Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
HAL Id: tel-00752404https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00752404
Submitted on 15 Nov 2012
HAL is a multi-disciplinary open accessarchive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come fromteaching and research institutions in France orabroad, or from public or private research centers.
L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, estdestinée au dépôt et à la diffusion de documentsscientifiques de niveau recherche, publiés ou non,émanant des établissements d’enseignement et derecherche français ou étrangers, des laboratoirespublics ou privés.
Etude de l’assemblage supramoléculaire des cadhérines,et dynamique d’adhésion
Sébastien Chevalier
To cite this version:Sébastien Chevalier. Etude de l’assemblage supramoléculaire des cadhérines, et dynamique d’adhésion.Biochimie [q-bio.BM]. Université Sciences et Technologies - Bordeaux I, 2009. Français. �tel-00752404�
N° d’ordre : 3970
THÈSE
PRÉSENTÉE A
L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1
ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE
Par M. CHEVALIER, Sébastien Vincent
POUR OBTENIR LE GRADE DE
DOCTEUR SPÉCIALITÉ : Biochimie
Etude de l’assemblage supramoléculaire des cadhérines, et
dynamique d’adhésion
Thèse dirigée par Dr. FERACCI, Hélène
Soutenue le : 15 décembre 2009
Devant la commission d’examen formée de : M. DE LA FUENTE, Jesus, Université de Saragosse M. MEGE, René-Marc, Université Pierre et Marie Curie Mme ODA, Reiko, Université de Bordeaux M. RICHETTI, Philippe, Université de Bordeaux M.SILBERZAN, Pascal, Université Pierre et Marie Curie Mme FERACCI, Hélène, Université de Bordeaux
Université Bordeaux 1 – Les Sciences et les Technologies au service de l'Homme et de l'environnement
Sommaire
Avant-Propos ______________________________________________________________ 1
Exposé Bibliographique ______________________________________________________ 7
I. Les jonctions intercellulaires _____________________________________________ 9
1. Les jonctions serrées (zonulae occludentes) ____________________________________________ 10
2. Les jonctions adhérentes (zonulae adherentes) __________________________________________ 10
3. Les desmosomes (maculae adherentes) ________________________________________________ 12
4. Les jonctions communicantes (gap junctions) ___________________________________________ 14
II. La Superfamille des cadhérines __________________________________________ 14
1. Description _______________________________________________________________________ 14
2. Les cadhérines classiques de type I ____________________________________________________ 17
a. Interface adhésive et échange de brin β _____________________________________________ 17
b. Modification de conformation lors de l’interaction : le Domain Swapping __________________ 24
c. Implication des modules EC dans l’interaction cadhérine ________________________________ 29
3. Les cadhérines classiques de type II ___________________________________________________ 32
4. Les cadhérines desmosomales _______________________________________________________ 34
5. La T-cadhérine ____________________________________________________________________ 37
6. La spécificité d’interaction des cadhérines ______________________________________________ 39
a. Tests d’agrégation cellulaire _______________________________________________________ 39
b. Modèle théorique de l’adhésion spécifique ___________________________________________ 41
c. Comparaison entre cadhérines de type I et cadhérines de type II _________________________ 43
III. Régulation des cadhérines ____________________________________________ 44
1. Assemblage des cadhérines et formation des jonctions ___________________________________ 44
2. Régulations de l’adhésion ___________________________________________________________ 46
3. Cadhérines et développement _______________________________________________________ 47
a. Un peu d’embryologie ____________________________________________________________ 47
b. Cadherin Switching et transition épithélio-mésenchymateuse ____________________________ 49
IV. Biofonctionnalisation ________________________________________________ 51
1. Modification de surface _____________________________________________________________ 51
2. Méthodes d’immobilisation des biomolécules ___________________________________________ 55
a. Fixation des protéines non orientée _________________________________________________ 55
i. Attachement non covalent par adsorption _________________________________________ 55
ii. Attachement covalent _________________________________________________________ 55
b. Fixation orientée des protéines ____________________________________________________ 57
3. Chimie et géométrie _______________________________________________________________ 59
Objectif du travail __________________________________________________________ 65
Article I : Tryptophan 2: the cadherin feeler, finding the way for the trans interaction ___ 67
Article II: Type I vs Type II Cadherins ___________________________________________ 99
Article III: Surfaces Covalently Covered with E-Cadherin to Improve Cell Adhesion Events125
Article IV: Beyong Structure, to survival: Activation of Stat3 by cadherin engagement __ 151
Conclusion _______________________________________________________________ 165
Références Bibliographiques ________________________________________________ 171
Résumé:
Les mécanismes adhésifs jouent un rôle crucial en biologie. Les cadhérines classiques
constituent une des principales familles de molécules d‟adhésion cellulaire dépendante du
calcium. Ces glycoprotéines transmembranaires sont impliquées dans des interactions
principalement homophiles. Ces interactions régulent des voies de signalisation impliquées
dans de nombreux phénomènes biologiques. Cette thèse porte sur l‟étude comparative des
dynamiques d‟interactions des cadhérines E- et -11, prototypes respectivement des cadhérines
classiques de type I et II. Le ciblage d‟acides aminés particuliers de l‟interface adhésive nous
a permis de montrer que pour les cadhérines de type I, l‟échange de brin avec le Trp2 ont un
rôle clé ; pour les types II un mécanisme différent intervient. Nous avons aussi développé une
chimie innovante pour contrôler l‟immobilisation orientée et covalente de protéines. Enfin
une revue décrit une étude de l‟activation de voies de signalisation par engagement des
cadhérines.
Mots clés : Cadhérines, Dynamique d‟interaction, Molécule unique, Chambre de flux,
biofonctionnalisation, structure-fonction, signalisation
Summary:
Cell adhesion receptors of the classical cadherin family are involved in Ca2+
-dependent
homophilic interactions. In order to dissect the molecular mechanisms of cadherin-based cell-
cell adhesion, this Ph.D. thesis describes a comparative dynamic study of interactions
between cadherins E- & -11, chosen as classical type I and II cadherins prototypes
respectively. Modifications of particular residues in the E-cadherin adhesive interface showed
that the -strand exchange with its Trp2 had a prominent feature; for type II cadherins, a
different mechanism was described involving a larger domain swapping. We then developed a
new protocol for immobilizing proteins in an orientated and covalent manner on surfaces.
These interactions regulate signalization pathways in various biological processes. Studies
describing Stat3 activation through direct cadherin engagement are reviewed.
Key words: Cadherins, interaction dynamics, single molecule, flow chamber,
biofunctionalization, structure-function relationships, signalling pathways
1
AVANT-PROPOS
2
3
L'adhérence cellulaire est un phénomène ubiquitaire essentiel pour le développement
et le fonctionnement en harmonie des organismes pluricellulaires. Elle intervient dans des
phénomènes physiologiques très divers comme la survie, la prolifération, la différenciation et
la migration cellulaire. Une dérégulation de cette adhérence cellulaire peut conduire à de
nombreuses pathologies comme l‟inflammation, l‟invasion d'un tissu par un agent pathogène,
la réaction de l'organisme vis-à-vis des biomatériaux, et en particulier à la formation de
métastases. L‟adhérence participe de façon importante à l‟organisation et la structuration des
tissus, et est ainsi nécessaire à la cohésion et au bon fonctionnement des organismes
multicellulaires. Ainsi, les mécanismes adhésifs jouent un rôle crucial en biologie.
Les cellules adhèrent sélectivement entre elles et à des molécules de la matrice
extracellulaire qui assure le soutien mécanique de l‟ensemble. Il est maintenant clair que les
conséquences de l‟engagement de récepteurs adhésifs sont bien plus larges qu‟un simple
ancrage mécanique des cellules à un endroit donné dans l‟organisme. Outre leur rôle
d‟attachement, les molécules adhésives ont souvent un rôle de senseur pour les cellules. En
effet l‟adhérence informe la cellule sur environnement, et affecte plusieurs éléments
structuraux et fonctionnels comme l‟organisation du cytosquelette, la polarité ou la
prolifération cellulaire, et l‟expression de gènes. Les interactions adhésives sont assurées
majoritairement par des protéines transmembranaires et parfois par des sucres ou des
peptides.
Les protéines d‟adhésion peuvent être classées en 4 familles structurales : les protéines
apparentées aux immunoglobulines, les intégrines, les sélectines et enfin les cadhérines. Ces
dernières forment une des principales familles de molécules assurant l‟adhésion intercellulaire
dépendante du calcium. Ces glycoprotéines transmembranaires se lient par interaction
homophile de leurs segments extracellulaires, et ainsi connectent les cellules entre elles. Le
domaine intracytoplasmique de ces molécules se lie aux filaments d‟actine et participe à
différentes voies de signalisation. La majorité des cellules expriment plusieurs types de
cadhérines à leur surface, suggérant une coopération complexe entre adhésion et signalisation
cellulaire.
Durant ma thèse, je me suis intéressé à l‟adhésion cellule-cellule par les cadhérines
classiques de type I et de type II. La E-cadhérine et la cadhérine-11 ont été choisies comme
4
prototypes de ces 2 familles de cadhérines pour leurs patrons d‟expression qui suggère des
rôles biologiques distincts. En effet la E-cadhérine est exprimée à la surface des cellules
épithéliales, au niveau des jonctions adhérentes qui forment une ceinture adhésive entre les
cellules épithéliales. La cadhérine-11 est quant à elle exprimée en particulier à la surface de
cellules ayant un phénotype mésenchymateux (comme les synoviocytes ou les
myofibroblastes) ou encore des neurones et des ostéoblastes. La cadhérine-11 s‟organise en
points de contacts jonctionnels à la surface de ces cellules (Hinz et al, 2004; Kiener et al,
2009).
L‟exposé bibliographique présenté dans ce manuscrit fait tout d‟abord le point sur
l‟état de l‟art de la superfamille des cadhérines. Nous décrirons d‟abord les 5 familles de
cadhérines, en nous intéressant plus particulièrement aux cadhérines classiques de type I et de
type II. Nous détaillerons les propriétés structurales de leurs interactions. Puis nous étudierons
comment les cadhérines participent à l‟organisation du cytosquelette, contribuent à la
formation des jonctions adhérentes, et interviennent dans la ségrégation cellulaire au cours du
développement embryonnaire. Nous nous sommes enfin intéressés à différentes méthodes de
chimie de surface permettant l‟immobilisation de molécules. L‟objectif est de réaliser des
surfaces biomimétiques permettant de progresser dans la compréhension des phénomènes
adhésifs.
C‟est dans ce contexte que nous avons comparé les interactions homophiles réalisées
par la E-cadhérine et la cadhérine-11, en conditions dynamiques. Notre approche a pour but
de caractériser la nanomécanique de ces protéines à l‟échelle de la molécule unique, pour
mieux comprendre les relations structure fonction et faire le lien avec le fonctionnement des
cadhérines dans leur contexte cellulaire. Un tel projet exige la mise au point de nouveaux
outils biochimiques et chimiques, que nous avons commencé à développer en particulier au
cours de cette thèse.
La première partie des résultats définit le rôle de certains éléments structuraux très
conservés parmi les cadhérines de type I et de type II dans la dynamique d‟adhésion.
L‟influence de ces éléments structuraux a été mise en évidence en combinant les techniques
de biologie moléculaire et de mesures d‟interactions en chambre à flux laminaire.
La deuxième partie de ce travail décrit le développement d‟une nouvelle stratégie de
fixation covalente et orientée des fragments protéiques via leur motif hexahistidine. Ce
nouveau procédé, développé pour les cadhérines, peut être très facilement transposable à
d‟autres molécules possédant le motif hexahistidine, et fait l‟objet d‟un dépôt de brevet.
5
Enfin, le dernier volet de ce travail consiste en une synthèse des travaux montrant que
l‟engagement direct de la E-cadhérine intervient sur l‟activation et la régulation d‟un facteur
de transcription, Stat3, et sur la survie cellulaire.
6
7
EXPOSE BIBLIOGRAPHIQUE
8
9
I. Les jonctions intercellulaires
Au sein d‟un organisme multicellulaire, les contacts intercellulaires jouent des rôles
essentiels dans de nombreux processus cellulaires dont la morphogenèse, la différenciation, la
prolifération et la migration (Gumbiner, 1996; Takeichi, 1991). Lorsque l‟on évoque
l‟adhérence cellulaire et en particulier l‟adhérence intercellulaire, il est utile de préciser quels
sont les éléments subcellulaires qui la structurent.
L‟arrivée de la microscopie électronique à transmission, dans les années 1960, a permis
d‟identifier et de décrire morphologiquement une succession de structures jonctionnelles
(complexe jonctionnel 1µm) qui n‟étaient pas détectables par microscopie photonique
(Farquhar & Palade, 1963). Ces points d‟attachement apparaissent très complexes d‟un point
de vue morphologique (Figure 1), avec une structuration spécifique de l‟espace intercellulaire
et du cytoplasme sous-jacent. Cette complexité a été confirmée par l‟identification des
différentes protéines transmembranaires et intracytoplasmiques qui constituent ces jonctions.
Ces sites de contact possèdent une architecture globale commune et, de façon générale, sont
constitués de deux catégories de protéines :
- des protéines de liaison transmembranaires, dont les domaines extracellulaires interagissent
avec ceux de leurs partenaires exprimés sur la cellule voisine. Leurs domaines cytoplasmiques
participent à la connexion de ces structures au réseau cytosquelettique, par leurs interactions
avec une ou plusieurs protéines d‟attachement intracellulaire,
- des protéines intracellulaires qui forment une plaque dense aux électrons du côté
cytoplasmique et régulent la connexion du complexe jonctionnel au réseau d‟actine ou aux
filaments intermédiaires.
Il existe quatre types de jonctions intercellulaires: les jonctions serrées, les jonctions
adhérentes, les desmosomes et les jonctions communicantes (Figure 1). Ces jonctions sont
particulièrement bien organisées dans les structures tissulaires de type épithélial, mais sont
aussi présentes dans d‟autres tissus (muscle cardiaque, tissus nerveux…).
Nous décrirons ces 4 types de jonctions, en nous intéressant plus particulièrement aux
jonctions adhérentes et aux desmosomes, les cadhérines étant les récepteurs adhésifs de ces
plaques adhésives.
10
1. Les jonctions serrées (zonulae occludentes)
Les jonctions serrées constituent une barrière de perméabilité sélective au niveau des
feuillets cellulaires épithéliaux et une barrière de diffusion des lipides et des protéines
membranaires délimitant les domaines apicaux et basolatéraux de la membrane plasmique.
Ces jonctions sont présentes principalement dans les cellules épithéliales et endothéliales.
Les jonctions serrées se situent au niveau de la portion apicale de la membrane latérale
des cellules et apparaissent comme une succession de points de contact discrets, récemment
appelés « kissing points », où les membranes semblent fusionnées (espace intercellulaire
indétectable), formant une ceinture perméable autour de la cellule. Au sein d‟une cellule, il
existe plusieurs chaînes de « kissing points ». Ces chaînes sont formées par l‟association de
protéines transmembranaires spécifiques au niveau de deux membranes plasmiques
adjacentes. L‟occludine, première protéine transmembranaire des jonctions serrées, a été
identifiée il y a qu‟une quinzaine d‟années (Furuse et al, 1993).
Figure 1 : Morphologie des jonctions intercellulaires. (a) Cliché de microscopie électronique à
transmission représentant 3 des jonctions intercellulaires (Tsukita et al, 2001). (b) Schéma de cellules
épithéliales polarisées avec positionnement des différentes jonctions.
2. Les jonctions adhérentes (zonulae adherentes)
Ces jonctions, situées en position basale des jonctions serrées, forment des connexions
entre cellules voisines et présentent un espace intercellulaire d‟environ 20 nm, observable par
microscopie électronique (Farquhar & Palade, 1963). Les ponts transmembranaires sont
constitués dans ces structures par les cadhérines. Ces molécules ont une spécificité tissulaire,
par exemple la E-cadhérine est exprimée dans les cellules épithéliales, la N-cadhérine dans les
cellules nerveuses et le muscle cardiaque, la P-cadhérine dans le placenta. Le segment
Jonctions
serrées
Jonctions
adhérentes
Jonctions
communicantes
Desmosomes
11
intracellulaire des cadhérines se lie, au niveau du réticulum endoplasmique, à la ou à la -
caténine aussi appelée plakoglobine (Hinck et al, 1994). L‟-caténine vient ensuite s‟associer
à la (ou )-caténine et fait le lien avec le réseau d‟actine. Bien que le complexe cadhérines-
caténines inclue l‟ -caténine (protéine de liaison au cytosquelette), il n‟a jamais été démontré
que ce complexe se lie directement au réseau d‟actine, comme il est généralement assumé.
Dans le modèle proposé par W.J. Nelson, l‟interaction entre le complexe cadhérines-caténines
et l‟actine est réalisée par les monomères d‟-caténines liés à la (ou )-caténine, en équilibre
avec les dimères d‟-caténines liés au cytosquelette d‟actine (Nelson, 2008). En effet, des
expériences de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) ont montré que bien que
les éléments du complexe E-cadhérine/-caténine/-caténine aient une fraction mobile
similaire, l‟-caténine immédiatement adjacente au contact cellule-cellule était beaucoup
plus dynamique (Yamada et al, 2005).Différentes protéines de liaison à l‟actine viennent
compléter cet échafaudage moléculaire : la vinculine, l‟-actinine et aussi ZO-1 et ZO-2 mais
uniquement dans les cellules non épithéliales qui ne possèdent pas de jonctions serrées,
comme les fibroblastes ou les cellules de muscle cardiaque (Nagafuchi et al, 1994). Une autre
protéine intracellulaire, appelée p120, semble être très importante pour réguler le niveau de E-
cadhérine à la surface cellulaire (Peifer & Yap, 2003; van Hengel & van Roy, 2007). Plus
récemment, les nectines ont été découvertes comme constituants des jonctions adhérentes
(Morrison & Racaniello, 1992). Les nectines, actuellement au nombre de 4, font partie de la
superfamille des immunoglobulines et se lient à l‟afadine par leur l‟extrémité C-terminale.
Deux isoformes de l‟afadine résultant d‟épissage alternatif ont été identifiées, mais seule la 1-
afadine se lie à l‟actine (Mandai et al, 1997). Le complexe nectine-afadine semble jouer un
rôle important dans l‟organisation des jonctions cellulaires. De nombreuses autres protéines
ont été identifiées au niveau des jonctions adhérentes, comme ceci est représenté sur la Figure
2 soulignant à nouveau la complexité moléculaire de ces jonctions et suggérant une régulation
importante.
Les jonctions intercellulaires assurent la cohésion de tissus tels que les épithéliums ou
le tissu cardiaque. Cette homéostasie peut subir des dérèglements au cours de la progression
tumorale et les cadhérines, éléments structuraux de ces jonctions, sont souvent impliquées.
Dans les tumeurs humaines, la perte de l‟adhésion via les cadhérines est corrélée à
l‟acquisition du pouvoir métastatique des carcinomes. Parmi les phénomènes responsables de
cette perte d‟adhésion, on peut trouver des mutations du gène de la E-cadhérine, une
diminution ou une inhibition totale d‟expression de la E-cadhérine. En effet, la E-cadhérine
est classée parmi les gènes supresseurs de tumeurs ; ceci a été mis en évidence de façon
expérimentale mais aussi dans de multiples études cliniques de cancers chez l‟homme
12
(Birchmeier et al, 1996; Christofori & Semb, 1999). Par exemple, le caractère invasif de
cellules de carcinomes mammaires dédifférenciées peut être bloqué par transfection avec
l‟ADNc de la E-cadhérine. De plus, l‟expression de N-cadhérine a aussi été corrélée à une
augmentation de la motilité et du caractère invasif de cellules cancéreuses mammaires (Hazan
et al, 2000; Nieman et al, 1999). Cet effet de la N-cadhérine s‟exprime malgré la présence de
E-cadhérine, normalement suppresseur de motilité. Enfin, une expression réduite de la E-
cadhérine est observée dans des carcinomes squameux de la peau et dans la maladie de Paget.
D‟autres maladies comme le bullous pemphigoid ou le psoriasis sont caractérisées par une
forte quantité de E-cadhérine soluble dans le sérum des patients (Furukawa et al, 1994).
Figure 2 : Représentation schématique de l’échafaudage moléculaire des jonctions adhérentes (Mege et al,
2006). La E-cadhérine, au niveau des jonctions adhérentes, se lie directement à la -caténine. La -
caténine interagit avec l’-caténine qui contribue à la polymérisation des filaments d’actine.
3. Les desmosomes (maculae adherentes)
Les desmosomes sont observés principalement dans les tissus soumis à des contraintes
mécaniques (épithéliums et muscle cardiaque). Ils sont distribués le long de la membrane
latérale sans localisation spécifique, souvent en alternance avec les jonctions adhérentes
(Vasioukhin et al, 2000). L‟espace intercellulaire est de 30 nm environ (Farquhar & Palade,
1963). Ces jonctions sont également constituées de membres de la superfamille des
cadhérines, les desmocollines et desmogléines (Figure 3). La plaque intracytoplasmique,
13
composée de plakoglobines et desmoplakines, réalise un support d‟ancrage pour les filaments
intermédiaires de cytokératine. La plakoglobine s‟associe au segment cytoplasmique des
desmocollines et desmogléines. Elle est homologue à la -caténine et est d‟ailleurs parfois
retrouvée associée aux cadhérines au niveau des jonctions adhérentes (Gumbiner, 1996).
Figure 3 : Modèle d’interaction des complexes protéiques au niveau des desmosomes. (D’après Nollet et al.,
2000). Des hétérodimères cis de desmocolline-desmogléine s’associent par leur domaine extracellulaire. Le
domaine intracellulaire s’associe à un complexe multiprotéique : plakoglobine, plakofiline-1 et
desmoplakine. Ces protéines font le lien avec les filaments intermédiaires.
Deux maladies auto-immunes de la peau et des muqueuses, pemphigus foliaceus et
pemphigus vulgaris, ont pour cause la production d‟anticorps dirigés respectivement contre
les desmogléines Dsg1 et Dsg3 (Lin et al, 1997). D‟autres pemphigus à IgA ont pour cible la
desmocolline Dsc1 (Hashimoto et al, 1997). Ces divers pemphigus sont caractérisés par une
perturbation des desmosomes au niveau des cellules épithéliales, à l‟origine d‟un détachement
cellulaire provoquant l‟apparition de cloques au sein des différentes couches de l‟épiderme
(Lin et al, 1997). Des souris transgéniques synthétisant la Dsg3 tronquée de son domaine
amino-terminal présentent des symptômes proches de ceux du pemphigus vulgaris (Allen et
al, 1996). Les desmogléines sont également impliquées dans une variante de la keratodermie
palmoplantaire striée, correspondant à une hyperkératination des mains et des pieds. Cette
pathologie proviendrait d‟une mutation ponctuelle conduisant à un épissage aberrant de
l‟ARNm ayant pour conséquence la perte du domaine EC1 et du début de EC2 de la
desmogléine Dsg1 (Rickman et al, 1999).
14
4. Les jonctions communicantes (gap junctions)
Les jonctions communicantes correspondent à la concentration de canaux
intercellulaires au niveau des contacts entre deux cellules. L‟unité de base de ces canaux est
une protéine transmembranaire, la connexine. Six connexines s‟assemblent pour former un
connexon et l‟association de deux connexons de deux cellules voisines forme un canal
intercellulaire. Ce canal permet à des ions et à d‟autres molécules hydrosolubles (oses, acides
aminés, nucléotides et vitamines) d‟une taille ~ 1 kDa de passer directement d‟une cellule à
l‟autre. L‟espace intercellulaire est d‟environ 3 nm.
En conclusion, les cellules sont capables, pour rester cohésives, d‟organiser des
assemblages relativement complexes : les jonctions intercellulaires. La complexité
morphologique de ces structures se retrouve au niveau moléculaire. Ces jonctions sont
constituées de protéines d‟adhésion et de protéines intracellulaires spécifiques qui peuvent
aussi servir de liens entre différents types de jonctions et intervenir dans la plasticité des
contacts. L‟ensemble de ces protéines constitue un échafaudage supramoléculaire très régulé
qui participe à la transmission du signal entre le milieu extra- et intra-cellulaire et
réciproquement, et, également d‟une cellule à l‟autre au sein d‟une structure tissulaire.
Les jonctions adhérentes et les desmosomes sont structurés au niveau transmembranaire
par les membres de la superfamille des cadhérines. Ces molécules ont des structures très
voisines et semblent remplir des fonctions différentes, dans des processus normaux et
pathologiques. La E-cadhérine, constituant principal des jonctions adhérentes dans les cellules
épithéliales, semble intervenir dans les premières étapes de l‟assemblage du complexe
jonctionnel apical et ainsi être un élément essentiel dans leur organisation. C‟est la raison
pour laquelle notre intérêt s‟est particulièrement porté sur les cadhérines.
II. La Superfamille des cadhérines
1. Description
Les cadhérines constituent une superfamille de glycoprotéines transmembranaires qui
lient le calcium, dont la plupart ont des propriétés adhésives. Dans cette superfamille, c‟est la
E-cadhérine qui a d‟abord été décrite, isolée à partir d‟embryon de souris au stade morula et
appelée uvomoruline (Hyafil et al, 1981) ou L-CAM chez le poulet (Gallin et al, 1983). Peu
15
après la découverte de la E-cadhérine, la P- puis la N-cadhérine ont été décrites (Miyatani et
al, 1989; Nose & Takeichi, 1986). L‟utilisation de RT-PCR a permis ensuite de découvrir
d‟autres cadhérines (cadhérines 4 à 11) dans les tissus nerveux de rat (Suzuki et al, 1991).
Depuis, la superfamille des cadhérines n‟a cessé de croitre grâce aux programmes de
séquençage du génome, avec aujourd‟hui plus de 350 cadhérines identifiées si l‟on inclut les
isoformes caractéristiques des différentes espèces animales (Hulpiau & van Roy, 2009).
Tous les membres de la superfamille des cadhérines ont un domaine extracellulaire
multimodulaire avec la présence de « motifs cadhérines » d‟environ 110 acides aminés de
long (Figure 2). Ces motifs cadhérines ont des sites très conservés qui permettent de les
identifier, comme les séquences: LDRE (Leu-Asp-Arg-Glu), DxNDN (Asp-x-Asn-Asp-Asn)
et DxD (Asp-x-Asp) (Hatta et al, 1988) (Figure 6). Ces acides aminés constituent les éléments
structuraux des poches de fixation du calcium qui sont situés entre 2 modules extracellulaires
consécutifs. En effet, les cadhérines (Ca pour calcium et Adherin pour adhésion en grec) sont
des molécules dont l‟activité biologique est dépendante du calcium (Takeichi, 1977).
La E-cadhérine reste sans conteste la cadhérine la plus étudiée, et est souvent considérée
comme la cadhérine de référence. Outre sa fonction de "colle moléculaire", elle est impliquée
dans un grand nombre de régulations au cours du développement embryonnaire, et est
capable d‟influencer la différenciation cellulaire et la morphogénèse des tissus (Larue et al,
1996a; van Roy & Berx, 2008). De plus le gène de la E-cadhérine est aussi considéré comme
suppresseur de tumeur (Jeanes et al, 2008). Cette molécule possède un ectodomaine
comprenant 5 modules extracellulaires de ~110 acides aminés chacun, un domaine
transmembranaire, et une queue cytoplasmique en interaction avec le cytosquelette d‟actine
via les caténines. Nollet et al. ont proposé une classification basée sur les similarités de
séquences de l‟ensemble des cadhérines en 5 familles (Nollet et al, 2000) (Figure 4) :
1. les cadhérines classiques de type I ont de nombreuses homologies de séquence avec la
E-cadhérine (68% à 78% pour le module EC1), et présentent des éléments conservés
comme un tryptophane en 2ème
position (Trp2) ou la séquence HAV (His79, Ala80,
Val81). On en dénombre 5 différentes : les E-, N-, P-, R- et C-cadhérines ;
2. les cadhérines classiques de type II ne présentent, au niveau du module EC1, que 40 à
50% d‟homologie de séquence avec le module EC1 de la E-cadhérine. Le motif HAV,
est ici remplacé par le motif QAV (Gln76, Ala77, Val78). Ces cadhérines présentent
de fortes similarités entre elles, et en particulier 2 tryptophanes en 2ème
et 4ème
position
(Trp2 et 4). Elles sont au nombre de 12 (cadhérine-5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -18,-
19,-20 et la PB-) ;
16
3. les desmocollines et les desmogléines sont les cadhérines présentes au niveau des
desmosomes, comme ceci a déjà été mentionné. Leur module EC1 présente ~50% de
similarité avec celui de la E-cadhérine. Les cadhérines desmosomales possèdent aussi
un Trp2 et la séquence HAV. Cependant, leur segment cytoplasmique interagit avec
les filaments intermédiaires et non pas avec les filaments d‟actine, à la différence des
cadhérines classiques de type I et II. Il existe 3 desmocollines et 4 desmogléines
différentes ;
4. les protocadhérines possèdent 1 ou 2 modules extracellulaires supplémentaires par
rapport aux cadhérines décrites précédemment. Les modules extracellulaires sont
semblables au sein de cette même famille, mais différents de ceux de la E-cadhérine
(Nollet et al, 2000). En particulier, le Trp2 et la séquence HAV ne sont pas présents au
sein de cette famille. Leur queue cytoplasmique diffère aussi de celles des autres
cadhérines ; elle interagit à la fois avec l‟actine, mais aussi avec les neurofilaments et
les microtubules (Yagi, 2008). Le domaine EC1 de certaines protocadhérines possède
un motif RGD (Arg-Gly-Asp) (Morishita & Yagi, 2007). Ainsi, ces molécules peuvent
interagir avec les intégrines (Mutoh et al, 2004). Avec plus de 50 membres différents,
elles constituent par le nombre la plus importante famille de cadhérines ;
5. les autres cadhérines sont répertoriées dans cette dernière famille, dite des protéines
apparentées aux cadhérines. Ces cadhérines ne possèdent ni Trp2, ni séquence HAV et
ne présentent pas vraiment d‟homologies entre elles. Dans cette famille, la T-
cadhérine est remarquable par le fait qu‟elle est la seule cadhérine dépourvue de
domaine intracytoplasmique et est insérée dans la membrane par une ancre
glycosylphosphatidylinositol (GPI). Les Fat-cadhérines ou encore les cadhérines
flamingo à 7 domaines transmembranaires ont de multiples modules EC
(respectivement 33 et 9) ; elles ont de plus des motifs EGF et laminine, ainsi qu‟une
boîte Flamingo pour la cadhérine homonyme (Nollet et al, 2000). Il existe une
quinzaine de protéines apparentées aux cadhérines.
L‟ensemble des données structurelles et fonctionnelles montrent que 3 ions calcium se
fixent dans chaque poche entre 2 modules cadhérines consécutifs, soit 12 ions sur
l‟ensemble du fragment extracellulaire des cadhérines classiques, rigidifiant ainsi
l‟ensemble de l‟ectodomaine (Boggon et al, 2002; Pertz et al, 1999b). Cette fixation
(KD~25 µM), qui s‟opère de manière coopérative, induit de légers changements de
conformation et participe à la maturité structurale de la protéine fonctionnelle (Courjean et
al, 2008). Les expériences de RMN de même que les simulations numériques suggèrent
17
que cette fixation de calcium favoriserait la dimérisation des cadhérines (Haussinger et al,
2004; Haussinger et al, 2002; Sotomayor & Schulten, 2008). Une étude très récente sur le
segment extracellulaire EC15 de la E-cadhérine par FRET (fluorescence résonance energy
transfer) confirme que, en solution, la dimérisation est dépendante de la présence de
calcium et est observée à 0.1 mM de calcium (Sivasankar et al, 2009; Zhang et al, 2009).
Figure 4 : Représentation schématique des différentes familles de cadhérines.
2. Les cadhérines classiques de type I
a. Interface adhésive et échange de brin β
L‟organisation tridimensionnelle du domaine le plus externe, EC1, de la E-cadhérine
correspond à 7 brins β organisés en 2 feuillets, avec une topographie en « Y » et formant un
sandwich (ou tonneau-β), de dimensions : 45Å x 25 Å x 25 Å (Overduin et al., 1995). Cette
structure, similaire à celle d‟un domaine d‟immunoglobuline, est commune à tous les modules
cadhérine (Boggon et al., 2002). Les premières images de cristallographie ont été obtenues
avec le module EC1 de la N-cadhérine (type I) (Shapiro et al, 1995). Les cristaux présentent 2
interfaces d‟association : i) l‟une impliquant deux molécules orientées de manière parallèle,
avec l‟échange réciproque du premier brin β N-terminal et l‟insertion de la chaîne latérale du
Trp2 dans une poche hydrophobe de la molécule partenaire, ii) l‟autre impliquant deux
molécules orientées de manières antiparallèle. L‟interprétation de ces observations a conduit
18
les auteurs à proposer un premier modèle d‟interaction des cadhérines dit en « fermeture
éclair » (Figure 5), dans lequel les protéines s‟associent d‟abord en dimères parallèles sur la
même surface cellulaire (interaction cis ou « Strand dimer ») puis ces dimères parallèles,
présents sur les surfaces cellulaires voisines s‟associent de manière antiparallèle (interaction
trans).
Figure 5 : Modèles d’interaction des cadhérines proposés à partir d’analyses structurales, (a) du domaine
EC1 de la N-cadhérine (en « fermeture éclair », Shapiro et al., 1995) , puis (b) du fragment EC15 de la C-
cadhérine (Boggon et al., 2002).
Ce modèle a été partiellement modifié par le même groupe après l‟étude structurale de
la totalité du segment EC1-5 de la C-cadhérine (Boggon et al, 2002). L‟interface trans,
d‟abord identifiée comme adhésive dans la première étude structurale (Shapiro et al, 1995),
n‟a plus été retrouvée. Dans cette étude, le module EC1 s‟associe parallèlement au module
EC1 de la molécule partenaire par échange réciproque de brin pour former la surface
adhésive, sans nécessité d‟organisation préalable en dimère parallèle (Figure 5 et Figure 6). Il
est important de souligner que cette interface avait initialement été considérée comme une
interaction entre cis dimères. L‟organisation moléculaire dans ces cristaux ne révèle pas de
dimères parallèles, mais fait apparaître un empilement de monomères en cis présentant une
courbure prononcée et une torsion des différents modules les uns par rapport aux autres. Des
contacts ont été visualisés entre modules EC1 d‟une molécule et EC2-3 d‟une cadhérine
voisine.
L‟ensemble des structures disponibles pour les cadhérines classiques est résumé dans
le Tableau 1. Les cadhérines de type I y sont majoritairement représentées, et toutes les
a b
19
études, à l‟exception de celle de Boggon et al., portent sur les fragments N-terminaux EC1 ou
EC12.
Tableau 1 : Liste des différentes études structurales publiées sur les cadhérines. Les fragments utilisés ont,
pour certains, leur extrémité N-ter modifiée par des acides aminés additionnels, (AA Nter). Certains
cristaux ne permettent pas de visualiser les acides aminés N terminaux, et les longueurs de chaînes
correspondent aux résidus identifiables dans les cristaux. Les surfaces adhésives entre dimères,
lorsqu’elles sont observables, incluent (E) ou non (NE) l’échange de brin .
Comme ceci a déjà été mentionné, chaque module cadhérine est organisé en 2 feuillets
(Figure 5), l‟un des feuillets composé des brins β D, E et B, et l‟autre des brins G, F et C. Le
brin A quant à lui est divisé en 2 segments : A* et A, qui n‟interagissent pas avec le même
feuillet (Posy et al, 2008) (Figure 6). Le segment N-terminal A* possède 3 résidus qui
forment des liaisons hydrogènes avec le brin B du premier feuillet, alors que le segment A
est lié par des liaisons hydrogènes au brin C du second feuillet. Ces 2 segments sont séparés
par 2 ou 3 résidus (dont les Pro 5 et 6) qui connectent les 2 feuillets. Ces 2 ou 3 résidus
peuvent être considérés comme une charnière ; en effet leur changement de conformation lors
de la dimérisation par échange de brins permet et facilite le mouvement du brin A* (Parisini
et al, 2007).
20
Figure 6 : Topologie et architecture des domaines cadhérine. (a) Séquence en acides aminés du module
EC1 de la E-cadhérine et positionnement des brins dans la séquence. (b) Structure en feuillets β d’un
module EC de cadhérine de type I . (c) Détails de l’interface adhésive entre modules EC1 avec échange de
brin β (Parisini et al, 2007). (d) Structure de 2 cadhérines en interaction (Boggon et al, 2002).
Ces segments A et A* ont un rôle primordial dans l‟interface adhésive. En effet pour
les cadhérines classiques de type I, l‟interface adhésive est essentiellement formée par les
résidus intervenant dans cet échange de brin (Boggon et al, 2002; Shapiro et al, 1995). Les 2
modules EC1, en se positionnant de manière parallèle, échangent le brin A* et permettent à la
chaîne latérale du Trp2 de s‟insérer dans la poche hydrophobe de la molécule partenaire
(Figure 6c). Il n‟est donc pas étonnant que des acides aminés supplémentaires à l‟extrémité N-
terminale, souvent présents dans les protéines recombinantes produites dans les bactéries,
puissent perturber l‟interaction adhésive des cadhérines en interférant avec l‟échange de brin
β (Harrison et al, 2005b). De même des mutations (notamment celle du Trp2 en Ala) qui
modifient cette interface perturbent l‟efficacité adhésive de ces protéines (Harrison et al,
2005a; Harrison et al, 2005b; Perret et al, 2002a; Tamura et al, 1998a; Troyanovsky et al,
2003). Enfin, ces éléments structuraux pourraient aussi être essentiels pour la formation de
dimères parallèles en cis, entre molécules insérées dans la même surface cellulaire. En effet il
a été montré, par cross-linking, que la formation de tels dimères impliquait l‟échange de brin
(Troyanovsky et al, 2003).
En résumé, les cadhérines classiques de type I présentent, au niveau de leur domaine EC1,
trois éléments structuraux principaux très conservés, qui contribuent à l‟échange du brin et
à la formation de l‟interface adhésive (Figure 7):
1. un Trp en deuxième position dans la séquence de la protéine fonctionnelle. La
chaine latérale de cet acide aminé s‟insère dans une poche hydrophobe composée des
a)
b) c)
d)
21
résidus Ile24, Tyr36, Ser/Ala78, et Ala80, soit dans la forme monomérique en
intramoléculaire, soit de façon intermoléculaire conduisant à la formation d‟un dimère.
In vivo, la mutation sur la N-cadhérine de ce tryptophane en glycine affecte le
développement de certains organes où cette molécule est présente, tels que la rétine ou
le cœur (Malicki et al, 2003), ce qui confirme l‟importance de cet acide aminé pour la
fonctionnalité adhésive des cadhérines ;
2. une contrainte dans la boucle charnière, du brin A* qui se relaxe lors de la
dimérisation, et favorise ainsi l‟échange de brin β. Cette charnière est plus courte sur
le domaine EC1 que sur les autres domaines, de même que sur les cadhérines
n‟interagissant pas par échange de brin β. Les contraintes intramoléculaires sont
augmentées avec les prolines 5 et 6 très conservées à l‟état monomérique (Parisini et
al, 2007). Lors de l‟échange du brin , la boucle charnière change de conformation et
le dimère est énergétiquement plus stable ;
3. enfin, le résidu Glutamine 89 est très conservé. La chaine latérale de cet aminoacide
forme un pont salin avec le résidu chargé N-terminal ; ce pont salin participe
pleinement à l‟interface adhésive. Le rajout d‟acides aminés en N-ter ou la mutation
de Glu89 qui empêchent la formation de ce pont salin perturbent l‟interaction entre
cadhérines.
Ces 3 éléments structuraux se retrouvent aussi chez les cadhérines de type II et
desmosomales. L‟échange de brin β, observé aussi dans les cristaux de cadhérines de type II,
pourrait donc être un mode d‟interaction commun à différentes familles de cadhérines.
Figure 7 : Alignements de séquences de cadhérines de type I. Les acides aminés surlignés participent à
l’échange de brin β ; en jaune le site HAV très conservé ; en rose, les acides aminés formant le motif
cadhérine.
Une belle étude de bioinformatique publiée récemment par le groupe de B. Honig a
examiné les éléments de séquence et de structure communs aux modules EC de cadhérines
22
(Posy et al, 2008). L‟alignement de séquences des modules EC1 à EC5 des cadhérines de type
I et de type II disponibles dans les bases de données a permis d‟identifier 14 acides aminés
conservés, outre ceux des motifs cadhérines, dont 13 sont hydrophobes. 11 de ces résidus
hydrophobes sont particulièrement conservés, dans plus de 70% des séquences étudiées. En se
basant sur leur localisation sur les brins β, ces positions ont été étiquetées A*2, B6, C1, C3,
D1, D3, F2, F4, F6, F8, G5 et G7. Les 2 acides aminés conservés restants, A8 et C5, ne sont
retrouvés que dans 50% des séquences étudiées. Toutes les chaines latérales de ces résidus
hydrophobes sont orientées vers l‟intérieur de leur module EC, et ainsi non exposées au
solvant. Le seul acide aminé polaire conservé est en position A8 dans la boucle AB (Figure
8), qui appartient à la jonction entre modules consécutifs et aux 4 sites de liaison au calcium.
Cependant, cette Glu est aussi présente sur le module EC5, même s‟il ne fixe pas le calcium.
Les résidus hydrophobes conservés s‟organisent en un réseau de contacts qui forment
des noyaux hydrophobes à l‟intérieur des modules cadhérines. Ces noyaux hydrophobes
délimitent 2 groupes indépendants qui séparent le module EC en 2, séparés par un pont
formés des résidus G5 et C5. Le premier noyau hydrophobe (A*2, B6, D3, C1, C3, F6 et F8)
est retrouvé dans plus de 70% des séquences, alors que les 5 résidus du deuxième noyau (D1,
F2, F4, et G7) forment des contacts très conservés. Il est intéressant de remarquer que la
plupart de ces contacts sont présents à l‟interface entre les 2 feuillets β qui composent le
module cadhérine, et sont très proches de ceux retrouvés dans les domaines
immunoglobulines.
L‟ensemble des structures disponibles pour les cadhérines a aussi été analysé. Les
auteurs ont montré que les modules EC se superposent à 3 Å près, voire 2 Å si l‟on ne
considère uniquement les éléments des feuillets β. De plus, ces structures révèlent que les
modules correspondants de 2 familles différentes sont plus similaires entre eux que les
modules différents de la même famille c'est-à-dire que les modules EC1 des cadhérines de
type I et de type II se superposent mieux que les modules EC1 et EC2 des cadhérines de
type I.
23
Figure 8 : Alignements de séquences et de structures des modules EC1 à EC5 des cadhérines de type I et
II. (a) Alignement de séquences des modules EC1 à EC5 des cadhérines de type I et type II. Les résidus
conservés sont surlignés, avec en vert les résidus du premier noyau hydrophobe et en rouge ceux du
deuxième noyau hydrophobe. Les deux résidus formant le pont entre les noyaux sont surlignés en orange.
(b) Les residus conservés sur la structure du module EC2 de la C-cadherine (PDB 1L3W) sont montrés en
representation « stick » et colorés comme en (a). (c) Alignement de structure des modules EC1 à EC4.
L’alignement inclut le module de E-cadhérine EC1 (PDB 1O6S), N-cadhérine EC2 (1NCJ), E-cadhérine
EC2 (2O72), C-cadhérine EC2 (1L3W), cadhérine-11 EC2 (2A4E), cadhérine-8 EC2 (2A62), C-cadhérine
EC3 (1L3W), cadhérine-8 EC3 (2A62), C-cadhérine EC4 (1L3W) (voir Tableau 1 pour références). Le
ségments A*, la boucle charnière et le segment A sont colorés (Les segments A* et A du domaine EC1 sont
en rose et la boucle charnière en rouge ; Les segments A* et A des modules EC2 à EC4 sont en bleu et la
boucle charnière en cyan). Pour plus de clareté, le domaine EC5 de la C-cadhérine a été exclu ; son brin A
a une orientation légèrement différente.
Ces alignements de séquences et de structures permettent de définir des éléments
structuraux présents uniquement sur les modules EC1 et qui confèrent à ce module la
propriété particulière d‟échange de brin β, et indispensable pour l‟activité adhésive. Le Trp2,
que l‟on retrouve sur tous les domaines EC1 des cadhérines classiques, est remplacé sur les
autres modules EC par un autre résidu hydrophobe sur cette position 2 (généralement une
Phe). La poche hydrophobe dans laquelle s‟insère la chaine latérale du Trp2 est retrouvée sur
les modules EC2-5 et est en partie composée de l‟un des noyaux hydrophobes décrits
24
précédemment avec les résidus B6, C3, F6 et F8. La longueur de la boucle charnière entre
les segments A* et A est, sur les modules EC1, plus courte de 2 acides aminés que sur les
autres modules (Figure 8b). La conséquence d‟un brin A plus long sur les domaines EC2-5 est
que la boucle charnière est placée plus haut sur la structure de ces domaines, et qu‟elle forme
un renflement (Figure 8c). Il est probable que le rétrécissement de cette boucle sur domaine
EC1 induise des tensions qui déstabiliseraient la forme monomérique, en plus des tensions
créées par les Pro5 et 6. Les modules EC2-5 ont une Pro2 conservée, et absente du module
EC1. Cette Pro2 inhibe l‟échange de brin . Dans les domaines EC2-5, les résidus des brins B
et G forment une poche dans laquelle s‟insère la Pro2, qui permet l‟ancrage des segments A*
et A au reste du module. Cette « ancre Pro » est remplacée par la Val88 de la boucle FG dans
les modules EC1. Le résidu Glu89 est très conservé sur les domaines EC1 et absent sur les
autres. Comme déjà mentionné, la chaine latérale forme un pont salin avec l‟acide aminé
chargé de l‟extrémité N-terminale, qui fait partie de l‟échange de domaine. La mutation de
Glu89 par une Ala ou l‟allongement de l‟extrémité N-terminale interfèrent avec l‟adhésion
(Harrison et al, 2005b).
b. Modification de conformation lors de l’interaction : le Domain Swapping
Les informations que nous venons de synthétiser sur la structure des cadhérines sont
extrêmement utiles pour la compréhension de leurs propriétés fonctionnelles. En effet, ces
protéines participent à la transmission de signaux au niveau inter et intracellulaire. La
connaissance de ces voies de communication a été incrémentée ces dernières années grâce à
l‟apport de la génétique et de la biochimie avec la cartographie des interactions à l‟échelle du
protéome. Cependant, notre compréhension est souvent très limitée pour ce qui concerne la
façon dont les signaux sont transmis d‟un composant à l‟autre au sein d‟une voie de
signalisation. Il est de plus en plus évident que cette signalisation repose sur les propriétés
dynamiques intrinsèques des protéines qui transmettent des signaux par basculement d‟un état
d‟énergie à un autre en réponse à différents stimuli. La structure native, repliée, d‟une
protéine déterminée par sa structure primaire est souvent considérée comme correspondant à
son état d‟énergie le plus faible. Le repliement tridimensionnel de la protéine est contraint par
la compétition entre forces entropiques (coût énergétique pour la maintenir repliée) et
enthalpiques (interactions favorables formées favorisant ce repliement). Ces forces
déterminent les mouvements intrinsèques de la protéine. Les différents états que peut adopter
la protéine peuvent être décrits par son « paysage énergétique ». Les états de conformations
de la protéine sont peuplés en fonction de ses états d‟énergie, et le passage d‟un état
25
énergétique à l‟autre est gouverné par la hauteur des barrières d‟énergie qui les séparent
(Smock & Gierasch, 2009).
Figure 9: Les paysages énergétiques peuvent, par leurs modifications, changer les propriétés intrinsèques
d’une protéine. (a) Illustration shématique d’un paysage énergétique d’une protéine, représentant les
énergies hautes en rouge, et basses en bleu. La région délimitée représente les états conformationnels
accessibles énergétiquement, qui pourront être testés dans les conditions physiologiques, aux fluctuations
thermiques près. (b) Une des façons pour un signal de remodeler le paysage énergétique est de rétrécir la
taille de l’ensemble des états à un seul puits d’énergie.. Ceci réduit la dynamqiue intrinsèque de la
protéine, amenant à la rigidification structurale de la même conformation. (c) Une protéine peut exister
en équilibre entre 2 états conformationnels différents. Des signaux extérieurs peuvent redistribuer
l’occupation relative de chacun des états. (d) Une légère modification de (c) peut survenir si, en absence de
ligand, le niveau d’énergie le plus élevé conduit par une voie parallèle avec mofification du profil à la
conformation induite par le signal (d’après Smock et Gierasch, 2009).
La topographie du paysage énergétique est modulée par l‟interaction de la protéine
avec d‟autres protéines, des peptides ou des ligands plus petits, mais aussi par des
modifications covalentes, comme la phosphorylation de certains acides aminés. L‟étude des
images statiques de la protéine, comme les celles issues de cristallographie par rayon X, sont
un bon point de départ pour sonder l‟ensemble des états de la protéine. Par exemple, la
fixation ou le relargage de l‟oxygène par l‟hémoglobine requiert un changement de
conformation, qui a été immédiatement reconnu par les biophysiciens dès qu‟ils ont étudié sa
structure (Perutz & Mathews, 1966).
+ signal
+ signal
+ signal
a)
b)
c)
d)
26
L‟oligomérisation des protéines induit un changement dans le paysage énergétique des
protéines. Plusieurs mécanismes d‟assemblage des protéines sont décrits dans la littérature,
parmi lesquels l‟empilement de structures « beta-plissées » comme pour les fibrilles
d‟amyloïde, d‟empilement « tête à queue » retrouvée dans l‟oligomérisation de l‟actine, ou le
domain swapping comme pour les cadhérines.
Le terme domain swapping a été utilisé la première fois par Bennett et al. pour décrire
la structure dimérique de la toxine diphtérique (Bennett et al, 1994b). Cependant, le concept
d‟échange de domaine a été décrit pour la première fois il y a plus de 40 ans avec la
description de la dimérisation de la ribonucléase pancréatique de bœuf (Crestfield et al, 1962).
Le domain swapping décrit un mécanisme d‟oligomérisation dans lequel 2 ou
plusieurs chaînes polypeptidiques échangent des éléments structuraux identiques. Si cet
échange est réciproque entre 2 monomères, il y a formation d‟un dimère. Mais le nombre de
chaînes polypeptidiques échangées peut être supérieur à 2 et conduire à la formation
d„oligomères. La description plus complète des éléments du domain swapping fait
intervenir (Figure 10) :
1. le domaine échangé : il peut référer à différents unités structurales, comme des brins
β, des hélices et des structures au repliement plus complexe. En principe, le domaine
échangé peut se trouver n‟importe où dans la séquence, mais il est le plus souvent
retrouvé aux extrémités N- ou C-terminales des chaînes polypeptidiques. Dans de
rares cas comme celui de la cyanovirine-N, la moitié de la structure peut être
impliquée (Barrientos et al, 2002). Les sous-unités échangées sont identiques ; elles ne
possèdent pas de différences dans leur conformation. Elles ont aussi un environnement
semblable dans les 2 conformations monomérique ou dimérique ;
2. la boucle charnière : c‟est un segment de la chaîne polypeptidique qui lie le domaine
échangé au reste de la protéine. Elle a une conformation différente entre la forme
monomérique et dimérique ;
3. l’interface C (closed) : qui correspond à l‟interface entre le domaine échangé et le
reste de la protéine ; on la retrouve à la fois dans les formes monomériques et
dimériques ;
4. le dimère domain-swapped : un dimère avec une interface C entre 2 monomères
« ouverts » est un dimère domain-swapped ;
27
5. l’interface O (open) : elle se trouve entre le domaine échangé et le reste protéine
partenaire ; elle n‟est présente que dans la forme oligomérique et pas dans la forme
monomérique.
La recherche des signaux moléculaires qui pourraient être à l‟origine du domain swapping
s‟est surtout focalisée sur la boucle charnière. En effet, c‟est la seule partie qui possède une
conformation différente entre l‟état monomérique et l‟état oligomérique avec domaines
échangés. Dans plusieurs structures, on retrouve des prolines dans cette boucle (Bergdoll et al,
1998; Boggon et al, 2002; Rousseau et al, 2001). Rousseau et al. ont suggéré que ces prolines
créent une contrainte dans la boucle et ainsi influencent l‟échange de domaines. En effet, la
mutation d‟une proline en alanine stabilise la forme monomérique de la protéine p13suc1,
alors que la mutation d‟une 2ème
proline stabilise la forme dimérique. Cette boucle jouerait
donc le rôle de ressort moléculaire, et la tension serait relâchée lors de la formation du dimère.
De même, l‟ajout d‟une proline chez la cyanovirine-N (Barrientos et al, 2002) ou le
raccourcissement de la boucle pour l‟inhibiteur de la chymotrypsine (Chen et al, 1999)
peuvent aussi influer sur l‟équilibre monomère-dimère en favorisant l‟échange de domaine.
Figure 10 : Définitions des éléments de l’échange de domaine.
Mais la modification de la boucle charnière n‟est pas la seule modification susceptible
d‟influencer l‟échange de domaine. L‟étude de la toxine diphtérique révèle que cette protéine,
qui dimérise par échange de domaine à pH 4, ne forme pas de dimères à pH neutre, suggérant
qu‟une haute barrière énergétique doive être franchie pour conduire à la dimérisation. Il faut
donc apporter de l‟énergie pour déstabiliser l‟interface primaire du monomère. En effet, à
faible pH, les ponts salins qui stabilisent cette interface sont détruits, favorisant ainsi
l‟ouverture du monomère (Bennett et al, 1994a). Les interactions nouvellement créées sur
l‟interface O stabilisent la forme dimérique et abaissent ainsi l‟énergie libre de dimérisation.
Boucle charnière
Monomères « fermés »
Dimères avec échange de
domaines
Monomères
« ouverts »,
formants le
dimère domain-
swapped
Interface C Interface O
+
28
Les auteurs ont donc proposé un modèle énergétique où, par diminution de pH, l‟abaissement
des énergies d‟activation favorise la dimérisation (Figure 11).
Figure 11 : Relations entre énergies libres des dimères de la toxine diphtérique par échange de domaines,
et de leurs monomères (Bennett et al, 1994a).
Ce schéma, caractéristique de l‟échange de domaine, n‟est pas sans rappeler celui proposé
par Chen et al. pour l‟interaction des cadhérines et que nous aborderons plus loin (Figure 20).
Dans ce cas précis, la variation de pH influe sur les énergies libres, facilitant la dimérisation.
Plus généralement, 3 facteurs peuvent affecter les différences d‟énergie libre entre le
monomère et le dimère :
1. une entropie plus grande pour le monomère, qui favorise thermodynamiquement
l‟ouverture de son interface ;
2. la flexibilité de la boucle charnière qui positionne de nouvelles interactions après
l‟échange de domaine. Le changement de conformation de cette boucle peut aussi
contribuer aux différences d‟énergie libre ;
3. La nature de l‟interface O, nouvellement créée par l‟échange de domaine et qui
n‟existe pas dans la forme monomérique. Ces nouvelles interactions peuvent favoriser
la formation du dimère.
Ainsi, in vitro, l‟échange de domaine peut être dû aux conditions de préparation des
échantillons en modifiant les 3 critères précités. Par exemple, la protéine
Barnase (ribonucléase bactérienne) dimérise par échange de domaines à pH 4,5, mais pas dans
les conditions physiologiques (Zegers et al, 1999). D‟autre exemples comme Spo0A, les
29
récepteurs Trk ou encore les récepteurs neutrophin (Lewis et al, 2000; Ultsch et al, 1999;
Urfer et al, 1995) montrent que l‟échange de domaines peut être la cause d‟artefacts dus à la
préparation des échantillons. Une attention toute particulière doit donc être prise quant à
l‟interprétation des résultats, et notamment en prenant en compte les conditions
expérimentales d‟obtention d‟échange de domaine.
Il est intéressant de remarquer que ces caractéristiques structurales sont retrouvées dans
l‟échange du brin β des cadhérines de type I. Les interfaces primaires monomérique et
dimérique sont quasiment identiques. Nous avons déjà vu que leur boucle charnière possède 2
prolines très conservées par l‟ensemble des cadhérines de type I (Pro5 et 6) et que la
modification de leur surface d‟interaction favorise la forme monomérique (Harrison et al,
2005b; Prakasam et al, 2006a). En revanche, il faut souligner que les cadhérines de type II
n‟ont pas de prolines dans leur boucle charnière, qu‟une interface O nouvelle non présente
dans la forme monomérique est crée par la formation du dimère. Les 2 études structurales qui
décrivent l‟interface d‟interaction entre cadhérines de type II montrent un échange de brin β
(Miloushev et al, 2008; Patel et al, 2006) mais les conditions expérimentales ne respectent pas
les conditions physiologiques de pH ou de salinité. D‟autres études sont donc à mener pour
confirmer ou infirmer l‟interaction par échange de brin β des cadhérines de type II.
c. Implication des modules EC dans l’interaction cadhérine
Les études de structures décrites précédemment mettent l‟accent sur l‟importance du
module EC1 et l‟échange du premier brin β dans l‟interaction cadhérine.
Les premières données cinétiques ont été obtenues sur la E-cadhérine par la méthode
de chambre à flux laminaire (Figure 12). Des billes recouvertes des 2 premiers modules EC1-
2 (E/EC12) sont injectées dans la chambre sous un flux constant et contrôlé, et peuvent
interagir avec les cadhérines fixées sur le fond de la chambre. Les variations du flux
permettent de moduler la force appliquée sur la bille, et donc la contrainte mécanique
appliquée sur l‟interaction. La durée de vie courte de ces interactions, de l‟ordre de 2s à force
nulle, permet de rendre compte des fonctions de haute sélectivité et de plasticité des
interactions entre les cadhérines (Perret et al, 2002a).
Ces résultats ont ensuite été confirmés par d‟autres approches, par RMN (Haussinger
et al, 2004), AFM (du Roure et al., 2006) ou très récemment par résonance de plasmons de
surface (Katsamba et al, 2009). En RMN, des conformations différentes sont observées pour
le monomère avec ou sans Ca2+
, ou le dimère dont la formation nécessite la complexation du
30
Ca2+
. La liaison du Ca2+
entre les modules EC1 et EC2 déplace l‟équilibre vers l‟état
dimérique ; la constante de dissociation à l‟équilibre KD du fragment E/EC12 varie de 10mM
en absence de Ca2+
à 0.7mM en présence de Ca2+
. La constante d‟association Kon caractérisant
la formation du dimère en solution (~104M
-1s
-1) est plusieurs ordres de grandeurs inférieure à
celle d‟un processus limité par la diffusion (~108M
-1s
-1), indiquant que la dimérisation est très
limitée par une barrière d‟activation (Haussinger et al, 2004). Ainsi, ces données suggèrent
que la cohésion cellulaire serait assurée par des molécules aux faibles affinités d‟interaction,
ce qui peut sembler surprenant.
Figure 12 : Schéma de la chambre à flux laminaire (a) ; les billes sont soumises à un gradient de vitesse
contrôlé, qui permet de corréler la tension T qui leur est appliquée à la vitesse V (b). Les protéines sont
fixées par 2 couches d’Ig sur la bille et par affinité au nickel Ni2+
sur le mica via leur motif C-terminal
hexa-histidine (c). Cette technique a permis la première caractérisation dynamique du fragment EC12 de
la E-cadhérine (d) (Perret et al, 2002a).
Les travaux pionniers du groupe de D. Leckband ont révélé par Surface Force
Apparatus (ou SFA) que les différents modules pouvaient établir des interactions multiples,
comme nous le verrons plus loin. Les modules EC2 et EC3 sont aussi impliqués,
respectivement en favorisant la fixation du calcium et en permettant l‟interaction cis (Boggon
et al, 2002; Haussinger et al, 2004).
L‟implication directe des modules profonds (EC4-5) dans les contacts adhésifs n‟ont
pas été confirmés par les études structurales, puisque dans l‟état actuel des connaissances,
seuls les modules EC1-3 ont été visualisés en interaction (Boggon et al, 2002). Différentes
questions restent posées pour savoir quelle est la part des différents modules dans la
a)
b) c)
d)
31
fonctionnalité des cadhérines : est-ce que ces modules profonds maintiennent les modules
EC1-3 à bonne distance de la membrane avec laquelle ils pourraient interagir de manière non
spécifique, et pour optimiser l‟accessibilité et la formation des interactions adhésives ? Sont-
ils tous directement impliqués dans le processus adhésif dans certaines conditions
physiologiques ?
L‟utilisation des fragments de C-cadhérine dans des expériences de SFA montre que
des contacts adhésifs multiples existent le long du domaine extracellulaire (Sivasankar et al,
1999). Cette approche permet de mesurer simultanément la distance entre deux surfaces et la
force requise pour séparer les fragments en interaction. Trois décrochages successifs sont
observés lors de la séparation du fragment EC1-5 de la C-cadhérine, ce qui a été interprété
comme reflétant des interactions multiples entre les différents modules EC.
Figure 13 : La technique de BFP a permis d’établir le spectre de force dynamique et de caractériser 4
interactions différentes entre fragments E/EC15 (Perret et al, 2004), tandis que la SFA met en évidence le
rôle du module EC3 (Zhu et al, 2003) dans les contacts adhésifs entre fragments EC1-5 des cadhérines.
La technique de Biomembrane Force Probe (BFP) développée par E. Evans (Merkel et
al, 1999) a permis de sonder l‟influence des modules plus profonds sur la dynamique (Perret
et al, 2004). Ces travaux ont confirmé la présence d‟interactions multiples révélées par D.
Leckband et mis en évidence une hiérarchie de résistance au stress mécanique le long du
fragment extracellulaire de la E-cadhérine et 4 interactions ont été caractérisées: les modules
EC1-2 établissent des interactions labiles de 0,1s et 1s, tandis que les modules plus profonds
permettent des interactions beaucoup plus stables de 102s et 10
5s (Figure 13). Les modules
EC1-2 sembleraient donc être impliqués dans la reconnaissance et la spécificité des
interactions ; ce résultat confirma donc ceux obtenus par la méthode de chambre à flux
laminaire. Les modules plus profonds EC3-5 participeraient au renforcement et à la stabilité
des interactions. Ces propriétés ont ensuite été confirmées par cette même technique sur la C-
32
cadhérine (Bayas et al, 2006). Des données obtenues par SFA mettent en évidence un rôle très
important du module EC3 dans ce renforcement (Zhu et al, 2003). En effet, la délétion de ce
module empêche les cadhérines recombinantes ainsi modifiées de former les interactions
longues et stables (Figure 13).
Une étude réalisée dans le groupe de B. Gumbiner permet de replacer ces résultats
dans le contexte cellulaire (Chappuis-Flament et al, 2001). Les auteurs ont fonctionnalisé des
surfaces avec différents fragments recombinants d‟ectodomaines de C-cadhérines (Figure
14a), où certains modules EC ont été supprimés ou substitués. Des cellules CHO exprimant la
C-cadhérine ont ensuite été mises en contact avec ces surfaces pour en tester les propriétés.
L‟efficacité adhésive est évaluée par la résistance au détachement des cellules ensemencées
sur les surfaces recouvertes de diverses protéines recombinantes (Figure 14b-c). En accord
avec les données obtenues par BFP, ces expériences mettent en évidence 2 types d‟adhésion
conduisant à : i) une faible résistance au stress mécanique sur les surfaces recouvertes de
fragments EC12 ; ii) une plus forte résistance lorsque les modules plus profonds EC35 sont
présents. L‟importance du module EC3 déjà révélée par D. Leckband par SFA semble
confirmée (Figure 14b). Néanmoins l‟implication des modules EC4 et EC5 reste à éclaircir.
Figure 14 : Evaluation de la participation des différents modules de C-cadhérine dans l’efficacité adhésive
3. Les cadhérines classiques de type II
Comme nous l‟avons évoqué précédemment, les cadhérines de type I et II présentent
de fortes homologies de séquences. Cependant il a fallu attendre 2006 pour que les premières
images structurales de cadhérines de type II soient disponibles (les cadhérines-8, -11 et MN-,
a)
b)
33
tableau 1) (Patel et al, 2006). Les domaines EC des cadhérines de type II ont une structure
globale très proche de celles de type I, à savoir un repliement en 7 brins β organisés en 2
feuillets (domaines Ig-like). Dans cette étude, les auteurs ont observé que l‟échange de brin β
ici inclut les chaînes latérales des Trp2 et 4, conservés chez les cadhérines de type II, et
insérées dans une large poche hydrophobe de la molécule partenaire (Figure 15). Les auteurs
retrouvent un pont salin entre Glu 87 et l‟extrémité N-ter, ainsi que la fixation de 3 ions Ca2+
entre 2 modules EC consécutifs. Il faut cependant noter que les cadherines de type II ne
possèdent pas le motif (Pro5-Pro6) qui favorise la dimérisation des cadhérines de type I.
Les données structurales attribuent une surface adhésive de ~1600 Å pour les
cadhérines de type I (Parisini et al, 2007), et de 2700-3300 Å pour les cadhérines de type II
(Patel et al, 2006). Une surface d‟interaction plus étendue suggère que les cadhérines de type
II forment des interactions beaucoup plus fortes que les cadhérines de type I. Ceci est difficile
à corréler avec le phénotype des cellules qui expriment ces 2 types de cadhérines. En effet par
exemple, la E-cadhérine (de type I) est exprimée à la surface de la plupart des épithéliums, et
forme des interactions très stables et cohésives alors que la cadhérine-11 (type II) est surtout
présente sur des cellules de phénotype mésenchymateux, dans des contextes de plasticité
cellulaire, de migration pendant le développement et la progression tumorale. Des expériences
utilisant des micropipettes ont permis de mesurer les forces d‟adhésion à l‟échelle cellulaire
de l‟ordre de 100 pN pour les E- et N-cadherines (type I) et plus faibles, ~10 pN pour les
cadhérines-11 et -7 (typeII) (Chu et al, 2006). Il apparaît donc que le mode d‟interaction des
cadhérines de type II reste encore mal compris, et nécessite d‟être documenté.
Figure 15 : Interface adhésive entre modules 11/EC1 en interaction, avec échange du brin β A*. Les
Tryptophanes (Trp2 et 4) sont représentés en rouge ; sur la zone d’interaction hydrophobe les chaînes
latérales de la phénylalanine 8 (F8) et et l’Isoleucine 10 (I10) sont mises en évidence sur le brin A.
Récemment, B. Honig et L. Shapiro ont complété ces études structurales de
cristallographie en RX par l‟étude en RMN du domaine EC1 d‟une cadhérine de type II, la
cadhérine-8 (Miloushev et al, 2008). La constante d‟équilibre monomère-dimère KD de cette
34
interaction est de 0.84 mM en absence de calcium, et 0.11mM en présence de 15 mM Ca2+
.
Plus précisément, les auteurs distinguent 2 types d‟association possibles : i) un mécanisme
inducted-fit, et ii) un mécanisme selected-fit (Figure 16) :
Figure 16 : Deux mécanismes différents sont décrits pour obtenir le dimère de cadhérine de type II
(Miloushev et al, 2008) : une voie inducted fit (bas) où les monomères s’associent sans activation
préalable ; une voie selected fit où les monomères doivent exposer leur brin β avant de pouvoir s’associer
(haut).
Dans le mécanisme selected-fit, la collision entre molécules actives avec leurs brins β
Nter exposés donnent lieu à la formation de dimères ; dans le mécanisme inducted-fit, 2
molécules avec les brins β en conformation intramoléculaire forment un complexe initial,
puis dans un deuxième temps les brins β s‟échangent pour finalement former le dimère
adhésif. Même si la détermination des énergies d‟activation obtenues par RMN sur le module
EC1 est en faveur d‟un mécanisme selected-fit pour la formation des dimères, des études
complémentaires sont à prendre en compte. En effet, nous l‟avons vu plus haut, des
différences notables existent entre cadhérines de type I et II au niveau de l‟échange de brin .
De plus, le fragment extracellulaire complet EC15 peut se comporter de manière différente,
car la poche de fixation de calcium sur le module isolé EC1 est incomplète. Cette poche
calcium est en effet essentielle à l‟interaction des cadhérines de type I (Harrison et al, 2005a;
Prakasam et al, 2006a). Les études dynamiques devraient aussi nous renseigner sur le rôle des
acides aminés clés de l‟interaction des cadhérines de type II, et sur l‟importance relative de
l‟échange du brin β par rapport à la zone d‟interaction hydrophobe, dans les conditions plus
proches de la physiologie (voir l‟article 2 de ce travail de thèse).
4. Les cadhérines desmosomales
Il existe deux types de cadhérines desmosomales : les desmocollines et les
desmogléines (Marcozzi et al, 1998). Les cadhérines desmosomales, bien que proches des
cadhérines classiques par leur séquence et leur structure (PDB 2YQG), forment une famille
distincte. Ces molécules ont la même architecture que les cadhérines classiques : leurs
segments extracellulaires avec 5 domaines présentent 30 à 35% d‟identité de séquence et le
35
5ème
domaine est le moins bien conservé (Patel et al, 2003b). Leur segment cytoplasmique,
bien que relativement divergent, possède un domaine de liaison à la plakoglobine. Celle-ci
interagit avec la desmoplakine qui elle-même s‟associe aux filaments intermédiaires (Figure
3). A l‟heure actuelle, 3 desmocollines et 4 desmogléines ont été identifiées. Ces cadhérines
s‟organisent en hétérodimères, c‟est-à-dire qu‟une desmogléine s‟associe avec une
desmocolline en cis (Chitaev & Troyanovsky, 1997). De tels dimères, à la surface de deux
cellules adjacentes, interagissent ensuite en trans pour participer la structuration des structures
jonctionnelles appelées desmosomes. L‟adhésion cellulaire forte des desmosomes viendrait
d‟interactions hétérophiles entre ces 2 différentes cadhérines, et de leur ancrage aux filaments
de cytokératine au niveau de leur plaque intracytoplasmique.
Figure 17 : Organisation des cadhérines au sein des desmosomes. (a)Hypothèse pour la perte d’adhésivité
des desmosomes au cours de la réparation tissulaire (Garrod et al, 2005). [A] Dans l’épiderme normal, la
PKC diffuse librement, les desmosomes sont structurés et leur organisation est indépendante du calcium.
[B] Après blessure, les PKC s’associent à la plaque desmosomale. [C-D] Les éléments de la plaque
desmosomale sont phosphorylés par la PKC. [E] Un signal transmembranire désorganise les cadhérines
desmosomales ; l’adhésion devient dépendante du calcium. [F] Finalement, le desmosome est internalisé.
(b) Images obtenues sur des échantillons déshydratés par tomographie des desmosomes et révélant des
cadhérines désorganisées (He et al, 2003) et (c) échantillons vitrifiés et montrant des arrangements
moléculaires ordonnés (Al-Amoudi et al, 2007).
Malgré les homologies de structure entre cadhérines classiques et desmosomales, les
jonctions adhérentes et les desmosomes sont aisément identifiables morphologiquement en
microscopie électronique à transmission, par leur espacement intermembranaire et la densité
(a)
(b)
(c)
36
de la plaque cytoplasmique (Farquhar & Palade, 1963; Miyaguchi, 2000). Les jonctions
adhérentes, où sont présentes les cadhérines classiques, ont un espace intercellulaire de 25 nm
et sont relativement peu organisées. L‟espace intercellulaire au niveau des desmosomes est
plutôt de l‟ordre de 30 nm, avec une ligne dense aux électrons au milieu de l‟espace
intercellulaire (Al-Amoudi et al, 2007; Farquhar & Palade, 1963). Cette ligne pourrait être
indicative d‟un arrangement très organisé des domaines extracellulaires des cadhérines
desmosomales dans ces structures.
Ces différences morphologiques entre desmosomes et jonctions adhérentes pourraient
être explicables en partie par une flexibilité différente des domaines extracellulaires des
cadhérines qui les constituent. De plus, les cadhérines desmosomales présentent des
comportements distincts vis-à-vis du calcium et réalisent 2 types d‟adhésion : i) une adhésion
indépendante du calcium, dite « hyper-adhésive » et caractérisée par une organisation quasi
cristalline (Garrod et al, 2005) ; ii) une adhésion dépendante du calcium, caractérisée en partie
par la perte de la ligne dense au milieu de l‟espace intercellulaire, et se rapprochant davantage
des jonctions adhérentes par leur morphologie en microscopie électronique (Wallis et al,
2000).
La structure classique des desmosomes est observée dans les tissus au repos. Dans
certaines situations physiologiques, en particulier lors de processus de remodelage tissulaire
après blessure, il y a par recrutement de Protéine Kinase C (PKCau niveau de la plaque
desmosomale, phosphorylation de constituants de cette plaque. Un signal transmembranaire
est généré et suivi d‟une modification de l‟organisation du desmosome qui devient sensible au
calcium (Garrod and Kimura, 2008) (Figure 17a). Ces observations, qui peuvent paraître
contre-intuitives, présentent l‟intérêt de révéler différents niveaux d‟organisations
macromoléculaires de ces plaques adhésives, généralement considérées comme très figées,
très stables, de même que leur plasticité et leur adaptation aux conditions physiologiques.
Si les jonctions intercellulaires sont bien caractérisées en microscopie électronique
conventionnelle, seules 2 études par tomographie sont actuellement disponibles et portent sur
l‟organisation spatiale des cadhérines dans les desmosomes. La difficulté vient très
probablement de la plasticité de ces plaques adhésives, même si elles apparaissent très
structurées. La première étude, obtenue sur des échantillons tissulaires déshydratés, confirme
que le module EC1 est le principal module impliqué dans l‟interface adhésive (He et al,
2003). En effet la modélisation de la structure cristalline du domaine extracellulaire de la C-
cadhérine dans la cartographie tomographique a révélé des interactions stochastiques entre les
cadhérines, avec 3 arrangements principaux des segments extracellulaires qui ressemblent aux
37
lettres W, S et λ, où les molécules interagissent par leur domaine N-terminaux (Figure 17a).
Ces interactions moléculaires suggèrent une grande flexibilité des dimères. Une étude plus
récente, réalisée sur des échantillons vitrifiés, révèle quant à elle un arrangement moléculaire
périodique dans les desmosomes (Al-Amoudi et al, 2007) (Figure 17b). Les cadhérines y sont
organisées en intervalles de ~7nm le long de la ligne dense intercellulaire, présentent une
forme courbée proche de la structure cristalline de la C-cadhérine (Boggon et al, 2002), mais
surtout on y distingue des dimères cis et trans évoquant ceux déjà décrits dans la littérature
dans le modèle de « fermeture éclair » (Shapiro et al, 1995). Il faut cependant garder à l‟esprit
que les modes d‟interaction cis et trans des cadhérines ne sont pas encore complètement
élucidés et restent ouverts à débats. Une différence essentielle entre ces 2 études est la
méthode de préparation des échantillons. La déshydratation pourrait être à l‟origine de la
désorganisation des desmosomes observée par He et al. (par la méthode de freeze-
substitution). En revanche, la seconde approche, utilisant la vitrification des structures par
refroidissement rapide, préserverait mieux les structures natives des échafaudages
moléculaires.
La visualisation des desmosomes par tomographie offre une formidable perspective
pour la compréhension du fonctionnement des cadhérines classiques au niveau des jonctions
adhérentes, tant la similitude entre les cadhérines classiques et desmosomales est grande.
Cependant l‟organisation des cadhérines classiques n‟a jamais été observée par tomographie
dans le contexte cellulaire malgré les tentatives infructueuses pour l‟instant d‟imager les
jonctions adhérentes (Frangakis, communication personnelle). Cette analyse est très
probablement rendue difficile par les propriétés intrinsèques différentes dues à la composition
biochimique et aux comportements dynamiques de ces jonctions. En effet, les jonctions
adhérentes apparaissent moins organisées que les desmosomes ; par ailleurs, les desmosomes
sont principalement présents dans des tissus soumis à des contraintes mécaniques
(épithéliums, et muscle cardiaque) et sont impliqués dans diverses pathologies cutanées. Ces
disparités d‟observations entre les travaux de He et al. et ceux de Al-Amoudi et al. sont peut-
être aussi le reflet de différents états d‟organisation de ces structures et de leurs adaptations
aux conditions physiologiques.
5. La T-cadhérine
La T-cadhérine est une cadhérine atypique. En effet, alors qu‟elle possède la structure
extracellulaire générale des cadhérines classiques (5 modules EC), elle n‟a ni domaine
transmembranaire, ni domaine intracellulaire et est insérée à la membrane plasmique par une
38
ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI) (Ranscht & Dours-Zimmermann, 1991) (Figure 4).
Le domaine EC1 de la T-cadhérine présente ~38% d‟homologie avec celui de la E-cadhérine,
et 30% avec les domaines EC1 des autres cadhérines classiques (Dames et al, 2008; Ranscht
& Dours-Zimmermann, 1991). Elle conserve les sites de fixation au calcium entre ses
modules EC. Cependant, la T-cadhérine ne possède ni Trp2 (remplacé par une Ile en position
2) ni séquence HAV (très conservée chez les cadhérines classiques). Ces différences
structurales laissent penser que la T-cadhérine n‟interagit pas par échange de brin comme
c‟est le cas pour les cadhérines classiques. Cette hypothèse a été renforcée récemment par
l‟étude RMN de son domaine EC1 (Dames et al, 2008). La T-cadhérine semblerait interagir
en formant d‟une interface en X (résultats non publiés, voir (Posy et al, 2008)), analogue aux
structures observées avec des fragments de E-cadhérine présentant des extrémités N-ter
modifiées par Nagar & al. et Pertz & al. (Nagar et al, 1996; Pertz et al, 1999b).
Les interactions que cette cadhérine établit in vivo ne sont pas encore clairement
définies, mais de nombreuses études suggèrent que cette protéine serait impliquée dans la
motilité cellulaire plutôt que dans des phénomènes adhésifs (Lee et al, 2008; Philippova et al,
2003; Philippova et al, 2009; Resink et al, 1999).
Figure 18 : Images par microscopie confocale montrant les différentes distributions de la T-cadhérine sur
des cellules polarisées soit (a) à la membrane apicale (Koller & Ranscht, 1996), soit sur les surfaces
basolatérales (Zhou et al, 2002). Les images du haut montrent des vues de dessus (coupes xy) et celles du
bas des tranches (coupes xz).
La T-cadhérine n‟est pas concentrée spécifiquement au niveau des jonctions
intercellulaires, et son insertion membranaire via une ancre GPI favoriserait sa localisation
dans les radeaux lipidiques, lui procurant un rôle dans la migration directionnelle plutôt que
dans l‟adhésion cellulaire. Il est intéressant de remarquer que l‟ancre GPI résiste peu à la
(a) (b)
39
force mécanique (Cross et al, 2005), et peut facilement être extraite d‟une bicouche lipidique,
ce qui est en accord avec des fonctions autres qu‟adhésives de la T-cadhérine.
Sur différents types cellulaires polarisés (épithélium intestinal de poulet in vivo,
MDCK) la T-cadhérine est localisée à la surface apicale (Koller & Ranscht, 1996). Cependant
dans les cellules basales de la peau, la T-cadhérine est localisée au pôle basolatéral (Zhou et
al, 2002). Ces observations montrent que la T-cadhérine peut présenter différentes
distributions en fonction du type cellulaire suggérant que cette protéine pourrait avoir
différents effets sur le comportement cellulaire (Figure 18).
L‟étude de la T-cadhérine prend de plus en plus d‟essor, en particulier parce que sa
dérégulation est corrélée à l‟apparition de nombreux types de cancers (Hebbard et al, 2008;
Lee, 1996; Ogama et al, 2004).
6. La spécificité d’interaction des cadhérines
De très nombreuses observations, allant des patrons d‟expression des cadhérines au
cours du développement embryonnaire à l‟analyse comparative de l‟adhérence au niveau
moléculaire et cellulaire, ont été faites pour caractériser les propriétés adhésives des
cadhérines (Gumbiner, 2005; Mege et al, 2006; Takeichi, 1995). La majorité des données est
en faveur d‟interactions homophiles. Ceci peut être difficile à concilier avec les
caractéristiques structurales décrites précédemment, (Trp2 et échange de brin β qui forment
l‟interface adhésive) partagées par l‟ensemble des cadhérines de type I (voir Tableau 1), et qui
n‟expliquent pas comment celles-ci réalisent des interactions spécifiques. Quelques
différences structurales existant à la périphérie de l‟interface pourraient affecter la spécificité
intrinsèque des cadhérines. Les différences d‟énergie entre les interactions homophiles et
hétérophiles sont faibles, de l‟ordre de quelques kcal/mol (Prakasam et al, 2006b; Shi et al,
2008). Nous verrons avec quelques exemples, que les mécanismes moléculaires conduisant à
la sélectivité de l‟adhésion des cadhérines ne sont encore que partiellement compris.
a. Tests d’agrégation cellulaire
Les tests d‟agrégation cellulaire furent parmi les premiers essais utilisés pour étudier
l‟adhérence cellulaire. Ils ont permis d‟évaluer le caractère adhésif de différentes molécules
de surface et particulièrement des cadhérines.
40
Les cellules sont mises en contact par agitation et leur capacité adhésive est évaluée
par la formation d‟agrégats. Roth et Weston en 1967 ont obtenu des mesures qu‟ils ont
définies comme « quantitatives » en comparant la vitesse à laquelle des cellules
embryonnaires dérivées du cartilage, du foie ou des muscles pectoraux de poulet forment des
agrégats homogènes. Ils ont constaté une préférence pour la formation d‟interactions
homotypiques par rapport aux interactions hétérotypiques (Roth, 1968). Plus tard Moyer et
Steinberg ont mesuré la vitesse à laquelle des agrégats sphériques de même taille, de foie (F),
de cœur (C) ou de rétine (R) d‟embryons de poulet étaient capables de s‟associer dans des
conditions standardisées (Moyer & Steinberg, 1976). Une hiérarchie d‟association a été
observée : F-F ≥ C-C > F-C > R-R > C-R > F-R. Même si les interactions homotypiques
semblent être favorisées par rapport aux interactions héterotypiques, une interprétation
moléculaire est délicate. En effet, les agrégats sont partiellement homogènes au niveau
cellulaire et de plus le niveau d‟expression des cadhérines n‟est pas maîtrisé.
Plus tard, Steinberg et collaborateurs ont testé l‟hypothèse d‟adhésion différentielle
(DAH, Differential Adhesion Hypothesis) sur les cadhérines. Cette théorie propose que
l‟ensemble des cellules dans un tissu, au même titre que l‟ensemble des molécules dans un
liquide, adopte une organisation permettant de minimiser l‟énergie libre du système ; cette
minimisation de l‟énergie libre dépend essentiellement des interactions cellule-cellule (Foty &
Steinberg, 2005). Dans leurs expériences, des cellules exprimant des niveaux comparables de
P- ou de E-cadhérine s‟intermixent, tandis que des cellules exprimant la R- ou la B-cadhérine
se démixent et s‟organisent de façon hétérogène (Duguay et al, 2003). Ces observations
suggèrent que l‟énergie d‟adhésion hétérophile entre la R- et la B-cadhérine est plus faible
que leurs interactions homophiles respectives, alors que l‟interaction hétérophile P- vs E-
cadhérine est équivalente aux interactions homophiles respectives. Dans cette même étude, les
auteurs soulignent que le niveau d‟expression des cadhérines est primordial pour pouvoir
interpréter leur comportement cellulaire collectif.
Plus récemment, des tests d‟agrégation cellulaires similaires ont été menées sur des
cellules exprimant la E-cadhérine et la N-cadhérine (type I), ainsi que la cadhérine 6b (type II)
(Figure 19) (Katsamba et al, 2009). Comme dans les expériences de Duguay et al., les cellules
forment des agrégats homogènes pour les interactions homophiles et des agrégats mixtes pour
les interactions hétérophiles entre cadhérines de type I. Les cellules exprimant les cadhérines
de type I et II n‟agrègent pas entre elles (montrant que les cadhérines de type I et de type II
n‟interagissent pas les unes avec les autres). Les auteurs ont mesuré par centrifugation
analytique et résonance plasmonique de surface les constantes d‟interaction des interactions
homophiles et hétérophiles entre ces 3 cadhérines. Ils ont ensuite relié le comportement
41
cellulaire observé dans les tests d‟agrégation à ces constantes de dissociation moléculaires par
un modèle que nous allons décrire maintenant.
Figure 19 : Expériences d’agrégation cellulaire ; (a) différents cas de figures prévus par la DAH pour le tri
cellulaire ; (b) exemples de tests d’agrégation avec des cellules exprimant des cadhérines différentes
(Katsamba et al, 2009) où on retrouve l’intermixité (photos du haut), l’enveloppement partiel (en bas à
gauche) et de tri complet. Les cellules sont marquées avec des sondes fluorescentes différentes en fonction
des cadhérines qu’elles expriment, afin de différencier la nature des agrégats.
b. Modèle théorique de l’adhésion spécifique
L‟expression de différentes cadhérines est souvent corrélée au phénomène de
ségrégation cellulaire. La sélectivité d‟expression est souvent considérée comme la
manifestation directe au niveau cellulaire des interactions homophiles des cadhérines, comme
ceci a été décrit au cours du développement embryonnaire (Takeichi, 1988b). Cependant, des
cellules peuvent exprimer plusieurs types de cadhérines in vivo, même si ceci ne signifie pas
que des interactions hétérophiles soient présentes (Agarwal et al, 2008; Lampugnani et al,
2006). . En complément de ces observations in vivo, les tests d‟agrégation cellulaire montrent
que in vitro dans certaines conditions des cellules exprimant différentes cadhérines adhèrerent
entre elles comme nous l‟avons vu précédemment (Duguay et al, 2003; Niessen & Gumbiner,
2002). De plus, l‟analyse des séquences et des structures n‟explique pas clairement pourquoi
la formation d‟homodimères serait favorisée par rapport à la formation d‟hétérodimères. La
spécificité de l‟adhésion cellule-cellule ne serait donc pas simplement corrélée à la spécificité
d‟interaction des molécules de cadhérines. En effet, les niveaux d‟expression à la surface
(a) (b)
42
cellulaire plutôt que la nature des cadhérines pourraient régir les interactions cellulaires
(Duguay et al, 2003; Steinberg & Takeichi, 1994).
Chen et al. ont développé un modèle basé sur les affinités de liaison des cadhérines,
qui décrit comment de faibles différences d‟affinité d‟interactions moléculaires peuvent
conduire à des différences significatives d‟adhésion cellulaire (Chen et al, 2005). Ce modèle
montre que le comportement cellulaire est très dépendant de la concentration surfacique en
cadhérines, et fournit une explication rationnelle aux résultats précédents à priori
contradictoires.
Figure 20 : Modèle proposé par Chen et al. pour l’interaction des cadhérines, et son diagramme d’énergie
(A) Les 2 monomères [M] avec leur Trp en conformation intramoléculaire, exposent leur brin au solvant
[O] pour s’associer en dimère adhésif [D] (B) Diagramme d’énergie libre associé aux étapes de
l’interaction montrée en (A).
La surface d‟interaction des cadhérines de type I, de l‟ordre de 1600 Å a les propriétés
structurales de complexes protéiques de haute affinité. Le mode d‟interaction par échange de
domaine, ici échange de brin, modifie ces propriétés. De fait, les cadhérines ont de faibles
affinités d‟interaction à l‟équilibre, de l‟ordre de la millimole (Haussinger et al, 2004; Perret
et al, 2002a). En effet, les interactions établies entre le brin β et le domaine EC1 sont
similaires, que ce soit en intramoléculaire dans la forme monomérique ou en intermoléculaire
dans la forme dimérique. De ce fait, le monomère se comporte comme un inhibiteur
compétitif de la formation du dimère, diminuant les affinités d‟interaction (Figure 20). De
plus, les monomères doivent surmonter une barrière énergétique et passer par un état activé
instable pour interagir. Cet état hypothétique, décrit figure 20, n‟a encore jamais été observé.
Pour le cas le plus simple, si la concentration en monomères est plus faible que le KD, seules
quelques molécules associées en dimères sont présentes. Dans ce régime, il est intéressant de
souligner que de petites différences dans les affinités intrinsèques des molécules de cadhérine
produisent des différences significatives dans le nombre de dimères formés. L‟énergie
(a)
(b) ∆G=7kcal.mol-1
∆G=-4kcal.mol-1
43
d‟adhésion cellulaire, directment proportionnel au nombre de dimères à la surface entre deux
cellules, se trouve ainsi modifiée.
Les contacts cellule-cellule initiaux sont établis par les cadhérines présentes à la
surface d‟extensions membranaires très dynamiques. Ces contacts, s‟ils durent suffisamment
longtemps, vont permettre à d‟autres molécules de cadhérines de diffuser vers la zone de
contact et de renforcer l‟adhésion. Ainsi, les interactions faibles mais multiples peuvent
produire des interactions cellule-cellule homophiles et spécifiques. Des contacts plus labiles
entre hétérodimères se dissocieront avant que l‟adhésion cellulaire n‟ait le temps de se
renforcer. En revanche, si ces interactions entre cadhérines de différents types ont
intrinsèquement de fortes affinités, elles maintiendront les contacts hétérophiles suffisamment
longtemps pour établir des interactions hétérophiles. Ce modèle a été utilisé avec succès par
Katsamba et al. (Figure 19) entre N- et E-cadhérines (Katsamba et al, 2009).
c. Comparaison entre cadhérines de type I et cadhérines de type II
La majorité des études décrivant les interactions adhésives porte sur les cadhérines de
type I, un nombre croissant de travaux documente les cadhérines de type II. A cause de leurs
homologies de séquences, les cadhérines de type II sont souvent considérées comme
interagissant au niveau du segment extracellulaire de façon similaire aux cadhérines de type I.
Cependant, les différences séquentielles et structurales suggèrent très fortement que leur
mécanisme d‟interaction présente des singularités.
L‟adhérence entre cellules exprimant les cadhérines de type I et II a été quantifiée en
particulier dans une étude très intéressante utilisant des micropipettes (Chu et al, 2006). Les
forces d‟adhésion ont été mesurées à l‟échelle cellulaire, et ont permis de déterminer pour les
N- et E- cadhérines (type I) des forces de détachement de 75 et 195 nN respectivement, contre
4 et 10nN pour les cadhérines -11 et -7 (type II). Par remplacement du domaine extracellulaire
de la cadhérine-7 par celui de la E-cadhérine, et réciproquement, les auteurs ont montré que
ces différences d‟adhésion cellulaire étaient dues à la capacité adhésive des domaines
extracellulaires de ces protéines.
D‟autres études indiquent à l‟inverse que des cadhérines de type II peuvent établir des
interactions plus fortes que celles de type I. Notamment par mesures d‟AFM, sur molécules
isolées vs molécules isolées, molécules isolées vs cellules, ou cellules vs cellules, il apparaît
que les interactions établies par la cadhérine-11 sont plus stables que celles entre N-
cadhérines (Pittet et al, 2008). Des mesures de constantes de dissociation à l‟équilibre
44
obtenues par ultracentrifugation analytique indiquent un KD moyen de 3 µM pour la
cadhérine-6, contre 100 µM et 25 µM pour la E- et la N-cadhérine respectivement (Katsamba
et al, 2009).
Ces différences entre la nanomécanique des cadhérines de type II et les comportements
cellulaires qu‟elles engendrent restent encore incomprises et sujettes à débat. Les résultats
contradictoires sur les cadhérines de type II montrent que leur mécanisme d‟interaction n‟est
pas encore appréhendé complètement, et que leurs implications dans le contexte
physiologique ou pathologique n‟est pas encore élucidé.
III. Régulation post-traductionnelle des cadhérines
Les « colles moléculaires » que sont les cadhérines interviennent très tôt dans le
développement, et jouent un rôle crucial dans la reconnaissance, mais aussi la différenciation
cellulaire (Larue et al, 1996a). Les caractéristiques très spécifiques de leurs interactions ainsi
que leurs fortes homologies de séquences donnent aux cadhérines classiques toute la
complexité et donc tout l‟intérêt de leur étude. Une littérature très abondante concerne
l‟implication des cadhérines dans diverses voies de signalisation. Nous avons choisi quelques
exemples non exhaustifs pour en illustrer la complexité.
1. Assemblage des cadhérines et formation des jonctions
Les cadhérines sont synthétisées dans le réticulum, avec un peptide signal pour leur
adressage membranaire, ainsi qu‟un prodomaine N-terminal qui empêche les cadhérines
d‟interagir et de former des agrégats trop précocement. Durant le transport du réticulum à la
membrane plasmique, différentes modifications port-traductionnelles vont contribuer à la
maturation de la protéine : au niveau de l‟appareil de Golgi le prodomaine N-terminal est
clivé, et des groupements glycosylés importants pour les propriétés adhésive sont greffés
(Guo et al, 2009).
La notion d‟adhésion suggère la résistance aux contraintes mécaniques. La cellule,
pour résister efficacement à ces forces, doit avoir un minimum de rigidité. Les récepteurs
adhésifs soient ancrés au cytosquelette, dont le rôle est de maintenir la forme des cellules.
Comme pour les intégrines, les interactions entre cadhérines et cytosquelette, doivent donc
être hautement contrôlées pour pouvoir réguler l‟adhésion cellulaire (Figure 21).
45
Figure 21 : Représentation shématique du complexe E-adhérines/caténines à la jonctions entre deux
cellules épithéliales voisines (van Roy & Berx, 2008).
Les caténines ainsi que d‟autres protéines cytoplasmiques concentrées au niveau des
jonctions adhérentes (small GTPases & récepteur Tyrosine Kinase) forment un échafaudage
moléculaire et contribuent à la structuration des jonctions, modulent leur stabilité et leur
renouvellement. Cet échafaudage est impliqué dans la transduction du signal. Pour assurer
leur fonction et leur stabilité à la surface, les cadhérines doivent être liées à la β-caténine ou à
la γ-caténine. Cette association s‟effectue très tôt, dès le réticulum endoplasmique. La
connexion entre le cytosquelette et le complexe cadhérine/β-caténine est sujette à débat.
Certaines études suggèrent que l‟α-caténine relie directement le complexe cadhérine/β-
caténine, d‟autres concluent que l‟α-caténine ne peut pas être liée simultanément au complexe
et aux filaments d‟actine (Weis & Nelson, 2006). Un mécanisme alternatif pour l‟ancrage des
cadhérines au cytosquelette d‟actine suggère l‟existence d‟un lien encore inconnu entre l‟α-
caténine et l‟actine (Halbleib & Nelson, 2006). Ce lien pourrait être établi par l‟intermédiaire
de la protéine EPLIN (epithelial protein lost in neoplams), dont la liaison à l‟α-caténine
associée au complexe a été montrée récemment (Abe & Takeichi, 2008). Il est intéressant de
noter que la β-caténine a un double rôle dans la cellule ; elle participe à l‟échafaudage
intracellulaire des jonctions adhérentes, mais aussi à la transduction de signaux dans la voie
de signalisation Wnt en tant que cofacteur de transcription (Cadigan & Nusse, 1997; Clevers,
2006; Hoppler & Kavanagh, 2007). Chaque membre de ce complexe est essentiel. Des
mutations affectant l‟expression ou la liaison de l‟une de ces protéines réduit dramatiquement
l‟adhésion cellulaire (Nagafuchi et al, 1994; Ozawa et al, 1990b; Vasioukhin et al, 2001).
Une autre protéine se lie aux domaines intracellulaires des cadhérines de type I et II, la
p120-caténine (Figure 21). Elle se lie de manière indépendante aux α- et β-caténines. Son rôle
46
précis reste encore indéterminé. Contrairement à la β-caténine, la p120-caténine ne se lie pas
aux cadhérines au cours du trafic intracellulaire, mais au niveau de la membrane plasmique
(Miranda et al, 2003). En fonction du contexte cellulaire, la p120-caténine peut être une
protéine d‟échafaudage et réguler la force d‟adhésion en groupant les cadhérines en sites
spécifiques à la surface cellulaire (Thoreson et al, 2000; Yap et al, 1998). De plus, elle
participe au renouvellement des cadhérines en adaptant le niveau d‟expression des cadhérines
disponibles à la surface (Davis et al, 2003; Ireton et al, 2002; Xiao et al, 2003). L‟importance
de la p120-caténine a aussi été démontrée chez la souris où sa délétion dans le génome de
l‟épithélium des glandes salivaires ou de la peau réduit le taux d‟expression de la E-cadhérine
dans ces tissus (Davis & Reynolds, 2006; Perez-Moreno et al, 2006).
2. Régulations de l’adhésion
Comme nous venons de voir, différents paramètres comme le niveau d‟expression des
cadhérines à la surface cellulaire, leur renouvellement, les interactions avec le cytosquelette
sont très importantes pour la régulation des phénomènes adhésifs. Un changement de ces
protéines d‟échafaudage (physiologique ou pathologique) peut entraîner une perturbation de
l‟adhérence, sans que pour autant les cadhérines ne perdent leur capacité adhésive intrinsèque.
Les cadhérines, au delà de leurs capacités de « colles moléculaires », sont aussi des
transducteurs de signaux. Elles renseignent la cellule sur son environnement, et ainsi la
cellule, grâce à ce mécano-senseur, peut réagir et s‟adapter à certaines conditions extérieures.
Comme décrit ci-dessous, les cadhérines agissent de concert avec d‟autres molécules pour
moduler la réponse cellulaire.
Les récepteurs à tyrosine kinase (RTK) jouent un rôle très important dans le
développement. Après fixation de leur ligand, les RTK s‟oligomérisent et
s‟autophosphorylent, et passent d‟une forme inactive à une forme active ; ils peuvent alors
phosphoryler leurs protéines cibles. Les RTK peuvent interagir avec les cadhérines, et ces
interactions modulent les voies de signalisation en modifiant l‟affinité entre les RTK et leurs
protéines cibles (Hoschuetzky et al, 1994; Pece & Gutkind, 2000; Qian et al, 2004). Par
exemple, le récepteur au facteur de croissance épidermal (EGFR) intervient dans différents
phénomènes comme la croissance, la différenciation, la migration ou la transformation
(Fedor-Chaiken et al, 2003). La E-cadhérine interagit spécifiquement avec l‟EGFR via le
domaine extracellulaire. Il a été observé que l‟engagement adhésif de la E-cadhérine active la
phosphorylation de l‟EGFR, ce qui entraine de rapides altérations de la morphologie
47
cellulaire, des réarrangements du cytosquelette d‟actine et une redistribution des récepteurs
(Fedor-Chaiken et al, 2003).
Un autre groupe de RTK, les récepteurs au facteur de croissance fibroblastique
(FGFR) sont impliqués dans de nombreux processus au cours du développement, comme la
différenciation musculaire, l‟induction et la migration du mésoderme, l‟angiogénèse et
l‟induction neurale (Bottcher & Niehrs, 2005). Très récemment, il a été montré que
l‟engagement adhésif de la cadhérine-11 au niveau du cône de croissance des neurones permet
le recrutement du FGFR. L‟interaction du domaine extracellulaire de la cadhérine-11 avec
celui du FGFR active des voies de signalisation intracytoplasmiques, et stimule ainsi
l‟extension des axones (Boscher & Mege, 2008). Ce mécanisme impliquant le FGFR et la
cadhérine-11 (exprimée à la surface de cellules au phénotype mésenchymateux) pourrait être
impliqué dans d‟autres phénomènes migratoires, physiologiques ou pathologiques.
Les cadhérines classiques ont aussi été identifiées comme substrat potentiel de
metalloprotéases (comme ADAM10) ou de γ-sécrétases (Marambaud et al, 2002). Le clivage
du domaine extracellulaire de la N-cadhérine par ADAM10 produit un fragment carboxy-
terminal (CTF1), ancré à la membrane. Ce fragment est rapidement dégradé par une γ-
sécrétase qui relargue dans le cytoplasme un deuxième fragment carboxy-terminal (CFT2). Le
CFT2 se lie au complexe CBP (CREB binding protein) et est alors rapidement dégradé par le
protéasome. La quantité de CBP, après translocation et dégradation, diminue drastiquement
dans le cytoplasme et le noyau, et l‟expression des gènes régulée par CBP s‟en trouve
modulée (Uemura et al, 2007).
Enfin, comme ceci est décrit dans l‟article 4 dans cette thèse, les cadhérines peuvent
aussi, par leur engagement, réguler l‟activation de certaines voies de signalisation, et
l‟expression de gènes par activation du facteur de transcription Stat3 (Arulanandam et al,
2009). Cet équilibre dynamique permet aux cadhérines de jouer un rôle dans des processus
complexes et primordiaux, comme le développement embryonnaire.
3. Cadhérines et développement
a. Un peu d’embryologie
Au cours du développement embryonnaire, chaque cadhérine possède une expression
spatio-temporelle particulière (Figure 22; (Takeichi, 1988a). La E-cadhérine est exprimée
dans l‟embryon de souris au stade très précoce de 2 cellules (Ogou et al, 1982). Elle joue un
rôle indispensable lors de la compaction au stade 8 et 16 cellules (Damsky et al, 1983; Hyafil
48
et al, 1980; Shirayoshi et al, 1983). Au cours de l‟implantation, la E-cadhérine est exprimée
dans toutes les cellules de l‟embryon, puis lorsque ces cellules se différencient, certaines
d‟entre elles perdent l‟expression de cette cadhérine. Ainsi, lors de la gastrulation, moment clé
correspondant à la mise en place des trois feuillets embryonnaires, les cellules du mésoderme
nouvellement formé répriment l‟expression de la E-cadhérine et expriment la N-cadhérine
(Hatta & Takeichi, 1986). Ce même changement d‟expression entre la E- et la N- cadhérine
est observé au moment de la neurulation, au niveau des cellules du tube neural nouvellement
formé. Par contre d‟autres régions de l‟ectoderme et toutes les cellules de l‟endoderme
gardent l‟expression de la E-cadhérine et cette expression persiste aussi longtemps qu‟elles se
différencient en cellules épithéliales. Plus tard, pratiquement toutes les cellules épithéliales
dérivées de l‟ectoderme et de l‟endoderme, qui prolifèrent, expriment la E-cadhérine. A de
rares exceptions près, les tissus neural et mésodermique n‟expriment pas de E-cadhérine
(Takeichi, 1988a). Les composants épithéliaux du système urogénital dérivé du mésoderme,
tels que les tubules mésonephriques et métanephriques expriment la E-cadhérine après
différenciation. Enfin certains tissus mésothéliaux expriment également cette cadhérine
(Damjanov et al, 1986). Ainsi le changement d‟expression d‟une cadhérine est souvent corrélé
avec la différenciation, elle-même coordonnée avec les processus de morphogenèse.
Figure 22 : Coupe sagittale de l’embryon de souris montrant l’expression différentielle de diverses
cadhérines de type I (reproduit de (Takeichi, 1988b).
Decidua
Ectoderme
Cône ectoplacental
Endoderme viscéral
Mésoderme
Ligne
primitive
E-cadhérine
N-cadhérine
P-cadhérine
E-+P-
cadhérines
E-+N-
cadhérines
49
La réalisation de souris transgéniques présentant une invalidation des gènes de
certaines cadhérines a confirmé le rôle primordial de ces molécules au cours du
développement. L‟absence d‟expression de E-cadhérine aboutit à une mort précoce de
l‟embryon, liée à une absence de formation de l‟épithélium du trophectoderme (Larue et al,
1994; Riethmacher et al, 1995). De même, les embryons n‟exprimant pas de N-cadhérine
meurent au cours du dixième jour de gestation avec des malformations du tube neural et du
cœur (Radice et al, 1997). Le rôle morphogénétique de ces cadhérines a également été mis en
évidence in vitro. L‟expression de E-cadhérine dans les cellules L qui n‟expriment pas
habituellement de cadhérines conduit à un changement morphologique de ces cellules
(Nagafuchi et al, 1987). Plus tard la même observation a été faite avec la P- ou la N-cadhérine
(Takeichi, 1988a).
Il apparaît évident que les cadhérines, en participant à l‟adhésion cellule-cellule,
jouent un rôle décisif dans la morphogenèse cellulaire et dans l‟homéostasie des tissus sains
de l‟adulte. Une étude très élégante a démontré que des cadhérines spécifiques jouent un rôle
plus direct dans la différenciation de certains tissus et qu‟elles sont capables d‟influencer
l‟activité de certains gènes (Larue et al, 1996b). Les auteurs ont utilisé des cellules ES
(embryonic stem cells) invalidées pour le gène de la E-cadhérine et ont regardé quel était le
devenir de la cellule si, au cours de la différenciation, elle exprime une cadhérine différente.
Tout d‟abord ces cellules ayant perdu l‟expression de la E-cadhérine présentent un phénotype
désagrégé et expriment le facteur de transcription T-brachyury : les cadhérines peuvent donc
influencer l‟expression de gènes. Lorsque l‟expression de la E-cadhérine est induite dans ces
cellules, il se forme uniquement des épithéliums. Si l‟expression constitutive de la N-
cadhérine est induite, les tissus formés sont de type neuro-épithélial et cartilagineux.
Les cadhérines participent au maintien des contacts intercellulaires. En exécutant cette
fonction, elles participent à des événements morphogénétiques importants, mais elles sont
aussi capables de propager d‟autres informations influençant la différenciation cellulaire et
l‟expression de gènes.
b. "Cadherin switching" et transition épithélio-mésenchymateuse
La régulation spatio-temporelle d‟expression des cadhérines participe de façon
cruciale à la reconnaissance cellulaire et la ségrégation tissulaire. Cette régulation se traduit
par un changement d‟expression des cadhérines appelé "cadherin switching".
50
Au cours du développement, ainsi que dans certaines pathologies comme le cancer, on
observe le phénomène de « cadherin switching », parfois corrélé avec la ségrégation cellulaire
(Thiery & Sleeman, 2006). L‟exemple le plus connu et le mieux étudié de "cadherin
switching" est la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT).
La transition épithélio-mésenchymateuse est un mécanisme indispensable au cours de
la morphogénèse ; sans cellules mésenchymateuses, les tissus et les organes ne peuvent pas
se former. Cependant, la plasticité des cellules épithéliales, couplée à la formation permanente
ou transitoire du mésenchyme, va bien au-delà du problème de ségrégation des tissus
embryonnaires. Comprendre comment les cellules mésenchymateuses se forment à partir
d‟une perturbation au niveau d‟un tissu épithélial aura un fort impact dans le décryptage des
mécanismes qui contrôlent de nombreuse pathologies, et en particulier la progression des
cancers.
Au cours de la EMT, une cellule épithéliale perd ses caractéristiques de polarité,
désassemble ses jonctions cellule-cellule et devient plus motile. La EMT est déclenchée par
des signaux extérieurs, comme ceux transmis par les composants de la matrice extracellulaire
(le collagène et l‟acide hyaluronique par exemple), ou des facteurs de croissance solubles
comme le transforming growth factor 2 (TGF2) ou le facteur de croissance épidermal
(EGF).
Figure 23 : Expression de la E- et N-cadhérine (en rose et en vert respectivement) durant la gastrulation.
Les cellules de l’épiblaste (rose) subissent une EMT, migrent et colonisent le mesoderme (vert). Pendant ce
processus, l’expression de E-cadhérine est réprimée et remplacée par celle de la N-cadhérine.
La plupart des cellules épithéliales expriment la E-cadhérine et sont très cohésives ; les
cellules de phénotype mésenchymateux sont plus motiles, moins polarisées, et expriment
souvent la N-cadhérine. Au cours de la gastrulation, les cellules de l‟épiblaste exprimant la
EMT
51
E-cadhérine subissent une EMT et migrent pour coloniser le mésoderme ; ce phénomène est
concomitant au remplacement de l‟expression de la E-cadhérine par celle de la N-cadhérine
(Butz & Larue, 1995) (Figure 23).
Certaines cellules cancéreuses qui dérivent d‟épithéliums expriment aussi de manière
inappropriée la N-cadhérine, dont la surexpression déclenche la motilité et l‟apparition du
phénomène métastatique (Hazan et al, 2000; Islam et al, 1996; Nieman et al, 1999). Le terme
de "cadherin switching" réfère le plus souvent au changement d‟expression entre E- et N-
cadhérine, mais comprend aussi des situations où le patron d‟expression est modifié ; ainsi le
niveau d‟expression de la E-cadhérine peut ne pas changer significativement, mais les cellules
se mettent à coexprimer la N-cadhérine ou augmentent son expression. Des situations ont été
décrites où d‟autres cadhérines remplacent ou sont coexprimées avec la E-cadhérine (comme
les -11, T-, P- ou R- cadhérine, (Derycke & Bracke, 2004; Paredes et al, 2005; Patel et al,
2003a; Riou et al, 2006; Taniuchi et al, 2005; Tomita et al, 2000). Par exemple dans le cancer
de la prostate, il a été observé que les cellules saines exprimant initialement la E-cadhérine
surexpriment la N- ou la -11 cadhérines avec la pathologie (Tomita et al, 2000). Très
récemment dans une étude intéressante, cette corrélation a été établie entre surexpression de
cadhérine-11 par les cellules tumorales et la formation de métastases osseuses; en effet, la
cadhérine-11 (ou OB-cadhérine) est exprimée par les ostéoblastes (Chu et al, 2008). Lorsque
l‟expression de la cadhérine-11 a été désactivée dans les cellules tumorales, aucune métastase
osseuse n‟a pu être détectée chez la souris, mettant en évidence l‟importance de ce système
adhésif dans la pathologie.
IV. Biofonctionnalisation
1. Modification de surface
L‟étude de l‟adhésion cellulaire ainsi que le développement croissant des
biotechnologies requiert la mise au point de matériaux innovants aux propriétés adhésives, et
le développement de nouvelles stratégies pour la fonctionnalisation de ces matériaux avec des
biomolécules. L‟utilisation des puces à ADN ou des puces à protéines a permis un formidable
progrès de ces technologies. Leurs impacts dans les sciences médicales et biologiques est de
plus en plus grand.
52
Comme nous l‟avons vu dans les chapitres précédents, l‟organisation des molécules de
cadhérines à la surface cellulaire reste encore un sujet à débat, voire très peu connu en ce qui
concerne les cadhérines de type I et II. Le développement des différentes voies de
fonctionnalisation/modification de surface devrait permettre la modélisation de ces systèmes
adhésifs : l‟objectif est d‟organiser sur les surfaces modèles des molécules de cadhérines et de
contrôler la géométrie des ligands, et de comparer les réactions cellulaires in vitro avec les
comportements in vivo.
Il existe toute une zoologie de chemins pour arriver à la fonctionnalisation de surface
par des biomolécules, allant de la fixation non covalente orientée à la fixation covalente
aléatoire. La bibliographie sur ces techniques est très vaste et les techniques très diverses.
L‟engouement pour les biotechnologies semble débrider les chimistes qui n‟ont comme limite
que leur créativité pour développer de nouveaux procédés de fonctionnalisation de surface et
d‟organisation de biomolécules sur ces substrats. Nous verrons d‟abord les voies classiques de
fixation de protéines à un substrat, avec leurs différents avantages et inconvénients, puis
quelques méthodes mises en œuvre pour les organiser.
La fonctionnalisation de surface passe par deux étapes obligatoires : i) l‟activation de la
surface et ii) l‟immobilisation de la biomolécule.
L‟activation doit prendre en compte le type de surface, et doit aussi être compatible
avec la stratégie d‟immobilisation. Les performances finales du matériau vont dépendre de
paramètres en relation avec cette stratégie d‟immobilisation : i) les propriétés physiques et
chimiques de la surface, qui influencent à la fois les liaisons spécifiques et non spécifiques
des protéines ; ii) la distance entre les protéines immobilisées et la surface ; iii) l‟orientation
de la protéine immobilisée, qui peut détériorer la surface d‟interaction ou la protéine elle-
même ; iv) la densité de surface en protéines.
Le choix de la surface va dépendre de son utilisation et de ses applications. Les
propriétés de conductivité électrique des surfaces d‟or vont être préférentiellement utilisées
pour le développement de détecteurs électrochimiques ou de Résonance Plasmons de
Surface (SPR) (Lee et al, 2005). Des surfaces de verre seront quant à elles préférées pour des
détecteurs optiques pour leurs capacités de transparence. En général, ces 2 surfaces sont
choisies pour leurs caractéristiques d‟homogénéité et de stabilité chimiques, pour le contrôle
de leurs propriétés de surface (polarité, mouillabilité), leurs capacités à être modifiées par une
large gamme de fonctions chimiques, et la reproductibilité de leur modification de surface
(Cheung et al, 1999; Holloway et al, 2002; Southern et al, 1999).
53
La principale méthode pour fonctionnaliser les surfaces de verre est d‟utiliser les
fonctions silanol Si-OH de la surface du verre (Figure 24). Les groupes silanols peuvent être
générés par exemple par traitement à la solution piranha (H2O2/H2SO4) ou par plasma
d‟oxygène. Des silanes aux fonctions organiques de structure générale (RO)3Si(CH2)nX
peuvent ensuite être utilisés pour introduire de nouveaux groupes fonctionnels à la surface.
Une large gamme de silanes sont disponibles commercialement, avec des fonctions aussi
variées que des amines, des thiols, des carboxyles, des époxys, ou encore d‟autres fonctions
pour des étapes de modifications ultérieures (von Nickisch-Rosenegk et al, 2005). Les étapes
de réaction se font tout d‟abord par l‟hydrolyse du silane puis sa condensation à la surface du
verre.
Figure 24 : Voie chimique pour fonctionnaliser une surface de verre activée par un tri-éthoxy-silane.
Les surfaces d‟or, outre leurs propriétés de conductivité électrique, sont généralement
utilisées pour leur fonctionnalisation par les fonctions thiols (Figure 25) (Love et al, 2005). La
chimie de l‟interface or/thiol est très bien connue et beaucoup plus facile à contrôler que la
chimie des organosilanes. Les thiols sont dissouts dans un solvant pur (en général de l‟eau ou
de l‟éthanol) et appliqués sur la surface d‟or propre. Les thiols forment très facilement des
monocouches auto-assemblées (Self-Assembled Monolayers ou SAM) (Hodneland et al,
2002) ; cet auto-assemblage dépend fortement de la structure cristalline de la couche de métal
sous-jacente.
54
Figure 25 : Auto-assemblage d’une monocouche de molécules (SAM) possédant une fonction thiol sur une
surface d’or.
Ces 2 voies de fonctionnalisation sont de loin les plus utilisées, mais ne sont pas les
seules. En effet, certaines études décrivent la fonctionnalisation de polymères comme le
polydiméthylsiloxane (PDMS) ou le polyacrylamide par exemple (Delamarche et al, 1997;
Fixe et al, 2004). Les polymères permettent l‟élaboration de matrices 3D fonctionnalisables,
avec des modules élastiques variables en fonction du degré de polymérisation. La chimie du
PDMS est assez proche de celle du verre, car ce polymère est composé de dérivés du silane.
Une fois les surfaces activées, il convient d‟y fixer la protéine d‟intérêt. Un des
principaux challenges est de fixer de manière spécifique et contrôlée la protéine d‟intérêt. En
effet, lors de l‟application de la solution de protéine sur la surface activée, celle-ci peut
s‟adsorber de manière non spécifique et aléatoire sur la surface. Cette adsorption est fonction
des charges de surfaces, des interactions de type électrostatique et de Van Der Waals, ou par
établissement de forces acide-base de Lewis, d‟interactions hydrophobes simultanées ou
induisant des changements de conformation (Hlady & Buijs, 1996). Ce type de liaisons non
spécifiques peut altérer l‟efficacité de la fonctionnalisation « active ». Cependant, la sélection
du matériel déposé en surface peut réduire cette adsorption non spécifique, notamment en
utilisant de l‟élastine, de l‟agarose, de la cellulose, du polyéthylène glycol, polyvinyle alcool
et bien d‟autres molécules (Carter, 1965; Lee et al, 2004; Ponten & Stolt, 1980). Une attention
particulière doit être prise quant à la stabilité de tels matériels ; par exemple, le polyéthylène
glycol a tendance à s‟autooxyder avec le temps.
L‟attachement direct des protéines à la surface peut aussi créer un encombrement
stérique, et ainsi limiter la réactivité de la protéine ou sa capacité d‟interagir avec d‟autres
55
molécules. La proximité de la surface peut en plus induire la dénaturation partielle ou totale
de la protéine. L‟insertion d‟espaceur entre la protéine et le groupe réactif peut permettre
d‟éviter ce biais. Il est maintenant possible de trouver une grande variété d‟espaceurs, qui
peuvent avoir la longueur que l‟on désire, et des propriétés physiques variées : ils peuvent être
rigides ou souples, hydrophiles ou hydrophobes, chargés ou neutres… (Rusin et al, 1992)
2. Méthodes d’immobilisation des biomolécules
Les stratégies d‟attachement des protéines peuvent largement déterminer les propriétés
du matériau final. La fixation peut être orientée ou non orientée, covalente ou non covalente.
Nous verrons que le choix de stratégie n‟est pas toujours trivial. En effet, la fixation covalente
des protéines implique généralement qu‟elles soient aléatoirement orientées sur la surface,
alors que la fixation non covalente permet souvent d‟orienter les protéines. La combinaison
des deux (protéine fixée de manière covalente et orientée) requiert la modification des
protéines et la mise en œuvre lourde de différentes étapes de chimie, biologie moléculaire et
biochimie.
a. Fixation des protéines non orientée
i. Attachement non covalent par adsorption
Les protéines peuvent s‟adsorber sur les surfaces par interactions électrostatiques,
liaisons ioniques, interactions polaires ou hydrophobes. Les interactions qui vont prédominer
dépendront de la protéine et de la surface sur laquelle elle va s‟adsorber. Une telle
fonctionnalisation aboutira à la formation d‟une couche de protéines aléatoirement orientées ;
en effet chaque protéine va former individuellement de nouveaux contacts pour minimiser ses
interactions répulsives avec la surface et les protéines déjà adsorbées. L‟adsorption est surtout
utilisée pour les matrices 3D, lesquelles sont imprégnées de solution de protéines. Sur les
surfaces d‟or, l‟adsorption de protéines peut se faire via les résidus cystéines qui possèdent
une fonction thiol (Lee et al, 2003; Wilson et al, 2001). Mais une étape supplémentaire de
passivation de surface doit être mise en jeu pour recouvrir l‟or resté à nu.
ii. Attachement covalent
L‟attachement covalent peut se faire par l‟intermédiaire des nombreuses fonctions
chimiques présentes dans une protéine, au niveau de la chaîne latérale des acides aminés ou
des extrémités N- et C-ter de la molécule. Les réactions utilisées pour ces attachements
covalents sont aussi variées que le nombre de fonctions des chaînes latérales. Il faut
cependant porter attention au fait que l‟attachement covalent par ce type de méthode peut
56
créer des liens à plusieurs endroits dans la même protéine, et ainsi réduire le degré de liberté
des conformations de la protéine.
Les 2 principales méthodes d‟attachement de protéines par liaisons covalentes non
orientées tirent parti de l‟abondance des fonctions amines et carboxyles des protéines. Les
fonctions amines représentent plus de 10% des groupes présents sur les protéines, et peuvent
donc induire, par l‟attachement en plusieurs points à la surface de la protéine, une
augmentation de la fixation aléatoire de la protéine et une réduction de la flexibilité
conformationelle. La réaction la plus utilisée pour la fonctionnalisation par les fonctions
amines est la formation de liaisons peptidiques stables à des fonctions carboxyles activées par
le N-hydroxysuccinimide (NHS). L‟efficacité de fixation va dépendre de plusieurs
paramètres, comme par exemple le pH, la force ionique, la concentration, le temps de
réaction, etc. qui doivent être optimisés pour chaque protéine. Cependant, cette réaction est
suffisamment stable et réactive pour se faire dans un tampon phosphate standard à pH=7,4 et
température ambiante. Une autre réaction très utilisée consiste à utiliser des surfaces
recouvertes de groupes aldéhydes, qui réagissent très fortement avec les amines, formant des
liaisons imines stabilisées par réduction (Johnsson et al, 1991; Rao et al, 1999; Yam et al,
2006).
Le greffage sur les fonctions carboxyles intrinsèques des protéines peut servir
d‟alternative à celui sur les fonctions amines. Seuls l‟acide aspartique et l‟acide glutamique
possèdent de telles fonctions parmi l‟ensemble des acides aminés, ce qui permet d‟éviter
l‟attachement en de multiples points comme c‟est le cas en utilisant les fonctions amines. La
même réaction utilisant le NHS peut être utilisée pour fixer les protéines sur des surfaces
fonctionnalisées par des NH2, mais la fonction carboxyle activée par le NHS, très réactive,
présente l‟inconvénient de pouvoir réagir avec les lysines très représentées à la surface des
protéines et créer ainsi des ponts intra- et intermoléculaires (Fernandez-Lafuente et al, 1993).
Bien que ces 2 voies soient les plus utilisées et les plus simples à mettre en œuvre au
laboratoire, il existe d‟autres voies de fonctionnalisation, comme le greffage via les résidus
cystéines à des surfaces activées par un groupe maléimide, la liaison de résidus aux groupes
nucléophiles (NH ou SH) à des surfaces recouvertes de fonctions époxy, ou encore de
nombreuses voies chimiques beaucoup plus complexes.
57
b. Fixation orientée des protéines
La fixation orientée de protéines peut avoir des avantages en facilitant leur activité
biologique. Les stratégies développées pour la purification de protéines et la mise au point de
colonnes de chromatographie, en particulier pour la rétention de protéines de fusion, ont été
adaptées pour immobiliser de manière orientées les protéines sur des surfaces. Pour ce faire,
plusieurs caractéristiques des protéines de fusion ont été mises à profit, avec les motifs
comme la glutathionne S-transférase (Martzen et al, 1999), l‟hexahistidine (Schmitt et al,
1993), l‟hexacystéine (Ichihara et al, 2006). Les avantages de telles adsorptions résident dans
le contrôle de la spécificité et de la directionnalité de la fixation des protéines sur les
substrats.
De nombreuses protéines recombinantes ont un motif hexahistidine introduit par
biologie moléculaire à leurs extrémités C-ter ou N-ter, ce qui permet leur purification par
immobilisation de manière non covalente sur des surfaces Ni-NTA (Acide NitriloTriAcetique
couplé au nickel) (Figure 26) (Gizeli & Glad, 2004; Kato et al, 2005; Schmitt et al, 1993). Le
NTA forme un complexe hexagonal avec un ion métallique divalent (le plus souvent, le nickel
Ni2+
), laissant libre 2 positions au nickel pour interagir avec le motif hexahistidine. La
protéine sélectivement fixée sur de telles surfaces est facilement éluée par addition
d‟éthylènediaminetétraacétate (EDTA) qui complexe les ions Ni2+
ou d‟imidazole qui vient se
substituer aux histidines par compétition. La fixation via la technologie Ni-NTA peut dans
certains cas présenter des inconvénients, comme l‟adsorption non spécifique de certaines
protéines induite par leur affinité aux ions divalents, ou la faible affinité relative du motif
hexahistidine au NTA (KD=10µM), pouvant parfois engendrer une dissociation non contrôlée
(Mammen & al, 1998).
Figure 26 : Deux manières très utilisées pour orienter les protéines sur une surface ; en utilisant un motif
hexahistidine permettant l’élution aisée de la protéine ou le couple streptavidine-biotine permettant une
liaison très solide de la protéine.
58
Le motif hexacystéine, introduit grâce aux techniques de biologie moléculaire, peut
aussi être utilisé pour fixer de manière orientée et covalente des protéines à des fonctions
maléimide ou directement à des surfaces d‟or, comme nous l‟avons mentionné
précédemment. Mais si la protéine exprime à sa surface d‟autres cystéines, la liaison peut se
faire de manière non spécifique, ce qui restreint donc la méthodologie.
Une autre stratégie très utilisée pour la fixation non covalente est l‟utilisation du
couple streptavidine (ou avidine) / biotine (PDB 1STP) (Figure 26). La streptavidine est
composé de 4 sous unités et chacune peut se lier à une seule biotine. L‟affinité de ce couple
ligand-récepteur, est très élevée (KD=10-13
-10-15
M) (Green, 1975). Cette fixation, une des plus
forte en biologie, est considérée comme presque covalente (durée de vie de plusieurs
semaines). Elle est résistante aux conditions extrêmes de pH, de chaleur, de dénaturants et de
certaines protéolyses, et est souvent utilisée comme alternative à la fixation orientée et
covalente. La fixation de la biotine à une protéine peut se faire par voie chimique, de façon
non spécifique avec une biotine-NHS par exemple. Mais la protéine peut aussi être exprimée
en C-ter ou N-ter avec la séquence GLNDIFEAQKIEWHE reconnue par biotine ligase
(enzyme d‟E. Coli qui, en présence d‟ATP, reconnait et lie la biotine sur l‟acide aminé
souligné) (de Boer et al, 2003).
Nous avons donc vu qu‟il est difficile de concilier à la fois liaison orientée et liaison
covalente. Pourtant, les protéines, et spécialement les protéines membranaires, sont orientées
pour accomplir leurs fonctions biologiques. L‟adhésion cellulaire nécessite la résistance à des
forces, ainsi que le contrôle du nombre de protéines actives. L‟étude de l‟adhésion cellulaire a
donc besoin d‟une méthodologie simple pour fonctionnaliser les surfaces de manière orientée
et covalente.
Les systèmes adhésifs cellulaires ne sont pas des surfaces homogènes en protéines,
mais celles-ci s‟organisent en amas de protéines d‟adhésion reliées au cytosquelette. Comme
nous l‟avons vu précédemment, les cellules peuvent réagir à un stimulus interne ou externe, et
notamment sonder la topographie de leur substrat, leur rigidité, leur anisotropie et bien
d‟autres caractéristiques. Cette perception de l‟environnement peut exercer des effets
mesurables sur la dynamique et la fonction cellulaire. Les réponses engendrées par ces
signaux physiques peuvent être locales et affecter directement le site d‟adhésion, ou globales
et activer des voies de signalisation qui régulent des processus cellulaires comme la
croissance, la différentiation ou la mort cellulaire programmée. Les mécanismes à la base des
signaux engendrés par l‟adhésion cellulaire suscitent des questions intéressantes comme : à
quelles échelles temporelles et spatiales se produisent ces événements de signalisation ?
59
Comment les interactions moléculaires diverses sur les sites d‟adhésion sont régulées ?
Comment les caractéristiques physiques des surfaces adhésives activent des voies de
signalisation spécifiques ? Les voies de la physico-chimie décrite précédemment nous
donnant de formidables outils pour répondre en partie à ces questions, généralement en les
combinant entre elles. Et le contrôle de plus en plus précis de la biofonctionnalisation de
surface nous aide à mieux comprendre la perception du micro et nano-environnement des
cellules.
Les études combinant la chimie de surface et la biologie cellulaire ou moléculaire ont
révélé une très grande sensibilité des cellules aux caractéristiques de leur environnement. Ces
caractéristiques incluent à la fois la nature chimique des surfaces adhésives, la distribution
spatiale précise et contrôlée du micron au nanomètre des molécules d‟adhésion, ainsi que les
propriétés physiques des surfaces comme la topographie, la rigidité ou la dimensionnalité.
3. Chimie et géométrie
Comme nous l‟avons vu précédemment, il est essentiel, dans l‟élaboration de surfaces
bio-adhésives d‟optimiser la spécificité des contacts cellulaires par la passivation des espaces
non fonctionnalisés. Les polyéthylènes glycols (PEG) sont les molécules les plus utilisées
aujourd‟hui. La concentration surfacique moyenne et la densité spatiale des ligands adhésifs
sur des surfaces recouvertes de PEG doivent être contrôlées pour promouvoir l‟adhésion
spécifique de ces ligands. La fixation chimique des ligands adhésifs sur les PEG a aussi été
utilisée pour créer des plateformes adhésives (Massia & Hubbell, 1991). Dans ce travail,
l‟augmentation de densité en surface de peptides Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr (GRGDY) est
corrélée à la formation de point focaux d‟adhésion, au déclenchement de l‟étalement cellulaire
et à l‟activation de signaux de survie. L‟utilisation dans cette étude de molécules de PEG
fonctionnalisées avec les peptides GRGDY peut présenter l‟avantage de la flexibilité des
liens permettant l‟enrichissement local de ligands. Cette biofonctionnalisation peut cependant
être parfois trop flexible, pas assez ordonnée pour permettre l‟arrangement adéquat des
ligands nécessaire à la structuration de points focaux.
L‟organisation des ligands à l‟échelle du micromètre peut être réalisée par
micropatterning. Cette approche consiste à créer des zones couvertes de molécules présentant
un espacement régulier de dimensions micrométriques (0,5µm à plusieurs dizaines de µm).
Les principales techniques de micropatterning sont le microcontact printing, la
photolithographie, et la lithographie dip-pen.
60
Le microcontact printing (Figure 27) (de la Fuente et al, 2006) est un processus de
transfert de matériel d‟un tampon en élastomère souple ayant des motifs en reliefs vers un
substrat. La zone transférée sera la zone de contact entre le tampon et le substrat. Dans un
masque creusé avec les motifs (a) est créé le négatif 3D de ce masque par moulage avec une
solution de polydiméthylsiloxane (PDMS) (b) : c‟est le tampon. Ce tampon est ensuite incubé
avec le matériel d‟intérêt (c-d) puis appliqué sur la surface d‟intérêt (e). Par un contact très
précis et contrôlé, le matériel du tampon est transféré sur la surface (f) et le motif est créé. Le
matériel et le substrat peuvent être de différentes natures. La plupart des combinaisons
surfaces activées – molécule de fonctionnalisation décrites précédemment peuvent être
utilisées pour créer des motifs à toutes les étapes de la biofonctionnalisation. Une attention
toute particulière doit cependant être prise durant la stratégie de création de motifs sur les
zones de la surface où aucun motif n‟a été transféré : elles restent en effet actives et peuvent
réagir avec les différents produits que l‟on incubera dans la suite de l‟expérimentation.
.
Figure 27 : microcontact printing.
La photolithographie (Figure 28), développée à l‟origine pour les matériaux semi-
conducteurs, est un procédé pour transférer des motifs géométriques d‟un photomasque sur un
substrat par irradiation UV. Le substrat est recouvert d‟une couche photosensible (a) puis
irradié par une lampe UV à travers un photomasque (b).
La couche photosensible, après exposition aux radiations, peut voir sa composition
chimique modifiée ; elle peut devenir alors soluble et être éliminée. On obtient ainsi le
transfert des motifs du masque (c) sur le substrat. Le substrat peut ensuite être activé et le
matériel d‟intérêt greffé (d-e). L‟élimination du reste de la couche photosensible conduit à la
création de motifs du matériel d‟intérêt sur le substrat (f).
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
61
Figure 28 : photolithographie.
La lithographie dip-pen (Figure 29) est une technique dérivée de la microscopie à
force atomique (AFM). En effet, la pointe de l‟AFM (plume), d‟abord immergée dans la
solution d‟intérêt (encre), est ensuite mise en contact avec le substrat (papier). Cette technique
permet, par le contrôle du mouvement de la pointe d‟AFM, de « dessiner » le motif
géométrique désiré. Elle met à profit la formation du ménisque entre la pointe de l‟AFM et le
substrat lors de l‟écriture, qui a pour effet de concentrer la molécule d‟intérêt et d‟accélérer
son transfert.
Figure 29 : lithographie dip-pen.
Les travaux très élégants développés depuis de nombreuses années dans groupe de G.
M. Whitesides sur le greffage de protéines de la MEC ont permis, en collaboration avec D.
Ingber des avancées importantes dans la compréhension des relations cellule-MEC. Dans une
étude récente, le greffage de la fibronectine a été réalisé par microcontact printing sous forme
d‟îlots de tailles et d‟espacements différents (Xia et al, 2008)., Ces ilôts, circulaires ou
ellipsoïdaux, ont des tailles allant de 1µm à 8µm, et des espacements de 1µm, 3µm ou 4,5µm.
Cet arrangement a été conçu pour tester si le positionnement spacial des points focaux
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
(a) (b) (c)
62
gouverne la directionnalité d‟étalement et de migration cellulaire. Des fibroblastes de souris
(NIH 3T3) ont ensuite été ensemencés sur les différents substrats : l‟alignement cellulaire est
contrôlé par l‟arrangement des filaments d‟actine et la vinculine suit aussi la forme et la
répétition de ces îlots (Figure 30). L‟alignement des cellules a été observé dès 50 min, alors
que les effets sur l‟élongation proprement dite ne sont observables qu‟après 8 h d‟incubation.
Ces travaux suggèrent que le mouvement cellulaire directionnel peut être contrôlé par un
mécanisme qui implique des interactions physiques locales et globales entre cellule et MEC.
La composition chimique des points focaux est différente dans les différents endroits à travers
la cellule : la vinculine est distribuée de façon relativement uniforme tandis que d‟autres
molécules comme Rac activé ne sont présentes que dans les points focaux périphériques.
Figure 30: Epifluorescence de fibroblastes de souris NIH 3T3 cultivés 8 heures sur différents îlots de
fibronectine-rhodamine (magenta). Les interactions entre le cytosquelette et intégrines sont marquées par
des anticorps anti-vinculine fluorescents (vert). Inserts : agrandissements montrant la colocalisation de la
vinculine et de la fibronectine-rhodamine (en blanc), et correspondant aux images de gauche.
Même si le micropatterning fournit de précieuses informations pour rendre compte de
l‟importance de la géométrie de la MEC, un contrôle plus précis des distances inter ligands
dans une gamme de 20 à 200 nm est nécessaire pour mimer les échelles de longueurs
retrouvées dans les structures adhésives. Un tel contrôle est désormais possible grâce au
développement incessant ces dernières années des nanoparticules.
63
Pour obtenir une résolution nanométrique, Spatz et ses collaborateurs ont mis au
point une méthode de nanolithographie utilisant des micelles de copolymères diblocs avec un
coeur de nanoparticules métalliques (généralement de l‟or) de 1 à 15 nm de diamètre Ce
procédé permet l‟organisation très régulière, contrôlée, des nanoparticules avec des distances
inter-particules ajustables entre 30 et 160 nm imposées par la longueur des copolymères. Ces
surfaces ont été préparées avec l‟objectif l‟évaluer l‟importance de l‟organisation 2D des
ancrages entre cellule et MEC. Les nanoparticules ont été fonctionnalisées avec des peptides
adhésifs (RGDFK-thiols, par exemple). La culture de fibroblastes sur de telles surfaces
indique que les cellules sont sensibles à la variation de distance. Les cellules s‟étalent, se
multiplient et adoptent un phénotype faiblement migratoire lorsque la densité de ligands est
élevée et ce jusqu‟à des distances entre nanoparticules <58nm ; elles ne s‟étalent que
faiblement, migrent rapidement et aléatoirement, et éventuellement entrent en apoptose pour
des distances interparticulaires > 73nm. Ceci suggère qu‟une organisation spatiale du réseau
de molécules de MEC et d‟intégrines est essentielle pour la structuration du cytosquelette et
des molécules associées à la signalisation via les intégrines. Les réponses cellulaires sont
différentes sur des surfaces fonctionnalisées par des cadhérines, pour lesquelles l‟adhésion
linéairement décroissante a été corrélée avec un espacement croissant des molécules de N-
cadhérine, ce qui suggère des mécanismes de transduction de signaux distincts pour ces
différents systèmes adhésifs (Wolfram et al, 2008).
64
65
OBJECTIF DU TRAVAIL
L‟adhérence cellulaire gouverne la morphogenèse et l‟intégrité des tissus biologiques,
ainsi que la communication entre les cellules et leur environnement. Une dérégulation de cette
adhérence peut avoir de lourdes conséquences pour l‟organisme et conduire à de nombreuses
pathologies, et en particulier à l‟apparition de cellules cancéreuses. L‟adhérence nécessite
donc une régulation fine, très précise. Les premiers acteurs de cette régulation sont les
récepteurs adhésifs qui, comme nous l‟avons vu, sont constitués de 4 familles principales.
Dans ce travail, nous avons centré notre intérêt sur les cadhérines.
Les cadhérines ont été découvertes, il y a une trentaine d‟années. De nombreuses
études utilisant des approches diverses (invalidation de gènes, patrons d‟expression in vivo,
biologie moléculaire, biochimie, immunologie, biophysique, études structurales, étude
cellulaire de l‟adhésion, suivi par vidéo-microscopie de protéines fluorescentes,…) ont permis
des avancées notables dans le domaine. Leurs rôles essentiel en biologie et notamment leur
importance dans le développement embryonnaire et la signalisation intracellulaire sont
maintenant bien reconnus. Néanmoins de très nombreux points restent à éclaircir comme la
façon dont elles établissent des interactions spécifiques, dont ces interactions participent à la
mécanotransduction de signaux, ou enfin la nature de la signification biologique de la
diversité des membres de cette famille de protéines.
Pour étudier les cadhérines et leur mode d‟association et de fonctionnement, nous
avons fait le choix de nous focaliser sur la E-cadhérine et la cadhérine-11, utilisées
respectivement comme prototypes des cadhérines classiques de type I et II. La E-cadhérine
joue un rôle pivot dans la formation et le maintien des structures épithéliales ; la cadhérine-11,
considérée comme un récepteur adhésif mésenchymateux, est retrouvée sur les cellules
dérivées du mésoderme (ostéoblastes, neurones,..) et son expression est corrélée avec la
migration cellulaire et la formation de nouvelles structures.
Mon travail de thèse a pour objectif premier d‟étudier, à l’échelle unimoléculaire, la
dynamique de l‟échange de brin entre cadhérines ; plus précisément j‟ai cherché à
identifier les éléments clé structuraux qui différencient l‟établissement de l‟interface adhésive
des cadhérines de type I et II. Pour mieux appréhender le rôle de ces molécules dans la
mécanotransduction du signal et la dynamique de formation des points de contacts, le
deuxième objectif a été de réaliser des surfaces biomimétiques.
66
Ce travail a été centré sur les deux modules les plus externes dans le segment
extracellulaire des cadhérines, qui sont le siège du premier contact physique lors de
l‟interaction entre ces molécules. Nous avons utilisé des fragments extracellulaires de la E-
cadhérine (E/EC1-2) et de la cadhérine-11 (11/EC12) pour étudier les paramètres physico-
chimiques de l‟interaction par l‟utilisation d‟une chambre à flux laminaire.
Dans une première partie, sont d‟abord présentés les résultats obtenus sur le fragment
E/EC1-2, ainsi que sur un fragment présentant une mutation ponctuelle sur le Tryptophane2
(E/W2A) et sur la T-cadhérine (T/EC12). La très grande sensibilité de cette méthode a permis
de mettre en évidence à l‟échelle unimoléculaire la complexité de l‟échange de brin au
niveau cinétique. Le rôle de catalyseur joué par le Tryptophane2 a été mis en avant, à la fois dans
la formation et dans la stabilité de cette interface adhésive. Nous avons caractérisé pour la
première fois un intermédiaire réactionnel de cette interaction qui nous a conduit à proposer un
mécanisme moléculaire pour rendre compte de la dynamique de formation des jonctions (Article I).
L‟analyse du comportement de la cadhérine-11 par cette même approche a permis de révéler que les
processus de formation de l‟échange de domaine sont fondamentalement différents entre cadhérines
de type I et II (Article II). Ces différences dans les mécanismes adhésifs sont très probablement à
relier aux fonctionnalités biologiques différentes de ces molécules.
Dans une deuxième partie, je présenterai le travail concernant le greffage des
fragments de protéines sur des surfaces de verre pour répondre aux exigences d‟une
biomimétisation optimisée. Ce travail de chimie de surface a conduit à la mise au point d‟un
protocole de greffage des protéines portant une étiquette hexahistidine de façon orientée et
covalente (Article III). L‟intérêt de l‟utilisation de surfaces modèle dans le décryptage des
voies de signalisation initiées en surface par les cadhérines est relaté dans une synthèse
bibliographique avec la mise en évidence de l‟activation de Stat3 par des surfaces décorées
par des fragments EC12 de cadhérines.
67
ARTICLE I : TRYPTOPHAN 2: THE CADHERIN FEELER,
FINDING THE WAY FOR THE TRANS INTERACTION
68
69
Pour progresser dans la compréhension des mécanismes moléculaires de l‟adhésion
des cadhérines, nous avons choisi d‟étudier les paramètres cinétiques de cette interaction à
l‟échelle de la molécule unique.
Nous avons dans ce travail concentré notre intérêt sur un acide aminé situé à
l‟extrémité N-ter du domaine EC1, le Trp2. Ce résidu est conservé au niveau de toutes les
cadhérines classiques de type I et II ainsi que les cadhérines desmosomales. Son rôle dans
l‟activité adhésive semble être particulièrement important. En effet, la mutation du Trp2 en
Ala abolit l‟activité adhésive des cadhérines au niveau cellulaire (Tamura et al, 1998b) ainsi
que sur les protéines isolées (Perret et al, 2002b; Pertz et al, 1999a). De plus, l‟ajout d‟un
analogue de la chaîne latérale du Trp, l‟I3A, inhibe l‟adhésion à la fois au niveau cellulaire
(Tamura et al, 1998b) et sur des protéines purifiées (Perret et al, 2002b). Enfin, in vivo, la
mutation du Trp2 sur la N-cadhérine conduit, chez le poisson zèbre, à un développement
anormal de l‟embryon (Malicki et al, 2003).
Les données structurales mettent en évidence l‟importance de cet acide aminé dans le
fonctionnement moléculaire des cadhérines. Dans ces études, la chaîne latérale du Trp2 vient
se loger dans une poche hydrophobe formée en particulier par l‟alanine 80 du motif HAV
(Histidine - Alanine - Valine) au niveau du domaine EC1. Cependant deux types de
positionnement ont été observés : soit un ancrage intramoléculaire, soit un ancrage réciproque
dans la cavité hydrophobe de la molécule partenaire. Le Trp2 participe ici directement à
l‟interaction adhésive et à l‟échange de brin . La façon dont cet acide aminé est impliqué
dans l‟interaction adhésive reste donc encore imprécise, et c‟est ce point que nous avons
essayé de clarifier dans le travail qui suit.
Pour ce faire, nous avons utilisé la chambre à flux laminaire qui s‟est déjà révélée
comme un outil puissant pour étudier les interactions dynamiques des cadhérines (Perret et al,
2002a; Pierres et al, 1998b). En chambre de flux, méthode développée indépendamment par
T . Springer et P. Bongrand, les protéines nécessitent d‟être fixées sur des surfaces modèles :
des billes et la surface constituant le fond de la chambre (Pierres et al, 1998a). Cette condition
présentait un double avantage dans le cas particulier des cadhérines. D‟une part, le fait d‟avoir
des protéines fixées sur des surfaces permet de contourner la difficulté posée par l‟éventualité
d‟homoassociation en solution. D‟autre part, ces protéines sont transmembranaires, nous nous
70
plaçons donc dans des conditions similaires à celles du contexte biologique. Les deux surfaces
sont ensuite amenées en contact à l‟aide d‟un faible écoulement laminaire. Ce système
minimaliste recrée l‟approche de deux cellules exprimant des cadhérines à leur surface, tout
en éliminant pour le moment les paramètres non contrôlables (tels que le nombre de
molécules impliquées, la formation de plaque, le cytosquelette d‟actine, les mouvements
membranaires, …).
Ces billes sont ensuite injectées dans la chambre aux dimensions millimétriques. Le
flux est laminaire et l‟on peut donc corréler la vitesse des billes avec leur hauteur dans la
chambre. A proximité du fond de la chambre seront les billes les moins rapides, c‟est à dire
celles susceptibles d‟interagir avec la paroi. L‟analyse des trajectoires de ces billes nous
renseigne sur les propriétés dynamiques de l‟interaction cadhérines. En effet, la fréquence
d‟arrêt est directement proportionnelle à l‟association (kon) de l‟interaction (Pierres et al,
1998b). La durée des arrêts des billes nous permet de caractériser la dissociation (koff) de
l‟interaction; enfin la variation de la vitesse du flux permet de faire varier la tension appliquée
sur la liaison et ainsi la détermination du spectre de force de l‟interaction (Perret et al., 2002).
De plus, en diminuant suffisamment la densité de protéine sur la lame de mica, il est possible
de mesurer des interactions à l‟échelle de la molécule unique.
Nous verrons dans le travail suivant que cette méthode est suffisamment performante
pour sonder l‟influence d‟un seul acide aminé. Dans ce manuscrit, nous avons comparé les
dynamiques d‟adhésion des fragments sauvages de E-cadhérine (E/EC12) avec les mêmes
fragments dont le Trp2 a été muté en Ala (E/W2A). Nous montrons ainsi que le Trp2 favorise
non seulement la stabilité mais aussi l‟initiation de l‟interaction entre cadhérines, en agissant
sur la formation des contacts. Le confinement de ces deux protéines recombinantes sur l‟une
ou l‟autre surface dans la chambre a permis l‟analyse d‟interactions hétérophiles : ici le Trp2
et la poche hydrophobe sont présents sur une surface et la surface opposée ne possède que la
poche hydrophobe Nous avonsmis en évidence , par ces expériences, un intermédiaire
réactionnel dont les propriétés dépendent de la molécule initiatrice de l‟échange de brin.
Enfin, cette interaction asymétrique analysée sur des contacts bille-cellule renforcent cette
observation : ces mêmes billes recouvertes du fragment E/EC12 sont rapidement internalisées
par des cellules exprimant la E-cadhérine, alors que le fragment E/W2A, par la seule
différence sur le Trp2, permet une immobilisation mais n‟induit aucun recrutement
membranaire.
71
Tryptophan 2: the cadherin feeler, finding the way
for the trans interaction
Sébastien Chevalier$, Olivier Courjean
$, Emilie Perret
1, Pierre Bongrand
2,
Hélène Feracci
Centre de Recherche Paul Pascal, CNRS UPR 8641, 115 Avenue Albert Schweitzer, 33600 Pessac,
France
1Present address: INSERM U854, Hôpital Bicêtre, 80 rue du Général Leclerc, 94275 Le Kremlin-
Bicêtre, France
2INSERM UMR 600-CNRS UMR 6212, 163, avenue de Luminy, 13288 Marseille Cedex 09, France
Corresponding author
$These authors contributed equally to this work
72
Introduction
A wide variety of physiological processes are the reflection of interactions between
macromolecules, especially between proteins. Adhesion between cells is one of such
processes, essential for tissue morphogenesis and maintenance of adult structures. Classical
cadherins are plasma membrane receptors that mediate cell-cell adhesion through homophilic
Ca2+
-dependent interactions (Nollet et al, 2000; Takeichi, 1988b). E-cadherin, the epithelial
prototype, is a transmembrane glycoprotein of which the extracellular segment contains five
EC modules (numbered 1 to 5 from the outermost domain) separated by interdomain Ca2+
binding sites (Courjean et al, 2008) and is responsible for adhesive interactions with E-
cadherins on the surface of opposing cells. Following the transmembrane segment, an
intracellular domain of about 110 amino acids is important for anchoring to the actin
cytoskeleton via , and p120 catenins and in the clustering of surface cadherins to form
junctional structures. This association is the starting point of intracellular signalling
(Gumbiner, 2005; Ozawa et al, 1989; Raptis et al, 2009; Reynolds et al, 1994; Shibamoto et
al, 1995; Takeichi, 1990; Yap & Kovacs, 2003).
Cadherins biological properties rely at least in part on the extracellular segment where the
first events of protein interactions take place. Structural studies of the extracellular cadherin
segment as well as sequence alignments indicate that each individual repeat EC is composed
of seven anti-parallel -strands arranged as two opposing sheets (Patel et al, 2003a).
However, it is in the interactions between cadherin domains where much controversy has
emerged. Crystal structure analyses of classical cadherins show that these proteins interact at
the most distal of five extracellular domains, called EC1 (Boggon et al, 2002; Haussinger et
al, 2004; Shapiro et al, 1995). Other studies suggest that strong adhesion could only be
produced by more extensive interactions along the extracellular arms (Bayas et al, 2006;
Perret et al, 2004).
Much effort has been spent to reveal the atomic details of cadherins adhesive interactions. But
despite numerous structural data, the adhesive interface corresponding to the cadherin trans
interaction was for long under debate. The first model for cadherin-mediated interactions
proposed that cadherin cis-dimers on opposing cells form a zipper-like superstructure
(Shapiro et al, 1995). However, the crystal assemblies of the pair EC12 domains of both N-
and E-cadherins did not fully confirm this picture (Nagar et al, 1996; Pertz et al, 1999b).
More recently, a novel model for cadherin-mediated adhesion has been proposed based on the
crystal structure of the entire ectodomain EC15 of C-cadherin (Boggon et al, 2002). Trans
interactions between the ectodomains were proposed to imply the -strand exchange assigned
73
to the cis interaction in earlier work. This -strand exchange was then observed between E-
cadherin two EC12 fragments by x-ray crystallography and NMR (Haussinger et al, 2004)
(Figure 1a). A definitive biological interpretation is difficult because crystal-packing forces
are of similar size or even larger than the weak physiological interactions.
Numerous lines of evidence support the idea that the outermost cadherin module is essential
in mediating the adhesion between cadherin molecules (Chappuis-Flament et al, 2001;
Harrison et al, 2005a; Shan et al, 1999; Tomschy et al, 1996; Zhang et al, 2009). Some highly
conserved residues of the EC1 modules of classical cadherins are essential for adhesive
function (Fig 2). In particular, replacement of Trp2 with Ala (W2A) or Ala80 with Ile
abrogates the cadherin adhesive capacity at the cell surface (Noe et al, 1999; Pertz et al,
1999b; Tamura et al, 1998a). More precisely, the HAV sequence located at the C-terminal
region of domain EC1 and conserved residues surrounding it contribute to the formation of a
hydrophobic pocket (Blaschuk et al, 1990; Tamura et al, 1998a) where the Trp2 docks into.
Divergent interpretations have been proposed from the successive structural studies.
However, various recent studies suggested that the different images obtained by x-ray
crystallography correspond to different steps of the -strand exchange process leading to
cadherin-cadherin interaction: intramolecular docking of Trp2 corresponds to the monomeric
conformation, while the trans dimer is achieved by -strand exchange (Chen et al, 2005;
Harrison et al, 2005b; Troyanovsky, 2005).
Flow chamber measurements have proven to be valuable tools for resolving dynamic
parameters of receptor-ligand interactions (Pierres et al, 2002; Robert et al, 2007). In an
attempt to dissect the cadherin-based adhesive interactions, we have recently used this
methodology to determine the overall adhesive properties of the extracellular cadherin
segment (Perret et al, 2002a; Pierres et al, 1998b; Pierres et al, 2007). Here we used the flow
chamber operated under very low shear rate and enhanced detection sensitivity as a powerful
molecular approach to probe the contribution of the Trp2 in the dynamics of the -strand
exchange of the E/EC12 fragment at the single molecule level. By comparison, we also
probed the behaviour of a recombinant protein bearing a Trp2 to Ala2 point mutation as well
as of a T/EC12 where the Trp2 is not conserved on the wild-type protein. We were thus able
to demonstrate the occurrence of a Trp2 docking with a fast kinetics that precedes a
previously described longer interaction step of the two outermost domains. Our observations
i) provide a mechanism for the involvement of Trp2, which acts as a feeler, in the cadherin
trans interaction, ii) suggest that we have for the first time revealed a reaction intermediate
involving only the strand of one molecule, iii) the strand of the second molecule appears to be
necessary to fully accomplish the adhesive contacts, as documented by cell-beads
74
interactions. Our results also provide new detailed insights into the dynamics involved in
regulating epithelial cell-cell adhesion.
Materials and Methods
Plasmid constructs
Cloning of the MIEGR-E/EC12 has been already described (Courjean et al., 2008). The
construct coding for the cleavable protein MIEGR-E/W2A, which corresponds to MIEGR-
E/EC12 mutated in W2A, was realized using the same strategy. First, an intermediate
construct was obtained by cloning the first part of the sequence coding for HisXa-
ECAD12W2A, kindly provided by Thomas Ahrens and J. Engel (Haussinger et al. 2004).
DNA fragments were cloned from pET19b (HisXa-ECAD12W2A) plasmid into the pET24a
(M-E/W2A) plasmid (Perret et al., 2002), using the BglII / EcorI sites and resulting in
sequences coding for HisXa-E/W2A, fused with the histidine tag in C-terminal position. Then
the fragments coding MIEGR-E/W2A was cloned from the previous plasmid in a pET24a
plasmid using the XhoI / NdeI site.
Prior to the expression of the proteins, the cDNA constructs were sequenced to verify that
mutations had not arisen during polymerase chain reaction.
Protein expression and purification
The E-cadherin fragments used in this study are displayed on Figure 2a. For MIEGR-E/EC12
and MIEGR-E/W2A chimeric proteins purification, Terrific Broth media cultures of 500 ml
containing 50µg/ml kanamycin were inoculated with transformed colonies picked up from
agar plates. Expression was induced by the addition of IPTG, then after 2h, cells were
harvested and stored at -70°C. Cell pellets were resuspended in lysis buffer (4M urea; 50mM
Na2HPO4 pH 7.8; 20mM imidazole and 20mM -mercaptoethanol). The fusion proteins were
purified by affinity chromatography of crude bacterial lysates on Ni2+
-NTA Superflow
(Qiagen), followed by extensive dialysis to remove imidazole. Cadherin fragments were
eluted with 0.25M imidazole. These constructs produced two proteins with a factor Xa
protease site (Ile-Glu-Gly-Arg) directly before the N-terminus sequence. Cleavage of these
fusion proteins with the Factor Xa protease yielded proteins with the correct N terminus.
Factor Xa protease digestion of 1mg of MXa-E/EC12-His or MXa-E/W2A-His chimeric
75
proteins was performed in 1mL Tris 20mM, NaCl 50mM, CaCl2 1mM, pH6,5 with 50U
(Qiagen), during 60h at 16°C. The reaction was stopped by addition of leupeptin and
removing the Factor Xa enzyme using Xa Removal Resin (Qiagen). The cleaved fragments
were then dialysed against Tris 20mM, NaCl 150mM pH8 using Amicon Ultra 15, cut off
10kDa (Millipore) in order to remove Ca2+
ions and the cleaved peptide. The resultant
proteins were named E/EC12 and E/W2A respectively. A Cter hexahistidine tagged
recombinant protein corresponding to the outermost T-cadherin domains T/EC12 was kindly
provided by L. Shapiro and B. Honig (Posy et al, 2008).
Protein concentration was determined spectrophotometrically by absorbance measurements at
280nm. The absorbance coefficient was evaluated on the basis of amino acid composition
using ProtParam tool, provided by ExPaSy web site (http://expasy.ch). Following purification,
proteins purity was checked by SDS-PAGE, western blotting as described (Perret et al,
2002a), and mass spectrometry.
Circular Dichroism
Circular dichroism spectra were recorded at 20 °C in a solution containing 20 mM Hepes and
150 mM NaCl (pH 7), using a Jasco 810 spectropolarimeter with quartz cells with a path
length of 0.2 mm. The protein concentration was 1.2 mg/mL. Spectroscopic studies of
structural modifications were performed by adding aliquots of a Ca2+
stock solution to the
Ca2+
-depleted protein, to a final Ca2+
concentration of 1 mM. Spectra were recorded by
subtracting the background due to the buffer signal.
Mass Spectrometry
ESI-ToF mass spectrometry was performed on a Waters LCT Premier instrument in the
positive mode. 20µL of a 20µM cadherin solution was extensively washed in a
Trifluoroacetic acid (TFA) 0.1% in water and then directly injected in the mass spectrometer.
Preparation of substrates for the flow chamber experiments
Streptavidin coated beads (2,8 µm diameter, 1,3 g/l density, Dynabeads M280, Dynal) were
incubated (~ 8.108 beads/ml) at 37°C for 30 min with 10 µg of biotinylated rat anti-mouse Ig
mAb (Pharmingen) then with 10µg of mouse anti-histidine mAb (clone His-1, Sigma). Finally
76
beads were incubated with the recombinant E/EC12, E/W2A or T/EC12 fragments, for at
least 1h. Prior using in adhesion experiments, beads were washed in 20 mM Hepes, 150 mM
NaCl, pH7.
Freshly cleaved mica surfaces (Muskovite mica, Metafix, Montdidier, France) were incubated
with 1mM NiCl2 (Sigma) for 1 min. Cadherin fragments were diluted to the desired coating
concentration in binding buffer (Hepes-NaCl) and deposited on each mica surfaces for 1h at
RT. Surfaces were then washed with Hepes-NaCl. Before use in laminar flow assays, beads
and slides were incubated for 15min with1mM CaCl2 in Hepes-NaCl. Experiments were
performed in Hepes-NaCl, with1mM CaCl2, BSA 0.2% at RT.
Interaction lifetime measurements were carried out with saturated beads (6900
molecules/µm2) and with a binding site density on mica of 50-100 molecules/µm
2, as
described previously (Perret et al, 2002a). Such conditions allowed optimal attachment
frequency and unimolecular measurements.
Laminar flow adhesion assays
Flow chamber: Chambers were assembled as previously described by applying molecularly
smooth mica sheets against a plexiglas block with a cavity of 0.1 x 6 x 20 mm3 (Satim,
Evenos, France). The chamber was set on the stage of an inverted microscope (Axiovert 135,
Zeiss, Germany) bearing a long-distance 40X dry objective (n.a. 0.55) and a CCD camera
(WV-BP 310/G, Panasonic) connected to a Time Lapse Video Recorder (AG 6730,
Panasonic) and a videotape recorder for delayed analysis. Typically, 1 mL of bead suspension
(10 million/ml) was driven through the chamber with a 5ml syringe mounted on a syringe
holder (Rasel, Stamford CT, supplied by Bioblock, Illkirch, France).
Particle tracking: Videotapes were digitized using a Pinnacle‟s DV500 PCI card (Pinnacle
Systems, Inc, Chatillon, France). The movies were exported in sequences of numbered files.
Then, a 20 millisecond time resolution was obtained by separating the interlaced fields
forming each image. Bead trajectories were recorded using the Metamorph tracking option
(Universal Imaging Corp.). Pixel size was 0.37 µm. On each field, the sphere centre of gravity
was determined with 0.040 µm accuracy. Also, the trajectories were checked to detect
artefactual events such as sphere collisions or doublet formation. In a typical experiment,
about 1500-2500 particle trajectories were recorded, amounting to about 500000-1000000
events, defined as sets of three parameters: time, x and y coordinates of the sphere centre.
77
Data analysis
Arrest definition: A custom-made software was used to analyse particle trajectories and to
detect arrests. A sphere was defined as arrested when it moved by a distance lower than a
threshold during the following time period . Due to the occurrence of Brownian motion of
flowing spheres, it cannot be ensured that a particle arrest represents an actual binding event
rather than a random velocity fluctuation (Pierres et al., 2001). More precisely, particle
motion depends on its bound/unbound state and displacement of a moving particle, during a
time t, can be defined as following:
CBtzux hmoving )(
Where uh(z) is the local hydrodynamic velocity of a sphere, in absence of diffusion. This
velocity depends on the wall shear rate and the distance z between the particle and the floor of
the flow chamber. B is a random displacement along the flow direction due to Brownian
motion. C is a random apparent displacement due to error in determining the centre of the
particle (originating from tracking device). When the particle is arrested, due to a molecular
interaction, its displacement is reduced to:
xarrested B'C
B‟ corresponds to a confined Brownian motion of the bead around the anchoring position on
the mica sheet. Since the component C is due to the uncertainty in optical/video detection of
the particle position, this variable does not depend on t. It can be assumed that the
distribution function of xarrested is limited in a range tighter than the dimension of the particle.
This assumption was verified experimentally (Figure 3). The component B correspond to a
random diffusive displacement, varying as tDx . Dx is the diffusive coefficient along
the flow direction. Consequently, it is possible to discriminate between arrested and moving
particles by measuring displacement during a sufficient time t from which it is mainly
observed that: movingarrested xx .
We determined experimental distributions of particles displacement for various values of t
(20, 40, 80, 120, 160, 200, 240ms) in order to choose acceptable values for and (Figure
3).This distribution was determined for all our experiments, showing a good homogeneity of
our data. In particular, we verified experimentally that the minimal period of time , allowing
separating the part of arrested particles from the moving ones, only depends on the wall shear
78
rate, but not on the nature of proteins covering the beads and mica surfaces. The choice of
and is also critical because these parameters define the average minimal duration of
detectable arrest (dm) and the average shift between apparent (da) and true (dt) arrest duration,
introduced by this way of detecting arrests.
vdd
vd
ta
m
2
v is the mean velocity of sphere flowing close to the chamber floor. Since one of our goals is
to detect short arrests, we need to choose the shortest acceptable that is to say the minimal
t allowing to discriminate between arrests due to a cadherin interaction and random
fluctuation of velocity. The parameter was chosen to be the maximal displacement of
arrested particles (Figure 3). When the wall shear rate was of order of 8-10 s-1
, optimal results
were obtained by using = 0.31 µm and = 0.12 s, resulting in: dm = 68 ms and dt = da + 17
ms.
Although we can observe arrests with apparent duration (da) of 20ms, many of them are not
detected. We chose to only retain arrests da 40ms. By doing so, we obtained a very limited
underestimation of the number of short arrests.
Binding frequency: The binding frequency was used to reflect the binding efficiency as
previously described (Perret et al., 2002). It was thus determined by dividing the number of
arrests Ns(t=0), obtained by extrapolation using the best fit of the detachment curve, by the
total duration of motion of particles meeting the aforementioned velocity limitation.
Detachment curves and simulations: By plotting the number of particles remaining bound
versus time, we could determine characteristic durations of interactions. To fit the
experimental data, we built P(t), the probability for a complex to be still bound. P(t) is the
sum of the probability for the different bound states DI and DII; P(t=0) = 1. To adjust the
function P(t) with the experimental data, we constructed a theoretical function displaying the
number of arrests versus time:
Ns(t) = P(t) x Nexp/P(t = 57 ms)
79
Where Nexp is the number of experimental arrests detected, which corresponds to dt 57 ms.
Numerical simulations were used to fit with our experimental data with the following
mechanism:
With initial conditions: DI(t=0) = 1 and DII(t=0) = 0. The constants k10, k12 and k21 were
varied to obtain the best fit. Theoretical curves were fitted to experimental data with 2 test.
Arrest durations were grouped in eleven classes. Parameters kij were systematically varied
with a step of 1 s-1
in order to determine the values yielding minimal 2. This procedure was
repeated with a step of 0.1 s-1
to refine the minimization. Note that the threshold 2 for a 0.05
significance level is 14 when the number of degrees of freedom is 7.
Cell-bead adhesion assays
The normal mouse mammary epithelial cell line HC11 has been described (Wojcik et al,
2006) and was kindly provided by Dr. L. Raptis (Kingston, ON Canada). These cells were
used to assay the cadherin-coated beads adhesion with cells. Beads were coated with either
E/EC12 cadherin fragment or E/W2A cadherin fragment, as described in the previous section.
Cells were seeded on glass coverslips in 24-well tissue-culture test plates (105cells/well)
overnight, in RPMI (Gibco) supplemented with 10% FCS, 100 U/ml penicillin G, and
100 mg/ml streptomycin, insulin, EGF. Cell culture was conducted at 37°C in a humidified
atmosphere of 5% CO2 in air.
To perform beads/cells adhesion assays, ~ 5.105 beads were added on cells in 800µL in RPMI
and incubated for 40 min at 37°C under 5% CO2. Cells were then gently washed with 0.1 M
Na cacodylate pH 7.4 under pipette outflow and fixed with 2.5% glutaraldehyde (Sigma) in
cacodylate buffer for 90 min at 4°C. Samples were then treated with 1% osmium tetroxide,
1% tannic acid then dehydrated with a series of graded methanol/water baths, stained in 2%
uranyl acetate in 70% methanol before critical-point drying with HMDS. The samples were
sputter coated with gold and observed with a Jeol JSM 6700F Field Emission Scanning
Electron Microscope operated at 5 kV.
80
Results
We previously showed using a flow chamber device that the E-cadherin two outermost
modules (M-E/EC12) exhibit transient tethers with first-order kinetics. The unstressed
lifetime of individual E-cadherin interactions is as brief as 1-2 seconds (Perret et al, 2002a).
The cadherin fragments used in this study were expressed in E.Coli, thus had an additional
Met residue at the N-ter end. However cadherin homophilic interaction strongly depends on a
salt bridge between Glu89 and the N-ter end (Harrison et al, 2005b; Posy et al, 2008). This 1-
2 second interaction and an additional one of 0.1 second were characterized using the
biomembrane force probe (Perret et al, 2004). To specifically assess the influence of the Trp2
in the formation of the -strand exchange, our approach was to probe cadherin fragments with
a native Nter end, and modify the arrest definition resulting in a better detection of short
arrests.
Characterisation of the cadherin fragments
In order to remove the additional Nter methionine that potentially perturbs the establisment of
the -strand exchange, we introduced the sequence IEGR (Factor Xa) at the N-terminal end
(figure 2a). This sequence is specifically recognized and cleaved by the Factor Xa Protease,
providing cadherin fragments with no spare amino acid. The correct processing was checked
by mass spectrometry (figure 2b). Theoretical masses for both E/EC12 and E/W2A fragments
were calculated using the ProtParam tool from the ExPaSy web site (www.expasy.ch) and
found to be respectively 25177,0 Da and 25061,9 Da. The experimental mass values obtained
for E/EC12 and for E/W2A fragments were 25176 Da and 25061 Da, respectively indicating
that the amino acid sequence was correct and that the Nter end was similar to the wild type
proteins.
Circular dichroism was used to probe the folding of cadherin fragments. As shown in figure
2c, E/EC12 as well as E/W2A exhibited spectra characteristics of correct cadherin folding.
The mean molar residue ellipticity of both apoproteins changed when 1mM Ca2+
was added to
the protein solutions (Courjean et al, 2008). These data indicated that the W2A point mutation
did not modify the folding of the E/W2A fragment.
An optimised Flow Chamber device to detect short arrests
The interest of the flow chamber methodology is: i) to study the association of surface-
attached molecules rather than the soluble form thus achieving a molecular orientation
81
relevant to physiological conditions, ii) to allow very sensitive detection of molecular
interactions, iii) to allow confinement of molecules on surfaces making possible probing of
individual asymmetric molecular interactions. In order to improve our knowledge of the
mechanism of cadherin trans interaction, we needed to be able to detect a possible slight
effect on kinetics, due to the fact that our interest was on a single residue, i.e Trp2. More
precisely, our goal was to detect arrests as brief as possible. With this perspective, the main
difficulty was to discriminate between arrests due to true cadherin interactions and random
fluctuations originating mainly from Brownian motion. Usually, a particle is considered as
arrested at some point when the displacement during the previous period of time is lower
than the threshold distance . An optimal discrimination could be obtained by studying the
distributions of particle displacements, observed during different intervals of time t (For
more details, see Materials and Methods).
Typical plots of these distributions showed both moving and arrested particle distributions,
which were more distinguishable when we increased t. Consequently, we observed that the
minimal duration to separate these two components was 120 ms, when both surfaces were
coated with cadherin fragments. We could easily distinguish arrested particles due to a
cadherin interaction with the mica surface, which displacement is limited, from free particles.
Consequently, we are able to determine the optimal set of parameters necessary to define an
arrest due to a cadherin interaction. We verified experimentally that the choice of these
parameters depends only on the wall shear rate of the laminar flow, as expected (Data not
shown). The optimal values chosen in this study were for = 120ms and = 0.31µm and by
doing so, the minimal duration of detectable arrests was about 0.068s.
Kinetics of cadherin homophilic interaction
Binding formation
The laminar flow chamber method allowed us to probe the formation and the stability of
individual trans interaction between cadherin fragments. By measuring the arrest frequency of
coated beads flowing near coated mica surfaces, we were able to quantify the formation
kinetics of this interaction. Although this is not a direct measurement of binding rate (also
called on-rate), theory shows that binding frequency is proportional to on-rate (Pierres et al,
1998b). Then it is possible, by using our different fragments probed in identical conditions, to
consider binding frequency as a quantitative effect of their on-rate.
82
As shown in Figure 3, binding frequency between beads and mica both coated with E/EC12
was higher than between E/W2A or T/EC12, two proteins that do not bear a Trp2 even though
binding frequencies of E/W2A and T/EC12 were significantly above the background level at
low (2pN) force. These frequencies were sensitive to force, as expected. When force on the
interaction increased, binding frequency decreased from 0.023 µm-1
at 2pN to 0.001 µm-1
at
13pN. By comparison, binding frequency of E/W2A was 0.011 µm-1
at 2pN and 0,001 µm-1
à
6-7pN; binding frequency of T/EC12 was 0.01 µm-1
at 2pN and 0,0015 µm-1
à 4pN . These
data showed that Trp2 is directly involved in binding formation, at the molecular level. These
results indicated that the Trp2 clearly enhanced the formation of cadherin trans interaction.
Binding stability
Binding stability could be quantified from the duration of individual arrests, by plotting the
proportion of detected interactions as a function of time (see Materials and Methods). As
shown in Figure 3b, trans interaction between E/EC12 fragments appeared to be more stable
than between E/W2A and T/EC12. These data revealed that the Trp2 is directly involved in
the stability of cadherin interaction, which is consistent with structural and biological data.
These experimental distributions of arrest durations were fitted according to several
theoretical models. In a first series of calculations (not shown), it was checked that
experimental data displayed on Figure 3b could not correspond to a first order kinetics, with
an adjustable off-rate. Indeed, in this case, the experimental curves should be straight lines.
These results were different from those obtained by Perret and coll. (2002). Indeed, due to the
improvement of sensitivity of detection used in the present work, we were able to detect short
arrests more efficiently, then inligthening the complexity of the bound state. The simplest way
to fit these experimental data was by using a two states model. More precisely, we considered
a three-parameter model involving an intermediate binding state (see Materiel and Methods),
and the arguments are given in the Discussion section.
Mechanism of interaction between cadherin extracellular fragments
According to recent structural studies, cadherin trans interaction is achieved by a -strand
exchange mechanism, but only few details are currently available. This mechanism is simply
described as a domain swapping process: the N-ter strand is able to exchange its
intramolecular bonds to interact with the EC1 motif of the opposing molecule. The “closed”
83
monomeric conformation acts as a competitive inhibitor of dimer formation, thus lowering
affinities even though the dimer interface has the characteristics of high-affinity complexes,
and the transition from the monomeric to the dimeric conformation is limited by high
activation energy (Chen et al, 2005). Our measurements provided qualitative and quantitative
information about trans interaction between cadherin fragments. Trp2 appeared to play an
important kinetic role in this process by facilitating binding formation and increasing bond
stability. Moreover, we showed that a (at least) two bound states process was necessary to
account for the dissociation of the dimer.
The question was then to know whether the establisment of the adhesive interface between
two cadherin molecules is sequential (that is initiated by only one molecule) or whether this
process needs a simultaneous coordination of both molecules (both in an active, “open”
conformation, with the Trp2 exposed to the solvent). We made use of the flow chamber
method to probe these hypotheses by confining the recombinant proteins, E/EC12 or E/W2A,
in one surface or the other and then analyzed the heterophilic interaction under both
configurations. Because the protein density is 50-100 times much higher on the beads (6900
molecules/µm²) than on the mica (50-100 molecule/µm²) surfaces (Perret et al, 2002a), the
occurrence of proteins exhibiting an “active configuration” will be higher on the beads than
on the mica (Chen et al, 2005).
As illustrated on Figure 4a, the formation of a heterodimer by a simultaneous process requires
active monomers on both surfaces, and would be characterized by a unique binding
frequency; this frequency should likely be intermediate between frequencies obtained for
homophilic configurations (E/EC12 vs E/EC12 and E/W2A vs E/W2A). By contrast, a
sequential process will rely on the reaction pathway followed by the interacting molecules,
that is on the cadherin fragment that will initiate the interaction; due to the experimental
setup, the protein on the bead will much likely initiate the interaction. Nonetheless either
simultaneous or sequential pathway leads to the same heterodimer adhesive interface, which
obviously will exhibit the same stability.
Experimental measurements presented in figure 4b clearly showed that the cadherin
interaction is a sequential process. More precisely, binding frequencies measured for
homodimers and heterodimers configurations clearly depended on which protein was on the
beads. Unexpectedly stability of heterodimers (figure 4c) was not the same but also depended
on the protein present on the bead, which most probably initiates the interaction. Taken
together, our results provided new insights for a detailed mechanism of cadherin trans
interaction. When molecules from two opposite surfaces are close enough, one molecule in an
84
active state, initiates the -strand exchange following a sequential mechanism. The Trp2
together with other amino acids such as the residues forming the hydrophobic pocket are
directly involved in this binding initiation. Moreover, these data characterized for the first
time an intermediate state involving the -strand of only one cadherin along the energy
landscape described by Chen (Chen et al, 2005) from monomers to dimer formation.
To further probe the role of the Trp2 in this interaction, these beads decorated with E/EC12 or
E/W2A fragments were incubated with HC11 cells expressing E-cadherin on the plasma
membrane and assayed for binding activity by scanning electron microscopy (figure 5). After
40 min of incubation, both types of beads appeared associated with cell membranes.
Interestingly, 90% of E/EC12 beads appeared internalized by HC11 cells (figure 5a-c), while
90% of E/W2A decorated beads were associated with cell surface through membrane
protrusions with no internalization (figure 5d-e).
Discussion
The purpose of this study was to clarify the molecular mechanism of cadherin interaction. As
described by structural data, the adhesive interface is achieved by domain swapping and more
precisely the N-terminal -strand exchange. However little information is available
concerning the molecular mechanism of the dynamic of this swapping. The Trp2, a conserved
residue among classical and desmosomal cadherins, is essential for cadherin adhesive
interaction. This is illustrated by cellular adhesion and molecular interaction experiments
(Harrison et al, 2005a; Harrison et al, 2005b; Malicki et al, 2003; Perret et al, 2002a;
Prakasam et al, 2006a; Troyanovsky et al, 2003), and its central role in binding interface is
suggested by x-ray crystallography and NMR studies (Boggon et al, 2002; Haussinger et al,
2004; Parisini et al, 2007; Tamura et al, 1998a). Other residues of the EC1 domain that are
conserved amongst classical type I cadherins, have also been identified as key elements of the
-strand exchange (Posy et al, 2008). Altogether these observations raise the question of how
cadherin interactions are preferentially homophilic. In order to investigate further this process,
we focused on the involvement of the Trp2 in the kinetic properties of the E-cadherin
interaction. Three recombinant proteins: i) the wild-type E/EC12 fragment, ii) its domain pair
including the point mutation W2A (E/W2A), iii) the T/EC12 fragment, corresponding to the
T-cadherin outermost modules of which the wild-type sequence does not have Trp2 (Posy et
al, 2008), were probed, resulting in qualitative and quantitative information on the molecular
mechanism.
85
A relevant mechanism
Previous studies, using the flow chamber technique, clearly show the ability to probe single-
molecule binding kinetics between cadherin-11 (Pierres et al, 1998b), C-cadherin (Pierres et
al, 2007) and E-cadherin fragments (Perret et al, 2002a). In this work, the off-rate of E/EC12
interaction is determined (0.5 s-1
), further validated by NMR data (Haussinger et al, 2004).
However, biomembrane force probe studies reveal an additional interaction (off-rate 10 s-1
) on
this fragment (Perret et al, 2004). Thanks to a better detection of short arrests, the detachment
curves revealed the complexity of the dissociation which could not be described by a first
order reaction, as already suspected by considering biomembrane force probe data (Perret et
al, 2004).
Numerous studies have been performed in order to describe the adhesive cadherin interaction
(Patel et al, 2003b; van Roy & Berx, 2008). Most data using different approaches suggest that
cadherin trans interaction between EC1 domains is achieved by a unique binding interface
that involves the Trp2 (Boggon et al, 2002; Haussinger et al, 2004; Parisini et al, 2007;
Troyanovsky et al, 2003; Zhang et al, 2009). According to structural and kinetics parameters
data, Chen et al. (2005) suggested a mechanism describing general domain swapping
properties for the cadherin interaction (Chen et al, 2005). Briefly, intramolecular
configuration of the N-ter -strand, including the Trp2 docking in a hydrophobic pocket,
stabilizes the monomeric state in a “close” conformation. This conformation acts as a
competitor of dimer formation, resulting in weak binding affinity (KD = 0.72 mM)
(Haussinger et al, 2004). The dimer formation is limited by a high energy transient state
which may need the destabilization of the N-terminal -strand. By approximating cadherin
interaction as a first order reaction, the authors estimated free energies between monomeric,
dimeric and transient states. The transient state has never been characterized until now.
Experimental detachment curves presented in this study clearly showed that cadherin
dissociation occurs through a more complex process than a first order reaction. The -strand
exchange model was used as a frame to analyse the kinetic rates of cadherin interaction. Due
to the low force applied on the molecular bond (about 2 pN), we considered in first
approximation these fitted rates as spontaneous dissociation rates. Then, the simplest way to
fit the experimental data was by using a two states model, which is in good agreement with
previous biomembrane force probe studies that revealed two distinct binding states on the first
two EC motifs of E- and C-cadherin (Bayas et al, 2006; Perret et al, 2004). The two
corresponding off-rates for E-cadherin were about 10 s-1
and 1 s1. Unfortunately, it was not
86
possible, from experimental curves, to determine if this process resulted from two
independent or two successive binding states on the same reaction pathway. Altogether our
results reveal for the first time the involvement of Trp2 in the formation and not only on the
stability of the -strand exchange.
Structural studies on E/EC12 fragments with additional Nter residues describe another
adhesive interface involving the hinge region between EC1 and EC2 motifs (Pertz et al,
1999b). Interacting molecules in these crystals exhibit a parallel arrangement, without Trp2
involvement or -strand exchange. Very recently, a similar arrangement was described
between T-cadherin molecules, which do not have Trp2 and do not appear to interact via b-
strand exchange (Dames et al, 2008; Posy et al, 2008). Altogether these data strongly argue
for an involvement of the Trp2 in the dynamic of the Nter -strand exchange for classical type
I cadherins.
Finally, as cadherin interaction involves at least two bound states, they should be part of the
adhesive interface described by the -strand exchange and involve Trp2,
Trp2 and N-terminal end in the molecular mechanism of cadherin interaction
First, our measurements suggest that the binding formation is limited by a high activation
barrier. Indeed, our results showed that the conserved Trp2 is directly involved in this
process. Its mutation increased this activation barrier. Second, the energy difference between
monomeric and both bound states is weak. As previously discussed by Chen et al. (2005), this
should be due to the similar N-ter strand interactions in both monomeric and -strand
exchange conformations (Chen et al, 2005). In particular, according to the direct involvement
of Trp2 in the first bound state formation and stability and the intermediate energy level, this
intermediate state could be viewed as an incomplete -strand exchange, which is related to an
asymmetrical binding process. A potential explanation of this observation is that molecular
adjustment involves other amino acids on the N-terminal strand.
Potential roles of asymmetrical intermediate complex in cadherin adhesive function
To our knowledge, the kinetic data presented in this study are the first experimental evidence
of an asymmetrical process in the cadherin trans interaction. One advantage of this
mechanism is that the asymmetrical intermediate state favours the formation of a second state,
87
more stable, as only one activated molecule is necessary to initiate this binding. This
complexity in the interactions between cadherin extracellular segments was suggested by
electron tomography of desmosomal plaques. Indeed the main structural properties of
cadherins ectodomain are shared with classical and desmosomal cadherins: five EC motifs, a
conserved Trp2 and a putative hydrophobic pocket on EC1 (Posy et al, 2008). A first study,
using a freeze-substituted desmosomes from neonatal mouse epidermis, revealed a
desorganized three-dimentional array of cadherin molecules (He et al, 2003). Modeling of the
crystal structure of C-cadherin ectodomain (Boggon et al, 2002) onto the tomographic maps
revealed a stochastic interaction of the cadherins, which was described as three prominent
arrangements that resemble the letters W, S, and in which the molecules interact at their
Nter tips. The S shape implies the interaction between Trp2 of one molecule and the non-
active site of the neighbouring molecule without inserting Trp2 into the hydrophobic pocket
of the neighbouring molecule. Another study, using freeze-vitrified samples showed a highly
organized structure of the desmosomes (Al-Amoudi et al, 2007) as in the in vivo hyper-
adhesive Ca2+
-independent state (Garrod et al, 2005; Kimura et al, 2007). However upon
wounding in epidermis and conconfluent epithelial sheets, desmosomes adopt another state
characterized by Ca2+
-dependence and loss of the midline suggesting a less-organized
structure (Garrod et al, 2005; Kimura et al, 2007). This state was shown to mimick the
characteristic of adherens junctions, which are sentitive to Ca2+
ions. Hence it was
hypothesized that the extracellular regions of adherens junctions are naturally disorganized.
Even though these data are hypothetical they suggest the occurrence of asymmetrical
complexes at the cell surface.
Interestingly such asymmetrical, incomplete trans dimer could be the basis for the initiation of
adhesive plaques organisation. Indeed, He el al. data showed trans interactions involving both
cadherin monomers and cis dimers. Other studies using protein cross-linking and
coimmunoprecipitation demonstrated that cis cadherin dimers were formed only in cells
grown at low calcium concentrations, and that cis and trans interactions shared the same
adhesive interface (Troyanovsky et al, 2007; Troyanovsky et al, 2003; Troyanovsky et al,
2006). Data presented in this work strongly suggest that only one molecule is sufficient for
the trans interaction, giving the other molecule the capability of interacting with a third one,
then followed by the formation of a more complex oligomer. The strand of the second
molecule appears to be necessary to fully accomplish the adhesive contacts, as documented by
cell-beads interactions (this work) or cells grown on cadherin-decorated surfaces where only
E/EC12 and not E/W2A is able to initiate signalling pathways (Arulanandam et al, 2009).
Taken together, such asymmetrical cadherin trans interaction mechanism is a potential
88
molecular basis for multimolecular oligomerisation between cadherins ectodomains coming
from opposite cell surfaces and leading to the formation of adhesive plaques.
ACKNOWLEDGMENTS: This work was supported by institutional funding from CNRS,
as well as by grants from ARC (subvention libre), Région Aquitaine, Fondation pour la
Recherche Médicale, la Ligue Contre le Cancer (Dordogne). During this work, S.C. received
a doctoral fellowship from Région Aquitaine and O. C. held a BDI fellowship from the
CNRS, the ARC and from la Ligue Contre le Cancer-Oise. We are grateful to Pr L. Raptis
(Queens University, Kingston, Canada) and to Drs L. Shapiro and B. Honig (Cornell
University, New York, USA) for providing the HC11 cells and the T-cadherin fragments,
respectively. We thank Elisabeth Sellier (CREMEM, Université Bordeaux 1) for scanning
electron microscopy, Katell Bathany (IECB, Bordeaux, France) for performing mass
spectrometry measurements and I. Lascu (IBGC, Bordeaux, France) for his assistance with
circular dichroism experiments.
References:
Al-Amoudi A, Diez DC, Betts MJ, Frangakis AS (2007) The molecular architecture of
cadherins in native epidermal desmosomes. Nature 450: 832-837
Arulanandam R, Vultur A, Cao J, Carefoot E, Elliott BE, Truesdell PF, Larue L, Feracci H,
Raptis L (2009) Cadherin-cadherin engagement promotes cell survival via Rac1/Cdc42 and
signal transducer and activator of transcription-3. Mol Cancer Res 7: 1310-1327
Bayas MV, Leung A, Evans E, Leckband D (2006) Lifetime measurements reveal kinetic
differences between homophilic cadherin bonds. Biophys J 90: 1385-1395
Blaschuk OW, Sullivan R, David S, Pouliot Y (1990) Identification of a cadherin cell
adhesion recognition sequence. Dev Biol 139: 227-229
Boggon TJ, Murray J, Chappuis-Flament S, Wong E, Gumbiner BM, Shapiro L (2002) C-
cadherin ectodomain structure and implications for cell adhesion mechanisms. Science 296:
1308-1313
Chappuis-Flament S, Wong E, Hicks LD, Kay CM, Gumbiner BM (2001) Multiple cadherin
extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J Cell Biol 154: 231-243
Chen CP, Posy S, Ben-Shaul A, Shapiro L, Honig BH (2005) Specificity of cell-cell adhesion
by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand
swapping. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 8531-8536
89
Courjean O, Chevreux G, Perret E, Morel A, Sanglier S, Potier N, Engel J, van Dorsselaer A,
Feracci H (2008) Modulation of E-cadherin monomer folding by cooperative binding of
calcium ions. Biochemistry 47: 2339-2349
Dames SA, Bang E, Haussinger D, Ahrens T, Engel J, Grzesiek S (2008) Insights into the low
adhesive capacity of human T-cadherin from the NMR structure of Its N-terminal
extracellular domain. J Biol Chem 283: 23485-23495
Garrod DR, Berika MY, Bardsley WF, Holmes D, Tabernero L (2005) Hyper-adhesion in
desmosomes: its regulation in wound healing and possible relationship to cadherin crystal
structure. J Cell Sci 118: 5743-5754
Gumbiner BM (2005) Regulation of cadherin-mediated adhesion in morphogenesis. Nat Rev
Mol Cell Biol 6: 622-634
Harrison OJ, Corps EM, Berge T, Kilshaw PJ (2005a) The mechanism of cell adhesion by
classical cadherins: the role of domain 1. J Cell Sci 118: 711-721
Harrison OJ, Corps EM, Kilshaw PJ (2005b) Cadherin adhesion depends on a salt bridge at
the N-terminus. J Cell Sci 118: 4123-4130
Haussinger D, Ahrens T, Aberle T, Engel J, Stetefeld J, Grzesiek S (2004) Proteolytic E-
cadherin activation followed by solution NMR and X-ray crystallography. Embo J 23: 1699-
1708
He W, Cowin P, Stokes DL (2003) Untangling desmosomal knots with electron tomography.
Science 302: 109-113
Kimura TE, Merritt AJ, Garrod DR (2007) Calcium-independent desmosomes of
keratinocytes are hyper-adhesive. J Invest Dermatol 127: 775-781
Malicki J, Jo H, Pujic Z (2003) Zebrafish N-cadherin, encoded by the glass onion locus, plays
an essential role in retinal patterning. Dev Biol 259: 95-108
Nagar B, Overduin M, Ikura M, Rini JM (1996) Structural basis of calcium-induced E-
cadherin rigidification and dimerization. Nature 380: 360-364
Noe V, Willems J, Vandekerckhove J, Roy FV, Bruyneel E, Mareel M (1999) Inhibition of
adhesion and induction of epithelial cell invasion by HAV-containing E-cadherin-specific
peptides. J Cell Sci 112 ( Pt 1): 127-135
Nollet F, Kools P, van Roy F (2000) Phylogenetic analysis of the cadherin superfamily allows
identification of six major subfamilies besides several solitary members. J Mol Biol 299: 551-
572
Ozawa M, Baribault H, Kemler R (1989) The cytoplasmic domain of the cell adhesion
molecule uvomorulin associates with three independent proteins structurally related in
different species. EMBO J 8: 1711-1717
Parisini E, Higgins JM, Liu JH, Brenner MB, Wang JH (2007) The crystal structure of human
E-cadherin domains 1 and 2, and comparison with other cadherins in the context of adhesion
mechanism. J Mol Biol 373: 401-411
90
Patel IS, Madan P, Getsios S, Bertrand MA, MacCalman CD (2003a) Cadherin switching in
ovarian cancer progression. Int J Cancer 106: 172-177
Patel SD, Chen CP, Bahna F, Honig B, Shapiro L (2003b) Cadherin-mediated cell-cell
adhesion: sticking together as a family. Curr Opin Struct Biol 13: 690-698
Perret E, Benoliel AM, Nassoy P, Pierres A, Delmas V, Thiery JP, Bongrand P, Feracci H
(2002) Fast dissociation kinetics between individual E-cadherin fragments revealed by flow
chamber analysis. EMBO J 21: 2537-2546
Perret E, Leung A, Feracci H, Evans E (2004) Trans-bonded pairs of E-cadherin exhibit a
remarkable hierarchy of mechanical strengths. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 16472-16477
Pertz O, Bozic D, Koch AW, Fauser C, Brancaccio A, Engel J (1999) A new crystal structure,
Ca2+ dependence and mutational analysis reveal molecular details of E-cadherin
homoassociation. EMBO J 18: 1738-1747
Pierres A, Feracci H, Delmas V, Benoliel AM, Thiery JP, Bongrand P (1998) Experimental
study of the interaction range and association rate of surface-attached cadherin 11. Proc Natl
Acad Sci U S A 95: 9256-9261
Pierres A, Prakasam A, Touchard D, Benoliel AM, Bongrand P, Leckband D (2007)
Dissecting subsecond cadherin bound states reveals an efficient way for cells to achieve
ultrafast probing of their environment. FEBS Lett 581: 1841-1846
Pierres A, Touchard D, Benoliel AM, Bongrand P (2002) Dissecting streptavidin-biotin
interaction with a laminar flow chamber. Biophys J 82: 3214-3223
Posy S, Shapiro L, Honig B (2008) Sequence and structural determinants of strand swapping
in cadherin domains: do all cadherins bind through the same adhesive interface? J Mol Biol
378: 952-966
Prakasam A, Chien YH, Maruthamuthu V, Leckband DE (2006) Calcium site mutations in
cadherin: impact on adhesion and evidence of cooperativity. Biochemistry 45: 6930-6939
Raptis L, Arulanandam R, Vultur A, Geletu M, Chevalier S, Feracci H (2009) Beyong
Structure, to survival: activation of Stat3 by cadherin engagement. Biochemistry and Cell
Biology manuscript accepted: see article IV of this Ph.D. thesis
Reynolds AB, Daniel J, McCrea PD, Wheelock MJ, Wu J, Zhang Z (1994) Identification of a
new catenin: the tyrosine kinase substrate p120cas associates with E-cadherin complexes. Mol
Cell Biol 14: 8333-8342
Robert P, Benoliel AM, Pierres A, Bongrand P (2007) What is the biological relevance of the
specific bond properties revealed by single-molecule studies? J Mol Recognit 20: 432-447
Shan WS, Koch A, Murray J, Colman DR, Shapiro L (1999) The adhesive binding site of
cadherins revisited. Biophys Chem 82: 157-163
Shapiro L, Fannon AM, Kwong PD, Thompson A, Lehmann MS, Grubel G, Legrand JF, Als-
Nielsen J, Colman DR, Hendrickson WA (1995) Structural basis of cell-cell adhesion by
cadherins. Nature 374: 327-337
91
Shibamoto S, Hayakawa M, Takeuchi K, Hori T, Miyazawa K, Kitamura N, Johnson KR,
Wheelock MJ, Matsuyoshi N, Takeichi M, et al. (1995) Association of p120, a tyrosine kinase
substrate, with E-cadherin/catenin complexes. J Cell Biol 128: 949-957
Takeichi M (1988) The cadherins: cell-cell adhesion molecules controlling animal
morphogenesis. Development 102: 639-655
Takeichi M (1990) Cadherins: a molecular family important in selective cell-cell adhesion.
Annu Rev Biochem 59: 237-252
Tamura K, Shan WS, Hendrickson WA, Colman DR, Shapiro L (1998) Structure-function
analysis of cell adhesion by neural (N-) cadherin. Neuron 20: 1153-1163
Tomschy A, Fauser C, Landwehr R, Engel J (1996) Homophilic adhesion of E-cadherin
occurs by a co-operative two-step interaction of N-terminal domains. EMBO J 15: 3507-3514
Troyanovsky RB, Laur O, Troyanovsky SM (2007) Stable and unstable cadherin dimers:
mechanisms of formation and roles in cell adhesion. Mol Biol Cell 18: 4343-4352
Troyanovsky RB, Sokolov E, Troyanovsky SM (2003) Adhesive and lateral E-cadherin
dimers are mediated by the same interface. Mol Cell Biol 23: 7965-7972
Troyanovsky RB, Sokolov EP, Troyanovsky SM (2006) Endocytosis of cadherin from
intracellular junctions is the driving force for cadherin adhesive dimer disassembly. Mol Biol
Cell 17: 3484-3493
Troyanovsky S (2005) Cadherin dimers in cell-cell adhesion. Eur J Cell Biol 84: 225-233
van Roy F, Berx G (2008) The cell-cell adhesion molecule E-cadherin. Cell Mol Life Sci 65:
3756-3788
Wojcik EJ, Sharifpoor S, Miller NA, Wright TG, Watering R, Tremblay EA, Swan K,
Mueller CR, Elliott BE (2006) A novel activating function of c-Src and Stat3 on HGF
transcription in mammary carcinoma cells. Oncogene 25: 2773-2784
Yap AS, Kovacs EM (2003) Direct cadherin-activated cell signaling: a view from the plasma
membrane. J Cell Biol 160: 11-16
Zhang Y, Sivasankar S, Nelson WJ, Chu S (2009) Resolving cadherin interactions and
binding cooperativity at the single-molecule level. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 109-114
FIGURES LEGENDS:
Figure 1: Structural and sequence determinants of the -strand exchange (a)
Crystallographic structure of the binding interface of the human E-cadherin (PDB 2O72)
(Parisini et al, 2007). -strand exchange and docking of Trp2 in the partner hydrophobic
pocket are required for trans-interaction. (b) Sequence alignments of classical type I cadherins
92
and T-cadherin. Trp2 and amino acids surrounding the hydrophobic pocket are conserved
(highlighted).
Figures 2: Characterization of the cadherins fragments (a) Schematic representation of
murine E-cadherin constructs used in this study. All chimeric proteins comprise the two
outermost EC motifs, a polyhistidine tag at the C-terminal end, and a specific sequence
(MIEGR) at the N-terminal end allowing cleavage by the factor Xa protease. (b) Mass
spectrometry of the cleaved E/EC12-6xHis and E/W2A-6xHis fragments. Theoretical mass
calculated using ProtParam were 25177 Da for E/EC12-6xHis and 25061,9 Da for E/W2A-
6xHis. Our measurements are in good agrement with these values. (c) Circular dichroism of
both fragments. Spectra are characteristics of -sheet folding, and the modification of mean
molar residue ellipticity by addition of calcium is typical of cadherin folded fragments
(Courjean et al, 2008).
Figure 3: Kinetics of cadherin homophilic interaction (a) E/EC12 fragment exhibits four
fold higher binding frequencies than E/W2A. Decrease of the binding frequency of E/EC12
and E/W2A is linear when shear rate increases. Binding of the T/EC12 does not resist to
force. (b) Detachment curves at 2 pN: E/EC12 interaction is more stable than E/W2A,
specifically on the early steps of interaction. T/EC12 stability is very similar to E/W2A in the
early steps of interaction.
Figure 4: Characterization of an intermediate state (a) Schematic pathways for two
monomers achieving the trans interaction; the top pathway describes a simultaneous process,
the bottom one a sequential mechanism, driven by different kinetics parameters. (b-c)
Experimental data showing binding frequencies (b) and detachment curves (c) of homophilic
and heterophilic E/EC12 and E/W2A fragments.
Figure 5: Scanning electron microscopy of beads/cells interactions (a) 90% of beads
coated with E/EC12 are internalized by HC11 cells. (b,c) Higher magnification showing
beads overlied by cell membrane. (d) 90% of E/W2A decorated beads were associated with
cell surface through membrane protrusions (e) with no internalization. (f) Isolated beads
decorated by cadherin fragments.
93
Figure 1
(a)
(b)
94
Figure 2
Protease
Protease
(a)
(b)
(c)
E/EC12 E/W2A
95
Figure 3
2pN
(a)
(b)
96
Figure 4
(a)
(b) (c)
Simultaneous
Sequential
97
Figure 5
a
b
c
d
e
f
98
99
ARTICLE II: TYPE I VS TYPE II CADHERINS
all cadherins do not bind through the same adhesive
interface
100
101
L‟adhésion cellule-cellule par les cadhérines joue un rôle primordial dès les premiers
stades du développement embryonnaire, puis plus tard dans le maintien de l‟architecture
tissulaire. En effet, les cadhérines établissent des contacts sélectifs conduisant à la ségrégation
cellulaire ; dans certaines pathologies comme le cancer, les changements de leur expression
("cadherin switching") sont corrélés à des modifications de phénotype (transition épithélio-
mésenchymateuse). Le changement d‟expression de la E-cadhérine en faveur delà N-
cadhérine ou de la cadhérine-11 joue un rôle très important dans le caractère invasif des
métastases de nombreux cancers épithéliaux, comme ceux de la prostate, du sein ou de
l‟estomac (Chu et al, 2008; Shibata et al, 1996; Tamura et al, 2008). Les cellules utilisent
alors ces nouveaux systèmes adhésifs pour coloniser d‟autres tissus. Ceci a été très récemment
décrit dans le cancer de la prostate, où les cellules épithéliales, qui expriment initialement la
E-cadhérine, migrent vers les os avec l‟expression de la cadhérine-11 (Chu et al, 2008).
Les cadhérines de type I sont les mieux connues. De nombreuses informations sont
maintenant disponibles sur leur mécanisme d‟interaction. Nous avons vu précédemment le
rôle primordial du Trp2, impliqué à la fois dans l‟initiation et dans la stabilité de l‟échange de
brin conduisant au contact adhésif entre cadhérines.
Les cadhérines de type II sont beaucoup moins étudiées. Elles possèdent des
homologies de séquences avec les cadhérines de type I, notamment le Trp2 et d‟autres résidus
nécessaires à l‟échange de brin β (Posy et al, 2008). La cristallographie par RX de trois
cadhérines de type II ainsi que l‟étude par RMN de la cadhérine-8 suggèrent que la
dimérisation des cadhérines de type II se fait de façon similaire par échange de brin β avec
insertion des chaines latérales des Trp2 et 4 dans la poche hydrophobe de la molécule
partenaire (Miloushev et al, 2008; Patel et al, 2006). Cependant, des études comparatives sur
les différences d‟énergie d‟adhésion entre cadhérines de type I et de type II donnent des
résultats controversés, peut-être dus aux différentes techniques et aux divers couples de
cadhérines testés (Chu et al, 2006; Katsamba et al, 2009).
Il n‟y a néanmoins aucune étude qui, à ma connaissance, ait identifié les éléments
structuraux importants dans la dynamique de l‟échange de brin β, à l‟échelle de la molécule
102
unique, pour les cadhérines de type II. Dans cette étude, nous avons, par chambre à flux
laminaire, comparé la E-cadhérine et la cadhérine-11.
Cette étude comparative, faite avec la même approche expérimentale, nous a permis de
mettre en évidence que la différence réside essentiellement dans la capacité à initier les
interactions. Nous avons ensuite recherché les éléments structuraux qui participent à
l‟interface adhésive de la cadhérine-11, décrite par la cristallographie (Patel et al, 2006). Ces
auteurs ont attribué aux Trp2 et 4 le rôle majeur dans la dynamique d‟échange de brin β,
comme pour les cadhérines de type I. Grâce à la biologie moléculaire qui nous a permis
d‟introduire des modifications ponctuelles dans la séquence protéique, nous avons montré que
les Trp2 et 4 n‟ont pas l‟influence attendue ; leur mutation en Ala ne modifie pas de manière
significative la cinétique d‟adhésion de la cadhérine-11. En revanche, les études structurales
décrivent une surface adhésive plus étendue pour les cadhérines de type II, impliquant des
résidus majoritairement hydrophobes. Nos données mettent en évidence le rôle majeur de
cette partie de l‟interface adhésive : la mutation de 2 résidus dans cette zone réduit
considérablement l‟efficacité de liaison, à l‟échelle de la molécule unique et dans les
interactions bille-cellule. Les cadhérines de type I et de type II ne semblent donc pas partager
le même mécanisme d‟interaction.
103
Type I vs Type II Cadherins:
all cadherins do not bind through the same adhesive interface
Sébastien Chevalier and Hélène Feracci$
Centre de Recherche Paul Pascal, CNRS UPR 8641, 115 Avenue Albert Schweitzer, 33600
Pessac, France
$Corresponding author: [email protected]
Article en préparation
104
Introduction
Classical cadherins participate in cell-cell contacts, especially in specific cell adhesion
mechanisms mediated by highly homophilic interactions which define cell-cell selectivity.
These cell surface receptors are crucial for tissue morphogenesis, and they participate in the
maintenance of tissue architecture (Gumbiner, 2005; Takeichi, 1991). E(epithelial)-cadherin
(type I), localized on the basolateral membrane of polarized epithelial cells, is highly
concentrated to adherens junctions (AJ) and its gene is amongst the tumor suppressors (Jeanes
et al, 2008). Most human cancers are of epithelial origin, and the loss of E-cadherin is often
correlated to invasive phenotype. Cadherin-11 (type II) is expressed on cellular‟s of motile
phenotype such as myofibroblasts (Hinz et al, 2004), or neurons during neurite outgrowth
(Boscher & Mege, 2008). Recently, cadherin-11 has been also shown to promote invasiveness
of tumoral cell lines through epithelial-mesenchymental transition, and is involved in
metastasis progression towards bones in prostate cancer (Chu et al, 2008).
Classical type I and type II cadherins are transmembrane glycoproteins. They comprise an
extracellular domain, a single-pass transmembrane domain and an intracellular domain which
interacts with the cytoskeleton via β- and -catenins respectively (Patel et al, 2003b). Their
ectodomains consist of five modules (EC1 to EC5) of ~100 amino acids each with internal
sequence homology. Cadherins are known to achieve their biological functions in the
presence of calcium (Ozawa et al, 1990a; Takeichi, 1991). Indeed, 3 calcium ions Ca2+
bind
between two successive EC modules and rigidify the entire ectodomain for achieving its
complete mature folding (Courjean et al, 2008; Pertz et al, 1999b).
Cadherins biological properties must rely at least in part on the extracellular segment where
the first events of protein interactions take place. Structural studies of the extracellular
cadherin segment as well as sequence alignments indicate that each individual repeat EC is
composed of seven anti-parallel -strands (labelled A to G) arranged as two opposing sheets
(Patel et al, 2003b).
Crystal structure analyses of classical type I cadherins show that these proteins interact
through their most distal extracellular domain, called EC1 (Boggon et al, 2002; Haussinger et
al, 2004; Shapiro et al, 1995). Trans interactions between the ectodomains were proposed to
imply a domain swapping through the exchangeof their Nter -strand. This -strand
exchange was observed between E-cadherin two EC12 fragments by x-ray crystallography
and NMR (Haussinger et al, 2004; Parisini et al, 2007) and depends mainly on four conserved
structural features (Posy et al, 2008): i) the Trp2 side chain docks into an hydrophobic pocket
intramolecularly or into the partner molecule, in a parallel fashion. The Histidine-Alanine-
Valine (HAV) conserved sequence located at the C-terminal region of domain EC1 and
105
conserved residues surrounding it contribute to the formation of this hydrophobic pocket
(Blaschuk et al, 1990; Tamura et al, 1998a). The mutation of Trp2 into Ala (W2A) or Ala80
into Ile abrogate the adhesive capacity of the protein (Noe et al, 1999; Pertz et al, 1999b) ; ii)
twoo prolines (Pro5-Pro6) are part of the hinge region between the exchanged strand and the
rest of the protein. Generally, Pro residues are known to induce strain in hinge loops
(Bergdoll et al, 1998; Rousseau et al, 2001). The Pro5-Pro6 motif in type I cadherin releases
strain when the -strand is exchanged, which favours dimerization (Parisini et al, 2007); iii)
the Gu89 side chain forms a salt bridge with the charged Nter residue as part of the swapping
interface. Mutations of EC1 that destroy the salt bridge either by replacing Glu89 with Ala or
by extending the N terminus interfere with adhesion (Harrison et al, 2005b) ; iv) the -strand
exchanged in the EC1 domain is shorter than in other domains. Compared to EC1, EC1-4
have two extra residues in their A strand that form additional hydrogen bonds with the G
strand. EC5 domains appear to have only one extra residue. As a consequence of the longer A
strand, the hinge region in EC2-5 is positioned higher in the structure than in EC1, and forms
a bungle. It is possible that the shorter strand in EC1 destabilized the monomer by inducing
strain in closed conformations, when Trp2 tucks into a pocket into its own monomer (Posy et
al, 2008).
Classical type II cadherins share sequences homologies with type I cadherins but have two
Trp conserved in second and fourth position (Trp2 et 4). Crystal structure reveal that type II
cadherins also interact through a -strand exchange (Patel et al, 2006). Trp 2 and 4 dock into
a large hydrophobic pocket, into the own monomer as well as into the partner molecule.
While in type I cadherins almost the entire adhesive interface is formed from strand swapped
residues, type II cadherins form a larger interface that includes additional hydrophobic
contacts. Moreover, it should be underlined that some of the structural features that allow the
-strand exchange in type I cadherins are not conserved in type II cadherins. Specifically,
type II cadherins have no Pro residue in their hinge loop to favour the dimerization.
In a recent study, we probed the role of Trp2 in type I cadherins dynamics (Chevalier et al., in
preparation). We have shown that this residue acts like a feeler, enhancing both the formation
and the stability of the E-cadherin interaction.
Yet, the molecular mechanisms of type II cadherin ectodomain interactions are still unclear.
Here, we chose cadherin-11 as a prototype of classical type II cadherin with the goal of
relying structural features to adhesive functions. We used the flow chamber combined with
molecular biology as a powerful molecular approach to probe the dynamics of their -strand
exchange, at the single molecule level. Our observations reveal that differences in dynamics
between type I and type II cadherins stand essentially in the ability to initiate the interaction.
106
Moreover, the large hydrophobic adhesive surface is predominant on Trp2 and 4 for the
adhesive trans interaction of type II cadherins, which suggests for the first time that type I and
type II cadherins do not interact through the same mechanism.
Materials and Methods
Protein expression and purification
For chimeric proteins purification, Terrific Broth media cultures of 500 mL containing
50 µg/mL kanamycin were inoculated with transformed colonies picked up from agar plates.
Expression was induced by the addition of IPTG. After 2h, cells were harvested and stored at
-70°C. Cell pellets were resuspended in lysis buffer (4 M urea; 50 mM Na2HPO4 pH 7.8;
20 mM Imidazole). The lysate was clarified by centrifugation at 10,000 g for 20 min and the
supernatant incubated for 2 h with Ni2+
-NTA Superflow (Qiagen). The beads were
extensively washed with lysis buffer and then subjected to stepwise dialysis against PBS.
Cadherin fragments were eluted with 0.25 M imidazole, then dialysed against Hepes 20 mM,
NaCl 150 mM pH 7 using Amicon Ultra 15, cut off 10 kDa (Millipore) in order to remove
Ca2+
ions.
Protein concentration was determined spectrophotometrically by absorbance measurements at
280 nm. The absorbance coefficient was evaluated on the basis of amino acid composition
using ProtParam tool, provided by ExPaSy web site (http://expasy.ch). Following purification,
proteins purity was checked by SDS-PAGE and by mass spectroscopy.
Trypsin sensitivity
We incubated purified cadherin fragments (~5 µg) with CaCl2 solutions ranging in
concentration from 0.02 to 2 mM in 10 mM Tris (pH 8.0) or with 5 mM EDTA. The protein
solutions were then incubated with 90 units of trypsin-agarose beads (Sigma) in a final
volume of 40 µL for 1 h, at 37 °C, with shaking (400 rpm, Thermomixer Comfort,
Eppendorf). A trypsin inhibitor was added to stop proteolysis (leupeptin hemisulfate, ICN
Biomedicals Inc.). Samples were then analyzed by SDS-PAGE in 15% polyacrylamide gels
and Coomassie blue staining.
Circular Dichroism
107
Circular dichroism spectra were recorded at 20 °C in a solution containing 20 mM Hepes and
150 mM NaCl (pH 7), using a Jasco 810 spectropolarimeter with quartz cells with a path
length of 1 mm. The protein concentration was 0.3 mg/mL. Spectroscopic studies of structural
modifications were performed by adding aliquots of a Ca2+
stock solution to the Ca2+
-depleted
protein, to a final Ca2+
concentration of 1 mM, 5 mM or 10 mM. Spectra were recorded by
subtracting the background due to the buffer signal.
Mass Spectrometry
ESI-ToF mass spectrometry was performed on a Waters LCT Premier instrument in the
positive mode. 20 µL of a 20 µM cadherin solution was extensively washed in
aTrifluoroacetic acid (TFA) 0.1% in water and then directly injected in the mass spectrometer.
Preparation of substrates for the flow chamber experiments
As described previously, streptavidin coated beads (2,8µm diameter, 1,3 g/l density,
Dynabeads M280, Dynal) were incubated (~ 8.108 beads/ml) at 37°C for 30 min with 10 µg of
biotinylated rat anti-mouse Ig mAb (Pharmingen) then with 10 µg of mouse anti-histidine
mAb (clone His-1, Sigma). Finally beads were incubated with the recombinant cadherin
fragments, for at least 1h. Prior using in adhesion experiments, beads were washed in 20 mM
Hepes, 150 mM NaCl, pH 7 at room temperature.
Freshly cleaved mica surfaces (Muskovite mica, Metafix, Montdidier, France) were incubated
with 1mM NiCl2 (Sigma) for 1 min. Cadherin fragments were diluted to the desired coating
concentration in binding buffer (Hepes-NaCl) and deposited on each mica surfaces for 1 h at
room temperature. Surfaces were then washed with Hepes-NaCl. Before use in laminar flow
assays, beads and slides were incubated for 15 min with 1 mM CaCl2 in Hepes-NaCl.
Experiments were performed in Hepes-NaCl, with 1 mM CaCl2, BSA 0.2% at room
temperature.
Interaction lifetime measurements were carried out with saturated beads (6900
molecules/µm2) and with a binding site density on mica of 50-100 molecules/µm
2, as
described in a previous work (Perret et al., 2002). Such conditions allowed optimal
attachment frequency and unimolecular measurements, as discussed in the results section.
Laminar flow adhesion assays
108
Flow chamber: Chambers were assembled as previously described by applying molecularly
smooth mica sheets against a plexiglas block with a cavity of 0.1 x 6 x 20 mm3 (Satim,
Evenos, France). The chamber was set on the stage of an inverted microscope (Axiovert 135,
Zeiss, Germany) bearing a long-distance 40X dry objective (n.a. 0.55) and a CCD camera
(WV-BP 310/G, Panasonic) connected to a Time Lapse Video Recorder (AG 6730,
Panasonic) and a videotape recorder for delayed analysis. Typically, 1 mL of bead suspension
(10 million/ml) was driven through the chamber with a 5 ml syringe mounted on a syringe
holder (Rasel, Stamford CT, supplied by Bioblock, Illkirch, France).
Particle tracking: Videotapes were digitized using a Pinnacle‟s DV500 PCI card (Pinnacle
Systems, Inc, Chatillon, France). The movies were exported in sequences of numbered files.
Then, a 20 millisecond time resolution was obtained by separating the interlaced fields
forming each image. Bead trajectories were recorded using the Metamorph tracking option
(Universal Imaging Corp.). Pixel size was 0.37 µm. On each field, the sphere centre of gravity
was determined with 0.040 µm accuracy. Also, the trajectories were checked to detect
artefactual events such as sphere collisions or doublet formation. In a typical experiment,
about 1500-2500 particle trajectories were recorded, amounting to about 500000-1000000
events, defined as sets of three parameters: time, x and y coordinates of the sphere centre.
Analysis: As described previously, particle trajectories and arrests were analyzed by custom
made software (Chevalier et al., in preparation). Detachment curves were obtained by plotting
the number of particles remaining bound versus time. We were thus able to determine the
characteristic duration of interactions. Experimental unbinding plots were then fitted to
theoretical curves according to the following two-step model of bond formation with a χ² test:
Binding frequency was used to reflect the binding efficiency; it was thus determined by
dividing the number of arrest à time t=0s (obtained by extrapolation using the best fit of the
detachment curves) by the total duration of motion of particles.
The global efficiency was used to reflect both initiation and stability of interactions. It was
determined by dividing the number of stable arrests (arbitrary chosen > 1s) by the total
duration of motion of particles.
Cell/Beads aggregation essays
109
Neutravidin coated fluorescent beads (1 µm diameter, 10 g/L density, FluoSphere, Molecular
Probes) were incubated (~ 2.107 beads/mL) at 37°C for 30 min with 10 µg of biotinylated rat
anti-mouse Ig mAb (Pharmingen) then with 10 µg of mouse anti-histidine mAb (clone His-1,
Sigma). Finally beads were incubated with the recombinant cadherin fragments, for 1 h. Prior
using in adhesion experiments, beads were washed three times in DMEM.
The albino mouse fibroblastic cell line Balb/c 3T3 was kindly provided by Dr. L. Raptis
(Kingston, ON Canada). Cells were grown in DMEM culture medium completed with SVF.
Cells were incubated at 37°C in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air. 50.106 beads were
incubated on cells during 1 h, then washed with PBS and fixed in 4% formaldehyde in PBS
for 20 minutes and washed with PBS. Cells were then photographed then beads and cells were
scored. The results of this bead-cell adhesion assay were evaluated as the relative number of
each type of bound beads.
Results
Characterization of the cadherin fragments
Type II cadherin trans interaction strongly depends on a salt bridge between Glu 87 and the
end terminal end (Patel et al, 2006). As suggested by Harrison and al. (Harrison et al, 2005b),
an additional residue at the N-terminal is sufficient, by disruption of this salt bridge, to
perturb the -strand exchange and disturb the adhesive interaction. Protein expression in E.
Coli usually introduces a additional Met at the N-ter end. In some proteins, when the
penultimate amino acid is a Gly, the N-ter Met is excised in the bacteria, by the methionyl-
aminopeptidase (Bradshaw et al, 1998; Frottin et al, 2006; Hirel et al, 1989). In our case, the
cadherin-11 fragment has indeed a Gly in this position of the sequence, and E. Coli
expression of this fragment should occur with the correct native terminal end. We checked the
correct processing of the recombinant proteins by mass spectrometry and indeed as shown in
Figure 2a & 2b, our fragments had the correct expected mass (calculating from the native
sequence, using the ProtParam tool from the ExPaSy web site, www.expasy.ch).
Cadherins are known to resist to trypsin digestion in the presence of calcium, and as recently
shown the E/EC12 fragment is protected up to 0.05 mM Ca2+
concentration (Courjean et al,
2008). Type II cadherins behave slightly differently, and not surprisingly cadherin-11
11/EC12 and 11/W24A fragments resisted, but appeared to be more sensitive to trypsin
digestion (figure 2c & 2d). Cadherin-11 fragments seemed to be protected at 2 mM Ca2+
, but
110
cleaved from 1 mM Ca2+
and were completely degraded at 0.2 mM Ca2+
(as they were in
control with 5 mM EDTA).
Circular dichroism was used to probe conformational changes of proteins. Type I cadherins
have typical sheet spectra, and shift of these spectra are observed when calcium is added
(Courjean et al, 2008). Circular dichroism spectra of 11/EC12, 11/W24A and E/EC12
fragments were very similar in shape, displaying a typical cadherin spectrum. We also
observed a slight change in the conformational state upon addition of 1 mM or 5 mM Ca2+
;
addition of 10 mM Ca2+
led to upper changes.
Altogether, the different recombinant 11/EC12 fragments were correctly cleaved, and folded
according to the criteria defined for type II cadherins. Indeed, type II cadherin folding is
known to be less sensitive to calcium fixation than type I cadherins (Heupel et al, 2008).
Flow Chamber experiments
Determination of cadherin surface density
As previously described for E-cadherin (Perret et al, 2002a), unimolecular interactions can be
probed by the flow chamber. We needed to setup the experimental conditions for measuring
cadherin-11 single molecule interactions. We tuned cadherin surface density from 1000
molecules/µm² up to 20 molecules/µm². For 100 molecules/µm², detachment rates did not
increase with decreasing surface density of binding site on the floor chamber. This was an
evidence that the arrest were mediated mostly by individual bonds. Due to the high sequence
and structure homologies between 11/EC12 and E/EC12, it was not surprising that the surface
density of both fragments was the same for probing single molecule interactions.
Comparison of cadherin-11 with E-cadherin
Binding frequency:
The laminar flow chamber method allowed us to probe the formation and the stability of
individual trans interaction between cadherin fragments. By measuring the arrest frequency of
coated beads flowing near coated mica surfaces, we were able to quantify the formation
kinetics of this interaction. Although this is not a direct measurement of binding rate (also
called on-rate), theory shows that binding frequency is proportional to on-rate (Pierres et al,
1998b). Then it is possible, by using our different fragments probed in identical conditions, to
consider binding frequency as a quantitative effect of their on-rate. E/EC12 flow chamber
111
parameters have been already described (courjean & al.). Briefly, binding frequencies
decrease from 0.023 µm-1
at 2 pN to 0.001 µm-1
at 13 pN.
11/EC12 had 4 fold smaller binding frequencies. At 2 pN, 11/EC12 bound with a frequency
of 0.006 µm-1
and fall down until 0.001 µm-1
at 6 pN. The increasing shear rate G seemed to
influence arrest frequencies of both 11/EC12 and E/EC12 in a similar way.
Stability:
Binding stability could be quantified from the duration of individual arrests, by plotting the
proportion of detected interactions as a function of time (see Materials and Methods).
11/EC12 detachment curves are not straight lines, showing that the interaction is more
complex than a single state interaction. Detachment curves of the 11/EC12 showed that this
interaction is slightly less stable than for E/EC12. Figure 4b showed the detachment curves at
2 pN, but similar behaviour can be observed for higher forces applied on the beads (not
shown). From 0.5 s to 1 s, detachment curves of the 2 proteins are similar; slight differences
were in the early steps of interactions.
The global efficiency reflects both differences in the initiation and stability of interactions. As
binding frequency differences are more important than stability differences, evolution of the
global efficiencies of the 11/EC12 and E/EC12 fragments were very similar to the evolution
of their binding frequencies. These results all together showed that the main differences
between 11/EC12 and E/EC12 were the initiation of the interaction.
Probing the cadherin-11 trans-interactions
Dissecting cadherin-11 molecular details of interaction
By using 11/W24A fragments, we could probe the role of these amino acids in the cadherin-
11 interaction. As suggested by Patel & al. (Patel et al, 2006), these two amino acids involved
in the beta strand exchange are essential for achieving type II cadherin trans interaction.
W24A mutation increased very slightly the initiation of the interaction and didn‟t change the
stability of interaction. As a results global efficiency were very similar between these both
fragments (figure 5). Contrary to type I cadherin, Trp2 and 4 didn‟t seem to play a key role in
cadherin-11 interactions. We then probed a third cadherin fragment, with 2 other points
mutations, Phe8 and Ile10 that participate to the extended hydrophobic adhesive surface of
type II cadherin, mutated in Ala (2 mut). These mutations almost prevented the formation of
interactions as shown in figure 5a; the binding frequency of 0.0003 µm-1
at 2 pN was 20 fold
smaller than for the wild type 11/EC12 fragment. And the global efficiency is also 15 fold
112
weaker for this fragment than for the WT. So these amino acids Phe8 and Ile10 are essential
for the trans interactions of type II cadherins.
Beads/Cells aggregation essays
Specific recognition of cadherin fragments by cells expressing cadherin-11 molecules was
also investigated. Green fluorescent polystyrene beads decorated with 11/EC12 fragments
were incubated with Balb/c 3T3 cell lines expressing cadherin-11 at their surface, together
with red fluorescent polystyrene beads decorated with either 11/W24A or either 11/2mut
fragments (figure 6). Beads coated with the wild type fragment adhered on cells, as did beads
decorated with 11/W24A. However, beads coated with 11/2mut were not sticking to cells.
Cells recognized the recombinant cadherin-11 fragments that remained their biological
activity. And cells experimental results were in good agreement with flow chamber
experiment assays.
Discussion
The main purpose of this work was to compare type II to type I cadherins binding activities,
and to improve important structural features in cadherin type II dynamics. We choose
cadherin-11 and E-cadherin as prototype of type II and type I cadherins. The laminar low
chamber has already been used as a powerful tool to probe molecular aspect of type I
cadherins interactions. Crystallographic structure as well as RMN measurement strongly
suggest that type II cadherins bind through domain swapping mechanism (Miloushev et al,
2008; Patel et al, 2006). Force measurement spectroscopy combine with molecular biology
allowed us to determine the structural component of type II cadherins interactions.
Cadherin-11 fragment are correctly expressed
For probing the molecular components of type II cadherin interaction, we chose to focus on
the two outermost modules of cadherin-11. As it has already been validated for E-cadherin
(Courjean et al, 2008; Perret et al, 2002a), 11/EC12 is the minimal segment to obtain a direct
determination of lifetime of the initial homophilic interaction. Due to the properties of the
adhesive interface, and the importance of Nter processing, it was essential to verify that the
cadherin fragments we were using were correctly expressed and folded. As already
mentioned, a correct native N ter end is required for achieving proper cadherin adhesion
113
(Harrison et al, 2005b). We used both mass spectrometry and circular dichroism to show that
we obtained cadherin-11 fragments exhibiting identity with the wild-type sequence as well as
a correct folding. This was also confirmed by trypsin sensitivity depending on calcium
concentrations.
Cadherin-11 EC12 fragments were expressed with a hexahistidine tag at the C ter end. This
tag, which is used to purify the recombinant proteins, is also very conveniently used to
immobilize these fragments in an orientated fashion on substrates for the flow chamber
experiments. We chose to study the association of surface-attached molecules rather than
between soluble molecules thus achieving the molecular configuration occurring in
physiological conditions. Experimental conditions have then be determined in order to probe
unimolecular measurements, as it has already been described for E-cadherin (Perret et al,
2002a).
E-cadherin and cadherin-11 have different dynamics parameters
To our knowledge, no direct comparison between cadherin-11 and E-cadherin dynamics at the
molecular level has been described yet. It appears indeed that differences may arise from the
technical approach used, as well as cell types, cadherin members and numbers of cadherin
molecules involved in the adhesion plaque. Indeed, data coming from AFM measurements
suggest that cadherin-11 bonds are stronger than N-cadherin bonds (Pittet et al, 2008); on the
other hand, dual micropipette experiments show that E-cadherin adheres much strongly than
cadherin-7 (Chu et al, 2008).
For probing 11/EC12 recombinant fragment, we use the laminar flow chamber, in the same
experimental conditions as to probe E/EC12 (Chevalier et al., in preparation). We could
therefore directly compare the behaviour of these two proteins. As shown in figure 3c,
binding efficiency is much lower for the 11/EC12 fragment than for E/EC12; this difference is
mostly due to differences in binding frequencies. This result is coherent with the phenotype of
cells expressing these cadherins. Indeed, epithelial cells expressing E-cadherin exhibit a
strong adhesion ability and are very cohesive; whereas cells expressing cadherin-11 are more
motile and may have an invasive phenotype.
The β-strand exchange is not involved in cadherin-11 binding activity
114
In a previous work, mutation of Trp with Ala was used to probe the role of Trp2 into cadherin
type I interaction, (Chevalier et al., in preparation). These studies described the Trp2 acting as
a molecular hook, enhancing both the initiation and the stability of the interaction.
In order to decipher the contribution of the two Trp2&4 in the β-strand exchange of type II
cadherins, we expressed the 11/EC12 fragment with these two Trp mutated into Ala
(11/W24A). Surprisingly, no differences were observed (figure 4). Indeed, binding frequency
is a little bit higher without Trp, and the stability is exactly the same for 11/EC12 and
11/W24A. The flow chamber analysis was indeed sensitive enough to reveal differences for
the W2A mutation of E-cadherin, but did not show difference with type II cadherins. These
observations strongly suggested that the involvement of β-strand exchange in the
establishment of the adhesive interface may be different in type I and type II cadherins.
Type I and type II cadherins do not share the same adhesive interface
In order to identify the key residues driving the adhesive interaction in type II cadherins, we
performed other structural modifications in the protein sequence using point mutation
changes. Indeed, structural images of type II cadherins reveal an extended hydrophobic region
in the adhesive interface involving the entire Nter b-strand (Patel et al, 2006). In this adhesive
interface, Phe8 occupies a pocket formed partially by Gly22 and Tyr20 in the partner
molecule; similarly Ile10 fills a pocket formed by Tyr13 and Leu19. Such interactions have
not been described in type I cadherin structures. So we decided to mutate Phe8 and Ile10 with
Ala into the 11/EC12 fragment (11/2mut) then probed its behaviour in flow chamber assays.
As shown in figure 5, these two mutations fully abolished the adhesive interaction. Cell-beads
adhesion assays validated the observations made at the molecular level.
This extended interaction zone appeared to be essential for cadherin-11 dimerization and not
the β-strand exchange. This difference may come from the dynamics of the Nter b-strand: the
presence of only one Trp (type I) vs 2 Trp (type II) could provide a higher mobility of this
strand in type I cadherins, and a better ability for solvant exposure when only one Trp2 is
present. Altogether these results suggested a new mechanism for interaction for type II
cadherins.
Altogether, these structure-function study strongly suggests a different mechanism of
interaction between type I and type II cadherins. We found that the β-strand exchange does
115
not seem to participate in the dynamics of homophilic type II cadherins interactions, but an
extended region of hydrophobic interactions described by Patel et al. (Patel et al, 2006)
seemed to be the main structure involved.
ACKNOWLEDGMENTS: This work was supported by institutional funding from CNRS,
as well as by grants from ARC (subvention libre), Région Aquitaine, Fondation pour la
Recherche Médicale, la Ligue Contre le Cancer (Dordogne). During this work, S.C. received
a doctoral fellowship from Région Aquitaine. We are grateful to Pr L. Raptis (Queens
University, Kingston, Canada) for providing the BalbC 3T3 cells. We thank Elisabeth Sellier
(CREMEM, Université Bordeaux 1) for scanning electron microscopy, Katell Bathany
(IECB, Bordeaux, France) for performing mass spectrometry measurements and I. Lascu
(IBGC, Bordeaux, France) for their assistance with circular dichroism experiments.
References:
Bergdoll M, Eltis LD, Cameron AD, Dumas P, Bolin JT (1998) All in the family: structural
and evolutionary relationships among three modular proteins with diverse functions and
variable assembly. Protein Sci 7: 1661-1670
Blaschuk OW, Sullivan R, David S, Pouliot Y (1990) Identification of a cadherin cell
adhesion recognition sequence. Dev Biol 139: 227-229
Boggon TJ, Murray J, Chappuis-Flament S, Wong E, Gumbiner BM, Shapiro L (2002) C-
cadherin ectodomain structure and implications for cell adhesion mechanisms. Science 296:
1308-1313
Boscher C, Mege RM (2008) Cadherin-11 interacts with the FGF receptor and induces neurite
outgrowth through associated downstream signalling. Cell Signal 20: 1061-1072
Bradshaw RA, Brickey WW, Walker KW (1998) N-terminal processing: the methionine
aminopeptidase and N alpha-acetyl transferase families. Trends Biochem Sci 23: 263-267
Chu K, Cheng CJ, Ye X, Lee YC, Zurita AJ, Chen DT, Yu-Lee LY, Zhang S, Yeh ET, Hu
MC, Logothetis CJ, Lin SH (2008) Cadherin-11 promotes the metastasis of prostate cancer
cells to bone. Mol Cancer Res 6: 1259-1267
Courjean O, Chevreux G, Perret E, Morel A, Sanglier S, Potier N, Engel J, van Dorsselaer A,
Feracci H (2008) Modulation of E-cadherin monomer folding by cooperative binding of
calcium ions. Biochemistry 47: 2339-2349
Frottin F, Martinez A, Peynot P, Mitra S, Holz RC, Giglione C, Meinnel T (2006) The
proteomics of N-terminal methionine cleavage. Mol Cell Proteomics 5: 2336-2349
116
Gumbiner BM (2005) Regulation of cadherin-mediated adhesion in morphogenesis. Nat Rev
Mol Cell Biol 6: 622-634
Harrison OJ, Corps EM, Kilshaw PJ (2005) Cadherin adhesion depends on a salt bridge at the
N-terminus. J Cell Sci 118: 4123-4130
Haussinger D, Ahrens T, Aberle T, Engel J, Stetefeld J, Grzesiek S (2004) Proteolytic E-
cadherin activation followed by solution NMR and X-ray crystallography. Embo J 23: 1699-
1708
Heupel WM, Baumgartner W, Laymann B, Drenckhahn D, Golenhofen N (2008) Different
Ca2+ affinities and functional implications of the two synaptic adhesion molecules cadherin-
11 and N-cadherin. Mol Cell Neurosci 37: 548-558
Hinz B, Pittet P, Smith-Clerc J, Chaponnier C, Meister JJ (2004) Myofibroblast development
is characterized by specific cell-cell adherens junctions. Mol Biol Cell 15: 4310-4320
Hirel PH, Schmitter MJ, Dessen P, Fayat G, Blanquet S (1989) Extent of N-terminal
methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the
penultimate amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A 86: 8247-8251
Jeanes A, Gottardi CJ, Yap AS (2008) Cadherins and cancer: how does cadherin dysfunction
promote tumor progression? Oncogene 27: 6920-6929
Miloushev VZ, Bahna F, Ciatto C, Ahlsen G, Honig B, Shapiro L, Palmer AG, 3rd (2008)
Dynamic properties of a type II cadherin adhesive domain: implications for the mechanism of
strand-swapping of classical cadherins. Structure 16: 1195-1205
Noe V, Willems J, Vandekerckhove J, Roy FV, Bruyneel E, Mareel M (1999) Inhibition of
adhesion and induction of epithelial cell invasion by HAV-containing E-cadherin-specific
peptides. J Cell Sci 112 ( Pt 1): 127-135
Ozawa M, Engel J, Kemler R (1990) Single amino acid substitutions in one Ca2+ binding site
of uvomorulin abolish the adhesive function. Cell 63: 1033-1038
Parisini E, Higgins JM, Liu JH, Brenner MB, Wang JH (2007) The crystal structure of human
E-cadherin domains 1 and 2, and comparison with other cadherins in the context of adhesion
mechanism. J Mol Biol 373: 401-411
Patel SD, Chen CP, Bahna F, Honig B, Shapiro L (2003) Cadherin-mediated cell-cell
adhesion: sticking together as a family. Curr Opin Struct Biol 13: 690-698
Patel SD, Ciatto C, Chen CP, Bahna F, Rajebhosale M, Arkus N, Schieren I, Jessell TM,
Honig B, Price SR, Shapiro L (2006) Type II cadherin ectodomain structures: implications for
classical cadherin specificity. Cell 124: 1255-1268
Perret E, Benoliel AM, Nassoy P, Pierres A, Delmas V, Thiery JP, Bongrand P, Feracci H
(2002) Fast dissociation kinetics between individual E-cadherin fragments revealed by flow
chamber analysis. EMBO J 21: 2537-2546
Pertz O, Bozic D, Koch AW, Fauser C, Brancaccio A, Engel J (1999) A new crystal structure,
Ca2+ dependence and mutational analysis reveal molecular details of E-cadherin
homoassociation. EMBO J 18: 1738-1747
117
Pierres A, Feracci H, Delmas V, Benoliel AM, Thiery JP, Bongrand P (1998) Experimental
study of the interaction range and association rate of surface-attached cadherin 11. Proc Natl
Acad Sci U S A 95: 9256-9261
Pittet P, Lee K, Kulik AJ, Meister JJ, Hinz B (2008) Fibrogenic fibroblasts increase
intercellular adhesion strength by reinforcing individual OB-cadherin bonds. J Cell Sci 121:
877-886
Posy S, Shapiro L, Honig B (2008) Sequence and structural determinants of strand swapping
in cadherin domains: do all cadherins bind through the same adhesive interface? J Mol Biol
378: 952-966
Rousseau F, Schymkowitz JW, Wilkinson HR, Itzhaki LS (2001) Three-dimensional domain
swapping in p13suc1 occurs in the unfolded state and is controlled by conserved proline
residues. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 5596-5601
Shapiro L, Fannon AM, Kwong PD, Thompson A, Lehmann MS, Grubel G, Legrand JF, Als-
Nielsen J, Colman DR, Hendrickson WA (1995) Structural basis of cell-cell adhesion by
cadherins. Nature 374: 327-337
Takeichi M (1991) Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenetic regulator. Science
251: 1451-1455
Tamura K, Shan WS, Hendrickson WA, Colman DR, Shapiro L (1998) Structure-function
analysis of cell adhesion by neural (N-) cadherin. Neuron 20: 1153-1163
FIGURES LEGENDS:
Figure 1: Structures of type I and type II cadherin (a,b) (a) Crystallographic structure of
the binding interface of the E-cadherin (PDB 2O72) (Parisini et al, 2007). (b) Magnification
of EC1 domains suggest that -strand exchange and docking of Trp2 in the partner
hydrophobic pocket are required for trans-interaction of type I cadherins. (c,d) (c)
Crystallographic structure of the binding interface of the cadherin-11 (PDB 2A4E) (Patel et
al, 2006). (d) Magnification of EC1 domains suggest that -strand exchange and docking of
Trp2 and 4 in the large hydrophobic pocket of the partner molecule, as well as additional
hydrophobic contacts, are required for trans-interaction of type II cadherins.
Figures 2: Characterization of the cadherins fragments (a,b) Mass spectrometry of the
11/EC12 (a) and 11/W24A (b) fragments. Theoretical mass calculated using ProtParam were
25348 Da for 11/EC12 and 25232,9 Da for 11/W24A. Our measurements are in good
agrement with these values. (c,d) Influence of Ca2+
on the biochemical properties of 11/EC12
(c) and 11/W24A (d), as assessed by assays of trypsin sensitivity. Proteins were incubated
118
with trypsin in the presence of various concentrations of Ca2+
for 1 h at 37 °C. They were then
analyzed by SDS−PAGE in 15% acrylamide gels. Lane T corresponds to the protein
incubated without trypsin. (e,f) Circular dichroism of 11/EC12 (e) and 11/W24A (f)
fragments. Spectra are characteristics of -sheet folding, and the modification of mean molar
residue ellipticity by addition of calcium is typical of cadherin folded fragments (Courjean et
al, 2008).
Figure 3: Unimolecular experimental condition. Mica surfaces were coated with various
density of 11/EC12 fragment, and used for dynamic study of interaction. (a) Binding
frequencies decreased when cadherin site density decrease. (b) At high density (1000
cadherins/µm²), stable arrests were observed, corresponding to multiple binding interactions.
At cadherin site density of 100 cadherins/µm² or less, dissociation rate was constant,
indicating measurements of interactions between single 11/EC12 fragments.
Figure 4: Comparison of the kinetics between E-cadherin and cadherin-11 (a) E/EC12
fragment exhibits four fold higher binding frequencies than E/W2A. Decrease of the binding
frequency of E/EC12 and E/W2A is linear when shear rate increases. Binding of the T/EC12
does not resist to force. (b) Detachment curves at 2 pN: E/EC12 interaction is more stable
than 11/EC12. (c) Global efficiency, that reflects both the initiation and the stability of
interaction, displays the same evolution that binding frequency ; the main difference between
E/EC12 and 11/EC12 is the ability to initiate the interaction.
Figure 5: Structural determinants of the adhesive interface of cadherin-11 (a) Binding
frequency of 11/EC12 fragments compare to 11/W24A fragments suggests that Trp2 and 4 do
not interfere in the initiation of the adhesive interactions. Mutation of Phe8 and Ile10 into Ala
almost prevent the initiation of interaction. (b) 11/EC12 fragment and 11/W24A fragment
have the same stability. (c) Global efficiencies suggest that Trp2 and 4 point mutation into
Ala have no significant influence on cadheri-11 adhesive activity. Phe8 and Ile10 are
important for this interaction.
Figure 6: Agregation beads assay on BalbC 3T3 cells (a,c) Brightfield microscopy of
BalbC 3T3 cells, expressing cadherin-11 at the plasma membrane. Cells were incubated with
green-fluorescent beads, coated with 11/EC12 fragments, and with red-fluorescent beads,
coated with 11/W24A fragments (b) or 11/2mut fragments (d). 11/W24A coated beads remain
adherent as 11/2mut beads do not, confirming the flow chamber experimental results.
119
Figure 1
(a) (b)
(c) (d)
120
Figure 2
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
F
121
Figure 3
(a)
(b)
122
Figure 4
(a)
(b)
(c)
123
Figure 5
(a)
(c)
(b)
124
Figure 6
(a)
(c)
(b)
(d)
125
ARTICLE III: SURFACES COVALENTLY COVERED WITH
E-CADHERIN TO IMPROVE CELL ADHESION EVENTS
126
127
L‟assemblage des jonctions adhérentes, l‟activation de diverses voies de signalisation
et le comportement cellulaire qui en résulte sont dépendants de l‟organisation des récepteurs
adhésifs à la membrane. Ceci a été extrêmement documenté pour les interactions cellule-
matrice extracellulaire. En particulier, de très élégants travaux des groupes de Ingber et
Withesides il y a une quinzaine d‟années ont révélé les relations entre dimensions et nature de
la surface d‟attachement avec la différenciation cellulaire des hépatocytes. La
fonctionnalisation des surfaces par la fibronectine a permis de décrypter la complexité des
interactions cellule-matrice extracellulaire (MEC) et des échafaudages moléculaires qui sont
mis en place (Xia et al, 2008). L‟organisation des protéines de la MEC en îlots de tailles
variables réorganise le cytosquelette, et la cellule adapte sa morphologie selon la nature des
contacts. De même, sur des surfaces décorées de N-cadhérine, la cellule répond par la
réorganisation des complexes cadhérines-caténines, la polymérisation de l‟actine par
activation de la voie PI3-kinase-Rac1, et l‟extension de lamillipodes (Gavard et al, 2004).
Plus récemment, des surfaces décorées de fragments de E-cadhérine (E/EC12) ont permis de
montrer l‟activation d‟un facteur de transcription, Stat3, sensible à la présence du Trp2
(Arulanandam et al., 2009). Cette dernière étude souligne la complexité de la réponse
cellulaire, et décrit les modulations de ces voies de signalisation en fonction de la maturation
des jonctions.
Dans le but de mieux comprendre les processus de maturation des jonctions
adhérentes, notre objectif est de préparer des surfaces biomimétiques avec un espacement
contrôlé des molécules sur ces surfaces. La première étape pour la confection de substrats
modèles a été de mettre au point un protocole simple, rapide, et bon marché pour immobiliser
de manière orientée et covalente les protéines sur des surfaces. Cette étude a été réalisée en
collaboration avec le laboratoire du Dr J. de la Fuente (INA, Saragosse, Espagne) où j‟ai eu
l‟opportunité de passer 2 mois (octobre et novembre 2008) pour mettre au point cette chimie
de surface.
Chaque étape du processus a été contrôlée par XPS (X-ray Photoelectron
Spectrometry). L‟efficacité de fixation a été montrée par microscopie confocale à
fluorescence. Enfin par microscopie à force atomique (collaboration avec Dr M. Luna,
128
Madrid), nous avons imagé les surfaces fonctionnalisées, quantifié le recouvrement de 80%
de la surface par les cadhérines et confirmé la nature covalente de la liaison.
Les fragments protéiques, après ce greffage, restent biologiquement actifs ; en effet, le
comportement de cellules sur ces surfaces a été analysé. L‟étude de la morphologie de ces
cellules en microscopie électronique à balayage montre que leur étalement dépend de la
nature de la surface. Les images par microscopie confocale révèlent une organisation du
cytosquelette typique de l‟interaction cadhérine.
Cette méthode de greffage pourra être exploitée pour différentes protéines. Par ailleurs
la nécessité d‟immobiliser les protéines de manière covalente et orientée est intéressante pour
étudier l‟adhésion, mais aussi pour le développement de biomatériaux stables, de biopuces, de
biopiles, etc… C‟est dans ce contexte que cette étude fait l‟objet d‟un dépôt de brevet
actuellement en cours d‟étude. Le manuscrit sera soumis pour publication dès que les
démarches en cours pour dépôt de brevet déposées auprès des services de valorisation du
CNRS et de l‟Université de Saragosse le permettront.
129
Surfaces Covalently Covered with E-Cadherin
to Improve Cell Adhesion Events
Sébastien Chevalier1, Carlos Cuestas-Ayllon
2, Valeria Grazu
2, Monica Luna
3, Helene
Feracci1* and Jesus M. de la Fuente
2*
1Université Bordeaux 1, CNRS UPR 8641, Centre de Recherche Paul Pascal, 115 Avenue Dr
Schweitzer, 33600 Pessac (France)
2 Instituto de Nanociencia de Aragon-ARAID, University of Zaragoza, Campus Rio Ebro, Edif. I+D,
C/ Mariano Esquillor s/n, Zaragoza 50018 (Spain)
3Instituto de Microelectrónica de Madrid (IMM-CSIC), C/ Isaac Newton 8, PTM 28760 Tres Cantos,
Madrid (Spain)
E-mail: [email protected] & [email protected]
ABSTRACT : This paper describes a novel method for the biofunctionalization of glass
surfaces with polyhistidine tagged proteins. The innovation of this methodology consists in
the covalent binding between the nitrilotriacetic acid (NTA) moiety and the proteins, ensuring
the orientation and stability of the recombinant proteins on NTA-covered surfaces. In this
work, as C-terminal poly-histidine tagged cadherin extracellular fragments have been used,
this methodology guarantees the right orientation of the proteins for mimicking cell plasma
membranes. These biofunctionalized surfaces have been characterized by confocal
microscopy, X-ray photoelectron spectroscopy, contact angle and atomic force microscopy,
showing a high density of the cadherins on the glass surface and the stability of the linkage.
The so prepared materials exhibited a high tendency to promote cell spreading, demonstrating
the functionality of the protein and the high utility of these biomaterials to promote cell
adhesion events. This method, which allows the robust immobilization of polyhistidine tagged
proteins with a defined orientation, may find particular usefulness in the making of protein
biochips, for analysis of protein-protein interactions as well as structural and single-molecule
studies.
KEYWORDS: Cadherin, Surface Modification, Biofunctionalization, Protein, Cell Adhesion
130
Introduction
Biofunctional surfaces are extensively used in therapeutics and diagnostics for cell-based
assays (Falconnet et al, 2006; Geiger et al, 2009), tissue-engineering applications(Curtis &
Riehle, 2001; Lutolf & Hubbell, 2005), biosensor developments (Jonkheijm et al, 2008; Wong
et al, 2009), bioelectronics, and, more generally, for medical devices (Bettinger et al, 2009;
Jonkheijm et al, 2008; Wong et al, 2009). The ideal biofunctional surface should be easy to
prepare, characterize, amenable to design, biocompatible and efficient. In this regard, the
incorporation of relevant biomolecules have been already reported going from proteins (Thery
et al, 2005), peptides (Perret et al, 2002c), carbohydrates (Fuss et al, 2008; Schatz et al, 2009),
oligonucleotides (Weisbrod & Marx, 2008), and others (de la Fuente et al, 2006; Song et al,
2009). Several strategies have been followed for the chemical modification of these
biomaterials. Different approaches can be used to immobilize biomolecules, using covalent or
noncovalent chemistry. However, both approaches have advantages and disadvantages.
Covalent binding ensures a strong linkage between the biomolecules and the surface, however
it requires the surface modification and it does not generally guarantee the right orientation of
the biomolecules for complex molecules such as proteins. Such chemical binding of
unmodified proteins most often leads to random orientation of the proteins onto reactive
surfaces. On the other hand, unspecific adsorption constitutes a simple strategy for the
biofunctionalization of surfaces, but it constitutes a binding very dependent of the media
conditions (pH, ionic strength, temperature, etc.). Moreover, such uncontrolled interactions
often induce protein unfolding and thus a decrease in activity.
The study of cell adhesion to biomaterials is a very important topic in tissue engineering. The
interactions of cells with materials modulate the cellular response to implanted devices as
well as cell culture supports (Chen et al, 1998; Stevens & George, 2005). Controlling cell
adhesion on polymeric materials is a key issue for biomaterials. Biochemical data highlight
the necessity of extracellular matrix (ECM) proteins in promoting cell adhesion through
specific interactions. Cells, via integrins, bind to specific amino acid sequences on ECM
proteins (RGD) present in fibronectin, vitronectin, and thrombospondin. These proteins
provide an attachment network for the adhesion and growth of specific cells in vivo.
Furthermore, cadherins are also involved in cell-cell adhesion events. Classical cadherins are
transmembrane glycoproteins involved in controlling the specificity, organization and
dynamics of cell adhesion, which is crucial for the development and maintenance of tissue
architecture and function (Hartsock & Nelson, 2008; Larue et al, 1996a; Nishimura &
Takeichi, 2009). Cadherins interact with other cell surface cadherins on neighbouring cells
through their extracellular subdomain repeats (EC1 to EC5) (Patel et al, 2003b; Perret et al,
131
2002a; Perret et al, 2004). Their adhesive engagement initiates intracellular signals ranging
from cytoskeletal organization to cell polarity, proliferation, or apoptosis that are
communicated through the conserved cadherin tail domain to cytoplasmic pathways
(Charrasse et al, 2002; Hartsock & Nelson, 2008; van Roy & Berx, 2008). The role of
adhesion forces in the signalling process is yet to be understood due to the difficulty in the
interpretation of biological responses involving dynamic and complex multi-molecular
organizations (Thiery, 2003). On the biomaterial surfaces in vitro, the same mechanisms also
apply. When foreign materials come into contact with body fluid or cell culture medium, the
initial response is protein adsorption at the materials‟ surfaces. Thus, the materials interact
with the cells through the adsorbed protein layer. The composition and structure of this
protein layer play critical roles in determining subsequent cell behaviors (Arulanandam et al,
2009; Dupin et al, 2009; Ganz et al, 2006; Ostuni et al, 2009).
We describe in this paper an efficient, simple and straightforward procedure to prepare as a
model system functionalized surfaces with cadherins. The developed protocol uses modified
cadherin fragments with a poly-histidine tail at the C-terminal end of the proteins and
silanized surfaces incorporating a metal chelator complex such as nitrilotriacetic acid (NTA)
molecules. A two steps protocol has been developed. First, the chelation of the polyhistidine
tails to the Ni2+
- NTA residues located at the surfaces through its high binding affinity will
ensure a right orientation of the proteins incorporated to the surface. However, the poly-
histidine-NTA interaction is highly dependent on pH, ionic strength and other media
condition (Crowe et al, 1994; Schmitt et al, 1993). To guarantee a stable linkage to the
surface, a second step has been proposed by an amide formation between amino groups from
the histidine lateral chains and the carboxylated groups presented in the NTA. The so
prepared biofunctional surfaces have been characterized by fluorescent microscopy, contact
angle measurements and XPS. In AFM studies the stability of the protein immobilization
process was visualized at the single-molecule level in height of the covering layer. These
surfaces have also been proven as excellent adhesive platforms for cells presenting cadherins
on their surfaces, confirming their potential capabilities as biomaterials to study cadherin-
cadherin interactions using cellular models. Indeed, the total control over the orientation of
the immobilized proteins on such surfaces without affecting their conformation and function
optimizes the accessibility of proteins‟ active site. Because the polyhistidine tag is one of the
most generically used affinity tag for ease of purification, this method provides the basis for
numerous further applications for studies focusing on research targets at single-molecule
levels and for nanobiotechnology. The homogeneous orientation and distribution of
132
immobilized proteins demonstrates the high quality of the designed surface and qualify its
application in nano-scaled protein chip architectures.
Experimental section
Materials
Water used in the described reactions and for cleaning was obtained from a water purification
system, MILLI-Q A10 from Millipore.
For the activation of glass supports, sulfuric acid (ACS reagent, 95-98%) and hydrogen
peroxide (30%) were purchased from Sigma-Aldrich.
For the functionalization of glass supports with NTA-NH2, (3-
Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (≥98%), N-(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic
acid (≥97%, TLC), dry toluene (99,8%), sodium carbonate (≥99%) and sodium bicarbonate
(99,7%) were purchased from Sigma-Aldrich.
For protein immobilization, nickel II chloride hexahydrate, Hepes (≥99,5%), N-(3-
Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride crystalline, imidazole (ACS
reagent, ≥99%) were purchased from Sigma-Aldrich. N-Hydroxysuccinimide (≥97%) was
purchased from Fluka. Sodium chloride (ultrapure, 5M) was purchased from Gibco.
Ethylenediaminetetraacetic (EDTA, ≥99%) was purchased from Panreac.
For scanning electron microscopy, glutaraldehyde (25% in water) and hexamethyldisilazane
(HDMS, ≥99%) were purchased from Sigma-Aldrich. Sodium cacodylate and osmium
tetroxyde were purchased from Agar Scientific. Tannic acid was purchased from Fluka.
Methanol (Spectranal, ≥99,9%) was purchased from Riedel-de Haën. Uranyl acetate was
purchased from Eloïse SARL.
For immunocytochemistry, formaldehyde, Triton X-100 and bovin serum albumin (BSA)
were purchased from Sigma-Aldrich. Monoclonal anti-E-cadherin antibodies were purchased
from BD Biosciences. Mouse anti-beta-catenin was purchased from Interchim.
All the chemicals were used as received.
Activation of Glass Supports
133
Glass supports were cleaned with piranha solution (H2SO4 and 30% H2O2, 3:1) for 30 min at
room temperature (RT). The slides were then rinsed several times with milli-Q water and
dried under nitrogen.
Functionalization of Glass Supports with N-(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic
acid (NTA-NH2)
A 2% solution of 3-(2,3-epoxypropoxy) propyltrimethoxysilane in dry toluene was added
overnight (ON) at RT onto the activated glass supports. After washing extensively with
toluene and 10mM carbonate buffer pH 10.8, glass supports were incubated ON at RT with
25 mM NTA-NH2 in carbonate buffer pH 10.8. The supports were then washed and dried.
Expression and Purification of the Hexahistidine Tagged cadherin fragments (E/EC12)
The mouse E-Cadherin extracellular fragment (MIEGR-E/EC12) corresponding to the two
outermost cadherin modules bearing a C-terminal hexahistidine tag was produced as already
described (Courjean et al, 2008). Briefly, the IEGR sequence was introduced in the plasmid
construct of the cadherin fragment, in order to obtain the correctly cleaved cadherin fragment
at the N-ter end. For production of this chimeric protein, 500 mL of Terrific Broth
supplemented with 50 µg/mL kanamycin was inoculated with a transformed colony and
protein synthesis induced by IPTG. Cell pellet was resuspended in lysis buffer [4 M urea, 50
mM Na2HPO4 (pH 7.8), 20 mM imidazole, and 20 mM beta-mercaptoethanol]. The resulting
lysate was cleared by centrifugation, and the supernatant was incubated for 2 h with Ni-NTA
Superflow agarose resin beads (Qiagen). The beads were then thoroughly washed and
subjected to stepwise dialysis against PBS. Factor Xa protease (Qiagen) digestion of MIEGR-
E/EC12 was performed for 60 h at 16 °C and stopped by removing the enzyme with Xa
Removal Resin (Qiagen). Finally the resulting E/EC12 fragments was then dialyzed against
20 mM Hepes and 150 mM NaCl (pH 7.0) in order to remove Ca2+
ions and the cleaved
peptide. Protein purity was checked by SDS-PAGE, Western blotting and mass spectrometry
(not shown).
Protein immobilization
134
The NTA-surfaces were then loaded with 100 mM NiCl2 in aqueous solution to form the
complexation environment for the hexahistidine motif. The cadherin fragment (0.1 mg/ml)
was incubated at RT for 1 h and the surfaces were then extensively washed with 150mM
NaCl, 20mM Hepes (pH 7.0).
Cadherin fragments were conjugated to the glass supports by cross-linking carboxyl groups of
NTA to amino groups of the proteins, mediated by 50mM EDC, 75mM NHS, 20mM Hepes,
(pH 7.0) solution, for 45 min at RT.
Non-covalently linked proteins were eluted by 1M Imidazole, 10mM EDTA in 150mM NaCl
Hepes 20mM (pH 7.5). Samples were extensively rinsed with 150mM NaCl, 20mM Hepes
(pH 7.0).
Contact Angle Measurements
The contact angle measurements were carried out using an easy drop commercial instrument
(Krüss, Germany). MilliQ water (3 µL) was added onto each surfaces using a Hamilton
syringe at 25ºC. Three measurements were done per sample and the contact angle was
calculated using the Sessile Drop Fitting Method.
X-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS)
XPS measurements were made using an ESCALAB 220-iXL spectrometer (Thermo-Electron,
VG Company). Photoemission was stimulated by monochromatized Al Kα radiation
(1486.6eV). An area of about 150µm diameter was analyzed for each sample. Surveys and
high-resolution spectra were recorded and then fitted with the Avantage processing program
provided by ThermoFisher Scientific.
AFM characterization
The Atomic Force Microscopy analysis was performed using a commercial instrument
(www.nanotec.es) operated in dynamic mode in liquid (PBS+Ca2+
or milli-Q H2O). To
characterize the samples with covalently bound cadherins we used cantilevers with a nominal
force constant of 2.8 N/m (www.nanosensors.com). To be able to image the proteins in the
135
samples that cadherins were not covalently bound to the surface we needed softer cantilevers
with a force constant of 0.03 N/m (BioLevers, www.olympus.com).
Cell culture
The normal mouse mammary epithelial cell line HC11 has been described (Wojcik et al,
2006) and was kindly provided by Dr. L. Raptis (Kingston, ON Canada). These cells were
used to assay the cell attachment onto cadherin-coated surfaces. Cells were grown in RPMI
(Gibco) supplemented with 10% FCS, 100 U/ml penicillin G, and 100 mg/ml streptomycin,
insulin, EGF. Cell culture was conducted at 37°C in a humidified atmosphere of 5% CO2 in
air.
For cell attachment assay, the cadherin-coated samples were cultured in 24-well tissue-culture
test plates. Cells were seeded on the coated surfaces at a density of 1.2x106 cells/ml and
cultured for up to 2h30. At each culture period (0.5, 1, 1.5 and 2.5 h), samples were taken out
to new tissue-culture plates.
Scanning electron microscopy
Cells were cultured on treated glass coverslips for the indicated periods of time before cells
were washed with cacodylate buffer and fixed with 2.5% glutaraldehyde (Sigma) in 0.1 M
Na cacodylate pH 7.4 for 90 min at 4°C. Samples were then treated with 1% osmium
tetroxide, 1% tannic acid then dehydrated with a series of graded methanol/water baths,
stained in 2% uranyl acetate in 70% methanol before critical-point drying with HMDS. The
samples were sputter coated with gold and observed with a Jeol JSM 6700F Field Emission
Scanning Electron Microscope operated at 5 kV.
Immunocytochemistry
HC11 cells were seeded on coverslips at a subconfluent density and incubated for different
periods of time. Cells were fixed in 4% formaldehyde in PBS for 20 minutes, permeabilized
with 0.2% Triton X-100 in PBS for 5 minutes, washed in PBS, blocked for 10 minutes in PBS
containing 0.2% BSA, and stained with the appropriate antibodies. The cells were incubated
for 1 h with primary antibodies, washed and incubated with secondary antibodies for 1 h.
Monoclonal anti-E-cadherin antibody against the cytoplasmic tail (BD Biosciences) and
136
mouse anti-b-catenin (clone 14, Transduction Laboratories, Interchim) were used at a 1:25
and 1:100 dilution respectively made with PBS containing 0,2% BSA. Images were obtained
with a laser-scanning confocal microscope (Leica DMR upright TCS SP2 AOBS).
Results and Discussion
Surface bio-functionalization is a very important and competitive field in biochemistry.
Several routes have been designed for modifying different types of materials and/or linking
bio-macromolecules to these surfaces. However, most of them fail to link these molecules
covalently and in an oriented manner. Here we present a simple glass surface modification,
using the well-known Ni-NTA technology, which for the first time fulfils these double
criteria, and furthermore could be extended to a broad type of different materials.
Glass support modifications with Nitrilotriacetic Acid (NTA)
Glass has been used as model material due to extensive use for cell culture. The first step of
this functionalization was to remove all the organics residues from the glass supports, in order
to correctly graft the epoxysilane on the surface, as described in the Experimental section. As
shown in Scheme 1, a two step method has been used: i) first, coating of the glass support
with 3-(2,3-epoxypropoxy) propyltrimethoxysilane; ii) then linkage, through the epoxy group,
of the (S)-N-(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid (NTA-NH2). The grafting of the
epoxysilane was performed with dry toluene to avoid gel formation of the silanes. The epoxy
groups on the surface guarantee an efficient reaction with the amine group of the NTA at
basic pH (10.8). At this pH, the amine of the NTA easily opens the epoxy group in a high
molar ratio. Finally, samples were incubated with a 100mM NiCl2 solution to chelate the
metal ion into the NTA moiety.
Contact angle measurements have been carried out to monitorize the functionalization
process. These data can provide useful information about the structure and composition of a
surface by examining their weattability after the different chemical treatments. After cleaning
the glass samples with piranha solution, contact angle changed from 62º to near 0º due to the
appearance of hydroxyl groups on the glass surface using these oxidative conditions. After the
silanization using 3-(2,3-epoxypropoxy) propyltrimethoxysilane, the contact angle changed to
54º. Finally, incorporation of NTA moieties originated the decreasing of the contact angle to
137
36º due to the appearance of carboxylic groups on the glass surface, and therefore the increase
of the hydrophilicity of the surface.
Hexahistidine tagged proteins immobilization
A very convenient and common way for purifying recombinant proteins is to modify their
terminal end with a polyhistidine tag, and immobilize them to a Ni-NTA support. We
developed the same strategy for attaching 6xHis cadherins recombinant fragments to glass
supports (figure 1). The orientation of the proteins on the supports will be driven by the
position of the histidine tag in the protein sequence. Cadherins amino groups in the
polyHistidine tag proximity were then crosslinked to the NTA carboxyl groups mediated by
the EDC/NHS, resulting in a simple and novel method for binding 6xHis tagged proteins in an
oriented and covalent manner. An EDTA/Imidazole mixture was used to remove Ni2+
ions,
and subsequently eliminate the non-covalently linked proteins (figure 2a and b).
In order to check the efficiency of the cadherin binding, we hid half of the glass support with
a fresh and clean piece of polydimethylsiloxane (PDMS). Cadherins fragments were
incubated on the non-hidden part of the supports then the non-covalently linked proteins
eliminated as it was previously described. The protein remaining on the surface was
visualized by immunofluorescence using a fluorescently labelled anti-cadherin antibody and
confocal microscopy. As shown in figure 2c, cadherin fragments were indeed detected only
on half of the glass supports.
XPS analysis was performed to determine the surface elemental composition for each of the
modification steps used in this study. The analysis confirmed the coupling of NTA to the
glass surface (addition of carbon and nitrogen) and the cadherin incorporation (addition of
carbon and nitrogen) (table 1).
Atomic Force Microscopy (AFM) has confirmed the formation of covalent bonds using this
strategy, at the single-molecule level in height of the protein covering layer. Figure 3a shows
an image of the covalently bound cadherins. The surface protein coverage is high (about 80 %
of the surface area) and shows the expected height with respect the Ni2+
-NTA surface (8-9
nm) as can be observed in the profile. However, when we tried to image the non-covalently
bound protein sample we always wiped out the protein from the surface even for operation
conditions in which we tip exerted minimum interaction force. We were not able to observe
the protein in the non-covalently bound surface (Figure 3b) until we used a cantilever about
100 times softer than the ones used for the covalent sample. The surface coverage is low
138
(about 15%) but the protein height is the expected one (8-9 nm), as it is shown in the profile.
Still, if we increased the tip-sample interaction by just a few percent of the amplitude
reduction we managed to sweep away the protein from the scanning area (dashed square
marked in fig. 3d) as can be observed when a larger zoomed out image is taken (figure 3d).
Images of control samples NTA+Ni (figure 3c) and bare glass slide surface in purified H2O
showed the expected roughness and no agglomerates adsorbed.
Adhesion of cells to bio functionalized glass supports
Cadherins participate in cell-cell contacts, especially in the specific cell adhesion mechanisms
mediated by the highly homophilic interactions they establish and which define cell-cell
selectivity. We choose E-cadherin fragment E/EC12 to cover our glass surfaces and promote
the adhesion of HC11 cells, which also express E-cadherin (Arulanandam et al, 2009).
For this purpose, we seeded HC11 cells, a mouse mammary epithelial cell line, on glass slides
modified or not with our mouse E-cadherin fragments and followed their kinetics of
attachment from 30 min up to 2h30. We observed by phase contrast microscopy that after 30
minutes, cells seem to gently adhere to the surfaces. Cell density was low at early time points
and increased with time. The attachment of HC11 cells was similar of both surfaces (not
shown), which is most probably due to the dynamic properties of cadherin trans interaction.
Indeed E/EC12 adhesive interactions that last for 0.1s to 1 sec (Perret et al., 2002; 2004) do
not appear to have a major influence on attachment efficiency.
We then investigated the influence of cadherin surfaces on cell spreading. By phase contrast
microscopy we observed that cells plated onto cadherin-decorated glass slides, were mostly
round at early time points then developed membrane extensions with time. These extensions
were clearly less numerous on control NTA-surfaces (not shown). To gain information about
these cell-surface contacts, cell morphology was analyzed using Scanning Electron
Microscopy (SEM). After different incubation times, cells were fixed with glutaraldehyde and
treated with contrast agents. As shown in figure 4, analysis at higher magnification revealed
that after 30 min plating on cadherin-coated surfaces, cells begin to establish contacts with
some membrane extensions. After 1 hour incubation, although most cells were still round, we
could also observe that some adhere in a stronger manner on the surfaces. After 1h30 and
2h30 plating, many cells were well spread even though some still exhibited a round shape. As
shown in figure 4, cells responded to our cadherin-decorated surfaces as large membrane
extensions were visible after 2h30, indicating that cells interact strongly with the substrate.
139
Cells on control supports without cadherins behave on a different manner. After 2h30, few
cells begin to spread, and most of them showed a round shape. Zoom at higher magnification
shows that cells did not engage significant membrane extension to enhance their adhesiveness
to the surface.
To further analyze the impact of surface functionalization, we used confocal microscopy. We
compared E-cadherin and actin distribution in HC11 cells adherent on surfaces covalently
decorated by cadherin fragments or NTA- surfaces (figure 5). We observed after 1h30 similar
topography as described in the SEM experiments: when the cells are cultured on cadherin
substrates, many HC11 cells were well spread and few still adopt a round shape. On these
spread cells, the distribution of actin cytoskeleton was most dense at the cell periphery
whereas cadherins were more uniformly distributed on the cell surface. On cells attached to
cadherin surfaces and exhibiting a round shape (figure 5b), fluorescent labeling highlighted
that the actin cytoskeleton was characterized by a circular network of filaments surrounding
the nucleus, together with radial fibers directed towards and ending in the edge of the cell, as
already described (Gavard et al, 2004). In the X-Z and Y-Z plans, cadherins were distributed
on the contact area on spread cells, and form clusters on round cells.
As observed by SEM, cells did not spread on substrates with no cadherin functionalization.
Nearly all cells were round with uniform cadherin distribution (figure 5d, e, f). Actin did not
form typical cytoskeleton patterns controlled by cadherins as in figure 5b. Finally, X-Z and
Y-Z sections showed that cadherins have no preferential localization and that actin
distribution is uniform around the cells, delimiting their profiles.
Conclusions
Covalent and oriented attachment of proteins on surfaces is a very challenging field of
biochemistry and cell biology. We have designed a fast and inexpensive method for the
immobilization of oligohistidine tagged proteins by exploiting the high recognition of this
motif to the metal chelator nitrilotriacetic acid (NTA). Our technology could also be adapted
to a broad type of different materials. The use of NTA technology may be extended to any
type of 6xHis tagged proteins, and could be a great development for biochips, biosensors,
substrates for cell adhesion, etc…Most importantly, this method is compatible with a large set
of fusion proteins while maintaining their integrity, native conformation and biological
function. The protein immobilization on the surface is controlled with respect to selectivity:
140
indeed the orientation of the biomolecule on the surface is preferentially driven by the
position of the histidine tag.
ACKNOWLEDGMENTS : This work was supported by institutional funding from CNRS,
as well as by grants from ARC (subvention libre), Région Aquitaine, Fondation pour la
Recherche Médicale, la Ligue Contre le Cancer (Dordogne) (HF), MITYC (Spain) through
the projects CTQ2005-07993-C0202/BQU, NAN2004-09125-C07-02 and PET2007_0315.
M. L. acknowledges financial support from CSIC. During this work, S.C. received a doctoral
fellowship from Région Aquitaine. JMF thanks ARAID and CCA thanks MITYC for
financial support. We thank L. Malicieux, C. Poujol and P. Legros (PICIN, Université
Bordeaux 2) and R. Vallée (CRPP) for their help with the confocal microscopy, C. Labrugère
(ICMCB, Bordeaux) and JP Salvetat (CRPP) for XPS measurements and Elisabeth Sellier
(CREMEM, Université Bordeaux 1) for scanning electron microscopy.
References:
Arulanandam R, Vultur A, Cao J, Carefoot E, Elliott BE, Truesdell PF, Larue L, Feracci H,
Raptis L (2009) Cadherin-cadherin engagement promotes cell survival via Rac1/Cdc42 and
signal transducer and activator of transcription-3. Mol Cancer Res 7(8): 1310-1327
Bettinger CJ, Langer R, Borenstein JT (2009) Engineering substrate topography at the micro-
and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl 48(30): 5406-5415
Charrasse S, Meriane M, Comunale F, Blangy A, Gauthier-Rouviere C (2002) N-cadherin-
dependent cell-cell contact regulates Rho GTPases and beta-catenin localization in mouse
C2C12 myoblasts. J Cell Biol 158(5): 953-965
Chen CS, Mrksich M, Huang S, Whitesides GM, Ingber DE (1998) Micropatterned surfaces
for control of cell shape, position, and function. Biotechnol Prog 14(3): 356-363
Courjean O, Chevreux G, Perret E, Morel A, Sanglier S, Potier N, Engel J, van Dorsselaer A,
Feracci H (2008) Modulation of E-cadherin monomer folding by cooperative binding of
calcium ions. Biochemistry 47(8): 2339-2349
Crowe J, Dobeli H, Gentz R, Hochuli E, Stuber D, Henco K (1994) 6xHis-Ni-NTA
chromatography as a superior technique in recombinant protein expression/purification.
Methods Mol Biol 31: 371-387
141
Curtis A, Riehle M (2001) Tissue engineering: the biophysical background. Phys Med Biol
46(4): R47-65
de la Fuente JM, Andar A, Gadegaard N, Berry CC, Kingshott P, Riehle MO (2006)
Fluorescent aromatic platforms for cell patterning. Langmuir 22(13): 5528-5532
Dupin I, Camand E, Etienne-Manneville S (2009) Classical cadherins control nucleus and
centrosome position and cell polarity. J Cell Biol 185(5): 779-786
Falconnet D, Csucs G, Grandin HM, Textor M (2006) Surface engineering approaches to
micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials 27(16): 3044-3063
Fuss M, Luna M, Alcantara D, Fuente JM, Penades S, Briones F (2008) Supramolecular self-
assembled arrangements of maltose glyconanoparticles. Langmuir 24(9): 5124-5128
Ganz A, Lambert M, Saez A, Silberzan P, Buguin A, Mege RM, Ladoux B (2006) Traction
forces exerted through N-cadherin contacts. Biol Cell 98(12): 721-730
Gavard J, Lambert M, Grosheva I, Marthiens V, Irinopoulou T, Riou JF, Bershadsky A, Mege
RM (2004) Lamellipodium extension and cadherin adhesion: two cell responses to cadherin
activation relying on distinct signalling pathways. J Cell Sci 117(Pt 2): 257-270
Geiger B, Spatz JP, Bershadsky AD (2009) Environmental sensing through focal adhesions.
Nat Rev Mol Cell Biol 10(1): 21-33
Hartsock A, Nelson WJ (2008) Adherens and tight junctions: structure, function and
connections to the actin cytoskeleton. Biochim Biophys Acta 1778(3): 660-669
Jonkheijm P, Weinrich D, Schroder H, Niemeyer CM, Waldmann H (2008) Chemical
strategies for generating protein biochips. Angew Chem Int Ed Engl 47(50): 9618-9647
Larue L, Antos C, Butz S, Huber O, Delmas V, Dominis M, Kemler R (1996) A role for
cadherins in tissue formation. Development 122(10): 3185-3194
Lutolf MP, Hubbell JA (2005) Synthetic biomaterials as instructive extracellular
microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol 23(1): 47-55
Nishimura T, Takeichi M (2009) Remodeling of the adherens junctions during
morphogenesis. Curr Top Dev Biol 89: 33-54
Ostuni E, Whitesides GM, Ingber DE, Chen CS (2009) Using self-assembled monolayers to
pattern ECM proteins and cells on substrates. Methods Mol Biol 522: 183-194
Patel SD, Chen CP, Bahna F, Honig B, Shapiro L (2003) Cadherin-mediated cell-cell
adhesion: sticking together as a family. Curr Opin Struct Biol 13(6): 690-698
142
Perret E, Benoliel AM, Nassoy P, Pierres A, Delmas V, Thiery JP, Bongrand P, Feracci H
(2002a) Fast dissociation kinetics between individual E-cadherin fragments revealed by flow
chamber analysis. EMBO J 21(11): 2537-2546
Perret E, Leung A, Feracci H, Evans E (2004) Trans-bonded pairs of E-cadherin exhibit a
remarkable hierarchy of mechanical strengths. Proc Natl Acad Sci U S A 101(47): 16472-
16477
Perret E, Leung A, Morel A, Feracci H, Nassoy P (2002b) Versatile Decoration of Glass
Surfaces To Probe Individual Protein−Protein Interactions and Cellular Adhesion.
Langmuir 18(3): 846-854
Schatz C, Louguet S, Le Meins JF, Lecommandoux S (2009) Polysaccharide-block-
polypeptide copolymer vesicles: towards synthetic viral capsids. Angew Chem Int Ed Engl
48(14): 2572-2575
Schmitt J, Hess H, Stunnenberg HG (1993) Affinity purification of histidine-tagged proteins.
Mol Biol Rep 18(3): 223-230
Song YF, McMillan N, Long DL, Kane S, Malm J, Riehle MO, Pradeep CP, Gadegaard N,
Cronin L (2009) Micropatterned surfaces with covalently grafted unsymmetrical
polyoxometalate-hybrid clusters lead to selective cell adhesion. J Am Chem Soc 131(4): 1340-
1341
Stevens MM, George JH (2005) Exploring and engineering the cell surface interface. Science
310(5751): 1135-1138
Thery M, Racine V, Pepin A, Piel M, Chen Y, Sibarita JB, Bornens M (2005) The
extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis. Nat Cell Biol 7(10): 947-
953
Thiery JP (2003) Cell adhesion in development: a complex signaling network. Curr Opin
Genet Dev 13(4): 365-371
van Roy F, Berx G (2008) The cell-cell adhesion molecule E-cadherin. Cell Mol Life Sci
65(23): 3756-3788
Weisbrod SH, Marx A (2008) Novel strategies for the site-specific covalent labelling of
nucleic acids. Chem Commun (Camb)(44): 5675-5685
Wojcik EJ, Sharifpoor S, Miller NA, Wright TG, Watering R, Tremblay EA, Swan K,
Mueller CR, Elliott BE (2006) A novel activating function of c-Src and Stat3 on HGF
transcription in mammary carcinoma cells. Oncogene 25(19): 2773-2784
143
Wong LS, Khan F, Micklefield J (2009) Selective covalent protein immobilization: strategies
and applications. Chem Rev 109(9): 4025-4053
C O N
Glass Slide 12,4 60,3 0,4
Glass- NTA-NH2 18,9 52,95 1,9
Glass-NTA-EC12
covalent link 36,9 36,95 4,85
Table 1: Average of XPS results. Slides were cleaned, silanized and covered with NTA-NH2.
These surfaces were then biofunctionnalized with hexahistidine-tagged E/EC12 fragments
that were or not covalently linked. Following E/EC12 incubation, surfaces were extensively
washed with [Imidazole 1M/EDTA 10mM], in order to eliminate non-covalently bound
proteins.
FIGURES LEGENDS
Figure 1: Covalent and oriented crosslinking of Histidine-tagged cadherin fragments onto
NTA surfaces. The C-ter hexaHis-tagged cadherin fragments were first immobilized using the
well known Ni-NTA technology in an orientated manner. Then the proteins were crosslinked
to the carboxylic groups of the NTA moiety, mediated by EDC and NHS.
Figure 2: Immunodetection of covalently linked cadherin fragments onto NTA surfaces.
Confocal microscopy of glass supports either covalently (a) or non-covalently (b) coated with
hexaHistidine-cadherin fragments. Both types of surfaces were treated with imidazole/EDTA
to eliminate non covalently bound proteins. Only covalently immobilized cadherin fragments
remained bound. Finally, glass support covered half with (+) and half without (-) cadherins
(mask was made with polymerized PDMS) indicating the labeling specificity (c). Scale bare =
50µm.
144
Figure 3: Dynamic Atomic Force Microscopy analysis of surfaces. Images of the
functionalized surfaces were taken under the same buffer conditions (PBS+Ca+Mg). (a) The
coverage of the covalent bound protein is around 80%, with a coverage height of a single
protein (~9 nm), as it is shown in the profile. The coverage of non-covalently bound protein
(b) is about 15%, with a height corresponding also to the one of a single protein. By slightly
increasing the interaction force between tip and sample on the of non-covalently bound
protein sample, the protein is easily swept away, as can be observed in the dashed square
marked in (d) which appears depleted from protein after just one scan under these somewhat
lower amplitude operating conditions. Fig. c shows the surface of a control sample NTA+Ni.
The surface exhibits a flat profile within a few Å of height.
Figure 4: Dynamic cell spreading depends on surfaces biofunctionalization. HC11 cells were
plated for different periods of time onto NTA-coated glass slides covalently decorated or not
with cadherin fragments, as indicated on the images. Extent of adhesive contacts was
visualized by scanning electron microscopy.
Figure 5: HC11 cells were allowed to adhere on NTA-coated (d, e, f) or E-cadherin
covalently coated (a, b, c) coverslips for 1h30 in the absence of serum to avoid integrins and
growth factor receptors activation. Cells were then fixed, permeabilized then stained for
cadherin (green, a, d), actin (red, b, e) and DNA (blue, c, f in the merge images) and observed
by confocal laser scanning microscopy. On cadherin-surfaces, many cells are well spread and
exhibit a large number of membrane tethers involving cadherin contacts and actin fibers
exhibit the typical radial organization driven by cadherin attachments. Very few contacts are
observed on NTA-surfaces (d, e, f). Corresponding orthogonal sections in the x-z and y-z axis
are shown beside, clearly indicating differences in spreading and height of cells on different
surfaces. Round cells and spread cells are about 13-15 and 6-8m height respectively. Scale
bar: 15 m.
145
Scheme 1
30 min, +Cad 1h, +Cad
2h30, +Cad 2h30, -Cad
146
Figure 31
147
Figure 32
148
Figure 33
200nm
200nm350300250200150100500
108
64
20
X[nm]
Z[n
m]
140120100806040200
108
6
42
0
X[nm]
Z[n
m]
200nm 10008006004002000
8
6
4
2
0
X[nm]
Z[Å
]
a
b
c
600nm
d22.5 nm
0
200nm
200nm350300250200150100500
108
64
20
X[nm]
Z[n
m]
140120100806040200
108
6
42
0
X[nm]
Z[n
m]
200nm 10008006004002000
8
6
4
2
0
X[nm]
Z[Å
]
a
b
c
600nm
d22.5 nm
0
200nm
200nm350300250200150100500
108
64
20
X[nm]
Z[n
m]
140120100806040200
108
6
42
0
X[nm]
Z[n
m]
200nm 10008006004002000
8
6
4
2
0
X[nm]
Z[Å
]
a
b
c
600nm600nm
d22.5 nm
0
149
Figure 34
150
Figure 35
151
ARTICLE IV: BEYONG STRUCTURE, TO SURVIVAL:
ACTIVATION OF STAT3 BY CADHERIN ENGAGEMENT
152
153
Une très abondante littérature décrit les fonctions adhésives les cadhérines, aussi bien
in vivo (Gumbiner, 2005; Takeichi, 1988b), que in vitro au niveau cellulaire (Foty &
Steinberg, 2004) et au niveau moléculaire (Leckband, 2004; Patel et al, 2003b).
L‟engagement adhésif des cadhérines, par la mise en place de jonctions cellule-cellule,
contribue à remodeler le cytosquelette d‟actine, la morphologie cellulaire et à réguler
différentes voies de signalisation (Arulanandam et al, 2009; Mege et al, 2006; Nelson, 2008;
Philippova et al, 2009; van Roy & Berx, 2008).
Le groupe du Pr L. Raptis avec lequel nous collaborons s‟intéresse tout
particulièrement au transducteur du signal Stat3 (Signal transducer and activator of
transduction-3) et a montré que son activation était corrélée à la formation de contacts cellule-
cellule. En ensemençant des cellules épithéliales sur des surfaces fonctionnalisées par les
fragments E/EC12 de façon non orientée (via la polylysine et le glutaraldéhyde), les auteurs
ont montré que, même en absence de contacts cellule-cellule, l‟engagement direct des
cadhérines induit une très nette augmentation de l‟activation de Stat3, de Rac1/Cdc42 et de la
famille du récepteur de l‟IL6 (Arulanandam et al., 2009). Cet effet est inhibé par l‟addition de
fragments de cadhérines solubles ou après ablation génétique. Cette activation de Stat3
pourrait jouer un rôle dans la survie cellulaire et contribuer à l‟établissement de la polarité
cellulaire.
Le travail présenté ici est une synthèse sur l‟état de l‟art de l‟activation de Stat3 par les
cadhérines.
154
155
156
157
158
159
160
161
162
163
164
165
CONCLUSION
166
167
De nombreux récepteurs exprimés au niveau de la membrane plasmique permettent
aux cellules de percevoir leur environnement. Certains de ces récepteurs ont des propriétés
adhésives qui contribuent à la structuration et la cohésion des tissus. Parmi ces molécules, les
cadhérines ont un rôle décisif au cours du développement embryonnaire dans le tri et la
différenciation cellulaire, et aussi à l‟âge adulte dans la stabilisation des tissus. En particulier
la E-cadhérine a une part active dans l‟initiation des jonctions intercellulaires et participe au
maintien des épithéliums. Si l‟implication des cadhérines dans ces diverses activités
biologiques est clairement établie, les mécanismes moléculaires qui permettent de réaliser ces
fonctions est encore mal connu.
La façon dont les cadhérines interagissent est à l‟heure actuelle toujours sujet à débats.
De nombreux points restent à éclaircir : l‟existence au sein du segment extracellulaire d‟une
ou plusieurs interfaces adhésives, l‟implication d‟autres domaines au delà du domaine EC1,
les éléments structuraux intervenant dans la spécificité des interactions, la nécessité ou non de
dimères parallèles préétablis pour que les contacts adhésifs se réalisent, la régulation de la
réponse cellulaire, etc…
Au début de ce travail, nous avons pensé que la complexité des interactions ne pouvait
être décryptée sans des informations complémentaires sur la dynamique de formation des
dimères adhésifs. En effet, quatre interactions ont été décrites le long du segment
extracellulaire, dont deux sont clairement réalisées au niveau de l‟extrémité N-ter (EC12) de
la molécule (Perret et al., 2002 ; Perret et al., 2004 ; Bayas et al., 2006 ; du Roure et al.,
2006). Les données structurales, multiples, ont progressivement évolué et il est maintenant
admis que les cadhérines classiques de type I, au niveau du module EC1, interagissent par
échange de brin (Chen et al., 2005). Néanmoins, à la lumière de ces informations, il est
difficile de comprendre comment des interactions entre cadhérines classiques de type I, de
type II et desmosomales peuvent être spécifiques malgré la présence d‟homologies au niveau
des éléments structuraux constituant l‟interface adhésive. Il nous a semblé essentiel de définir
le rôle de certains acides aminés dans l‟interaction adhésive. C‟est avec cet objectif que nous
avons comparé les paramètres dynamiques d‟interaction, à l‟échelle d‟une paire adhésive
individuelle, des segments EC12 de la E-cadhérine (type I) et de la cadhérine-11 (type II).
168
Notre première étude, centrée sur l‟interface adhésive des cadhérines de type I, a
permis de mieux caractériser le rôle du Trp2, et d‟apporter des informations nouvelles
concernant les interactions entre molécules de E-cadhérine. Ce résidu est essentiel pour la
fonctionnalité adhésive des cadhérines, à la fois in vitro et in vivo. La chaîne latérale du Trp2,
visualisée dans une poche hydrophobe au niveau du module EC1 soit en intramoléculaire soit
de façon intermoléculaire, fait partie de l‟échange de brin . Nous avons montré que ce résidu
favorise non seulement la stabilité mais aussi la formation de la liaison ; il semble agir comme
un « hameçon moléculaire », explorant l‟environnement pour essentiellement jouer sur la
première étape d‟un processus en deux temps. Le Trp2 est un acide aminé conservé parmi les
cadhérines classiques et desmosomales. On peut donc supposer que l‟initiation de
l‟interaction entre molécules de cadhérines est un processus conservé. Par contre, la
spécificité d‟interaction (homophilie) pourrait venir de l‟ajustement de l‟interface adhésive et
donc jouer dans un deuxième temps, comme ceci a déjà été suggéré (Perret et al., 2002 ; Chen
et al., 2005).
La caractérisation structurale des dimères adhésifs a été essentiellement faite par des
mesures à l‟équilibre (RX, RMN), qui informent sur les états les plus stables, à savoir
l‟échange des deux brins dans une conformation symétrique. L‟approche que nous avons
choisie –chambre à flux laminaire- permet de sonder la dynamique de formation et de
dissociation d‟une interaction à l‟échelle de la liaison unique. De façon très intéressante, par
le confinement des molécules sur les deux surfaces de la chambre, cette approche permet
éventuellement d‟influer sur le chemin réactionnel d‟une interaction asymétrique. Cette étude
a ainsi permis pour la première fois de caractériser un intermédiaire réactionnel et de montrer
que l‟échange de brin se fait de façon séquentielle, dissymétrique: l‟interaction est initiée
par une seule des deux molécules. Une telle interaction asymétrique pourrait intervenir soit
pour consolider l‟interface adhésive soit pour former des dimères cis et conduire à des
arrangements moléculaires complexes, comme décrits au sein des desmosomes (He et al.,
2002). La mise en évidence de cet intermédiaire réactionnel n‟impliquant qu‟un seul Trp2,
fournit une base moléculaire pour rendre compte à la fois de la plasticité et de la stabilité des
jonctions adhérentes.
Notre seconde étude compare les paramètres cinétiques des cadhérines de type I et de
type II. Les images de cristallographie RX montrent que la surface adhésive des cadhérines de
type II est formée par échange de brin incluant les Trp2 et 4 ainsi qu‟une zone
supplémentaire par rapport aux cadhérines de type I, principalement formée de résidus
hydrophobes. En comparant les paramètres cinétiques à l‟échelle de la molécule unique, nous
avons pu montrer que les cadhérines E- et -11 ont des efficacités adhésives nettement
169
différentes, mais surtout la principale différence porte sur l‟initiation de l‟interaction. De
façon très inattendue, les Trp2 et 4 des cadhérines des types II ne semblent pas jouer le même
rôle que dans les cadhérines de type I. En effet, leur mutation ne modifie pas
significativement l‟interaction ; c‟est en mutant les acides aminés de la zone hydrophobe
étendue de l‟interface adhésive que l‟on perturbe l‟interaction. Il apparait donc que l‟interface
adhésive des cadhérines de type II, plus structurée, mette plus de temps à s‟ajuster que celle
des cadhérines de type I.
Nous avons ensuite développé une chimie de surface innovante, permettant d‟orienter
les fragments de cadhérines à la fois de manière orientée et covalente. Cette
biofonctionnalisation peut être facilement transposable à d‟autres protéines possédant un
motif hexahistidine, et fait l‟objet d‟un dépôt de brevet. Ce travail préliminaire sera poursuivi
après cette thèse par la mise au point de surfaces modèles présentant une organisation
micro/nanocontrôlée des protéines afin de mimer les différentes étapes de maturation des
jonctions adhérentes. Ceci nous aidera à comprendre l‟influence de la topographie des
cadhérines sur le comportement cellulaire. La dernière partie présente la synthèse des travaux
montrant que l‟engagement direct de la E-cadhérine intervient sur l‟activation et la régulation
d‟un facteur de transcription, Stat3, et sur la survie cellulaire. Les signaux intracellulaires des
cellules devront être étudiés pour être corrélés à la géométrie des cadhérines sur les surfaces
biomimétiques.
L‟ensemble de ce travail a consisté à étudier les propriétés dynamiques à l‟échelle de
la molécule unique des cadhérines de type I et de type II. Nous avons ainsi pu déterminer le
rôle de certains acides aminés très conservés au sein de ces familles de cadhérines, et mettre
en évidence un mécanisme d‟interaction différent pour ces deux types de cadhérines. Cette
étude des relations structure-fonction des cadhérines, devrait aboutir sur la compréhension des
phénomènes collectifs des cadhérines, à la surface des cellules. En effet, dans le contexte
cellulaire, les propriétés des cadhérines sont modulées par l‟action de divers partenaires
membranaires ou/et cytoplasmiques. Le niveau d‟expression à la surface cellulaire, le
recrutement dans la zone de contact, le renforcement par l‟actine et l‟activation de voies de
signalisation contribuent à la mise en place des jonctions adhérentes. A plus long terme, il
sera intéressant de relier les propriétés structurales des divers constituants de ces jonctions
avec la dynamique des différentes interactions au sein de ces échafaudages moléculaires pour
les intégrer et mieux comprendre le comportement cellulaire.
170
171
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
172
173
Abe K, Takeichi M (2008) EPLIN mediates linkage of the cadherin catenin complex to F-actin and
stabilizes the circumferential actin belt. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 13-19
Agarwal SK, Lee DM, Kiener HP, Brenner MB (2008) Coexpression of two mesenchymal cadherins,
cadherin 11 and N-cadherin, on murine fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheum 58: 1044-1054
Al-Amoudi A, Diez DC, Betts MJ, Frangakis AS (2007) The molecular architecture of cadherins in
native epidermal desmosomes. Nature 450: 832-837
Allen E, Yu QC, Fuchs E (1996) Mice expressing a mutant desmosomal cadherin exhibit
abnormalities in desmosomes, proliferation, and epidermal differentiation. J Cell Biol 133: 1367-1382
Arulanandam R, Vultur A, Cao J, Carefoot E, Elliott BE, Truesdell PF, Larue L, Feracci H, Raptis L
(2009) Cadherin-cadherin engagement promotes cell survival via Rac1/Cdc42 and signal transducer
and activator of transcription-3. Mol Cancer Res 7: 1310-1327
Barrientos LG, Louis JM, Botos I, Mori T, Han Z, O'Keefe BR, Boyd MR, Wlodawer A, Gronenborn
AM (2002) The domain-swapped dimer of cyanovirin-N is in a metastable folded state: reconciliation
of X-ray and NMR structures. Structure 10: 673-686
Bayas MV, Leung A, Evans E, Leckband D (2006) Lifetime measurements reveal kinetic differences
between homophilic cadherin bonds. Biophys J 90: 1385-1395
Bennett MJ, Choe S, Eisenberg D (1994a) Domain swapping: entangling alliances between proteins.
Proc Natl Acad Sci U S A 91: 3127-3131
Bennett MJ, Choe S, Eisenberg D (1994b) Refined structure of dimeric diphtheria toxin at 2.0 A
resolution. Protein Sci 3: 1444-1463
Bergdoll M, Eltis LD, Cameron AD, Dumas P, Bolin JT (1998) All in the family: structural and
evolutionary relationships among three modular proteins with diverse functions and variable assembly.
Protein Sci 7: 1661-1670
Bettinger CJ, Langer R, Borenstein JT (2009) Engineering substrate topography at the micro- and
nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl 48: 5406-5415
Birchmeier C, Birchmeier W, Brand-Saberi B (1996) Epithelial-mesenchymal transitions in cancer
progression. Acta Anat (Basel) 156: 217-226
Blaschuk OW, Sullivan R, David S, Pouliot Y (1990) Identification of a cadherin cell adhesion
recognition sequence. Dev Biol 139: 227-229
Boggon TJ, Murray J, Chappuis-Flament S, Wong E, Gumbiner BM, Shapiro L (2002) C-cadherin
ectodomain structure and implications for cell adhesion mechanisms. Science 296: 1308-1313
Boscher C, Mege RM (2008) Cadherin-11 interacts with the FGF receptor and induces neurite
outgrowth through associated downstream signalling. Cell Signal 20: 1061-1072
Bottcher RT, Niehrs C (2005) Fibroblast growth factor signaling during early vertebrate development.
Endocr Rev 26: 63-77
Bradshaw RA, Brickey WW, Walker KW (1998) N-terminal processing: the methionine
aminopeptidase and N alpha-acetyl transferase families. Trends Biochem Sci 23: 263-267
Butz S, Larue L (1995) Expression of catenins during mouse embryonic development and in adult
tissues. Cell Adhes Commun 3: 337-352
174
Cadigan KM, Nusse R (1997) Wnt signaling: a common theme in animal development. Genes Dev 11:
3286-3305
Carter SB (1965) Principles of cell motility: the direction of cell movement and cancer invasion.
Nature 208: 1183-1187
Chappuis-Flament S, Wong E, Hicks LD, Kay CM, Gumbiner BM (2001) Multiple cadherin
extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J Cell Biol 154: 231-243
Charrasse S, Meriane M, Comunale F, Blangy A, Gauthier-Rouviere C (2002) N-cadherin-dependent
cell-cell contact regulates Rho GTPases and beta-catenin localization in mouse C2C12 myoblasts. J
Cell Biol 158: 953-965
Chen CP, Posy S, Ben-Shaul A, Shapiro L, Honig BH (2005) Specificity of cell-cell adhesion by
classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl
Acad Sci U S A 102: 8531-8536
Chen CS, Mrksich M, Huang S, Whitesides GM, Ingber DE (1998) Micropatterned surfaces for
control of cell shape, position, and function. Biotechnol Prog 14: 356-363
Chen YW, Stott K, Perutz MF (1999) Crystal structure of a dimeric chymotrypsin inhibitor 2 mutant
containing an inserted glutamine repeat. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 1257-1261
Cheung VG, Morley M, Aguilar F, Massimi A, Kucherlapati R, Childs G (1999) Making and reading
microarrays. Nat Genet 21: 15-19
Chitaev NA, Troyanovsky SM (1997) Direct Ca2+-dependent heterophilic interaction between
desmosomal cadherins, desmoglein and desmocollin, contributes to cell-cell adhesion. J Cell Biol 138:
193-201
Christofori G, Semb H (1999) The role of the cell-adhesion molecule E-cadherin as a tumour-
suppressor gene. Trends Biochem Sci 24: 73-76
Chu K, Cheng CJ, Ye X, Lee YC, Zurita AJ, Chen DT, Yu-Lee LY, Zhang S, Yeh ET, Hu MC,
Logothetis CJ, Lin SH (2008) Cadherin-11 promotes the metastasis of prostate cancer cells to bone.
Mol Cancer Res 6: 1259-1267
Chu YS, Eder O, Thomas WA, Simcha I, Pincet F, Ben-Ze'ev A, Perez E, Thiery JP, Dufour S (2006)
Prototypical type I E-cadherin and type II cadherin-7 mediate very distinct adhesiveness through their
extracellular domains. J Biol Chem 281: 2901-2910
Clevers H (2006) Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell 127: 469-480
Courjean O, Chevreux G, Perret E, Morel A, Sanglier S, Potier N, Engel J, van Dorsselaer A, Feracci
H (2008) Modulation of E-cadherin monomer folding by cooperative binding of calcium ions.
Biochemistry 47: 2339-2349
Crestfield AM, Stein WH, Moore S (1962) On the aggregation of bovine pancreatic ribonuclease.
Arch Biochem Biophys Suppl 1: 217-222
Cross B, Ronzon F, Roux B, Rieu JP (2005) Measurement of the anchorage force between GPI-
anchored alkaline phosphatase and supported membranes by AFM force spectroscopy. Langmuir 21:
5149-5153
Crowe J, Dobeli H, Gentz R, Hochuli E, Stuber D, Henco K (1994) 6xHis-Ni-NTA chromatography as
a superior technique in recombinant protein expression/purification. Methods Mol Biol 31: 371-387
Curtis A, Riehle M (2001) Tissue engineering: the biophysical background. Phys Med Biol 46: R47-65
175
Dames SA, Bang E, Haussinger D, Ahrens T, Engel J, Grzesiek S (2008) Insights into the low
adhesive capacity of human T-cadherin from the NMR structure of Its N-terminal extracellular
domain. J Biol Chem 283: 23485-23495
Damjanov I, Damjanov A, Damsky CH (1986) Developmentally regulated expression of the cell-cell
adhesion glycoprotein cell-CAM 120/80 in peri-implantation mouse embryos and extraembryonic
membranes. Dev Biol 116: 194-202
Damsky CH, Richa J, Solter D, Knudsen K, Buck CA (1983) Identification and purification of a cell
surface glycoprotein mediating intercellular adhesion in embryonic and adult tissue. Cell 34: 455-466
Davis MA, Ireton RC, Reynolds AB (2003) A core function for p120-catenin in cadherin turnover. J
Cell Biol 163: 525-534
Davis MA, Reynolds AB (2006) Blocked acinar development, E-cadherin reduction, and
intraepithelial neoplasia upon ablation of p120-catenin in the mouse salivary gland. Dev Cell 10: 21-
31
de Boer E, Rodriguez P, Bonte E, Krijgsveld J, Katsantoni E, Heck A, Grosveld F, Strouboulis J
(2003) Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in
mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 7480-7485
de la Fuente JM, Andar A, Gadegaard N, Berry CC, Kingshott P, Riehle MO (2006) Fluorescent
aromatic platforms for cell patterning. Langmuir 22: 5528-5532
Delamarche E, Bernard A, Schmid H, Michel B, Biebuyck H (1997) Patterned delivery of
immunoglobulins to surfaces using microfluidic networks. Science 276: 779-781
Derycke LD, Bracke ME (2004) N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation,
embryogenesis, invasion and signalling. Int J Dev Biol 48: 463-476
Duguay D, Foty RA, Steinberg MS (2003) Cadherin-mediated cell adhesion and tissue segregation:
qualitative and quantitative determinants. Dev Biol 253: 309-323
Dupin I, Camand E, Etienne-Manneville S (2009) Classical cadherins control nucleus and centrosome
position and cell polarity. J Cell Biol 185: 779-786
Falconnet D, Csucs G, Grandin HM, Textor M (2006) Surface engineering approaches to micropattern
surfaces for cell-based assays. Biomaterials 27: 3044-3063
Farquhar MG, Palade GE (1963) Junctional complexes in various epithelia. J Cell Biol 17: 375-412
Fedor-Chaiken M, Hein PW, Stewart JC, Brackenbury R, Kinch MS (2003) E-cadherin binding
modulates EGF receptor activation. Cell Commun Adhes 10: 105-118
Fernandez-Lafuente R, Rosell CM, Rodriguez V, Santana C, Soler G, Bastida A, Guisan JM (1993)
Preparation of activated supports containing low pK amino groups. A new tool for protein
immobilization via the carboxyl coupling method. Enzyme Microb Technol 15: 546-550
Fixe F, Dufva M, Telleman P, Christensen CB (2004) Functionalization of poly(methyl methacrylate)
(PMMA) as a substrate for DNA microarrays. Nucleic Acids Res 32: e9
Foty RA, Steinberg MS (2004) Cadherin-mediated cell-cell adhesion and tissue segregation in relation
to malignancy. Int J Dev Biol 48: 397-409
Foty RA, Steinberg MS (2005) The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Dev Biol
278: 255-263
176
Frottin F, Martinez A, Peynot P, Mitra S, Holz RC, Giglione C, Meinnel T (2006) The proteomics of
N-terminal methionine cleavage. Mol Cell Proteomics 5: 2336-2349
Furukawa F, Takigawa M, Matsuyoshi N, Shirahama S, Wakita H, Fujita M, Horiguchi Y, Imamura S
(1994) Cadherins in cutaneous biology. J Dermatol 21: 802-813
Furuse M, Hirase T, Itoh M, Nagafuchi A, Yonemura S, Tsukita S (1993) Occludin: a novel integral
membrane protein localizing at tight junctions. J Cell Biol 123: 1777-1788
Fuss M, Luna M, Alcantara D, Fuente JM, Penades S, Briones F (2008) Supramolecular self-
assembled arrangements of maltose glyconanoparticles. Langmuir 24: 5124-5128
Gallin WJ, Edelman GM, Cunningham BA (1983) Characterization of L-CAM, a major cell adhesion
molecule from embryonic liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A 80: 1038-1042
Ganz A, Lambert M, Saez A, Silberzan P, Buguin A, Mege RM, Ladoux B (2006) Traction forces
exerted through N-cadherin contacts. Biol Cell 98: 721-730
Garrod DR, Berika MY, Bardsley WF, Holmes D, Tabernero L (2005) Hyper-adhesion in
desmosomes: its regulation in wound healing and possible relationship to cadherin crystal structure. J
Cell Sci 118: 5743-5754
Gavard J, Lambert M, Grosheva I, Marthiens V, Irinopoulou T, Riou JF, Bershadsky A, Mege RM
(2004) Lamellipodium extension and cadherin adhesion: two cell responses to cadherin activation
relying on distinct signalling pathways. J Cell Sci 117: 257-270
Geiger B, Spatz JP, Bershadsky AD (2009) Environmental sensing through focal adhesions. Nat Rev
Mol Cell Biol 10: 21-33
Gizeli E, Glad J (2004) Single-step formation of a biorecognition layer for assaying histidine-tagged
proteins. Anal Chem 76: 3995-4001
Green NM (1975) Avidin. Adv Protein Chem 29: 85-133
Gumbiner BM (1996) Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis.
Cell 84: 345-357
Gumbiner BM (2005) Regulation of cadherin-mediated adhesion in morphogenesis. Nat Rev Mol Cell
Biol 6: 622-634
Guo HB, Johnson H, Randolph M, Pierce M (2009) Regulation of homotypic cell-cell adhesion by
branched N-glycosylation of N-cadherin extracellular EC2-3 domains. J Biol Chem
Halbleib JM, Nelson WJ (2006) Cadherins in development: cell adhesion, sorting, and tissue
morphogenesis. Genes Dev 20: 3199-3214
Harrison OJ, Corps EM, Berge T, Kilshaw PJ (2005a) The mechanism of cell adhesion by classical
cadherins: the role of domain 1. J Cell Sci 118: 711-721
Harrison OJ, Corps EM, Kilshaw PJ (2005b) Cadherin adhesion depends on a salt bridge at the N-
terminus. J Cell Sci 118: 4123-4130
Hartsock A, Nelson WJ (2008) Adherens and tight junctions: structure, function and connections to
the actin cytoskeleton. Biochim Biophys Acta 1778: 660-669
177
Hashimoto T, Kiyokawa C, Mori O, Miyasato M, Chidgey MA, Garrod DR, Kobayashi Y, Komori K,
Ishii K, Amagai M, Nishikawa T (1997) Human desmocollin 1 (Dsc1) is an autoantigen for the
subcorneal pustular dermatosis type of IgA pemphigus. J Invest Dermatol 109: 127-131
Hatta K, Nose A, Nagafuchi A, Takeichi M (1988) Cloning and expression of cDNA encoding a
neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J Cell Biol
106: 873-881
Hatta K, Takeichi M (1986) Expression of N-cadherin adhesion molecules associated with early
morphogenetic events in chick development. Nature 320: 447-449
Haussinger D, Ahrens T, Aberle T, Engel J, Stetefeld J, Grzesiek S (2004) Proteolytic E-cadherin
activation followed by solution NMR and X-ray crystallography. Embo J 23: 1699-1708
Haussinger D, Ahrens T, Sass HJ, Pertz O, Engel J, Grzesiek S (2002) Calcium-dependent
homoassociation of E-cadherin by NMR spectroscopy: changes in mobility, conformation and
mapping of contact regions. J Mol Biol 324: 823-839
Hazan RB, Phillips GR, Qiao RF, Norton L, Aaronson SA (2000) Exogenous expression of N-
cadherin in breast cancer cells induces cell migration, invasion, and metastasis. J Cell Biol 148: 779-
790
He W, Cowin P, Stokes DL (2003) Untangling desmosomal knots with electron tomography. Science
302: 109-113
Hebbard LW, Garlatti M, Young LJ, Cardiff RD, Oshima RG, Ranscht B (2008) T-cadherin supports
angiogenesis and adiponectin association with the vasculature in a mouse mammary tumor model.
Cancer Res 68: 1407-1416
Heupel WM, Baumgartner W, Laymann B, Drenckhahn D, Golenhofen N (2008) Different Ca2+
affinities and functional implications of the two synaptic adhesion molecules cadherin-11 and N-
cadherin. Mol Cell Neurosci 37: 548-558
Hinck L, Nathke IS, Papkoff J, Nelson WJ (1994) Dynamics of cadherin/catenin complex formation:
novel protein interactions and pathways of complex assembly. J Cell Biol 125: 1327-1340
Hinz B, Pittet P, Smith-Clerc J, Chaponnier C, Meister JJ (2004) Myofibroblast development is
characterized by specific cell-cell adherens junctions. Mol Biol Cell 15: 4310-4320
Hirel PH, Schmitter MJ, Dessen P, Fayat G, Blanquet S (1989) Extent of N-terminal methionine
excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the penultimate amino
acid. Proc Natl Acad Sci U S A 86: 8247-8251
Hlady VV, Buijs J (1996) Protein adsorption on solid surfaces. Curr Opin Biotechnol 7: 72-77
Hodneland CD, Lee YS, Min DH, Mrksich M (2002) Selective immobilization of proteins to self-
assembled monolayers presenting active site-directed capture ligands. Proc Natl Acad Sci U S A 99:
5048-5052
Holloway AJ, van Laar RK, Tothill RW, Bowtell DD (2002) Options available--from start to finish--
for obtaining data from DNA microarrays II. Nat Genet 32 Suppl: 481-489
Hoppler S, Kavanagh CL (2007) Wnt signalling: variety at the core. J Cell Sci 120: 385-393
Hoschuetzky H, Aberle H, Kemler R (1994) Beta-catenin mediates the interaction of the cadherin-
catenin complex with epidermal growth factor receptor. J Cell Biol 127: 1375-1380
178
Hulpiau P, van Roy F (2009) Molecular evolution of the cadherin superfamily. Int J Biochem Cell Biol
41: 349-369
Hyafil F, Babinet C, Jacob F (1981) Cell-cell interactions in early embryogenesis: a molecular
approach to the role of calcium. Cell 26: 447-454
Hyafil F, Morello D, Babinet C, Jacob F (1980) A cell surface glycoprotein involved in the
compaction of embryonal carcinoma cells and cleavage embryos. Cell 21: 927-934
Ichihara T, Akada JK, Kamei S, Ohshiro S, Sato D, Fujimoto M, Kuramitsu Y, Nakamura K (2006) A
novel approach of protein immobilization for protein chips using an oligo-cysteine tag. J Proteome
Res 5: 2144-2151
Ireton RC, Davis MA, van Hengel J, Mariner DJ, Barnes K, Thoreson MA, Anastasiadis PZ, Matrisian
L, Bundy LM, Sealy L, Gilbert B, van Roy F, Reynolds AB (2002) A novel role for p120 catenin in E-
cadherin function. J Cell Biol 159: 465-476
Islam S, Carey TE, Wolf GT, Wheelock MJ, Johnson KR (1996) Expression of N-cadherin by human
squamous carcinoma cells induces a scattered fibroblastic phenotype with disrupted cell-cell adhesion.
J Cell Biol 135: 1643-1654
Jeanes A, Gottardi CJ, Yap AS (2008) Cadherins and cancer: how does cadherin dysfunction promote
tumor progression? Oncogene 27: 6920-6929
Johnsson B, Lofas S, Lindquist G (1991) Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-
modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors. Anal
Biochem 198: 268-277
Jonkheijm P, Weinrich D, Schroder H, Niemeyer CM, Waldmann H (2008) Chemical strategies for
generating protein biochips. Angew Chem Int Ed Engl 47: 9618-9647
Kato K, Sato H, Iwata H (2005) Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto
micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir 21: 7071-7075
Katsamba P, Carroll K, Ahlsen G, Bahna F, Vendome J, Posy S, Rajebhosale M, Price S, Jessell TM,
Ben-Shaul A, Shapiro L, Honig BH (2009) Linking molecular affinity and cellular specificity in
cadherin-mediated adhesion. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 11594-11599
Kiener HP, Niederreiter B, Lee DM, Jimenez-Boj E, Smolen JS, Brenner MB (2009) Cadherin 11
promotes invasive behavior of fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheum 60: 1305-1310
Kimura TE, Merritt AJ, Garrod DR (2007) Calcium-independent desmosomes of keratinocytes are
hyper-adhesive. J Invest Dermatol 127: 775-781
Koller E, Ranscht B (1996) Differential targeting of T- and N-cadherin in polarized epithelial cells. J
Biol Chem 271: 30061-30067
Lampugnani MG, Orsenigo F, Gagliani MC, Tacchetti C, Dejana E (2006) Vascular endothelial
cadherin controls VEGFR-2 internalization and signaling from intracellular compartments. J Cell Biol
174: 593-604
Larue L, Antos C, Butz S, Huber O, Delmas V, Dominis M, Kemler R (1996a) A role for cadherins in
tissue formation. Development 122: 3185-3194
Larue L, Antos C, Butz S, Huber O, Delmas V, Dominis M, Kemler R (1996b) A role for cadherins in
tissue formation. Development 122: 3185-3194
179
Larue L, Ohsugi M, Hirchenhain J, Kemler R (1994) E-cadherin null mutant embryos fail to form a
trophectoderm epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A 91: 8263-8267.
Leckband D (2004) Nanomechanics of adhesion proteins. Curr Opin Struct Biol 14: 524-530
Lee HJ, Yan Y, Marriott G, Corn RM (2005) Quantitative functional analysis of protein complexes on
surfaces. J Physiol 563: 61-71
Lee JN, Jiang X, Ryan D, Whitesides GM (2004) Compatibility of mammalian cells on surfaces of
poly(dimethylsiloxane). Langmuir 20: 11684-11691
Lee KB, Lim JH, Mirkin CA (2003) Protein nanostructures formed via direct-write dip-pen
nanolithography. J Am Chem Soc 125: 5588-5589
Lee MH, Klein RL, El-Shewy HM, Luttrell DK, Luttrell LM (2008) The adiponectin receptors
AdipoR1 and AdipoR2 activate ERK1/2 through a Src/Ras-dependent pathway and stimulate cell
growth. Biochemistry 47: 11682-11692
Lee SW (1996) H-cadherin, a novel cadherin with growth inhibitory functions and diminished
expression in human breast cancer. Nat Med 2: 776-782
Lewis RJ, Muchova K, Brannigan JA, Barak I, Leonard G, Wilkinson AJ (2000) Domain swapping in
the sporulation response regulator Spo0A. J Mol Biol 297: 757-770
Lin MS, Mascaro JM, Jr., Liu Z, Espana A, Diaz LA (1997) The desmosome and hemidesmosome in
cutaneous autoimmunity. Clin Exp Immunol 107 Suppl 1: 9-15
Love JC, Estroff LA, Kriebel JK, Nuzzo RG, Whitesides GM (2005) Self-assembled monolayers of
thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem Rev 105: 1103-1169
Lutolf MP, Hubbell JA (2005) Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments
for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol 23: 47-55
Malicki J, Jo H, Pujic Z (2003) Zebrafish N-cadherin, encoded by the glass onion locus, plays an
essential role in retinal patterning. Dev Biol 259: 95-108
Mandai K, Nakanishi H, Satoh A, Obaishi H, Wada M, Nishioka H, Itoh M, Mizoguchi A, Aoki T,
Fujimoto T, Matsuda Y, Tsukita S, Takai Y (1997) Afadin: A novel actin filament-binding protein
with one PDZ domain localized at cadherin-based cell-to-cell adherens junction. J Cell Biol 139: 517-
528
Marambaud P, Shioi J, Serban G, Georgakopoulos A, Sarner S, Nagy V, Baki L, Wen P,
Efthimiopoulos S, Shao Z, Wisniewski T, Robakis NK (2002) A presenilin-1/gamma-secretase
cleavage releases the E-cadherin intracellular domain and regulates disassembly of adherens junctions.
EMBO J 21: 1948-1956
Marcozzi C, Burdett ID, Buxton RS, Magee AI (1998) Coexpression of both types of desmosomal
cadherin and plakoglobin confers strong intercellular adhesion. J Cell Sci 111 ( Pt 4): 495-509
Martzen MR, McCraith SM, Spinelli SL, Torres FM, Fields S, Grayhack EJ, Phizicky EM (1999) A
biochemical genomics approach for identifying genes by the activity of their products. Science 286:
1153-1155
Massia SP, Hubbell JA (1991) An RGD spacing of 440 nm is sufficient for integrin alpha V beta 3-
mediated fibroblast spreading and 140 nm for focal contact and stress fiber formation. J Cell Biol 114:
1089-1100
180
Mege RM, Gavard J, Lambert M (2006) Regulation of cell-cell junctions by the cytoskeleton. Curr
Opin Cell Biol 18: 541-548
Merkel R, Nassoy P, Leung A, Ritchie K, Evans E (1999) Energy landscapes of receptor-ligand bonds
explored with dynamic force spectroscopy. Nature 397: 50-53
Miloushev VZ, Bahna F, Ciatto C, Ahlsen G, Honig B, Shapiro L, Palmer AG, 3rd (2008) Dynamic
properties of a type II cadherin adhesive domain: implications for the mechanism of strand-swapping
of classical cadherins. Structure 16: 1195-1205
Miranda KC, Joseph SR, Yap AS, Teasdale RD, Stow JL (2003) Contextual binding of p120ctn to E-
cadherin at the basolateral plasma membrane in polarized epithelia. J Biol Chem 278: 43480-43488
Miyaguchi K (2000) Ultrastructure of the zonula adherens revealed by rapid-freeze deep-etching. J
Struct Biol 132: 169-178
Miyatani S, Shimamura K, Hatta M, Nagafuchi A, Nose A, Matsunaga M, Hatta K, Takeichi M (1989)
Neural cadherin: role in selective cell-cell adhesion. Science 245: 631-635
Morishita H, Yagi T (2007) Protocadherin family: diversity, structure, and function. Curr Opin Cell
Biol 19: 584-592
Morrison ME, Racaniello VR (1992) Molecular cloning and expression of a murine homolog of the
human poliovirus receptor gene. J Virol 66: 2807-2813
Moyer WA, Steinberg MS (1976) Do rates of intercellular adhesion measure the cell affinities
reflected in cell-sorting and tissue-spreading configurations? Dev Biol 52: 246-262
Mutoh T, Hamada S, Senzaki K, Murata Y, Yagi T (2004) Cadherin-related neuronal receptor 1
(CNR1) has cell adhesion activity with beta1 integrin mediated through the RGD site of CNR1. Exp
Cell Res 294: 494-508
Nagafuchi A, Ishihara S, Tsukita S (1994) The roles of catenins in the cadherin-mediated cell
adhesion: functional analysis of E-cadherin-alpha catenin fusion molecules. J Cell Biol 127: 235-245
Nagafuchi A, Shirayoshi Y, Okasaki K, Yasuda K, Takeichi M (1987) Transformation of cell adhesion
properties by exogenously introduced E-cadherin cDNA. Nature 329: 341-343
Nagar B, Overduin M, Ikura M, Rini JM (1996) Structural basis of calcium-induced E-cadherin
rigidification and dimerization. Nature 380: 360-364
Nelson WJ (2008) Regulation of cell-cell adhesion by the cadherin-catenin complex. Biochem Soc
Trans 36: 149-155
Nieman MT, Prudoff RS, Johnson KR, Wheelock MJ (1999) N-cadherin promotes motility in human
breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol 147: 631-644
Niessen CM, Gumbiner BM (2002) Cadherin-mediated cell sorting not determined by binding or
adhesion specificity. J Cell Biol 156: 389-399
Nishimura T, Takeichi M (2009) Remodeling of the adherens junctions during morphogenesis. Curr
Top Dev Biol 89: 33-54
Noe V, Willems J, Vandekerckhove J, Roy FV, Bruyneel E, Mareel M (1999) Inhibition of adhesion
and induction of epithelial cell invasion by HAV-containing E-cadherin-specific peptides. J Cell Sci
112 ( Pt 1): 127-135
181
Nollet F, Kools P, van Roy F (2000) Phylogenetic analysis of the cadherin superfamily allows
identification of six major subfamilies besides several solitary members. J Mol Biol 299: 551-572
Nose A, Takeichi M (1986) A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns
associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J Cell Biol 103: 2649-2658
Ogama Y, Ouchida M, Yoshino T, Ito S, Takimoto H, Shiote Y, Ishimaru F, Harada M, Tanimoto M,
Shimizu K (2004) Prevalent hyper-methylation of the CDH13 gene promoter in malignant B cell
lymphomas. Int J Oncol 25: 685-691
Ogou S, Okada TS, Takeichi M (1982) Cleavage stage mouse embryos share a common cell adhesion
system with teratocarcinoma cells. Dev Biol 92: 521-528
Ostuni E, Whitesides GM, Ingber DE, Chen CS (2009) Using self-assembled monolayers to pattern
ECM proteins and cells on substrates. Methods Mol Biol 522: 183-194
Ozawa M, Baribault H, Kemler R (1989) The cytoplasmic domain of the cell adhesion molecule
uvomorulin associates with three independent proteins structurally related in different species. EMBO
J 8: 1711-1717
Ozawa M, Engel J, Kemler R (1990a) Single amino acid substitutions in one Ca2+ binding site of
uvomorulin abolish the adhesive function. Cell 63: 1033-1038
Ozawa M, Ringwald M, Kemler R (1990b) Uvomorulin-catenin complex formation is regulated by a
specific domain in the cytoplasmic region of the cell adhesion molecule. Proc Natl Acad Sci U S A 87:
4246-4250
Paredes J, Albergaria A, Oliveira JT, Jeronimo C, Milanezi F, Schmitt FC (2005) P-cadherin
overexpression is an indicator of clinical outcome in invasive breast carcinomas and is associated with
CDH3 promoter hypomethylation. Clin Cancer Res 11: 5869-5877
Parisini E, Higgins JM, Liu JH, Brenner MB, Wang JH (2007) The crystal structure of human E-
cadherin domains 1 and 2, and comparison with other cadherins in the context of adhesion mechanism.
J Mol Biol 373: 401-411
Patel IS, Madan P, Getsios S, Bertrand MA, MacCalman CD (2003a) Cadherin switching in ovarian
cancer progression. Int J Cancer 106: 172-177
Patel SD, Chen CP, Bahna F, Honig B, Shapiro L (2003b) Cadherin-mediated cell-cell adhesion:
sticking together as a family. Curr Opin Struct Biol 13: 690-698
Patel SD, Ciatto C, Chen CP, Bahna F, Rajebhosale M, Arkus N, Schieren I, Jessell TM, Honig B,
Price SR, Shapiro L (2006) Type II cadherin ectodomain structures: implications for classical cadherin
specificity. Cell 124: 1255-1268
Pece S, Gutkind JS (2000) Signaling from E-cadherins to the MAPK pathway by the recruitment and
activation of epidermal growth factor receptors upon cell-cell contact formation. J Biol Chem 275:
41227-41233
Peifer M, Yap AS (2003) Traffic control: p120-catenin acts as a gatekeeper to control the fate of
classical cadherins in mammalian cells. J Cell Biol 163: 437-440
Perez-Moreno M, Davis MA, Wong E, Pasolli HA, Reynolds AB, Fuchs E (2006) p120-catenin
mediates inflammatory responses in the skin. Cell 124: 631-644
Perret E, Benoliel AM, Nassoy P, Pierres A, Delmas V, Thiery JP, Bongrand P, Feracci H (2002a)
Fast dissociation kinetics between individual E-cadherin fragments revealed by flow chamber analysis.
EMBO J 21: 2537-2546
182
Perret E, Benoliel AM, Nassoy P, Pierres A, Delmas V, Thiery JP, Bongrand P, Feracci H (2002b)
Fast dissociation kinetics between individual E-cadherin fragments revealed by flow chamber analysis.
Embo J 21: 2537-2546.
Perret E, Leung A, Feracci H, Evans E (2004) Trans-bonded pairs of E-cadherin exhibit a remarkable
hierarchy of mechanical strengths. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 16472-16477
Perret E, Leung A, Morel A, Feracci H, Nassoy P (2002c) Versatile Decoration of Glass Surfaces To
Probe Individual Protein−Protein Interactions and Cellular Adhesion. Langmuir 18: 846-854
Pertz O, Bozic D, Koch AW, Fauser C, Brancaccio A, Engel J (1999a) A new crystal structure, Ca2+
dependence and mutational analysis reveal molecular details of E-cadherin homoassociation. Embo J
18: 1738-1747.
Pertz O, Bozic D, Koch AW, Fauser C, Brancaccio A, Engel J (1999b) A new crystal structure, Ca2+
dependence and mutational analysis reveal molecular details of E-cadherin homoassociation. EMBO J
18: 1738-1747
Perutz MF, Mathews FS (1966) An x-ray study of azide methaemoglobin. J Mol Biol 21: 199-202
Philippova M, Ivanov D, Tkachuk V, Erne P, Resink TJ (2003) Polarisation of T-cadherin to the
leading edge of migrating vascular cells in vitro: a function in vascular cell motility? Histochem Cell
Biol 120: 353-360
Philippova M, Joshi MB, Kyriakakis E, Pfaff D, Erne P, Resink TJ (2009) A guide and guard: the
many faces of T-cadherin. Cell Signal 21: 1035-1044
Pierres A, Benoliel AM, Bongrand P (1998a) Interactions between biological surfaces. Curr Opin Coll
& Interface Science 3: 525-533
Pierres A, Feracci H, Delmas V, Benoliel AM, Thiery JP, Bongrand P (1998b) Experimental study of
the interaction range and association rate of surface-attached cadherin 11. Proc Natl Acad Sci U S A
95: 9256-9261
Pierres A, Prakasam A, Touchard D, Benoliel AM, Bongrand P, Leckband D (2007) Dissecting
subsecond cadherin bound states reveals an efficient way for cells to achieve ultrafast probing of their
environment. FEBS Lett 581: 1841-1846
Pierres A, Touchard D, Benoliel AM, Bongrand P (2002) Dissecting streptavidin-biotin interaction
with a laminar flow chamber. Biophys J 82: 3214-3223
Pittet P, Lee K, Kulik AJ, Meister JJ, Hinz B (2008) Fibrogenic fibroblasts increase intercellular
adhesion strength by reinforcing individual OB-cadherin bonds. J Cell Sci 121: 877-886
Ponten J, Stolt L (1980) Proliferation control in cloned normal and malignant human cells. Exp Cell
Res 129: 367-375
Posy S, Shapiro L, Honig B (2008) Sequence and structural determinants of strand swapping in
cadherin domains: do all cadherins bind through the same adhesive interface? J Mol Biol 378: 952-966
Prakasam A, Chien YH, Maruthamuthu V, Leckband DE (2006a) Calcium site mutations in cadherin:
impact on adhesion and evidence of cooperativity. Biochemistry 45: 6930-6939
Prakasam AK, Maruthamuthu V, Leckband DE (2006b) Similarities between heterophilic and
homophilic cadherin adhesion. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 15434-15439
183
Qian X, Karpova T, Sheppard AM, McNally J, Lowy DR (2004) E-cadherin-mediated adhesion
inhibits ligand-dependent activation of diverse receptor tyrosine kinases. EMBO J 23: 1739-1748
Radice GL, Rayburn H, Matsunami H, Knudsen KA, Takeichi M, Hynes RO (1997) Developmental
defects in mouse embryos lacking N-cadherin. Developmental Biology 181: 64-78
Ranscht B, Dours-Zimmermann MT (1991) T-cadherin, a novel cadherin cell adhesion molecule in the
nervous system lacks the conserved cytoplasmic region. Neuron 7: 391-402
Rao SV, Anderson KW, Bachas LG (1999) Controlled layer-by-layer immobilization of horseradish
peroxidase. Biotechnol Bioeng 65: 389-396
Raptis L, Arulanandam R, Vultur A, Geletu M, Chevalier S, Feracci H (2009) Beyong Structure, to
survival: activation of Stat3 by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology manuscript
accepted: see article IV of this Ph.D. thesis
Resink TJ, Kuzmenko YS, Kern F, Stambolsky D, Bochkov VN, Tkachuk VA, Erne P, Niermann T
(1999) LDL binds to surface-expressed human T-cadherin in transfected HEK293 cells and influences
homophilic adhesive interactions. FEBS Lett 463: 29-34
Reynolds AB, Daniel J, McCrea PD, Wheelock MJ, Wu J, Zhang Z (1994) Identification of a new
catenin: the tyrosine kinase substrate p120cas associates with E-cadherin complexes. Mol Cell Biol 14:
8333-8342
Rickman L, Simrak D, Stevens HP, Hunt DM, King IA, Bryant SP, Eady RA, Leigh IM, Arnemann J,
Magee AI, Kelsell DP, Buxton RS (1999) N-terminal deletion in a desmosomal cadherin causes the
autosomal dominant skin disease striate palmoplantar keratoderma. Hum Mol Genet 8: 971-976
Riethmacher D, Brinkmann V, Birchmeier C (1995) A targeted mutation in the mouse E-cadherin
gene results in defective preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 855-859
Riou P, Saffroy R, Chenailler C, Franc B, Gentile C, Rubinstein E, Resink T, Debuire B, Piatier-
Tonneau D, Lemoine A (2006) Expression of T-cadherin in tumor cells influences invasive potential
of human hepatocellular carcinoma. FASEB J 20: 2291-2301
Robert P, Benoliel AM, Pierres A, Bongrand P (2007) What is the biological relevance of the specific
bond properties revealed by single-molecule studies? J Mol Recognit 20: 432-447
Roth S (1968) Studies on intercellular adhesive selectivity. Dev Biol 18: 602-631
Rousseau F, Schymkowitz JW, Wilkinson HR, Itzhaki LS (2001) Three-dimensional domain
swapping in p13suc1 occurs in the unfolded state and is controlled by conserved proline residues. Proc
Natl Acad Sci U S A 98: 5596-5601
Rusin KM, Fare TL, Stemple JZ (1992) Immobilization of flavoproteins on silicon: effect of cross-
linker chain length on enzyme activity. Biosens Bioelectron 7: 367-373
Schatz C, Louguet S, Le Meins JF, Lecommandoux S (2009) Polysaccharide-block-polypeptide
copolymer vesicles: towards synthetic viral capsids. Angew Chem Int Ed Engl 48: 2572-2575
Schmitt J, Hess H, Stunnenberg HG (1993) Affinity purification of histidine-tagged proteins. Mol Biol
Rep 18: 223-230
Shan WS, Koch A, Murray J, Colman DR, Shapiro L (1999) The adhesive binding site of cadherins
revisited. Biophys Chem 82: 157-163
184
Shapiro L, Fannon AM, Kwong PD, Thompson A, Lehmann MS, Grubel G, Legrand JF, Als-Nielsen
J, Colman DR, Hendrickson WA (1995) Structural basis of cell-cell adhesion by cadherins. Nature
374: 327-337
Shi Q, Chien YH, Leckband D (2008) Biophysical properties of cadherin bonds do not predict cell
sorting. J Biol Chem
Shibamoto S, Hayakawa M, Takeuchi K, Hori T, Miyazawa K, Kitamura N, Johnson KR, Wheelock
MJ, Matsuyoshi N, Takeichi M, et al. (1995) Association of p120, a tyrosine kinase substrate, with E-
cadherin/catenin complexes. J Cell Biol 128: 949-957
Shibata T, Ochiai A, Gotoh M, Machinami R, Hirohashi S (1996) Simultaneous expression of
cadherin-11 in signet-ring cell carcinoma and stromal cells of diffuse-type gastric cancer. Cancer Lett
99: 147-153
Shirayoshi Y, Okada TS, Takeichi M (1983) The calcium-dependent cell-cell adhesion system
regulates inner cell mass formation and cell surface polarization in early mouse development. Cell 35:
631-638
Sivasankar S, Brieher W, Lavrik N, Gumbiner B, Leckband D (1999) Direct molecular force
measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc Natl Acad Sci U
S A 96: 11820-11824
Sivasankar S, Zhang Y, Nelson WJ, Chu S (2009) Characterizing the initial encounter complex in
cadherin adhesion. Structure 17: 1075-1081
Smock RG, Gierasch LM (2009) Sending signals dynamically. Science 324: 198-203
Song YF, McMillan N, Long DL, Kane S, Malm J, Riehle MO, Pradeep CP, Gadegaard N, Cronin L
(2009) Micropatterned surfaces with covalently grafted unsymmetrical polyoxometalate-hybrid
clusters lead to selective cell adhesion. J Am Chem Soc 131: 1340-1341
Sotomayor M, Schulten K (2008) The allosteric role of the Ca2+ switch in adhesion and elasticity of
C-cadherin. Biophys J 94: 4621-4633
Southern E, Mir K, Shchepinov M (1999) Molecular interactions on microarrays. Nat Genet 21: 5-9
Steinberg MS, Takeichi M (1994) Experimental specification of cell sorting, tissue spreading, and
specific spatial patterning by quantitative differences in cadherin expression. Proc Natl Acad Sci U S A
91: 206-209
Stevens MM, George JH (2005) Exploring and engineering the cell surface interface. Science 310:
1135-1138
Suzuki S, Sano K, Tanihara H (1991) Diversity of the cadherin family: evidence for eight new
cadherins in nervous tissue. Cell Regul 2: 261-270
Takeichi M (1977) Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface
proteins. J Cell Biol 75: 464-474
Takeichi M (1988a) The cadherins: cell-cell adhesion molecules controlling animal morphogenesis.
Development 102: 639-655
Takeichi M (1988b) The cadherins: cell-cell adhesion molecules controlling animal morphogenesis.
Development 102: 639-655
Takeichi M (1990) Cadherins: a molecular family important in selective cell-cell adhesion. Annu Rev
Biochem 59: 237-252
185
Takeichi M (1991) Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenetic regulator. Science 251: 1451-
1455
Takeichi M (1995) Morphogenetic roles of classic cadherins. Curr Opin Cell Biol 7: 619-627
Tamura D, Hiraga T, Myoui A, Yoshikawa H, Yoneda T (2008) Cadherin-11-mediated interactions
with bone marrow stromal/osteoblastic cells support selective colonization of breast cancer cells in
bone. Int J Oncol 33: 17-24
Tamura K, Shan WS, Hendrickson WA, Colman DR, Shapiro L (1998a) Structure-function analysis of
cell adhesion by neural (N-) cadherin. Neuron 20: 1153-1163
Tamura K, Shan WS, Hendrickson WA, Colman DR, Shapiro L (1998b) Structure-function analysis of
cell adhesion by neural (N-) cadherin. Neuron 20: 1153-1163.
Taniuchi K, Nakagawa H, Hosokawa M, Nakamura T, Eguchi H, Ohigashi H, Ishikawa O, Katagiri T,
Nakamura Y (2005) Overexpressed P-cadherin/CDH3 promotes motility of pancreatic cancer cells by
interacting with p120ctn and activating rho-family GTPases. Cancer Res 65: 3092-3099
Thery M, Racine V, Pepin A, Piel M, Chen Y, Sibarita JB, Bornens M (2005) The extracellular matrix
guides the orientation of the cell division axis. Nat Cell Biol 7: 947-953
Thiery JP (2003) Cell adhesion in development: a complex signaling network. Curr Opin Genet Dev
13: 365-371
Thiery JP, Sleeman JP (2006) Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat
Rev Mol Cell Biol 7: 131-142
Thoreson MA, Anastasiadis PZ, Daniel JM, Ireton RC, Wheelock MJ, Johnson KR, Hummingbird
DK, Reynolds AB (2000) Selective uncoupling of p120(ctn) from E-cadherin disrupts strong adhesion.
J Cell Biol 148: 189-202
Tomita K, van Bokhoven A, van Leenders GJ, Ruijter ET, Jansen CF, Bussemakers MJ, Schalken JA
(2000) Cadherin switching in human prostate cancer progression. Cancer Res 60: 3650-3654
Tomschy A, Fauser C, Landwehr R, Engel J (1996) Homophilic adhesion of E-cadherin occurs by a
co-operative two-step interaction of N-terminal domains. EMBO J 15: 3507-3514
Troyanovsky RB, Laur O, Troyanovsky SM (2007) Stable and unstable cadherin dimers: mechanisms
of formation and roles in cell adhesion. Mol Biol Cell 18: 4343-4352
Troyanovsky RB, Sokolov E, Troyanovsky SM (2003) Adhesive and lateral E-cadherin dimers are
mediated by the same interface. Mol Cell Biol 23: 7965-7972
Troyanovsky RB, Sokolov EP, Troyanovsky SM (2006) Endocytosis of cadherin from intracellular
junctions is the driving force for cadherin adhesive dimer disassembly. Mol Biol Cell 17: 3484-3493
Troyanovsky S (2005) Cadherin dimers in cell-cell adhesion. Eur J Cell Biol 84: 225-233
Tsukita S, Furuse M, Itoh M (2001) Multifunctional strands in tight junctions. Nat Rev Mol Cell Biol
2: 285-293
Uemura K, Kuzuya A, Aoyagi N, Ando K, Shimozono Y, Ninomiya H, Shimohama S, Kinoshita A
(2007) Amyloid beta inhibits ectodomain shedding of N-cadherin via down-regulation of cell-surface
NMDA receptor. Neuroscience 145: 5-10
186
Ultsch MH, Wiesmann C, Simmons LC, Henrich J, Yang M, Reilly D, Bass SH, de Vos AM (1999)
Crystal structures of the neurotrophin-binding domain of TrkA, TrkB and TrkC. J Mol Biol 290: 149-
159
Urfer R, Tsoulfas P, O'Connell L, Shelton DL, Parada LF, Presta LG (1995) An immunoglobulin-like
domain determines the specificity of neurotrophin receptors. EMBO J 14: 2795-2805
van Hengel J, van Roy F (2007) Diverse functions of p120ctn in tumors. Biochim Biophys Acta 1773:
78-88
van Roy F, Berx G (2008) The cell-cell adhesion molecule E-cadherin. Cell Mol Life Sci 65: 3756-
3788
Vasioukhin V, Bauer C, Degenstein L, Wise B, Fuchs E (2001) Hyperproliferation and defects in
epithelial polarity upon conditional ablation of alpha-catenin in skin. Cell 104: 605-617
Vasioukhin V, Bauer C, Yin M, Fuchs E (2000) Directed actin polymerization is the driving force for
epithelial cell-cell adhesion. Cell 100: 209-219
von Nickisch-Rosenegk M, Marschan X, Andresen D, Abraham A, Heise C, Bier FF (2005) On-chip
PCR amplification of very long templates using immobilized primers on glassy surfaces. Biosens
Bioelectron 20: 1491-1498
Wallis S, Lloyd S, Wise I, Ireland G, Fleming TP, Garrod D (2000) The alpha isoform of protein
kinase C is involved in signaling the response of desmosomes to wounding in cultured epithelial cells.
Mol Biol Cell 11: 1077-1092
Weis WI, Nelson WJ (2006) Re-solving the cadherin-catenin-actin conundrum. J Biol Chem 281:
35593-35597
Weisbrod SH, Marx A (2008) Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids.
Chem Commun (Camb): 5675-5685
Wilson DL, Martin R, Hong S, Cronin-Golomb M, Mirkin CA, Kaplan DL (2001) Surface
organization and nanopatterning of collagen by dip-pen nanolithography. Proc Natl Acad Sci U S A
98: 13660-13664
Wojcik EJ, Sharifpoor S, Miller NA, Wright TG, Watering R, Tremblay EA, Swan K, Mueller CR,
Elliott BE (2006) A novel activating function of c-Src and Stat3 on HGF transcription in mammary
carcinoma cells. Oncogene 25: 2773-2784
Wolfram T, Spatz JP, Burgess RW (2008) Cell adhesion to agrin presented as a nanopatterned
substrate is consistent with an interaction with the extracellular matrix and not transmembrane
adhesion molecules. BMC Cell Biol 9: 64
Wong LS, Khan F, Micklefield J (2009) Selective covalent protein immobilization: strategies and
applications. Chem Rev 109: 4025-4053
Xia N, Thodeti CK, Hunt TP, Xu Q, Ho M, Whitesides GM, Westervelt R, Ingber DE (2008)
Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac
activation. FASEB J 22: 1649-1659
Xiao K, Allison DF, Buckley KM, Kottke MD, Vincent PA, Faundez V, Kowalczyk AP (2003)
Cellular levels of p120 catenin function as a set point for cadherin expression levels in microvascular
endothelial cells. J Cell Biol 163: 535-545
Yagi T (2008) Clustered protocadherin family. Dev Growth Differ 50 Suppl 1: S131-140
187
Yam CM, Deluge M, Tang D, Kumar A, Cai C (2006) Preparation, characterization, resistance to
protein adsorption, and specific avidin-biotin binding of poly(amidoamine) dendrimers functionalized
with oligo(ethylene glycol) on gold. J Colloid Interface Sci 296: 118-130
Yamada S, Pokutta S, Drees F, Weis WI, Nelson WJ (2005) Deconstructing the cadherin-catenin-actin
complex. Cell 123: 889-901
Yap AS, Kovacs EM (2003) Direct cadherin-activated cell signaling: a view from the plasma
membrane. J Cell Biol 160: 11-16
Yap AS, Niessen CM, Gumbiner BM (1998) The juxtamembrane region of the cadherin cytoplasmic
tail supports lateral clustering, adhesive strengthening, and interaction with p120ctn. J Cell Biol 141:
779-789
Zegers I, Deswarte J, Wyns L (1999) Trimeric domain-swapped barnase. Proc Natl Acad Sci U S A
96: 818-822
Zhang Y, Sivasankar S, Nelson WJ, Chu S (2009) Resolving cadherin interactions and binding
cooperativity at the single-molecule level. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 109-114
Zhou S, Matsuyoshi N, Liang SB, Takeuchi T, Ohtsuki Y, Miyachi Y (2002) Expression of T-cadherin
in Basal keratinocytes of skin. J Invest Dermatol 118: 1080-1084
Zhu B, Chappuis-Flament S, Wong E, Jensen IE, Gumbiner BM, Leckband D (2003) Functional
analysis of the structural basis of homophilic cadherin adhesion. Biophys J 84: 4033-4042