ESTUDOS DE ACTIVIDADE INIBIDORA DE …repositorio.ul.pt/bitstream/10451/3530/1/ulfc055722_tm_Susana... · Estudos de Actividade Inibidora de Acetilcolinesterase e Actividade Antioxidante

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA

ESTUDOS DE ACTIVIDADE INIBIDORA DE ACETILCOLINESTERASE E

ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE POR DERIVADOS DE COLINA DE

ÁCIDOS CAFEICO, CINÂMICO E ROSMARÍNICO.

METABOLISMO IN VITRO DESTES COMPOSTOS.

Susana Isabel Pólvora Santos

Mestrado Em Bioquímica (Área De Especialização: Bioquímica Médica)

2009

Estudos de Actividade Inibidora de Acetilcolinesterase e Actividade Antioxidante por derivados de Colina de Ácidos

Cafeico, Cinâmico e Rosmarínico. Metabolismo in vitro destes compostos.

ii

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA

ESTUDOS DE ACTIVIDADE INIBIDORA DE ACETILCOLINESTERASE E

ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE POR DERIVADOS DE COLINA DE

ÁCIDOS CAFEICO, CINÂMICO E ROSMARÍNICO.

METABOLISMO IN VITRO DESTES COMPOSTOS.

Susana Isabel Pólvora Santos

Mestrado Em Bioquímica (Área De Especialização: Bioquímica Médica)

Dissertação orientada pela Prof. Doutora Maria Luísa Serralheiro

2009

Estudos de Actividade Inibidora de Acetilcolinesterase e Actividade Antioxidante por derivados de Colina de Ácidos

Cafeico, Cinâmico e Rosmarínico. Metabolismo in vitro destes compostos.

iii

Agradecimentos

Agradeço à Professora Doutora Luísa Serralheiro pela orientação, compreensão e apoio em

todos os momentos.

À Professora Doutora Amélia Seabra e Sérgio, do Centro de Química Estrutural do Instituto

Superior Técnico, pela ajuda na técnica de NMR e na ajuda da síntese do composto. À Doutora

Catarina Madeira do Instituto Superior Técnico pelo apoio na formulação da elaboração dos

lipossomas.

Aos membros do Centro de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Universidade de

Lisboa, pela amizade, colaboração e apoio. Em especial ao Doutor Rodrigo Almeida e seus

estagiários, Joaquim e André, pela ajuda imprescindível na elaboração dos lipossomas e ao

Professor Doutorado Manuel Matos Lopes pela ajuda na determinação dos tamanhos destes.

Ao Mestre Pedro Falé por toda a ajuda, como na técnica de HPLC, no manuseamento das

células Caco-2 e entre outros, mas acima de tudo pela compreensão e disponibilidade, sem os

quais seria difícil a concretização deste projecto.

À Inês, Rita e Sara, as melhores colegas de laboratório, sempre prestáveis e divertidas,

tornando o trabalho laboratorial alegre e motivante, mesmo nos momentos difíceis.

À minha família, ao Daniel e aos meus amigos por todo o apoio, motivação, confiança e

principalmente por acreditarem em mim.

A todos os que, de vários modos, me ajudaram no decorrer deste trabalho, os meus sinceros

agradecimentos.

Resumo

iv

Resumo

A doença de Alzheimer (AD) é considerada a forma mais comum de demência na população

idosa. O cérebro de um doente de AD é caracterizado por uma deficiência na

neurotransmissão colinérgica central, principalmente pela diminuição de acetilcolina. Um dos

tratamentos para esta doença é a utilização de inibidores de acetilcolinesterase, enzima

responsável pela degradação da acetilcolina. Por outro lado, a inflamação e o stress oxidativo

são algumas das causas desta doença, pelo que pensa-se que a acção de antioxidantes poderá

contribuir também para o seu tratamento.

Neste trabalho estudou-se a actividade inibidora de acetilcolinesterase e a actividade

antioxidante de compostos fenólicos, devido às suas propriedades antioxidantes, e respectivos

ésteres de colina sintetizados, com o intuito de encontrar compostos mais eficazes.

De todos os compostos fenólicos estudados (ácidos cafeico, cinâmico, rosmarínico, 3,4-

dimetoxicinâmico e trolox), o ácido rosmarínico apresentou maior actividade antioxidante,

EC50 = 6,38 µM, e melhor capacidade de inibir o enzima, IC50 = 1,2 mM. Contudo, observou-se

que a introdução do grupo colina, aumentou o poder de inibição do enzima, obtendo-se IC50

mais baixos. Assim, de todos os compostos estudados, o 3,4-dimetoxicinamato de colina exibiu

melhor capacidade de inibir o enzima, IC50 = 7,3 µM.

O estudo do metabolismo pelo tracto digestivo evidenciou que, à excepção do trolox, nenhum

composto é degradado no suco gástrico. No suco pancreático, ao contrário dos ácidos, os

ésteres de colina são degradados, sendo o 3,4-dimetoxicinamato de colina o que apresenta

uma biodisponibilidade maior. Dadas as propriedades apresentadas do 3,4-dimetoxicinamato

de colina, estudou-se o metabolismo deste em células Caco-2, juntamente com o

correspondente ácido. Por fim, foram realizados estudos preliminares para permeação do 3,4-

dimetoxicinamato de colina pela barreira intestinal, usando lipossomas para encapsular o

ácido cafeico como modelo inicial.

Palavras-chave: Doença de Alzheimer, inibidores da AChE, actividade antioxidante, compostos

fenólicos, biodisponibilidade.

Abstract

v

Abstract

Alzheimer’s disease is the most common form of dementia in the elderly. The brain of a

patient with AD is characterized by a deficiency in cholinergic neurotransmission, caused by

the decrease of acetylcholine. One of the treatments for this disease consists of using

acetylcholinesterase inhibitors, an enzyme responsible for the degradation of acetylcholine.

Furthermore, it is known that, due to inflammation and oxidative stress, the action of

antioxidants may help in treating the disease.

In order to find more effective compounds, this work focused on the activity of

acetylcholinesterase inhibitory and antioxidant activity of phenolic compounds (mostly due to

its antioxidant properties), as well as synthesized esters of choline.

Of all the studied phenolic compounds (caffeic, cinnamic, rosmarinic, 3.4-dimethoxycinnamic

acid and Trolox), the rosmarinic acid showed higher antioxidant activity, EC50 = 6,38 μM, and a

better ability to inhibit the enzyme, IC50 = 1,2 mM. However, it was observed that the

introduction of the choline moiety increased the power of the enzyme’s inhibition, resulting in

a reduction of IC50. Thus, from all the compounds studied, it was the 3,4-

dimethoxycinnamoylcholine which exhibited a better ability to inhibit the enzyme, IC50 = 7,3

μM.

A metabolism study using the digestive tract has shown that, except for Trolox, no other

compound is degraded in the gastric juice. In the pancreatic juice, and contrary to what

happens to acids, choline esters are degraded, which also makes 3,4-

dimethoxycinnamoylcholine the most bioavailable of these. Duo to the properties found in

3,4-dimethoxycinnamoylcholine, it was further studied the metabolism of cells Caco-2,

together with its corresponding acid. Finally, preliminary studies have been performed for the

permeation of 3,4-dimethoxycinnamoylcholine through the intestinal barrier, using liposomes

to encapsulate the caffeic acid as initial model.

Keywords: Alzheimer’s disease, inhibitors of AChE, antioxidant activity, phenolics compounds,

bioavailability.

Índice

vi

Índice

Agradecimentos ........................................................................................................................... iii

Resumo ..........................................................................................................................................iv

Abstract ......................................................................................................................................... v

Índice .............................................................................................................................................vi

Lista de Abreviaturas e Siglas ...................................................................................................... viii

Capítulo I – Introdução e Objectivos ............................................................................................. 1

1. Doença de Alzheimer ........................................................................................................ 2

1.1. Sintomas e Factores de Risco .................................................................................... 2

1.2. Fisiopatologia ............................................................................................................ 3

1.2.1. Proteína β-amilóide e Proteína tau ................................................................... 3

1.3. Inflamação, Stress Oxidativo e Antioxidantes ........................................................... 6

1.4. Neuroquímica ............................................................................................................ 7

1.4.1. Acetilcolina ........................................................................................................ 7

1.4.2. Acetilcolinesterase ............................................................................................ 9

1.5. Tratamento .............................................................................................................. 12

1.5.1. Antioxidantes .................................................................................................. 13

1.5.2. Inibidores da Acetilcolinesterase .................................................................... 13

2. Polifenóis ......................................................................................................................... 15

3. Objectivos ........................................................................................................................ 17

Capítulo II – Materiais e Métodos ............................................................................................... 18

1. Materiais ......................................................................................................................... 19

1.1. Reagentes Químicos ................................................................................................ 19

1.2. Linhas Celulares ....................................................................................................... 20

1.3. Equipamentos ......................................................................................................... 20

2. Métodos .......................................................................................................................... 20

2.1. Determinação da Actividade Antioxidante (método do DPPH) .............................. 20

Índice

vii

2.2. Inibição da Actividade da Acetilcolinesterase ......................................................... 21

2.3. HPLC Analítico ......................................................................................................... 23

2.4. Digestão pelos Sucos Digestivos in vitro ................................................................. 23

2.4.1. Digestão pelo Suco Gástrico Artificial ............................................................. 23

2.4.2. Digestão pelo Suco Pancreático Artificial ........................................................ 24

2.5. Ensaios em células Caco-2 ....................................................................................... 24

2.5.1. Ensaio de Citotoxicidade em Células Caco-2 ................................................... 24

2.5.2. Ensaio de Metabolismo pelas Células Caco-2 ................................................. 25

2.6. Encapsulamento do Ácido Cafeico em Lipossomas ................................................ 26

2.7. Dispersão Dinâmica de Luz ...................................................................................... 26

2.8. Análise Estatística .................................................................................................... 27

Capítulo III – Resultados e Discussão de Resultados ................................................................... 28

1. Propriedades Antioxidantes ............................................................................................ 30

2. Inibição da Actividade de Acetilcolinesterase ................................................................. 33

3. Digestão pelos Sucos Digestivos in vitro ......................................................................... 36

4. Síntese do 3,4-Dimetoxicinamato de Colina ................................................................... 41

5. Metabolismo pelas células Caco-2 .................................................................................. 45

6. Encapsulamento do Ácido Cafeico em Lipossomas ........................................................ 49

Capítulo IV – Conclusão ............................................................................................................... 53

Bibliografia .................................................................................................................................. 56

Anexos ......................................................................................................................................... 62

1. Determinação dos EC50 .................................................................................................. 63

2. Determinação dos IC50 ................................................................................................... 64

3. Cromatograma do Trolox após digestão gástrica ........................................................... 65

4. Espectros UV detectados por HPLC ................................................................................. 66

5. Espectro de 1H-NMR do Ácido 3,4-Dimetoxicinâmico .................................................... 69

6. Ensaio de biodisponibilidade pelas células Caco-2 ......................................................... 70

Lista de Abreviaturas e Siglas

viii


Aβ

ABS

ACh

AChE

AChI

AD

AGEs

Ala

APOE

APP

AS

ChAT

CoA

DEMEM

DMSO

DPPH

DTNB

EC50

EPP

ES

FDA

Gly

Glu

His

HPLC

β-amilóide

Local de Ligação ao Acilo (do inglês Acyl Binding Site)

Acetilcolina

Acetilcolinesterase

Acetilcolina Iodada

Doença de Alzheimer (do inglês Alzheimer Disease)

Produtos Finais de Glicação Avançada (do inglês Advanced Glycation Endproducts)

Resíduo de Alanina

Apolipoproteína E

Proteína Precursora Amilóide

Local Aniónico de Ligação ao Substrato (do inglês Anionic Substrate Binding Site)

Colina Acetiltransferase (do inglês Choline Acetyltransferase)

Coenzima A

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

Dimetilsulfóxido

2,2-Di (4-tert-octylphenyl) -1-picrylhydrazyl

5,5’-dithiobis [2-nitrobenzoic acid]

Concentração a que corresponde 50% de extinção

Placa Motora Terminal (do inglês End-Plate Potential)

Local Catalítico (do inglês Ecstatic Site)

Food and Drug Administration

Resíduo de Glicina

Resíduo de Glutamina

Resíduo de Histidina

High Precision Liquid Chromatography


ix

IAChE

IC50

J

LUV

MCT

MLV

MTT

NMR

OH

Phe

PSEN1

PSEN2

RNS

ROS

RT

PAS

PBS

Ser

SNC

SNP

SUV

TcAChE

THF

Trp

Trolox

Tyr

UV-Vis

Inibidores de Acetilcolinesterase

Concentração a que corresponde 50% de inibição

Constante de Acoplamento

Large Unilamellar Vesicles

MonoCarboxylic acid Transporter

MultiLamellar Vesicles

Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide

Nuclear Magnetic Resonance

Cavidade Oxianiónica (do inglês Oxyanion Hole)

Resíduo de Fenilalanina

Presenilina-1

Presenilina-2

Espécies Reactivas de Azoto (do inglês Reactive Nitrogen Species)

Espécies Reactivas de Oxigénio (do inglês Reactive Oxygen Species)

Tempo de Retenção (do inglês Retention Time)

Local Aniónico Periférico (do inglês Peripheral Anionic Site)

Phosphates Buffer Solution

Resíduo de Serina

Sistema Nervoso Central

Sistema Nervoso Periférico

Small Unilamellar Vesicles

Acetilcolinesterase de Torpedo californica

Tetrahidrofurano

Resíduo de Triptofano

6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl chroman-2-carboxylic acid

Resíduo de Tirosina

Ultravioleta-Visível

Susana Isabel Pólvora Santos – DQB – FCUL 1

Capítulo I – Introdução e Objectivos

Introdução


1. Doença de Alzheimer

A idade da população mundial está claramente a aumentar e, consequentemente, há um

aumento na probabilidade de declínio da saúde mental ou de demência. A forma mais comum

de demência é a doença de Alzheimer (AD) e a sua incidência aumenta com a idade (Scarpini et

al., 2003; Racchi et al., 2003; Blennow et al., 2006; Sugimoto et al., 2008; García-Ayllón et al.,

2008).

1.1. Sintomas e Factores de Risco

Um sinal inicial da doença é a perda da memória. À medida que a memória recente se

deteriora, o doente pode recordar eventos de há muito tempo, sendo incapaz de recordar

coisas que sucederam nesse mesmo dia, ou mesmo horas antes. Com a progressão da doença,

a perda de memória agrava-se e a própria linguagem, compreensão e reconhecimento do

indivíduo degeneram-se. Também são característicos os distúrbios comportamentais, que

interferem com o humor, a razão e o julgamento (LaFerla & Oddo, 2005; Scarpini et al., 2003;

Citron, 2004). Os doentes tornam-se confusos e, por vezes, agressivos, passando a apresentar

alterações de personalidade. Nas fases tardias da doença, existem anormalidades motoras e

sensoriais, iniciando-se as dificuldades de locomoção e comunicação. Com o evoluir da doença,

começam os distúrbios funcionais em que há alterações nas actividades básicas do quotidiano,

como alimentação, higiene pessoal e vestuário, pelo que se vão tornando totalmente

dependentes de terceiros (Cummings, 2004; Citron, 2004). A psicose e agitação são

características das fases de evolução e final da doença (Mega et al., 1996).

De um ponto de vista etiológico, AD pode ser definida como uma doença multifactorial. A

maioria dos casos de AD são esporádicos, com uma ocorrência tardia na vida, mas a

manifestação precoce da doença tem sido associada a factores genéticos (Frank & Gupta,

2005; Rossi et al., 2008; Singh et al., 2008). Actualmente, quatro genes foram ligados à AD:

proteína precursora da β-amilóide (APP) e proteínas envolvidas no processamento de APP,

como presenilina-1 (PSEN1) e presenilina-2 (PSEN2), sendo que estas últimas compõem o

núcleo catalisador da γ-secretase (Hardy et al., 1997; Frank & Gupta, 2005). Além disso, a

forma tardia da AD, que representa a grande maioria de todos os casos, tem um factor de risco

genético comum, o alelo ε4 do gene da apolipoproteína E (APOE) (Singh et al., 2008).

Introdução


Por outro lado, os factores ambientais e comportamentais também parecem contribuir para a

ocorrência de AD. Alguns estudos sugerem que a falta de interacções sociais e “educação”,

bem como um estilo de vida sedentário podem aumentar o risco de AD (Fratiglioni et al.,

2004). Muitas evidências sugerem que factores do estilo de vida, e especialmente a dieta,

podem neutralizar danos oxidativos que contribuem para o aparecimento de muitas doenças,

incluindo as cardiovasculares, o cancro ou doenças neurodegenerativas. Actualmente, muitas

plantas e frutos são considerados “alimentos funcionais”, porque, quando consumido

regularmente, eles protegem o aparecimento ou atrasam a progressão de uma doença. É

possível que o aparecimento de doenças cerebrais durante o envelhecimento seja

parcialmente devido à falta de factores de protecção, especialmente nos mais fracos – os

idosos –, à alimentação inadequada e a deficiências alimentares (Rossi et al., 2008).

1.2. Fisiopatologia

A AD é caracterizada por dois tipos de agregados proteicos: depósitos extracelulares esféricos,

compactos (placas amilóides), compostos por uma pequena proteína designada péptido β-

amilóide (Aβ) e por depósitos intracelulares (novelos neurofibrilhares) constituídos,

principalmente, pela proteína tau associada a microtúbulos (La Ferla & Oddo, 2005).

Mutações nos genes da APP, PSEN1 e PSEN2 aumentam a produção de Aβ que está presente

nas placas, enquanto o alelo ε4 da apoliproteína E não só aumenta a produção de Aβ, mas

inibe a sua eliminação, aumentando a sua deposição nas placas amilóides. Contudo, estes

genes não são a causa desta doença, uma vez que estão ligados a apenas 10% do total de AD

(Frank & Gupta, 2005).

1.2.1. Proteína β-amilóide e Proteína tau

APP é uma proteína transmembranar tipo I com vários domínios, em particular o domínio Aβ

que se encontra parcialmente incorporado na membrana plasmática e inclui apenas 28

resíduos fora da membrana e os primeiros 12/14 resíduos no domínio transmembranar

(Blennow et al., 2006). APP pode ser processada por duas vias principais (figura 1). Na via α-

secretase (também designada via não-amiloidogénica), α-secretase cliva APP no domínio Aβ,

prevenindo desse modo a formação de Aβ, resultando na libertação de uma porção

Susana Isabel Pólvora Santos – DQB

extracelular grande e solúvel de APP (

resíduos (C83). C83, por sua vez, pode sofrer uma transformação posterior po

com libertação do péptido p3, que é considerado não amiloidogénico, embora se deposite nas

placas difusas. Na via β-secretase (também designada via amiloidogénica),

APP imediatamente antes do domínio A

um fragmento C-terminal amiloidogénico (C99). C99, por sua vez, pode sofrer uma

transformação posterior por

Este fragmento sofre uma mudança conformacional para

poderá resultar na agregação em oligómeros solúveis e grandes fibrilhas insolúveis. Neste

processo, a isoforma amiloidogénica A

péptidos Aβ (Blennow et al., 2006).

Figura 1 A proteína precursora da

uma série de clivagens proteolíticas por secretases. Quando é clivada por

domínio β-amilóide (Aβ), não é amiloidogénica. No entanto, quando APP é

são libertados péptidos Aβ, que se podem acumular em agregados oligom

(adaptado de Patterson et al., 2008)

Recentemente descobriu-se que o péptido A

metabolismo normal das células, no entanto, em condições normais, o péptido A

degradado por alguns enzimas, pelo que é extinta do cérebro. A hipótese central para a causa

da doença de Alzheimer é a hipótese da cascata amilóide (figura 2), que afirma que um

desequilíbrio entre a produção e a eliminação do péptido A

iniciação, levando à degeneração neuronal e demência (Blennow

esta hipótese inclui, por exemplo, doentes com trissomia 21 (Síndrome de Down) e três cópi

DQB – FCUL

extracelular grande e solúvel de APP (α-sAPP) e um fragmento C-terminal constituído por 83

resíduos (C83). C83, por sua vez, pode sofrer uma transformação posterior po


secretase (também designada via amiloidogénica),

APP imediatamente antes do domínio Aβ, libertando um fragmento solúvel de APP (

terminal amiloidogénico (C99). C99, por sua vez, pode sofrer uma

transformação posterior por γ-secretase com libertação do péptido Aβ (LaFerla e Oddo, 2005).

Este fragmento sofre uma mudança conformacional para uma estrutura rica em folhas β, que


processo, a isoforma amiloidogénica Aβ42 desencadeia o misfolding de outras formas de

, 2006).

A proteína precursora da β-amilóide (APP) é uma proteína transmembranar que pode sofrer

uma série de clivagens proteolíticas por secretases. Quando é clivada por α-secretase no meio do

ão é amiloidogénica. No entanto, quando APP é clivada por β

β, que se podem acumular em agregados oligoméricos.

, 2008)

se que o péptido Aβ é produzido constitutivamente durante o

mal das células, no entanto, em condições normais, o péptido A



io entre a produção e a eliminação do péptido Aβ no cérebro é o evento de

iniciação, levando à degeneração neuronal e demência (Blennow et al., 2006). O suporte para

esta hipótese inclui, por exemplo, doentes com trissomia 21 (Síndrome de Down) e três cópi

Introdução

4

terminal constituído por 83

resíduos (C83). C83, por sua vez, pode sofrer uma transformação posterior por γ-secretase


secretase (também designada via amiloidogénica), β-secretase cliva

nto solúvel de APP (β-sAPP) e

terminal amiloidogénico (C99). C99, por sua vez, pode sofrer uma

β (LaFerla e Oddo, 2005).

uma estrutura rica em folhas β, que


de outras formas de

amilóide (APP) é uma proteína transmembranar que pode sofrer

secretase no meio do

clivada por β- e γ-secretases,

éricos. ↑ = Aumento

é produzido constitutivamente durante o

mal das células, no entanto, em condições normais, o péptido Aβ é



érebro é o evento de

, 2006). O suporte para

esta hipótese inclui, por exemplo, doentes com trissomia 21 (Síndrome de Down) e três cópias


do gene APP, desenvolvem características neuropatológicas da doença de Alzheimer nos

primeiros anos de vida; Aβ é neurotóxico

com sobre-expressão de APP humana têm evidências de deficiência de apren

memória, em combinação com a acumulação de A

semelhantes aos observados em humanos com AD (Butterfield

1999; Cummings, 2004). No entanto, esta hipótese ainda não foi confirmada po

evidências de que a perda de sinapses também ocorre em regiões onde não existem placas

amilóides.

Os eventos descritos conduzem não só à

alterações na actividade cinase/fosfatase. Estas alterações são

aparecimento de novelos neurofibrilhares que são constituídos por proteína tau

hiperfosforilada. Num estado normal, tau é uma proteína solúvel que promove a junção e

estabilização dos microtúbulos. A proteína tau patológica, pelo contr

de solubilidade alteradas, estrutura com forma filamentosa e está anormalmente fosforilada

em certos resíduos (LaFerla & Oddo, 2005). A hiperfosforilação da tau na AD começa

intracelularmente, levando à captação da tau normal e out

microtúbulos, o que provoca disjunção dos microtúbulos axonais e assim prejudica o

transporte axonal, comprometendo a função neuronal e sináptica (Iqbal

outro lado, a tau também torna

comprometendo ainda mais a função neuronal (Braak

DQB – FCUL


é neurotóxico in vitro e leva à morte celular; ratinhos transgénicos

expressão de APP humana têm evidências de deficiência de apren

memória, em combinação com a acumulação de Aβ, resultando em placas neur

semelhantes aos observados em humanos com AD (Butterfield et al., 2002; Mesulam

1999; Cummings, 2004). No entanto, esta hipótese ainda não foi confirmada po


conduzem não só à disfunção neuronal como também provocam

alterações na actividade cinase/fosfatase. Estas alterações são relevantes uma vez que leva ao



estabilização dos microtúbulos. A proteína tau patológica, pelo contrário, exibe propriedades



intracelularmente, levando à captação da tau normal e outras proteínas associadas a


transporte axonal, comprometendo a função neuronal e sináptica (Iqbal et al.

outro lado, a tau também torna-se vulnerável a agregar em fibras insolúveis em novelos,

comprometendo ainda mais a função neuronal (Braak et al., 1999).

Figura 2 Hipótese da cascata amilóide. A

cascata é iniciada através da geração de

péptidos Aβ. Oligómeros podem agredir

directamente as sinapses e neurites dos

neurónios do cérebro, além de activarem

microglia e astrócitos, conduzindo à morte

neuronal. O péptido Aβ desencadeia ainda

a hiperfosforilação da tau, originando

novelos neurofibrilhares, o que contribui

substancialmente para a doença. (adaptado

de www.gladstone.ucsf.edu)

Introdução

5


e leva à morte celular; ratinhos transgénicos

expressão de APP humana têm evidências de deficiência de aprendizagem e de

β, resultando em placas neuríticas

, 2002; Mesulam et al.,

1999; Cummings, 2004). No entanto, esta hipótese ainda não foi confirmada porque há


disfunção neuronal como também provocam

uma vez que leva ao



ário, exibe propriedades



ras proteínas associadas a


et al., 2005). Por

fibras insolúveis em novelos,

Hipótese da cascata amilóide. A

cascata é iniciada através da geração de

ómeros podem agredir

directamente as sinapses e neurites dos

neurónios do cérebro, além de activarem

microglia e astrócitos, conduzindo à morte

β desencadeia ainda

a hiperfosforilação da tau, originando

novelos neurofibrilhares, o que contribui

mente para a doença. (adaptado

de www.gladstone.ucsf.edu)

Introdução


Estima-se que a neurodegeneração na AD começa 20-30 anos antes dos sintomas clínicos.

Durante essa pré-fase, há um aumento das placas e dos novelos até um certo limite e os

primeiros sintomas aparecem (Blennow et al., 2006).

1.3. Inflamação, Stress Oxidativo e Antioxidantes

Ao longo dos anos têm surgido evidências que as placas amilóides podem desempenhar um

papel central na cascata inflamatória, uma vez que Aβ não só é capaz de activar microglia e

astrócitos (células glias residentes do sistema nervoso central) como também é um alvo de

alteração por produtos finais de glicação avançada (AGEs), que são capazes de amplificar as

vias inflamatórias (Stuchbury & Münch, 2005). Como uma parte inevitável do envelhecimento,

estes produtos ligam-se covalentemente a proteínas de longa vida e por isso encontram-se em

concentrações elevadas nas placas amilóides, devido à longevidade dos depósitos de Aβ (Smith

et al., 1994). O péptido Aβ é capaz de agravar ainda mais a inflamação na AD, através de uma

série de efeitos secundários, tais como: aumento da permeabilidade da barreira

hematoencefálica (Zlokovic, 1997) e aumento da vasoconstrição das células musculares lisas

vasculares (Crawford et al., 1998; Suo et al., 1998). O excesso de inflamação na AD resulta em

neurodegeneração, que causa a demência observada em doentes de Alzheimer.

Vários passos na via inflamatória da AD envolvem ainda a produção de radicais, tais como

superóxido e óxido nítrico, ambos produtos da microglia e astrócitos estimulados por Aβ

(Stuchbury & Münch, 2005). Assim, outro fenómeno ligado ao declínio cognitivo e perda

neuronal associado à idade em doenças neurodegenerativas é o stress induzido por espécies

reactivas de oxigénio (ROS) e de azoto (RNS). Quando estes são produzidos em excesso podem

oxidar lípidos, proteínas e ácidos nucleicos, perturbando as suas estruturas e as suas funções,

interferindo, assim, com o metabolismo celular normal – stress oxidativo e nitrosativo (Rossi et

al., 2008). Este processo pode ser especialmente importante no sistema nervoso central, dado

que é vulnerável a danos de ROS e RNS como resultado do alto consumo de O2, alto teor

lipídico e baixas defesas de antioxidantes no cérebro quando comparado com outros tecidos

(Frank & Gupta, 2005). Sabe-se ainda que proteínas que foram modificadas com AGEs

produzem quase 50 vezes mais ROS do que as proteínas que não foram glicadas (Stuchbury &

Münch, 2005), contribuindo, assim, para a neurotoxicidade da proteína Aβ.

Introdução


1.4. Neuroquímica

Para além destes agregados proteicos, o cérebro de um doente de AD é também caracterizado

por atrofia, perda de sinapses e deficiência na neurotransmissão colinérgica central,

designadamente a degeneração dos neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal, baseada

principalmente na hipótese colinérgica (Kasa et al., 1997; Racchi et al., 2004; LaFerla & Oddo,

2005). A disfunção celular e morte celular de neurónios, que são responsáveis pela

manutenção de sistemas de transmissão específicos, conduz a deficiências de acetilcolina,

noradrenalina e serotonina – hipótese colinérgica (Cummings, 2004). Estes acontecimentos

foram comprovados por vários autores que demonstraram que a diminuição na actividade

colinérgica afecta a actividade dos enzimas responsáveis pela síntese e degradação da

acetilcolina (Racchi et al., 2004; Mukherjee et al., 2007).

1.4.1. Acetilcolina

Acetilcolina (ACh) encontra-se em vertebrados e artrópodes e é um dos principais compostos

responsáveis pela sinalização do nervo para o músculo nas sinapses especializadas designadas

junções neuromusculares (Houghton et al., 2006). No entanto, para além da sua função no

sistema nervoso periférico (SNP), também tem um papel importante no sistema nervoso

central (SNC), no qual está envolvida na memória e aprendizagem.

Existem dois receptores neuronais sensíveis a ACh, muscarínicos e nicotínicos, que estão

distribuídos no SNC e no SNP (Houghton et al., 2006). Os receptores muscarínicos estão

principalmente associados com o SNP e com músculo liso e cardíaco. O efeito da ligação com

ACh está geralmente associado com a estimulação do sistema nervoso parassimpático

(Houghton et al., 2006). Pelo contrário, os receptores nicotínicos encontram-se no SNC e na

placa motora terminal (EPP), que são as sinapses entre os nervos e músculos esqueléticos. A

perda progressiva dos receptores nicotínicos durante o desenvolvimento da AD também tem

sido descrita e há evidências de um papel destes receptores na deficiência de cognição e

memória (Silman & Sussman et al., 2005; Scarpini et al., 2003).

A ACh é, quimicamente, um éster de colina e é sintetizada no terminal pré-sináptico a partir de

colina e acetil-coenzima A (acetil-CoA), sendo a reacção catalisada pelo enzima colina

acetiltransferase (ChAT). O mecanismo do processo está representado na figura 3.


A ACh sintetizada é armazenada em vesículas, que se fundem com a membrana

liberta o seu conteúdo na fenda sináptica. A libertação da ACh no nervo terminal pode ser

efectuada através dos canais de Ca

nervoso. Uma acção potencial que chega ao terminal do neurónio pré

abertura dos canais de Ca2+ dependentes da voltagem. O Ca

vesículas com a membrana do nervo terminal e estas libertam grandes quantidades de ACh

por exocitose. As moléculas de ACh difundem

nicotínicos, localizados na membrana pós

nicotínicos resulta na difusão de Na

libertada tem um tempo de meia

do enzima acetilcolinesterase (

sintetizada no retículo endoplasmático da célula neuronal e é transportado para a membrana

terminal pré-sináptica (local de

degrada rapidamente a ACh em acetato e colina, o que provoca uma perda de actividade

estimuladora. A colina é retomada pelo terminal pré

(Greenstein, 2000; Shen et al.

DQB – FCUL

A ACh sintetizada é armazenada em vesículas, que se fundem com a membrana


efectuada através dos canais de Ca2+ dependentes da voltagem, existentes no terminal

nervoso. Uma acção potencial que chega ao terminal do neurónio pré-sináptico desencadeia a

dependentes da voltagem. O Ca2+ intracelular estimula a fusão das


por exocitose. As moléculas de ACh difundem-se através da fenda e activam os receptores

nicotínicos, localizados na membrana pós-sináptica. A ligação de ACh com os receptores

nicotínicos resulta na difusão de Na+ e K+ em toda a membrana e despolariza a célula. A ACh

libertada tem um tempo de meia-vida muito curto, devido à presença de grandes quantidades

do enzima acetilcolinesterase (AChE) na superfície externa do nervo terminal. A AC


sináptica (local de actividade) através de microtúbulos axonais. Este enzima


estimuladora. A colina é retomada pelo terminal pré-sináptico para nova síntese de ACh

al., 2002; Houghton et al., 2006; Siegel & Sapru, 2006).

Figura 3 Passos envolvidos na

síntese e libertação de

acetilcolina (ACh). Após o

estímulo, há libertação da ACh

na fenda sináptica, por exocitose.

ACh difunde e liga

receptores e, posteriormente, é

hidrolisada em c

acetato (A) através da acção de

acetilcolinesterase (AChE). Ch é

retomada para re

e armazenada em vesículas.

(adaptado de

2006).

Introdução

8

A ACh sintetizada é armazenada em vesículas, que se fundem com a membrana celular e


dependentes da voltagem, existentes no terminal

ptico desencadeia a

intracelular estimula a fusão das


da fenda e activam os receptores

sináptica. A ligação de ACh com os receptores

em toda a membrana e despolariza a célula. A ACh

rto, devido à presença de grandes quantidades

externa do nervo terminal. A AChE é


actividade) através de microtúbulos axonais. Este enzima


sináptico para nova síntese de ACh

Sapru, 2006).

Passos envolvidos na

síntese e libertação de

acetilcolina (ACh). Após o

estímulo, há libertação da ACh

na fenda sináptica, por exocitose.

ACh difunde e liga-se aos seus

receptores e, posteriormente, é

hidrolisada em colina (Ch) e

acetato (A) através da acção de

acetilcolinesterase (AChE). Ch é

retomada para re-síntese de ACh

e armazenada em vesículas.

(adaptado de Siegel & Sapru,

Introdução


1.4.2. Acetilcolinesterase

Todo o ciclo de transmissão de sinal – ou seja, a libertação de ACh, a sua difusão através da

fenda sináptica, a sua interacção reversível com o receptor nicotínico e, finalmente, a sua

hidrólise pela AChE – ocorre em alguns milisegundos. Portanto, todo o processo deve ser

perfeitamente integrado, no espaço e no tempo (Silman & Sussman, 2005).

Actualmente, os conhecimentos relativos à estrutura de AChE (EC 3.1.1.7) baseiam-se

principalmente em estudos realizados sobre o enzima TcAChE, obtidos a partir da enguia

eléctrica Torpedo californica. No entanto, a estrutura de AChE de mamíferos é muito

semelhante ao de TcAChE in vitro (Houghton et al., 2006) e a sua elucidação permitiu uma

abordagem estrutural para desenvolvimento de fármacos anticolinesterases (Silman &

Sussman, 2005). Foi demonstrado que AChE pertence à família de hidrolases α/β, embora este

enzima apresente um número de turnover muito superior ao das serinas hidrolases que fazem

uso da mesma tríade catalítica, Ser200-His440-Glu327 (Shen et al.,2002; Silman & Sussman,

2005; Houghton et al., 2006).

AChE é codificada a partir de um único gene, mas existe uma variedade de formas moleculares

que varia de tecido para tecido. Estas formas são geradas por splicing alternativo do exão C-

terminal seguidos por modificação pós-transducional. As subunidades catalíticas, que podem

variar em glicosilação, podem oligomerizar em dímeros ou tetrâmeros, dando origem a formas

globulares (G): G1, G2 e G4. Os monómeros (G1), dímeros (G2) e tetrâmeros (G4) podem ser

secretados como formas solúveis ou ancoradas à membrana por um domínio hidrófobo (Shen

et al., 2002; Silman & Sussman, 2005).

Na figura 4 está apresentado um diagrama da subunidade catalítica de TcAChE. Uma maneira

de ver a sua estrutura é como uma plataforma de folhas β que suporta a maquinaria catalítica

e, nas suas características gerais, é bastante semelhante a todos os membros da família. Na

verdade, os três membros da tríade catalítica aparecem na mesma ordem ao longo da cadeia

polipeptídica em todos os enzimas hidrolases α/β. Por outro lado, as hélices α e loops têm a

função de lidar com a especificidade do elemento, daí os substratos dos diferentes membros

da família ser tão variada (Silman e Sussman, 2008).


Inesperadamente para um enzima tão rápido, o seu centro activo está localizado numa

profunda e estreita fenda, denominada geralmente por cavidade, com cerca de 20Å de

profundidade, ladeado por 14 resíduos aromáticos conservados (Shen

Sussman, 2005; Houghton et al.

cavidade, a ligação inicial da ACh sucede no bordo exterior numa r

aniónico periférico (PAS). Esta ligação inicial é

de o substrato prosseguir para o centro activo. No fundo da cavidade, onde ocorre a

verdadeira hidrólise, existem quatro principais sublocais, sendo estes

cavidade oxianiónica, o local aniónico de ligação ao substr

O local catalítico (ES) contém a tríade catalítica Ser200

utilizam esta tríade catalítica Ser

uma vez que a forte ligação de hidrogénio entre His e Ser melhora a capacidade da Ser at

nucleofilicamente o substrato, enquanto Glu estabiliza o catião histidinium do estado de

DQB – FCUL



profundidade, ladeado por 14 resíduos aromáticos conservados (Shen et al.

et al., 2006). Apesar do processo de hidrólise ocorrer na base da

cavidade, a ligação inicial da ACh sucede no bordo exterior numa região denomina

). Esta ligação inicial é essencial, uma vez que aumenta a probabilidade


verdadeira hidrólise, existem quatro principais sublocais, sendo estes o local catalít

cavidade oxianiónica, o local aniónico de ligação ao substrato e ao acilo (figura 5).

) contém a tríade catalítica Ser200-His440-Glu327. As colinesterases

utilizam esta tríade catalítica Ser-His-Glu para reforçar a nucleofilicidade da serina catalítica,

uma vez que a forte ligação de hidrogénio entre His e Ser melhora a capacidade da Ser at


Figura 4 Estrutura tridimensional de

TcAChE com ACh, exibido como

bolas, ancorada no centro activo.

(retirado de Silman e Sussman, 2008)

Figura 5 Esquema do centro activo e local aniónico

periférico (PAS) de AChE. Os números dizem

respeito às posições dos resíduos na

local aniónico de ligação ao substrato; ABS = local

de ligação ao acilo; OH = cavidade oxianiónica; ES =

local catalítico.

Introdução

10



et al.,2002; Silman &

, 2006). Apesar do processo de hidrólise ocorrer na base da

egião denominada local

nta a probabilidade


o local catalítico, a

ato e ao acilo (figura 5).

Glu327. As colinesterases

Glu para reforçar a nucleofilicidade da serina catalítica,

uma vez que a forte ligação de hidrogénio entre His e Ser melhora a capacidade da Ser atacar


Estrutura tridimensional de

AChE com ACh, exibido como

bolas, ancorada no centro activo.

(retirado de Silman e Sussman, 2008)

Esquema do centro activo e local aniónico

periférico (PAS) de AChE. Os números dizem

respeito às posições dos resíduos na TcAChE. AS =

local aniónico de ligação ao substrato; ABS = local

igação ao acilo; OH = cavidade oxianiónica; ES =

Introdução


transição. A cavidade oxianiónica (OH) consiste em Gly118, Gly119 e Ala201. Estes três

resíduos peptídicos contêm dadores de ligação de hidrogénio e estabilizam o intermediário

tetraédrico de ACh, intermediário acil-AChE, que é formado durante o processo catalítico. O

local aniónico de ligação ao substrato (AS) é na maioria composto por resíduos aromáticos,

como Trp84 e Phe330, que possuem uma pequena carga negativa onde se ligam a ligandos

amónias quaternárias por interacções π-catião. A carga positiva do grupo amina quaternária

de ACh pode formar uma interacção estável com os sistemas ricos em electrões π dos anéis

aromáticos. O local de ligação ao acilo (ABS) é composto por Phe288 e Phe299, ao qual se liga

o grupo acilo da ACh, desempenhando um papel importante na limitação da dimensão de

substratos que são capazes de entrar no centro activo (Houghton et al., 2006; Zhou et al.,

2008). Uma molécula de água, em seguida, desloca o grupo acilo para regenerar o enzima e

libertar acetato.

Como já foi referido anteriormente, o centro activo deste enzima está embebido numa

cavidade, com cerca de 20Å de profundidade pelo que se coloca a grande questão: como é que

um enzima tão activo tem o seu centro activo imerso numa cavidade? Para além deste enigma,

existe ainda uma constrição no meio da cavidade produzida pela justaposição de Phe330 e

Tyr121, cuja distância entre si, aproximadamente 5Å, é substancialmente mais reduzido do

que o diâmetro do grupo quaternário de ACh que é 6,4Å (Silman & Sussman, 2008). Uma

recente publicação, por Hulme et al. (2006) tornou evidente que a fraca hidratação de ACh em

solução aquosa favorece a sua interacção com o local de ligação de ACh ao receptor

muscarínico. Do mesmo modo, a fraca hidratação de ACh deve favorecer a interacção π-catião

com os resíduos aromáticos, principalmente Trp279 e Tyr70, na parte superior da cavidade,

bem como as interacções subsequentes ao longo da cavidade para o centro activo, incluindo

os dois resíduos do estrangulamento, Phe330 e Tyr121. Em termos gerais, a superfície

aromática da cavidade poderá servir como uma espécie de coluna de fraca afinidade que o

substrato poderia deslizar para o centro activo através de sucessivas interacções π-catião

(Silman & Sussman, 2008). Para além deste facto, AChE tem um grande momento dipolar e o

eixo do momento dipolar da AChE está orientado, aproximadamente, ao longo do eixo do

centro activo da cavidade. Assim, Silman & Sussman (2008) propuseram que o momento

dipolar pode ajudar a atrair os substratos carregados positivamente de AChE para dentro e

para baixo do centro activo na cavidade, sendo esta uma forma de superar a dificuldade do

centro activo estar imerso. No entanto, devido ao elevado turnover do enzima e do forte

dipolo electrostático causado pela distribuição assimétrica da carga, é pouco provável que a

Introdução


colina produzida por hidrólise saia do centro activo pelo mesmo caminho que entrou a ACh

(Houghton et al., 2006). Com este indício, coloca-se uma nova questão: como é que os

produtos da reacção catalisada por este enzima são eliminados a partir da cavidade, uma vez

que a colina também possui carga positiva? Tem sido proposto, baseado em estudos de

dinâmica molecular e mutagénese dirigida, o mecanismo da “porta traseira” (figura 6) em que

o processo ocorre através da abertura da parte inferior da cavidade de AChE proporcionando

um canal através do qual os produtos podem passar (Gilson et al., 1994).

Grande interesse tem sido gerado quanto à expressão alterada de AChE no cérebro AD. Uma

série de estudos têm demonstrado que, apesar da diminuição geral na actividade de AChE no

cérebro AD, os níveis desse enzima aumenta em torno das placas amilóides e nos novelos

neurofibrilhares. Curiosamente, a actividade da AChE associada com placas neuríticas no

cérebro AD exibe propriedades enzimáticas especiais e sensibilidade a inibidores (García-

Ayllón et al., 2008). É de notar ainda que, nos últimos anos, deparou-se que AChE está

envolvido numa série de outras funções para além do seu papel clássico na transmissão

nervosa. Estas incluem um papel como uma proteína de adesão, uma proteína da matriz óssea,

no crescimento da neurite e na produção de fibrilhas amilóides. Alguns estudos evidenciaram

que AChE acelera a associação de péptidos Aβ em fibrilhas amilóides, provavelmente através

de um pool de aminoácidos localizados na proximidade do PAS do enzima (De Ferrari et al.,

2001).

1.5. Tratamento

Para melhorar a neurotransmissão colinérgica, diferentes estratégias têm sido investigadas,

incluindo a redução da placa amilóide através da administração de vacina anti-Aβ42 (Scarpini

Figura 6 Libertação dos produtos de

hidrólise de ACh do centro activo do

enzima. (adaptado de Houghton et al.,

2006)

Introdução


et al., 2003; Citron, 2004), diminuição da inflamação com drogas anti-inflamatórias (Scarpini et

al., 2003; Cummings, 2004; Blennow et al., 2006), a redução de ROS e RNS com antioxidantes

(Cummings, 2004; Frank & Gupta, 2005; Stuchbury & Münch, 2005; Blennow et al., 2006; Rossi

et al., 2008), bem como a diminuição da degradação sináptica de acetilcolina com inibidores

da colinesterase. Só serão relatados os tratamentos com antioxidantes e inibidores da

colinesterase.

1.5.1. Antioxidantes

O stress oxidativo em sistemas biológicos é contra-balançado por um grande conjunto de

antioxidantes endógenos bem como compostos de baixo peso molecular. Embora alguns

estudos sugerem que não há conexão entre antioxidantes e um risco reduzido de AD

(Luchsinger et al., 2003), vários ensaios com antioxidantes e scavengers de radicais livres,

incluindo vitamina E (Sano et al., 1997) e ácido α-lipóico (Hager et al., 2001) apresentam

vantagens em doentes com Alzheimer. A produção de ROS pode ocorrer muito cedo no

processo da doença, antes mesmo do surgimento das placas e novelos neurofibrilhares,

levando ao dano tecidual através de várias vias celulares. Portanto, o tratamento com

antioxidantes auxilia no impedimento da propagação do dano tecidual e no melhoramento da

sobrevivência neurológica (Stuchbury & Münch, 2005).

Ensaios iniciais com antioxidantes têm demonstrado a sua promessa como um tratamento

para a AD, mas devem ser realizados mais estudos clínicos para confirmar a sua eficácia. Dada

a baixa toxicidade dos antioxidantes e da grande variedade disponível, como ácido α-lipóico,

vitaminas C e E, presentes no chá verde, Ginkgo biloba, frutas e vinho tinto, podem não

fornecer apenas um efeito protector para a AD, mas pode ser uma alternativa importante para

os doentes que são incapazes de utilizar agentes com efeitos secundários tóxicos (Stuchbury &

Münch, 2005).

1.5.2. Inibidores da Acetilcolinesterase

Uma estratégia terapêutica para aumentar a neurotransmissão colinérgica é aumentar a

disponibilidade de acetilcolina através da inibição da acetilcolinesterase. Inibidores da AChE

(IAChE) são aprovados para o tratamento de leve a moderada AD e estes devem ser a primeira

linha de tratamento (Doody et al., 2001). Quatro inibidores da colinesterase estão aprovados

Introdução


pela Food and Drug Administration (FDA) – tacrina, donepezil, rivastigmina e galantamina.

Destes quatro, a tacrina é raramente usada, pois tem efeitos hepatotóxicos em,

aproximadamente, 40 por centro das pessoas expostas ao composto (Cummings, 2004; Racchi

et al., 2004). A segunda geração de inibidores, ao qual pertence os restantes, são menos

tóxicos e a sua duração de acção permite uma dose mais conveniente (Cummings, 2004).

Embora donepezil, rivastigmina e galantamina façam parte da mesma classe terapêutica, eles

diferem na sua farmacologia e farmacocinética. Donepezil é um derivado da piperina, que

inibe não-competitivamente e reversivelmente a AChE, sendo altamente selectivo para este

enzima (Scarpini et al., 2003; Racchi et al., 2004; Sugimoto, 2008). Galantamina é um alcalóide

terciário com duplo modo de acção: inibidor competitivo e reversível da AChE, bem como

modulador alostérico de receptores nicotínicos de ACh (Scarpini et al., 2003; Racchi et al.,

2004). Pelo oposto, a rivastigmina é um inibidor pseudo-irreversível da AChE.

Metabolicamente, tanto o donepezil e a galantamina são metabolizados no fígado pelo

citocromo P450, no entanto a rivastigmina não é metabolizada (Scarpini et al., 2003). Em

termos de biodisponibilidade, o donepezil tem um tempo de meia-vida plasmática longo pelo

que permite um regime posológico de uma vez por dia (Scarpini et al., 2003; Racchi et al.,

2004; Sugimoto, 2008). Inversamente, a galantamina e rivastigmina têm um curto tempo de

meia-vida de eliminação, o que requer uma posologia de duas doses diárias (Scarpini et al.,

2003; Racchi et al., 2004). Globalmente, estes fármacos são seguros e os efeitos secundários

são geralmente limitados a sintomas gastrointestinais, como náuseas, vómitos e diarreia. A

ocorrência de efeitos colaterais geralmente pode ser reduzida com uma dose baixa no início

do tratamento, que é aumentada lentamente. A co-administração com alimentos atrasa a

absorção dos fármacos e pode também reduzir os efeitos secundários gastrointestinais

(Blennow et al., 2006).

Considerando o mecanismo de acção dos IAChE’s, não se espera que alterem o curso natural

da doença, mas apenas atenuar, temporariamente, alguns dos sintomas. Esta abordagem

prevê alguma melhoria cognitiva a curto prazo, mas não previne o aparecimento da doença.

No entanto, alguns estudos têm demonstrado que os IAChE’s podem ser eficazes até 2 anos e

a extensão dos estudos sugerem que alguns doentes podem ter benefícios a longo prazo, até 5

anos (Blennow et al., 2006).

Introdução


Como foi referido anteriormente, pensa-se que AChE promove a associação de péptidos Aβ em

fibrilhas amilóides, através da ligação do PAS do enzima. Alguns estudos demonstraram que

moléculas que interagem quer, exclusivamente, com PAS ou com os dois locais catalítico e

periférico, podem impedir a pró-agregação de AChE com Aβ (Inestrosa et al., 1996; Fallarero et

al., 2008). Esta pesquisa está a resultar na produção de novas classes de IAChE’s, com dupla

especificidade, sendo direccionado tanto para o centro activo como para o PAS. Assim, podem

desempenhar duplos papéis no contexto da AD, pela inibição da hidrólise de ACh e pelo atraso

da associação de péptidos Aβ nas fibrilhas amilóides (Silman & Sussman, 2005).

É certo que a AD se tornará na doença mais prevalente com o envelhecimento da população

mundial. Sendo assim é importante encontrar métodos eficazes de não só tratar a doença,

mas prevenir a neurodegeneração antes dos sintomas clínicos serem observados.

2. Polifenóis

Polifenóis encontram-se em plantas comestíveis e não-comestíveis, sendo importantes para o

normal crescimento das plantas e defesa contra infecções e lesão (Amorati et al., 2006). Isto é,

são metabolitos secundários de plantas, essenciais para a fisiologia vegetal, contribuindo para

a sua pigmentação, crescimento, reprodução e resistência a patogénios e predadores.

Também são responsáveis pela acidez dos alimentos e de bebidas derivados das plantas, bem

como pela oxidação dos mesmos produtos quando são produzidos ou armazenados (Rossi et

al., 2008).

Polifenóis dietéticos têm sido amplamente considerados como sendo benéficos para a saúde

humana, exercendo diversos efeitos biológicos, tais como scavenging de radicais livres,

quelação de metais metálicos de transição prooxidantes, modulação da actividade enzimática,

e alteração de vias de transdução de sinal (Konishi & Kobayashi, 2004; Amorati et al., 2006).

Estudos epidemiológicos também destacaram a associação entre o consumo de alimentos e de

bebidas ricas em polifenóis na prevenção de diversas doenças humanas (Konishi & Kobayashi,

2004).

Um grande grupo de compostos fenólicos é formado pelo ácido cinâmico e seus derivados,

que se encontra, principalmente, no reino vegetal (Ekmekcioglu et al., 1998; Konishi &

Introdução


Kobayashi, 2004). As estruturas deste grupo podem ser encontradas com diferentes níveis de

hidroxilação (Lafay & Gil-Izquierdo, 2008) e existem principalmente numa forma esterificada

com ácidos orgânicos, açúcares, e lípidos (Konishi & Kobayashi, 2004). Ácido cinâmico e seus

derivados hidroxilados são ingeridos pelo Homem e animais em variadíssimas quantidades

através da dieta (Ekmekcioglu et al., 1998). Os derivados de ácidos cinâmicos são

representados principalmente pelos ácidos cafeico, ferúlico, sinapínico e p-cumárico – figura 7

(Lafay & Gil-Izquierdo, 2008).

Figura 7 Estruturas de alguns derivados do ácido cinâmico.

Ácido cafeico é o mais comum, representando até 70% do total de ácidos hidroxicinâmicos nos

frutos (Lafay & Gil-Izquierdo, 2008) e surge, principalmente em alimentos, na forma de ácido

clorogénico (Konishi & Kobayashi, 2004). O ácido cafeico tem dois grupos hidroxilos adjacentes

a um resíduo aromático, apresentando actividade antioxidante e efeitos anti-mutagénico e

anti-cancerígenos in vitro (Konishi & Kobayashi, 2004). Outro composto presente nesta classe é

o ácido rosmarínico que é um éster do ácido cafeico e ácido 3,4-dihidroxifenilacético (Konishi

& Kobayashi, 2005). O ácido rosmarínico encontra-se em várias ervas Lamiaceae usadas

nomeadamente como ervas aromáticas, tal como a erva cidreira, Melissa officinalis L (Konishi

& Kobayashi, 2005). Tem sido relatado que este ácido tem uma série de actividades biológicas

in vitro, incluindo actividade anti-viral, anti-bacteriana, antioxidante, anti-inflamatória, e anti-

alérgica (Konishi & Kobayashi, 2005). Mas, a actividade biológica in vivo após administração,

Ácido Cafeico

Ácido Ferúlico

Ácido Clorogénico

Ácido p-cumárico

Ácido Sinapínico

Ácido Rosmarínico

Introdução


tanto do ácido cafeico como do rosmarínico, é dependente da absorção intestinal e posterior

interacção com os tecidos-alvo (Konishi & Kobayashi, 2004; Konishi & Kobayashi, 2005).

Vários estudos epidemiológicos e experimentais sugerem que os polifenóis dietéticos

contribuem para a protecção contra diversas doenças degenerativas, devido principalmente às

suas propriedades antioxidantes (Lafay & Gil-Izquierdo, 2008). Como referido anteriormente, a

inflamação é um componente de doenças neurodegenerativas. Assim, é concebível que os

efeitos positivos dos polifenóis sobre neurodegeneração e envelhecimento podem também

ser mediado pelo seu papel anti-inflamatório (Rossi et al., 2008).

3. Objectivos

Vários estudos epidemiológicos e experimentais sugerem que polifenóis dietéticos contribuem

para a protecção contra diversas doenças degenerativas (Lafay & Gil-Izquierdo, 2008). Em

estudos anteriores, observou-se que alguns ácidos fenólicos, nomeadamente o ácido

rosmarínico (Falé et al., 2009), conseguiam inibir a actividade de AChE. Dadas as propriedades

antioxidantes dos ácidos fenólicos, estes poderão apresentar potencial terapêutico na

aplicação à AD.

O objectivo da investigação aqui exposta foi sintetizar novos e específicos inibidores de AChE

com baixa toxicidade e alta estabilidade química. Foi decidido que os compostos a serem

sintetizados teriam de ter uma funcionalidade semelhante à funcionalidade do grupo éster da

ACh, ou seja, que eles conteriam a fracção colina. Assim, uma série de derivados de colina de

ácidos fenólicos foram sintetizados para analisar se seriam melhores antioxidantes que os

ácidos fenólicos que os deram origem e se tinham alguma actividade inibidora do enzima

AChE.

Para além da determinação das propriedades biológicas dos ésteres de colina sintetizados,

pretende-se determinar o seu metabolismo e biodisponibilidade no tracto gastrointestinal com

vista a avaliar a estabilidade dos compostos sintetizados.


Capítulo II – Materiais e Métodos

Materiais e Métodos


1. Materiais

1.1. Reagentes Químicos

Todos os reagentes químicos utilizados no trabalho foram pro analysis.

Enzima acetilcolinesterase tipo VI-S, isolado de enguia eléctrica contendo 349 U/mg sólido e

411 U/mg de proteína; 5,5’-dithiobis [2-nitrobenzoic acid] (DTNB); iodeto de acetiltiocolina

(AChI); 2,2-Di (4-tert-octylphenyl) -1-picrylhydrazyl (DPPH); tampão Hepes; tampão Tris;

pancreatina, isolada de pâncreas de porco; Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide

(MTT); colina clorada; dimetilsulfato [(MeO)2SO2]; colesterol; Dipalmitoylphosphatidylcholine

(DPPC) foram adquiridos à Sigma. Sais de fosfato de potássio, ácido trifluoroacético (TFA),

ácido fosfórico, acetonitrilo, carbonato de potássio (K2CO3), tetrahidrofurano (THF),

clorofórmio (CHCl3), dioxano, Thionyl chloride (SOCl2) e acetato de etilo foram adquiridos à

Merck. Sais de cloreto de sódio, cloreto de magnésio hexahidratado, ácido clorídrico (HCl) e

dimetilsulfóxido (DMSO) foram obtidos na Riedel – de Haën; sulfato de sódio (Na2SO4) foi

obtido na Panreac; pepsina contendo 0,53 U/mg foi adquirida à Fluka; hidróxido de sódio

(NaOH) foi obtido à Absolve; butanol foi adquirido ao BDH Biochemicals. DMEM (Dulbecco’s

Modified Eagle’s Medium), HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution), PBS (Phosphates Buffer

Solution), tripsina, FBS (Foetal Bovine Serum), glutamina e Pen-Strep (penicilina e

estreptomicina) foram adquiridos à Lonza (Merck). O metanol utilizado no decorrer de todo o

trabalho era HPLC grade e foi adquirido à Fisher Scientific.

Os ácidos cafeico (Fluka), cinâmico (Fluka), rosmarínico (Aldrich) e Trolox (Sigma) foram

obtidos comercialmente.

Os ésteres de colina – cafeato de colina, cinamato de colina, 3,4-dimetoxicinamato de colina,

rosmarinato de colina e trolox de colina – e o Trolox foram gentilmente cedidos pela

Professora Doutora Amélia Santos, pertencente ao Centro de Química Estrutural do Instituto

Superior Técnico.



1.2. Linhas Celulares

A linha celular utilizada foi Caco-2 (ATCC#HTB-37), uma linha de células epiteliais de

adenocarcinoma colorrectal. As células foram gentilmente cedidas pelo Professor Doutor

Carlos Farinha, pertencente ao Centro de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da

Universidade de Lisboa.

1.3. Equipamentos

As absorvências foram lidas num espectrofotómetro de feixe duplo UV-Vis M350 da Camspec e

num leitor de microplacas Tecan Sunrise. A análise de HPLC (High Precision Liquid

Chromatography) foi realizada num cromatógrafo líquido Finnigan™ Surveyor® Plus Modular

LC System equipado com uma coluna Purospher® STAR RP-18 da Merck e software Xcalibur. Os

ensaios celulares foram realizados numa câmara de fluxo laminar Esco Class II Biohazard Safety

e as células guardadas numa estufa Shel Lab CO2 Series da Sheldon Mfg. Inc. As reacções

químicas foram monitorizadas por TLC usando placas de alumínio revestidas com sílica gel 60

F254 (Merck) e para as suas detecções usou-se UV 254nm. Os compostos foram secos num

liofilizador Heto Power Dry LL 3000. Os espectros de NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

foram realizados num Bruker AVANCE III 300MHz. A formação de lipossomas foi efectuada

num Ultrasonic Processor UP200S da Hielscher e num Mini-Extruser Avanti® da Polar Lipids,

Inc., utilizando membranas Whatman® Shleicher & Schuell de poro 0,1µm. Para a secagem dos

lipossomas usou-se um excicador Nalgene™ da Nalgene ® Brand Products.

2. Métodos

2.1. Determinação da Actividade Antioxidante (método do DPPH)

A actividade antioxidante foi determinada através de um teste clássico, o teste do DPPH (Tepe

et al.2006). Este método baseia-se na capacidade dos compostos para extinguir radicais livres,

neste caso o DPPH, através da transferência de um átomo de hidrogénio (figura 8).



Figura 8 Esquema reaccional de extinção do DPPH. O radical DPPH apresenta uma cor púrpura mas

quando é reduzido deixa de ter cor, pelo que não absorve a 517 nm.

Adicionou-se 15µl de solução de composto a 1,5ml de solução metanólica de DPPH 0,02%

(2mg em 100ml de metano destilado). Esta mistura incubou durante 30 minutos e mediu-se a

absorvência a 517 nm contra o branco correspondente (sem DPPH). Uma reacção controlo,

utilizando água/metanol (dependendo do composto) no lugar da solução do composto, foi

considerada como 100% da actividade antioxidante. O ensaio foi realizado em várias

concentrações de cada composto e em triplicado para cada uma das concentrações.

��%� � 100 � �� ⁄ � � 100

Em que E(%) é a percentagem de extinção de DPPH, Acontrolo é a média da absorvência da

reacção controlo e Aamostra é a absorvência da reacção com determinada concentração de

composto. A concentração de composto, cuja extinção de DPPH é 50% (EC50) foi determinada

através da regressão obtida pela representação gráfica da percentagem de extinção versus

concentração de solução de composto.

2.2. Inibição da Actividade da Acetilcolinesterase

A actividade enzimática de AChE foi quantificada através da adaptação do método descrito por

Ingkanian et al. (2003). Neste método a acetiltiocolina foi usada como substrato para o AChE,

originando acetato e tiocolina. Da reacção de tiocolina com o 5,5’-Ditiobis(2-ácido

nitrobenzóico) (DTNB) resulta 2-nitrobenzoato-5-mercaptotiocolina e o ião 5-tio-2-

nitrobenzoato (TNB) que tem um pico de absorvência a 405 nm. Estas reacções estão

apresentadas na figura 9.

Radical DPPH (púrpura – 517nm) DPPH reduzido (sem cor)



Figura 9 Reacção química de Ellman’s usada para determinar a actividade colinesterase (adaptado de

Frasco et al., 2005).

Adicionou-se, numa cuvette, 325µl de solução tampão Tris/Hepes (50 mM a pH 8,0), 100µl de

solução de composto e 25µl de solução de AChE contendo 0,26 U/ml. Esta mistura incubou

durante 15 minutos e adicionou-se 75µl de solução de AChI (0,023 mg/ml) e 475µl de 3 mM de

DTNB. Noutra cuvette fez-se o branco correspondente (sem AChE) e mediu-se a absorvência a

405 nm. Uma reacção controlo, utilizando água/metanol (dependendo do composto) no lugar

da solução de composto, foi considerada como 100% da actividade enzimática de AChE. O

ensaio foi realizado em várias concentrações de cada composto e em triplicado para cada uma

das concentrações.

��%� � 100 � �� ⁄ � � 100

Em que I(%) é a percentagem de inibição enzimática, Acontrolo é a média da absorvência da

reacção controlo e Aamostra é a absorvência da reacção com determinada concentração de

composto. A concentração de composto, cuja inibição da actividade enzimática é 50% (IC50) foi

determinada através da regressão obtida pela representação gráfica da percentagem de

inibição versus concentração de composto.

Acetiltiocolina

Tiocolina Acetato

5,5’-Ditiobis(2-ácido nitrobenzóico) (DTNB)

5-tio-2-nitrobenzoato (TNB)



2.3. HPLC Analítico

Os compostos foram analisados por HPLC com um volume de injecção de 25µl e o fluxo de

injecção de 1,0 ml/min. Foram realizados vários gradientes de eluição com solução A composta

por acetonitrilo, solução B por metanol e solução C por ácido trifluoroacético 0,05% (v/v),

excepto para o ácido cinâmico. Para este composto a solução C foi composta por ácido

fosfórico 0,3% (v/v).

O gradiente G1 consistiu em inicialmente 10% de solução A e 90% de solução C; 50min, 80% de

A, 15% de B e 5% de C; 52min, 10% de A e 90% de C; 60min, 10% de A e 90% de C.

O gradiente G2 consistiu em inicialmente 10% de solução A e 90% de solução C; 40min, 66% de

A, 12.38% de B e 21.62% de C; 42min, 10% de A e 90% de C; 45min, 10% de A e 90% de C.

O gradiente G3 consistiu em inicialmente 30% de solução B e 70% de solução C; 20min, 90% de

B e 10% de C; 25min, 90% de B e 10% de C; 28min, 30% de B e 70% de C.

2.4. Digestão pelos Sucos Digestivos in vitro

A degradação dos compostos foi efectuada através do método descrito por Yamamoto et al.

(1999). O volume reaccional é de 5mL, no entanto no caso do Cafeato, Rosmarinato e Trolox

de Colina foi usado um volume reaccional de 1mL (500µL de suco artificial, 400µL de H2O e

100µL de amostra a 10 mg/mL) devido à escassa quantidade dos compostos. Todos os ensaios

foram feitos em duplicado e, quando necessário, em triplicado.

2.4.1. Digestão pelo Suco Gástrico Artificial

O suco gástrico artificial consistiu em 320mg de pepsina e 200mg de NaCl em 100mL, a pH 1,2.

Juntou-se 2,5mL de suco gástrico artificial e 2,0mL de H2O, num tubo de ensaio. Para iniciar a

reacção, adicionou-se 0,5mL de amostra a 10 mg/mL ao tubo e colocou-se a 37°C. Para parar a

reacção, juntou-se 100µL de mistura reaccional a 900µL de metanol num vial de HPLC nos

tempos 0h, 1h, 2h, 3h e 4h e manteve-se em gelo. Por fim, injectou-se cada tempo no HPLC

para análise.



2.4.2. Digestão pelo Suco Pancreático Artificial

O suco pancreático artificial consiste em 25mg de pancreatina de porco para 1mL de tampão

K-fosfatos 50 mM a pH 8,0.

Juntou-se 2,5mL de suco pancreático artificial e 2,0mL de H2O, num tubo de ensaio. Para iniciar

a reacção, adicionou-se 0,5mL de amostra a 10 mg/mL ao tubo e colocou-se a 37°C. Para parar

a reacção, juntou-se 100µL de mistura reaccional a 900µL de metanol num eppendorf nos

tempos 0h, 1h, 2h, 3h e 4h. Faz-se um short spin de 30s para precipitar a proteína, recolheu-se

o sobrenadante para um vial de HPLC e manteve-se em gelo. Por fim, injectou-se cada tempo

no HPLC para análise.

2.5. Ensaios em células Caco-2

O crescimento de células Caco-2 foi feito recorrendo ao método descrito por Kern et al. (2003).

Semearam-se células Caco-2 em meio de cultura DMEM suplementado com 10% soro bovino

(FBS), 100 U/mL de penicilina, 100 U/mL de estreptomicina e 2 mM L-glutamina, a 37°C em

atmosfera com 5% de CO2. O meio foi substituído a cada 48h e as células foram recolhidas

depois do processo de tripsinização.

2.5.1. Ensaio de Citotoxicidade em Células Caco-2

Este ensaio foi realizado de acordo com o método descrito por Chen et al. (2008).

Os ensaios de citotoxicidade celular foram realizados pelo método do MTT, indicador da

actividade do desidrogenase mitocondrial, reflectindo a actividade metabólica de células

viáveis. As células vivas têm capacidade para reduzir o MTT a azul de tripano, através da acção

do succinato desidrogenase mitocondrial, enzima que só está activo em células com

metabolismo da cadeia respiratória intacto. Ao adicionar DMSO vai solubilizar o produto roxo

insolúvel (azul de tripano), permitindo a obtenção de uma solução corada que pode ser

quantificada espectrofotometricamente. Assim, é possível determinar a

viabilidade/citotoxicidade celular através da redução do MTT – figura 10.



Figura 10 Esquema reaccional da redução do MTT. Apenas as células viáveis conseguem reduzir o MTT

(570nm) através do succinato desidrogenase mitocondrial.

Semearam-se as células tripsinizadas em caixas de 96 poços (0,31 cm2), cerca de 1200 células

num volume de 100µL de meio, até atingir cerca de 90% de confluência (aproximadamente 15

dias). Após atingida a confluência, aspirou-se o meio e adicionou-se 100µL de meio

suplementado com diferentes concentrações de composto (0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1 mg/mL). Ao

fim de 48h, aspirou-se o meio suplementado e adicionou-se 50µL de PBS para lavar as células.

Adicionou-se meio suplementado com 10% (v/v) solução de MTT 5 mg/mL e incubou-se a caixa

a 37°C durante, aproximadamente, 1h30. Retirou-se o meio e adicionou-se 100µL de DMSO a

cada poço (solubilização do produto da reacção). Após 3h de incubação, leu-se a 570 nm

(referência 630 nm), num leitor de microplacas.

2.5.2. Ensaio de Metabolismo pelas Células Caco-2

O metabolismo pelas células Caco-2 foi adaptado através do método descrito por Kern et al.

(2003).

Para este ensaio, semearam-se cerca de 2 x 104 células em caixas de Petri de 4 cm de diâmetro

e deixaram-se crescer, durante 15 dias, até atingir 80-90% confluência. Após atingida a

confluência, removeu-se o meio e adicionou-se 2,5mL de HBSS suplementado com 0,5 mg/mL

de composto (5% DMSO no final). Às 0h, 1h, 2h, 4h e 6h recolheu-se 300μL do meio e juntou-

se 300μL de MeOH. Seguiu-se uma centrifugação a 9000 rpm durante 10 minutos e recolheu-

se o sobrenadante para análise por HPLC. Ao fim das 6h removeu-se o meio e lavaram-se as

células com 1mL de HBSS novo. Durante 30 minutos deixou-se as células com 1mL de solução

1:10 TFA 0,05%/MeOH para precipitarem e, de seguida, fizeram-se 5 ciclos de 2 minutos de

ultrasons. Por fim, centrifugou-se a 9000 rpm, durante 10 minutos, para precipitar restos

Célula viável

Succinato Desidrogenase Mitocondrial

MTT (amarelo) MTT reduzido (púrpura)



celulares e recolheu-se o sobrenadante, o qual foi injectado no HPLC para análise. Este ensaio

foi realizado em triplicado.

Em paralelo a este ensaio, realizou-se um ensaio controlo, exactamente idêntico mas na

ausência de células Caco-2. O objectivo do ensaio foi verificar que o composto não era

degradado pelo meio.

2.6. Encapsulamento do Ácido Cafeico em Lipossomas

A formação de LUV’s com um diâmetro médio de 100 nm foi adaptada do método descrito por

Coutinho et al. (2004).

Os componentes da mistura lipídica foram Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) e colesterol

(Ch) numa razão molar de 7:3 e preparou-se uma solução apropriada da quantidade de lípidos

em clorofórmio. Evaporou-se o solvente num fluxo de azoto, havendo formação de um filme

lipídico fino e, de seguida, colocou-se o resíduo lipídico numa bomba de vácuo durante 2h.

Para preparar lipossomas contendo o ácido cafeico, o filme lipídico, aquecido a 50°C num

banho, foi hidratado com 1mL de 0,1mg/mL de ácido cafeico em tampão PBS (150 mM NaCl,

2,70 mM K2HPO4 e 1,50 mM NaH2PO4) e repetidamente levou-se ao vortex de modo a remover

o máximo possível de lípido das paredes do eppendorf. Em seguida, realizaram-se ciclos de

congelamento-descongelamento, repetidos 8x, usando azoto líquido e um banho a 50°C.

Posteriormente, a suspensão lipídica foi extrudida 23x através de membranas policarbonato

de poros de 100 nm. A solução final foi armazenada a 4°C.

2.7. Dispersão Dinâmica de Luz

A dispersão de luz foi feita recorrendo ao método descrito por Pacheco et al. (2005). A fonte

de luz foi um Spectra Physics 127, 35 mW laser He-Ne, operado no único modo em λ = 632,8

nM. A luz reflectida pelos espelhos chegou à amostra contida numa célula de quartzo Hellma

com 10 mm de percurso óptico. A colecção óptica captura a luz dispersada num ângulo de 90°

em polarização V-V e conduzida através de uma fibra óptica para um fotomultiplicador

ALV/SO-SIPD. A intensidade das funções de correlação foi determinada com UNICOR photon

correlator. O alinhamento do ângulo de 90° foi ajustado com a ajuda de um Melles Griot,

1mW, laser He-Ne. As medições foram realizadas à temperatura ambiente (≈ 20°C).



Os tempos de correlação, τ, relacionados com a difusividade, D, e o vector de onda de

dispersão, q, τ = (Dq2)-1, foram obtidos das funções de correlação usando o método dos

cumulantes. Os valores do raio hidrodinâmico, Rh, foram obtidos através da equação de

Stokes-Einstein ��

�� , fazendo a aproximação de que as partículas estão em condições

de diluição infinita. Considerou-se a viscosidade, h, da água.

2.8. Análise Estatística

Todos os resultados são apresentados como média ± desvio padrão, tendo sido utilizado o

software Microsoft ® Excel 2007.

Adicionalmente realizou-se uma análise estatística ANOVA (do inglês Analysis of Variance) de

distribuição F-Snedecor com um intervalo de confiança de 95%.


Capítulo III – Resultados e Discussão de Resultados

Resultados e Discussão de Resultados


Os ácidos hidroxicinâmicos, como os ácidos cafeico e rosmarínico, apresentam um grande

poder antioxidante (Lafay & Gil-Izquierdo, 2008). Mais recentemente, Falé et al. (2009)

evidenciou que para além desta propriedade, o ácido rosmarínico também exibia actividade

inibidora de AChE. Uma vez que estes compostos apresentaram actividade inibidora de AChE e

dado que a colina é o substrato natural deste enzima, propôs-se a combinação destes ácidos

fenólicos com colina, originando ésteres de colina que poderiam ser melhores inibidores do

enzima em causa. Assim, neste trabalho, utilizaram-se ésteres de colina do trolox e dos ácidos

cafeico, cinâmico, 3,4-dimetoxicinâmico e rosmarínico – figura 11.

Ácido Cafeico Ácido Cinâmico Ácido 3,4-Dimetoxicinâmico

Ácido Rosmarínico

Trolox

Cafeato de Colina

Cinamato de Colina 3,4-Dimetoxicinamato de Colina

Rosmarinato de Colina

Trolox de Colina

Figura 11 Estruturas químicas dos vários ácidos fenólicos e seus derivados de colina usados neste

trabalho.

OH

O

OH

OH

OH

O

O

OH

CH3

OH

O

CH3

CH3

CH3

H3CO

OCH3

OH

O

CH3

O

O

N+

CH3

CH3

Cl-

O

OH

CH3

O

O

CH3

CH3

CH3

CH3

N+

CH3

CH3

Cl-

OH

OH

O

O

OO

OH

OH

N+

CH3

CH3

CH3

O

O-

F3C

CH3

O

O

N+

CH3

CH3

OH

OH

O

O-

F3C

Cl-

CH3

O

O

N+

CH3

CH3

H3CO

OCH3

OH

OH

O

O

OH

O

OH

OH



Primeiramente, foram analisados relativamente à sua actividade antioxidante (ponto 1) e

inibidora do enzima AChE (ponto 2) com a finalidade de saber se as propriedades antioxidantes

se mantinham, em relação ao ácido respectivo, e se possuem capacidade de inibir o enzima

intimamente ligado à AD. Mesmo que os compostos estudados sejam substratos fracos para a

inibição da actividade de AChE, não devem apresentar qualquer toxicidade significativa para

mamíferos. No entanto, poderão apresentar actividade antioxidante, podendo assim ter algum

potencial terapêutico na aplicação à AD.

Para além das suas propriedades biológicas, como antioxidante e inibidora do enzima AChE,

foram realizados estudos de metabolismo gastrointestinal (ponto 3) para se poder conhecer a

estabilidade dos compostos nas condições da digestão (pH ácido do estômago e pH neutro do

suco pancreático, com os respectivos enzimas). Como um dos compostos mostrou boa

actividade inibidora do enzima AChE e biodisponibilidade, seleccionou-se este composto para

prosseguir os estudos. Procedeu-se, assim, à sua síntese química (ponto 4) e continuou-se o

estudo no sentido de determinar o seu comportamento face às células Caco-2 (ponto 5). Este

estudo tem como finalidade avaliar a facilidade com que os compostos podem ultrapassar a

barreira intestinal. Para facilitar a permeação através das membranas celulares, iniciaram-se

estudos com o encapsulamento de ácido cafeico, como modelo, em sistemas lipossomais

(ponto 6).

1. Propriedades Antioxidantes

Nesta primeira fase do trabalho pretendeu-se estudar a capacidade antioxidante dos derivados

de colina obtidos a partir de ácidos fenólicos, face à capacidade antioxidante dos próprios

ácidos utilizados como composto de partida. O estudo desta propriedade foi realizado através

do método do DPPH, um radical estável, sendo avaliado neste teste a existência de compostos

com capacidade para capturarem um radical livre, podendo assim funcionar como

antioxidante.

A concentração de antioxidante que produz 50% de extinção do radical (valor de EC50) é usada

frequentemente como um parâmetro para caracterizar o poder antioxidante. Assim, para cada

um dos compostos realizou-se o ensaio do DPPH para diferentes concentrações destes

compostos. A representação da percentagem de extinção do radical DPPH em função da



concentração de cada um dos compostos permite estabelecer uma regressão linear, que se

encontram no ANEXO 1. Os valores de EC50 para os vários ácidos e seus derivados são

expressos em µg/mL e µM (tabela 1).

Tabela 1 Valores de EC50 dos vários ácidos e seus derivados, expressos em µg/mL e µM. Análise

estatística ANOVA: ácido cafeico vs cafeato de colina p > 0,05; ácido rosmarínico vs rosmarinato de

colina p < 0,05; trolox vs trolox de colina p < 0,05.

Composto

Actividade Antioxidante

EC50 (µg/mL) EC50 (µM)

Composto

Actividade Antioxidante

EC50 (µg/mL) EC50 (µM)

Ácido Cafeico

4,47±0,03

24,78±0,19

Cafeato de Colina

11,23±2,25

29,62±5,94

Ácido Cinâmico

100(a)

675(a)

Cinamato de Colina

100(c)

371(c)

Ácido 3,4-

Dimetoxicinâmico

100(b)

480(b)

3,4-Dimetoxicinamato

de Colina

100(d)

303(d)

Ácido

Rosmarínico

2,30±0,05

6,38±0,13


2,41±0,10

4,30±0,18

Trolox

3,31±0,09

13,22±0,38

Trolox de Colina

14,27±0,34

38,39±0,93

(a) máximo que se usou no ensaio, apresentando 2,48±1,00% de extinção.

(b) máximo que se usou no ensaio, apresentando 2,20±0,64% de extinção.

(c) máximo que se usou no ensaio, apresentando 3,91±0,28% de extinção.

(d) máximo que se usou no ensaio, apresentando 4,27±0,45% de extinção.

Desde a sua síntese há vinte anos atrás, o antioxidante fenólico sintético Trolox foi investigado

pelo seu poder antioxidante por inúmeros investigadores. A estrutura de Trolox apresenta os

requisitos para uma actividade antioxidante efectiva, ou seja, é um fenol substituído com um



oxigénio éter em para num sistema de anéis. Assim, a estrutura possui o requisito de

estabilização estereoelectrónica, resultando radicais fenoxilo, através da transferência de um

átomo de hidrogénio para um radical oxigénio activo, tais como peroxilo (figura 12). Devido a

esta estrutura cromanol, que antevê a actividade antioxidante, e o grupo carboxilo com efeitos

de solubilidade moderada em água, Trolox tem vantagens em relação a outros antioxidantes

(Barclay et al., 1995).

O

OH

CH3

OH

O

CH3

CH3

CH3

O

O

CH3

OH

O

CH3

CH3

CH3

Os ácidos cafeico (EC50 = 24,78 ± 0,19 µM) e rosmarínico (EC50 = 6,38 ± 0,13 µM) apresentam

boa actividade antioxidante quando comparado com o Trolox (EC50 = 13,22 ± 0,38 µM). A boa

actividade antioxidante destes ácidos é devida à presença da fracção catecol que dá origem,

por eliminação do átomo de hidrogénio, a radicais semiquinonas que são altamente

estabilizados por uma ligação hidrogénio intramolecular – figura 13 (Amorati et al., 2006).

Porém, o ácido rosmarínico apresenta uma melhor actividade antioxidante pois exibe dois

grupos catecol, enquanto o ácido cafeico apenas contém um grupo catecol.

Ao contrário dos ácidos cafeico e rosmarínico, os ácidos cinâmico e 3,4-dimetoxicinâmico não

apresentam a fracção catecol responsável pela captação eficiente de radicais livres. Assim,

com igual massa de ácidos cinâmico e 3,4-dimetoxicinâmico só se obteve uma actividade

antioxidante inferior a 5%, não sendo possível determinar o EC50. Estes 5%, provavelmente,

devem-se ao facto de o grupo acrilo (H2C=CH–C(=O)R) ter também alguma relevância na

Figura 13 Mecanismo de reacção de

catecóis com radicais peroxilo,

originando radicais semiquinonas.

HAT = Transferência de átomo de

hidrogénio; ET = Transferência de

electrão; X = qualquer grupo (retirado

de Amorati et al., 2006)

ROO•

Figura 12 Esquema reaccional da acção

antioxidante do Trolox na presença de

radical peroxilo, com formação do

radical fenoxilo.



determinação das boas propriedades antioxidantes dos derivados do ácido cinâmico (Amorati

et al., 2006).

Com a introdução da fracção colina, o cafeato de colina e o trolox de colina apresentaram

valores de EC50 ligeiramente superiores em relação aos respectivos ácidos (tabela 1). No

entanto, só para o trolox e trolox de colina é que a diferença é estatisticamente significante

para uma probabilidade de 5%.

O trolox de colina (EC50 = 38,39 ± 0,93 µM) e o cafeato de colina (EC50 = 29,62 ± 5,94 µM), para

além de apresentarem os grupos característicos dos seus ácidos respectivos, têm o grupo

hidroxilo (-OH) do grupo carboxilo (COOH) substituído pela colina. Esta deverá ser a causa

provável do aumento do EC50, uma vez que o grupo hidroxilo do grupo carboxilo também

conseguiria captar radicais de uma forma mais eficiente que a fracção colina. Contudo, o

rosmarinato de colina, EC50 = 4,30 ± 0,18 µM, conseguiu apresentar melhor actividade

antioxidante que o respectivo ácido e Trolox. Tal como para os ácidos cinâmico e 3,4-

dimetoxicinâmico, também não foi possível determinar os EC50 para os seus derivados de

colina.

Neste estudo verificou-se que a introdução da fracção colina não afecta a actividade

antioxidante dos compostos de partida com estrutura de ácido, desde que, de facto, já

tivessem a propriedade de serem antioxidantes, logo no início.

2. Inibição da Actividade de Acetilcolinesterase

Desde que a patogénese das fases tardias de AD foi associada a uma deficiência da ACh no

cérebro, utilizam-se inibidores da AChE para o tratamento sintomático da doença. Assim, para

além de conhecer as propriedades antioxidantes dos ácidos e ésteres de colina sintetizados,

também se estudou a capacidade de estes inibirem o enzima que está intimamente ligado ao

tratamento da AD.

Tal como para a determinação da actividade antioxidante, a representação da percentagem de

inibição do enzima em função da concentração de cada composto permite estabelecer uma

regressão linear, a partir da qual se determina a concentração de composto que produz 50%

de inibição do enzima (valor de IC50). As regressões lineares dos vários compostos encontram-



se no ANEXO 2. Os valores de IC50 para os vários ácidos e seus derivados são expressos em

µg/mL e µM (tabela 2).

Tabela 2 Valores de IC50 dos ácidos e ésteres de colina sintetizados, expressos em µg/mL e µM.

Composto

Inibição de AChE

IC50 (µg/mL) IC50 (µM)

Composto

Inibição de AChE

IC50 (µg/mL) IC50 (µM)

Ácido Cafeico

1000(a)

5551(a)

Cafeato de Colina

34,3±1,9

90,5±5,1

Ácido Cinâmico

1465±92

9885±624

Cinamato de Colina

13,4±1,8

49,8±6,6

Ácido 3,4-

Dimetoxicinâmico

1500(b)

7204(b)


de Colina

2,4±0,3

7,3±0,8

Ácido Rosmarínico

440±26

1222±73


167,3±15,2

299,1±27,2

Trolox

1000(c)

3995(c)

Trolox de Colina

443,4±34,5

1192,7±92,7

(a) máximo que se usou no ensaio, apresentando 25,70±0,07% de inibição.

(b) máximo que se usou no ensaio, apresentando 19,34±0,35% de inibição.

(c) máximo que se usou no ensaio, apresentando 27,27±7,18% de inibição.

O ácido rosmarínico tem boa capacidade de inibição, IC50 = 1,2 mM, relativamente aos outros

ácidos. Todavia, a adição do grupo colina em todos os ácidos originou um aumento drástico na

actividade de inibição do enzima, ou seja, houve uma diminuição do IC50. É o caso do éster de

colina derivado do ácido rosmarínico que apresentou um aumento de 75% na inibição da

actividade.

Os valores obtidos para a inibição de AChE são da mesma ordem de grandeza que os

apresentados com ésteres de colina derivados de aminoácidos, IC50 de 36,9 µM – 1264,3 µM

(Grigoryan et al., 2008). Pelo contrário, quando comparados com o donepezil, IC50 = 11,6 nM



(Camps et al.,2008), estes compostos têm poder de inibição inferior. Equiparando todos os

compostos sintetizados, o 3,4-dimetoxicinamato de colina mostrou ter maior capacidade de

inibir o enzima, IC50 = 7,3 µM. Este possui o grupo catecol protegido com dois grupos metoxi

que é semelhante ao donepezil.

Donepezil hidroclorado (E2020; donepezil) é o segundo fármaco aprovado para o tratamento

de AD. Donepezil faz as principais interacções ao longo da cavidade do local activo do enzima

AChE através dos seus três grandes grupos funcionais: o grupo benzilo, a N-piperidina, e o

grupo dimetoxiindanona (figura 14).

H3CO

H3CO

O

N

Perto do fundo da cavidade, o anel benzilo interage com o grupo indolo do Trp84. Na região de

constrição da cavidade, o azoto da piperidina faz uma interacção π-catião com o grupo fenilo

do Phe330. No topo da cavidade, o anel indanona interactua com o anel indolo do Trp279, no

PAS, através da interacção clássica π-π. Estas observações foram relativas ao TcAChE, no

entanto como este é muito semelhante ao AChE dos mamíferos, poderão ser aplicadas as

mesmas conclusões (Kryger et al., 1999; Camps et al., 2008). As interacções entre o donepezil

e o enzima TcAChE estão representadas na figura 15.

N-piperidina benzilo dimetoxiindanona

Figura 14 Estrutura do donepezil com

evidência aos seus três grupos

funcionais: dimetoxiindanona, N-

piperidina e o grupo benzilo.

(adaptado de Kryger et al., 1999)

Figura 15 Donepezil liga-se ao longo do centro activo e interage

com o PAS no topo da cavidade. Donepezil é exibido a verde semi-

transparente; as moléculas do solvente são as bolas a lilás; os

resíduos da tríade catalítica estão a laranja; e a superfície acessível

ao solvente da cavidade é apresentado a castanho. (retirado de

Kryger et al., 1999)



Dada a semelhança de estrutura do donepezil com o 3,4-dimetoxicinamato de colina, o grupo

do Centro de Química Estrutural do Instituto Superior Técnico realizou estudos de docking

molecular para estudar as interacções dos ésteres de colina com o enzima.

Parece que os potentes inibidores de AChE, como donepezil e 3,4-dimetoxicinamato de colina

são capazes de proteger o local de ligação da ACh ao enzima. Os seus anéis aromáticos são

praticamente coplanares e estão localizados no local de entrada da ACh. Assim, o 3,4-

dimetoxicinamato de colina é capaz de proteger não só o centro activo do enzima com o grupo

amónio como também o local de entrada da ACh através do grupo aromático dimetoxi, tal

como o donepezil. Contrariamente, quando o inibidor não ocupa o local de entrada da ACh, há

um aumento do IC50, isto é, torna-se num inibidor mais fraco. Poderá ser este o motivo pelo

qual os outros compostos não apresentam tão boa actividade inibidora do enzima quando

comparado com o 3,4-dimetoxicinamato de colina.

3. Digestão pelos Sucos Digestivos in vitro

Dado que o enzima AChE actua na junção sináptica neuronal, para que estes compostos

possam actuar como inibidores do enzima AChE é essencial que cheguem intactos ao cérebro,

para actuar a nível de AD. Isto é, não devem ser digeridos/metabolizados pelo tracto digestivo

de modo a serem transportados até ao cérebro, através da corrente sanguínea, tal como são.

Assim, com o objectivo de conhecer as alterações dos compostos que ocorrem ao nível do

tracto digestivo, realizaram-se ensaios de digestão com suco gástrico e suco pancreático

artificiais, in vitro.

O suco gástrico é composto pelo enzima pepsina que é produzido pelas paredes do estômago,

sendo assim possível mimetizar o primeiro passo da digestão. Tem como função quebrar as

proteínas em péptidos mais simples, através da clivagem das ligações peptídicas do lado N-

terminal de aminoácidos aromáticos, como fenilalanina, triptofano e tirosina. Este enzima só

apresenta actividade em meio ácido (pH 1,0).

O suco pancreático é um líquido secretado pelo pâncreas que é constituído por um conjunto

de enzimas, incluindo a tripsina, quimotripsina, elastase, carboxipeptidase, lipase e amilase

pancreática. Ao contrário do suco gástrico, o suco pancreático é de natureza alcalina devido à

elevada concentração de iões bicarbonato. Estes são fundamentais para a neutralização do



ácido gástrico, permitindo uma acção enzimática eficaz. Os enzimas pancreáticos são

responsáveis pela digestão de proteínas – enzimas proteolíticos, pelas gorduras – lipases, e

carbohidratos – amilases. No entanto, alguns dos enzimas proteolíticos do pâncreas são

descritos por terem actividade esterase, tal como tripsina (Ganea et al., 1982) e lipases

(Mattson et al., 1966).

Os resultados dos ácidos e ésteres de colina sintetizados aquando digeridos com os sucos

digestivos estão apresentados na tabela 3. Para cada ensaio de suco digestivo foi considerado

que às 0h existia 100% de composto.

Tabela 3 Percentagem de composto remanescente, ao fim de 4h, dos ácidos e ésteres de colina

sintetizados nos sucos gástrico (SG) e pancreático (SP).

Composto

SG SP

Composto

SG SP

Ácido Cafeico

103,2±5,6

97,9±6,5

Cafeato de Colina

107,5±22,1

7,0±1,0

Ácido Cinâmico

97,1±1,1

93,4±4,2

Cinamato de Colina

89,5±10,4

19,2±7,7

Ácido 3,4-

Dimetoxicinâmico

90,0±22,8

100,8±12,1


de Colina

95,1*

82,8±5,3

Ácido Rosmarínico

99,3±4,5

90,0±2,2


97,6±6,5

40,7±7,2

Trolox

53,3±23,6

100,3±27,3

Trolox de Colina

109,7±12,0

0,3±12,0

* Realizou-se um único ensaio, devido à escassa quantidade de composto.

Como era de esperar, os ácidos não sofreram degradação significativa tanto em meio ácido

como em meio básico, pois não possuem qualquer local de hidrólise para os enzimas presentes

nos sucos. Todavia, o trolox em meio ácido sofreu alguma degradação, ficando apenas 53%



disponível no suco gástrico. No entanto, não foi visível qualquer surgimento de um novo pico

no cromatograma (anexo 3).

Relativamente aos ésteres de colina sintetizados, estes apresentaram igualmente grande

biodisponibilidade no suco gástrico, logo não são degradados pela pepsina nem pelo meio

ácido. Quanto ao suco pancreático, estes exibiram uma degradação variada. Neste estudo

usou-se a pancreatina comercial para simular o suco pancreático que é constituído por

amilase, tripsina, lipase, ribonuclease e protease. Como referido anteriormente, este suco

possui enzimas com actividade esterase pelo que conseguem clivar a ligação éster destes

compostos, como a tripsina e a lipase. Assim, devido à presença destes enzimas, os ésteres de

colina sofreram hidrólise. A diferença de percentagem de degradação dos ésteres poderá estar

relacionada com a maior afinidade ou não para o centro activo do enzima, ou seja, ésteres

com maior afinidade serão mais degradados.

Para se compreender quais seriam os compostos formados durante a digestão pelo suco

pancreático, foram feitas análises por HPLC de amostras retiradas no decorrer do ensaio

enzimático (figura 16).



Figura 16 Cromatogramas das digestões pelo suco pancreático nos tempos 0h e 4h dos ésteres de colina

sintetizados: A – Cafeato de Colina (RT = 6.80). Aparecimento de ácido cafeico (RT = 7.67) ao fim de 4h;

B – Cinamato de Colina (RT = 16.51). Aparecimento de ácido cinâmico (RT = 23.86) ao fim de 4h; C – 3,4-

Dimetoxicinamato de Colina (RT = 17.57). Aparecimento de ácido 3,4-dimetoxicinâmico (RT = 21.14) ao

fim de 4h; D – Trolox de Colina (RT = 28.39). Aparecimento de trolox ao fim de 4h (RT = 24.93); E –

Rosmarinato de Colina (RT = 18.62). Aparecimento de ácido rosmarínico (RT = 17.99) e de ácido cafeico

(RT = 11.81) ao fim de 4h.

-20000

30000

80000

130000

180000

230000

0 10 20 30

Inte

nsi

dad

e (u

AU

)

Tempo (min)

0h

4h

-100000

0

100000

200000

300000

400000

0 10 20 30 40 50

Inte

nsi

dad

e (u

AU

)

Tempo (min)

0h

4h

-100000

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

0 10 20 30 40 50

Inte

nsi

dad

e (u

AU

)

Tempo (min)

0h

4h

-50000

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

0 10 20 30 40 50

Inte

nsi

dad

e (u

AU

)

Tempo (min)

0h

4h

-50000

0

50000

100000

150000

200000

250000

0 10 20 30 40 50

Inte

nsi

dad

e (u

AU

)

Tempo (min)

0h

4h

A B

C D

E

16.51

16.26

23.86

6.80

7.67

17.57

17.31

21.14

18.62

18.84

17.99

11.81

28.39

24.93



Tendo em conta os tempos de retenção (RT), os espectros UV dos compostos detectados por

HPLC (anexo 4) aquando digeridos com suco pancreático e os enzimas presentes no suco pode-

se inferir que o cafeato de colina (RT = 6.80; figura 16-A) degrada-se no seu ácido respectivo

(RT = 7.67), visto que ao fim de 6h aparece o pico correspondente a este. Através da recta de

calibração realizada para o ácido cafeico, a degradação do cafeato de colina deu origem a

227,17 ± 3,66 µM de ácido, restando 7% de cafeato de colina. Semelhantemente, o cinamato

de colina (RT = 16.51 às 0h; figura 16-B) originou o seu ácido respectivo (RT = 23.86) ao fim de

6h, permanecendo 19% do éster. O 3,4-dimetoxicinamato de colina (RT = 17.57 às 0h; figura

16-C) degradou-se no seu ácido correspondente, devido ao aparecimento do pico do ácido (RT

= 21.14). Como realizado para o ácido cafeico, fez-se uma recta de calibração para o ácido 3,4-

dimetoxicinâmico. Assim, a degradação do 3,4-dimetoxicinamato de colina originou 9,40 ±

1,53 µM de ácido 3,4-dimetoxicinâmico, ficando aproximadamente 83% do éster. Igualmente,

o trolox de colina (RT = 24.83; figura 16-D) deu origem ao respectivo ácido, com um

rendimento de hidrólise de 100%, ou seja, degradou-se todo o trolox de colina. No caso do

rosmarinato de colina (RT = 18.62 às 0h; figura 16-E), apareceu o pico correspondente ao ácido

rosmarínico (RT = 17.99), aparecendo 81,08 ± 4,06 µM de ácido rosmarínico. Para além deste

éster se degradar no seu ácido, este por sua vez degrada-se em ácido cafeico (RT = 11.81),

aparecendo assim 18,98 ± 3,90 µM de ácido cafeico. Isto acontece porque o próprio ácido

rosmarínico é um éster do ácido cafeico pelo que também é alvo da acção dos enzimas

pancreáticos. Porém, permaneceu no meio aproximadamente 41% de rosmarinato de colina.

In vivo, para além dos enzimas mencionados, existe também a esterase pancreática (também

conhecida como colesterol esterase) que parece ser o enzima hidrolítico responsável pela

hidrólise de ésteres colesteril e ésteres tocoferol (Mathias et al., 1981). Assim, uma vez que o

trolox é um análogo à vitamina E, o seu derivado éster poderá ser alvo da acção deste enzima.

A quimotripsina também hidrolisa ligações éster e tem como principais substratos os

aminoácidos aromáticos, como fenilalanina, triptofano, tirosina. Como todos os derivados de

colina são ésteres e possuem anéis aromáticos poderão ser alvos da acção deste enzima.

Porém, como o cafeato e cinamato de colina têm anéis aromáticos semelhantes com a tirosina

e fenilalanina, respectivamente, deverão ser os mais degradados. De seguida, surgiria o

rosmarinato de colina, que é semelhante ao cafeato de colina mas com menos degradação,

talvez devido ao seu grande volume. O menos degradado seria o 3,4-dimetoxicinamato de



colina possivelmente porque o seu anel aromático contém dois grupos metoxi sendo assim um

pouco diferente dos anéis aromáticos dos aminoácidos.

De todos estes compostos verifica-se que o 3,4-dimetoxicinamato de colina tem uma baixa

degradação, aproximadamente, 13% no suco pancreático, o que permitirá chegar ao intestino

em larga quantidade de produto, caso fosse tomado por via oral.

4. Síntese do 3,4-Dimetoxicinamato de Colina

De todos os compostos estudados, o 3,4-dimetoxicinamato de colina foi o que apresentou

melhor inibição do enzima AChE e menor degradação. Com o propósito de realizar estudos em

células Caco-2, foi necessário sintetizá-lo novamente para a continuação do trabalho. Como os

compostos sintetizados até esta fase tinham sido sintetizados pelo grupo da Professora Amélia

Santos do IST, descreve-se agora a síntese química do 3,4-dimetoxicinamato de colina

sintetizado desta vez na FCUL, com a metodologia desenvolvida pelo grupo referido.

A síntese deste composto envolve quatro passos fundamentais: a síntese do 3,4-

dimetoxicinamato de metilo (1); a síntese do ácido 3,4-dimetoxicinâmico (2); a preparação da

colina (3); e, a síntese do 3,4-dimetoxicinamato de colina (4). O esquema reaccional desta

síntese encontra-se elucidado na figura 17.

Figura 17 Esquema reaccional da síntese do 3,4-dimetoxicinamato de Colina. Primeiramente, o ácido

cafeico é metilado, originando o 3,4-dimetoxicinamato de metilo (composto 1). De seguida, hidrolisou-

se o éster com NaOH e acidificou-se o meio com HCl, formando-se o ácido 3,4-dimetoxicinâmico



(composto 2). Por fim, depois da colina preparada (composto 3) adicionou-se ao ácido, gerando o 3,4-

dimetoxicinamato de colina (composto 4).

Para se seguir a formação do composto utilizou-se cromatografia em camada fina com sílica,

mediada de fluorescência. As fases móveis usadas foram CHCl3:MeOH 9:1 (X) e

BuOH:HCOOH:H2O 75:14:12 (Y), pois estas permitiram a visualização do aparecimento dos

compostos a sintetizar.

O composto 1 foi obtido através da adaptação do método de Jung et al. (2003). O ácido cafeico

(1g; 5,6mmol) foi metilado com (MeO)2SO2 (3,15mL; 33,3mmol), K2CO3 (4,6029g; 33,3mmol)

em THF (20mL). A mistura reaccional foi aquecida (50-60°C) sob refluxo. Após 43h a reacção

ficou completa. Fez-se uma filtração para remover o K2CO3 e de seguida evaporou-se, no

rotavapor, o THF. Na figura 18 constata-se que na pista 1 o ácido cafeico já não está presente,

convertendo-se na sua totalidade no 3,4-dimetoxicinamato de metilo. Assim, uma vez que a

reacção foi completa, obteve-se 1g de composto 1, apresentando um RF de 0.88 no eluente X

em TLC (figura 18).

O composto 2 foi obtido pela adaptação do método descrito por Bisogno et al. (2007). Para

hidrolisar o éster do composto 1 (0,990g; 4,63mmol) foi adicionado a este 10mL de NaOH 1M

até obter pH 12. Após 2h de agitação, a mistura reaccional foi lavada com éter (2x). Por fim,

acidificou-se o meio de reacção, com algumas gotas de HCl 37% até obter-se um pH de 1-2,

para a precipitação do ácido, extraiu-se com acetato de etilo e o solvente foi evaporado à

secura. Na figura 19 observa-se que, em relação à pista AD, a pista 2 apresenta um arrasto,

pelo que não está completamente puro, obtendo-se 0,551g (2,58mmol; 56%) de composto 2

que apresenta um RF de 0.41 no eluente X em TLC (figura 19). O ácido 3,4-dimetoxicinâmico

(AD) usado como padrão foi o sintetizado previamente pelo grupo IST, tendo sido

caracterizado espectroscopicamente, garantido assim a sua estrutura química.

Figura 18 TLC da reacção de síntese do 3,4-dimetoxicinamato de

metilo (1). Como controlo utilizou-se o ácido cafeico comercial

(AC - banda da esquerda). Eluente usado – CHCl3:MeOH 9:1. AC 1


Este composto sintetizado

identidade. O espectro de 1H

singleto, δ 7.13, 2 dupletos δ

δ 7.53 e δ 6.27, J=16Hz) da cadeia insaturada, apresentando o padrão típico dos derivados

ácido cafeico (Exarchou et al.

dos dois grupos metilo do anel aromátic

Para preparar a colina (3), p

para secar. A este sólido branco foi adicionado SOCl

110°C) sob refluxo durante 3h. O solvente foi evaporado até à secura.

dissolvido em MeOH (3x) e re

O 3,4-dimetoxicinamato de colina clorado (

do IST (artigo a ser escrito)

dioxano-água (3:2) (10mL) e adicionou

água (2mL). Depois de 15min de agitação, foi evaporado à secura. Ao sólido obtido adicionou

se o composto 3 (1g; 6,96mmol). Estes sólidos c

para secar. DMSO foi adicionado à mistura quente e a temperatura foi mantida a 60°C durante

15 dias. DMSO foi destilado e o resíduo foi seco na linha de vácuo.

RF de 0.27 no eluente Y em TLC

3,4-dimetoxicinamato de colina (DC)

grupo IST, tendo sido caracterizado espectroscopicamente, garantido assim a sua estrutura

química.

AD AD+2 2


DQB – FCUL

foi analisado por 1H-NMR (anexo 5), para comprova

H-NMR apresentou os sinais correspondentes aos três protões (1

7.09 e δ 6.90, J=8.4Hz) aromáticos e aos dois protões (2 dupletos,

Hz) da cadeia insaturada, apresentando o padrão típico dos derivados

et al. 2001), e o sinal correspondente aos 6 protões (1

upos metilo do anel aromático.

Para preparar a colina (3), pôs-se colina clorada (1g; 6,96mmol) no liofilizador durante 24h

para secar. A este sólido branco foi adicionado SOCl2 (10mL) e a reacção foi aquecida (100

C) sob refluxo durante 3h. O solvente foi evaporado até à secura. O sólido obtido foi re

dissolvido em MeOH (3x) e re-evaporado até à secura, para eliminar restos de SOCl

toxicinamato de colina clorado (4) foi obtido através do método descrito

do IST (artigo a ser escrito). Pôs-se o composto 2 (0,359g; 1,72mmol) numa mistura de

água (3:2) (10mL) e adicionou-se uma solução de K2CO3 (123,4mg

água (2mL). Depois de 15min de agitação, foi evaporado à secura. Ao sólido obtido adicionou

96mmol). Estes sólidos combinados estiveram um dia no liofilizador


15 dias. DMSO foi destilado e o resíduo foi seco na linha de vácuo. O composto

TLC (figura 20). Tal como para o ácido 3,4-dimetoxicinâmico (AD), o

dimetoxicinamato de colina (DC) usado como padrão foi o sintetizado previamente pelo


Figura 19 TLC da reacção de síntese do ácido 3,4-dimetoxicinâmico.

Aplicou-se o ácido 3,4-dimetoxicinâmico à esquerda (AD); ácido

3,4-dimetoxicinâmico e o composto 2 obtido no meio (AD + 2); e o

composto 2 à direita (2). Eluente usado – CHCl3:MeOH 9:1


43

comprovar a sua

apresentou os sinais correspondentes aos três protões (1

dois protões (2 dupletos,

Hz) da cadeia insaturada, apresentando o padrão típico dos derivados de

2001), e o sinal correspondente aos 6 protões (1 singleto, δ 3.79)

96mmol) no liofilizador durante 24h

(10mL) e a reacção foi aquecida (100-

O sólido obtido foi re-

evaporado até à secura, para eliminar restos de SOCl2.

descrito pelo grupo

72mmol) numa mistura de

4mg; 0,90mmol) em

água (2mL). Depois de 15min de agitação, foi evaporado à secura. Ao sólido obtido adicionou-

ombinados estiveram um dia no liofilizador


O composto 4 apresenta um

dimetoxicinâmico (AD), o

sintetizado previamente pelo


dimetoxicinâmico.

dimetoxicinâmico à esquerda (AD); ácido

obtido no meio (AD + 2); e o

:MeOH 9:1.


Como se observa na figura 20

completa, pelo que na pista 4 é visível a banda correspondente ao

(banda de cima) e ao 3,4-dimetoxicinamato de colina (banda de baixo).

separá-los, o resíduo obtido

Merck. A separação foi efectuada no eluente ACN:H

separação foi conseguida pois verifica

ácido correspondente (banda de cima). N

composto 4 da sílica.

A sílica com o 3,4-dimetoxicinamato de colina foi retirada da placa e

metanol. Após algum tempo de agitação foi filtrada.

se uma TLC dos vários filtrado

dimetoxicinamato de colina (

tempo em metanol, o composto

substituição do resíduo de colina pelo grupo metilo

AD DC 4

AD


DQB – FCUL

Como se observa na figura 20, a reacção de síntese do 3,4-dimetoxicinamato de colina não foi

pelo que na pista 4 é visível a banda correspondente ao ácido 3,4-

dimetoxicinamato de colina (banda de baixo). Com o objectivo de

obtido foi re-dissolvido em CHCl3 e colocado em placas TLC de 1mm da

Merck. A separação foi efectuada no eluente ACN:H2O (3:1). Como é visível n

pois verifica-se a separação do éster de colina (banda de baixo) do

ácido correspondente (banda de cima). No entanto, o problema surgiu na extracção do

oxicinamato de colina foi retirada da placa e foi ressuspendi

pós algum tempo de agitação foi filtrada. Este processo foi repetido três vezes e f

filtrados e todos estes apresentavam um Rf semelhante ao do 3,4

dimetoxicinamato de colina (figura 22-A). Porém, ao fim de algumas extracções

, o composto começou a alterar-se sofrendo uma transesterificação com

substituição do resíduo de colina pelo grupo metilo. Possivelmente devido à fracção

Figura 20 TLC da reacção de síntese do 3,4-dimetoxicinamato de

colina (4). Como controlos utilizaram-se o ácido 3,4

(AD - banda da esquerda) e 3,4-dimetoxicinamato de colina (

banda do centro). Eluente usado – BuOH:HCOOH:H

DC

Figura 21 TLC da separação do

composto 4. A banda superior

corresponde ao ácido 3,4

dimetoxicinâmico (AD)

inferior ao 3,4-dimetoxicinamato

de colina (DC). Eluente usado

ACN:H2O 3:1.


44

dimetoxicinamato de colina não foi

-dimetoxicinâmico

Com o objectivo de

em placas TLC de 1mm da

Como é visível na figura 21, a

se a separação do éster de colina (banda de baixo) do

o problema surgiu na extracção do

ressuspendida em

Este processo foi repetido três vezes e fez-

um Rf semelhante ao do 3,4-

). Porém, ao fim de algumas extracções e de algum

se sofrendo uma transesterificação com

Possivelmente devido à fracção colina ser

dimetoxicinamato de

se o ácido 3,4-dimetoxicinâmico

dimetoxicinamato de colina (DC -

BuOH:HCOOH:H2O 75:14:12.

da separação do

banda superior

corresponde ao ácido 3,4-

(AD) e a banda

dimetoxicinamato

. Eluente usado –


melhor grupo sainte que o grupo metilo

Tal é visível através do aparecimento de uma banda mais hidrófoba (com R

Figura 22 TLC’s da reacção de síntese do 3,4

dimetoxicinamato de colina (DC

sílica, onde se observa o éster pretendido (composto 4).

metanol. O éster sofreu transesterificação, a

composto ficou metilado originando o 3,4

Como não foi possível separar o éster de colina do ácido que lhe deu origem, os estudos

metabolismo nas células Caco

5. Metabolismo pelas células Caco

As células Caco-2 são uma linha de células epiteliais de adenocarcinoma colorrectal humano,

amplamente utilizadas para mimetizar a barreira de células

estudo da digestão nos sucos gástrico e pancreático, o passo seguint

composto em estudo é metabolizado e/ou absorvido pelas células

máxima importância porque para o composto chegar ao cérebro é necessário que ultrapasse a

barreira intestinal, sem sofrer alterações, para poste

Assim, com a finalidade de

absorvido pelas células intestinais

Primeiramente, efectuou-se um ensaio de

composto poderia ser tóxico

verificaria essa toxicidade. Como se utilizou a mistura, 3,4

DC 4 DC


DQB – FCUL

melhor grupo sainte que o grupo metilo, obtendo-se novamente o composto

Tal é visível através do aparecimento de uma banda mais hidrófoba (com Rf superior)

da reacção de síntese do 3,4-dimetoxicinamato de colina. Como controlo usou

dimetoxicinamato de colina (DC - bandas da esquerda). (A) TLC’s de algumas extracções

, onde se observa o éster pretendido (composto 4). (B) TLC da solução após algum tempo em

metanol. O éster sofreu transesterificação, aparecendo uma banda mais hidrofóbica

originando o 3,4-dimetoxicinamato de metilo (banda superior)

Como não foi possível separar o éster de colina do ácido que lhe deu origem, os estudos

metabolismo nas células Caco-2 foram efectuados com a mistura dos dois.

Metabolismo pelas células Caco-2

2 são uma linha de células epiteliais de adenocarcinoma colorrectal humano,

amplamente utilizadas para mimetizar a barreira de células epiteliais intestina

estudo da digestão nos sucos gástrico e pancreático, o passo seguinte é perceber se o

composto em estudo é metabolizado e/ou absorvido pelas células intestinais


barreira intestinal, sem sofrer alterações, para posteriormente entrar na corrente sanguínea.

de compreender se o composto em estudo é metabolizado e/ou

absorvido pelas células intestinais, realizaram-se ensaios de metabolismo com

se um ensaio de toxicidade/viabilidade com o intuito

tóxico para as células e, caso assim fosse, em que concentração se

Como se utilizou a mistura, 3,4-dimetoxicinamato de colina e ácido

(A)

4 DC 4 DC 4


45

se novamente o composto 1 (figura 22-B).

superior).

dimetoxicinamato de colina. Como controlo usou-se 3,4-

de algumas extracções do composto da

ção após algum tempo em

o uma banda mais hidrofóbica, ou seja, o

(banda superior).

Como não foi possível separar o éster de colina do ácido que lhe deu origem, os estudos de

2 são uma linha de células epiteliais de adenocarcinoma colorrectal humano,

intestinais. Ora, feito o

e é perceber se o

intestinais. Esta análise é de


riormente entrar na corrente sanguínea.

é metabolizado e/ou

com células Caco-2.

toxicidade/viabilidade com o intuito de saber se o

, em que concentração se

dimetoxicinamato de colina e ácido

(B)

4

Trimetilado

DC



3,4-dimetoxicinâmico, realizou-se o método do MTT com diferentes concentrações desta.

Verificou-se pelo ensaio do MTT (figura 23) que as células se mantinham viáveis e

metabolicamente activas a qualquer concentração usada. Ou seja, a partir deste estudo,

conseguiu-se confirmar que nem o 3,4-dimetoxicinamato de colina nem o seu ácido respectivo

são tóxicos para as células. Contudo, devido aos grandes desvios padrões observados, o ensaio

de metabolismo pelas células Caco-2 foi efectuado com 0,5 mg/mL da mistura.

Como se pode observar na figura 24, ao fim de 1h há uma ligeira diminuição de ácido 3,4-

dimetoxicinâmico no meio das células, mas depois volta a aumentar. Estas oscilações são

normais se os compostos entrarem e saírem das células. Pelo contrário, o 3,4-

dimetoxicinamato de colina não apresentou qualquer alteração, permanecendo inalterável no

meio (anexo 6).

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Via

bili

dad

e (%

)

[Mistura] (mg/mL)

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6

Bio

dis

po

nib

ilid

ade

(%)

Tempo (h)

Figura 23 Ensaio de viabilidade celular,

pelo método do MTT, aquando exposto

à mistura (3,4-dimetoxicinamato de

colina + ácido 3,4-dimetoxicinâmico).

Análise estatística ANOVA: p > 0,05.

Figura 24 Ensaio de biodisponibilidade

do ácido 3,4-dimetoxicinâmico, presente

na mistura, pelas células Caco-2. Análise

estatística ANOVA: p > 0,05.



Quando ao fim das 6h de ensaio se romperam as células para visualizar o seu interior, as

oscilações observadas do ácido 3,4-dimetoxicinâmico no meio das células puderam ser

explicadas. Na figura 25 está representado o cromatograma do interior das células ao fim das

6h de incubação com a mistura. No cromatograma é bem visível o aparecimento do pico

respeitante ao ácido 3,4-dimetoxicinâmico (RT = 19.80) no interior das células, sendo o pico

com RT = 15.03 correspondente ao composto do meio de cultura, o HBSS.

Actualmente, sabe-se que as células Caco-2 possuem um transportador de ácido

monocarboxílico (MCT). Um grupo carboxilo monoaniónico e uma cadeia apolar ou uma

fracção aromática hidrofóbica parecem ser os componentes necessários para ser substrato do

MCT (Konishi & Kobayashi, 2005). Estudos realizados com os ácidos ferúlico e p-cumárico (ver

estruturas na figura 7) demonstraram que estes são absorvidos através do transportador MCT

(Konishi & Shimizu, 2003; Konishi et al., 2003), uma vez que possuem um grupo carboxilo

monoaniónico e um anel aromático relativamente hidrófobo. No caso do ácido cafeico, este é

preferencialmente absorvido via paracelular mas também é transportado via MCT. No

entanto, como o ácido cafeico é um derivado dihidroxi do ácido cinâmico a afinidade para o

transportador diminui, relativamente aos ácidos acima referidos, pois a região do anel é

menos hidrófoba (Konishi & Kobayashi, 2004). Pelo contrário, o ácido clorogénico (ver

estrutura na figura 7) tem um grupo monocarboxilo na porção do ácido quínico e uma porção

aromática como o ácido cafeico, o que poderia ser um substrato para o MCT. Porém, o grupo

éster parece causar um efeito negativo na interacção com o transportador MCT (Konishi &

Kobayashi, 2004), pelo que este não é transportado via MCT.

Tendo este conhecimento, é possível explicar os resultados obtidos neste estudo. Apesar do

éster 3,4-dimetoxicinamato de colina ter um anel hidrófobo não é transportado via MCT, pois

-30000

-20000

-10000

0

10000

20000

30000

40000

50000

0 10 20 30 40 50Inte

nsi

dad

e (u

AU

)

Tempo (min)

19.80

Figura 25 Cromatograma do interior

das células ao fim de 6h de

incubação com a mistura de 3,4-

dimetoxicinamato de colina e ácido

3,4-dimetoxicinâmico. Aparecimento

do ácido com RT = 19.80. O pico com

RT = 15.03 corresponde ao HBSS

(meio de cultura).

15.03



possui um grupo éster com carga positiva, o que pode ter um efeito impeditivo na interacção

da molécula com MCT. No entanto, o ácido 3,4-dimetoxicinâmico como é um derivado

dimetoxi do ácido cinâmico pode ser transportado pelo MCT e também via paracelular,

entrando, assim dentro das células, como detectado pela análise por HPLC (figura 25).

A ausência de flora intestinal em estudos in vitro faz com que não seja detectável a

permeabilidade dos compostos na barreira intestinal. Em estudos in vivo, a flora intestinal

exibe actividade esterase. Assim, o ácido clorogénico, que não é transportado pelo MCT, pode

ser hidrolisado por uma esterase, formando-se o ácido cafeico que, por sua vez, pode ser

transportado via MCT (Konishi & Kobayashi, 2004). Igualmente, o 3,4-dimetoxicinamato de

colina será susceptível de sofrer hidrólise por uma esterase da flora intestinal, originando o

ácido 3,4-dimetoxicinâmico. Este, por sua vez, pode ser transportado via MCT, entrando assim

para o interior das células, no entanto, perderá deste modo a sua fracção colina necessária à

inibição do enzima AChE.

A utilização do 3,4-dimetoxicinamato de colina conjuntamente com o correspondente ácido foi

favorável ao estudo, pois assim permitiu o conhecimento da entrada do ácido para o interior

das células. O suposto mecanismo para a absorção do ácido 3,4-dimetoxicinâmico e o seu

derivado éster de colina é elucidado na figura 26.

Figura 26 Vias propostas para a absorção de 3,4-dimetoxicinamato de colina.



6. Encapsulamento do Ácido Cafeico em Lipossomas

Uma vez que o 3,4-dimetoxicinamato de colina apresenta actividade inibitória do enzima

AChE, mas não tem actividade antioxidante, a proposta seria fazer chegar ao interior da célula

dois compostos, um com actividade inibidora do enzima e outra com actividade antioxidante,

de modo a que pudessem existir duas funcionalidades que poderia conduzir ao melhoramento

da doença. Deste modo e como o ácido 3,4-dimetoxicinâmico não apresenta actividade

antioxidante, poder-se-ia utilizar o 3,4-dimetoxicinamato de colina com o ácido cafeico que é

um bom antioxidante. Contudo, como os derivados de colina não permeiam a barreira

intestinal, começou-se primeiramente por desenvolver o sistema de lipossomas para o ácido

cafeico para futuramente se poder encapsular a mistura em questão.

As propriedades benéficas dos lipossomas como transportadores de fármacos foram

reconhecidas pela primeira vez nas décadas de 1970 e 1980, e o seu número de aplicações

biofarmacêuticas têm aumentado rapidamente. Lipossomas são, a partir de uma perspectiva

morfológica, mais frequentemente classificados pela sua dimensão e número de bicamadas

membranares (lamelas). As vesículas unilamelares são de especial interesse na investigação,

principalmente devido às propriedades das membranas estarem bem caracterizadas e por ser

de fácil preparação. Elas são divididas em três tipos de tamanho: pequena, grande e gigante

(Jesorka & Orwar, 2008).

Neste estudo, foram preparadas vesículas unilamelares pequenas (SUVs) e grandes (LUVs).

Primeiramente a solução lipídica foi bem seca, formando-se um filme lipídico. Para a formação

de vesículas multilamelares (MLVs), o filme lipídico foi hidratado com um tampão. Os MLVs

formados foram reduzidos através da técnica de extrusão e de sonicação, formando-se LUVs e

SUVs, respectivamente.

Inicialmente, reduziram-se os MLVs a SUVs, através da técnica de sonicação, fazendo-se 5

ciclos de 0.6 com 75% de amplitude, cada ciclo com uma duração de 3 minutos. Pela técnica da

dispersão dinâmica de luz (DLS), determinou-se o perfil de distribuição dos tamanhos dos

lipossomas na solução. Os resultados preliminares da DLS mostraram a existência de um

sistema polidisperso, isto é, com partículas de diferentes tamanhos, com diâmetros que

variam desde poucas dezenas de nanómetros até diâmetros de várias ordens de grandeza

superiores. Isto verifica-se pelo facto das funções de correlação apresentarem a tempos de



correlação baixos, um decaimento exponencial correspondente a partículas mais pequenas

essencialmente com o mesmo tamanho (entre 10 e 30 nm), mas, simultaneamente, para

tempos de correlação muito superiores evidenciaram a existência de processos

correspondentes à dinâmica de partículas, ou aglomerados, de tamanhos de várias ordens de

grandeza superiores ao das partículas mais pequenas. Assim, de modo a recolher os

lipossomas de menores dimensões, fez-se uma filtração de exclusão molecular, com uma

coluna Sephadex LH-20, utilizando tampão PBS como eluente. Seguidamente, analisou-se as 19

fracções por UV-Vis com o intuito de visualizar a presença de ácido cafeico. De todas as

fracções, as fracções 12 e 13 foram as que mostraram espectros mais intensos e bem definidos

(figura 27). Efectivamente, o espectro da fracção 12 é semelhante ao espectro do ácido

cafeico. Todavia, no espectro da fracção 13 observa-se uma dispersão de luz, ou seja, o

espectro é quase idêntico ao do ácido cafeico mas as bandas têm intensidades diferentes, pelo

que se pode inferir que o ácido cafeico se encontra dentro dos lipossomas. Contudo, a partir

deste processo não se conseguiu separar os lipossomas de menores dimensões dos de

maiores.

Figura 27 Espectros de

UV-Vis das fracções 12 e

13 recolhidas. A fracção

12 (em cima) apresenta

um espectro típico do

ácido cafeico, enquanto a

fracção 13 (em baixo)

exibe dois picos de igual

intensidade.



Decidiu-se reduzir os MLVs pela técnica de extrusão utilizando membranas de poro 0,1 µm, de

modo a obter lipossomas de 100 nm – LUVs. No extrusor usado, ao fim de 11 passagens já há

uma grande quantidade de LUVs, tendo-se uma distribuição gaussiana. Assim, quanto mais

passagens se efectuar menor é a variância, pelo que se fez 23 passagens, de forma a conseguir

o maior número possível de LUVs com 100 nm. De seguida, fez-se uma centrifugação a 19 000g

durante 30min com o intuito de separar o ácido cafeico livre do encapsulado. Porém, não se

conseguiu realizar esta separação, pois a solução permaneceu incolor e portanto não sofreu

qualquer alteração, provavelmente devido aos lipossomas terem tamanho reduzido. Logo,

continuou-se o trabalho com a mistura dos dois. Para se conseguir quantificar a absorção de

ácido cafeico encapsulado, efectuou-se um branco que consistiu em células Caco-2 incubadas

com ácido cafeico livre.

Como é visível na figura 28, há uma ligeira diminuição de ácido cafeico no meio das células

Caco-2 ao fim de 6h quando este é encapsulado em lipossomas, de 5,60 para 5,47 µg/mL. Esta

diferença mínima, mas significativa, pode ser o fruto da junção dos lipossomas com a parede

celular, conduzindo à entrada de ácido cafeico para o interior das células. Contudo, estes

resultados não puderam ser confirmados quando se romperam as células (figura 29).

Provavelmente, pode ter entrado uma concentração mínima, a qual não foi detectável pelo

HPLC.

Figura 28 Concentração de ácido

cafeico no meio das células Caco-2 às

0h e 6h de ensaio, quando incubadas

com ácido cafeico encapsulado (e

não-encapsulado) em lipossomas e

ácido cafeico livre. Análise estatística

ANOVA: AC livre p > 0,05; AC

encapsulado p < 0,05.



Não se encontraram na literatura resultados de encapsulamento de ácido cafeico em

lipossomas. No entanto, estudos realizados com o sistema constituído por fosfatidilcolina e

colesterol, semelhante ao utilizado neste trabalho, para encapsular ATP demonstraram que

conseguiam encapsular 0,38 µmol de ATP por µmol de lípido total, ou seja, 38% (mol) (Liang et

al., 2004).

Estes resultados foram promissores, pois demonstraram que o ácido cafeico pode ser mais

facilmente introduzido no interior das células quando dentro de lipossomas, todavia é

necessário ainda muito estudo sobre a elaboração do sistema em questão de modo a

aumentar a quantidade de composto a permear as células. Por outro lado, os ensaios foram

muito preliminares para se avaliar a eficiência de encapsulamento do ácido cafeico, sendo

preciso melhorar o sistema constituído pelos próprios lipossomas e o processo da sua

obtenção.

O sistema aqui utilizado foi escolhido por ser o sistema “clássico” de formação de lipossomas,

sobre o qual existe maior número de referências bibliográficas. Contudo, o sistema com

fosfatidilcolina poderá não ser o mais apropriado para o encapsulamento de 3,4-

dimetoxicinamato de colina, pois poderá haver repulsão electrostática entre as unidades

“colina” do composto e do lípido constituinte do lipossoma e, portanto, seria interessante

utilizar outros sistemas para encapsulamento.

05000

1000015000200002500030000350004000045000

0 10 20 30

Inte

nsi

dad

e (u

AU

)

Tempo (min)

AC livre

AC encapsulado

Figura 29 Cromatograma do interior das

células Caco-2 ao fim de 6h de ensaio,

quando incubadas com ácido cafeico

livre e ácido cafeico encapsulado (e não-

encapsulado) em lipossomas.


Capítulo IV – Conclusão

Conclusão


De todos os compostos fenólicos estudados (ácidos cafeico, cinâmico, rosmarínico, 3,4-

dimetoxicinâmico e trolox), o ácido rosmarínico apresentou maior actividade antioxidante.

Contudo, observou-se que a introdução da fracção colina não afectou o poder antioxidante

dos ésteres quando comparado com os correspondentes ácidos. Porém, a existência da

fracção colina melhorou exponencialmente a actividade inibidora do enzima AChE, obtendo-se

IC50 mais baixos. Assim, de todos os compostos estudados, o 3,4-dimetoxicinamato de colina

foi o inibidor mais potente, apresentando um IC50 = 7,3µM. Este contém um grupo catecol

protegido com grupos metoxi que é semelhante ao fármaco aprovado pela FDA, o donepezil.

Todavia, sabe-se que os componentes da conjugação de ácidos hidroxicinâmicos e colina são

compostos naturalmente não tóxicos, pelo que será mais uma vantagem destes compostos.

A metabolização ao longo do tracto digestivo foi estudada in vitro. Com excepção do trolox,

nenhum composto é degradado no suco gástrico. No suco pancreático, os ácidos não sofreram

praticamente degradação, pelo que se mantiveram presentes no meio. O trolox, rosmarinato,

cinamato e cafeato de colina apresentaram degradação significativa, pois estes devem ter

requisitos para serem substratos dos enzimas pancreáticos. O 3,4-dimetoxicinamato de colina

foi o que apresentou menor degradação aquando digerido com suco pancreático.

Face ao metabolismo e inibição do enzima, o 3,4-dimetoxicinamato apresentou ser o melhor,

pelo que este foi o escolhido para continuação dos estudos de metabolização.

O estudo de metabolização exterior às células Caco-2 e de biodisponibilidade através destas

células foi estudado com o 3,4-dimetoxicinamato de colina em conjunto com o ácido

correspondente. Embora não se tenha observado alterações significativas do ácido 3,4-

dimetoxicinâmico e do éster de colina no meio das células, ao fim das 6h quando se romperam

as células, encontrou-se o ácido dentro do interior destas. Este ácido poderá ter entrado via

paracelular e através do transportador MCT, tal como descrito na literatura para o ácido

cafeico. Como não se visualizou a presença do éster de colina dentro das células, este não

passará pela barreira intestinal, no entanto é um forte candidato a ser metabolizado pela flora

intestinal que contém esterases. Os ensaios preliminares de permeação da barreira intestinal

com lipossomas e ácido cafeico encapsulado, como padrão, demonstraram que os lipossomas

facilitam a entrada do ácido cafeico nas células.

Com estes resultados expostos permite-nos propor a realização de alguns estudos, para

melhorar a compreensão de alguns ensaios.

Conclusão


Primeiramente, deverá se separar o ácido 3,4-dimetoxicinâmico do seu éster de colina com

eficiência para ser possível prosseguir com os estudos. Após obtenção do éster de colina,

verificar os resultados obtidos no ensaio com células Caco-2, ou seja, esclarecer se o 3,4-

dimetoxicinamato de colina é absorvido e/ou metabolizado pelos intestinos, de modo a passar

a barreira intestinal. Caso não se observe a entrada do composto sem sofrer hidrólise,

encapsular este em lipossomas. Para tal, aperfeiçoar a técnica iniciada nesta dissertação,

começando por fazer extrusão com membranas de poros superiores ao usado neste trabalho,

por exemplo 200 ou 400 nm. Assim, é provável que pelo menos seja possível separar o

composto livre do encapsulado. Posteriormente, realizar ensaios em células Caco-2 com os

lipossomas para descobrir se assim o 3,4-dimetoxicinamato de colina passa a barreira

intestinal. Também seria interessante saber se o 3,4-dimetoxicinamato de colina se encontra

nas paredes do lipossoma ou está numa forma solúvel, uma vez que possui a fracção colina.


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Anexos

Anexos


1. Determinação dos EC50

Extinção do radical DPPH em função da concentração de alguns compostos. O valor final de

EC50 é determinado pela média dos três ensaios.

y = 7618,4x + 15,766R² = 0,9932

y = 7615,7x + 15,928R² = 0,9796

y = 7688,4x + 15,955R² = 0,9709

0102030405060708090

100

0 0,005 0,01 0,015

Exti

nçã

o (

%)

[Ácido Cafeico] (mg/ml)

Replicado 1

Replicado 2

Replicado 3

y = 1686,7x + 34,804R² = 0,9679

y = 1291,5x + 32,55R² = 0,9046

y = 1957,1x + 28,13R² = 0,976

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 0,01 0,02 0,03Ex

tin

ção

(%

)[Cafeato Colina] (mg/ml)

Replicado 1

Replicado 2

Replicado 3

y = 18531x + 6,5277R² = 0,9755

y = 17303x + 10,366R² = 0,999

y = 17537x + 10,444R² = 0,9915

0102030405060708090

100

0 0,002 0,004 0,006

Exti

nçã

o (

%)

[Ácido Rosmarínico] (mg/ml)

Replicado 1

Replicado 2

Replicado 3

y = 16170x + 12,863R² = 0,9893

y = 17050x + 7,5294R² = 1

y = 16192x + 10,634R² = 0,9974

0102030405060708090

100

0 0,002 0,004 0,006

Exti

nçã

o (

%)

[Rosmarinato Colina] (mg/ml)

Replicado 1

Replicado 2

Replicado 3

y = 12982x + 5,7868R² = 1

y = 12658x + 9,2719R² = 0,9919

y = 12696x + 8,0411R² = 0,9994

0102030405060708090

100

0 0,002 0,004 0,006 0,008

Exti

nçã

o (

%)

[Trolox] (mg/mL)

Replicado 1

Replicado 2

Replicado 3

y = 2267x + 17,094R² = 0,9894

y = 2157,5x + 20,053R² = 0,9852

y = 2156,8x + 18,883R² = 0,9626

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 0,01 0,02 0,03 0,04

Exti

nçã

o(%

)

[Trolox Colina] (mg/ml)

Replicado 1

Replicado 2

Replicado 3

Anexos


2. Determinação dos IC50

Inibição do enzima AChE em função da concentração de alguns compostos. O valor final de IC50

é determinado pela média dos três ensaios.

y = 44,422x - 15,794R² = 0,8354

y = 61,299x - 33,677R² = 0,9704

0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0

100,0

0 1 2 3

Inib

ição

(%

)

[Ácido Cinâmico] (mg/mL)

Replicado 1

Replicado 2

Replicado 3

y = 1771,7x + 29,415R² = 0,8655

y = 1132,9x + 34,639R² = 0,9822

y = 2214,7x + 16,411R² = 0,9548

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 0,01 0,02 0,03 0,04In

ibiç

ão (

%)

[Cinamato Colina] (mg/mL)

Replicado 1

Replicado 2

Replicado 3

y = 979,42x + 14,376R² = 0,9986

y = 940,62x + 17,929R² = 0,9545

y = 980,35x + 18,102R² = 0,8551

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 0,02 0,04 0,06

Inib

ição

(5

)

[Cafeato Colina] (mg/mL)

Replicado 1

Replicado 2

Replicado 3

y = 191,78x + 21,03R² = 0,9626

y = 232,52x + 10,563R² = 0,8977

y = 254,69x + 3,836R² = 0,9974

0102030405060708090

0 0,1 0,2 0,3 0,4

Inib

ição

(%

)

[Rosmarinato Colina] (mg/ml)

Replicado 1

Replicado 2

Replicado 3

y = 89,428x + 7,0466R² = 0,988

y = 113,33x + 3,3048R² = 0,9989

y = 107,22x + 3,0385R² = 0,9965

0

10

20

30

40

50

60

70

0 0,2 0,4 0,6

Inib

ição

(%

)

[Trolox Colina] (mg/ml)

Replicado 1

Replicado 2

Replicado 3

Anexos


3. Cromatograma do Trolox após digestão gástrica

Cromatograma do Trolox aquando digerido pela pepsina presente no suco gástrico artificial. O

pico com RT = 25.14 corresponde ao trolox, não havendo aparecimento de outro pico.

-20000

-10000

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

0 10 20 30 40 50

Inte

nsi

dad

e (u

AU

)

T (min)

25.14

Anexos


4. Espectros UV detectados por HPLC

Espectros UV dos compostos detectados por HPLC do cafeato de colina (A), cinamato de colina

(B), 3,4-dimetoxicinamato de colina (C), rosmarinato de colina (D/E) e trolox de colina (F)

aquando digeridos com suco pancreático. Os tempos de retenção (RT) dos compostos estão

indicados em minutos.

0100000200000

300000400000500000600000700000800000

200 300 400 500 600

Ab

sorv

ênci

a

Comprimento de onda (nm)

Cafeato Colina - RT: 7.67

-500000

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

200 300 400 500 600

Ab

sorv

ênci

a


Cinamato Colina - RT: 23.86

A

B

Anexos


-150000

-100000

-50000

0

50000

100000

200 300 400 500 600

Ab

sorv

ênci

a


3,4-Dimetoxicinamato Colina - RT: 21.14

-200000

20000400006000080000

100000120000140000160000

200 300 400 500 600

Ab

sorv

ênci

a


Rosmarinato Colina - RT: 11.81

-100000

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

200 300 400 500 600

Ab

sorv

ênci

a


Rosmarinato Colina - RT: 17.99

C

D

E

Anexos


-100000

0

100000

200000

300000

400000

500000

200 300 400 500 600

Ab

sorv

ênci

a


Trolox Colina - RT: 24.74

F


5. Espectro de 1H-NMR do Ácido 3,4

Espectro de NMR de 1H do ácido 3,

apresenta os sinais correspondentes aos três protões (1 singleto

6.90, J=8.4Hz) aromático, aos dois protões (2 dupletos,

insaturada e o sinal correspondente aos 6 protões (1

do anel aromático.

DQB – FCUL

NMR do Ácido 3,4-Dimetoxicinâmico

H do ácido 3,4-dimetoxicinâmico (composto 2), em MeOD.

os sinais correspondentes aos três protões (1 singleto, δ 7.13, 2 dupletos

aos dois protões (2 dupletos, δ 7.53 e δ 6.27, J=16

insaturada e o sinal correspondente aos 6 protões (1 singleto, δ 3.79) dos dois gr

Anexos

69

dimetoxicinâmico (composto 2), em MeOD. O espectro

3, 2 dupletos δ 7.09 e δ

6.27, J=16Hz) da cadeia

dois grupos metilo

Anexos


6. Ensaio de biodisponibilidade pelas células Caco-2

Ensaio de biodisponibilidade do 3,4-dimetoxicinamato de colina, presente na mistura, pelas

células Caco-2, ao longo de 6h de ensaio.

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6

Bio

dis

po

nib

ilid

ade

(%)

Tempo (h)

Documents

ESTUDOS DE ACTIVIDADE INIBIDORA DE …repositorio.ul.pt/bitstream/10451/3530/1/ulfc055722_tm_Susana... · Estudos de Actividade Inibidora de Acetilcolinesterase e Actividade Antioxidante