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Estudos de oxidação da 2-hidroxi-nevirapina, metabolito do fármaco anti-HIV nevirapina
Muna Cabral Sidarus (Licenciada)
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Química
Júri
Presidente e Orientador: Prof.ª Doutora Maria Matilde Soares Duarte Marques, Departamento de Engenharia Química e Biológica, IST
Vogais: Doutora Alexandra Maria Moita Antunes, REQUIMTE, Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa
Prof.ª Doutora Dulce Elizabete Bornes Teixeira Pereira Simão, Departamento de Engenharia Química e Biológica, IST
Dezembro 2007
2
Agradecimentos
Antes de mais, gostaria de começar por agradecer à Prof. Doutora Matilde Marques pela
oportunidade de trabalho, que representou muito para mim, e pela infinita paciência que
demonstrou.
Agradeço à Doutora Mariana Duarte por tudo o que me ensinou sobre as técnicas
envolvidas neste trabalho, pelo apoio, boa disposição e amizade, embora tenhamos trabalhado
juntas pouco mais de um mês. Agradeço também à Doutora Alexandra Antunes pelos
esclarecimentos sobre o trabalho desenvolvido anteriormente e por alguns conselhos práticos.
Quero ainda agradecer aos colegas presentes no dia-a-dia pela companhia, simpatia e
ajuda, em especial ao Doutor André Ferreira e à Dr.ª Ana Sofia Ferreira, à Dr.ª Cristina Jacob e
ao Dr. Tiago Fernandes. Espero que o espírito de partilha entre os laboratórios 401 e 403
possa manter-se, apesar das dificuldades.
Agradeço à Prof. Doutora Mª Fernanda Carvalho pela disponibilização de algum
equipamento, como o aparelho de IV e ao Prof. Doutor José Ascenso e ao Doutor Konstantin
Luzyanin pela assistência no uso dos aparelhos de RMN. Agradeço ainda à Dr.ª Kamila Koci
pelos espectros de massa. Por fim, agradeço ao Prof. Doutor João Luís Ferreira da Silva pelos
resultados da difracção de raios-X que foram marcantes neste trabalho.
Por último, agradeço à FCT pela bolsa no âmbito do projecto POCI/QUI/56582/2004.
3
Resumo
A nevirapina (NVP) é um inibidor da enzima transcriptase reversa do vírus da
imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV–1) cuja hepatotoxicidade está bem documentada.
Neste trabalho pretendeu-se avaliar a possível contribuição do metabolito 2-hidroxi-nevirapina
(2−OH−NVP) para a hepatotoxicidade da NVP. A abordagem utilizada envolveu o estudo da
oxidação da 2−OH−NVP com o intuito de prever o tipo de metabolitos secundários que se
poderão formar in vivo. Em especial, pretendeu-se avaliar a possibilidade daquela estrutura do
tipo fenólico originar catecóis e/ou quinonas, que se sabe terem potencial citotóxico e
genotóxico. A oxidação com sal de Fremy, nitrosodissulfonato de potássio [(KSO3)2NO],
originou a abertura do anel central da NVP e a contracção do anel hidroxilado a um anel de 5
membros, que resultou na formação de 2-ciclopropilamino-N-(4-metil-2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-
-pirrol-3-il)nicotinamida. Os outros produtos de oxidação identificados, as 3-carbamoil-
e 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridinas resultaram de oxidações ainda mais extensas,
envolvendo uma destruição completa da estrutura da NVP, tanto com sal de Fremy como com
óxido de prata, Ag2O. Nenhum dos produtos identificados tem interesse biológico plausível,
visto que não se prevê que este tipo de degradação ocorra in vivo. Estudos enzimáticos
preliminares, utilizando peroxidases, indicaram alguma inactividade do metabolito; contudo,
será ainda necessário confirmar os resultados obtidos. Foram também caracterizados um dos
produtos secundários da síntese da 2−OH−NVP, a 2,5-N-diacetoxi-NVP (di−OAc−NVP), e o
seu produto de hidrólise, a 2,5-N-di-hidroxi-NVP (Ndi−OH−NVP). Atribui-se um maior interesse
ao produto secundário, di−OAc−NVP; com efeito a sua hidrólise parece ter originado o produto
final, 2−OH−NVP, o que poderá levar a novas optimizações do processo de síntese.
Palavras Chave
Nevirapina, 2-hidroxi-nevirapina, fármacos anti-HIV, oxidação, metabolismo,
hepatotoxicidade.
4
Abstract
Nevirapine (NVP), an inhibitor of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV–1)
reverse transcriptase enzyme, has been well described as hepatotoxic. The main goal of this
work was to assess the possible contribution of the NVP metabolite, 2-hydroxy-nevirapine
(2−OH−NVP), to NVP hepatoxicity. The study of the metabolite’s oxidation was used to
evaluate the possible formation of secondary metabolites in vivo. In particular, the ability to
obtain catechols and/or quinones from the phenolic-like structure would give good information
about its potential cytotoxic and genotoxic properties. Oxidation with Fremy’s salt,
potassium nitrosodisulfonate [(KSO3)2NO], caused opening of the central NVP ring and
contraction of the hydroxylated ring to a 5-membered ring, originating 2-cyclopropylamino-
-N-(4-methyl-2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl)nicotinamide. The other oxidation products
identified, 3-carbamoyl- and 3-carboxy-2-cyclopropylamino-pyridine, were a result of lengthier
oxidations, causing total destruction of the NVP backbone, with both Fremy’s salt and silver
oxide, Ag2O. None of the products identified are of plausible biological interest, since this kind of
degradation is not expected to happen in vivo. Preliminary enzymatic studies, using
peroxidases, suggest inactivity of the metabolite substrate, though further confirmation of these
results is required. 2,5-N-diacetoxy-NVP (di−OAc−NVP), one of the secondary products of the
2−OH−NVP synthesis, was also characterised, as well as its hydrolysis product,
2,5-N-dihydroxy-NVP (Ndi−OH−NVP). A greater interest was ascribed to this secondary
product, di−OAc−NVP; in fact, its total hydrolysis seems to have yielded the final product,
2−OH−NVP, which could lead to further optimization of the synthetic method.
Keywords
Nevirapine, 2-hydroxy-nevirapine, anti-HIV drugs, oxidation, metabolism, hepatotoxicity.
5
Índice
Agradecimentos ................................................................................................................ 2
Resumo .............................................................................................................................. 3
Palavras Chave.................................................................................................................. 3
Abstract.............................................................................................................................. 4
Keywords ........................................................................................................................... 4
Índice de Figuras............................................................................................................... 7
Índice de Tabelas ............................................................................................................ 11
Lista de Abreviaturas...................................................................................................... 12
1. Introdução................................................................................................................ 15
1.1. Enquadramento.................................................................................................. 15 1.1.1. O Síndrome da Imunodeficiência Adquirida................................................. 15
1.1.1.1. Os primórdios ......................................................................................................15 1.1.1.2. O que define a SIDA............................................................................................15 1.1.1.3. Os números da pandemia ...................................................................................18
1.1.2. O Vírus da Imunodeficiência Humana ......................................................... 19 1.1.2.1. Modo de acção....................................................................................................19 1.1.2.2. A transmissão......................................................................................................20 1.1.2.3. Objectivo terapêutico...........................................................................................21 1.1.2.4. Terapias ..............................................................................................................22
1.2. A Nevirapina....................................................................................................... 25 1.2.1. Revelância da Nevirapina nos Tramentos Anti-HIV..................................... 25
1.2.1.1. A descoberta .......................................................................................................25 1.2.1.2. Eficácia vs Toxicidade .........................................................................................26 1.2.1.3. A Prevenção da Transmissão Vertical Mãe-Filho................................................29 1.2.1.4. Resistências ........................................................................................................32
1.2.2. Metabolismo ................................................................................................. 34 1.2.3. Os Riscos de Hepato- e Genotoxicidade ..................................................... 37
1.3. Considerações finais.......................................................................................... 40
2. Parte Experimental.................................................................................................. 41
2.1. Métodos Gerais, Materiais e Equipamento........................................................ 41 2.1.1.1. Solventes.............................................................................................................41 2.1.1.2. Reagentes ...........................................................................................................41 2.1.1.3. Soluções tampão.................................................................................................41 2.1.1.4. Cromatografias de camada fina...........................................................................41 2.1.1.5. Cromatografias preparativas de camada fina......................................................42 2.1.1.6. Evaporação e secagem de amostras ..................................................................42 2.1.1.7. Espectros de infravermelhos ...............................................................................42 2.1.1.8. Espectros de massa ............................................................................................42 2.1.1.9. Espectros de ressonância magnética nuclear .....................................................43 2.1.1.10. Pontos de fusão...................................................................................................43
2.2. Síntese da 2−OH−NVP...................................................................................... 43 2.2.1.1. Acetilação............................................................................................................43 2.2.1.2. Cromatografia em coluna ....................................................................................44 2.2.1.3. Hidrólise ..............................................................................................................44
2.3. Oxidação química da 2−OH−NVP ..................................................................... 44 2.3.1.1. Isolamento e purificação dos produtos ................................................................44 2.3.1.2. Aquecimento, arrefecimento e agitação ..............................................................44
6
2.3.2. Óxido de prata, Ag2O ................................................................................... 45 2.3.2.1. Oxidações............................................................................................................45 2.3.2.2. Tratamento das misturas reaccionais..................................................................45
2.3.3. Sal de Fremy ................................................................................................ 46 2.3.3.1. Oxidações............................................................................................................46 2.3.3.2. Tratamento das misturas reaccionais..................................................................48
2.4. Oxidação enzimática da 2−OH−NVP................................................................. 48 2.4.1.1. Peroxidase de rábano .........................................................................................48 2.4.1.2. Lactoperoxidase ..................................................................................................48
3. Resultados e Discussão......................................................................................... 49
3.1. Síntese da 2−OH−NVP...................................................................................... 49 3.1.1. Procedimento ............................................................................................... 49 3.1.2. Mecanismo ................................................................................................... 52 3.1.3. Caracterização dos produtos isolados ......................................................... 54
3.1.3.1. NVP .....................................................................................................................59 3.1.3.2. di−OAc−NVP .......................................................................................................59 3.1.3.3. 2−OAc−NVP........................................................................................................60 3.1.3.4. 2−OH−NVP..........................................................................................................61 3.1.3.5. Ndi−OH−NVP ......................................................................................................62
3.2. Oxidação química da 2−OH−NVP ..................................................................... 63 3.2.1. Óxido de prata, Ag2O ................................................................................... 64 3.2.2. Sal de Fremy ................................................................................................ 66 3.2.3. Caracterização dos produtos de oxidação isolados..................................... 69
3.2.3.1. Nicotinamida XVII ................................................................................................72 3.2.3.2. mO e mU .............................................................................................................73 3.2.3.3. mV.......................................................................................................................74
3.2.4. Mecanismos de oxidação............................................................................. 75 3.3. Oxidação enzimática da 2−OH−NVP................................................................. 77 3.4. Conclusões ........................................................................................................ 79
Bibliografia....................................................................................................................... 80
Anexo I – Espectros de IV .............................................................................................. 85
Anexo II – Espectros de MS ........................................................................................... 89
Anexo III – Espectros de RMN ....................................................................................... 96
7
Índice de Figuras
Figura 1 – O Laço Vermelho é um símbolo de solidariedade para com as pessoas que vivem com VIH/SIDA. (fonte Wikipédia) ...................................................................................... 15
Figura 2 – Esquema da relação entre o número de cópias de HIV por mL de plasma (escala e curva a vermelho) e a contagem de células CD4 por µL de sangue (escala e curva a azul) durante a progressão natural da infecção sem tratamento; de notar que o perfil destas curvas pode apresentar grandes variações. (adaptado de Wikipédia) ............................ 17
Figura 3 – Os números da pandemia em 2006, adaptado do relatório anual da OMS/ONUSIDA. A rubrica mulheres não inclui os números da população infantil, onde se consideram crianças de idade inferior a 15 anos. Os intervalos apresentados definem limites baseados na melhor informação disponível. .................................................................... 18
Figura 4 – Microscopia de varrimento electrónico do HIV–1 durante o processo de gemulação da célula hospedeira numa cultura de linfócitos. (fonte Wikipédia).................................. 20
Figura 5 – Esquema do ciclo de vida do HIV, da entrada na célula à formação duma réplica pela célula infectada. (adaptado de Wikipédia) ................................................................ 23
Figura 6 – Os componentes dum cocktail triplo usual contra o HIV combinado das formulações comerciais Combivir® , que contém os NRTIs AZT (I) e 3TC (II), e Viramune®, que contém o NNRTI NVP (III)................................................................................................. 24
Figura 7 – A estrutura de mais um NRTI, a didanosina ou ddI cuja formulação comercial tem o nome de Videx®................................................................................................................. 26
Figura 8 – A estrutura dum PI, o nelfinavir, cuja formulação comercial tem o nome de Viracept®. .......................................................................................................................... 26
Figura 9 – As estruturas de mais um NRTI e um NNRTI, respectivamente a estavudina ou d4I (VI), cuja formulação comercial tem o nome de Zerit®, e o efavirenz ou EFV (VII), cuja formulação comercial pode ter nomes como Sustiva® ou Stocrin®. ................................. 27
Figura 10 – Frequência de sintomas hepáticos nas primeiras 6 semanas de tratamento com NVP. Nesta representação são postos em evidência os limites de contagens de CD4 avançados pela BI e a FDA para minimizar a ocorrência de efeitos adversos graves pelo uso de NVP. Imagem adaptada dum gráfico apresentado pela BI, coligido a partir de estudos com e sem grupo de controlo.............................................................................. 29
Figura 11 – Os metabolitos da NVP, 2−OH−NVP (VIII), 3−OH−NVP (IX), 4−CO2H−NVP (X), 12−OH−NVP (XI) e 8−OH−NVP (XII). .............................................................................. 35
Figura 12 – Esquema das reacções duma quinona no meio fisiológico. Por um lado, actuando como electrófilo (E+) pode reagir directamente com nucleófilos como as proteínas e o DNA. Por outro lado, devido à sua reactividade redox pode originar ROS por intermédio de ciclos entre as suas formas de hidroquinona e radical semiquinona. As ROS produzidas podem por sua vez levar à oxidação de lípidos, proteínas ou DNA. (adaptado da referência 50) ............................................................................................................... 38
Figura 13 – Esquema representativo das vias potenciais de genotoxicidade duma quinona, onde E+ e ROS correspondem, respectivamente, à acção electrófila da própria quinona ou à acção das espécies de oxigénio reactivas originadas por intermédio de ciclos redox nos quais a quinona está envolvida. GSH corresponde ao nucleófilo glutationa, presente no meio celular, e [NQO1] a enzima NAD(P)H:quinone oxidoreductase dependente dos co-factores NAD(P)H, nicotinamida adenina dinucleótido (fosfato). (adaptado da referência 50) .................................................................................................................... 39
Figura 14 – Esquema reaccional simplificado da síntese do metabolito 2−OH−NVP a partir da NVP. Para efeitos de clarificação, inclui-se a identificação dos anéis e a numeração dos átomos da NVP. ................................................................................................................ 49
8
Figura 15 – Esquema reaccional da síntese da 2−OH−NVP, com produtos intermediários. ..... 51
Figura 16 – Hipótese de mecanismo para a acetilação oxidativa nas condições deste trabalho........................................................................................................................................... 53
Figura 17 – Sobreposição, na zona dos protões aromáticos, dos espectros de 1H−RMN dos compostos isolados na síntese da 2−OH−NVP, incluindo o produto secundário, di−OAc−NVP, e o seu produto de hidrólise, Ndi−OH−NVP.............................................. 55
Figura 18 – Sobreposição, na zona de campo alto, dos espectros de 1H−RMN dos compostos isolados na síntese da 2−OH−NVP, incluindo o produto secundário, di−OAc−NVP, e o seu produto de hidrólise, Ndi−OH−NVP. .......................................................................... 55
Figura 19 – Sobreposição, na zona dos carbonos aromáticos, dos espectros de 13C−RMN dos compostos isolados na síntese da 2−OH−NVP, incluindo o produto secundário, di−OAc−NVP, e o seu produto de hidrólise, Ndi−OH−NVP.............................................. 57
Figura 20 – Isómeros cis e trans da di−OAc−NVP. .................................................................... 59
Figura 21 – Estrutura do novo produto isolado, Ndi−OH−NVP XV, proveniente da hidrólise da di−OAc−NVP; XVI representa um esquema do tipo de protonação que propomos que ocorra para XV. ................................................................................................................. 62
Figura 22 – CCF das m.r.s de MS12 a MS17, da esquerda para a direita, cada uma seguida da sua mistura com o padrão de MP, que se encontra mais à direita. MS12 e 13 foram realizadas em CHCl3, MS14 e 15 em CH2Cl2 e MS16 e 17 em THF. MS12, 14 e 16 foram realizadas unicamente com fase orgânica, enquanto MS13, 15 e 17 também têm tampão. Foram coloridas a vermelho as manchas resultantes do MP e noutras cores produtos que se pensam coincidentes entre as reacções................................................ 65
Figura 23 – CCF de vários produtos isolados. mP e mO, respectivamente nas 1ª e 5ª posições a contar da esquerda são de reacções com Fremy. mT, mU e mV, nas 3ª, 7ª e 8ª posições são produtos de oxidação com Ag2O. As 2ª, 4 e 6ª posições são misturas dos isolados do lado direito e esquerdo. A 9ª posição é a mistura de mV e o padrão de MP, que se encontra-se mais à direita. Foram coloridas as manchas que se pensam coincidentes; rfs idênticos foram comparados através dos espectros de 1H-RMN. ......... 68
Figura 24 – Sobreposição dos espectros de 1H−RMN na zona dos protões aromáticos para o MP, 2−OH−NVP, e os produtos de oxidação caracterizados........................................... 69
Figura 25 – Sobreposição dos espectros de 13C−RMN na zona dos carbonos aromáticos para o MP, 2−OH−NVP, e os produtos de oxidação caracterizados........................................... 71
Figura 26 – Estutura do produto mioritário de oxidação da 2−OH−NVP pelo sal de Fremy. ..... 72
Figura 27 – Estrutura do produto de oxidação extensa da 2−OH−NVP comum aos dois oxidantes, sal de Fremy e Ag2O, a 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina. ....................... 73
Figura 28 – Estrutura doutro produto de oxidação extensa da 2−OH−NVP isolado de reacções com Ag2O, a 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina...................................................... 74
Figura 29 – Hipótese de mecanismo de oxidação mediado pelo radical de Fremy, com catálise básica. ............................................................................................................................... 76
Figura 30 – Hipótese de mecanismo de oxidação que dá origem aos produtos de maior degradação oxidativa, para ambos os oxidantes testados............................................... 77
Figura 31 – Espectro de IV da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP.......................................... 85
Figura 32 – Espectro de IV da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP........................................................................................................................................... 85
Figura 33 – Espectro de IV da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP........................................................................................................................................... 86
Figura 34 – Espectro de IV da 2−OH−NVP. ............................................................................... 86
9
Figura 35 – Espectro de IV da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP................ 87
Figura 36 – Espectro de IV do produto de oxidação do sal de Fremy, mAC (=mE=mP), identificado como a nicotininamida XVII. .......................................................................... 87
Figura 37 – Espectro de IV do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi- -2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy). .............................................. 88
Figura 38 – Espectro de IV do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina. ........................................................................... 88
Figura 39 – Espectro de MS-ESI positivo da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP. .................. 89
Figura 40 – Espectro de MS-ESI positivo da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP. ...................................................................................................................... 89
Figura 41 – Espectro de MS-ESI negativo da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP. ...................................................................................................................... 90
Figura 42 – Espectro de MS-ESI positivo da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP. ...................................................................................................................... 90
Figura 43 – Espectro de MS-ESI negativo da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP. ...................................................................................................................... 91
Figura 44 – Espectro de MS-ESI positivo da 2−OH−NVP. ......................................................... 91
Figura 45 – Espectro de MS-ESI negativo da 2−OH−NVP......................................................... 92
Figura 46 – Espectro de MS-ESI positivo da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP..................................................................................................................... 92
Figura 47 – Espectro de MS-ESI negativo da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP..................................................................................................................... 93
Figura 48 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII. .................................................... 93
Figura 49 – Espectro de MS-ESI negativo do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII. .................................................... 94
Figura 50 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de do sal de Fremy, mO, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mU do Ag2O)............................................. 94
Figura 51 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy). .................... 95
Figura 52 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina. ................................................................ 95
Figura 53 – Espectro de 1H-RMN (em acetona) da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP. ........ 96
Figura 54 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP. ....... 96
Figura 55 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP...................................................................................................... 97
Figura 56 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP...................................................................................................... 97
Figura 57 – Espectro de 1H-RMN (em acetona) da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP...................................................................................................... 98
Figura 58 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP...................................................................................................... 98
Figura 59 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) da 2−OH−NVP. ................................................. 99
Figura 60 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) da 2−OH−NVP................................................. 99
10
Figura 61 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP................................................................................................................... 100
Figura 62 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP................................................................................................................... 100
Figura 63 – Espectro de 1H-RMN (em acetona) do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII. .................................................. 101
Figura 64 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII. .................................................. 101
Figura 65 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) do produto de do sal de Fremy, mO, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mU do Ag2O). ............................... 102
Figura 66 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) do produto de do sal de Fremy, mO, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mU do Ag2O). ............................... 102
Figura 67 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy).103
Figura 68 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy).103
Figura 69 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina. ........................................... 104
Figura 70 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina. ........................................... 104
11
Índice de Tabelas
Tabela 1 – Condições das reacções de oxidação da 2−OH−NVP com Ag2O............................ 46
Tabela 2 – Condições das reacções de oxidação com sal de Fremy......................................... 47
Tabela 3 – Atribuições dos sinais de 1H−RMN dos produtos isolados na síntese .................... 56
Tabela 4 – Atribuições dos sinais de 13C−RMN dos produtos isolados na síntese.................... 57
Tabela 5 – Resumo dos fragmentos positivos obtidos por MS-ESI dos produtos isolados na síntese............................................................................................................................... 58
Tabela 6 – Resumo dos fragmentos negativos obtidos por MS-ESI dos produtos isolados na síntese............................................................................................................................... 58
Tabela 7 – Resultados das reacções de oxidação da 2−OH−NVP com Ag2O........................... 64
Tabela 8 – Resultados das reacções de oxidação com sal de Fremy ....................................... 67
Tabela 9 – Atribuições dos sinais de 1H−RMN dos produtos de oxidação................................. 70
Tabela 10 – Atribuições dos sinais de 13C−RMN dos produtos de oxidação ............................. 71
Tabela 11 – Resumo dos fragmentos positivos e negativos obtidos por MS-ESI dos produtos de oxidação....................................................................................................................... 72
12
Lista de Abreviaturas
Devido ao uso generalizado da língua inglesa no meio científico, mas também no
dia-a-dia, serão utilizadas ao longo deste trabalho várias abreviaturas na sua forma inglesa
mais usual. Aqui apresentam-se as siglas por ordem alfabética da abreviatura mais utilizada no
texto seguida do seu significado em português. Nos casos onde foram utilizadas as siglas
inglesas, a expressão correspondente encontra-se entre parêntesis. Em casos pontuais não se
apresentam os significados em português por serem siglas muito específicas.
AcOEt – acetato de etilo
AgOAc – acetato de prata
AZT – azidotimidina ou zidovudina ou ZDV
BI – Boehringer Ingelheim
CD4 – linfócitos T CD4+
CCF – cromatografia em camada fina
CYP – citocromo P450 13C-RMN – ressonância magnética nuclear de carbono-13
D – coeficiente de distribuição
ddI – didanosina
DMSO – dimetilsulfóxido
DNA – ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid)
d4T – estavudina
E+ – espécie electrófila
EFV – efivarenz
EI – ionização por impacto electrónico
ESI – ionização por electrospray
eq – equivalente
Et2O – éter dietílico
EUA – Estados Unidos da América
FDA – Food and Drug Administration
GRID – gay-related immune deficiency
GSH – glutationa
HAART – terapias antiretrovirais de alta eficiência (highly active antiretroviral therapy)
HIV (VIH) – vírus da imunodeficiência humana (human immunodeficiency virus)
HIV+ – estatuto de seropositividade de um indivíduo que apresenta anti-corpos para o HIV
HMBC – correlação heteronuclear a mútliplas ligações (heteronuclear multiple bond correlation)
HRP – peroxidase de rábano (horseradish peroxidase)
13
HSQC – correlação heteronuclear de quantum simples (heteronuclear single quantum correlation)
1H-RMN – ressonância magnética nuclear de protão
IV – infravermelho
J – constante de acoplamento
LAV – lymphadenopathy associated virus
M – peso molecular
MeOH – metanol
MP – material de partida
m.r. – mistura reaccional
MS – espectro de massa (mass spectrum)
MTCT – transmissão vertical de mãe para filho (mother-to-child transmission)
m/z – razão massa/carga
NADH – nicotiniamida adenina dinucleótido (nicotinamide adenine dinucleotide)
NADPH – nicotiniamida adenina dinucleótido fosfato (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
nH – área relativa, como número de protões
NNRTI – inibidores da transcriptase reversa não nucleósidos (non nucleoside reverse transcriptase inhibitors)
NOESY – espectroscopia de amplificação nuclear de Overhauser (nuclear Overhauser enhancement spectroscopy)
NQO1 – NAD(P)H:quinone oxidoreductase
NRTI – inibidores da transcriptase reversa análogos dos nucleósidos (nucleoside reverse transcriptase inhibitors)
NtRTI – inibidores da transcriptase reversa análogos dos nucleótidos (nucleotide reverse transcriptase inhibitors)
NVP – nevirapina
OMS – Organização Mundial de Saúde
ONUSIDA – Programa Conjunto das Nações Unidas sobre o VIH/SIDA
PA – ponto de aplicação
PAH – hidrocarboneto policíclico aromático (policyclic aromatic hydrocarbon)
PI – inibidores da protease (protease inhibitors)
pka – logaritmo de base 10 da constante de acidez
rf – factor de retenção (retention factor)
RMN – ressonância magnética nuclear
RNA – ácido ribonucleico (ribonucleic acid)
ROS – espécies de oxigénio reactivas (reactive oxygen species)
RTI – inibidores da transcriptase reversa (reverse transcriptase inhibitors)
SIDA (AIDS) – síndrome da imunodeficiência humana adquirida (acquired immune deficiency syndrome)
THF – tetra-hidrofurano
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UV – ultravioleta
3TC – lamivudina
δ – desvio químico
λ – comprimento de onda
ν – número de onda
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1. Introdução
1.1. Enquadramento
1.1.1. O Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
1.1.1.1. Os primórdios 1, 2, 3
O alerta foi dado em 1981 nos Estados Unidos da
América (EUA) quando grupos de homossexuais de Los
Angeles e Nova Iorque começaram a ser afectados por
doenças pouco comuns. Foram detectados casos de
pneunomia por pneumocystis jirovecii (antes conhecido
por carinii) e de sarcoma de Kaposi, que são muito raros
em indivíduos saudáveis. Nesta altura, chegou a
denominar-se aquele quadro clínico por GRID,
Gay-Related Immune Deficiency, uma expressão sem
tradução simples em português, mas que mostra
claramente a relação que se estabelecia entre aquela
imunodeficiência e o grupo alvo detectado até então, a
comunidade homossexual masculina. Contudo, em breve
seriam descritos casos semelhantes em utilizadores de
drogas injectáveis e em pouco tempo o estranho
fenómeno estendeu-se a doentes hemofílicos, ou outros
indivíduos que tivessem necessitado de transfusões sanguíneas ou recebido produtos
derivados do sangue. Já em meados de 1982 foi introduzida a designação Síndrome da
Imunodeficiência Humana Adquirida (SIDA), embora inicialmente tenham coexistido várias
denominações, e apareceram as primeiras definições.
Com relativa rapidez começou a haver relatos de casos semelhantes por todo o mundo,
fazendo com a SIDA deixasse de ser encarada como um problema de saúde isolado. Em 1985,
a Organização Mundial de Saúde (OMS) reuniu cientistas e profissionais de saúde para que se
definissem estratégias globais para a prevenção e controlo da SIDA. No entanto, a associação
inicial entre a doença e comportamentos condenáveis pelas morais vigentes na maior parte das
culturas, foi e é ainda hoje responsável por parte da estigmatização dos doentes com SIDA e
portadores do Vírus da Imunodeficiência Humana (VIH ou HIV) e também pela dificuldade em
criar uma consciência global da pandemia que se instalou.
1.1.1.2. O que define a SIDA 1, 2
A doença designada por SIDA e que está associada ao HIV, não é, por assim dizer uma
única doença, mas um quadro clínico no qual um conjunto de patologias, que são raras na
população em geral, podem afectar em simultâneo um único indivíduo. A destruição
Figura 1 – O Laço Vermelho é um símbolo de solidariedade para com as pessoas que vivem com VIH/SIDA. (fonte Wikipédia)
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progressiva do sistema imunitário por parte do vírus cria uma grande vulnerabilidade a
qualquer tipo de infecção oportunista e a certos tumores e cancros.
Como veremos em maior detalhe, soube-se desde cedo que o HIV era um vírus muito
contagioso, embora com vias de contágio bastante específicas, como através do sangue,
fluidos corporais e do contacto com algumas mucosas. As características das vias de contágio
estabelecidas contribuíram para que a SIDA tenha sido considerada durante décadas, uma
doença exclusiva de certos grupos de risco, já de si marginalizados pela sociedade, como os
homossexuais e os toxicodependentes. Porém, hoje em dia, como consequência da
globalização do VIH/SIDA não podemos ver a epidemia na mesma óptica. Actualmente há, em
especial, zonas onde a taxa de incidência é enorme, como em geral por toda a África
sub-Sahariana. Subsistem grupos de risco, mas estes são fortemente dependentes da região e
respectivas práticas culturais, para além das campanhas de sensibilização e das medidas de
prevenção que as organizações mundiais e os governos locais vão fazendo. Presentemente,
os heterossexuais vieram mesmo a tornar-se no grupo com maior incidência numa larga
maioria de países devido a práticas como a prostituição e à negação e falta de
consciencialização relativamente à infecção pelo HIV.
Como veremos também, o vírus foi isolado pouco tempo depois dos primeiros relatos da
doença, o que permitiu começar a compreender a sua actuação e traçar guias sobre como
atacar a sua evolução. Contudo a relação entre o HIV e a SIDA foi admitida inicialmente sem
todas as verificações “clássicas” para agentes patogénicos, devido às características
específicas do próprio vírus e da respectiva doença. Por essa razão, persistem ainda hoje
vozes discordantes sobre a relação entre a doença e o vírus e sobre o grau de contágio do
HIV. Essa discussão fica fora do âmbito deste trabalho, ainda mais porque o conhecimento
existente hoje em dia deixa muito pouca margem para dúvidas4. A quem se interessar por esta
discussão recomenda-se a leitura dum pequeno capítulo dum livro de leitura fácil e repleto de
referências, Nine Crazy Ideas in Science, de Robert Ehrlich5. Uma das dificuldades na relação
entre o HIV e a SIDA é a possibilidade de um tempo de latência do vírus muito prolongado, que
pode ser superior a uma década. Outras dificuldades residem no facto de ser um retrovírus e
como tal não se comportar da mesma forma que as bactérias em cultura, para além de não
afectar todas as espécies animais da mesma forma. Por outro lado a complexidade da doença
torna difícil defini-la, o que se constata pela constante actualização e variadas definições.
Hoje em dia a maioria das definições da SIDA pressupõe geralmente que se verifiquem,
pelo menos, as seguintes condições:
� ser seropositivo, ou HIV+, o que significa que são detectáveis anticorpos do HIV no
sangue;
� ter uma contagem dos linfócitos CD4+ inferior a 200/µL de sangue.
17
Existe também uma listagem de doenças que pode definir o diagnóstico de SIDA,
contudo essa listagem tem maior utilidade na avaliação do estádio da doença do que para
definir um diagnóstico em si. Ainda que ela também pudesse ter interesse para os profissionais
de saúde a trabalhar em zonas sem condições de obter resultados laboratoriais, há que ter em
conta que as infecções oportunistas mais frequentes poderão variar de acordo com os locais,
pelo que uma listagem deste tipo não pode ser universal. Um diagnóstico de SIDA mantém-se
mesmo que a contagem de CD4 volte a subir e/ou que sejam curadas eventuais doenças
relacionadas com a SIDA.
Em especial nos países de fracos recursos económicos, nem sempre estão disponíveis
meios fiáveis de detecção da presença de anticorpos ou da carga viral, medida geralmente
pelo RNA viral. A medição directa do DNA viral ou a sua amplificação são métodos ainda mais
dispendiosos. Contudo a contagem de células do sistema imunitário pode ser mais acessível e
por isso se tornou importante compreender de que forma se relacionam estas variáveis, para
poder melhor definir diagnósticos e tratamentos em todo o mundo. A variação destes
indicadores encontra-se esquematizada na Figura 2.
A partir da Figura 2 figura podem identificar-se os vários estádios da infecção pelo HIV.
Inicialmente, existe uma fase de infecção relativamente rápida, muito virulenta, e que é também
a fase de maior probabilidade de contágio, embora o estado serológico do indivíduo seja ainda
negativo. Nesta fase podem ocorrer sintomas equivalentes a um estado gripal, mas a sua
frequência e variabilidade é de tal ordem que não podem servir como diagnóstico. De seguida,
Figura 2 – Esquema da relação entre o número de cópias de HIV por mL de plasma (escala e curva a vermelho) e a contagem de células CD4 por µL de sangue (escala e curva a azul) durante a progressão natural da infecção sem tratamento; de notar que o perfil destas curvas pode apresentar grandes variações. (adaptado de Wikipédia)
18
há um duma inflexão dos valores tanto de CD4 como da carga viral, que corresponde a uma
primeira resposta do sistema imunitário, na qual são criados anticorpos e a infecção é
parcialmente controlada. É somente após esta fase que o teste sanguíneo passa a dar HIV+;
o tempo entre o contágio e a seroconversão geralmente demora entre 3 a 6 meses. Após estas
primeiras fases, atinge-se um patamar de progressão lenta da carga viral, no início do qual os
valores de CD4 se situam ainda dentro do limiar do saudável. O tempo desta fase de latência é
o mais variável e pode chegar a décadas. Por fim, há uma fase de escalada da carga viral
quando se dá o colapso do sistema imunitário devido à diminuição excessiva dos linfócitos
CD4; a SIDA instala-se e a progressão é rápida, podendo levar à morte em menos de 1 ano.
1.1.1.3. Os números da pandemia
PPPeeessssssoooaaasss aaa vvviiivvveeerrr cccooommm HHHIIIVVV eeemmm 222000000666
dddaaasss qqquuuaaaiiisss mmmuuulllhhheeerrreeesss
dddaaasss qqquuuaaaiiisss cccrrr iiiaaannnçççaaasss
NNNooovvvaaasss iiinnnfffeeecccçççõõõeeesss pppooorrr HHHIIIVVV eeemmm 222000000666
dddaaasss qqquuuaaaiiisss cccrrr iiiaaannnçççaaasss
MMMooorrrttteeesss dddeeevvviiidddaaasss aaa SSSIIIDDDAAA eeemmm 222000000666
dddaaasss qqquuuaaaiiisss cccrrr iiiaaannnçççaaasss
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...............................................................
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333999,,,555 mmmiiilllhhhõõõeeesss [34,1 – 47,1]
111777,,,777 mmmiii lllhhhõõõeeesss [15,1 – 20,9]
222,,,333 mmmiii lllhhhõõõeeesss [1,7 – 3,5]
444,,,333 mmmiiilllhhhõõõeeesss [3,6 – 6,6]
555333000 mmmiii lll [410 – 660]
222,,,999 mmmiiilllhhhõõõeeesss [2,5 – 3,5]
333888000 mmmiii lll [290 – 500]
Figura 3 – Os números da pandemia em 2006, adaptado do relatório anual da OMS/ONUSIDA6. A rubrica mulheres não inclui os números da população infantil, onde se consideram crianças de idade inferior a 15 anos. Os intervalos apresentados definem limites baseados na melhor informação disponível.
Segundo o relatório6 mais recente da OMS e da ONUSIDA – Programa Conjunto das
Nações Unidas sobre o VIH/SIDA, hoje em dia parece estar-se no bom caminho no sentido
dum esforço global para gerir esta epidemia, incluindo a melhor acessibilidade a tratamentos
eficazes e a programas de prevenção. Todavia, segundo o mesmo relatório e ao contrário do
que se poderia pensar, o número de pessoas a viver com o HIV não parou de aumentar, assim
como as mortes associadas à SIDA. O número de adultos e crianças infectadas aumentou em
cerca de 400 mil entre 2004 e 2006, situando-se nos 4,3 milhões. Este valor encontra-se
incluído no total de quase 40 milhões a viver com o HIV em 2006 e que corresponde a uma
prevalência de 1,0% na população adulta mundial (15-49 anos). As estatísticas apontam para
que 40 % da população infectada dita adulta, ou seja com mais de 15 anos, pertença à faixa
etária dos 15 aos 24 anos. Há que ter isto em conta quando se analisa a percentagem de
mulheres que corresponde a metade (48 %) da população adulta infectada e que por isso
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estará na sua maioria em plena idade fértil, donde os grandes aumentos nas taxas de
infecções em crianças, em especial na África sub-Sahariana. São mesmo impressionantes os
dados para esta zona do planeta, pois quase dois terços (63 %) dos indivíduos infectados a
nível mundial se encontram nesta região e quase três quartos (72 %) das mortes causadas
pela SIDA no ano de 2006 se concentraram na África sub-Sahariana.
As difíceis condições politico-económicas encontradas na maioria dos países da África
sub-Sahariana têm tornado a sua população num alvo fragilizado para a infecção por HIV
originando consequentemente um novo foco de mortes por SIDA, o que nos países
desenvolvidos já está mais controlado. Naqueles países rege sobretudo a falta de informação e
de meios de prevenção do contágio e em certos locais, para piorar, uma miríade de
desinformação e mistificação extremamente perigosas, que têm levado a uma explosão dos
contágios sem precedentes. Para além do mais, a percentagem de população devidamente
testada é reduzidíssima e muito inferior é a percentagem de população tratada. Contudo várias
organizações mundiais têm vindo a realizar inúmeras iniciativas junto dos governantes e
sobretudo directamente junto da população, daí a introdução tendencialmente optimista do
relatório anteriormente referido, pois na verdade já se percorreu um longo caminho no sentido
de melhorar esta e outras situações de desigualdade.
Nos países ditos ricos, a SIDA tornou-se uma doença crónica, tendo vindo a ser
consideravelmente prolongada a esperança de vida dos doentes. Por outro lado, de maior
impacto e mais desejável é a possibilidade de prolongar a latência do vírus evitando mesmo
que a doença se instale, mantendo a carga viral em valores residuais através das actuais
terapias antiretrovirais de alta eficácia (HAART – highly active antiretroviral therapy). Contudo
estas terapias, em especial, são ainda muito dispendiosas e por isso não estão acessíveis a
todos. Como veremos com um pouco mais de detalhe na próxima secção, os tratamentos
antiretrovirais são usualmente “cocktails” de drogas que atacam o vírus impedindo a sua
replicação. Uma vacina para o HIV tem sido esperada, mas mostra-se difícil de atingir devido
às características específicas do retrovírus.
1.1.2. O Vírus da Imunodeficiência Humana
1.1.2.1. Modo de acção 1, 2
O vírus responsável pela nova doença detectada a partir de 1981, foi identificado em
1983 por uma equipa do Institut Pasteur liderada por Luc Montagnier, tendo sido inicialmente
designado por LAV - Lymphadenopathy Associated Virus7. Os avanços rápidos obtidos naquela
altura, só foram possíveis devido ao empenho e trabalho de conjunto de vários especialistas,
entre cientistas e clínicos e às colaborações com grupos doutros países8.
O isolamento do HIV permitiu uma rápida compreensão do seu mecanismo de acção,
desde a infecção até à fase da SIDA, e a definição dos alvos a atacar. Duma forma
simplificada, o HIV atinge algumas células do sistema imunitário, sobretudo os linfócitos CD4,
20
e ao usá-las para se replicar origina a sua destruição. Com o tempo, a diminuição da contagem
das células CD4 é acompanhada por um aumento das partículas de HIV no plasma, a carga
viral. Como anteriormente representado na Figura 2, a relação entre aqueles indicadores não é
tão simples e varia fortemente ao longo da infecção. Na Figura 4, pode ver-se uma imagem do
vírus durante o processo de gemulação, o que corresponde à fase na qual um novo vírus se
destaca do linfócito após replicação. Mais adiante na Figura 5 (pg. 23) pode encontrar-se uma
representação mais detalhada da actuação do vírus numa célula alvo.
Sem terapia antiretroviral, o tempo
médio de progressão da infecção pelo
HIV até à instalação da SIDA é de cerca
de uma década e o tempo médio de
sobrevivência depois de adquirir a
doença é de cerca de 9 meses. Contudo
há uma variabilidade enorme nestes
valores, pois para além de haver pessoas
que podem ter um sistema imunitário
mais frágil ou fragilizado, há no sentido
inverso factores genéticos que podem
contribuir para uma maior resistência ao
vírus. Por outro lado, tanto a
susceptibilidade à infecção como a sua progressão e posterior instalação da doença dependem
da espécie e da estirpe do HIV. Para além de haver duas espécies do vírus, o HIV–1 e o HIV–2
(pouco comum), existem ainda vários sub-tipos e estirpes; no caso do HIV–1 os sub-tipos mais
correntes são os A, B, C, D9,10. Convém ter em mente que a grande variabilidade genética do
HIV, embora só apresente 9 genes, advém sobretudo das suas naturalmente elevadas taxas
de replicação e de mutação9.
1.1.2.2. A transmissão 1, 2
Simplificando, pode dizer-se que a transmissão do HIV se dá pelo contacto com fluidos e
tecidos infectados. Contudo, para realçar os chamados “comportamentos de risco”, embora
duma forma muito generalista, estão definidas 3 vias de contágio:
�� o contacto sexual;
�� o contacto com fluidos e tecidos - seja devido à partilha de seringas infectadas ou
à transfusão de sangue infectado ou produtos derivados ou ainda à exposição dos
profissionais de saúde e outros profissionais que lidem com pessoas infectadas;
�� a transmissão vertical da mãe para o filho (MTCT) – que pode ser pré-natal,
perinatal ou pós-natal.
Figura 4 – Microscopia de varrimento electrónico do HIV–1 durante o processo de gemulação da célula hospedeira numa cultura de linfócitos. (fonte Wikipédia)
21
Detalhando a MTCT (sigla que corresponde à designação inglesa mother-to-child
transmission), que é a mais importante no âmbito deste trabalho, esta pode ser:
�� intra-uterina, pelo sangue da mãe que passa para o bebé através da placenta;
�� durante o parto, devido especialmente ao contacto com as mucosas vaginais;
�� através da amamentação, pois o vírus está presente no leite materno.
As estatísticas apresentadas num artigo de revisão de 200711 indicam que cerca de 1/3
da MTCT seja resultante da amamentação enquanto os restantes 2/3 se dão antes ou durante
o parto, sendo que estes se repartem em cerca de 1/3 antes do parto e 2/3 durante o parto.
Isto corresponde a uma percentagem de cerca de 45 % de MTCT no parto em si. No mesmo
artigo apresentam-se taxas de MTCT naturais, isto é sem qualquer intervenção, de 15-30 % na
Europa e EUA e 25-40 % na África sub-Sahariana. É muito corrente o uso dum valor
aproximado de 25 % para a MTCT natural, contudo há que ter em conta que embora por vezes
pareçam curiosamente baixas estas taxas são bastante variáveis.
Mesmo sem medicação, há alguns procedimentos relativamente simples que podem ser
seguidos como forma de reduzir significativamente o risco de MTCT, como é o caso da
cesariana e da alimentação através de aleitação artificial. Porém, e mais uma vez no caso dos
países de fracos recursos, estes procedimentos podem não se apresentar como alternativas
fiáveis, pois o risco duma intervenção como a cesariana pode representar um risco
grandemente acrescido para a mãe e o uso de aleitação artificial pode ser impossibilitado tanto
pelo sua inexistência no terreno como pela falta de água apropriada para a sua preparação.
Curiosamente, estudos realizados levaram a concluir que há um maior risco numa alimentação
mista que na amamentação exclusiva e por isso em certas circunstâncias a amamentação
pode representar um risco menor. As organizações mundiais envolvidas na luta contra o
VIH/SIDA têm-se mantido atentas e vários estudos tem sido desenvolvidos nesta área de forma
a avaliar melhor os prós e contras dos vários tipos de alimentação dos recém-nascidos, face às
situações dos vários países onde as alternativas são escassas.
1.1.2.3. Objectivo terapêutico 1, 2
Do isolamento do vírus à compreensão do mecanismo da doença o passo não foi longo
e cedo se definiram os alvos da terapia a desenvolver. Porém, desde a “declaração de ataque”
à replicação do vírus até se conseguir obter resultados verdadeiramente encorajadores e com
repercussão clara na qualidade de vida dos pacientes houve um longo caminho a percorrer.
Os primeiros resultados foram desoladores; terapias constituídas por uma única
substância com comprovada eficácia antiviral in vitro, como por exemplo o AZT (I, Figura 6,
pg. 24, azidotimidina, simplesmente zidovudina ou ZDV), embora pudessem diminuir a carga
viral não permitiam uma sustentabilidade de resultados que levasse a uma melhoria
significativa e continuada dos doentes de SIDA, pois para além dos efeitos secundários por
vezes insuportáveis, o desenvolvimento de resistências à droga reduzia a eficácia a médio
22
prazo. Mesmo assim, o AZT continua a ser hoje em dia uma das drogas mais utilizadas no
combate ao HIV/SIDA, seja nos chamados “cocktails” ou na prevenção da MTCT, como
veremos. Os “cocktails” triplos ou terapêuticas consideradas de “alta eficácia” só começaram a
ser utilizados a partir de 1996, 13 anos após o isolamento do vírus. As HAART são combinados
de, pelo menos, 3 drogas antiretrovirais, usualmente contendo 2 tipos de agentes que atacam a
replicação do vírus de forma diferente, como veremos em maior detalhe na próxima secção.
Só a partir da introdução das HAART se obteve um declínio muito marcado na morbidez e
mortalidade provocadas pelo HIV. Contudo e como já se referiu, a introdução de terapêuticas
eficazes não foi acompanhada pela redução na incidência da infecção, antes pelo contrário.
Além do mais, as zonas onde o HIV se tem mais disseminado, são também aquelas onde não
há acesso às terapias mais recentes e eficazes.
De referir que a progressão da fase de HIV+ para a fase de SIDA é ainda de difícil
controlo em alguns casos, mesmo usando HAART, particularmente devido a problemas de
adesão aos tratamentos. A falta de adesão tem variadas causas, das quais as principais são os
efeitos secundários e a dificuldade em seguir correctamente as, por vezes complicadas,
posologias. Este problema afecta não só a eficácia individual dos tratamentos como induz
resistências, como se verifica com os antibióticos para o caso das bactérias. Estas razões
fazem com que a indústria farmacêutica continue a manter-se empenhada em desenvolver
novas drogas de combate a esta grave infecção, tentando também melhorar as combinações e
posologias das terapêuticas, evitando efeitos secundários, facilitando a adesão e minimizando
o desenvolvimento de resistências.
Apesar dos cerca de 25 anos de pesquisas na área, a muito esperada vacina para o
HIV, com enorme potencial no controlo e erradicação desta pandemia, parece ter ainda um
longo caminho a percorrer, devido às características peculiares daquele retrovírus.
Actualmente o objecto de maior interesse nesta área é o sistema de fusão do vírus com a
membrana celular das suas células alvo. A fusão depende da interacção de estruturas
proteicas à superfície do vírus com receptores específicos existentes em algumas células do
sistema imunitário, contudo o HIV tem a capacidade de interagir com vários desses receptores,
o que dificulta a tarefa. Ao impedir aquelas interacções, evitar-se-ia a entrada do vírus nas
células hospedeiras, o que no fundo evitaria o processo de infecção em si (ver Figura 5).
1.1.2.4. Terapias 1, 2, 12
Como vimos, embora as terapêuticas disponíveis hoje em dia, permitam um combate
relativamente eficaz à replicação viral, estamos ainda longe de alcançar uma cura para esta
infecção. Para melhor compreender o modo de acção do HIV, na Figura 5 representa-se um
esquema do ciclo de vida do vírus, incluindo o processo de fusão, os processos de transcrição,
integração e reconstrução e terminando na gemulação do novo vírus. Os agentes terapêuticos
são classificados consoante os diferentes mecanismos nos quais actuam. Existem três classes
maioritárias, todas interferindo com a replicação viral:
23
¤¤ inibidores da transcriptase reversa
análogos dos nucleósidos (NRTI);
¤¤ inibidores da transcriptase reversa
não nucleósidos (NNRTI);
¤¤ inibidores da protease (PI).
São também utilisados inibidores
análogos dos nucleótidos (NtRTI), que
evitam a metabolização necessária aos
NRTIs, mas actuam da mesma forma,
e para além dos PIs peptídicos, mais
recentemente foram desenvolvido outros PIs
não peptídicos. Mantêm-se ainda linhas de
investigação que procuram novos alvos do
ciclo de vida do vírus onde se possa actuar,
como a linha de investigação que se referiu
anteriormente para o caso das vacinas,
tendo-se já desenvolvido inibidores da
fusão. Alguns antiretrovirais desta classe
emergente já se encontram aprovados pela
FDA (a Food and Drug Administration é a
entidade dos EUA que regula os mercados
da alimentação e medicamentos).
No caso das classes mais correntes,
que actuam sobre a replicação viral,
podemos ver que até agora se conseguiu
inibir com resultados positivos 2 enzimas
alvo no processo de replicação viral, a
transcriptase reversa e a protease. Como se
pode ver pelo esquema da Figura 5,
enquanto a primeira actua antes da replicação, quando o RNA viral é transcrito em DNA,
a segunda actua após a replicação, sendo responsável pelo processo de maturação do novo
vírus, independentemente do processo de gemulação. Para além disso, obtiveram-se
resultados com 2 tipos de inibidores: os que se assemelham aos substratos naturais
das enzimas e que competem com aqueles pela ligação ao centro activo, geralmente
bloqueando-o; ou outros que actuam num centro alostérico da enzima, induzindo alguma
alteração no centro activo ou impedindo o seu acesso; em ambos os casos, os substratos
naturais são impedidos de activarem os processos necessários à progressão da sequência da
replicação.
Figura 5 – Esquema do ciclo de vida do HIV, da entrada na célula à formação duma réplica pela célula infectada. (adaptado de Wikipédia)
24
Geralmente, os do primeiro tipo são designados por inibidores competitivos e os
segundos não-competitivos. Tomando como exemplo o caso dos RTIs – ou inibidores da
transcriptase reversa – inibem o mesmo alvo, a enzima transcriptase reversa, sejam eles
análogos ou não dos nucleósidos. Enquanto os NRTIs, ou seja os análogos dos nucleósidos,
se ligam ao centro activo da enzima, os NNRTIs, não nucleósidos, interagem com uma bolsa
alostérica específica originando uma deformação no centro activo. No caso específicos dos
NRTIs, ou pelos menos alguns deles, estes podem não bloquear a actividade da enzima, mas
antes actuar como se fossem substratos naturais, por terem estruturas semelhantes às dos
nucleósidos. Desta forma introduzem-se no DNA viral e impedem a continuação da cadeia por
terem a parte do açúcar adulterada (ver estruturas do AZT e 3TC na Figura 6, pg.24), o que por
conseguinte irá igualmente originar uma falha no processo de replicação. Os RTIs anti-HIV são
usualmente bastante específicos para a enzima viral não afectando as polimerases de DNA
doa mamíferos, o que permite que não interfiram com os processos normais de replicação
celular do hospedeiro. A especificidade é tal que o HIV–2 é intrinsecamente resistente aos
NNRTIs devido a diferenças estruturais do respectivo centro alostérico13, que não permitem o
mesmo tipo de interacção. Outra característica dos NNRTIs é que, por actuarem todos no
mesmo local, as estirpes que desenvolvem resistências são usualmente resistentes a todos os
NNRTIs. A selecção de estirpes com resistência a NNRTIs é bastante comum pois geralmente
são sensíveis à mutação de um único resíduo, entre vários, o que como veremos pode ser um
problema acrescido para certas terapias desenvolvidas com antiretrovirais desta classe.
Voltando às terapias HAART, podemos agora especificar que estas incluem,
vulgarmente, dois NRTIs e um NNRTI ou um PI. Um exemplo seria uma combinação dos
princípios activos representados na Figura 6. Os NRTIs AZT (I) e lamivudina (II, 3TC) estão
presentes na formulação comercial Combivir® e o NNRTI nevirapina (III, NVP) no Viramune®.
O
N3
OH
NH
NO
O
I
N
NH
NN
O
III
O
S
OH
N
NO
NH2
II
Figura 6 – Os componentes dum cocktail triplo usual contra o HIV combinado das formulações comerciais Combivir® , que contém os NRTIs AZT (I) e 3TC (II), e Viramune®, que contém o NNRTI NVP (III).
25
1.2. A Nevirapina
1.2.1. Revelância da Nevirapina nos Tramentos Anti-HIV
1.2.1.1. A descoberta 14
A NVP (11-ciclopropil-5,11-di-hidro-4-metil-6H-dipirido[3,2-b:2’,3’-e][1,4]diazepin-6-ona,
III, Figura 6) foi descoberta por Hargrave e seus colaboradores, um grupo que trabalhava na
Boehringer Ingelheim (BI) Pharmaceuticals. Num artigo de 199115, Hargrave descreve que para
tentar evitar os efeitos indesejáveis dos NRTIs procuravam um inibidor estruturalmente
diferente dos nucleósidos. Não tendo pistas que pudessem servir para a racionalização duma
estrutura-guia, seguiram a via do teste aleatório. Embora se tente apoiar cada vez mais o
desenvolvimento de novos fármacos em dados sobre relações estrutura−actividade ou no
conhecimento das estruturas das enzimas alvo, mesmo hoje em dia, isto nem sempre é
possível. Como no caso descrito, faz-se uso da via aleatória em especial nas situações de
pesquisa de novas estruturas eficazes. Depois de encontrarem um composto-guia com alguma
actividade, Hargrave e o seu grupo identificaram a NVP como sendo uma estrutura promissora
daquela família de compostos e em 1994 registaram a sua patente16. O trabalho posterior de
desenvolvimento realizado na BI fez com que a NVP fosse o primeiro NNRTI a ser aprovado
para o tratamento do HIV. Aprovado o uso exclusivo para adultos pela FDA em 1996, seguiu-se
a aprovação na Europa em 1997 e o alargamento da autorização da FDA ao uso em crianças,
no ano de 1998. Devido sobretudo à sua elevada toxicidade o Canadá mostrou-se renitente em
aprovar aquela droga. Em 200017, 200418 e 200519 foram emitidos avisos, pela BI e a FDA,
sobre os riscos de hepatotoxicidade do Viramune.
Convém referir que a NVP tem sido envolta em controvérsias sobre variados aspectos,
sejam a sua eficácia, a credibilidade de certos estudos, a hepatoxicidade, o uso como
profilático na MTCT ou o desenvolvimento de resistências. Assim, por vezes torna-se difícil
seguir os variados estudos, as suas conclusões, as discussões à volta dos resultados
apresentados, as controvérsias levantadas e as recomendações do fabricante e organizações
mundiais envolvidas. Sem querer fazer uma revisão aprofundada de toda a literatura existente,
pretende-se nos próximos sub-capítulos realçar alguns estudos e as conclusões principais dos
que consideramos serem os três principais dos pontos de vista a considerar: a eficácia vs
toxicidade, a MTCT e as resistências. Como veremos, a eficácia da NVP foi provada em vários
regimes, contudo a sua toxicidade é um problema incontornável e por isso foram definidas
algumas restrições ao seu uso. Paralelamente, foi descoberta uma alternativa terapêutica para
a profilaxia da MTCT que consiste no uso da NVP em dose única, o que permite diminuir
drasticamente a ocorrência de reacções adversas, especialmente as mais letais. Esta
posologia tem tido um impacto importante sobretudo na África sub-Sahariana, no entanto
realçou outro efeito negativo da NVP que é a geração de estirpes resistentes, típico dos
NNRTIs.
26
1.2.1.2. Eficácia vs Toxicidade
O estudo clínico publicado em 199820, denominado INCAS, comprovou a eficácia da
NVP numa terapia tripla com AZT e didanosina (IV, ddI), em comparação com 2 combinações
duplas, AZT + NVP e AZT + DDI. Para além de demonstrar a maior rapidez da combinação
tripla na redução da carga de RNA viral no plasma, mostrou que era possível atingir e manter
níveis abaixo dos limites de detecção disponíveis (20 cópias de RNA viral/mL de plasma).
Os resultados deste estudo também apontam para que o desenvolvimento de espécies
resistentes à NVP seja evitado pela combinação tripla, sendo sugerido como resultado directo
da supressão da replicação viral verificada pela diminuição da carga viral a valores abaixo dos
detectáveis. Neste estudo não foram relatadas reacções adversas graves.
Para além do uso profiláctico que a NVP tem na MTCT e que será discutido mais
adiante, o seu uso na profilaxia pós-exposição (PEP, postexposure prophylaxis) em
profissionais de saúde ou outros indivíduos que entram em contacto com o HIV no decurso da
sua actividade tomou alguma relevância, embora aparentemente não tenha havido
recomendações das entidades competentes nesse sentido21. No entanto, em 200022 e 200123,24
surgem relatos de hepatotoxicidade fulminante em pessoal de saúde sob PEP. Face a estes
casos o uso da NVP em PEP foi completamente desrecomendado. Estes casos são
perfeitamente concordantes com a hipótese de risco acrescido de hepatotoxicidade para
contagens de CD4 elevadas, apresentada posteriormente, pois aqueles indivíduos estariam
presumivelmente de boa saúde e por isso deveriam apresentar contagens bastante elevadas
daqueles linfócitos. Face a este relatos e provavelmente a resultados de estudos em curso,
a BI emite o primeiro aviso sobre a hepatotoxicidade do Viramune17.
IV
N
NH
N
N
O
OOH
HH
O
NH
OH
S
NH
O
OH
V
Figura 7 – A estrutura de mais um NRTI, a didanosina ou ddI cuja formulação comercial tem o nome de Videx®.
Figura 8 – A estrutura dum PI, o nelfinavir, cuja formulação comercial tem o nome de Viracept®.
27
Em 2004 é publicado um estudo sobre a toxicidade de regimes contendo NVP durante a
gravidez, resultante do PACTG 102225. Neste estudo pretendia-se inicialmente comparar a
eficácia da NVP vs um PI, o nelfinavir (V, NFV), numa combinação tripla com dois NRTIs,
o AZT e a 3TC. O estudo foi suspenso devido à incidência de efeitos adversos imputados à
NVP ser maior que o que se esperava. Em especial, uma morte devido a falha hepática,
foi objecto de muita polémica, como testemunha o artigo posteriormente editado pela Harper’s
Magazine26 onde se critica ferozmente os procedimentos dos estudos clínicos nos EUA e se
apontam as controvérsias em torno do HIVNET (estudo sobre o qual falaremos adiante,
abstendo-nos dessas controvérsias) e até se chega a apoiar as ideias do “dissidente”
Duesberg, uma voz quase solista contra os actuais pressupostos sobre o HIV e a SIDA.
Este artigo deve, no entanto, servir como alerta para a politização da questão da SIDA e para
as possíveis interferências que os poderes políticos e económicos podem ter e que a
comunidade científica, por vezes, não consegue evitar. Voltando aos resultados do PACTG, os
autores apontam para que todos os efeitos adversos encontrados no grupo da NVP se
verificaram em pacientes com contagens de CD4 acima de 250/µL. Do mesmo ano data o 2°
aviso18 da BI referindo um risco acrescido de efeitos adversos, sobretudo a nível hepático,
em pacientes com contagens de CD4 acima daquele limite e fazendo especial referência às
mulheres grávidas. Contudo no artigo do PACTG há já referência a um estudo retrospectivo de
2003 que realça os limites posteriormente definidos no aviso da FDA de 200519, 250/µL para as
mulheres e 400/µL para os homens.
Voltando a atenção para a eficácia da NVP há que realçar um estudo27, realizado por
uma equipa espanhola e publicado no mesmo ano e com os mesmo objectivos que o PACTG
1022, mas que não se centrava em mulheres
grávidas e que não faz referência alguma a
efeitos adversos. Os resultados obtidos por
esta equipa indicam não haver uma diferença
significativa no sucesso dos dois regimes
AZT+3TC+NVP vs AZT+3TC+NFV, sendo
ambos muito positivos pois ao fim de um ano
de terapia as percentagens de indivíduos com
cargas virais abaixo das 200 cópias/mL são
de 83% para o regime com NNRTI e 78%
para o regime com PI.
Em 2004 ainda é publicado outro
estudo28 sobre terapia tripla com base em 2
NRTIs, a estavudina (VI, d4T) e a 3TC, que
pretendeu comparar agora a eficácia da NVP
com outro dos NNRTIs correntemente
OOH
NH
NO
O
VI VII
O
NH
Cl
O
CF3
Figura 9 – As estruturas de mais um NRTI e um NNRTI, respectivamente a estavudina ou d4I (VI), cuja formulação comercial tem o nome de Zerit®, e o efavirenz ou EFV (VII), cuja formulação comercial pode ter nomes como Sustiva® ou Stocrin®.
28
utilizado, o efavirenz (VII, EFV). Neste estudo compararam-se não só a eficácia da combinação
com NVP vs EFV, como também o efeito dos 2 NNRTIs em conjunto e da toma diária da NVP
ser única ou repartida por duas doses. As taxas de insucesso (40-50 %) variam pouco entre as
diferentes terapias. A diferença não foi significativa entre a duas posologias de NVP, com uma
taxa intermédia. A combinação com EFV resultou na taxa mínima e a combinação com os 2
NNRTIs na máxima. O resultado menos positivo da junção dos 2 NNRTIs pode dever-se
simplesmente à maior ocorrência de efeitos adversos naquele sub-grupo, não se podendo
concluir sobre a eficácia daquela combinação em si. Também se verificou que a dose diária
única de NVP originou mais efeitos adversos que o EFV. Em termos de conclusões este estudo
não permitiu dar preferência a um dos NRTIs em estudo, mas levantou mais questões sobre a
segurança do uso da NVP, entre as quais porque 2 mortes lhe foram associadas. Interessante
que este estudo, ao contrário dos 2 anteriormente referidos, que se restringiam a grupos muito
pequenos e provavelmente pouco heterogéneos, aglutina resultados de vários locais e analisa
os resultados de várias perspectivas e com detalhes relevantes, como é o caso da variabilidade
de respostas consoante a proveniência dos pacientes. Há que sublinhar que se sabe que,
em especial, as isoenzimas que metabolizam a NVP sofrem de polimorfismos, como veremos
mais adiante, o que pode ter um impacto significativo nas probabilidade de reacções adversas
e sobretudo dos casos mais graves.
O mesmo grupo de investigadores, o grupo 2NN, publicou posteriormente um estudo
baseado nos resultados anteriores, mas onde explora as questões de segurança levantadas29.
Mais uma vez os resultados não permitem estabelecer uma diferença significativa na eficácia
dos 2 NNRTIs referidos, mesmo re-analisando os dados face a outras variáveis. Contudo,
conseguem estabelecer uma relação entre alguns dos efeitos secundários adversos
provocados pela NVP e a contagem das células CD4. No entanto os autores são muito
cuidadosos no que toca a tirar conclusões.
Dada a hepatotoxicidade da NVP se ter revelado por vezes fulminante e fatal, embora a
percentagem de casos indique que sejam relativamente raros, o fabricante preferiu tomar
medidas de precaução emitindo os avisos anteriormente referidos e sublinhando o
acompanhamento cuidado nas primeiras semanas de tratamento e os limites de contagens de
CD4 já referidos, que parecem apoiados por dados coligidos pela própria BI a partir de vários
estudos30.
Para além da hepatoxicidade que se tem vindo a sublinhar neste texto, a NVP origina
com mais frequência rash cutâneo (13 %) e podem ocorrer ocasionalmente (1,5 %) outras
reacções de hipersensibilidade, sobretudo expressas através da pele, sendo a mais rara e
mortal o síndrome de Stevens-Johnson14.
29
Figura 10 – Frequência de sintomas hepáticos nas primeiras 6 semanas de tratamento com NVP. Nesta representação são postos em evidência os limites de contagens de CD4 avançados pela BI e a FDA para minimizar a ocorrência de efeitos adversos graves pelo uso de NVP. Imagem adaptada dum gráfico apresentado pela BI30, coligido a partir de estudos com e sem grupo de controlo.
Apesar dos efeitos secundários, a NVP apresenta algumas aplicações específicas, uma
das quais iremos tratar de seguida. Outras aplicações são como último reduto, em casos onde
já se deu a chamada falha virológica, com combinações de um ou mais PIs ou NRTIs e em
especial nos casos em que não foram previamente usados NNRTIs14. Outra potencial
vantagem específica da NVP advém da sua capacidade de atravessar a barreira hemato-
-encefálica31, característica bastante particular entre os antiretrovirais e que poderá vir a abrir
novas aplicações terapêuticas. Por um lado, actualmente os casos de demência associada à
SIDA têm vindo a aumentar e, por outro lado, alguns estudos têm vindo a defender a hipótese
de que o vírus possa usar o sistema nervoso central e o cérebro como locais de acumulação
durante a fase de latência.
Depois de toda esta exposição não se espera que a NVP seja um dos antiretrovirais
mais utilizados a nível mundial32. Aparentemente, o desenvolvimento de genéricos baratos no
Brasil e na Índia, fazem com que não tenha deixado de fazer parte dos regimes terapêuticos
nas zonas de menores recursos, seja em HAART ou na profilaxia da MTCT, como veremos de
seguida.
1.2.1.3. A Prevenção da Transmissão Vertical Mãe-Filho
O primeiro fármaco a ser utilizado na prevenção da MTCT foi o AZT, administrado por
um curto período no final da gravidez. Os resultados não eram maus, contudo num estudo
preliminar sobre o uso duma dose única de NVP (HIVNET 006)33 obtiveram-se resultados
30
promissores. Observou-se que tanto com uma dose única de NVP só materna como na dose
única de NVP mãe+recém-nascido, era possível detectar o fármaco em níveis considerados
eficazes no recém-nascido até aos 7 dias. A persistência da NVP no organismo da mãe e do
bebé, para além de o proteger durante o parto permitiria prolongar o efeito protector, pelo
menos aos primeiros dias de amamentação. Verificou-se também que as mães não sofriam um
agravamento dos marcadores da infecção/doença após o parto. Este estudo não refere efeitos
adversos ou outras ocorrências relacionadas com o uso de NVP.
Desde então, a dose única de NVP tem sido objecto de muitos estudos, pois apresenta
fortes vantagens para os países de fracos recursos, quer a nível económico, quer na
simplificação da administração. No seguimento daquele estudo preliminar, pretendeu-se então
comparar a eficácia da posologia da dose única de NVP com a anteriormente utilizada de AZT
de curta duração. Os resultados do HIVNET 01234 mostraram haver uma diferença pouco
significativa na percentagem de crianças infectadas no momento do nascimento, 10,4 % e
8,2 %, para a terapia com AZT e NVP, respectivamente. Contudo às 6-8 semanas – 21,3 % e
11,9 % – e novamente às 14-16 semanas – 25,1 % e 13,1 % – as percentagens no grupo da
NVP foram cerca de metade das do grupo do AZT. De referir que os recém nascidos foram
amamentados quase na sua totalidade, o que justifica parte do aumento das percentagens de
crianças infectadas ao longo das primeiras semanas de vida. Neste estudo os efeitos adversos
foram considerados idênticos para ambos os grupos. As características da NVP que são
realçadas e que os autores pensam justificarem a diferença de resultados são a capacidade de
reduzir a concentração de RNA viral até 3 ordens de grandeza após uma dose única, de actuar
imediatamente sobre o vírus a nível intra- e extracelular e de não necessitar de metabolização
para ser activa. Os longos tempo de meia-vida são também referidos, permitindo com uma
única dose manter níveis terapêuticos no recém nascido ao longo da primeira semana.
Os curtos tempos de meia-vida do AZT implicam doses repetidas, que antes do mais podem
condicionar fortemente a eficácia do tratamento. Isto porque se não se conseguir manter um
bom estado estacionário há o risco de recorrentes concentrações plasmáticas
sub-terapêuticas, o que para além de diminuir directamente a eficácia da terapia aumenta a
probabilidade de emergirem resistências.
Os resultados deste último estudo parecem realçar mais vantagens da dose única de
NVP, pois para além de prevenir a MTCT durante o parto, os seus longos tempos de vida
permitem proteger também contra a MTCT através da amamentação, em especial tendo em
consideração que as primeiras semanas (aproximadamente o 1° mês) são as de maior risco
pois o colostro e o leite materno neste período apresentam uma maior carga viral que o leite
posterior11. Apesar de todas as controvérsias à volta do estudo HIVNET012, a simplicidade e
acessibilidade do tratamento originaram muitos apoios a que esta profilaxia de dose única de
NVP estivesse realmente acessível a uma maior percentagem de mulheres, sobretudo na
África sub-Sahariana. Ainda sobre o regime de dose única de NVP exclusivo, que continua a
31
ser até aos nossos dias o mais comum naquela zona do globo e ainda quase a única,
se alguma, alternativa de profilaxia disponível, há que referir alguns resultados obtidos no
HIVNET024. Num artigo já de 200535, apresentam-se resultados dum sub-estudo no qual se
pretendeu verificar a influência da variabilidade nos tempos de toma da dose única de NVP
materna ou infantil. Segundo os dados recolhidos, a eficácia da profilaxia não é grandemente
influenciada a não ser que a dose única de NVP materna seja ingerida a menos de 2 h do parto
e que a dose única de NVP infantil seja administrada logo nas primeiras 4 h de vida. De referir
que igualmente para os estudos anteriores a dose única de NVP materna foi administrada 24 h
ou mais antes do parto e que a dose única de NVP infantil foi administrada até às 72h.
A combinação dos dois procedimentos anteriormente descritos, AZT de curta duração
mais dose única de NVP, origina ainda melhores resultados na prevenção da MTCT e permite
diminuir parcialmente a principal preocupação relativa ao regime exclusivo que são as
resistências. Mais recentemente alguns estudos têm vindo a sustentar que nesta combinação,
a dose única de NVP materna pode ser evitada, sendo somente administrada a dose única de
NVP infantil e que tal permite reduzir a taxa de resistências nas mulheres. Um estudo realizado
no Botswana36 refere taxas de MTCT idênticas, de cerca de 4 %, para bebés com 1 mês cujas
mães tinham recebido ou não uma dose única de NVP, isto para além de todas as mães terem
recebido AZT nas últimas semanas de gravidez e durante o parto e todos os bebés terem
recebido uma dose única de NVP pós-parto e AZT durante o primeiro mês. Este estudo
verificou também que perto de 50 % da mulheres que receberam NVP apresentavam estirpes
resistentes 1 mês após o parto. Noutro estudo realizado no Malawi37, todos os recém-nascidos
receberam dose única de NVP imediatamente pós-parto e alguns também receberam AZT
durante 1 semana, enquanto às mães só foi administrada a dose única de NVP caso se
tivessem apresentado no hospital mais de 4 h antes do parto, caso contrário não receberam
dose única de NVP. Os resultados apontam para reduções bastante significativas nas
resistências à NVP entre os bebés que receberam dose única de NVP+AZT e cujas mães não
receberam NVP e os bebés que só receberam NVP e cujas mãe também receberam NVP,
respectivamente, 27 % vs 87 %. Para além de que ao eliminar a dose única de NVP materna,
evita-se o desenvolvimento de resistências nas mulheres. O risco de MTCT foi idêntico para
qualquer das opções de tratamento, 8-10 % à nascença e 6,5-12 % às 6-8 semanas.
É de considerar, que a utilização da dose única de NVP nunca chegou a ser aprovada
pela FDA. De qualquer forma, nos EUA, esta profilaxia só faria sentido em casos em que a
mãe desconhecesse o seu estado serológico até à altura do parto. Nos EUA e na Europa o uso
de HAART durante a gravidez é o procedimento mais recomendado, podendo reduzir a MTCT
até menos de 1 %. No entanto, riscos e benefícios a longo prazo dos tratamentos com
múltiplas drogas, tanto para as mães como para as crianças, estão ainda pouco esclarecidos.
32
1.2.1.4. Resistências 38, 39
Como já vimos, parte dos efeitos adversos podem ser evitados pela posologia de dose
única de NVP, contudo outro problema foi realçado por este uso como é o caso das
resistências. Esta é uma característica menos desejável, que afecta sobretudo os NNRTIs,
e que advém da facilidade com que aparecem estirpes resistentes e que em geral conferem
resistência a todos ou quase todos os fármacos desta classe. Os NNRTIs são particularmente
sensíveis, como já se referiu, porque basta uma única de várias mutações possíveis que
afectam a bolsa alostérica alvo para que o vírus crie resistência. Há que ter em mente que no
ciclo de vida do vírus ocorrem muitas mutações naturalmente, algumas das quais podem
originar resistência a antiretrovirais, e basta uma pequena pressão selectiva daqueles agentes
para que a variante mutante tome relevância. O facto da NVP apresentar longos tempos de
meia-vida e poder ser detectada no plasma até 3 semanas após uma dose única torna esta
droga especialmente susceptível ao desenvolvimento de resistências. Esta susceptibilidade é
ainda potenciada pela posologia de dose única, uma vez que não é garantida uma boa
supressão da carga viral.
Como já se relatou, este tem sido mais um tema de controvérsia em torno da NVP.
Alguns estudos indicam que a presença das estirpes resistentes não duraria mais de cerca de
1 ano. Todavia, outros estudos começaram a detectar as estirpes resistentes durante tempos
mais longos, devido essencialmente à sensibilidade das tecnologias disponíveis. Enquanto um
método padrão, por sequenciação, apenas consegue detectar sub-populações que
representem mais de 20 % da população total de vírus, outros métodos utilizados mais
recentemente permitem baixar essa sensibilidade até 0,1 %. No entanto, entre os vários
estudos nesta área também não parecem compatibilizar-se as percentagens de mães e filhos
afectados. Embora a sensibilidade das tecnologias utilizadas também possa ter efeito naqueles
resultados, estudos posteriores ajudam a compreender esta variabilidade doutro ponto de vista.
Estudos do grupo de Eshleman10 verificaram diferentes susceptibilidades dos sub-tipos de
HIV–1 à génese de resistências. Enquanto o sub-tipo C pode chegar a originar 70 % ou mais
casos de resistência, os sub-tipos A e D apresentam percentagens inferiores, 20-50 %.
Esta observação pode justificar, em grande parte, a variabilidade de resultados nestes e
noutros estudos, pois a distribuição de sub-tipos é variável entre regiões. Assim, estudos
realizados com populações de zonas diferentes podem naturalmente originar resultados
díspares; como se refere no estudo mencionado, enquanto no Uganda os sub-tipos
predominantes são os A e D e o C é quase inexistente, no Malawi este último sub-tipo é
praticamente o único presente.
Por outro lado, tem-se vindo a levantar a questão da relevância clínica destes resultados
e por isso outros estudos tentam verificar paralelamente se a exposição à dose única de NVP
das mães e dos filhos pode realmente comprometer tratamentos posteriores. Esta questão é
tanto mais importante tendo em conta que nos meios onde aquela profilaxia é largamente
33
utilizada, o mais provável é que um tratamento posterior, mesmo que já de terapias
combinadas, contenha também NVP. Não ficando também excluída a questão da eficácia da
mesma profilaxia utilizada numa gravidez posterior. Neste assunto também nem todos os
estudos são concordantes, mas alguns sugerem que mesmo para sub-populações de estirpes
resistentes só detectadas com os métodos mais sensíveis há um risco acrescido de falha
virológica.
Num estudo realizado na Tailândia (PHPT-2)41, foi administrada a dose única de NVP a
várias grávidas que tinham recebido AZT no último semestre da gravidez. De referir que, assim
como noutros estudos, o grupo de placebo-placebo, para a mãe e o bebé, foi descontinuado a
meio do tempo de observação devido às diferenças nos resultados da MTCT, que atingiram os
80 % neste caso. Os resultados obtidos são concordantes com os do estudo HIVNET006,
apontando para reduções muito similares nos grupos NVP-NVP, que corresponde a doses
únicas administradas à mãe e ao filho, e no grupo NVP-placebo, no qual só a mãe recebe dose
única de NVP. Voltando à discussão das resistências, posteriormente àquele estudo foi
avaliada a resposta das mães que tinham recebido dose única de NVP e um tratamento
pós-parto com HAART – contendo NVP42. Embora os resultados da eficácia dos tratamentos
pós-parto não sejam completamente conclusivos e levantem outras dúvidas, ao fim de 6 meses
as discrepâncias na percentagem de mulheres que atingiram cargas virais inferiores ao limite
de detecção de 50 cópias de RNA/mL de plasma começam a delinear-se. A diferença
encontrada entre o grupo não exposto e aquele que foi exposto e não apresentava mutações
(68 % vs 52 %) não foi estatisticamente significativa, mas indicia que possíveis sub-populações
não detectáveis pelos métodos padrão possam influenciar a resposta a futuros tratamentos.
Porém, o grupo com resistências detectadas não deixou responder à terapia, embora com
resultados menos positivos (38 % de taxa de supressão viral). É ainda de referir que, apesar de
aquele estudo ter sido feito com uma terapia de combinação com AZT, 66 % das mulheres que
receberam a dose única de NVP apresentavam resistências menos de 2 semanas após o
parto. A principal dúvida que ficou por esclarecer neste estudo prende-se com o tempo
pós-exposição à NVP do início da HAART, uma vez que outros estudos observaram uma
diminuição forte das sub-populações resistentes ao longo do primeiro ano pós-parto.
Já no ano corrente foi publicado um artigo43 cujos resultados parecem mais
esclarecedores. Neste estudo, realizado no Botswana entre 2001 e 2003, as grávidas
receberam AZT nas últimas semanas de gravidez e o par mãe-filho recebeu dose única de
NVP ou placebo. Os recém-nascidos foram ainda tratados com AZT durante 6 meses no caso
de serem amamentados ou durante um mês se receberam aleitação artificial. Devido a
resultados já aqui apresentados36, a meio do estudo todos os recém-nascidos passaram a
receber dose única de NVP. Para as mulheres que começaram tratamentos HAART com NVP
(Combivir® +Viramune®) menos de 6 meses após o parto, no qual tinham recebido NVP,
a percentagem de falha virológica foi superior a 40 % a 6 meses de tratamento, comparada
34
com nenhum caso no grupo de placebo durante o parto. Nas mulheres que iniciaram HAART 6
meses após o parto a diferença daquelas percentagens não é significativa, sendo 7,8 % e
12 %, respectivamente para o grupo placebo e o grupo dose única de NVP. Para os bebés que
começam HAART com menos de 12 meses, também se verificou que a percentagem de falha
virológica foi significativamente maior naqueles que receberam dose única de NVP, 77 % em
comparação com o placebo, 9 %. É ainda referido que as respostas não variam
significativamente 12 ou 24 meses após o início da HAART. Assim, os autores recomendam
que mulheres a necessitar de HAART menos de 6 meses após terem recebido dose única de
NVP devem começar o tratamento, mas sem NVP. Uma opção adequada seria uma
combinação de NRTIs com um PI44. Contudo, e mesmo considerando os maus resultados
obtidos para as crianças, os autores referem que a dose única de NVP não pode ainda deixar
de ser utilizada e que pelo menos a menor incidência de falha no tratamento para as mulheres
que necessitaram de tratamento mais tarde não deixa de ser um resultado bastante positivo.
Para além da grande discrepância entre as profilaxias e tratamentos disponíveis nos
países de maiores e menores recursos, estes resultados indicam a cada vez maior urgência
em tornar as HAART universalmente acessíveis, para que seja possível tanto diminuir as
transmissões horizontais e verticais como melhorar a qualidade e prolongar a vida daqueles
que vivem com o VIH/SIDA. Estatísticas de 2002 indicavam que para cada bebé nascido com
HIV nos EUA e na Europa quase 2 mil nasceriam infectados em África; no entanto há que ter
em conta que grandes esforços foram tidos desde essa altura, com resultados positivos no
terreno; por isso hoje espera-se que esta proporção esteja menos desequilibrada. Contudo,
ainda em 2004 o relatório da OMS/ONUSIDA referia que apenas um percentagem inferior a
10 % de mulheres grávidas podia aceder à profilaxia de dose única de NVP em África e por
isso ainda há um longo caminho a percorrer até ao acesso universal das HAART, tanto em
questões económicas como de logística e outras.
1.2.2. Metabolismo A NVP é uma droga de baixo peso molecular, M = 266,3 g/mol, e lipofilia moderada, com um
coeficiente de partição da ordem de log D = 1,831. É uma base fraca, de pka = 2,8, encontrando-
-se, por isso, não ionizada ao pH fisiológico. Os resultados farmacocinéticos observados estão
em boa concordância com estas características físico-químicas, uma vez que a NVP apresenta
uma elevada biodisponibilidade, longos tempos de meia-vida e uma distribuição corporal
alargada, incluindo ao nível do cérebro45. A eliminação da NVP dá-se principalmente através de
metabolização pelo fígado e excreção dos metabolitos na urina. A quantidade de composto-
-mãe excretado na urina é cerca de 3 % nos humanos46, sendo também baixa para os outros
animais estudados, salvo excepções provavelmente pontuais observadas num macaco
cynomolgus macho47. A excreção do composto-mãe através das fezes é próxima da excreção
urinária nos humanos e nos outros animais, excepto no cão que elimina perto de 50 % do
composto mãe por esta via46, 47. Embora sejam observadas diferenças no perfil de metabolitos
35
e velocidade de metabolização intra- e inter-espécies, pode considerar-se que qualitativamente
o metabolismo da NVP é semelhante. A NVP é extensamente oxidada por enzimas
dependentes do citocromo P450 (CYP), sendo os principais metabolitos identificados os
2-, 3-, 8- e 12-hidroxi-NVP (12−OH−NVP), respectivamente VIII, IX, XII e XI (na Figura 11),
o 4-carboxi-NVP (4−CO2H−NVP, X), originado por oxidação secundária do 12−OH−NVP, e os
conjugados glucorónidos dos metabolitos hidroxilados. Nos humanos a espécie 4−CO2H−NVP
parece ter pouca relevância, ao contrário das espécies animais onde é usualmente o
metabolito maioritário. Nos humanos os metabolitos de fase II, isto é, os conjugados
glucorónidos dos metabolitos hidroxilados, compõem a grande maioria das formas excretadas
através da urina. Num estudo46 realizado em condições de indução, isto é com tomas prévias
regulares durante algumas semanas, uma dose única de NVP radiomarcada com 14C foi
recuperada a 76 % na urina, dos quais 68 % correspondiam aos glucorónidos das 2-, 3- e
12−OH−NVP. Estes metabolitos correspondem individualmente a percentagens da ordem dos
20 % enquanto os outros metabolitos e o composto-mãe correspondem apenas a percentagens
na ordem dos 1-3 %. Nos estudos realizados não foram identificados outros metabolitos de
fase II, como os provenientes de acetilação ou sulfatação dos grupos hidroxilo.
N
NH
NN
O
OHN
NH
NN
O
OH
N
NH
NN
O
OH
N
NH
NN
OOH
VIII IX
XIIXI
N
NH
NN
OOOH
X
Figura 11 – Os metabolitos da NVP, 2−OH−NVP (VIII), 3−OH−NVP (IX), 4−CO2H−NVP (X), 12−OH−NVP (XI) e 8−OH−NVP (XII).
36
Tanto nos humanos como noutras espécies há fortes indícios de que o metabolismo da
NVP é autoinduzido. Comparando os resultados de estudos com dose única vs doses
repetidas, a velocidade de eliminação pode tornar-se 2 vezes mais rápida e os tempo de
meia-vida proporcionalmente mais curtos46. Os estudos indicam que a NVP é metabolizada
sobretudo pelas isoenzimas CYP3A4 e CYP2B6 e são estas que são especificamente
induzidas46, 48, 49. A dependência do CYP2B6 na formação do metabolito 3−OH−NVP,
em conjunto com o facto daquele ser um dos metabolito maioritários nos humanos, pode ser
um dos indicadores do processo de autoindução, uma vez que aquela isoforma é usualmente
pouco relevante nos humanos. Outros resultados corroboram estas observações, uma vez que
em culturas de células este metabolito nem sempre é tão relevante. Alguns resultados apontam
para a possibilidade da NVP também inibir o CYP3A4, mas a concentração necessária para tal
é muito superior, mais de 100 vezes, à concentração plasmática terapêutica pelo que não terá
relevância clínica49. A indução originada pela NVP actua não só no seu próprio metabolismo,
mas pode também interferir com outros fármacos aumentando as suas taxas de eliminação e
reduzindo a sua eficácia, inclusivamente outros antiretrovirais. No entanto, dado o metabolismo
da NVP fazer uso quase exclusivo daquelas duas isoformas de CYP e correspondentemente
apenas influenciar as mesmas, as interacções parecem ser na prática limitadas. Por outro lado,
o metabolismo da NVP também pode ser susceptível de alterações por interferência com
outros medicamentos, como é o caso do cetoconazol, um antifúngico conhecido pela sua
capacidade de inibir especificamente ambas aquelas isoformas49.
As isoenzimas referidas, para além de estarem envolvidas na metabolização de variados
xenobióticos – compostos estranhos que entram num organismo – são também especialmente
atreitas a polimorfismos. O que, como já se referiu no texto, quer dizer quer há variações
genéticas da sua expressão e em populações diferentes há probabilidades diferentes de se
expressarem cada uma das variantes. Há mutações que não são muito relevantes, mas há
outras que podem implicar uma metabolização muito mais lenta, potenciando o risco de efeitos
secundários, ou muito mais rápida, reduzindo a eficácia do tratamento devido a uma maior taxa
de eliminação. Porém a questão não é tão simples, pois também há a possibilidade das
variações nas isoenzimas originarem diferentes perfis de metabolitos. Isto pode originar que
em certas populações haja uma maior probabilidade de metabolizar um dado fármaco a um
metabolito que possa ser particularmente prejudicial, ou exactamente o oposto. Por isso são
importantes os estudos farmacológicos e farmacocinéticos antes dos primeiros estudos clínicos
e o posterior alagamento dos estudos clínicos a um número crescente de indivíduos. Contudo,
é sempre possível que não se detectem potenciais problemas graves, como no caso da NVP
com os casos de hepatotoxicidade fulminante.
37
1.2.3. Os Riscos de Hepato- e Genotoxicidade 50, 51, 52 A hepatotoxicidade da NVP pode ser devida aos mecanismos de indução enzimática ou
a uma potencial genotoxicidade. Este último mecanismo seria mediado pelo metabolismo e o
fígado tornar-se-ia um órgão alvo devido à concentração de enzimas que comporta. Estudos
em animais apontam para que a hepatotoxicidade da NVP possa ser devida à indução
enzimática e não a mecanismos de genotoxicidade53. Continua, porém, a ser necessário
esclarecer bem aqueles mecanismos e verificar aprofundadamente a sua existência ou não nos
humanos.
Nas últimas décadas houve uma evolução muito significativa na compreensão de vários
mecanismos de toxicidade e de mutagénese. Para além dum conhecimento mais detalhado do
metabolismo, uma das áreas que se desenvolveu bastante e apresenta resultados importantes
foi a da detecção e identificação de aductos de DNA. Ainda há trabalho a fazer para relacionar
os níveis e tipos de aductos encontrados com a oncogénese, mas em termos analíticos houve
uma evolução que permite a quantificação de doses muito reduzidas, aos níveis usualmente
presentes nos humanos. Em geral, qualquer xenobiótico com características electrófilas (E+),
ou que possa ser metabolizado a uma espécie E+, tem potencial genotóxico pois pode formar
aductos com o DNA, através do ataque às suas bases que têm carácter nucleófilo, em especial
as purinas. Existem vários tipos de aductos de DNA, que podem originar diferentes erros na
transcrição daquela molécula fundamental ao funcionamento de qualquer célula. Devido à
grande necessidade de correcção na transcrição do DNA, existem também vários mecanismos
naturais para a correcção daqueles erros, que contudo podem ser falíveis e induzir mutações.
Um dos tipos de compostos endógenos ou exógenos que têm vindo a ser estudados
devido ao seu potencial de formação de aductos são os compostos com anéis aromáticos
susceptíveis de formar espécies hidroxiladas que podem originar quinonas. As quinonas são
aceitadores do tipo Michael e por isso têm um carácter E+ acentuado. A nível endógeno temos
os estrogénios, que se sabe terem um papel relevante no desenvolvimento de cancros,
especialmente a nível da mama, devido a mecanismos de estimulação de receptores.
Para além desse mecanismo, os estrogénios parecem também estar envolvidos na iniciação
das mutações que levam à carcinogénese. Estudos recentes, têm vindo a apoiar esta hipótese
e a esclarecer os mecanismos pelos quais actuam, sendo apontado um dos tipos de
orto-quinonas usualmente existentes em quantidades desprezáveis, mas que devido a
diferenças ou desequilíbrios metabólicos podem ser detectadas em quantidades significativas
nos tecidos alvo, assim como os seus aductos. Outro exemplo, desta feita de proveniência
exógena, são os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs), os quais formam também
orto-quinonas que interactuam com o DNA.
38
Contudo o potencial genotóxico das quinonas não se restringe à formação de aductos
com o DNA; devido à sua reactividade redox, podem estar envolvidas em ciclos redox que
originam espécies de oxigénio reactivas (ROS), que por sua vez também podem iniciar vários
processos mutagénicos. Nas Figura 12 e Figura 13 são apresentados esquemas que
evidenciam a reactividade das quinonas e os mecanismos através dos quais podem levar à
mutagénese e à oncogénese.
OH
OHR
O
OR
O-
OR
1 e−2 e−, 2 H+
(E+)
Alquilação de Proteinas
DNA
(ROS)
Oxidação de Proteinas
DNA
Lípidos
2 O2 O2O2O22
hidr
oqui
nona
radical semiquinona
Figura 12 – Esquema das reacções duma quinona no meio fisiológico. Por um lado, actuando como electrófilo (E+) pode reagir directamente com nucleófilos como as proteínas e o DNA. Por outro lado, devido à sua reactividade redox pode originar ROS por intermédio de ciclos entre as suas formas de hidroquinona e radical semiquinona. As ROS produzidas podem por sua vez levar à oxidação de lípidos, proteínas ou DNA. (adaptado da referência 50)
39
O
O
peroxidaçãolipídica
proteínas com pontes disulfureto
mistas
alquilaçãoproteínas
Lípidos Proteínas
DNA
ROS
E+
ROSE+
oxidaçãoDNA
aductosDNA
aductosvolumosos
estáveis
locaisabásicos
(despurinação)
oxidaçãode
bases
quebras na cadeia
DNA
GSHNAD(P)H
[P450 reductase][NQO1]
consumo deespéciesredutoras
formaçãode
ROS
formação GSSG
GSH−E+
ROSE+
formaçãoROS
destoxificação
diminuição dos níveis
de GSH
activação decascatas desinalização
Figura 13 – Esquema representativo das vias potenciais de genotoxicidade duma quinona, onde E+ e ROS correspondem, respectivamente, à acção electrófila da própria quinona ou à acção das espécies de oxigénio reactivas originadas por intermédio de ciclos redox nos quais a quinona está envolvida. GSH corresponde ao nucleófilo glutationa, presente no meio celular, e [NQO1] a enzima NAD(P)H:quinone oxidoreductase dependente dos co-factores NAD(P)H, nicotinamida adenina dinucleótido (fosfato). (adaptado da referência 50)
40
1.3. Considerações finais
No grupo de trabalho em que este projecto se insere já foram feitos alguns estudos
sobre a potencial genotoxicidade da NVP, em especial, sobre o seu metabolito 12−OH−NVP,
o qual se verificou poder originar in vitro uma grande variedade estrutural de aductos de DNA.
Na sequência destes resultados, interessa aferir o significado dos outros metabolitos
hidroxilados, tendo sido escolhida, neste caso, a 2−OH−NVP. Resultados preliminares,
também obtidos no seio do grupo de investigação, indicam não haver reacção directa do
derivado mesilado do metabolito 2−OH−NVP com as bases do DNA, em contraste com o que
acontece de facto para a 12−OH−NVP (Doutora Alexandra Antunes, comunicação pessoal).
Outros estudos realizados também no grupo com metabolitos fenólicos do tamoxifeno55
serviram como ponto de partida para delinear as estratégias do presente trabalho.
Não se prevendo uma interacção directa do metabolito em estudo com o DNA, interessa
verificar se aquele metabolito de tipo fenólico poderá originar metabolitos secundários do tipo
catecóis e/ou quinonas. Como se referiu anteriormente, o potencial genotóxico das quinonas é
elevado, o que dá relevo ao estudo da oxidação in vivo dos metabolitos fenólicos a quinonas.
Foram assim, definidos os objectivos deste trabalho, como sendo primeiro o estudo da
oxidação química da 2−OH−NVP, incluindo a identificação dos produtos obtidos, e posteriores
estudos comparativos de oxidação enzimática e outros considerados relevantes. Os avanços
não permitiram ir mais além até este momento, sendo de seguida apresentados os resultados
obtidos.
41
2. Parte Experimental
Serão inicialmente descritos sucintamente alguns métodos utilizados durante este
trabalho. De seguida, para cada secção serão também descritas algumas metodologias gerais
e posteriormente serão apresentados os métodos específicos e eventuais
adaptações/alterações aos métodos gerais.
2.1. Métodos Gerais, Materiais e Equipamento
2.1.1.1. Solventes
Os solventes utilizados foram adquiridos comercialmente (Lab-Scan, Fisher Scientific,
Riedel-de Haën), eram de grau analítico ou superior e foram utilizados, em geral, sem qualquer
purificação.
2.1.1.2. Reagentes
Os reagentes necessários foram adquiridos comercialmente (Aldrich, Sigma, Riedel-de
Haën, Merck), apresentavam o grau de pureza necessário e não necessitaram de qualquer
purificação. A NVP foi adquirida à Cipla e também utilizada sem mais purificação.
2.1.1.3. Soluções tampão
A maioria das soluções tampão foram preparadas especificamente para este trabalho a
partir de reagentes disponíveis no laboratório e de água destilada. Alguns tampões foram
preparados, para uma dada concentração e pH, a partir das quantidades de reagentes
tabeladas56. No caso do tampão fosfato, utilizado a vários pHs, foi utilizada frequentemente
uma solução mãe a 100 mM preparada a partir de hidrogenofosfato de sódio dodecahidratado.
A partir da solução mãe foram preparadas, consoante a necessidade, porções de solução
tampão a um pH específico por adição de soluções de HCl ou NaOH 1 M, preparadas para o
efeito.
2.1.1.4. Cromatografias de camada fina
A evolução das reacções foi seguida por cromatografia em camada fina (CCF) em placas
cromatográficas de alumínio com sílica gel 60 F254 da Merck. Sempre que necessário, esta
metodologia foi também utilizada para comparar misturas e identificar componentes fazendo
uso de padrões. Não sendo a identificação por este método inequívoca, quando necessário
foram realizadas análises posteriores mais detalhadas por outros métodos. Foram utilizadas
várias misturas eluentes, baseadas sobretudo nos solventes: diclorometano, acetato de etilo e
éter dietílico (CH2Cl2, AcOEt e Et2O). Detalhes das proporções e outras misturas serão
identificados caso necessário. As placas de CCF foram “reveladas” por observação sob luz
ultravioleta (UV), lâmpada Camag, ao comprimento de onda (λ) de 254 nm.
42
2.1.1.5. Cromatografias preparativas de camada fina
A CCF preparativa foi utilizada com frequência para isolar ou purificar os componentes
de misturas obtidas durante o trabalho, em geral, em quantidades bastante reduzidas. Para tal
foram utilizadas as placas de sílica/alumínio anteriormente referidas, quando a quantidade de
amostra era da ordem dos poucos mg, ou placas de sílica/vidro, estas até um máximo de 100
mg de amostra cada (placa preparativas de sílica gel 60 F254 de 0,5 mm da Merck). Em casos
pontuais foram também utilizadas placas de alumina/vidro, óxido de alumínio 60 F254 da Merck.
Os eluentes variaram entre misturas de CH2Cl2, AcOEt e Et2O; as proporções utilizadas ou
outras misturas, serão indicadas quando houver relevância, assim como o número de eluições
se superior a uma. A aplicação das amostras foi realizada através de uma esponja aplicadora
preparada para o efeito a partir de algodão e uma pipeta de Pasteur. A placa foi sempre bem
seca entre cada aplicação de amostra. Posteriormente à eluição, as placas foram raspadas nas
zonas contendo os compostos de interesse e as respectivas sílicas extraídas, por contacto com
CH2Cl2 ou AcOEt durante um mínimo de 15 min e sob agitação forte. Outras misturas de
solventes podem ter sido utilizadas e o tempo de extracção variar. As sílicas foram de seguida
filtradas e lavadas, geralmente com AcOEt ou o solvente utilizado na extracção, e o extracto
evaporado num evaporador rotativo e seco na linha de vácuo, quando necessário para
caracterização. A “revelação” das CCF preparativas foi realizada pelo método anteriormente
descrito.
2.1.1.6. Evaporação e secagem de amostras
Sempre que necessário as amostras foram evaporadas no Rotavapor R-200 Büchi,
equipado com um banho de aquecimento B-490 da mesma marca. Quando necessário, as
amostras foram posteriormente secas na linha de vácuo, individualmente e directamente por
intermédio de um take-off ou dentro de um excicador, por vezes com várias amostras.
2.1.1.7. Espectros de infravermelhos
Foram realizados espectros de infravermelho, IV, para a caracterização de produtos de
interesse em pastilhas de brometo de potássio, KBr, num aparelho Jasco FI/IR 4100. Os
espectros dos compostos caracterizados neste trabalho são apresentados no Anexo I (pg. 85).
2.1.1.8. Espectros de massa
Para a caracterização adequada de todos os produtos de interesse, foram traçados
espectros de massa, MS, por injecção directa num espectrómetro de massa Varian 500 – MS
Ion Trap. A fonte de ionização utilizada foi o electrospray (ESI), com azoto (N2) como gás de
nebulização a uma pressão de 30 psi, uma voltagem de 5000 V e tempo máximo de ionização
250 ms. Foram obtidos MSs a polaridade positiva e para alguns casos também negativa.
O solvente utilizado foi metanol (MeOH) para todas as amostras. Os espectros obtidos estão
representados no Anexo II (pg. 89) e um resumo das razões m/z mais relevantes é
apresentado nas Tabelas 5, 6 e 11 do capítulo 3 – Resultados e Discussão.
43
2.1.1.9. Espectros de ressonância magnética nuclear
Os espectros de ressonância magnética nuclear de protão (1H-RMN) foram traçados nos
aparelhos Varian Unity–300 e Bruker Avance II 300 (a operarem a 300 MHz para o 1H) e
maioritariamente no Bruker Avance II 400 (a operar a 400 MHz para o 1H). Os espectros de
carbono (13C-RMN) foram traçados no Bruker 400 (a operar a 100,6 MHz para o 13C) assim
como as experiência bidimensionais: correlações heteronucleares de quantum simples e a
múltiplas ligações (HSQC e HMBC) e espectroscopia de amplificação nuclear de Overhauser
(NOESY). Os solventes utilizados foram acetona-d6 [(CD3)2CO] e dimetilsulfóxido-d6
[(CD3)2SO]. As experiências foram realizadas à temperatura ambiente, a cerca de 22 °C.
No caso do di−OAc−NVP, foram traçados espectros a várias temperaturas, desde a
temperatura ambiente até um máximo de 45 °C em acetona e 70 °C em DMSO. Os espectros
dos compostos aqui caracterizados estão representados no Anexo III (pg. 96). No capítulo 3
– Resultados e Discussão são apresentados alguns pormenores dos espectros em
sobreposição para comparação (Figuras 17-19 e 22-23) e os dados relevantes, como as
atribuições dos sinais dos espectros de 1H-RMN e 13C-RMN e as constantes de acoplamento
(J), encontram-se resumidos nas Tabelas 3, 4, 9 e 10. Todas as escalas foram calibradas
usando o sinal proveniente das quantidades residuais de solvente não deuterado: δ para 1H
– 2,50 [(CD3)2SO] e 2,05 [(CD3)2CO]; δ para 13C – 39,50 [(CD3)2SO] e 29,82 [(CD3)2CO]. Para a
atribuição de alguns sinais de 13C recorreu-se às correlações identificadas através das
experiências de bidimensionais – HSQC, HMBC e NOESY.
2.1.1.10. Pontos de fusão
Os pontos de fusão foram medidos para todos os produtos de interesse em lamela no
aparelho Leica Galen II, equipado com um módulo de aquecimento Leica AG, e não foram
corrigidos.
2.2. Síntese da 2−OH−NVP
2.2.1.1. Acetilação
Num balão de fundo redondo foram adicionados 100 mL de CH2Cl2 a cerca de 500 mg
(1,8 mmol) de NVP e a mistura levada a um refluxo forte (banho de água a cerca de 75 °C ou
banho de óleo a 105 °C). Ao atingir uma temperatura estável no banho, o balão foi retirado do
banho e foram adicionados sequencialmente os reagentes, AgOAc (1,32 g; 7,9 mmol; 4,5 eq)
e I2 (1,15 g, 4,5 mmol, 2,6 eq), sendo retomado o banho o mais rapidamente possível.
A reacção deu-se em cerca de 10 min, após os quais se deixou arrefecer a mistura reaccional
à temperatura ambiente antes de filtrar o sólido amarelo que se formou, o qual foi lavado com
CH2Cl2. A mistura obtida foi cromatografada em coluna.
44
2.2.1.2. Cromatografia em coluna
A solução resultante foi, geralmente, dispersa em celite (545 coarse da Fluka), sendo
seca no evaporador rotativo seguido da linha de vácuo. A mistura dispersa em celite foi
aplicada num funil com sílica gel (60 H da Merck) já acondicionada. Para aplicar a amostra na
sílica foi adicionado n-hexano, utilizado também no acondicionamento da sílica. Os gradientes
de eluentes utilizados foram misturas de CH2Cl2 e AcOEt evoluindo para % crescentes de
AcOEt e subsequentemente misturas de AcOEt e MeOH, até atingir os 100 % de MeOH.
Alternativamente, foi utilizado Et2O no lugar de CH2Cl2. Deste modo foram isolados os produtos
acetoxilados da NVP: 2-acetoxi-NVP (2−OAc−NVP) e 2,5-N-diacetoxi-NVP (di−OAc−NVP) cuja
caracterização será apresentada no capítulo 3 – Resultados e Discussão.
2.2.1.3. Hidrólise
Posteriormente, os produtos anteriormente isolados foram hidrolisados a 2-hidroxi-NVP
(2−OH−NVP) utilizando cerca de 100 mL de MeOH para dissolver cerca de 350 mg de produto
isolado e deixando reagir com mais 10 mL de KOH 1 M em MeOH, durante cerca de 2h.
A mistura reaccional foi parcialmente concentrada por evaporação e de seguida neutralizada
com HCl 1M. À solução neutralizada foi adicionada H2O e feitas pelo menos 2 extracções com
AcOEt. A caracterização do produto final será também apresentada no capítulo 3 – Resultados
e Discussão.
2.3. Oxidação química da 2−OH−NVP
2.3.1.1. Isolamento e purificação dos produtos
Nos casos de interesse foram realizadas CCFs preparativas utilizando como eluente
CH2Cl2/AcOEt 1:1 e extraindo com CH2Cl2 ou AcOEt.
2.3.1.2. Aquecimento, arrefecimento e agitação
Todas as reacções de oxidação foram realizadas com agitação, embora esta possa ter
sido interrompida, em situações a referir. Para garantir uma agitação eficiente, o método mais
utilizado foi a agitação através de barra magnética. No entanto, em algumas circunstâncias
foram também utilizados outros métodos, como um vórtex (MS1 Minishaker da IKA) com
adaptador para 6 amostras a cerca de 1000 rpm, a agitação suave de baloiço dum incubadora
(Incubator Shaker II da Boekel) ou a agitação dum Thermomixer (da Eppendorf com
capacidade para 24 tubos de 1,5 mL) também a cerca de 1000 rpm. Algumas reacções foram
também aquecidas, por intermédio de banhos de água ou óleo ou através do aquecimento
próprio dos aparelhos referidos, a incubadora ou o Thermomixer. Noutros casos ainda,
pretendeu-se manter a temperatura das reacções abaixo da temperatura ambiente, tendo para
tal sido usado um banho de água/gelo, com eventual adição de cloreto de sódio.
45
2.3.2. Óxido de prata, Ag2O
2.3.2.1. Oxidações
Foram realizadas reacções numa gama de 5 a 50 mg de MP, 2−OH−NVP. A quantidade
de oxidante, óxido de prata (Ag2O), usada foi geralmente um pouco inferior a 10 vezes o peso
do material de partida – m(Ag2O) = 10 m(NVP) ⇔ ~12 eq molares de Ag2O. Houve reacções
realizadas unicamente em fase orgânica, tendo os solventes utilizados sido clorofórmio
(CHCl3), CH2Cl2, ou tetra-hidrofurano (THF), em geral, 1 mL para cada 10 mg de MP. Para
várias das condições testadas foram realizadas reacções de fase única e reacções em duas
fases (embora geralmente THF/H2O não faça 2 fases, nas condições usadas tal aconteceu na
maioria dos casos). A fase aquosa foi um tampão a pH7 de 100 mM, citrato ou fosfato,
adicionado no mesmo volume da fase orgânica. Em casos pontuais as proporções utilizadas
podem ter sido diferentes (ver Tabela 1). Por vezes a temperatura das reacções foi mantida
acima da temperatura ambiente, através dum meio apropriado (ver 2.3.1.2), tendo sido a
temperatura máxima testada cerca de 60 °C. Na Tabela 1 apresenta-se um resumo das
condições específicas utilizadas em cada uma das reacções. Os tempos máximos de reacção
variaram entre 5 a 168 h e encontram-se detalhados na Tabela 7 (capítulo 3 – Resultados e
Discussão), assim como um resumo dos principais resultados.
2.3.2.2. Tratamento das misturas reaccionais
O tratamento das m.r.s passou primeiro por uma filtração, que inicialmente foi realizada
através duma pipeta com algodão, mas desta forma podiam ser encontrados resíduos de prata
(Ag) nas amostras tratadas. Posteriormente passou a usar-se um filtro de porcelana com uma
boa camada de celite para melhorar a retenção das pequenas partículas de Ag. Mesmo assim
não se conseguiu garantir a eliminação total dos resíduos. O sólido foi sempre lavado com o
solvente em uso e geralmente com mais um pouco de MeOH. No caso das reacções realizadas
com 2 fases, posteriormente à filtração foram extraídos eventuais produtos presentes na fase
aquosa e combinados com a fase orgânica pré-existente. Quando foi utilizado THF, a m.r. foi
evaporada antes do tratamento da fase aquosa. As fase aquosas foram extraídas, pelo menos
3 vezes, com AcOEt. A caracterização de alguns dos produtos isolados será apresentada no
capítulo 3 – Resultados e Discussão.
46
2.3.3. Sal de Fremy
2.3.3.1. Oxidações
Foram realizadas reacções numa gama de 3,5 a cerca de 140 mg de MP, 2−OH−NVP.
A quantidade de oxidante, sal de Fremy [(KSO3)2NO], usada foi cerca de 10 vezes o peso do
material de partida – m(Fremy) = 10 m(NVP) ⇔ 12 eq molares de Fremy. Nestas reacções
geralmente utilizou-se 1mL de fase orgânica e 1 mL de fase aquosa para cada 10 mg de MP:
como fase orgânica usou-se MeOH, THF e AcOEt; como fase aquosa foram utilizadas soluções
tampão, sobretudo fosfato 100 mM, a pH 5, 7 e 10, ou por vezes simplesmente H2O destilada
(como anteriormente referido, embora geralmente THF/H2O não faça 2 fases, nas condições
usadas tal aconteceu na maioria dos casos). Houve também reacções realizadas unicamente
em fase aquosa. A temperatura das reacções foi frequentemente mantida acima ou abaixo da
temperatura ambiente, usando um dos meios referidos (ver 2.3.1.2) e tendo a gama de
temperaturas testada variado entre cerca de 5 e 60 °C. Na Tabela 2 são apresentadas as
condições específicas para as reacções realizadas. Os tempos máximos de reacção variaram
Tabela 1 – Condições das reacções de oxidação da 2−OH−NVP com Ag2O
Nota: a eq ox = n(Ag2O)/n(2−OH−NVP). b Tp ct e tp ff correspondem a tampão citrato e fosfato, respectivamente.
Fase Orgânica Reacção m(MP)/mg eq oxa
Solvente1 Solvente2 Fase Aquosab Temperatura Agitação
MS1 9 11,0 — — Ambiente Magnética
MS3 11 10,9
CHCl3 1 mL
— — 40 °C Incubadora Incubadora
MS8 19 ~ 6,9 AcOEt 3 mL — 60 °C
Banho Água Magnética
MS10 19 13,3
CH2Cl2 2 mL
— — 60 °C Banho Óleo Magnética
MS12 5 12,9 — —
MS13 5 11,7
CHCl3 0,5 mL
— Tp ct pH7 100 mM 0,5 mL
MS14 5 11,7 — —
MS15 5 13,4
CH2Cl2 0,5 mL
— Tp ct pH7 100 mM 0,5 mL
MS16 5 12,7 — —
MS17 5 11,7
THF 0,5 mL
— Tp ct pH7 100 mM 0,5 mL
Ambiente Vórtex
MS27 21 12,0 THF 20 mL — —
MS28 21 12,6 THF 10 mL — Tp ff pH7
100 mM 10 mL
Ambiente Magnética
MS29 53 10,8 THF 25 mL — Tp ff pH7
100 mM 25 mL Ambiente Magnética
47
entre 1 a 208 h e encontram-se detalhados na Tabela 8 (capítulo 3 – Resultados e Discussão),
assim como um resumo dos principais resultados.
Tabela 2 – Condições das reacções de oxidação com sal de Fremy
Reacção m(MP)/mg eq oxa Fase Orgânica Fase Aquosab Temperatura Agitação
MS2 10 13,3 Ambiente Magnética
MS4 10 12,0
MeOH 1 mL
H2O 1 mL 40 °C
Incubadora Incubadora
MS5 12 9,9 H2O 1 mL
MS6 12 9,9 Tp ct pH6 10 mM 1 mL
Ambiente Magnética
MS7 9 ~ 13,1c
THF 1 mL
Tp ct pH7 100 mM 1 mL
50-60 °C Incubadora
Incubadora
MS9 20 ~ 12,0 c 60 °C Banho Água
Magnética
MS11 19 12,4
AcOEt 2 mL
Tp ct pH7 100 mM2 mL 60 °C
Banho Óleo Magnética
MS24 22 11,5 — Tp ff pH10 100 mM 4 mL
MS25 24 10,7 THF 2 mL
MS26 23 10,9 AcOEt 2 mL
Tp ff pH10 100 mM 2 mL
10 °C a Ambiente Banho Água/Gelo Magnética
MS31 137 10,2 THF 50 mLd
Tp ff pH10 100 mM 100 mL
5 °C a 30 °C Banho Água/Gelo
Magnética
MS34 3,6 12,3 H2O 0,5 mL
MS35 3,8 11,6 Tp ff pH5 100 mM 0,5 mL
MS36 3,5 11,6 Tp ff pH7 100 mM 0,5 mL
MS37 3,0 14,7
—
Tp ff pH10 100 mM 0,5 mL
MS38 3,5 12,3 H2O 0,5 mL
MS39 3,2 12,7 Tp ff pH5 100 mL 0,5 mL
MS40 3,6 12,0 Tp ff pH7 100 mM 0,5 mL
MS41 3,7 11,3
THF 0,5 mL
Tp ff pH10 100 mM 0,5 mL
MS42 3,5 11,3 H2O 0,5 mL
MS43 3,7 12,3 Tp ff pH5 100 mM 0,5 mL
MS44 3,7 12,3 Tp ff pH7 100 mM 0,5 mL
MS45 4,2 10,5
AcOEt 0,5 mL
Tp ff pH10 100 mM 0,5 mL
30 °C Thermomixer Thermomixer
MS46 6 12,8 THF 6 mL
Tp ff pH10 100 mM 6 mL
30 °C Banho Água Magnética
Notas: a eq ox = n(sal de Fremy)/n(2−OH−NVP). b Tp ct e tp ff correcpondem a tampão citrato e fosfato, respectivamente. c N° de equivalentes aproximado, porque foi preparada uma solução do oxidante, mas não se obteve a dissolução total. d Este solvente não foi adicionado logo de início, mas sim às 44h30m de reacção.
48
2.3.3.2. Tratamento das misturas reaccionais
O tratamento das m.r.s passou sempre pela recolha da fase orgânica sobrenadante no
caso do AcOEt, ou a sua evaporação no caso do THF, seguindo-se extracção da fase aquosa
com AcOEt. A caracterização dos produtos isolados considerados mais relevantes será
apresentada no capítulo 3 – Resultados e Discussão.
2.4. Oxidação enzimática da 2−OH−NVP
As reacções enzimáticas foram realizadas no aparelho Thermomixer, anteriormente
referido, a temperatura constante e com agitação adequada.
2.4.1.1. Peroxidase de rábano
Foi utilizada peroxidase de rábano (HRP) da Sigma, em solução a 1250 unidade/mL de
tampão fosfato 10 mM a pH7, e as reacções foram realizadas a 30 ou 37 °C. A par das
reacções com 2−OH−NVP foi realizado um branco e utilizada uma amostra de fenol para
controlo positivo, isto é, para testar quantitativamente a actividade da enzima. As quantidade
utilizadas foram 5 mg de produto, 500 µL de tampão fosfato 100 mM a pH7, 50 µL de enzima e
50 µL de H2O2 a 30 %. O tempo máximo de reacção foi de cerca de 3h.
2.4.1.2. Lactoperoxidase
Foi utilizada lactoperoxidase da Sigma, em solução a 135 unidades/mL de tampão
fosfato 33 mM a pH7. As reacções foram realizadas a 37 °C e as restantes condições foram
idênticas às usadas para a HRP.
49
3. Resultados e Discussão
3.1. Síntese da 2−OH−NVP
3.1.1. Procedimento
Resumida na Figura 14 está a síntese do metabolito hidroxilado na posição 2 – referente
ao anel A – da NVP, que foi optimizada no grupo pela Doutora Alexandra Antunes. Iremos
contudo descrevê-la sucintamente e debruçar-nos sobre alguns pontos relevantes do trabalho
desenvolvido previamente ao aqui apresentado. Já se encontravam descritos métodos de
síntese deste e outros metabolitos da NVP57; contudo havia interesse em encontrar sínteses
mais simples. O procedimento aqui apresentado é realizado em menos passos, parte
directamente da NVP e resulta em melhores rendimentos globais. A nova síntese, consiste
essencialmente em 2 passos, sendo o primeiro a acetoxilação do material de partida (MP) e o
segundo uma hidrólise do material acetoxilado ao respectivo derivado hidroxilado. Como se
pode prever pelo tipo de reacções envolvidas, a maior parte do trabalho de optimização
centrou-se no primeiro passo. Verificou-se que algumas condições, como o solvente e a
temperatura da reacção, influenciavam fortemente o rendimento obtido e como tal foram
testadas várias opções. As melhores condições encontradas foram CH2Cl2 a refluxo num
banho de óleo a 104 °C. Durante o desenvolvimento do método também se notou que era
crucial a ordem de adição dos reagentes, pois se o iodo (I2) fosse adicionado antes do acetato
de prata (AgOAc) não havia conversão significativa e era recuperado o MP; mais adiante na
discussão faremos alguns comentários ao mecanismo da reacção baseados sobretudo nesta
observação. Outra das observações feitas na altura, foi que o aumento do tempo de reacção
e/ou do número de equivalentes dos reagentes fazia aumentar a percentagem do produto
secundário di-acetoxilado (di−OAc−NVP, XIV, Figura 15, pg. 51). O método inclui também uma
cromatografia entre os dois passos de reacção pois verificou-se ser necessária a purificação do
produto maioritário, a 2-acetoxi-NVP (2−OAc−NVP, XIII, Figura 15, pg. 51), antes de proceder à
4a
11a
4
N1
3
2
NH
5
8
9
7
N10
6a
10a
6
N11
13
15 14
12O
N
NH
NN
O
OH
1) AgOAc
2) I2
CH2Cl2, ∆
10 min
KOH, MeOHA C
Figura 14 – Esquema reaccional simplificado da síntese do metabolito 2−OH−NVP a partir da NVP. Para efeitos de clarificação, inclui-se a identificação dos anéis e a numeração dos átomos da NVP.
50
sua hidrólise. Não foi possível encontrar condições que permitam a realização dos dois passos
em sequência pois a purificação do produto final, 2−OH−NVP, torna-se demasiado difícil.
Durante o presente trabalho foi necessário realizar esta síntese algumas vezes, tendo
sido feitas algumas observações de interesse para a discussão deste procedimento e
introduzidas algumas alterações pequenas ao método. Uma das dúvida que se punha era a
necessidade de fazer a reacção num banho de temperatura tão elevada quando o solvente era
CH2Cl2, que tem um ponto de ebulição muito mais baixo, da ordem dos 40 °C. O procedimento
adaptado envolveu a utilização dum banho de água e verificação da altura do refluxo; para se
obter um refluxo aproximadamente equivalente, a cerca de meia altura do condensador, o
banho de água apenas precisa de estar a cerca de 75 °C. Nestas condições a reacção parece
realizar-se com conversões adequadas e tem algumas vantagens, como a maior rapidez na
subida e homogeneização da temperatura do banho e maior estabilidade da temperatura do
banho quando se retira o balão para adição dos reagente e se volta a colocá-lo. Desta forma
há um menor gasto energético global devido à temperatura inferior do banho e à redução do
tempo de aquecimento do banho, sendo esta última também útil na redução do tempo de
preparação prévio, que era algo longo para uma reacção que em si é muito rápida. Uma
desvantagem do uso de banho de água poderia ser a perda por evaporação, pois a
temperatura é mesmo assim suficiente para induzir evaporação considerável; contudo o tempo
da reacção é curto e o tempo de regularização da temperatura não é suficiente para que isso
seja efectivamente um problema.
De maior influência no processo de síntese, foi a caracterização e confirmação da
relevância do produto secundário anteriormente identificado, di−OAc−NVP, que aparecia com
bastante frequência. Este produto secundário pode estar presente em quantidade considerável
na mistura final, o que se pensa levar a que a reacção não origine um rendimento tão alto
como o espectável, embora a conversão da NVP possa parecer completa. Outra razão possível
para esta limitação serão perdas na cromatografia, devido à hidrólise espontânea durante este
processo catalisada pela acidez da sílica. Como já se referiu, o produto de hidrólise do
intermediário maioritário é o produto final pretendido; no entanto, não foram encontradas
condições para o recuperar integralmente da sílica. Assim, a hidrólise espontânea antes ou
durante a cromatografia originará perdas inevitáveis. A observação efectuada de maior
interesse potencial foi que a hidrólise do produto secundário parece originar o produto final
pretendido, a 2−OH−NVP, nas mesmas condições utilizadas para o componente intermediário
maioritário. Contudo, não se conseguindo desenvolver uma metodologia que permita a
purificação do produto final, a hidrólise directa da mistura reaccional – que permitiria a
diminuição de perdas por conversão dos dois intermediários em simultâneo – continua
dificultada. Chegou a testar-se o uso de AcOEt como único eluente, para a purificação
cromatográfica da 2−OH−NVP, mas a separação não foi tão eficaz como esperaríamos pelas
CCFs. No entanto, a observação anterior abre a possibilidade de testar outras condições
51
reaccionais que venham a facilitar a purificação e a recuperação. Um método que poderia
permitir até a purificação amostras de 2−OH−NVP com impurezas, seria a acetoxilação total da
amostra obtendo-se maioritariamente o produto di−OAc−NVP. O isolamento apenas deste
último até seria útil porque usando a mesma técnica de cromatografia, mas introduzindo o Et2O
na mistura de eluentes, aquele produto é muito mais separado do MP e das outras impurezas
da reacção que têm um rf próximo da 2−OAc−NVP. Contudo tentativas preliminares que se
fizeram com anidrido acético em piridina não mostraram resultados promissores,
provavelmente porque a adição ao N é oxidativa assim como a adição ao anel, pelo que
condições de acetilação simples não são suficientes. Uma possibilidade de alteração directa no
procedimento de síntese, a partir das observações tidas durante a optimização, seria o
prolongamento do tempo de reacção. Em princípio, originar-se-ia um aumento do rendimento
do produto secundário, di−OAc−NVP, contudo em simultâneo poderá haver um aumento
doutros produtos secundários. Novas tentativas e uma optimização das condições naquele
sentido poderiam ser uma via interessante de melhoramento desta síntese, que não se fizeram
por não ser este o objectivo do presente trabalho.
Apresenta-se na Figura 15, como resumo, o esquema reaccional evidenciando os
intermediários obtidos e a possibilidade de hidrólise de ambos ao produto final. Relativamente
aos rendimentos, os resultados anteriores indicavam valores da ordem dos
43 % para a conversão da NVP em 2−OAc−NVP, com isolamento, e 79% para a hidrólise.
Não foi possível calcular rendimentos com as alterações introduzidas às condições da reacção,
em especial incluindo a hidrólise de ambos os produtos intermediários, 2−OAc−NVP e
di−OAc−NVP.
N
NH
NN
O
N
NH
NN
O
OO
N
NH
NN
O
OH
+
1) AgOAc
2) I2
CH2Cl2, ∆
10 min
KOH, MeOH
N
N
NN
O
O
O
O
O
XIII XIV
Figura 15 – Esquema reaccional da síntese da 2−OH−NVP, com produtos intermediários.
52
3.1.2. Mecanismo Como já se referiu, pretende-se também fazer uma pequena discussão do mecanismo
de reacção envolvido na acetoxilação, para tentar compreender melhor as condições e os
resultados obtidos em termos de produtos secundários. Para aquela reacção, uma hipótese
forte seria a mediação do ataque pelo I2, por um mecanismo radicalar ou outro. Na literatura, as
condições utilizadas correspondem à reacção de Prévost, que mecanisticamente se pensa ser
iniciada pelo ataque electrófilo de I+ a um alceno58, formando um ião iodónio cíclico. Contudo
um ataque deste tipo a uma piridina é muito pouco provável devido à sua aromaticidade e à
electrodeficiência característica destes heterociclos. Outra possibilidade seria o ataque do I+ ao
N da piridina, favorecendo um ataque nucleófilo na posição orto o que seria mais concordante
com os resultados obtidos já que não se obteve um produto di-substituído, característico da
reacção de Prévost, embora também não se esteja em condições exactamente idênticas.
Contudo, a hipótese dum papel iniciador do I2 não é concordante com a observação inicial de
que a adição daquele reagente em primeiro lugar implica não se dar reacção. No entanto,
pensando na afinidade entre a Ag e o I que leva à rápida formação dum precipitado quando se
adicionam os reagentes, presumivelmente AgI, é mais natural assumir que seja esta a força
motriz iniciadora da reacção e que transientemente poderá ser formada uma espécie do tipo
hipoiodito de acetilo, CH3COOI. Na literatura encontram-se referências a esta espécie e até
especificamente ao combinar AgOAc e I2 em ácido acético glacial59. Embora esta referência
trate de quebras oxidativas de álcoois e outras referências mencionem iodações em condições
similares60, pensamos que aquela espécie é a mais plausível nas condições usadas e para os
resultados obtidos. Pondo a hipótese da formação transiente da espécie CH3COOI temos
novamente vários mecanismos a considerar. Uma possibilidade seria a quebra homolítica da
ligação O−I, possivelmente catalisada pela luz, hν, iniciando um mecanismo radicalar59. Apesar
da evidência contra a iniciação através do I2, no grupo já haviam sido realizados alguns testes
com armadilhadores de radicais para a verificação daquela hipótese, os quais não apoiaram
um mecanismo daquele tipo (Doutoras Alexandra Antunes e Mariana Duarte, comunicações
pessoais). Assim, pondo a hipótese de um mecanismo não radicalar poderemos ter um ataque
do Iδ+ ao par de electrões livre do N da piridina e um posterior ataque do −OAc à posição
adjacente do anel. O esquema apresentado na Figura 16 é baseado nesta hipótese.
53
A partir da discussão do mecanismo da reacção, podemos prever outros produtos
secundários possíveis. Existem pelo menos mais 2 produtos visíveis nas CCFs da m.r., embora
estejam presentes em quantidade reduzidas. Um desses produtos tem rf inferior a 2−OH−NVP
e o outro, que foi detectado nas últimas repetições da síntese, tem rf entre a 2−OAc−NVP e a
NVP. Eventualmente estes produtos podem estar relacionados um com o outro, pois seria
plausível pela proximidade de rfs que fossem outro acetoxilado e o respectivo produto de
hidrólise. Dado que estes produtos não foram isolados, não temos, porém, nenhuma evidência
estrutural concreta. Como vimos, a NVP parece não reagir directamente com I2 provavelmente
devido à desactivação dos seus anéis para adições electrófilas. Por isso seria mais provável
que outros produtos secundários fossem também acetoxilados e não iodados. Por outro lado,
a substituição largamente maioritária na posição 2 poderá ser devida a um carácter doador
inferior do N para a este carbono, devido à presença do grupo carbonilo, em comparação com
N
NH
NN
OO
-
O
Ag+
O
O
I+ I2 AgI + δ+
δ−
N
NH
NN
O
I
O
O
H
O-
O
Ag+
N
NH
NN
O
OO
N+
NH
NN
O
IH
O-
O
+ AgI + CH3COOH
Figura 16 – Hipótese de mecanismo para a acetilação oxidativa nas condições deste trabalho.
54
o N para ao carbono 3. Em oposição, a presença do grupo carbonilo poderá ser responsável
por não ser observada substituição no anel C, devido a uma menor probabilidade de ataque
inicial do N daquele anel ao Iδ+. De qualquer forma, a haver outro produto de acetoxilação,
a 9-acetoxi-NVP poderá mesmo assim ser mais provável que a 3-acetoxi-NVP. Deve ainda ser
mencionado que foi aparente a presença de outros produtos secundários de polaridade
elevada que dificultam a purificação do produto final, 2−OH−NVP.
3.1.3. Caracterização dos produtos isolados Relativamente à estabilidade, a 2−OH−NVP e os outros compostos envolvidos na
síntese são bastante estáveis quando armazenados em pó ou em soluções de solventes
orgânicos, mesmo a temperaturas ambiente elevadas, cerca de 30 °C, com a excepção da
di−OAc−NVP e da 2−OAc−NVP, que em solução têm alguma tendência a hidrolisar
espontaneamente.
Dois novos produtos foram isolados a partir duma mistura de várias fracções contendo
2−OH−NVP que se tentou purificar por intermédio duma cromatografia realizada com AcOEt
como único eluente. Os produtos que não tinham sido observados anteriormente,
apresentavam igual rf em AcOEt, mas diferentes afinidades para com o Et2O. Em misturas de
AcOEt e Et2O é possível obter rfs diferentes e adicionando Et2O à mistura de produtos é
possível obter um pp branco e manter o produto corado em solução; tendo o produto branco
sido purificado desta forma. O outro produto que origina soluções muito escuras, mas é roxo
quando seco, ficou sempre contaminado com o primeiro, mesmo quando se realizou uma CCF
preparativa em condições nas quais eram aparentemente separados. Inicialmente não se
compreendeu a origem dos novos produtos, mas ao identificar o composto branco como sendo
a 2,5-N-di-hidroxi-NVP (Ndi−OH−NVP, XV, Figura 21, pg. 62) deduziu-se que fosse
proveniente de hidrólise da di−OAc−NVP. É provável que o produto roxo tenha uma
semelhança estrutural grande com a Ndi−OH−NVP, dados os rfs próximos e os resultados
obtidos por 1H−RMN. Partindo do princípio que seriam ambos produtos de hidrólise da
di−OAc−NVP, poderíamos pensar que fosse, por exemplo, o 2-acetoxi-5-N-hidroxi-NVP.
No entanto não podendo realizar uma caracterização mais detalhada por falta de pureza, não
se podem avançar mais considerações.
Apresenta-se um resumo do resultados da caracterização dos compostos envolvidos na
síntese da 2−OH−NVP nas figuras e tabelas que se seguem. Sucedem-se algumas
considerações sobre a caracterização de cada um dos compostos. O material de partida
– a NVP – que foi obtido comercialmente, é incluído para sobretudo para comparação.
Os espectros de IV, MS, 1H-RMN e 13C-RMN são apresentados por completo nos Anexos
I a III.
55
6789101112 ppm
2,5-N-di-OH-NVP(em DMSO): X = OH, Y = OH
2-OH-NVP (em DMSO): X = OH, Y = H
2-OAc-NVP (em acetona): X = OAc, Y = H
di-OAc-NVP (em DMSO): X = OAc, Y = OAc
NVP (em acetona): X = Y = H
Figura 17 – Sobreposição, na zona dos protões aromáticos, dos espectros de 1H−RMN dos compostos isolados na síntese da 2−OH−NVP, incluindo o produto secundário, di−OAc−NVP, e o seu produto de hidrólise, Ndi−OH−NVP.
0,00,20,40,60,81,01,2 ppm
2,5-N-di-OH-NVP(em DMSO)
2-OH-NVP (em DMSO)
2-OAc-NVP (em acetona)
di-OAc-NVP (em DMSO)
NVP (em acetona)
Figura 18 – Sobreposição, na zona de campo alto, dos espectros de 1H−RMN dos compostos isolados na síntese da 2−OH−NVP, incluindo o produto secundário, di−OAc−NVP, e o seu produto de hidrólise, Ndi−OH−NVP.
N
N
NN
O
X
Y
56
Tabela 3 – Atribuições dos sinais de 1H−RMN dos produtos isolados na síntese
δδδδ/ppm (integraçãoa, multiplicidadeb); J/Hzc atribuições
NVP di−OAc−NVP 2−OAc−NVP 2−OH−NVP Ndi−OH−NVP
Hs14
Hs15
0,38 (2H, m)
0,87 (2H, m)
0,29 (1H, m); 0,59 (1H, m)
0,88 (1H, m); 1,02 (1H, m)
0,40 (2H, m)
0,87 (2H, m)
0,35 (2H, m)
0,85 (2H, m)
0,38 (2H, m)
0,69 (2H, m) ciclopropilo
H13 3,74 (1H, m) 2,80 (1H, m) 3,63 (1H, m) 3,60 (1H, m) 2,74 (1H, m)
Me Hs12 2,43 (3H, s) 2,07 (3H, sd) 2,46 (3H, sd) 2,23 (3H, s) 1,87 (3H, sd)
Me (OAc) — 2,48 (3H, s); 1,79 (3H, s) 2,26 (3H, s) — —
H2 8,08 (1H, d) Jo (H2, H3) = 4,9
— — — — anel A
H3 7,05 (1H, d) 7,01 (1H, sd) 6,84 (1H, sd) 6,30 (1H, s) 6,26 (1H, s)
H7 8,06 (1H, dd) Jo (H7, H8) = 7,7
8,18 (1H, dd) Jo (H7, H8) = 7,7
8,07 (1H, dd) Jo (H7, H8) = 7,6
7,97 (1H, dd) Jo (H7, H8) = 7,6
8,16 (1H, dd) Jo (H7, H8) = 7,7
H8 7,15 (1H, dd) Jo (H8, H9) = 4,7
7,26 (1H, ddd) Jo (H8, H9) = 4,6
7,18 (1H, dd) Jo (H8, H9) = 4,8
7,17 (1H, dd) Jo (H8, H9) = 4,8
6,64 (1H, dd) Jo (H8, H9) = 4,8
anel C
H9 8,49 (1H, dd) Jm (H7, H9) = 2,0
8,69 (1H, dd) Jm (H7, H9) = 2,0
8,49 (1H, dd) Jm (H7, H9) = 2,0
8,47 (1H, dd) Jm (H7, H9) = 2,0
8,24 (1H, dd) Jm (H7, H9) = 1,7
NH (5) 8,79 (1H, sl) — 8,80 (1H, sl) 9,60 (1H, s) —
2−OH — — — 10,56 (1H, sl) 11,40 (1H, s)f
5−OH — — — — 9,49 (1H, s)f
Hs lábeise
N+H (11) — — — — 7,97g (1H, sd)f
Notas: a integração representada como número de protões, nH. b multiplicidade apresentada como s – singuleto, sl – siguleto largo, d – dupleto, dd – dupleto de dupletos, m –
mutipleto. c constantes de acoplamento: Jo – acoplamento orto, Jm – acoplamento meta. d singuletos desdobrados. e os H lábeis geralmente são singuletos largos que abatem por adição de D2O; no caso dos compostos em estudo os
grupos OH parecem tornar-se singuletos bem definidos quando se muda de solvente de acetona para DMSO. f os sinais dos Hs lábeis não foram atribuídos inequivocamente. g supõe-se que pode haver um protão associado aos Ns 1, 10 e/ou 11 (ver Figura 21, pg. 62).
57
80100120140160180 ppm
2,5-N-di-OH-NVP (em DMSO) 2-OH-NVP (em DMSO) 2-OAc-NVP (em acetona)
di-OAC-NVP (em DMSO) NVP (em acetona)
Figura 19 – Sobreposição, na zona dos carbonos aromáticos, dos espectros de 13C−RMN dos compostos isolados na síntese da 2−OH−NVP, incluindo o produto secundário, di−OAc−NVP, e o seu produto de hidrólise, Ndi−OH−NVP.
Tabela 4 – Atribuições dos sinais de 13C−RMN dos produtos isolados na síntese
δδδδ/ppm atribuições NVP di−OAc−NVP 2−OAc−NVP 2−OH−NVP Ndi−OH−NVP
C14
C15
9,1 9,4
10,0 10,4
9,1 9,3
8,5 8,6
6,8 6,9 ciclopropilo
C13 ~30a 29,3 ~30a 28,9 23,8
Me C12 17,7 16,0 18,1 17,8 16,0
Me (OAc) — 20,2; 28,0 21,0 — —
C2 144,7 162,3 c 160,4b 163,9b
C3 123,0 132,1 114,6 ~108 d 122,9
C4 153,1 ~118d
C4a 144,0 144,7
152,6 167,5b
anel A
C11a 93,0 106,4b
C6a
121,8b 155,3b
115,0
c 121,2b 124,9b 107,6
C7 140,8 138,8 141,0 139,9 137,7
C8 119,9 117,9 120,2 119,3 111,3
C9 152,3 153,6 152,3 150,9 152,2
anel C
C10a 151,1 159,4
carbonilo C6
161,3b 167,8b 177,9
c
167,1
158,4 168,8b
carbonilo (OAc) — 168,8; 171,9 169,1 — —
Notas: (ver página seguinte)
58
Notas (Tabela 4): a fica obscurecido pelo sinal do solvente, evidenciado pelo espectro HSQC. b sem atribuição definitiva, devido à falta de correlações bidimensionais. c no espectro traçado em acetona não se detectaram os carbonos quaternários, devido à baixa concentração.
Foi também traçado um espectro em DMSO, mas a amostrava estava pouco pura, não se conseguindo fazer as atribuições correctas devido a interferências.
d sinais pouco definidos, mas com correlação nos espectros bidimensionais.
Tabela 5 – Resumo dos fragmentos positivos obtidos por MS-ESI dos produtos isolados na síntese
m/z iões +
NVP di−OAc−NVP 2−OAc−NVP 2−OH−NVP Ndi−OH−NVP
M+Na++MeOH 321 379 353
MH++MeOH 357 331
M+Na+ 347 321
MH+ 267 325 283 299
[MH−CH3CO2H+MeOH+Na]+ 377
[MH−CH3CO2H+MeOH]+ 355
[MH−CH2=C=O]+ 283
[MH−CH3CO2H−CH2=C=O+MeOH+Na]+ 336
[MH−CH3CO2H−CH2=C=O+MeOH]+ 313
[MH −CH2=C=O−ciclopropilo]+ a 243
[3-acil-2-ciclopropilamino-piridina]+ b 161
[2-ciclopropilamino-piridina]+ c 133 Notas: a b c
NH
NH
NN
O
OH
+ H+
N
C+
O
N
NN
+
Tabela 6 – Resumo dos fragmentos negativos obtidos por MS-ESI dos produtos isolados na síntese
m/z iões −−−−
di−OAc−NVP 2−OAc−NVP 2−OH−NVP Ndi−OH−NVP
[M−H+MeOH]− 329
[M−H]− 323 281 297
[M−H−CH3CO+MeOH]− a 369
[M−H −CH3CO]− a 280
[M−CH3CO2H−CH3CO+MeOH]− 311 Notas: a Estas propostas de fragmentação apresentam diferença de uma unidade para as razões m/z detectados.
59
3.1.3.1. NVP
Não há muitas considerações a fazer sobre a caracterização
da NVP, que como já se referiu é comercial e se apresenta aqui
para comparação com os demais compostos estruturalmente
relacionados. Contudo, houve uma observação sobre o seu ponto
de fusão que gostaríamos de relatar. O ponto de fusão da NVP foi
medido com o intuito de comprovar a calibração do aparelho
utilizado e verificar a conveniente utilização do mesmo. O ponto de
fusão da NVP está referido como sendo 196 °C61. No entanto, por mais que uma ocasião,
aquilo que se observou para a NVP adquirida foi uma transição de estado pouco definida que
se dá a pouco e pouco e que culmina, a cerca de 200 °C, numa reorganização dos cristais da
amostra, que contudo só fundem a uma temperatura bastante superior, 245-250 °C. Sendo
confirmada a pureza da amostra através da caracterização espectroscópica realizada, resta
admitir que poderá haver uma transformação entre formas polimorfas, eventualmente com
diferentes graus de hidratação.
3.1.3.2. di−OAc−NVP
N
N
NN
O
O
O
O
O
N
N
NN
O
O
O
O
O
Figura 20 – Isómeros cis e trans da di−OAc−NVP.
O espectro de 1H-RMN da di−OAc−NVP apresentou algumas características curiosas,
como um desdobramento acentuado dos sinais dos Hs do grupo ciclopropilo, realçado na
Figura 18 pela presença de 4 multipletos bem distintos na zona de campo alto.
Esta observação levou a que se traçassem novos espectros com variação de temperatura
– em acetona até aos 45 °C e em DMSO até aos 70 °C – não tendo sido observadas variações
nos multipletos. A diminuição de temperatura não foi realizada, mas pensa-se que se possa
tratar de verdadeiros isómeros e não só de confórmeros. A construção de uma estrutura
modelo e simulações simples da estrutura em 3D com o programa ChemSktech permitiram
realçar a possibilidade de dois isómeros, cis e trans, relativamente às posições do grupo
N
NH
NN
O
60
N−OAc e ciclopropilo (Figura 20), com possível interacção dos grupos no isómero cis.
No entanto, observando a sobreposição de espectros de 1H-RMNs em pormenor na zona dos
protões do grupo ciclopropilo (Figura 18), vê-se que a NVP e a 2−OAc−NVP também
apresentam um muito ligeiro desdobramento daqueles sinais. No caso da di−OAc−NVP,
verifica-se ainda um desdobramento do sinal de H8, embora muito pequeno, e não observável
nos outros Hs aromáticos do anel C. O desdobramento doutros sinais como os H3 e Hs12 não
foi exclusivo do di−OAc−NVP (ver Tabela 3). A di−OAc−NVP foi o composto melhor
caracterizado, tendo sido realizados para além dos espectros HSQC e HMBC, um espectro
NOESY. Com as correlações dos espectros bidimensionais foi possível atribuir todos os
carbonos observados no espectro de 13C-RMN, à excepção dos carbonos dos 2 grupos acetilo,
os quais não foi possível distinguir um do outro. Estas correlações permitiram também distinguir
os Hs dos 3 grupos metilo presentes na molécula.
Os MS obtidos para a amostra de di−OAc−NVP não apresentam o ião molecular e todos
os fragmentos parecem estar associados pelo menos a uma molécula de solvente, MeOH, para
além da possibilidade de se associarem ainda a um ião sódio. Assim, identificaram-se os
fragmentos como sendo provenientes da perda de ácido acético e posterior perda de ceteno;
no modo positivo (ver Tabela 5) foram ambos encontrados em associação a MeOH e a
MeOH+Na+ e no modo negativo (ver Tabela 6) foram encontrados os fragmentos
correspondentes associados a MeOH.
O espectro de IV da di−OAc−NVP apresenta os esperados 3 picos de carbonilo, a 1769,
1692 e 1645 cm−1, que se atribuem respectivamente, ao 2-acetoxi, ao 5-acetoxi e ao NHCOAr.
Estas atribuições foram feitas por comparação com os carbonilos da NVP e 2−OAc−NVP.
A amostra de di−OAc−NVP apresentou cristais com comportamentos díspares: enquanto
os cristais de maiores dimensões parecem fundir com decomposição a temperaturas mais
baixas e pouco definidas (abaixo dos 200 °C) alguns cristais mais pequenos parecem persistir
acima de 300 °C. Poderá haver sistemas de cristalizações diferentes ou apenas a incorporação
de solvente nos cristais maiores. Não se descarta a possibilidade dos cristais mais resistentes
serem alguma impureza.
3.1.3.3. 2−OAc−NVP
O espectro de 1H-RMN da 2−OAc−NVP é muito próximo
do da NVP, à excepção da ausência de sinal para o H2,
da presença dum sinal de Me extra e de alguma
blindagem do H3. Esta blindagem do H3 é natural pela
presença do grupo OAc no carbono adjacente e foi
também observada na mesma ordem de grandeza para a di−OAc−NVP quando o espectro foi
traçado no mesmo solvente. Como para a NVP, não foi possível identificar todos os carbonos
porque no espectro de 13C-RMN não se distinguem bem os carbonos quaternários, não se
N
NH
NN
O
OO
61
observando também as respectivas correlações nos espectros bidimensionais. Em DMSO foi
possível atingir uma concentração superior, mas a amostra utilizada não estava tão pura,
havendo demasiadas interferências para poder atribuir os carbonos observados
inequivocamente.
Os MS obtidos para a amostra de 2−OAc−NVP apresentam muitos fragmentos
associados ao solvente ou a iões sódio (ver Tabela 5), como para a di−OAc−NVP.
São detectados o MH+ e o respectivo [M−H] −, assim como, em ambos os modos, a perda dos
grupos ceteno ou acetilo. No modo positivo são detectadas as associações do ião molecular
com Na+, MeOH e ambos. Neste modo há ainda um fragmento para o qual propomos a perda
de ceteno e ciclopropilo (ver Tabela 5). Embora, este tipo de fragmentação não seja comum
por ESI, que é uma técnica de fragmentação suave, ela pode ser observada com ionização por
impacto electrónico (EI)46. A escolha de uma voltagem elevada em ESI, poderá ser a razão da
observação deste tipo de fragmento e das fragmentações ainda mais extensas observadas
noutros casos, como veremos.
Como já se referiu, o espectro de IV da 2−OAc−NVP apresenta 2 picos de carbonilo,
a 1778 e 1645 cm−1, que se atribuem respectivamente, ao CH3COO e ao NHCOAr,
por comparação com os carbonilos da NVP e da di−OAc−NVP.
A fusão da 2−OAc−NVP deu-se a 255-260 °C, nos 2 ensaios realizados.
3.1.3.4. 2−OH−NVP
Para a 2−OH−NVP verificou-se uma blindagem ainda
maior do H3, que a observada para as di−OAc−NVP e
2−OAc−NVP; por outro lado parece haver desblindagem do H
lábil do N5 e, como seria de esperar, pode identificar-se mais
um H lábil relativo ao grupo hidroxilo. Os Hs do anel C são
pouco afectados, tal como observado para a 2−OAc−NVP.
Grande parte dos carbonos visíveis no espectro de 13C-RMN foram atribuídos, não sendo
contudo possível fazê-lo inequivocamente para todos. Os carbonos sem correlação nos
espectros bidimensionais foram incluídos na Tabela 4, tendo sido as atribuições realizadas por
comparação com as da di−OAc−NVP.
A 2−OH−NVP foi o composto para o qual se obtiveram MSs mais simples, tendo sido o
MH+ e o correspondente [M−H] − os picos base nos modos positivo como negativo,
respectivamente. No modo positivo, MH+ corresponde mesmo ao único fragmento significativo.
No modo negativo, foram observados outros fragmentos que não foi possível racionalizar e que
se pensa serem devidos a interferências.
O espectro de IV da 2−OH−NVP apresenta, como seria de esperar, apenas um
carbonilo, a 1658 cm−1, que coincide com o da 2−OAc−NVP.
N
NH
NN
O
OH
62
O ponto de fusão da 2−OH−NVP é superior a 300 °C, não se tendo observado qualquer
alteração na amostra até àquela temperatura.
3.1.3.5. Ndi−OH−NVP
N
N
NN
O
OH
OH
N
N
NN
O
OH
OH
R
H+
XV XVI
Figura 21 – Estrutura do novo produto isolado, Ndi−OH−NVP XV, proveniente da hidrólise da di−OAc−NVP; XVI representa um esquema do tipo de protonação que propomos que ocorra para XV.
Os espectros de RMN indicavam uma molécula próxima da 2−OH−NVP, mas não
coincidente, como se pode ver pela sobreposição dos 1H−RMNs apresentada na Figura 17.
Após cuidada ponderação de todos os resultados, pensa-se tratar-se duma forma protonada do
2,5−N−di−OH−NVP (XV e XVI, Figura 21) e as razões para tal são detalhadas de seguida.
A massa molecular encontrada a partir dos MS positivo e negativo indica a presença de um
grupo OH extra em relação à 2−OH−NVP. Contudo, o 1H−RMN indicava não ter havido uma
2ª substituição no anel A, nem no anel C, o que nos levou a supor uma oxidação num dos
azotos da molécula. Voltando de novo aos resultados do MS identificaram-se fragmentos
coincidentes ou concordantes com alguns resultados das oxidações químicas, os quais
discutiremos adiante, e que indicam uma dupla quebra da estrutura da NVP no anel central.
O facto de se observarem fragmentos nos quais a estrutura do anel C e o grupo N-ciclopropilo
se apresentam intactos (ver Tabela 5), leva-nos a restringir as opções de oxidação aos Ns do
anel A (posição 1) ou da amida (posição 5). O facto da se obterem fragmentos de baixo peso
molecular por ESI, que se sabe ser uma técnica de ionização suave, levou-nos a ponderar
opções que explicassem a tendência da molécula a fragmentar daquela forma. Assim,
parece-nos mais plausível que a oxidação se tenha dado no N5, pois pode facilitar a quebra da
ligação ao anel A (como se verifica para os produtos de oxidação) e permite que o N1 se
mantenha livre para a partilha do protão. Considera-se aqui um tipo de protonação, talvez
pouco comum, possivelmente distribuída entre 3 Ns, os N1, N10 e N11, como se esquematiza
em XVI (Figura 21). Uma partilha da protonação poderá ser facilitada pela proximidade
daqueles Ns, permitindo que o composto não apresente uma carga localizada, de que
decorrerá a mobilidade razoável observada nas CCFs. Esta hipótese é também consistente
com a presença de 3 Hs lábeis no espectro de 1H−RMN.
63
Considerando agora que este é um produto de hidrólise da di−OAc−NVP, verifica-se que
a blindagem do sinal dos Hs12 observada é concordante com uma substituição na posição 5 e
com a atribuição feita para a di−OAc−NVP, como se pode ver no resumo apresentado na
Tabela 3. O desdobramento dos sinais dos ciclopropilos, observado para a di−OAc−NVP, não é
identificado na Ndi−OH−NVP provavelmente devido à menor dimensão do grupo substituinte na
posição 5, OH em vez de OAc. Embora estes compostos sejam oxidados nas mesmas
posições, os respectivos efeitos nos Hs aromáticos são bastante diferentes: enquanto na
di−OAc−NVP todos os Hs do anel C foram ligeiramente desblindados, no Ndi−OH−NVP cada
um sofre um efeito diferente. Como para a 2−OH−NVP nem todos os carbonos puderam ser
atribuídos inequivocamente e aqueles para os quais não se dispôs de correlações através dos
espectros bidimensionais, foram incluídos na Tabela 4 por comparação com as atribuições da
di−OAc−NVP.
O espectro de IV traçado para o Ndi−OH−NVP apresenta um pico de carbonilo forte,
a 1635 cm−1, valor um pouco inferior à NVP e à di−OAc−NVP, embora também apresente outro
pico forte de maior energia, a 1705 cm−1, o qual não foi atribuído.
Para este composto, o ponto de fusão apresenta disparidades como se observou para o
di−OAc−NVP. Parece dar-se uma fusão de certas partes da amostra a uma temperatura
inferior a 200 °C com decompõe. Contudo, a restante amostra só parece fundir totalmente a
270 °C. Verificou-se alguma coloração do pó branco em certas zonas da amostra que poderá
ser proveniente de algumas impurezas que poderão ter ponto de fusão inferior.
3.2. Oxidação química da 2−OH−NVP
Foram escolhidos 2 reagentes amplamente documentados como promovendo a
oxidação de fenóis a quinonas, com o objectivo de aferir a tendência à oxidação do metabolito
2−OH−NVP e o tipo de produtos de oxidação que se originam. Para tal foram escolhidos o
óxido de prata (Ag2O) e o sal de Fremy [(KSO3)2NO], e foram realizadas reacções em variadas
condições. A tendência para a oxidação verifica-se realmente, tendo sido com o último oxidante
que se obtiveram os resultados mais consistentes e interessantes. Para as reacções com sal
de Fremy obteve-se um produto comum a todas as condições e, em geral, largamente
maioritário e identificado como a 2-ciclopropilamino-N-(4-metil-2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-
-3-il)nicotinamida (XVII, Figura 26, pg. 72). Com Ag2O, os resultados foram menos inequívocos
e a oxidação produzida parece ser, em geral, mais extensa, chegando a produtos sem
interesse para este estudo. Contudo, o sal de Fremy também leva parcialmente a oxidações
mais extensas que as previstas, como é comprovado pelo produto que se verificou coincidir
para ambos os oxidantes, identificado como a 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (XVIII,
Figura 27, pg. 73). Nas próximas secções os resultados serão descritos e discutidos em maior
detalhe. Por fim serão discutidos, em conjunto, as caracterizações dos produtos isolados de
maior interesse e os mecanismos das oxidações.
64
3.2.1. Óxido de prata, Ag2O As várias condições experimentadas, como quantidades utilizadas, solventes,
temperatura e agitação, encontram-se resumidas na Tabela 1 (Parte Experimental, pg. 46).
Os tempos máximos de reacção e alguns dos resultados, como a taxa de conversão, o número
de produtos obtidos e a codificação dos produtos isolados, são apresentados na Tabela 7.
Tabela 7 – Resultados das reacções de oxidação da 2−OH−NVP com Ag2O
Reacção Taxa Conversão/% t100%/ha tmáx/h
b N° de
Produtos Obtidos
Produtos Isolados
MS1 100 > 47 ~ 72 2 mC, mD
MS3 100 < 45 ~ 72 3 (+1)c
mA, mB
MS8 100 < 2 ~ 48 1 (= mB) d
MS10 100 < 2,5 ~ 72 1 (+2)e FMS10
MS12 100 <1,5f 4
MS13 100 <3,5f 2
MS14 100 < 0,5f 2
MS15 100 <3,5f 3
MS16 100 > 72 2
MS17 100h ~ 96h
~ 96 (~ 5)g
4
FFA MS13+15
MS27 ~ 100i >168 ~ 168 (~ 29)g 4
MS28 100 < 3 ~ 5 9 (3)j
MS29 ~ 100i >72 ~ 72 (~ 7)k
6 (3)j
mT, mU, mV, mX, mZ, mAA
Duma forma geral, observou-se uma dependência forte dos resultados com os solventes
orgânicos e a presença de fase aquosa. O tipo de diferenças observadas é bem representado
pelos resultados apresentados na Figura 22, na qual se pode ver a CCF das m.r.s de MS12 a
MS17, onde cada par de reacções foi feito com um solvente orgânico, CHCl3, CH2Cl2 e THF,
num caso sem fase aquosa, noutro caso com tampão a pH7 (ver Tabela 1). Não é contudo
possível apontar qual o tipo de efeito observado, até porque não foi possível isolar e
caracterizar todos os produtos obtidos. Uma diferença, por exemplo, entre os solventes
clorados, poderá ser a presença de HCl no CHCl3 que poderá catalisar certas degradações.
A influência da presença de fase aquosa, poderá também prender-se com a catálise de certas
reacções, como veremos na discussão do mecanismo.
Notas: a Tempo aproximado para atingir
100 % de conversão. b Tempo máximo de reacção. c Mais 1 produto foi detectado,
ténue, depois de parte do tratamento das m.r.s.
d Não foi realizado tratamento das m.r.s.
e Mais 2 produtos eram visíveis nas CCFs, mas muito ténues.
f Alguma dificuldade em determinar com segurança.
g Tempo de agitação no início da reacção, restante tempo sem agitação.
h Últimas CCF parecem ainda indicar presença de MP, contudo a resultante das reacções não apresenta MP.
i Não ficou clara a total conversão nestas reacções, mas no tratamento das m.r.s da mistura de MS27 a MS29 aparece MP.
j Nos extractos detectam-se muito mais produtos que ao aplicar as m.r.s directamente.
k Tempo inicial de agitação. Nesta reacção confirmou-se a tendência para reagir melhor sem agitação, pois teve momentos com e sem agitação.
65
Figura 22 – CCF das m.r.s de MS12 a MS17, da esquerda para a direita, cada uma seguida da sua mistura com o padrão de MP, que se encontra mais à direita. MS12 e 13 foram realizadas em CHCl3, MS14 e 15 em CH2Cl2 e MS16 e 17 em THF. MS12, 14 e 16 foram realizadas unicamente com fase orgânica, enquanto MS13, 15 e 17 também têm tampão. Foram coloridas a vermelho as manchas resultantes do MP e noutras cores produtos que se pensam coincidentes entre as reacções.
O aumento da temperatura de reacção pareceu resultar numa maior rapidez de
conversão, em comparação com outra reacção no mesmo solvente. No entanto, as velocidades
de reacção não foram muito reprodutíveis. Também se observou o caso de reacções que
pareceram evoluir mais sem agitação que quando agitadas, não tendo sido possível
racionalizar este fenómeno. Outro efeito da temperatura poderá ser a obtenção de um maior
número de produtos, que poderá ser devido a uma degradação dos produtos iniciais de
oxidação directa do MP. Um efeito do mesmo tipo poderá dar-se quando o tempo de reacção é
muito prolongado, mesmo sem se atingir a conversão total.
A conversão total poderá dar-se em poucas horas, mas devido a arraste observado nas
CCFs e à proximidade de rf de alguns produtos com o MP a maioria das reacções foi
prolongada durante bastante mais tempo. Contudo, houve dificuldades na reprodutibilidade da
rapidez de conversão como se mostra com os casos de MS28 e MS29 que em princípio
estariam nas mesmas condições. Em MS29 verificou-se uma influência negativa da agitação
na evolução da reacção, que já havia sido observada para outras reacções. Em contraste,
a reacção MS28 deu-se tão rapidamente que não pareceu existir o mesmo efeito negativo da
agitação.
Em relação às reacções com Ag2O deve-se ainda referir que é difícil eliminar totalmente
os resíduos de Ag das m.r.s e que a presença daqueles mesmo em quantidades pequenas
parece continuar a degradar a mistura de produtos filtrada. A concentração de oxidante na m.r.
também parece poder influenciar a reacção, mas mais uma vez os efeitos observados não
foram consistentes.
66
Através dos espectros de 1H-RMN os últimos produtos isolados, verificou-se que mT não
estava suficientemente puro para uma caracterização mais detalhada e mX, mZ e mAA não
pareceram ter interesse, pois não se reconhecem características da estrutura da NVP.
Foi possível caracterizar em maior detalhe o produto maioritário das respectivas reacções, mV,
assim como mU, como veremos mais adiante. A comparação de alguns destes produtos com
produtos das reacções com sal de Fremy será apresentada mais à frente após a discussão
daqueles resultados.
3.2.2. Sal de Fremy Como anteriormente no caso das oxidações com Ag2O, apresentam-se a condições
experimentais resumidas na Tabela 2 (Parte Experimental, pg. 47) e os tempos de reacção e
alguns dos resultados na Tabela 8.
Como já se referiu, os resultados das oxidações com o sal de Fremy parecem mais
consistentes, em especial porque se identificou um produto comum a todas as condições,
o qual se conseguiu isolar várias vezes. Inicialmente, com base na evidência de 1H-RMN e 13C-RMN, pensou-se que este produto fosse o catecol, 2,3-di-hidroxi-NVP, o que seria bastante
interessante do ponto de vista deste trabalho. Contudo, a possibilidade de resolução da
estrutura por difracção de raios-X levou à indentificação inequívoca deste produto como a
2-ciclopropilamino-N-(4-metil-2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-3-il) nicotinamida (XVII, Figura 26,
pg. 72). Esta estrutura apresenta menor interesse no âmbito do objectivo deste trabalho, mas
tem uma grande relevância estrutural e reaccional. Mais adiante será proposto um mecanismo
que tenta racionalizar a sua formação (Figura 29, pg. 76).
Uma das características que diferencia estas reacções das oxidações com Ag2O foi que
geralmente as conversões foram muito inferiores e mesmo quando foi possível obter
conversões totais, foi preciso um tempo superior. Esta observação é concordante com o facto
do sal de Fremy ser um oxidante mais suave que o Ag2O, sendo que nas condições testadas o
último parece levar a reacções mais rápidas, mais completas e originando maior degradação.
Antes de mais deve ser mencionado que se observaram instabilidades dos próprios
solventes ou da espécie reactiva do sal de Fremy em presença daqueles. Segundo a
literatura62, a coloração roxa observada ao disolver o sal de Fremy em solução aquosa é
originada pelo radical que se pensa ser activo na reacção - (KSO3)2NO•. Mais se verificou,
através daquela referência62, que as condições óptimas seriam pH 10 e temperatura
ligeiramente baixa. O MeOH, solvente utilizado inicialmente, parece reagir imediatamente com
o sal de Fremy. Nas condições testadas, o AcOEt é o solvente que parece ser menos sensível
ao sal de Fremy, como comprovaram o resultados das reacções MS42 a 45 realizadas com
este solvente e diferentes fases aquosas. O outro solvente utilizado foi o THF que também
reage com o sal de Fremy, mas essa reactividade diminui fortemente com o pH da fase
aquosa, sendo desprezável a pH10. Esta observação também é concordante com as
67
diferenças observadas nos resultados das reacções MS38 a 41. Sem solvente orgânico, a
reacção torna-se muito lenta, a todos os pHs testados, provavelmente devido à baixa
solubilidade do MP.
Tabela 8 – Resultados das reacções de oxidação com sal de Fremy
Reacção Taxa Conversão/% t100%/ha tmáx/h
a N° de
Produtos Obtidos
Produtos Isolados
MS2 — ~ 24 2
MS4 Baixa
— ~ 24 —b —
MS5 — — ~ 1 — —
MS6 Média — ~ 72 2 —
MS7 Média — ~ 48 2 —
MS9 Média — ~ 48 6 (4)c EMS9
MS11 Alta — ~ 24 4 mE, mF, mG
MS24 Alta — ~ 48 7 (2)d mP, mQ
MS25 Alta — ~ 48 2 mR, mS
MS26 100 < 19 ~ 24 4 (2)d
mM, mN, mO
MS31 ~ 100 ~ 2 e ~ 48 12 (3)c
mAB, mAC, mAD
MS34 —g
MS35 —g
MS36 —g
MS37 —g
MS38 —g
MS39 —g
MS40 —g
MS41 2
MS42 —g
MS43 2
MS44 3
MS45
Baixa — ~ 208 (~ 48)f
3
—h
MS46 Média — ~ 24 —
Notas: a Definidos como na Tabela 7. b Esta reacção não foi
suficientemente seguida para saber quantos produtos foram originados.
c Nestes casos parece haver um efeito claro de concentração, sendo observáveis mais produtos ao concentrar o sobrenadante da reacção.
d Os extractos finais apresentam mais produtos que aqueles que se detectam a partir das m.r.s apesar de se aplicar tanto a fase aquosa como a fase orgânica nas placas. Provavelmente será também um efeito de concentração.
e Depois de 2 dias de reacção com produtos muito ténues, ao adicionar THF a reacção parece ficar completa em apenas 2 h.
f As reacções foram agitadas e aquecidas durante os 2 primeiros dias, depois foram deixadas tapadas à temperatura ambiente e sem agitação.
g Não foi possível determinar com segurança, mas parece não ter ocorrido reacção ou foi muito pouco extensa.
h O tratamentos destas m.r.s não foi concluído.
68
Realmente, a reacção parece ser favorecida a pH elevado, provavelmente em especial
pela maior estabilidade da espécie radicalar reactiva, comprovada por uma persistência da
coloração roxa durante tempos muito superiores aos outros pHs testados. Contrariamente às
recomendações da literatura, a baixa temperatura não pareceu apresentar vantagens.
Neste caso, o aumento da temperatura parece ter um efeito positivo, mas provavelmente não é
necessário mais que cerca de 30 °C, pouco acima da temperatura ambiente.
O uso de duas fases imiscíveis também pareceu ter um efeito positivo nas reacções.
O tempo de reacção prolongado, a temperatura e o uso de AcOEt podem estar associados a
uma maior quantidade produtos, talvez alguns provenientes da degradação de produtos
primários, isto é directamente da oxidação do MP. O uso de THF associado a uma fase aquosa
de pH elevado parece adequado e gerou bons resultados.
Como já foi referido houve um produto, em geral, largamente maioritário presente em
todas as reacções. Foi possível caracteriza-lo com grande detalhe e foi identificado como
sendo a 2-ciclopropilamino-N-(4-metil-2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-3-il)nicotinamida (XVII,
Figura 26, pg. 72). Houve outro produto relevante obtido em algumas das reacções, mas que
contudo não se pode isolar com pureza suficiente para a sua identificação. Outro produto não
maioritário isolado da reacção MS26, mO, verificou-se ser coincidente com um dos produtos da
oxidação pelo Ag2O. Na Figura 23 apresenta-se uma CCF onde é possível ver a comparação
de rfs de alguns dos produtos isolados de ambos os oxidantes e destes com o MP.
A caracterização mais detalhada de mU e mO confirmou serem realmente o mesmo produto,
como discutiremos adiante.
Figura 23 – CCF de vários produtos isolados. mP e mO, respectivamente nas 1ª e 5ª posições a contar da esquerda são de reacções com Fremy. mT, mU e mV, nas 3ª, 7ª e 8ª posições são produtos de oxidação com Ag2O. As 2ª, 4 e 6ª posições são misturas dos isolados do lado direito e esquerdo. A 9ª posição é a mistura de mV e o padrão de MP, que se encontra-se mais à direita. Foram coloridas as manchas que se pensam coincidentes; rfs idênticos foram comparados através dos espectros de 1H-RMN.
69
3.2.3. Caracterização dos produtos de oxidação isolados Como foi anteriormente feito para os produtos isolados na síntese da 2−OH−NVP,
apresenta-se aqui um resumo dos resultados de RMN e MS, seguidos uma pequena discussão
da caracterização de alguns dos produtos de oxidação isolados. Nas figuras e tabelas, incluem-
se os resultados já discutidos do MP, 2−OH−NVP, para comparação. Os produtos para os
quais foi possível fazer uma caracterização mais completa foram: o produto maioritário da
reacção com sal de Fremy, para o qual se apresentam resultados dos isolados mE e mAC,
e que foi identificado como a nicotinamida XVII (Figura 26, pg. 72); o produto mO obtido da
oxidação pelo sal de Fremy e o produto mU obtido da oxidação pelo Ag2O, que se apresentam
em separado, mas se discutem em conjunto por se considerarem idênticos; e o produto mV,
maioritário das reacções MS27 a 29 realizadas com Ag2O.
6789101112 ppm
mV (em DMSO): X = NH2
mU (em DMSO): X = OH
mO (em acetona):X = OH
nicotinamida XVII(em acetona)
2-OH-NVP (em DMSO)
Figura 24 – Sobreposição dos espectros de 1H−RMN na zona dos protões aromáticos para o MP, 2−OH−NVP, e os produtos de oxidação caracterizados.
NH
NH
NNH
O
O
O
X
NNH
O
70
Tabela 9 – Atribuições dos sinais de 1H−RMN dos produtos de oxidação
δδδδ/ppm (integraçãos, multiplicidadeb); J/Hzc atribuições
2−OH−NVP nicotinamida XVIId mOd mUd mVd
Hs14
Hs15
0,35 (2H, m)
0,85 (2H, m)
0,50 (2H, m)
0,77 (2H, m)
0,76 (2H, m)
1,08 (2H, m)
0,78 (2H, m)
1,11 (2H, m)
0,39 (2H, m)
0,71 (2H, m) ciclopropilo
H13 3,60 (1H, m) 2,93 (1H, m) 2,76 (1H, m) 2,80 (1H, m) 2,78 (1H, m)
Me Hs12 2,23 (3H, s) 2,00 (3H, s) — — —
H2 — — — — — anel A
H3 6,30 (1H, s) — — — —
H7 7,97 (1H, dd) Jo (7, 8) = 7,6
8,17 (1H, dd) Jo (7, 8) = 7,8
8,22 (1H, dd) Jo (7, 8) = 7,6
8,29 (1H, dd) Jo (7, 8) = 7,7
7,93 (1H, dd) Jo (7, 8) = 7,6
H8 7,17 (1H, dd) Jo (8, 9) = 4,8
6,68 (1H, dd) Jo (8, 9) = 4,7
7,22 (1H, dd) Jo (8, 9) = 4,7
7,31 (1H, dd) Jo (8, 9) = 4,8
6,60 (1H, dd) Jo (8, 9) = 4,8
anel C
H9 8,47 (1H, dd) Jm = 2,0
8,33 (1H, dd) Jm = 1,8
8,64 (1H, dd) Jm = 1,8
8,73 (1H, dd) Jm = 2,0
8,20 (1H, dd) Jm = 1,7
NH/NH2 (5) 9,60 (1H, s) 9,69 (1H, sl)e — — 7,37 (<1H, s); 7,99 (<1H, s)
2−OH 10,56 (1H, sl) — — — —
NH (1) — 9,09 (1H, sl)e — — —
NH (11) — 8,13 (1H, sl)e f f 8,56 (1H, sg)
Hs lábeis
OH (ácido) — — h 11,58 (1H, s) —
Notas: a integração representada como número de protões, nH. b multiplicidade apresentada como s – singuleto, sl – siguleto largo, d – dupleto, dd – dupleto de dupletos,
m – mutlipleto. c constantes de acoplamento: Jo – acoplamento orto, Jm – acoplamento meta. d para facilitar a atribuição manteve a numeração original da NVP para todos os produtos de oxidação. e os sinais dos Hs lábeis não foram atribuídos inequivocamente
f em mO observa-se uma banda muito larga e grande a 3,5 que se define num pico de H2O por adição de D2O, não se identificando igual comportamento em mU. Contudo, também não se observa outro sinal que possa corresponder ao H lábil previsto.
g singuleto desdobrado.
h é possível que não se veja o singuleto por ser demasiado largo em acetona, enquanto que no caso de mU se vê bem porque o espectro foi traçado em DMSO.
71
80100120140160180 ppm
mV (em acetona) mU (em DMSO) mO (em DMSO)
nicotinamida XVII (em acetona) 2-OH-NVP (em DMSO)
Figura 25 – Sobreposição dos espectros de 13C−RMN na zona dos carbonos aromáticos para o MP, 2−OH−NVP, e os produtos de oxidação caracterizados.
Tabela 10 – Atribuições dos sinais de 13C−RMN dos produtos de oxidação
δδδδ/ppm atribuições 2−OH−NVP nicotinamida XVIIa mOa mUa mVa
C14
C15
8,5 8,6 7,4 9,8 10,0 7,4
ciclopropilo
C13 28,9 24,4 25,3 25,7 24,4
Me C12 17,8 10,2 — — —
C2 160,4 — — — —
C3 ~108b — — —
C4 ~118 b — — —
C4a 144,7
124,3 135,0 173,2 — — —
anel A
C11a 169,6 — — —
C6a
121,2 124,9 109,6 111,9 112,1 c
C7 139,9 138,8 129,0 137,2 137,2
C8 119,3 112,3 119,1 119,8 111,7
C9 150,9 153,7 153,7 154,5 152,7
anel C
C10a 151,1 148,0 151,6
carbonilo C6 177,9
159,8 167,3 167,1 162,4
c
Notas: a para facilitar a atribuição manteve a numeração original da NVP para todos os produtos de oxidação. b sinais pouco definidos, mas com correlação nos espectros bidimensionais. d os carbonos quaternários não foram visíveis.
72
Tabela 11 – Resumo dos fragmentos positivos e negativos obtidos por MS-ESI dos produtos de oxidação
nicotinamida XVII iões +
+ − mU mO mV iões −−−−
[dímero+MeOH]+ 386a
dímero+Na+ 379 379b
MH++MeOH 210 a 210 a
MH+ 178 a 178
[M-11]+ c 287 285 [M−13]− c
[3-acil-2-ciclopropilamino-piridina]+ d 161 161 161
[2-ciclopropilamino-piridina]+ e 133 133
imina f 121 Notas: a Nestes casos propõe-se que a fragmentação tenha originado M+ e não MH+ dadas as diferenças de uma unidade nas
razões m/z. b Neste caso há uma diferença de 2 unidades. c Não foi possível atribuir estes fragmentos. d e f
N
C+
O
N
NN
+
NN
+
3.2.3.1. Nicotinamida XVII
As características fundamentais do 1H-RMN
traçado para o produto maioritário das oxidações com
sal de Fremy são a ausência de H3, que indicava a
substituição naquela posição, e a existência de 3 Hs
lábeis. Isto levou-nos a pensar inicialmente tratar-se do
catecol 2,3 hidroxilado. Embora não tivesse sido
possível fazer todas as atribuições inequivocamente o 13C-RMN parecia apresentar os 15 carbonos da
estrutura da NVP. Contudo o MS apontava para a perda
de um carbono. Com a obtenção dum cristal deste
produto tornou-se possível a resolução da sua estrutura
por difracção de raios-X, identificando-se a 2-ciclopropil-
amino-N-(4-metil-2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-3-il)nico-
tinamida (XVII).
Ao indentificar correctamente a estrutura do produto, foi então possível atribuir os 3 Hs
lábeis aos três grupos NH, embora não especificamente de forma inequívoca, e confirmar quais
os sinais de 13C correctos. Os resultados de 13C-RMN ficaram também mais concordantes com
a estrutura pois havendo 3 carbonilos podem atribuir-se os 3 valores mais elevados de δ. De
NH
NH
NNH
O
O
O
XVII
Figura 26 – Estutura do produto mioritário de oxidação da 2−OH−NVP pelo sal de Fremy.
73
igual forma compreendem-se melhor os 3 picos fortes de carbonilo presentes no espectro de IV
da nicotinamida XVII, a 1662, 1685 e 1723 cm−1. O espectro de IV tinha nos feito pensar
inicialmente que haveria um equilíbrio entre uma forma catecólica e a respectiva quinona; no
entanto, as integrações unitárias dos Hs lábeis do espectro de 1H-RMN não eram compatíveis
com um equilíbrio daquele tipo.
Os MS obtidos levantaram bastantes dúvidas antes de identificação correcta da
estrutura. No entanto, entre o modo positivo e negativo, os resultados eram concordantes e a
sua repetição originou espectros idênticos. Após identificação do produto podem agora atribuir-
-se os picos base a m/z 287 e 285, respectivamente, ao MH+ e ao [M−H] −. Os restantes
fragmentos do modo positivo, têm m/z relativamente pequenos, mas são coincidentes com
outros encontrados e já apresentados, com excepção do m/z 121. Para este fragmento propõe-
-se que seja uma imina (ver Tabela 11) proveniente da perda de um carbono por parte da
2-ciclopropilamino-piridina, fragmento também observado a m/z 133.
Não foi possível obter uma amostra da nicotinamida XVII seca, apesar de evaporação
em linha de vácuo. Como já foi descrito para outros produtos caracterizados desta forma,
a amostra de cristais não parece homogénea, tendo comportamentos diferentes, consoante os
cristais se apresentam em aglomerados ou individualizados. Como também se verificou nos
outros casos, os aglomerados parecem sofrer transformações graduais, levando a uma fusão
com degradação, enquanto os cristais individualizados fundem a uma temperatura bastante
superior, que aqui se identificou como cerca de 230 °C.
3.2.3.2. mO e mU
Os resultados dos espectros de RMN para mO e mU –
produtos de oxidação pelo sal de Fremy e pelo Ag2O,
respectivamente – são muito próximos, as pequenas
diferenças observadas pensa-se serem devidas à
comparação de resultados obtidos em solventes diferentes,
mO em acetona e mU em DMSO. A ausência do H3 é uma
característica destes espectros; contudo à partida não se
esperava que todo o anel A estivesse em falta. O posterior
esclarecimento da estrutura como sendo a 3-carboxi-
-2-ciclopropilamino-piridina, através dos resultados de MS,
permite-nos agora compreender melhor os resultados de
RMN, em especial o 13C-RMN, no qual eram visíveis menos
carbonos que o esperado. Assim é também possível,
compreender melhor a presença dos protões lábeis, os quais,
no entanto, não foram completamente identificados. O H lábil identificado em DMSO a 11,58
ppm é provavelmente o do ácido carboxílico, que se esperaria bastante desblindado, mas não
é detectável em mO, provavelmente devido ao solvente. O H lábil do N do grupo ciclopropil,
OH
NNH
O
XVIII
Figura 27 – Estrutura do produto de oxidação extensa da 2−OH−NVP comum aos dois oxidantes, sal de Fremy e Ag2O, a 3-carboxi-2-ciclopropilamino- -piridina.
74
não se pôde atribuir inequivocamente, embora haja um sinal muito largo a cerca de 3,5 ppm no 1H-RMN do mO que poderá contê-lo (ver Tabela 9). Foi possível atribuir todos os carbonos
presentes no 13C-RMN e os valores encontrados são concordantes com os dos demais
produtos isolados.
Como já se referiu os resultados de MS foram muito importantes na caracterização
destes compostos e embora as fragmentações não sejam exactamente coincidentes,
mantém-se a identificação de ambos como idênticos. Em ambos os casos houve resultados
que apontam para uma presumível dimerização no espectrómetro de massa, como veremos
também para mV. Em mO, há mais dificuldade em atribuir o dímero com certeza, pois há
algumas interferências para m/z elevados. Contudo um dímero de [2M+MeOH] + parece
plausível uma vez que para o ião molecular também parece ser detectado M+ e não MH+.
Para mU o dímero associa-se a Na+ em vez de MeOH e não é visível o ião molecular.
Para ambos é importante o fragmento do ião molecular associado ao solvente e que também
difere de 1 unidade, sendo como tal [M+MeOH]+. Para mU foi também detectado o fragmento a
m/z 161 identificado anteriormente.
Devido à reduzida quantidade de amostras, só foi possível traçar o espectro de IV para
mU e o resultado não foi muito bom. Contudo, é aparente a presença de um grupo carbonilo,
a cerca de 1653 cm−1.
Não foi possível medir o ponto de fusão de nenhuma das amostras por falta de
quantidade.
3.2.3.3. mV
Como já se referiu para os produtos anteriores, após a
identificação do composto como a 3-carbamoil-2-
-ciclopropilamino-piridina, com base nos resultados dos MSs,
ficou mais fácil interpretar os resultados obtidos nos espectros
de RMN. No 1H-RMN, tal como para mO e mU é clara a
ausência do H3, mas as interferências na zona do Me não
permitiam admitir com segurança a sua inexistência. Admitindo
aquela estrutura fica até mais fácil atribuir os 3 Hs lábeis
encontrados, sendo o mais definido e mais desblindado
atribuído ao NH do ciclopropil e os outros dois ao NH2 da
amida, não equivalentes. Nos espectros de 13C-RMN não foi
possível observar os carbonos quaternários devido à diluição
da amostra.
Como já se referiu os resultados de MS foram cruciais na caracterização deste
composto. Como vimos também, estas estruturas parecem ter tendência a dimerizar, pelo que
se atribuiu o m/z 379 ao dímero associado a um Na+, embora haja uma diferença de 2
NH2
NNH
O
XIX
Figura 28 – Estrutura doutro produto de oxidação extensa da 2−OH−NVP isolado de reacções com Ag2O, a 3-carbamoil-2-ciclopropilamino--piridina.
75
unidades de massa. Para mV detecta-se também o MH+ e os fragmentos já identificados,
m/z 161 e 133.
Como para mU, a reduzida quantidade de composto disponível para traçar o espectro de
IV originou um espectro pouco definido, sendo, no entanto, possível atribuir um carbonilo,
a 1673 cm−1.
Não foi possível medir o ponto de fusão por falta de quantidade de amostra.
3.2.4. Mecanismos de oxidação
Ambos os oxidantes utilizados são referidos na literatura como doadores de 1e−, contudo
o sal de Fremy é mais usualmente referido como percursor de mecanismos radicalares62, 63, 64.
São aqui propostos dois mecanismos que tentam racionalizar as reacções que originam os
produtos de oxidação identificados. Ambos os mecanismos são apresentados com catálise
básica, contudo os resultados obtidos indicam que poderão ser independentes do pH. Para
ambos também seriam necessárias estudos mecanísticos aprofundados para os poder
confirmar.
O mecanismo apresentado na Figura 29, que ilustra a formação do produto XVII,
é específico para o sal de Fremy e é provável que seja iniciado por processos radicalares.
É ainda apresentada uma proposta distinta, na Figura 30, para o mecanismo conducente aos
outros produtos identificados, aplicável a ambos os oxidantes testados. A iniciação poderá ser
feita por mecanismos radicalares ou transferências sucessivas de 1 electrão, pelo sal de Fremy
ou Ag2O, dando origem à quinonimina XX. Através de catálise básica, a formação das
2-ciclopropilamino-piridinas XVIII e XIX poderá seguir os passos aqui apresentados.
Como se viu anteriormente, as 2-ciclopropilamino-piridinas XVIII e XIX foram ambas
isoladas e caracterizadas a partir dos produtos de oxidação com Ag2O, enquanto que a forma
de ácido carboxílico (XVIII) foi igualmente isolada como produto da oxidação com o sal de
Fremy. É possível que a polaridade elevada ou a tendência a polimerizar da quinona do anel A
(XXI) tenham levado a que esta espécie não tenha sido identificada e isolada. Nas reacções
com sal de Fremy era visível material fluorescente no PA das CCFs. Com Ag2O isso não
acontecia, mas houve suspeitas de que ficasse material adsorvido no óxido, pelo que aquela
espécie poderia não ser perceptível. Pelos resultados das reacções de oxidação com Ag2O
prevê-se que estes mecanismos se dêem mesmo em solventes orgânicos apróticos através
das doações sucessivas de 1 e−. Provavelmente a maior sensibilidade das oxidações com
Ag2O às escolha de solvente e à presença de água podem estar associadas à possibilidade de
catálise em meio aquoso e presença de ácidos ou bases. Por exemplo, a presença de vestígios
de HCl no CHCl3 poderia justificar a diferença de resultados entre o CHCl3 e o CH2Cl2. Porém
os efeitos observados não foram claros, não sendo possível compreender melhor aquelas
influências.
76
N
N
NN
O
OH
H
HN
N
NN
O
OHN
N
NN
O
OH
N
N
NN
O
O
N
OH
N O
NH
N
NN
O
O
N
O
NH
N
R
O
N
OO
OH
HNH
NH
OO
N
O
ROH
NH
NO
O O
ROHNH
NO
O
RO
OHO
H
H
NH
NO
O
RO
O
O
HNH
NHO
O
O
NH N
N O
HO− H2O
− (KSO3)2NH
N ONO
HO−
H2O
H2O
HO−
H2O
HO−
− CO2
HO−
XVII
Figura 29 – Hipótese de mecanismo de oxidação mediado pelo radical de Fremy, com catálise básica.
77
3.3. Oxidação enzimática da 2−OH−NVP
Foram realizados alguns testes preliminares com peroxidases, in vitro, para avaliar
melhor a probabilidade do metabolito em estudo, a 2−OH−NVP, gerar produtos oxidados do
tipo quinona que tenham potencial para interagir com as bases do DNA. Foram utilizadas as
enzimas peroxidase de rábano, HRP, e lactoperoxidase.
Detalhando um pouco mais os resultados, na primeira reacção com HRP, verificou-se a
formação aparente de um produto de rf relativamente elevado a cerca de 1 h de reacção a
30 °C. Contudo, posterior CCF realizada a 1h30m de reacção, revelou que embora a mancha
N
N
NN
O
O
H2O
N
NH
NN
O
O
O
H
NNN
O
O CONH2
HO-
H2O
H2O
HO-NNN
OH
O CONH2
OH
H2O
NH N
O
NH2
NOH
O
O
+
XX
XXI XIX
NH N
O
OH
XVIII
HO-
H2O
Figura 30 – Hipótese de mecanismo de oxidação que dá origem aos produtos de maior degradação oxidativa, para ambos os oxidantes testados.
78
até tivesse rf idêntico à nicotinamida obtida como produto da oxidação pelo sal de Fremy,
aquela estava também presente no branco, realizado na ausência de 2−OH−NVP. A 1h30m
parece haver outra mancha ténue de rf ainda superior à referida, no entanto às 3h de reacção a
mesma já não foi detectada. Realizando a reacção com fenol a 37 °C para controlo verifica-se
a HRP oxida o fenol, embora ao fim de 1h30 ainda existisse MP. Isto indica que a enzima
apesar de armazenada manteve a actividade. A repetição da reacção da 2−OH−NVP com HRP
a 37 °C não levou a nenhuma observação adicional relevante.
Por seu lado, a lactoperoxidase, não pareceu sequer reagir com o fenol, pelo que se
pensa que estivesse degradada ou desactivada.
Como conclusão seria útil realizar mais algumas experiências de oxidações enzimáticas
com enzimas adquiridas recentemente, para garantir que estão activas. Contudo, tal não foi
possível antes da escrita desta tese.
79
3.4. Conclusões
Ao longo deste trabalho, fizeram-se algumas observações sobre o método de síntese da
2−OH−NVP que poderão vir a permitir algumas melhorias no processo. Espera-se poder vir a
melhorar a conversão, se for possível converter todo o MP no produto di-acetoxilado. Contudo,
não se prevê a possibilidade de purificação do produto final através da técnica cromatográfica
utilizada. Mesmo que se obtenha maioritariamente a di−OAc−NVP, continuarão a ser possíveis
perdas por hidrólise durante a cromatografia.
A componente essencial do trabalho aqui apresentado, consistiu na oxidação química da
2−OH−NVP. Como já se referiu, resultados preliminares obtidos no grupo indicaram não haver
reacção directa deste metabolito com as bases do DNA. O objectivo de realizar as oxidações
químicas aqui descritas consistia em avaliar se metabolitos secundários como catecóis ou
quinonas são plausíveis in vivo, pois prevê-se que este tipo de metabolitos sejam por sua vez
muito mais reactivos para com o DNA.
Pensa-se que as oxidações químicas realizadas se dão de forma muito próxima com os
dois oxidantes escolhidos – sal de Fremy e Ag2O – por transferências sucessivas de electrões
ou no caso do sal de Fremy, mais provavelmente por um mecanismo radicalar. Os produtos
identificados indicam que a oxidação da 2−OH−NVP origina produtos muito mais degradados
que o esperado e sem interesse para o objectivo deste trabalho. A obtenção de estruturas
abertas do tipo nicotinamida são prova disso. Não é plausível que estas estruturas sejam
originadas in vivo. Porém, mesmo que através de oxidações enzimáticas e posterior
degradação estas se formem, não se prevê que tenham actividade biológica.
A forma de ácido carboxílico da 2-ciclopropilamino-piridina (ou ácido 2-ciclopropilamino-
-nicotínico) foi isolada tanto a partir das misturas resultantes de reacções tanto com o Ag2O
como com o sal de Fremy. Contudo, o sal de Fremy revelou ser um oxidante mais específico,
pois para todas as condições testadas foi obtido um produto maioritário, que se identificou
preliminarmente como o catecol, 2,3−di−OH−NVP, mas posteriormente se confirmou por
difracção de raios-X ser a nicotininamida XVII. A sua formação é mecanisticamente
interessante por envolver a quebra duma das ligações ao anel central da NVP e a contracção
do anel A a um anel de 5 membros. Apesar de não terem sido identificadas espécies quinóides
mantendo a estrutura da NVP, não está posta de parte a sua ocorrência in vivo. No seguimento
deste trabalho, teria interesse realizar estudos de voltametria cíclica para avaliar a reactividade
redox da 2−OH−NVP e testar a sua reactividade com as bases do DNA em condições de
oxidação electroquímica.
Estudos preliminares com peroxidases não foram conclusivos e carecem de avaliação
posterior. Em conclusão, serão necessário estudos adicionais in vitro e in vivo para esclarecer
a possível genotoxicidade da 2−OH−NVP.
80
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84
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85
Anexo I – Espectros de IV
16520
20
40
60
80
100
5001000150020002500300035004000
νννν /cm−−−−1
Inte
nsi
dad
e/%
Figura 31 – Espectro de IV da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP.
1769
16921645
40
55
70
85
100
5001000150020002500300035004000νννν /cm−−−−1
Inte
nsi
dad
e/%
Figura 32 – Espectro de IV da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.
86
1777
1658
40
55
70
85
100
5001000150020002500300035004000νννν /cm−−−−1
Inte
nsi
dad
e/%
Figura 33 – Espectro de IV da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.
16590
20
40
60
80
100
5001000150020002500300035004000
νννν /cm−−−−1
Inte
nsi
dad
e/%
Figura 34 – Espectro de IV da 2−OH−NVP.
87
1635
1706
10
25
40
55
70
85
100
5001000150020002500300035004000
νννν /cm−−−−1
Inte
nsi
dad
e/%
Figura 35 – Espectro de IV da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP.
1662
1685
1722
0
20
40
60
80
100
5001000150020002500300035004000
νννν /cm−−−−1
Inte
nsi
dad
e/%
Figura 36 – Espectro de IV do produto de oxidação do sal de Fremy, mAC (=mE=mP), identificado como a nicotininamida XVII.
88
1654
40
60
80
100
5001000150020002500300035004000
νννν /cm−−−−1
Inte
nsi
dad
e/%
Figura 37 – Espectro de IV do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi- -2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy).
1672
70
80
90
100
5001000150020002500300035004000νννν /cm−−−−1
Inte
nsi
dad
e/%
Figura 38 – Espectro de IV do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil- -2-ciclopropilamino-piridina.
89
Anexo II – Espectros de MS
321
267
100 150 200 250 300 350 400m/z
Figura 39 – Espectro de MS-ESI positivo da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP.
313
336
355
377
100 150 200 250 300 350 400m/z
Figura 40 – Espectro de MS-ESI positivo da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.
90
369
311
100 150 200 250 300 350 400m/z
Figura 41 – Espectro de MS-ESI negativo da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.
243
283
325
347
357
379
100 150 200 250 300 350 400m/z
Figura 42 – Espectro de MS-ESI positivo da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.
91
280
323
100 150 200 250 300 350 400m/z
Figura 43 – Espectro de MS-ESI negativo da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.
283
100 150 200 250 300 350 400m/z
Figura 44 – Espectro de MS-ESI positivo da 2−OH−NVP.
92
281
100 150 200 250 300 350 400m/z
Figura 45 – Espectro de MS-ESI negativo da 2−OH−NVP.
353
133161
299
321 331
100 150 200 250 300 350 400m/z
Figura 46 – Espectro de MS-ESI positivo da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP.
93
329
297
100 150 200 250 300 350 400m/z
Figura 47 – Espectro de MS-ESI negativo da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP.
121
133
161
287
100 150 200 250 300 350 400m/z
Figura 48 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII.
94
285
100 150 200 250 300 350 400m/z
Figura 49 – Espectro de MS-ESI negativo do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII.
386
178
210
100 150 200 250 300 350 400m/z
Figura 50 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de do sal de Fremy, mO, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mU do Ag2O).
95
379
161
210
100 150 200 250 300 350 400m/z
Figura 51 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy).
133
161
379
178
100 150 200 250 300 350 400m/z
Figura 52 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina.
96
Anexo III – Espectros de RMN
8,
79
7,05
8,49 8,
08
8,06
7,15
3,74
2,43
2,05
0,87
0,38
0246810 ppm
Figura 53 – Espectro de 1H-RMN (em acetona) da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP.
167,
8
161,
3
155,
315
2,3
144,
714
0,8
121,9
123,
0
119,9
9,4
9,1
17,7
020406080100120140160180 ppm
Figura 54 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP.
97
8,69
8,18
7,26 7,
01
1,79
2,48
2,81
2,07
2,50
0,30
0,58
0,88
1,02
0246810 ppm
Figura 55 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.
177,
9
171,
916
8,8
162,
315
3,6
151,
715
3,1
144,
0 138,
8
132,
1
117,
9
115,0
93,0
29,3
28,0
20,2 16
,0
10,4
10,0
020406080100120140160180 ppm
Figura 56 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.
98
8,80
8,49
8,07 7,18
6,84
3,63
2,46
2,26
2,05
0,87
0,40
0246810 ppm
Figura 57 – Espectro de 1H-RMN (em acetona) da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.
18,1
21,0
9,3
9,1
114,
6
120,
2
141,
0
152,
3
169,
4
020406080100120140160180 ppm
Figura 58 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.
99
10,5
6
9,60
8,47
7,97
7,17 6,
30
3,60
2,23
2,50
0,35
0,85
024681012 ppm
Figura 59 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) da 2−OH−NVP.
~115 ~1
07
167,
0
160,
415
9,4
150,
9
144,
613
9,9
124,
912
1,2
119,
3
8,6
8,5
17,8
28,9
020406080100120140160180 ppm
Figura 60 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) da 2−OH−NVP.
100
9,49
7,97
8,25
8,16
6,64 6,
26
2,74
2,50
1,87
0,380,69
0246810 ppm
Figura 61 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP.
152,
6
152,2106,4
158,
4
163,
916
7,5
168,8
137,
7
122,
9
111,
310
7,6
23,8 16
,0
6,9
6,8
020406080100120140160180 ppm
Figura 62 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP.
101
9,11
9,69
8,33
8,13
8,17
6,68
2,93
2,00
0,500,
772,05
0246810 ppm
Figura 63 – Espectro de 1H-RMN (em acetona) do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII.
159,
816
7,3
169,
617
3,2
153,
7
138,
813
5,0
124,
412
6,0
112,
310
9,6
24,4
10,2
7,5
020406080100120140160180 ppm
Figura 64 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII.
102
3,58,64
8,22
7,22
2,76
2,50
0,74
1,07
0246810 ppm
Figura 65 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) do produto de do sal de Fremy, mO, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mU do Ag2O).
167,
1 153,
8
136,
7
119,
1
112,
0
25,3
9,8
020406080100120140160180 ppm
Figura 66 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) do produto de do sal de Fremy, mO, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mU do Ag2O).
103
11
,58
8,73
8,29
7,31
2,08
2,50
1,10
0,78
024681012 ppm
Figura 67 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy).
151,
6
162,
4 154,
5
137,
2
119,
8
112,
1 25,8
10,0
020406080100120140160180 ppm
Figura 68 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy).
104
0,71
0,39
2,50
2,78
6,60
7,37
7,93
8,20
8,60
7,99
0246810 ppm
Figura 69 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina.
152,
7
137,
2
111,
7
24,4
7,4
020406080100120140160180 ppm
Figura 70 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina.