...................................................................................... 18
c. Producción de especies reactivas de oxígeno en el Complejo I (NADH-
ubiquinona oxidorreductasa) .................................................................................... 19
d. Neuroinflamación: ............................................................................................... 20
e. El daño oxidativo a los ácidos nucleicos en PD en el cerebro humano .... 22
f. La peroxidación lipídica en la EP en el cerebro humano. ............................ 22
g. La oxidación de proteínas en la EP humana ................................................. 22
2.3. Factores de riesgo ambientales asociados con la enfermedad de Parkinson...... 23
2.4. Sistemas de defensa contra el daño oxidativo .......................................................... 24
2.4.1. Antioxidantes no enzimáticos ............................................................................... 24
2.4.1.1. Vitamina E (Antioxidante dietético) .............................................................. 24
2.4.1.2. Vitamina C (Antioxidante dietético) .............................................................. 25
2.4.1.3. El Glutatión (Antioxidante endógeno) .......................................................... 25
2.4.1.4. La ubiquinona o conenzima Q10 ................................................................. 26
2.4.2. Antioxidantes enzimáticos ..................................................................................... 26
2.4.2.1. Superóxido dismutasa (Antioxidante endógeno) ....................................... 26
2.4.2.2. Catalasa (Antioxidante endógeno) ............................................................... 26
2.4.2.3. Glutatión peroxidasa (Antioxidante endógeno) .......................................... 26
2.5. Drosophila melanogaster Drosophilidae como modelo de estudio ........................ 26
4
2.5.1. Ciclo de vida Drosophila melanogaster Drosophilidae .................................... 27
2.5.2. Distinción de Drosophila melanogaster Drosophilidae macho y hembra ...... 28
2.6. Generalidades de la familia Euphorbiaceae............................................................... 29
2.6.1. Descripción morfológica de la familia Euphorbiaceae ...................................... 30
2.6.2. Distribución geográfica de la familia Euphorbiaceae ....................................... 30
2.6.3. Taxonomía del género Acalypha ......................................................................... 30
2.6.4. Distribución geográfica del género Acalypha diversifolia ................................. 30
2.6.5. Taxonomía del género Alchornea ........................................................................ 31
2.6.6. Distribución geográfica del género Alchornea coelophylla .............................. 31
3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................. 32
4. OBJETIVOS .................................................................................................... 34
4.1. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................... 34
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS ........................................................................................ 34
5. METODOLOGÍA ............................................................................................. 35
5.1. MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................................................. 35
5.1.1. Reactivos ................................................................................................................. 35
5.1.2. Materiales y equipos .............................................................................................. 35
5.1.3. Obtención de extractos .......................................................................................... 36
5.1.4. Alimentación de larvas y adultos de Drosophila melanogaster ....................... 36
5.1.5. Separación por géneros y sincronización de la edad de Drosophila
melanogaster. ......................................................................................................................... 36
5.1.6. Evaluación de la función locomotora de Drosophila melanogaster mediante
el ensayo de geotaxis negativa, (Ensayo de longevidad). ............................................... 37
5.1.7. Exposición de Drosophila melanogaster a varias concentraciones de
rotenona. .................................................................................................................................. 38
5.1.8. Exposición de Drosophila melanogaster a varias concentraciones de los
extractos metanólicos crudos de Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla
(Euphorbiaceae). .................................................................................................................... 38
5.1.9. Exposición de Drosophila melanogaster a rotenona, extractos metanólicos
crudos de Acalypha diversifolia y Alchornea calophylla (Euphorbiaceae). ................... 38
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................... 40
6.1. Evaluación de la función locomotora de Drosophila melanogaster mediante el
ensayo de geotaxis negativa, (ensayo de longevidad). ....................................................... 42
6.2. Exposición de Drosophila melanogaster a varias concentraciones de rotenona . 44
5
6.3. Exposición de Drosophila melanogaster a rotenona, extractos metanólicos de
Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla. ...................................................................... 49
7. CONCLUSIONES ........................................................................................... 52
8. RECOMENDACIONES ................................................................................... 53
9. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 54
ANEXOS ............................................................................................................... 60
6
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Neuropatología de la enfermedad de Parkinson (Dauer and Serge, 2003). ............................................................................................................... 14
Figura 2. Rutas de formación de especies reactivas de oxígeno (Valko et al., 2007). ............................................................................................................... 17
Figura 3. Daño oxidativo provocado por el Hierro (Fe) (Farina et al., 2013). ... 18
Figura 4: Formación de especies reactivas de oxígeno en mitocondria (Jin, Kanthasamy et al., 2013). ................................................................................ 19
Figura 5. Disposición modular y la producción de superóxido por el complejo I (NADH: ubiquinona oxidorreductasa). a. Modelo esquemático del complejo I. b. Los modelos para la producción de superóxido del complejo I. (Drose and Brandt, 2012) ................................................................................................... 20
Figura 6: La neuroinflamación en la enfermedad de Parkinson (Glass et al., 2010). ............................................................................................................... 21
Figura 7. Estructura química de la rotenona. ................................................... 23
Figura 8. Función antioxidante del α-tocoferol (Vitamina E) (Yukiko and Omaye 2009). ............................................................................................................... 25
Figura 9. Estadios del ciclo de vida de Drosophila melanogaster (Lavagnino, 2011). ............................................................................................................... 28
Figura 10. Drosophila melanogaster macho. ................................................... 29
Figura 11. Drosophila melanogaster hembra. .................................................. 29
Figura 12. Acalypha diversifolia. ...................................................................... 30
Figura 13. Alchornea coleophylla. .................................................................... 31
Figura 14. Evaluación de la actividad locomotora de Drosophila melanogaster mediantes geotaxis negativa. ........................................................................... 37
Figura 15. Etapas desarrolladas durante EVALUACIÓN DEL EFECTO NEUROPROTECTOR DE LOS EXTRACTOS METANOLICOS DE Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla (EUPHORBIACEAE) CONTRA LA TOXICIDAD INDUCIDA POR ROTENONA EN Drosophila melanogaster. ...... 41
Figura 16. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster de diferentes edades; tiempo de ascensión 6 segundos. Cada valor representa las medias de 6 experimentos independientes. ..................................................... 42
Figura 17. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster de diferentes edades; tiempo de ascensión 15 segundos. Cada valor representa las medias de 6 experimentos independientes. ............................................... 43
Figura 18. Correlación entre la concentración de rotenona y Geotaxis negativa en moscas macho de Drosophila melanogaster. ............................................. 44
7
Figura 19. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a diferentes concentraciones de rotenona; tiempo de ascensión 6 segundos. Cada valor representa las medias de 3 experimentos independientes. ......................................................................................................................... 44
Figura 20. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a diferentes concentraciones de rotenona; tiempo de ascensión 15 segundos. Cada valor representa las medias de 3 experimentos independientes. ......................................................................................................................... 45
Figura 21. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a diferentes concentraciones de rotenona; tiempo de ascensión 6 y 15 segundos. Cada valor representa las medias de 3 experimentos independientes. ................................................................................................ 45
Figura 22. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a diferentes concentraciones de extracto de Acalypha diversifolia; tiempo de ascensión 6 segundos. Cada valor representa las medias de 3 experimentos independientes. ......................................................................... 46
Figura 23. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a diferentes concentraciones de extracto de Acalypha diversifolia; tiempo de ascensión 15 segundos. Cada valor representa las medias de 3 experimentos independientes. ......................................................................... 47
Figura 24. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a diferentes concentraciones de extracto de Alchornea coelophylla; tiempo de ascensión 6 segundos. Cada valor representa las medias de 3 experimentos independientes. ......................................................................... 47
Figura 25. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a diferentes concentraciones de extracto de Alchornea coelophylla; tiempo de ascensión 15 segundos. Cada valor representa las medias de 3 experimentos independientes. ......................................................................... 48
Figura 26. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a varios tratamientos; tiempo de ascensión 6 segundos. Cada valor representa las medias de 3 experimentos independientes. ............................. 49
Figura 27. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a varios tratamientos; tiempo de ascensión 15 segundos. Cada valor representa las medias de 3 experimentos independientes. ............................. 50
Figura 28. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a varios tratamientos; tiempo de ascensión 6 y 15 segundos. Cada valor representa las medias de 3 experimentos independientes. .................... 50
8
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Actividad locomotora moscas macho Drosophila melanogaster 5 días de edad tiempo= 6 segundos. .......................................................................... 67
Tabla 2. Actividad locomotora moscas macho Drosophila melanogaster 5 días de edad tiempo= 15 segundos. ........................................................................ 67
Tabla 3. Actividad locomotora moscas macho Drosophila melanogaster 20 días de edad tiempo= 6 segundos ........................................................................... 67
Tabla 4. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster expuestas a varias concentraciones de rotenona tiempo= 6 segundos. .......... 67
Tabla 5. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster expuestas a varias concentraciones de rotenona tiempo= 15 segundos. ........ 68
Tabla 6. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster expuestas a varias concentraciones del extracto de Acalypha diversifolia tiempo= 6 segundos. ........................................................................................ 68
Tabla 7. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster expuestas a varias concentraciones del extracto de Acalypha diversifolia tiempo= 15 segundos. ...................................................................................... 69
Tabla 8. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster expuestas a varias concentraciones del extracto Alchornea coelophylla de tiempo= 6 segundos. ........................................................................................ 69
Tabla 9. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster expuestas a varias concentraciones del extracto Alchornea coelophylla de tiempo= 15 segundos. ...................................................................................... 70
Tabla 10. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster expuestas a rotenona, extractos metanólicos de Acalypha diversifolia, Alchornea coelophylla y Vitamina C tiempo= 6 segundos................................................ 70
Tabla 11. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster expuestas a rotenona, extractos metanólicos de Acalypha diversifolia, Alchornea coelophylla y Vitamina C tiempo= 15 segundos. ............................................. 71
Tabla 12. Metabolitos secundarios extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla Euphorbiaceae ........................................ 71
Tabla 13. Actividad antioxidante extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla Euphorbiaceae .......................................................... 72
Tabla 14.Cuantificación de fenoles y flavonoides totales extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla Euphorbiaceae .................... 72
9
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Protocolo para Crianza, alimentación de larvas y Drosophila melanogaster adultas. ................................................................................ 60
Anexo 2. Protocolo de la evaluación de la función locomotora de Drosophila melanogaster mediante el ensayo de geotaxis negativa, (ensayo de longevidad). ......................................................................................................................... 61
Anexo 3. Protocolo para el manejo del editor de imagen imageJ .................... 62
Anexo 4. Exposición de Drosophila melanogaster a rotenona varias concentraciones. (Evaluación de la actividad locomotora)............................... 63
Anexo 5. Exposición de Drosophila melanogaster al extracto metanólico de Acalypha diversifolia (Euphorbiaceae) varias concentraciones. (Evaluación de la actividad locomotora) ....................................................................................... 64
Anexo 6. Exposición de Drosophila melanogaster al extracto metanólico Alchornea calophylla (Euphorbiaceae) varias concentraciones. (Evaluación de la actividad locomotora) ....................................................................................... 65
Anexo 7. Exposición de Drosophila melanogaster a rotenona, extractos metanolicos crudos de Acalypha diversifolia y Alchornea calophylla (Euphorbiaceae), vitamina C. (Evaluación de la actividad locomotora) ........... 66
Anexo 8. Tablas de resultados ......................................................................... 67
Anexo 9. Marcha fitoquimica y Actividades antioxidantes de los extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla Euphorbiaceae 71
10
RESUMEN
Los neuroprotectores son sustancias químicas con efectos protectores en el sistema nervioso que previenen, mitigan o retrasan los procesos neurodegenerativos. Estos compuestos evitan la muerte o degeneración de las neuronas. La presente investigación aborda el estudio de las propiedades antioxidantes y neuroprotectoras de los extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y Alchornea calophylla ambas especies son pertenecientes a la familia Euphorbiaceae mediante el uso del agente xenobiotico rotenona y la utilización de un modelo experimental in-vivo denominado Drosophila melanogaster. Los resultados mostraron que los extractos metanólicos tienen un efecto antioxidante capaz de inhibir el deterioro locomotor generado en Drosophila melanogaster cuando este ha sido expuesto a concentraciones de 1000µM en rotenona. Se evidenció una mayor actividad inhibitoria con el extracto de Acalypha diversifolia en el co-tratamiento de las moscas expuestas a rotenona. La actividad locomotora de Drosophila melanogaster durante la investigación fue estudiada mediante el ensayo de geotáxis negativa, el cual aprovecha la capacidad innata de escape, en la que las moscas ascienden por la pared de un contenedor después de haber sido depositadas en el fondo de este. Este ensayo de estudio locomotor resultó ser una técnica reproducible que se puede establecer como un método confiable para el seguimiento del deterioro motriz y envejecimiento en Drosophila melanogaster. Además Drosophila melanogaster se estableció como un modelo in vivo de estudio útil, debido a las características que posee este organismo para ser criado bajo condiciones de fácil adquisición y de bajo costo; por otro lado, Drosophila se prestaría para la realización de eventuales evaluaciones bioquímicas, que en sí generarían estudios más completos y detallados acerca de las propiedades neuroprotectoras de los compuestos fitoquímicos que son constantemente extraídos de las plantas pertenecientes a la flora colombiana.
11
ABSTRACT
Neuroprotective are chemical or biological substances with protective effects on the nervous system to prevent, mitigate or delay the neurodegenerative processes. These compounds prevent death or degeneration of neurons. This research deals with the study of antioxidant and neuroprotective properties of methanolic extracts of Acalypha diversifolia and Alchornea calophylla using a xenobiotic agent called rotenone also used an experimental model in vivo called Drosophila melanogaster. The results showed that the methanolic extracts have an antioxidant effect capable of inhibiting the locomotor impairment in Drosophila melanogaster generated when this is exposed to 1000uM in rotenone concentrations. Greater inhibitory was evident when Acalypha diversifolia extract was used in the co-treatment of flies exposed to rotenone. The locomotor activity of Drosophila melanogaster during the investigation was studied by testing negative geotaxis, which exploits the innate ability to escape, which flies ascend the wall of a container after being deposited on the bottom of this. This study locomotor assay proved to be a reproducible technical that can be set as a reliable method for monitoring motor impairment and aging in Drosophila melanogaster. Furthermore Drosophila melanogaster was established as an in vivo useful study model because it has features of being an organism who is being able to raised under conditions readily avaliable and low cost, on the other hand Drosophila lend itself to conducting any biochemical evaluations, which generate more complete and detailed studies on the neuroprotective properties of phytochemicals that are constantly extracted from plants belonging to the Colombian flora.
12
AGRADECIMIENTOS
A los Profesores Fernando Cardozo Peláez, Oscar Marino Mosquera, Jaime Niño
Osorio.
A CENBIOTEP por permitir realizar mi trabajo en su laboratorio.
A la Universidad Tecnológica de Pereira a través de la Vicerrectoría de
Investigaciones, Innovación y Extensión por la financiación aportada para realizar
este proyecto.
A aquellas personas que aportaron en mi formación personal, que me han
acompañado a largo de mi vida. A aquellas personas les dedico este verso
La vida un poco intrépida regala asombros,
Trae consigo serafines que encausan la incertidumbre;
aquellos serafines se roban mis pensamientos y sentimientos,
los uno a todos como telarañas finas que el viento no arrastra
a todos les digo que los guardo como ocasos de olivo que cubren fastuosos
atardeceres…
13
1. INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno progresivo del sistema nervioso
central caracterizado por temblor en reposo, bradiscinesia (lentitud de
movimientos), rigidez y postura flexionada. Histológicamente, el déficit clave ha sido
identificado por la pérdida de neuronas pigmentadas productoras de dopamina en
la sustancia negra (Jain, 2011). EP es el segundo trastorno neurodegenerativo más
común después de la enfermedad de Alzheimer, con una prevalencia en los países
industrializados de aproximadamente el 0,3% de la población. La incidencia de
estas enfermedades aumenta con la edad a 1% en los mayores de 60 años y al 4%
en la población mayor de 80. La edad media de inicio es de aproximadamente 60
años, sin embargo, el 10% de los casos se clasifican como de inicio joven, se
produce entre 20 y 50 años de edad, que podría representar un grupo de
enfermedad distinta (Dexter and Jenner, 2013).
En los últimos años, se han descrito un número creciente de compuestos
polifenólicos con efectos neuroprotectores. Se han realizado esfuerzos para
explorar los mecanismos que subyacen a la acción neuroprotectora de los
polifenoles. Sin embargo, muchas de las vías y mecanismos considerados para
mediar estos efectos son más bien generales que específicos (Ebrahimi and
Schluesener, 2012); los tratamientos actuales para la enfermedad de Parkinson
(EP) están destinadas a hacer frente a los síntomas motores pero no hay terapia
enfocada en la modificación del curso de la enfermedad (Garbayo et al., 2013).
La mayor parte de los estudios sobre los polifenoles se han centrado en las
propiedades antioxidantes de estos compuestos químicos como su efecto más
destacado. Junto con los efectos protectores contra el envejecimiento y
enfermedades neurodegenerativas relacionadas (Ebrahimi and Schluesener, 2012).
Estos compuestos juegan un papel importante en la protección de los tejidos y
células de los efectos dañinos del estrés oxidativo, estimulando la respuesta inmune
y la activación de enzimas de desintoxicación.
El presente trabajo utilizara Drosophila melanogaster para generar un modelo de
la enfermedad de Parkinson; el cuál será inducido mediante un agente xenobiotico,
llamado rotenona, que le provocará un daño oxidativo al sistema nervioso central y
reproducirá los síntomas patológicos y motores característicos en dicha
enfermedad; este modelo toxicológico será utilizado para evaluar los efectos
neuroprotectores de los metabolitos secundarios con propiedades antioxidantes
contenidos en los extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y Alchornea
Coelophylla (Euphorbiaceae).
14
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Enfermedad de Parkinson (EP)
La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo que
clínicamente se caracteriza por bradiscinesia, rigidez, temblor en reposo e
inestabilidad postural. Sus características patológicas son: perdida de los cuerpos
celulares dopaminérgicos en la sustancia negra pars compacta (SNpc) induciendo
una reducción de los niveles de dopamina (DA). Adicionalmente, la EP se
caracteriza por la formación de agregados proteicos en las neuronas
dopaminergicas sobrevivientes, estos agregados se llaman cuerpos de Lewy
(Barlow et al., 2007). La figura 1 identifica las áreas cerebrales afectadas en la EP
y demuestra la evidencia de los cambios neuropatológicos.
Figura 1. Neuropatología de la enfermedad de Parkinson (Dauer and Serge,
2003).
15
2.2. Factores implicados en la degeneración progresiva de las neuronas
dopaminérgicos nigroestriatales en la enfermedad de Parkinson.
El estrés oxidativo, la inflamación, la disfunción mitocondrial, excitotoxicidad y la
deficiencia en la transcripción se han identificado como factores causales generales
asociados con el origen y/o la progresión de los trastornos neurodegenerativos.
2.2.1. Estrés oxidativo
El estrés oxidativo es causado por un desequilibrio entre el nivel de generación de
especies reactivas del oxígeno (ROS o ERO) y la capacidad de un sistema biológico
de reducir estas especies o para reparar el daño generado a los componentes
celulares. (Sies and Cadenas, 1985).
En términos químicos, el estrés oxidativo es un gran aumento en la reducción del
potencial celular o una gran disminución en la capacidad reductora de los pares
redox celulares. El estrés oxidativo severo puede causar la muerte celular y aún una
oxidación moderada puede desencadenar la apoptosis, mientras que si es muy
intensa puede provocar la necrosis. (Fina, 2009).
Todas las formas de vida mantienen un entorno reductor dentro de sus células,
preservado por las enzimas que mantienen el estado reducido a través de un
constante aporte de energía metabólica. Desbalances en este estado normal redox
pueden causar efectos tóxicos a través de la producción de peróxidos y radicales
libres que pueden alterar los componentes de la célula, incluyendo las proteínas,
los lípidos y el ADN. (Fina, 2009).
La capacidad del cerebro para protegerse contra el estrés oxidativo es limitada
debido a la presencia de altas cantidades de ácidos grasos poliinsaturados, los
bajos niveles de antioxidantes tales como el glutatión y la vitamina E y el elevado
contenido de hierro en áreas específicas, tales como el globus pallidus y la sustancia
negra (SN) (Calabrese et al., 2005). Además la alta demanda de oxígeno en el
cerebro incrementa el riesgo de daño por estrés oxidativo comparado con otros
órganos.
En la figura 2 se resumen las diversas vías de formación y los mecanismos de
regulación de las especies reactivas de oxigeno más comunes en sistemas
celulares. Mientras que en la figura 3 se presentan las moléculas producidas por
modificaciones covalentes luego de las reacciones generadas por las especies
reactivas de oxígeno.
16
17
Figura 2. Rutas de formación de especies reactivas de oxígeno (Valko et al.,
2007).
El anión superóxido (O2-•) se genera a través de procesos metabólicos o después
de la activación del oxígeno por irradiación física; es considerado como la principal
ROS y puede interactuar con otras moléculas para generar ROS secundarias, ya
sea directamente o a través de procesos catalizados por enzimas o metales (Valko,
Leibfritz et al., 2007).
2.2.1.1. Fuentes de especies reactivas de oxigeno causantes de estrés
oxidativo.
2.2.1.1.1. Metales, estrés oxidativo y neurodegeneración.
a. Hierro
En las células aeróbicas, el hierro (Fe) juega un papel vital en el transporte de
electrones derivados de la oxidación de alimentos al oxígeno molecular (O2) situado
en el extremo de la cadena respiratoria (Levi and Ermanna, 2009). Las propiedades
redox del hierro determinan su participación en reacciones potencialmente
citotóxicas. El Fe2+ puede catalizar la descomposición de H2O2 generando el radical
hidroxilo (OH•) (mediante la reacción de Fenton figura 3) que es el ROS más reactivo
y perjudicial formado durante el metabolismo celular (Halliwel, 1992).
18
Figura 3. Daño oxidativo provocado por el Hierro (Fe) (Farina et al., 2013).
b. Disfunción mitocondrial
Las mitocondrias generan la mayor parte de la energía celular en forma de ATP a
través de la fosforilación oxidativa, los electrones de los cofactores reducidos se
transfieren al oxígeno, el aceptor de electrones final, a través de una serie de
complejos de la cadena respiratoria (complejos I-IV) situados en la membrana
mitocondrial interna. El flujo de electrones conduce simultáneamente al bombeo de
protones fuera de la matriz mitocondrial. Esta reacción electroquímica genera un
potencial transmembrana (ΔΨm) proporcionando la energía para la síntesis de ATP
a partir de ADP y fosfato inorgánico (Jin et al., 2013).
Las especies reactivas de oxigeno se pueden generar dentro de la mitocondria en
varios sitios de las cadenas de transporte de electrones mitocondrial (ETC), en
particular en los complejos I y III, donde los electrones se pueden escapar y ser
transferidos al oxígeno molecular para formar el anión superóxido (O2•- ), la especie
reactiva de oxigeno predominante en las mitocondrias (Turrens, 2003), proceso que
se describe en la figura 4.
19
Figura 4: Formación de especies reactivas de oxígeno en mitocondria (Jin,
Kanthasamy et al., 2013).
c. Producción de especies reactivas de oxígeno en el Complejo I (NADH-
ubiquinona oxidorreductasa)
El Complejo I (NADH-ubiquinona oxidorreductasa) está conformado por la asociación de varias proteínas integradas en la membrana interna de la mitocondria, localizada entre la matriz y el espacio intermembrana. El complejo I oxida NADH usando la coenzima Q como aceptor de electrones mediante la reacción reversible de la bomba de protones y generación de un potencial de transmembrana. Este representa uno de los dos principales puntos en la cadena respiratoria para la reducción de los equivalentes derivados del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) (Gaggelli and Valensin, 2012).
20
Figura 5. Disposición modular y la producción de superóxido por el complejo I
(NADH: ubiquinona oxidorreductasa). a. Modelo esquemático del complejo I. b.
Los modelos para la producción de superóxido del complejo I. (Drose and Brandt,
2012)
Complejo I genera superóxido en dos situaciones diferentes:
I. En condiciones donde los electrones se respaldan en el conglomerado de FeS; esto ocurre cuando NADH está presente y la cadena respiratoria se encuentra bloqueada. Por ejemplo, en la presencia de inhibidores como rotenona que se une al sitio de unión de la coenzima Q o en presencia de inhibidores de complejo III como stigmatellin o antimicina A o del complejo IV como KCN (Chen et al., 2003).
II. En condiciones de transferencia de electrones inversa (RET), el cual ocurre cuando los electrones fluyen de vuelta de complejo II a través de la ubiquinona para el complejo I, que requiere un alto potencial de membrana como la fuerza motriz.( Grivennikiva and Vinogradov 2006).
d. Neuroinflamación:
Una característica común en las enfermedades neurodegenerativas es la presencia de la neuroinflamación y el estrés oxidativo, el cual activa vías de señalización inflamatorias a través de varios mecanismos, incluyendo la producción excesiva de especies reactivas de oxígeno, la inducción de la disfunción mitocondrial, la
21
activación de la microglía y los astrocitos para liberar citoquinas pro inflamatorias (Figura 5) (Schapira, 2010)
Las células de la microglía son las responsables de la respuesta inmune en el cerebro; estas células son muy sensibles a cualquier cambio patológico que ocurra en el cerebro, al que responden con un aumento en la secreción de factores neurotróficos. La activación de las microglías también está asociada con la secreción de citoquinas pro inflamatorias y la activación de la sintasa de óxido nítrico, la NADPH oxidasa y la ciclooxigenasa, que en conjunto inducen daños en otras células y la progresión de la enfermedad de un modo autoamplificado (Liu 2006). Se han observado niveles elevados de citoquinas en el cerebro de individuos afectados por la EP, así como la reacción microglial en etapas tempranas de degeneración neuronal en diversos modelos animales de neurodegeneración (Herrera et al., 2000).
Figura 6: La neuroinflamación en la enfermedad de Parkinson (Glass et al., 2010).
El glutamato es un neurotransmisor común en numerosas sinapsis de tipo excitatorio. La sinapsis recibe inervación glutamatérgica del núcleo subtalámico y en los afectados de la EP esta vía se encuentra hiperactivada (Przedborski, 2005). La estimulación glutamatérgica provoca la despolarización de la membrana, generando la liberación de calcio de sus reservorios celulares. La pérdida de la regulación del Ca2+, que también puede producirse debido al estrés oxidativo o a la disminución de los niveles de ATP como consecuencia de la alteración mitocondrial, provoca disfunción sináptica, pérdida de la plasticidad y degeneración neuronal
22
(Mattson, 2007). Como consecuencia la excitotoxicidad mediada por el glutamato es una de las causas que contribuyen a la degeneración dopaminérgica. Como punto común en los mecanismos descritos que están asociados con la degeneración progresiva de las neuronas dopaminergicas nigroestriatales en la enfermedad de Parkinson está la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), así que cualquier aproximación que reduzca los niveles de ROS o sus impactos en componentes celulares puede servir de objetivo terapéutico para prevenir el inicio o la progresión de EP.
e. El daño oxidativo a los ácidos nucleicos en PD en el cerebro humano
Las especies reactivas de oxigeno puede dañar los ácidos nucleicos, incluyendo ADN y ARN, alterando sus propiedades de codificación y la función metabólica(Evans et al., 2004). Daños en el ADN puede tener consecuencias importantes para la célula, incluyendo la inestabilidad genética causando modificaciones en la secuencia de aminoácidos en proteínas. La acumulación lenta de daño oxidativo del ADN tanto en la mitocondria y los genomas nucleares puede desencadenar la muerte celular (Sanders and Greenamyre, 2013). Este tipo de daño es perjudicial para el cerebro debido a que las neuronas no proliferan (Nunomura et al., 2012).
f. La peroxidación lipídica en la EP en el cerebro humano.
La peroxidación lipídica se refiere al proceso por el cual los lípidos se oxidan; los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAS) son los más propensos a la peroxidación lipídica. Después del tejido adiposo, el órgano con el más alto contenido de lípidos es el cerebro (Sanders and Greenamyre, 2013). Los lípidos están involucrados en la fluidez y la permeabilidad de la membrana celular, también puede servir como un depósito de energía y se ha demostrado que pueden mediar en procesos inflamatorios y señales apoptóticas (Ruiperez et al., 2010). Aunque los productos específicos de oxidación de lípidos pueden actuar como moléculas de señalización y ejercer efectos celulares de protección (Roberts and Fessel, 2004); los lípidos dañados u oxidados pueden tener efectos perjudiciales sobre las funciones antes mencionadas y dar lugar a daño neuronal alternado su función o en condiciones más severas generar muerte neuronal.
g. La oxidación de proteínas en la EP humana
Las ROS pueden dañar las proteínas de manera reversible (formación de sulfóxido
de metionina) o irreversible: por ejemplo los grupos amino en las cadenas laterales
de los aminoácidos específicos pueden modificarse en carbonilos) (Sanders and
Greenamyre, 2013).
23
2.3. Factores de riesgo ambientales asociados con la
enfermedad de Parkinson.
La enfermedad de Parkinson está ampliamente aceptada como una enfermedad
multifactorial con contribuciones genéticas y ambientales. Alrededor del 10% de los
casos de EP se estima que tiene una causa monogénica, los casos restantes se
denominan "esporádicos" o "idiopáticos", con origen desconocido (Sanders and
Greenamyre, 2013). Aunque la genética tiene un papel importante en la patogénesis
de la enfermedad de Parkinson, otros factores deben estar en juego. Las
variaciones geográficas en la distribución de la enfermedad dentro y entre los países
apoyan el factor ambiental como un agente inductor en el desarrollo de la
enfermedad de Parkinson (Rosati, et al., 1980).
Una de las clases principales de agentes ambientales asociados con la EP son los
plaguicidas, que incluyen fungicidas, herbicidas, insecticidas y rodenticidas (Hatcher
et al., 2008). Un punto común de varios pesticidas comerciales asociados a la EP
es que inhiben el complejo I de la cadena transportadora de electrones.
La Rotenona (Figura 7) es una de las sustancias neurotóxicas más estudiados utilizadas como modelo para las características de la EP y se ha establecido que los mecanismos de estrés oxidativo son un componente importante de su neurotoxicidad. La rotenona es un isoflavonoide natural que se encuentra en las hojas, raíces y rizomas de las leguminosas tropicales de los géneros Derris, Lonchocarpus y Tephrosia (Cabezas et al., 2012).
Se ha demostrado que la exposición a rotenona induce a la generación de especies
reactivas de oxigeno debido a que inhibe el complejo I de la cadena respiratoria
mitocondrial: específicamente inhibe la transferencia de electrones desde el centro
hierro-azufre en el complejo I de la ubiquinona (Franco et al., 2010).
Figura 7. Estructura química de la rotenona.
24
2.4. Sistemas de defensa contra el daño oxidativo
Los organismos aeróbicos están protegidos contra el estrés oxidativo mediante una
red elaborada de defensa en donde múltiples antioxidantes con diversas funciones
desempeñan sus funciones (Niki et al., 1995). Algunos antioxidantes son moléculas
pequeñas, mientras que otros son macromoléculas tales como las proteínas y las
enzimas (Niki, 2014). La primera línea de antioxidantes previene la producción de
especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, entre otras, secuestrando iones
metálicos activos; esta primera línea reduce los hidroperóxidos y el peróxido de
hidrógeno en agua. La segunda línea de defensa antioxidante elimina dichas
especies reactivas antes de que ataquen moléculas biológicas; en cuanto que en la
tercera intervienen compuestos antioxidantes y enzimas de reparación,
reconstruyendo membranas y tejidos (Niki, 2014).
2.4.1. Antioxidantes no enzimáticos
Los antioxidantes no enzimáticos ejercen su función antioxidante directamente en
la ausencia de reacciones enzimáticas en los sistemas celulares. Estas moléculas
actúan como agentes quelantes en la eliminación de especies reactivas de oxígeno,
ya sea mediante la inhibición de fuentes celulares de oxidantes o mediante la
inducción de los sistemas antioxidantes de las células (Uttara et al., 2009).
2.4.1.1. Vitamina E (Antioxidante dietético)
La vitamina E es un antioxidante lipofílico y protege las membranas celulares contra
el daño por especies reactivas de oxígeno, tales como radicales peróxido durante
la peroxidación lipídica. De las isoformas disponibles, α-tocoferol es la forma más
potente y activa (Dasuri et al., 2013). La actividad antioxidante de la vitamina E
contra radicales peróxido se muestra en la figura 8.
25
Figura 8. Función antioxidante del α-tocoferol (Vitamina E) (Yukiko and Omaye
2009).
2.4.1.2. Vitamina C (Antioxidante dietético)
En contraste con la vitamina E, la vitamina C o ácido ascórbico es hidrofílico y
funciona mejor en un ambiente acuoso. Como agente reductor y antioxidante, la
vitamina C reacciona con el radical superóxido y varios hidroperóxidos lipídicos. Así
mismo puede regenerar la propiedad antioxidante de la vitamina E. (Martinnet al.,
2002).
2.4.1.3. El Glutatión (Antioxidante endógeno)
El glutatión (GSH) es un tripéptido ubicuo compuesto de glutamato, cisteína y glicina. La forma oxidada de GSH es el glutatión disulfuro (GSSG). Se comporta como un importante tampón redox celular, los niveles relativos de GSH y GSSG mantienen el balance redox celular (Dalton et al., 2004). Debido a su abundancia, el glutatión sirve para proteger a las células contra la toxicidad resultante de la exposición a cantidades excesivas de electrófilos endógenos y exógenos (Meister 1991). El glutatión neutraliza el superóxido directamente y sirve como un cofactor para la enzima glutatión peroxidasa (GPx) en el metabolismo de peróxido de hidrógeno (H2O2) y peróxidos lipídicos (Arthur 2000), a través de la acción de la enzima glutatión S -transferasa (GST). GSH se puede conjugar a una variedad de compuestos endógenos y xenobióticos electrófilos lo cual da lugar a su eliminación segura y eficiente desde el organismo (Rinaldi et al 2002). Además, el GSH es capaz de regenerar otros antioxidantes importantes, tales como las vitaminas C y E (Meister, 1991).
26
2.4.1.4. La ubiquinona o conenzima Q10
La coenzima Q10 participa en el transporte de electrones durante la fosforilación
oxidativa en la mitocondria, protege contra el estrés oxidativo producido por los
radicales libres (James, Smith et al 2004), y regenera las formas activas de los
antioxidantes ácido ascórbico y tocoferol (vitamina E) (Arroyo et al., 2000.)
2.4.2. Antioxidantes enzimáticos
2.4.2.1. Superóxido dismutasa (Antioxidante endógeno)
Las superóxido dismutasas (SODs ubicuos) catalizan la desproporción de
superóxido a oxígeno molecular y peróxido de hidrogeno; por lo tanto, son críticos
para proteger la célula contra los productos de la respiración aeróbica (Fridovich,
1997) La Cobre citosólico / zinc SOD (SOD1), la mitocondrial Mn-SOD (SOD2) y la
dismutasa de superóxido extracelular (SOD3) representan las tres formas diferentes
de SOD: SOD1 y SOD2 juegan un papel principal en la eliminación de iones
superóxido en el citosol y mitocondrias, respectivamente (Celsi et al., 2004).
2.4.2.2. Catalasa (Antioxidante endógeno)
La catalasa convierte peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno utilizando hierro o
manganeso como cofactor. La catalasa se localiza principalmente en los
peroxisomas. (Ho et al., 2004).
2.4.2.3. Glutatión peroxidasa (Antioxidante endógeno)
La glutatión peroxidasa (GPX) cataliza la reducción de hidroperóxidos y peróxidos
lipídicos utilizando el glutatión reducido. GPX está presente tanto en el citosol y la
mitocondria. (Klivenyi et al., 2000).
2.5. Drosophila melanogaster Drosophilidae como modelo de
estudio
Actualmente, Drosophila melanogaster Drosophilidae ha sido usado como modelo animal alternativo para el cribado de agentes terapéuticos naturales para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la Enfermedad de Parkinson. En estudios realizados por (Sudati et al., 2013)se evaluó los efectos beneficiosos de Valeriana officinalis contra la toxicidad relacionada con la exposición a rotenona en Drosophila melanogaster; Drosophila mostro ser un modelo útil en la realización de este estudio puesto que al exponerlo a rotenona La Drosophila presento déficit locomotor, el cual mejoró cuando se realizó un tratamiento con extracto de Valeriana Officinalis (Sudati, Vieira et al., 2013).
27
Drosophila melanogaster también ha sido usado en estudios realizados por (St Laurent et al., 2013), quienes evaluaron el mejoramiento del deterioro del aparato locomotor y la mortalidad temprana inducida por rotenona en Drosophila cuando estos son expuestas a butirato de sodio; los resultados que obtuvieron dan pie para establecer este modelo animal como una alternativa viable en estudios con enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson, ya que al realizar ensayos de geotaxis negativa la capacidad locomotora se veía disminuida, debido a que Drosophila era incapaz de escalar las distancias que escalaba antes de ser expuestas a rotenona; además de ello el modelo se prestó para la realización de otros análisis como lo es la cuantificación de dopamina cuando esta ha sido expuesta a agentes neurotóxicos y antioxidantes exógenos.
La mosca de la fruta Drosophila se ha utilizado como un sistema biológico de gran alcance para hacer frente a aspectos fundamentales relacionados con los trastornos neurológicos en los seres humanos, ya que los componentes moleculares básicos relacionados y las vías de transducción de señales en los seres humanos se conservan; Además Drosophila ofrece grandes ventajas experimentales en genética, el análisis del comportamiento, así como en la biología celular y molecular (Koh, 2006).
2.5.1. Ciclo de vida Drosophila melanogaster Drosophilidae
El ciclo de la vida reproductiva de Drosophila es de 10 - 12 días a 25 °C, consta de una etapa embrionaria, seguida por tres estadios larvales donde el individuo va aumentando de tamaño hasta alcanzar el estadio pupal. El adulto emerge luego del pupario y alcanza la madurez sexual en pocas horas (Figura 9).
28
Figura 9. Estadios del ciclo de vida de Drosophila melanogaster (Lavagnino,
2011).
2.5.2. Distinción de Drosophila melanogaster Drosophilidae macho y
hembra. Drosophila melanogaster machos se caracterizan por tener en su costado cuatro líneas de color negro, mientras las hembras presentan siete líneas de color negro. El macho en su costado inferior presenta en sus patas delanteras unas prolongaciones llamadas peines sexuales y un órgano llamado cerco anal; las hembras carecen de color en su costado inferior que se prolonga en forma de V. las figuras 10 y 11 esquematizan estas diferencias.
29
Figura 10. Drosophila melanogaster macho.
Figura 11. Drosophila melanogaster hembra.
2.6. Generalidades de la familia Euphorbiaceae
La familia Euphorbiaceae es la sexta familia más diversa entre las Angiospermas, después de las Orchidaceae, Compositae, Leguminosae, Gramineae y Rubiaceae (Radcliffe and Smith, 1987). Presenta cinco subfamilias, 49 tribus, 317 géneros (Webster, 1994) y cerca de 8100 especies (Mabberley, 1998) distribuidas en todo el mundo con excepción de las zonas polares, estando mejor representadas en las regiones tropicales y subtropicales. Las subfamilias son: Phyllanthoideae, Oldfieldioideae, Acalyphoideae, Crotonoideae y Euphorbioideae (Martínez et al 2002).
30
2.6.1. Descripción morfológica de la familia Euphorbiaceae
La caracterización de las especies de la familia Euphorbiaceae es difícil debido a la alta variación morfológica que presentan. Sin embargo, la mayoría de las especies se reconocen por sus flores unisexuales, frecuentemente pequeñas, la presencia de un disco floral, un ovario súpero con tres lóculos, los lóculos con 1 o 2 óvulos y frutos típicamente esquizocarpicos capsulares con mericarpos elásticamente dehiscentes. Muchas de las plantas de esta familia contienen látex y presentan hojas con estípulas y varias formas de glándulas secretoras (Esteinmann, 2002).
2.6.2. Distribución geográfica de la familia Euphorbiaceae
Las euphorbiaceas están ampliamente distribuidas en todas las regiones naturales de Colombia, principalmente en la en la región andina (210 especies), de las cuales 83 son exclusivas para esta región, seguida de la región amazónica con 129 especies, (71 exclusivas), la región caribe con 114 especies (36 exclusivas), la región pacífica con 110 especies (14 exclusivas) y la Orinoquia con 88 especies (9 exclusivas) (Murillo, 2004).
2.6.3. Taxonomía del género Acalypha
Nombre científico: Acalypha diversifolia Reino: Plantae
Phylum: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Euphorbiales Familia: Euphorbiaceae Género: Acalypha
Figura 12. Acalypha diversifolia.
Misuri Botanical Garden
2.6.4. Distribución geográfica del género Acalypha diversifolia
Acalypha diversifolia está ampliamente distribuida en el Neotrópico desde el sur de México y Centroamérica donde es muy abundante sobre todo en la costa Atlántica, hasta Perú, Bolivia y Brasil. En Colombia se encuentra en las regiones Caribe y Pacífica, valles interandinos y piedemonte, este de la cordillera oriental hasta los ríos Caquetá y Putumayo (Sánchez, et al., 2002).
31
2.6.5. Taxonomía del género Alchornea
Nombre científico: Alchornea coelophylla Reino: Plantae
Phylum: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Euphorbiales Familia: Euphorbiaceae Género: Alchornea
Figura 13. Alchornea coleophylla.
2.6.6. Distribución geográfica del género Alchornea coelophylla
Alchornea coelophylla se encuentra distribuida en Colombia principalmente en la región Andina (Sánchez, et al., 2002).
32
3. JUSTIFICACIÓN
Las enfermedades neurológicas representan un grupo de padecimientos con repercusiones sociales y económicas, siendo evidente el elevado costo económico relacionado a los medicamentos y terapeutas así como el fuerte impacto que causan en las familias (Corona, 2002).
La identificación de terapias capaces de retrasar la pérdida de neuronas dopaminérgicas y los otros cambios patológicos en la enfermedad de Parkinson es un asunto primordial (Mhyre et al., 2012).El uso de fitocompuestos para mejorar la salud humana ha ganado una atención considerable en los últimos años debido a que se cree que estos productos naturales son más seguros y producen menores efectos secundarios que los fármacos sintéticos (Raskin Ribnicky et al., 2002).
Los fitocompuestos son un grupo heterogéneo de compuestos bioactivos producidos por las plantas, los cuales son ampliamente investigados por los científicos debido a sus potencialidades como promotores de la salud en los seres humanos. A diferencia de las vitaminas y minerales, los fitocompuestos no se requieren para el mantenimiento de la viabilidad celular, sino que juegan un papel importante en la protección de tejidos y células de los efectos dañinos del estrés oxidativo (Farooqui, 2010).
Los fitocompuestos ejercen acciones medicinales específicas sin cumplir una función nutricional en la dieta pueden utilizarse en respuesta a problemas específicos de salud en intervalos de corto o largo plazo (Spencer, 2010).
La dieta suplementada con fitocompuestos no sólo proporciona efectos benéficos sobre el proceso normal de envejecimiento en los seres humanos, sino que también retarda la aparición de enfermedades neurotraumáticas y neurodegenerativas. Los fitocompuestos producen acciones moduladoras sobre las células neuronales mediante la interacción con un amplio espectro de dianas moleculares a través de maquinaria de señalización de la célula (Farooqui, 2013).
En la actualidad existe un gran interés en fitoquímicos como componentes bioactivos de los alimentos. Las funciones de frutas, verduras y vino tinto en la prevención de enfermedades se han atribuido, en parte, a las propiedades antioxidantes de los polifenoles que los constituyen (vitaminas E y C y los carotenoides) (Rice et al., 1997).
Se ha demostrado que los polifenoles podrían proteger a diferentes células y neuronas frente a diversos compuestos tóxicos, a través de su potencial antioxidante y de la modulación de diferentes vías, tales como las cascadas de señalización y los procesos antiapoptóticos (Ramassamy, 2006).
33
En estudios aún no publicados, realizados en el Laboratorio de Biotecnología -
Productos Naturales de la Universidad Tecnológica de Pereira fue demostrado que
los extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y Alchornea calophylla
poseen una alta capacidad antioxidante; sin embargo, es poca la información sobre
el efecto protector de los extractos de dichas especies en la neurodegeneración, por
lo que se hace necesario evaluar si su efecto antioxidante es lo suficientemente
potente para contrarrestar la neurotoxicidad inducida por ejemplo por rotenona en
Drosophila melanogaster.
La mosca de fruta Drosophila melanogaster se ha utilizado como sistema
biológico para hacer frente a cuestiones relacionadas con trastornos neurológicos
en los seres humanos, debido a que los componentes moleculares básicos afines y
las vías de transducción de señales en los seres humanos son en su mayoría
conservado en Drosophila y ofrece grandes ventajas experimentales en genética,
en el análisis del comportamiento, en biología celular y molecular (HoKoh, 2006).
Gran parte de los estudios en rotenona han utilizado modelos animales y diferentes
vías de administración para la evaluación de sus efectos en el sistema nervioso
central (SNC), especialmente en las neuronas (Cabezas, 2012).
Varios grupos han demostrado que la administración sistémica de rotenona a
modelos animales reproduce las características claves de la enfermedad de
Parkinson, incluyendo la degeneración selectiva del sistema dopaminérgico
nigroestriatal, la activación de la microglía y astroglía, la formación de inclusiones
citoplasmáticas en las neuronas, trastornos del movimiento y los defectos en
complejo I de la mitocondria (Cabezas, 2012).
Con la realización de este trabajo se pretende determinar la efectividad
neuroprotectora de los extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y Alchornea
coelophylla; esto con la finalidad de que en otros estudios se logren aislar
compuestos fitoquímicos bioactivos que puedan ser utilizados en un futuro como
principios activos de nuevos medicamentos que contrarresten las consecuencias
patológicas asociadas a la enfermedad de Parkinson, lo que implicaría un gran
aparte para la sociedad actual y la industria farmacéutica.
34
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Determinar el efecto neuroprotector de los extractos metanólicos de
Acalypha diversifolia y Alchornea calophylla (Euphorbiaceae) contra
la toxicidad inducida por rotenona en Drosophila melanogaster.
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
Establecer Drosophila melanogaster como un modelo in vivo para el
estudio de la enfermedad de Parkinson.
Determinar si el ensayo geotaxis negativa es un método reproducible para
analizar la actividad locomotora en Drosophila melanogaster.
Estudiar el efecto neurotóxico del agente xenobiotico rotenona utilizando
el modelo en estudio.
35
5. METODOLOGÍA
5.1. MATERIAL Y MÉTODOS
5.1.1. Reactivos
Para los procesos de alimentación y crianza de larvas y adultos de Drosophila
melanogaster se emplearon diferentes nutrientes para enriquecer el medio de
cultivo, tales como: agar microbiológico, hidratos de carbono provenientes del
banano y proteínas originarias dela levadura; adicionalmente fueron empleados
conservantes como micostatin y ácido propionico para evitar que microorganismos
del medio que podrían infectar el medio y que pudieran afectar las larvas y las
moscas.
Para evaluar la actividad locomotora de Drosophila melanogaster se utilizó un
sistema basado en Gargano et al., (2005), formado de una caja de madera con una
ranura en la parte superior; el interior de la caja se encontraba equipada con seis
tubos geotaxicos de poliestireno ubicados de forma vertical. Las imágenes de las
posiciones de las moscas fueron capturadas con una cámara digital manteniendo
siempre 30 cm de separación entre la cámara y el sistema contenedor de los tubos
en todos los experimentos. En la parte superior del contenedor se acopló una
lámpara fluorescente para proporcionar iluminación uniforme al sistema. Fue
utilizado éter etílico para sedar las moscas; la rotenona se adquirió de sigma.
5.1.2. Materiales y equipos
Balanza analítica Precisa 300c modelo swiss quality Balanza RADWAG ref XA1103Y Refrigerador para el almacenamiento de productos químicos (Profile) Micropipetas Eppendorf de presión de 0-10, 10-100 100-1000 μL Material de vidrio Schott-Duran (Tirschenreuth, Datenshutz, Alemania) Camara digital Plancha magnética Corning stirrer/hot plate Licuadora Oster Estereoscopio UNICO ZM181HF
36
5.1.3. Obtención de extractos
Los materiales vegetales de Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla
(Euphorbiaceae) fueron recolectados en el Parque Regional Natural Ucumari
Risaralda –Colombia.
Para la obtención de los extractos de cada una las especies estudiadas se tomaron
300 g de material vegetal seco y molido y se sometieron a extracción por maceración
pasiva durante 48 horas (por triplicado con cada uno de los solventes) con hexano
(HEX), diclorometano (DCM) y (MeOH) sucesivamente, siguiendo el procedimiento
descrito por Niño et al., (2006); los extractos se concentraron a 50ºC y se
almacenaron a -10ºC hasta su utilización para la realización de los diferentes
ensayos.
5.1.4. Alimentación de larvas y adultos de Drosophila melanogaster
Fueron licuados cuatrocientos gramos (400 g) de banano en 175 mL de agua estéril; posteriormente, fueron diluidos 4 g de agar microbiológico en 160 ml de agua caliente y se adicionó el jugo de banano. La mezcla fue calentada hasta ebullición y fue suplementada con 3,5 g de levadura (disuelta inicialmente en 15 mL de agua estéril. Finalmente el medio de cultivo fue autoclavado a 120°C a 1,1 Pa por 20 minutos.
Una vez esterilizados el medio, dejar reposar y adicionar (2,5 mL) de micostatin y (0,6mL) de Ácido propionico, dejar reposar el medio y servir en frascos de vidrio que con anterioridad fueron esterilizados y expuestos a la luz ultravioleta.
Permitir que se enfríe el medio servido en los contenedores y proceder a tapar los frascos con tapones hechos de algodón y gasa.
Transferir las moscas Drosophila melanogaster al medio de alimentación gelificado. (Anexo 1).
5.1.5. Separación por géneros y sincronización de la edad de
Drosophila melanogaster.
Realizar una recolección de moscas Drosophila melanogaster macho durante un periodo de cinco días, siendo el día uno del periodo, el segundo día de eclosión, en el quinto día recolección se tendrán moscas macho Drosophila de 2-4-6 días de edad.
37
5.1.6. Evaluación de la función locomotora de Drosophila melanogaster
mediante el ensayo de geotaxis negativa, (Ensayo de longevidad).
Geotáxis es un método de evaluación del comportamiento locomotor de Drosophila melanogaster. Geotaxis negativa es una respuesta de escape innata en la que las moscas ascienden por la pared de un contenedor después de haber sido depositadas en el fondo de este.
El método se basa en la imagen digital de las moscas Drosophila melanogaster las
cuales estarían dispuestas en un sistema equipado con seis tubos geotáxicos.
Se recolectaron 150 moscas macho de Drosophila melanogaster y fueron
depositadas 25 moscas en cada uno de los seis tubos geotaxicos.
Posteriormente se golpeó el contenedor donde se encuentran los tubos geotáxicos
sobre la mesa tres veces. Las posiciones de las moscas en los tubos fueron
capturadas en imágenes digitales, donde son tomadas 10 fotos consecutivas en
modo ráfaga. De las diez fotos son analizadas la cuarta y décima, correspondientes
a tiempos de ascensión de 6 y 15 segundos. Anexo 2.
Editar las fotos utilizando el editor de imágenes ImageJ, el procedimiento para
utilizar dicho programa se describe en el Anexo 3.
Figura 14. Evaluación de la actividad locomotora de Drosophila melanogaster
mediantes geotaxis negativa.
38
5.1.7. Exposición de Drosophila melanogaster a varias
concentraciones de rotenona.
Los ensayos se realizaron por triplicado utilizando moscas macho de Drosophila
melanogaster de entre seis, ocho y diez días de edad.
Fueron recolectadas 360 moscas macho de Drosophila melanogaster y expuestas
durante siete días a medios de alimentación suplementados con rotenona a
concentraciones de 1000, 1500, 2000, 2500 y 3000 μM. 60 moscas de las 390 se
expusieron a una dieta. Después de siete días de exposición se evaluó la actividad
locomotora de las moscas mediante el ensayo de geotaxis negativa. Anexo 4.
5.1.8. Exposición de Drosophila melanogaster a varias concentraciones
de los extractos metanólicos crudos de Acalypha diversifolia y
Alchornea coelophylla (Euphorbiaceae).
Los ensayos se realizaron por triplicado utilizando moscas macho de Drosophila
melanogaster de entre seis, ocho y diez días de edad.
Fueron recolectadas 420 moscas macho de Drosophila melanogaster y expuestas
durante siete días a medios de alimentación suplementados con los extractos
metanólicos de Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla a concentraciones de
5, 10, 20 mg/ml. 60 moscas de las 420 se expusieron a una dieta. Después de siete
días de exposición se evaluó la actividad locomotora de las moscas mediante el
ensayo de geotáxis negativa. Anexo 5 y 6.
5.1.9. Exposición de Drosophila melanogaster a rotenona, extractos
metanólicos crudos de Acalypha diversifolia y Alchornea
calophylla (Euphorbiaceae).
Los ensayos se realizaron por triplicado utilizando moscas macho de Drosophila
melanogaster de entre seis, ocho y diez días de edad.
Fueron recolectadas 420 moscas macho de Drosophila melanogaster y expuestas
durante siete días a medios de alimentación suplementados con el primero de ellos
contenía extracto metanólico crudo de Acalypha diversifolia (Euphorbiaceae) a
una concentración de 10 mg/ml, el segundo fue enriquecido con extracto metanólico
crudo de Alchornea calophylla (Euphorbiaceae) a una concentración de 10
mg/ml, el tercero constaba de extracto metanólico crudo de Acalypha diversifolia
a una concentración de 10 mg/ml más rotenona a una concentración de 1000μM, el
cuarto contenía extracto metanólico crudo de Alchornea calophylla a una
concentración de 10mg/ml más rotenona a una concentración de 1000μM, el quinto
solo constaba de rotenona a una concentración de 1000 μM, el sexto tenia vitamina
39
C (Ácido ascórbico) a una concentración de 10 mg/ml y el séptimo consto de una
dieta normal. Anexo 7.
El anexo 8 esquematiza el diseño experimental
40
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Para el análisis de los resultados obtenidos en este proyecto se siguió el esquema
que se muestra en la figura 15,en el cual se observan las etapas a las que fueron
sometidas las moscas macho de Drosophila melanogaster para la evaluación del
efecto neuroprotector de los extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y
Alchornea calophylla. Las tablas de resultados se esquematizan en el anexo 9
41
Figura 15. Etapas desarrolladas durante EVALUACIÓN DEL EFECTO NEUROPROTECTOR DE LOS EXTRACTOS
METANOLICOS DE Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla (EUPHORBIACEAE) CONTRA LA TOXICIDAD
INDUCIDA POR ROTENONA EN Drosophila melanogaster.
Crianza,
alimentación de
larvas y
Drosophila
melanogaster
Separación por
géneros y
sincronización
de la edad de Drosophila
melanogaster
Evaluación de la
función locomotora
de Drosophila melanogaster
mediante el ensayo
de geotaxis negativa,
Exposición de
Drosophila
melanogaster a
varias
Exposición de
Drosophila melanogaster a varias
concentraciones en los
extractos metanólicos
crudos de Acalypha
diversifolia y Alchornea
coelophylla
Exposición de
Drosophila
melanogaster a
rotenona, extractos
metanólicos crudos de
Acalypha diversifolia y
Alchornea coelophylla
(Euphorbiaceae),
vitamina C. (Evaluación
Drosophila
melanogaster macho
adultos
Drosophila
melanogaster 2-4-6 días
de edad
(Ensayo de longevidad).
Desempeño locomotor
de Drosophila
melanogaster de entre 6
y 20 días de edad
Efecto modulador de los
extractos en la
supervivencia del
modelo en estudio
Efecto neuroprotector
de los extractos en
Drosophila
melanogaster.
Concentración en la
que se observa déficit
motriz en moscas
macho de Drosophila
melanogaster
42
6.1. Evaluación de la función locomotora de Drosophila
melanogaster mediante el ensayo de geotaxis negativa, (ensayo
de longevidad).
Para este ensayo se tomaron en cuenta un grupo de moscas con una longevidad
de 5 días y otro grupo con 20 días de edad.
5 20
0
5
10
15
20
*
días de edad
Nú
mero
de m
oscas a
scie
nd
en
Figura 16. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster de
diferentes edades; tiempo de ascensión 6 segundos. Cada valor representa las
medias de 6 experimentos independientes.
43
5 20
0
5
10
15
20
25*
días de edad
Nú
mero
de m
oscas a
scie
nd
en
Figura 17. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster de
diferentes edades; tiempo de ascensión 15 segundos. Cada valor representa las
medias de 6 experimentos independientes.
La figura 16 y 17 muestran que la capacidad de escalamiento de Drosophila melanogaster disminuyó de manera dependiente con la edad; resultado que podría estar respaldado con el hecho de que un periodo de envejecimiento normal está acompañado de la pérdida progresiva en el rendimiento fisiológico y homeostasis del organismo biológico; que en Drosophila melanogaster se evidenciaría en un descenso de su geotaxis negativa(Miquel, 2006); el término homeostasis hace referencia al auto-mantenimiento de la permanencia dinámica del organismo a través de su estabilidad química, física, biológica y metabólica con el propósito de preservar las condiciones óptimas para las actividades vitales.(Zhegunov, 2012). A medida que el tiempo del ensayo transcurrió la cantidad de moscas que ascienden por los tubos geotáxicos sea mayor.
44
6.2. Exposición de Drosophila melanogaster a varias
concentraciones de rotenona
0 1000 2000 3000 40000
5
10
15
206 segundos
15 segundos
Concentración rotenona (µM)
Nú
mero
de m
oscas a
scie
nd
en
Figura 18. Correlación entre la concentración de rotenona y Geotaxis negativa en
moscas macho de Drosophila melanogaster.
sin
rote
nona
100
0 µM
150
0 µM
200
0 µM
250
0 µM
300
0 µM
0
5
10
15
20
*
**
**
**
**
Mo
scas q
ue a
scie
nd
en
Figura 19. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a
diferentes concentraciones de rotenona; tiempo de ascensión 6 segundos. Cada
valor representa las medias de 3 experimentos independientes.
45
sin
rote
nona
100
0 µM
150
0 µM
200
0 µM
250
0 µM
300
0 µM
0
5
10
15
20
*
** **
**
**
Mo
scas q
ue a
scie
nd
en
Figura 20. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a
diferentes concentraciones de rotenona; tiempo de ascensión 15 segundos. Cada
valor representa las medias de 3 experimentos independientes.
6 15
0
5
10
15
20 sin rotenona
1000 µM
1500 µM
2000 µM
2500 µM
3000 µM
**
tiempo (s)
Nú
mero
de m
oscas a
scie
nd
en
Figura 21. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a
diferentes concentraciones de rotenona; tiempo de ascensión 6 y 15 segundos.
Cada valor representa las medias de 3 experimentos independientes.
46
Las figuras 18 a 21 muestran que la capacidad innata de escape en Drosophila
melanogaster es dependiente de la concentración de rotenona; 1000µM resultó ser
la concentración que generó déficit motriz, afectando la capacidad de ascensión en
las moscas. Este resultado sugiere que la rotenona pudo haber inhibido el complejo
I de la cadena respiratoria de electrones mitocondrial, impidiendo de esta manera el
flujo libre de electrones a través de la cadena respiratoria (Drechsel and Patel,
2008); esto alteraría la función normal de la mitocondria; que conllevaría a la
sobreproducción de especies reactivas de oxigeno; tal situación se vería reflejado
en el deterioro progresivo de la función motriz en Drosophila melanogaster
(Gaggelli, 2012).
Las concentraciones mayores a 1000µM no indujeron déficit locomotor; una
hipótesis que podría explicar este hecho es que las moscas detectaron la saturación
de rotenona en el medio, por esta razón la población de moscas decidirían
permanecer en periodo de inanición. Estudios realizados por (Geonanga, 2010)
indicaron que las moscas adultas enfrentan la inanición mediante la estimulación de
la autofagia (degradación de contenidos citoplasmáticos y secuestro de
macromoléculas), además de la inhibición de la síntesis de proteínas.
6.3 Exposición de Drosophila melanogaster a varias concentraciones de los extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla.
0 5
1
0 2
0
0
5
10
15
Concentración de extracto (mg/ml)
Nú
mero
de m
oscas a
scie
nd
en
Figura 22. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a
diferentes concentraciones de extracto de Acalypha diversifolia; tiempo de
ascensión 6 segundos. Cada valor representa las medias de 3 experimentos
independientes.
47
0 5
1
0 2
0
0
5
10
15
20
Concentración de extracto (mg/ml)
Mo
scas q
ue a
scie
nd
en
Figura 23. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a
diferentes concentraciones de extracto de Acalypha diversifolia; tiempo de
ascensión 15 segundos. Cada valor representa las medias de 3 experimentos
independientes.
0 5 10
20
0
5
10
15
Concentración de extracto (mg/ml)
Nú
mero
de m
oscas a
scie
nd
en
Figura 24. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a
diferentes concentraciones de extracto de Alchornea coelophylla; tiempo de
ascensión 6 segundos. Cada valor representa las medias de 3 experimentos
independientes.
48
0 5
1
0 2
0
0
5
10
15
20
Concentración de extracto (mg/ml)
Nú
mero
de m
oscas a
scie
nd
en
Figura 25. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a
diferentes concentraciones de extracto de Alchornea coelophylla; tiempo de
ascensión 15 segundos. Cada valor representa las medias de 3 experimentos
independientes.
Las figuras 22 a 25 muestran que los extractos metanólicos de Acalypha diversifolia
y Alchornea coelophylla no generaron efectos citotóxicos ni déficit motriz en moscas
macho de Drosophila melanogaster.
Es muy importante que estos extractos no hayan alterado la movilidad de las
moscas, ni tampoco hayan ejercido un efecto tóxico, porque esto daría a pie para
que muchos otros investigadores se interesen en aislar compuestos de los extractos
y estos puedan ser utilizados en un futuro como principios activos de medicamentos
que produzcan menos efectos secundarios (Farooqui, 2013)
49
6.3. Exposición de Drosophila melanogaster a rotenona,
extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y Alchornea
coelophylla.
sin ro
tenona
rote
nona 10
00 µ
M
Ex.
Aca
lhy
10m
g/ml
E.A
calh
+ ro
tenona1
000µ
M
E. a
lchorn
10m
g/ml
E. a
lchorn
+ ro
t 100
0µM
Vita
min
a C
0
5
10
15
20
*
**
**M
oscas q
ue a
scie
nd
en
Figura 26. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a
varios tratamientos; tiempo de ascensión 6 segundos. Cada valor representa las
medias de 3 experimentos independientes.
50
sin ro
tenona
rote
nona 10
00 µ
M
Ex.
Aca
lhy
10m
g/ml
E.A
calh
+ ro
tenona1
000µ
M
E. a
lchorn
10m
g/ml
E. a
lchorn
+ ro
t 100
0µM
Vita
min
a C
0
5
10
15
20
**
*
**
Mo
scas q
ue a
scie
nd
en
Figura 27. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a
varios tratamientos; tiempo de ascensión 15 segundos. Cada valor representa las
medias de 3 experimentos independientes.
6 15
0
5
10
15
20sin rotenona
rotenona 1000 µM
Ex.Acalhy 10mg/ml
E.Acalh+ rotenona1000µM
E. alchorn 10mg/ml
E. alchorn+ rot 1000µM
Vitamina C*
*
****
**
**
tiempo (s)
Nú
mero
de m
oscas a
scie
nd
en
Figura 28. Geotaxis negativa moscas macho Drosophila melanogaster expuestas a
varios tratamientos; tiempo de ascensión 6 y 15 segundos. Cada valor representa
las medias de 3 experimentos independientes.
51
Las figuras 26 a 28 muestran el efecto benéfico de los extractos metanólicos de
Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla; estos extractos inhibieron la toxicidad
de la rotenona a una concentración de 1000µM. El resultado positivo podría ser
consecuencia de los polifenoles presentes en los extractos; los cuales fueron
identificados mediante la marcha fitoquímica realizada en el laboratorio de
biotecnología de productos naturales de la Universidad Tecnológica de Pereira ver
anexo. El efecto favorable de los compuestos polifenólicos también se evidenció en
los estudios realizados por (Liu, 2013) quien determinó que un compuesto
polifenólico llamado curcumina redujo el nivel de ROS mitocondrial y aumentó el
tiempo de supervivencia de Drosophila melanogaster en presencia de rotenona,
aliviando así la discapacidad motriz y la degeneración neuronal dopaminergica.
Los efectos protectores de los extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y
Alchornea coelophylla se deben a sus actividades antioxidantes, debido a que estos
fueron analizados previamente mediante las técnicas ABTS•+ y DPPH •, las cuales
determinaron actividades significativas ver anexo. Lo anterior, respalda la hipótesis
de Bhatt y colaboradores, quienes afirman la protección de un organismo vivo al
daño oxidativo es debido a los antioxidantes obtenidos por medios naturales; que
son los metabolitos secundarios producidos por las plantas.
52
7. CONCLUSIONES
Geotaxis negativa es uno de los comportamientos que ha sido de vital importancia
en el seguimiento del proceso de envejecimiento y alteración motriz en Drosophila
melanogaster, dicho comportamiento evidencio una reproducibilidad confiable,
indicando que la técnica puede ser ajustada y extrapolada para estudios futuros.
La exposición a rotenona a una concentración de 1000µM induce déficit motor en
machos de Drosophila melanogaster, hecho que se vio reflejado en el estudio de
actividad locomotora mediante el ensayo geotaxis negativa, donde la capacidad de
Drosophila para escalar los tubos geotaxicos se ve disminuida.
La exposición a los extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y Alchornea
calophylla no generan deterioro motor en machos de Drosophila melanogaster.
Se ha observado un efecto protector de los extractos estudiados frente al daño
oxidativo inducido por rotenona. De los dos extractos metanólicos estudiados,
Acalypha diversifolia inhibió en mayor medida los efectos neurotóxicos de la
rotenona a una concentración de 1000µM.
53
8. RECOMENDACIONES
I. Es necesario realizar un ensayo para determinar si los extractos
metanólicos de Acalypha diversifolia y Alchornea calophylla disminuyen
la peroxidación lipídica, los niveles de hidroperóxido y proteínas carbonilo
en las moscas que han sido alimentadas con la dieta suplementada en
dichos extractos; esto con el fin de conocer el grado de neuroprotección
de los metabolitos secundarios contenidos en cada extracto.
II. El seguimiento de las actividades de las enzimas antioxidantes como
catalasa, superóxido dismutasa y glutatión transferasa sería de vital
importancia en este estudio, puesto que se podría conocer si el efecto
neuroprotector de los extractos en estudio es generado por las
actividades antioxidantes de los metabolitos secundarios contenidos en
los extractos o simplemente su efecto se resume en la activación de
dichas enzimas para contrarrestar los daños oxidativos generados por el
agente xenobiotico rotenona.
III. La determinación de dopamina daría a conocer el grado de agotamiento
de dicho neurotransmisor en Drosophila melanogaster cuando este ha
sido expuesto a los diferentes tratamientos; esto con el fin de hacer un
seguimiento y sacar conclusiones contundentes que soporten la
veracidad del efecto neuroprotector de los extractos en estudio y la
neurotoxicidad causada por la rotenona.
54
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60
ANEXOS
Anexo 1. Protocolo para Crianza, alimentación de larvas y Drosophila
melanogaster adultas.
Licuar 400g de banano + 175 ml
H2O estéril
Hervir 4g de agar + 160 ml H2O.
3,5 g levadura + 15 ml H2O
esterilizar.
2,5 ml de micostatin + 0,6 ml
Ácido propionico.
Servir el medio
Reposar medio
Jugo de banano.
61
Anexo 2. Protocolo de la evaluación de la función locomotora de Drosophila
melanogaster mediante el ensayo de geotaxis negativa, (ensayo de
longevidad).
150 moscas
Depositar 25 moscas en cada
tubo.
Descender moscas.
Tomar 10 fotos
Analizar la cuarta y decima
t= 6 s y 15 s
62
Anexo 3. Protocolo para el manejo del editor de imagen imageJ
Un ensayo tiene diez fotos cada foto tiene una duración de 1,5 segundos, se debe
contar las moscas que escalan 7 cm medidos desde la cima del tubo geotaxico hacia
abajo. Se cuentan las moscas que suben el punto de referencia en 6 y 15 segundos
.
Crear una carpeta que incluya las
10 fotos de un ensayo.
Abrir ImageJ; abrir la carpeta de
las fotos y seleccionar las 10
fotos.
Traer las fotos a la barra de
herramientas de ImageJ, se
abrirán las fotos.
La primera foto que aparece será
la décima foto t=15 s. En la barra
de herramientas ir a Process-
Find edges.
Cerrar seis fotos y observara la
cuarta foto t=6 s. En la barra de
herramientas ir a Process- Find
edges.
63
Anexo 4. Exposición de Drosophila melanogaster a rotenona varias
concentraciones. (Evaluación de la actividad locomotora) Machos de 6-8-10
días de edad siete días expuestos a rotenona.
Solución stock 1 45000 µM rotenona
Solución stock2 375000 µM rotenona
Solución stock 3 30000 µM rotenona
Solución stock 5 15000 µM rotenona
Solución stock 4 22500 µM rotenona
Alimento control
Alimento 3000 µM rotenona
15 ml Alimento + 1ml stock 1
20 x3
Alimento 2000 µM rotenona
15 ml Alimento + 1ml sn stock 3
Alimento 1500 µM rotenona
Alimento 1000 µM rotenona
Alimento 2500 µM rotenona
15 ml Alimento + 1ml sn stock 2
15 ml Alimento + 1ml sn stock 4
15 ml Alimento + 1ml sn 15000uM
20 x3
71 mg rot +4ml ETOH
20 x3
20 x3
20 x3
20 x3
64
Anexo 5. Exposición de Drosophila melanogaster al extracto metanólico de
Acalypha diversifolia (Euphorbiaceae) varias concentraciones. (Evaluación de
la actividad locomotora) Machos de 6-8-10 días de edad siete días expuestos a
extracto
Solución stock 1 200 mg extracto /ml
Solución stock 2 100 mg extracto /ml
Solución stock 3 50 mg/ml
20 mg extracto /ml alimento
15 ml Alimento + 1,5 ml sn stock1
5 mg extracto /ml alimento
15 ml Alimento + 1,5ml stock 3
Alimento control
10 mg extracto /ml alimento
15 ml Alimento + 1, 5mlsn stock 2
15 ml Alimento
800 mg Extracto +4ml H2O miliQ
20 x3
20 x3
20 x3
20 x3
65
Anexo 6. Exposición de Drosophila melanogaster al extracto metanólico
Alchornea calophylla (Euphorbiaceae) varias concentraciones. (Evaluación de
la actividad locomotora) Machos de 6-8-10 días de edad siete días expuestos a
extracto
Solución stock 1
200 mg extracto /ml
Solución stock 2 100 mg/ml extracto
Solución stock 3 50 mg/ml
20 mg extracto /ml alimento
15 ml Alimento + 1,5 ml sn stock1
5 mg extracto /ml alimento
15 ml Alimento + 1,5ml stock 3
Alimento control
10 mg extracto/ml alimento
15 ml Alimento + 1, 5mlsn stock 2
15 ml Alimento
800 mg Extracto +4ml H2O miliQ
20 x3
20 x3
20 x3
20 x3
66
Anexo 7. Exposición de Drosophila melanogaster a rotenona, extractos
metanolicos crudos de Acalypha diversifolia y Alchornea calophylla
(Euphorbiaceae), vitamina C. (Evaluación de la actividad locomotora)
Solución stock 1 15000 µM rotenona
Solución stock 2 Extracto Acalypha
150 mg/ml
Alimento 1000 µM rotenona
15 ml Alimento + 1ml sn stock 1
Alimento 10 mg/ml Alchornea
15 ml Alimento + 1ml sn stock 3
Alimento 10 mg/ml VitaminaC
Alimento rot + Alcalypha
Alimento 10 mg/ml Acalypha
15 ml Alimento + 1ml sn stock 2
15 ml Alimento + 1ml stock 4
15 ml Alimento + 1ml sn stock 1+ 1ml stock 2
17,75 mg rot +3ml ETOH
300 mg Extra. +2 ml H2O miliQ
Solución stock 3 Extracto Alchornea
150 mg/ml
300 mg Extra. +2 ml H2O miliQ
Solución stock 3 Vitamina C 150 mg/ml
300 mg Vit. C +2 ml H2O miliQ
20 x3
20 x3
20 x3
20 x3
20 x3
20 x3 Alimento rot + Alchornea
Alimento normal
15 ml Alimento + 1ml sn stock 1+ 1ml stock 3
15 ml Alimento
20 x3
67
Anexo 8. Tablas de resultados
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6
15 16 16 17 15 18
14 17 18 16 15 17
17 16 16 14 18 21
16 16 15 17 15 16
14 15 15 17 18 16
Tabla 1. Actividad locomotora moscas macho Drosophila melanogaster 5 días de
edad tiempo= 6 segundos.
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6
22 24 23 20 21 19
18 23 22 19 24 22
23 24 26 22 22 25
22 24 23 20 23 19
23 23 24 22 20 21
Tabla 2. Actividad locomotora moscas macho Drosophila melanogaster 5 días de
edad tiempo= 15 segundos.
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6
13 12 15 12 12 13
14 14 14 14 8 14
14 14 16 13 14 12
13 13 13 13 12 11
21 17 17 12 13 13
Tabla 3. Actividad locomotora moscas macho Drosophila melanogaster 20 días de
edad tiempo= 6 segundos.
Tubo 1 sin
rotenona
Tubo 2 rotenona 1000 µM
Tubo 3 rotenona 1500 µM
Tubo 4 rotenona 2000 µM
Tubo 5 rotenona 2500 µM
Tubo 6 rotenona 3000 µM
15 4 15 11 14 10
12 3 14 7 15 11
9 2 13 11 14 11
13 0 11 7 12 8
13 3 8 8 13 7
12 2 9 9 13 10
13 2 9 8 14 7
8 2 10 11 16 7
7 2 15 6 16 2
Tabla 4. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster
expuestas a varias concentraciones de rotenona tiempo= 6 segundos.
68
Tubo 1 sin rotenona
Tubo 2 rotenona 1000 µM
Tubo 3 rotenona 1500 µM
Tubo 4 rotenona 2000 µM
Tubo 5 rotenona 2500 µM
Tubo 6 rotenona 3000 µM
16 6 16 11 14 13
14 5 13 10 16 15
14 7 11 10 15 13
15 0 11 12 15 10
14 3 10 10 14 9
14 2 15 13 8 10
15 4 13 13 13 14
12 3 10 11 16 10
12 3 9 12 17 9
Tabla 5. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster
expuestas a varias concentraciones de rotenona tiempo= 15 segundos.
Tubo 1 sin extracto
Tubo 2. 5 mg/ml de
extracto Acalypha
diversifolia
Tubo 3. 10 mg/ml de
extracto Acalypha
diversifolia
Tubo 4. 20 mg/ml de
extracto Acalypha
diversifolia
13 16 11 14
11 14 12 9
14 16 8 10
10 13 11 6
13 15 16 13
10 15 8 10
8 10 12 7
13 11 12 11
6 12 11 6
Tabla 6. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster
expuestas a varias concentraciones del extracto de Acalypha diversifolia tiempo= 6
segundos.
69
Tubo 1 sin extracto
Tubo 2. 5 mg/ml de
extracto Acalypha
diversifolia
Tubo 3. 10 mg/ml de
extracto Acalypha
diversifolia
Tubo 4. 20mg/ml de
extracto Acalypha
diversifolia
16 16 17 15
14 15 10 11
17 15 18 11
15 14 14 13
14 16 17 14
13 14 16 14
9 15 14 13
14 13 18 14
8 13 13 9
Tabla 7. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster
expuestas a varias concentraciones del extracto de Acalypha diversifolia tiempo=
15 segundos.
Tubo 1. sin extracto
Tubo 2. 5 mg/ml de
extracto Alchornea
coelophylla
Tubo 3. 10 mg/ml de
extracto Alchornea
coelophylla
Tubo 4. 20 mg/ml de
extracto Alchornea
coelophylla
12 12 9 11
11 14 4 10
9 13 14 7
9 11 8 6
8 7 8 5
10 11 10 10
9 15 11 10
11 16 7 11
10 14 11 8
Tabla 8. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster
expuestas a varias concentraciones del extracto Alchornea coelophylla de tiempo=
6 segundos.
70
Tubo 1. sin extracto
Tubo 2. 5 mg/ml de
extracto Alchornea
coelophylla
Tubo 3. 10 mg/ml de
extracto Alchornea
coelophylla
tubo 4. 20mg/ml de
extracto Alchornea
coelophylla
14 13 10 12
11 15 13 13
11 17 15 8
12 13 9 9
9 11 10 8
15 14 11 11
15 13 16 14
14 17 13 11
14 15 14 15
Tabla 9. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster
expuestas a varias concentraciones del extracto Alchornea coelophylla de tiempo=
15 segundos.
Tabla 10. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster
expuestas a rotenona, extractos metanólicos de Acalypha diversifolia, Alchornea
coelophylla y Vitamina C tiempo= 6 segundos.
Tubo 1. sin
rotenona
Tubo 2. Rotenona 1000 µM
Tubo 3. Ext.Acalhypha
diversifolia 10mg/ml
Tubo 4. Ext.
Acalhypha+
rotenona
Tubo 5. Ext.
Alchornea coelophylla
10mg/ml
Tubo 6. Ext.
Alchornea+ rotenona
Tubo 7. Vitamina
C
15 4 11 15 9 8 8
12 3 12 15 4 12 7
9 2 8 12 14 12 11
13 0 11 16 8 11 11
13 3 16 14 8 12 10
12 2 8 13 10 15 13
13 2 12 15 11 12 8
8 2 12 16 7 14 9
7 2 11 14 11 11 10
71
Tabla 11. Actividad locomotora moscas macho de Drosophila melanogaster
expuestas a rotenona, extractos metanólicos de Acalypha diversifolia, Alchornea
coelophylla y Vitamina C tiempo= 15 segundos.
Anexo 9. Marcha fitoquimica y Actividades antioxidantes de los extractos
metanólicos de Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla Euphorbiaceae
Tabla 12. Metabolitos secundarios extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y
Alchornea coelophylla Euphorbiaceae
Tubo 1. sin
rotenona
Tubo 2. Rotenona 1000 µM
Tubo 3. Ext. Acalhypha diversifolia
10mg/ml
Tubo 4. Ext. Acalhypha+
rotenona
Tubo 5. Ext.
Alchornea coelophylla
10mg/ml
Tubo 6. Ext.
Alchornea+ rotenona
Tubo 7. Vitamina
C
16 6 17 18 10 15 8
14 5 10 15 13 12 8
14 7 18 16 15 16 11
15 0 14 17 9 14 15
14 3 17 16 10 15 13
14 2 16 17 11 18 13
15 4 14 17 16 11 15
12 3 18 17 13 13 13
12 3 13 16 14 15 12
Número UTP
Alcaloides Fenoles y taninos
ESTEROIDES, TRITERPENOS, TERPENOS y ESTEROLES
Cumarinas ESTEROIDES TRITERPENOS TERPENOS y
ESTEROLES
MeOH MeOH MeOH MeOH MeOH MeOH
126 - +++ - - + -
128 - ++ - - + -
Control (+)
Papaverina Ácido tánico Lupeol y lanosterol Hidroxicoumarina
Número UTP
Terpenos Saponinas Flavonoides Lactonas y
sesquiterpenlactonas Cumarinas
MeOH MeOH MeOH MeOH MeOH
126 + - ++ - -
128 + - +++ - -
Control (+) Lupeol Digitonina Apigenina Digitoxina Hidroxicoumarina
72
Tabla 13. Actividad antioxidante extractos metanólicos de Acalypha diversifolia y
Alchornea coelophylla Euphorbiaceae
Tabla 14.Cuantificación de fenoles y flavonoides totales extractos metanólicos de
Acalypha diversifolia y Alchornea coelophylla Euphorbiaceae
ESPECIE Voucher No
UTP
DPPH •
(μmol trolox/g extracto) DPPH •
%Actividad ABTS•+
(μmol trolox/g extracto) ABTS•+
% Actividad
MeOH
MeOH
MeOH
MeOH
Acalypha diversifolia
3967 126 41,51
39,6191587
280,59
99,1236852
Alchornea coelophylla
3969 128 51,95
49,5571326
282,48
99,7994132
Control (+) 67,13 282,67 282,67 282,67
ESPECIE Voucher No
UTP
Fenoles totales
(mg Ácido gálico/ mg extracto)
Flavonoides
(mg Kaempferol/ mg extracto)
MeOH MeOH
Acalypha diversifolia
3967 126 0,031 0,0044
Alchornea calophylla
3969 128 0,074 0,0049
