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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO Stricto sensu EM CIÊNCIAS APLICADAS A
PRODUTOS PARA SAÚDE (PPG-CAPS)
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO
DESENVOLVIMENTO DE PRODUTOS PARA SAÚDE
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DA ESPÉCIE VEGETAL
Manilkara subsericea (Mart.) Dubard
Caio Pinho Fernandes
Orientador: Prof. Dr. Leandro Machado Rocha
Niterói – RJ
2011
II
Caio Pinho Fernandes
Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal Manilkara subsericea
(Mart.) Dubard
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG-CAPS)
da Universidade Federal Fluminense, como
parte dos pré-requisitos para obtenção do grau
de mestre. Área de Concentração:
Desenvolvimento de Produtos para Saúde
Orientador: Prof. Dr. Leandro Machado Rocha
Niterói – RJ
2011
F363 Fernandes, Caio Pinho
Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal Manilkara
Subsericea (Mart.) Dubard) / Caio Pinho Fernandes. -- Niterói, 2011.
75f.
Orientador: Dr.Leandro Machado Rocha
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal Fluminense.
Faculdade de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em
Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde. – UFF, 2011.
Bibliografia: f. 67-75
1.Química orgânica. 2.Estudo fitoquímico.
3.Fracionamento guiado. 4.Manilkara subsericea. I.Rocha, Leandro
III
FOLHA DE APROVAÇÃO
Caio Pinho Fernandes
Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal Manilkara subsericea (Mart.) Dubard
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG-CAPS)
da Universidade Federal Fluminense, como
parte dos pré-requisitos para obtenção do grau
de mestre. Área de Concentração:
Desenvolvimento de Produtos para Saúde
Aprovada em
_________________________________________
Prof. Dr. Leandro Machado Rocha – Orientador
Faculdade de Farmácia – UFF
____________________________________________
Prof. Dr. Adriana Cortadi
Universidad Nacional de Rosario – UNR (ARG)
____________________________________________
Prof. Dr. José Luiz Pinto Ferreira
Faculdade de Farmácia – UFF
____________________________________________
Prof. Dr. Ricardo Machado Kuster
Núcleo de Pesquisa de Produtos Naturais – UFRJ
IV
Este trabalho foi realizado sob
orientação do Prof. Dr. Leandro
Machado Rocha
V
Dedico este trabalho aos meus
pais e a minha irmã, pelo apoio e
suporte que me têm dado ao longo
de toda a vida
VI
Não há vegetal algum que não
mereça ocupar a atenção de um
verdadeiro sábio; nenhum há, por
mais desprezível que pareça, de
que não se possa esperar alguma
utilidade.
(Frei Veloso)
VII
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Luiz Carlos Fernandes e Luizaura Pinho Fernandes, pelo apoio irrestrito
e amor incondicional.
À minha irmã Laís Pinho Fernandes, pelo caráter, amizade e exemplo que sempre
demonstrou.
Às minhas vós Aurora e Lacy, minha tia Laurinha e demais familiares, por demonstrar o
significado mais puro de uma família unida, tão presente em minha vida.
Ao meu orientador e grande amigo Prof. Leandro Machado Rocha, pelos valorosos
ensinamentos científicos e amizade.
Aos amigos do Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais (LTPN-UFF), Jonathas,
Rodrigo, Otávio, Henrique, José Carlos, Ricardo, Hildegardo, Iraí, Arthur, Luis Armando,
Adriana, Raquel, Bárbara, Gisele, Mariana, Ana Clara, Fernanda, pelo apoio e amizade, além
de contribuírem firmemente no meu caminho de aprendizado sobre as plantas.
Ao Prof Marcelo Guerra, pela amizade e grande ajuda durante as coletas na restinga.
Às Professoras Adriana Cortadi e Martha Gattuso, pelos ensinamentos e modo
extremamente acolhedor com que me receberam em seu laboratório.
Ao Professor José Luis Pinto, pelos ensinamentos desde a época de graduação e por ser
um exemplo de profissional.
À Professora Denise Feder e demais professores e alunos do Laboratório de Biologia
de Insetos do GBG/UFF, pelo grande auxílio e ensinamentos.
Aos Professores e funcionários vinculados ao Programa de Pós Graduação em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde (PG-CAPS)e da Faculdade de Farmácia da UFF, em
especial à coordenadora Profª Kátia Lima, pelo suporte dado ao longo do trabalho realizado.
À CAPES pelo suporte financeiro.
Muito Obrigado
VIII
RESUMO
FERNANDES, Caio Pinho. Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal Manilkara
subsericea (Mart.) Dubard. Niterói, 2011. Dissertação (Mestrado em Ciências Aplicadas a
Produtos para Saúde, Universidade Federal Fluminense.
Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (Sapotaceae) é popularmente cohecida no Brasil
como “guracica”. Neste trabalho, é descrito o fracionamento bioguiado pelo ensaio para inibidores
da acetilcolinesterase de uma mistura contendo acetato de beta-amirina e acetato de alfa-amirina e
a obtenção de uma mistura de ácido ursólico e ácido oleanólico. Esta é a primeira vez que a
atividade anticolinesterásica de uma mistura contendo acetato de beta amirina (76,3%) e acetato
de alfa amirina (23,7%) é descrita. Também foi verificada a eficiência de extratos de polaridade
distintas e da misturas dos acetatos de beta e alfa amirina no desenvolvimento de duas espécies de
insetos (Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus). O extrato etanólico de folhas e os
extratos hexânico, diclorometânico, acetato de etila e butanólico provenientes da partição
realizada com o extrato etanólico bruto de frutos foram capazes de induzir mortalidade, atraso
no desenvolvimento e inibição da muda. Além disso, os extratos hexânico, diclorometânico e
butanólico, causaram mal formação em insetos adultos. Estes resultados indicam que extratos
de M. subsericea atuam como inibidores do crescimento de fitófagos e que o acetato de beta
amirina e acetato de alfa amirina podem ser utilizados como potenciais marcadores químicos
em possíveis formulações de produtos para controle de pragas agrícolas. Extratos e fração
obtida de M. subsericea foram testados frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 e
Escherichia coli ATCC 25922. O extrato etanólico de folhas, extrato etanólico de caules,
extrato hexânico de caules, extrato diclorometânico de caules, extrato acetato de etila de
caules, extrato butanólico de caules, extrato hexânico de frutos, extrato diclorometânico de
frutos e a mistura dos acetatos de beta e alfa amirina mostraram atividade frente a S. aureus.
Somente o extrato etanólico de caules apresentou atividade frente a E. coli. Este é o primeiro
estudo sobre atividade biológicas e fitoquímico de M. subsericea e esperamos com estes
resultados, contruir para a valorização desta espécie.
Palavras-chave: Acetilcolinesterase, atividade antibacteriana, fitófagos, Manilkara subsericea,
Restinga de Jurubatiba, triterpenos.
IX
ABSTRACT
FERNANDES, Caio Pinho. Phytochemical and biological study of the vegetal species
Manilkara subsericea (Mart.) Dubard. Niterói, 2011. Dissertação (Mestrado em Ciências
Aplicadas a Produtos para Saúde, Universidade Federal Fluminense.
Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (Sapotaceae) is popularly known in Brazil as
“guracica”. In the present study, it is reported the bioguided fractionation by the bioassay for
anticholinesterase inhibitors of a mixture containing beta-amyrin acetate and alpha-amyrin
acetate and the achievement of a mixture containing oleanolic acid and ursolic acid. This was
the first time that the anticholinesterasic activity of a mixture containg the triterpenes beta-
amyrin acetate (76.3%) and alpha-amyrin acetate (23.7%) was described. We also evaluated
the efficacy of extracts with distinct polarity and of the mixture of beta- and alpha-amyrin
acetate from Manilkara subsericea on the development of two species of agricultural pest
insects (Oncopeltus fasciatus and Dysdercus peruvianus). The etanolic extract from leaves,
the hexanic extract, dichloromethanic extract, ethyl acetate extract and buthanolic extract
from fruits were able to induce mortality, delay development and molt inhibition. These
results indicate that M. subsericea extracts acts as a potent growth inhibitor of phytophagous
hemipteran nymphs and indicates that beta- and alpha-amyrin acetate can be used as chemical
markers for possible formulations of products to be used in control programs against crop
pests. On the present study we tested M. subsericea extracts against Staphylococcus aureus
ATCC 25923 e Escherichia coli ATCC 25922. The ethanolic extract from leaves, ethanolic
extract from stems, hexanic extract from stems, dichloromethanic extract from stems, ethyl
acetate extract from stems, buthanolic extract from stems, hexanic extract from fruits,
dichloromethanic extract from fruits and a mixture of beta- and alpha amyrin acetates showed
activity against S. aureus, with exception of the the ethyl acetate extract and buthanol extract
from fruits. Only the ethanolic extract from stems showed activity against E. coli. This is the
first contribution about phytochemistry and biological activities of M. subsericea and we
hope that these results contribute for preservation of this species.
Keywords: Acetylcholinesterase, antibacterial activity, phytofagous, “Restinga de
Jurubatiba”, triterpenes.
X
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Ilustração da localização do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba 2
Figura 2. Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba 3
Figura 3. A) Ilustração de Manilkara subsericea 7
B) foto de caule, folhas e frutos coletados no Parque Nacional da Restinga de
Jurubatiba
Figura 4. Manilkara subsericea (Mart.) Dubard 8
Figura 5. Desenho botânico de Manilkara subsericea 10
Figura 6. Manilkara subsericea situada no Parque Nacional da restinga de Jurubatiba 11
Figura 7. Formato cabeça-cauda de unidade isoprênica 12
Figura 8. Rota biossintética de formação de terpenóides 13
Figura 9. Esquema de formação de terpenóides por encadeamento cabeça-cauda e
cauda-cauda 14
Figura 10. Exsicata de M. subsericea coletada na Restinga de Jurubatiba, RJ, Brasil em
janeiro de 2009 17
Figura 11. Esquema de partição dos extratos etanólicos de frutos e caules 19
Figura 12. Fracionamento do extrato hexânico resultante da partição do extrato 21
etanólico de frutos
Figura 13. Reação colorimétrica de formação da substância azólica (roxa) que ocorre 25
no ensaio anticolinesterásico qualitativo
Figura 14. Cromatografia em camada fina de extratos e fração obtida de M. subsericea. 27
Figura 15. Cromatografia em camada fina das frações FH1X e FH1Y obtidas do 28
extrato hexânico de frutos de M. subsericea.
Figura 16. Cromatografia em camada fina da fração FH2P obtida do extrato 29
hexânico de frutos de M. subserica.
Figura 17. Cromatograma obtido por CG-EM do extrato hexânico (FH) resultante da 30
partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea
XI
Figura 18. Cromatograma obtido por CG-EM da fração FH1X obtida do extrato 34
hexânico (FH) resultante da partição efetuda no extrato etanólico de
frutos de M. subsericea.
Figura 19. Espectro de massas de A + B (17 e 18). 35
Figura 20. Fragmentação característica de triterpenos pentacíclicos (série oleano) com 35
dupla ligação na posição C-12, via reação Retro-Dies-Alder
Figura 21. Fragmentação característica de triterpenos pentacíclicos (série ursano) com 36
dupla ligação na posição C-12, via reação Retro-Dies-Alder
Figura 22. Espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 300 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18) 38
Figura 23. Expansão δ (2,02-2,08) do espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 38
300 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)
Figura 24. Expansão δ (4,40-4,60) do espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 39
300 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)
Figura 25. Expansão δ (5,02-5,30) do espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 40
300 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)
Figura 26. Espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 75 MHz; CDCl3) de A+B. 41
Figura 27. Expansão δ (121-145) do espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 43
75 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)
XII
Figura 28. Expansão δ (75-82) do espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 43
75 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)
Figura 29. Expansão δ (164-176) do espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 44
75 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)
Figura 30. Espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 500 MHz; CDCl3) de 47
C+D (19 e 20)
Figura 31. Espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 125 MHz; CDCl3) de 48
C+D (19 e 20)
Figura 32. Expansão δ (67-89 ) do espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 49
125 MHz; CDCl3) de C+D (19 e 20)
Figura 33. Expansão δ (121-145) do espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 50
125 MHz; CDCl3) de C+D (19 e 20)
Figura 34. Expansão δ (179-183) do espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 51
125 MHz; CDCl3) de C+D (19 e 20)
Figura 35: Avaliação da CMI de M. subsericea frente à S. aureus 25923. 53
Figura 36. Ensaio bioautográfico para inibidores da acetilcolinesterase 56
Figura 37. Limites de detecção no ensaio bioautográfico para inibidores 57
da acetilcolinesterase por uma mistura contendo 76,3% de
acetato de beta amirina e 23,7% de acetato de alfa amirina
XIII
Figura 38. Influência de fatores externos na produção de metabólitos secundários 59
Figura 39. A) D.peruvianus adulto saudável 60
B) D. peruvianus tratado com extrato hexânico de M. subsericea
com mal formação na asa e cutícula enrugada (estágio adulto)
XIV
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Ácidos graxos e ésteres presentes no extrato hexânico 31
resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea
Tabela 2. Deslocamentos químicos de RMN 13
C (ppm, CDCl3) característicos 42
dos átomos de carbono oxigenados dos triterpenos mais freqüentes
Tabela 3. Comparação de deslocamento químicos de 13
C de A e B (17 e 18) 45
(Varian VNMRS; 75 MHz, CDCl3) obtidos defrutos de M. subsericea com acetato
de beta amirina e acetato de alfa amirina.
Tabela 4. Comparação de deslocamentos químicos de RMN de 13
C de C+D (19 e 20) 52
(Varian VNMRS 125 MHz; CDCl3) obtidos de frutos de M. subsericea e comparação
com ácido ursólico e ácido oleanólico
Tabela 5. Atividade antibacteriana de extratos e fração obtida de M. 54
subsericea frente a S. aureus e E. coli
Tabela 6. Avaliação da atividade biológica de extratos de M. subsericea no 61
desenvolvimento de Dysdercus peruvianus
Tabela 7. Avaliação da atividade biológica de extratos de M. subsericea no 63
desenvolvimento de O. fasciatus
XV
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
ATCC American Type Culture Collection
CAE Extrato acetato de etila de caules
CB Extrato butanólico de caules
CCF Cromatografia em camada fina
CD Extrato diclorometânico de caules
CDCl3 Clorofórmio deuterado
CE Extrato etanólico de caules
CE50 Concentração Efetiva Mediana
CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas
CH Extrato hexânico de caules
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
cm Centímetro
CMI Concentração Mínima Inibitória
DMAPP Pirofosfato de dimetilalila (do inglês: Dimethylallyl pyrophosphate)
DMSO Dimetilsulfóxido
DPPH 2,2- difenil-1-picril-hidrazila
eV Elétron-volt
FAE Extrato acetato de etila de frutos
FB Extrato butanólico de frutos
FD Extrato diclorometânico de frutos
FDA U.S. Food and Drug Administration
XVI
FE Extrato etanólico de folhas
FH Extrato hexânico de frutos
FH1 Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH)
FH1X Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH)
FH1Y Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH)
FH2 Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH)
FH2P Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH)
g Grama
h Hora
H2O Água
IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis
IPP Pirofosfato de isopentenila (do inglês: Isopentenyl pyrophosphate)
J Constante de acoplamento
kg Quilograma
m Metro
M Molar
mg Miligrama
MHA Ágar Mueller-Hinton
MHz MegaHertz
min Minuto
mL Mililitro
MeOH Metanol
XVII
mm Milímetro
mM Milimolar
m/z relação massa/carga
NIST National Institute os Standards and Technology
p Para
PPM Parte por milhão
Rf Fator de retenção (do inglês: retention factor)
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN 13
C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono
SISBIO Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade
TSA Trypticase soy Agar
TTC cloreto de trifenil tetrazolium
U Unidade
UFC Unidade formadora de colônia
v/v Volume por volume
μm Micrômetro
μg Micrograma
μL Microlitro
α Alfa
β Beta
°C Graus celsius
XVIII
% Percentual
δ Deslocamento químico
XIX
SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO 1
1.1 – O ecossistema de restinga 1
1.2 – O gênero Manilkara 3
1.2.1 - Atividades Biológicas 3
1.2.1.1 - Atividade antibacteriana 4
1.2.1.2 - Atividade antiparasitária 4
1.2.1.3 - Atividade antioxidante 5
1.2.1.4 - Atividade citotóxica 6
1.2.2 - Manilkara subsericea (Mart.) Dubard 7
1.3 – Triterpenos 12
2 – OBJETIVO 16
2.1 – Objetivo geral 16
2.2 Objetivos específicos 16
3 – MATERIAIS E MÉTODOS 17
3.1 - Material Vegetal 17
3.2 – Solventes 18
3.3 - Extratos e partições 18
XX
3.4 – Ensaios fitoquímicos 19
3.4.1 – Cromatografia em Camada Fina (CCF) 19
Escala analítica 19
Escala preparativa 19
3.4.2 – Reveladores 20
3.4.3 – Fracionamento do extrato hexânico de frutos 20
3.5 – Elucidação estrutural 21
3.5.1 - Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM) 21
3.5.2 – Espectro de Ressonância Magnética Nuclear 22
3.6 - Atividade antibacteriana 22
Microrganismos 22
Preparação da suspensão bacteriana 22
3.6.1 - Método de difusão em disco 23
3.6.2 - Concentração Mínima Inibitória (CMI) 23
3.7. – Atividade anticolinesterásica 24
3.7.1 – Teste de Bioautografia 24
XXI
3.8 – Avaliação da atividade inseticida 25
3.8.1 – Colônias 25
3.8.2 – Bioensaio 26
4 – RESULTADOS E DISCUSSÂO 27
4.1 - Análise química dos extratos e substâncias isoladas 27
4.1.1 - Cromatografia em camada fina 27
4.2 - Elucidação estrutural 30
4.2.1 - Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas 30
4.2.1.1 - Análise do extrato hexânico 30
4.2.1.2 - Análise de FH1X 34
4.2.2 – Ressonância Magnética Nuclear 36
4.2.2.1 – A+ B (17 e 18) 36
4.2.2.2 – C+D (19 e 20) 46
4.3 – Atividade antibacteriana 53
4.4 – Atividade anticolinesterásica 55
4.5 - Atividade inseticida 58
5 – CONCLUSÃO 65
6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 67
1
1 – INTRODUÇÃO
1.1 – O ecossistema de restinga
O Estado do Rio de Janeiro é caracterizado por uma grande diversidade de
ecossistemas. A parte litorânea apresenta costas rochosas, mangues, restingas e lagos,
enquanto a parte continental apresenta uma vasta planície que se estende até uma área
montanhosa composta pela Serra dos Órgãos, das Araras e da Mantiqueira. A vegetação que
ocupa essas áreas é bem diversificada e inclui desde uma parte remanescente da Mata
Atlântica até a vegetação típica de restinga (KELECOM et al., 2002).
As restingas são caracterizadas por se distribuírem ao longo dos cordões litorâneos,
formados por sedimentos marinhos de origem quaternária ao longo da planície costeira
(MARQUES & OLIVEIRA, 2004) e correspondem a 79% da área do litoral brasileiro
(PESSOA et al., 2008). Estes ambientes são caracterizados por baixa disponibilidade de
recursos, principalmente em função de seus solos arenosos que possuem baixa capacidade de
retenção de água e nutrientes. A natureza das respostas das plantas à variação na
disponibilidade de recursos e condições ambientais é em grande parte modulada por
características morfológicas e fisiológicas (ROSADO & DE MATTOS, 2007), o que se torna
especialmente interessante quando consideramos que diversos fatores podem coordenar ou
alterar a taxa de produção de metabólitos especiais (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).
O Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba, criado em 29 de abril de 1998, está
situado entre as coordenadas 22º e 22º23‟S e 41º15‟ e 41º45‟W (figura 1) e abrange três
municípios: Macaé, Carapebus e Quissamã. A planície quaternária possui superfície
relativamente plana, com altitude máxima de aproximadamente 12 m e inclina-se suavemente
rumo ao Oceano Atlântico. Entre as antigas cristas praiais, encontram-se áreas inundáveis. A
distribuição das chuvas é fortemente sazonal, com mínima mensal no inverno (41 mm) e
máxima no verão (189 mm) (SANTOS et al., 2004).
2
Figura 1. Ilustração da localização do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (SANTOS
et al., 2004)
Segundo Henriques et al. (1986), a família Guttiferae, juntamente com as famílias
Myrtaceae, Leguminosae, Apocynaceae, Malpighiaceae, Ericaceae, Erythroxylaceae,
Bromeliaceae, Cactaceae, Humiriaceae e Sapotaceae são as mais representativas na Restinga
de Carapebus. Um levantamento etnobotânico das espécies utilizadas pela população local,
demonstrou o uso de 117 espécies, pertencentes a 99 gêneros e 47 famílias vegetais
(SANTOS et al., 2009)
O manejo sustentável das espécies locais pode trazer benefícios significativos para a
população e ao mesmo tempo preservar os recursos biológicos desta flora (GRIMES et al.,
1994). Portanto, a valorização do conhecimento popular aliado ao conhecimento do potencial
biotecnológico das espécies existentes no local, contribui para a preservação da
biodiversidade existente no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (figura 2).
3
Figura 2. Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (Fonte:Próprio autor)
1.2 – O gênero Manilkara
A família Sapotaceae é composta por aproximadamente 55 gêneros e 800 espécies,
dos quais podemos citar: Chrysophyllum, Pouteria, Sideroxylon e Manilkara (WATSON &
DALLWITZ, 1992). As espécies desta família são caracterizadas por apresentar uma
variedade de classes de substâncias, como triterpenos, esteróides, saponinas, polifenóis, além
de alcalóides, carotenóides, compostos cianogênicos e ácidos graxos (BELTRÃO, 2000;
PERFEITO et al., 2005; MONTENEGRO et al., 2006; BARBOSA-FILHO et al., 2008).
O gênero Manilkara é constituído por aproximadamente 35 espécies de hábito arbóreo
e arbustivo, distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais (GOMES et al., 2010). Estudos
realizados com espécies deste gênero indicaram a presença de flavonóides, ácidos fenólicos,
saponinas e triterpenos (MA et al., 2003; LAVAUD et al., 1996; MISRA & MITRA, 1969).
1.2.1 - Atividades Biológicas
Espécies do gênero Manilkara têm sido utilizadas popularmente como plantas
medicinais no tratamento de inflamações, febre, hemorragia pós-parto, dores de estômago e
como cicatrizante. Estudos realizados com espécies deste gênero demonstraram diversas
atividades, como antibacteriana, antiparasitária, antitumoral e antioxidante (CÁCERES et al.,
4
1995; DESRIVOT et al., 2007; MA et al., 2003; EIBOND et al., 2004; LEONTI et al., 2002;
COE, 2008). Os estudos de bioatividade geralmente são realizados com as frações e extratos
brutos, porém muitos estudos são realizados com as substâncias puras, obtidas a partir do
isolamento guiado pela atividade biológica.
1.2.1.1 - Atividade antibacteriana
Em um estudo realizado na Guatemala, extratos de diferentes plantas utilizadas
popularmente no tratamento de doenças sexualmente transmissíveis foram avaliadas quanto às
suas atividades in-vitro frente a Neisseria gonorrhoeae, visando a confirmação do uso
popular. O extrato etanólico do caule da espécie Manilkara achras (Mill.) Fosberg [=
Manilkara zapota (L.) P. Royen] apresentou um halo de inibição de 8,5 ± 0,1 mm quando
testado frente a uma cepa de Neisseria gonorrhoeae resistente à penicilina e apresentou um
espectro de inibição de 80 % quando testado frente a cinco cepas de Neisseria gonorrhoeae
isoladas recentemente de pacientes clínicos (CÁCERES et al., 1995).
Na Índia, o caule de Manilkara zapota L. é utilizado como antibiótico e seu decocto
indicado no tratamento da diarréia. A atividade antibacteriana frente a diferentes cepas de
bactérias foi avaliada com extratos aquosos e etanólicos do caule desta espécie. Os extratos
etanólicos se mostraram ativos frente à cepas de Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S.
subflava, Bacillus cereus, B. subtilis, B. megaterium, Micrococcus flavus, Pseudomonas
testosteroni, P. aeruginosa, P. pseudoalcaligenes, Proteus vulgaris, P. mirabilis, P. morganii,
Alcaligenes faecalis, Enterobacter aerogenes, Salmonella typhimurium, Klebsiella
pneumoniae, Escherichia coli, Citrobacter freundii enquanto os extratos aquosos
apresentaram uma menor atividade (NAIR & CHANDA, 2008).
1.2.1.2 - Atividade antiparasitária
Um estudo realizado com diversas espécies vegetais para avaliação de atividade
biológica frente a Leishmania donovani, Trypanosoma brucei brucei, Trichomonas vaginalis
e Caenorhabditis elegans indicam que o extrato diclorometânico de Manilkara dissecta var.
pancheri (Baillon) Maas foi ativo frente a Leishmania donovani, com uma concentração
mínima inibitória de 13,4±1,1 μg / mL (DESRIVOT et al., 2007).
5
A Doença de Chagas é um problema de saúde pública em diversos países latino americanos.
Seu tratamento hoje em dia ainda é um desafio, visto que os únicos dois medicamentos
aprovados, nifurtimox e benzonidazol, possuem vários efeitos adversos. Em estudo realizado
com diversas espécies vegetais latino americanas, o extrato aquoso do caule de Manilkara
achras (Mill.) Fosberg [= Manilkara zapota (L.) P. Royen] apresentou um percentual de
inibição de 78,8 % do crescimento de epimastigotos de Trypanosoma cruzi quando usado na
concentração de 500 μg / mL (MUELAS-SERRANO et al., 2000).
1.2.1.3 - Atividade antioxidante
Nos últimos anos, uma quantidade substancial de evidências tem indicado o papel
chave dos radicais livres e outros oxidantes como grandes responsáveis pelo envelhecimento e
doenças degenerativas associadas, como câncer, doenças cardiovasculares,
catarata, declínio do sistema imune e disfunções cerebrais. Em função dos possíveis
problemas provocados pelo consumo de antioxidantes sintéticos, as pesquisas têm-se voltado
no sentido de encontrar produtos naturais com atividade antioxidante (SOUSA et al., 2007).
Em estudo realizado com diversas espécies comestíveis, os frutos de Manilkara zapota
foram submetidos a extração exaustiva com metanol, concentrados a vácuo, ressuspendidos
em água e posteriormente particionados com hexano e acetato de etila. Em seguida, a fração
aquosa foi submetida ao fracionamento em coluna Diaion HP-20SS. A fração H2O:MeOH
obtida foi utilizada para determinação da atividade antioxidante através do ensaio com o
radical livre 2,2- difenil-1-picril-hidrazila (DPPH). A quantidade necessária para decrescer a
concentração inicial de DPPH em 50% (CE50) foi 50,8 ± 4,5 μg / mL (EIBOND et al., 2004).
Em outro estudo, frutos de M. zapota foram extraídos com metanol e em seguida
particionados com hexano e acetato de etila. A fração obtida com acetato de etila apresentou
elevada atividade no ensaio do DPPH e a mesma foi submetida ao fracionamento em coluna
Sephadex LH-20. Duas novas substâncias derivadas do ácido clorogênico (1) foram isoladas e
apresentaram elevada atividade antioxidante, sendo que o 4-O-galoilclorogenato de metila (2)
apresentou CE50 = 12,9 μM e o ácido 4-O-galoilclorogênico (3) apresentou CE50 = 23,5 μM, o
que indica uma maior atividade antioxidante em relação a encontrada para o ácido
clorogênico comercial CE50 = 39,5 μM) (MA et al., 2003).
6
OH
OH
O
OOH
OH COOH
OH
1
OH
OH OH
O
OH
OH
O
O
OH
OR2
OH
R1OOC
R=
R1 = CH
3 R
2 = R
R1 = H R
2 = R
1.2.1.4 - Atividade citotóxica
Foram realizados testes com 90.000 plantas terrestres e organismos marinhos para
avaliação da atividade frente a linhagens tumorais leucêmicas. O gênero Manilkara não foi
considerado entre os mais ativos, visto que apresentou menos de três espécies com atividade
citotóxica maior que 50 % frente a linhagens de células tumorais HL60 e K562 (CRAGG et
al., 2006).
Os derivados do ácido clorogênico 4-O-galoilclorogenato de metila (2) e ácido 4-O-
galoilclorogênico (3), isolados do fruto de Manilkara zapota, apresentaram atividade
citotóxica frente às linhagens celulares de câncer de cólon HCT-116 e SW-480, apresentando
respectivamente IC50 = 190 e 160 μM e IC50 = 154 e 135 μM (MA et al., 2003).
2
3
7
1.2.2 - Manilkara subsericea (Mart.) Dubard
Segundo o The Plant List (acessado em 25/07/2011), a espécie Manilkara subsericea
(figura 3) apresenta as seguintes sinonímias científicas Mimusops subsericea Mart.,
Kaukenia floribunda (Mart.) Kuntze, Kaukenia subsericea (Mart.) Kuntze, Manilkara bella
Monach., Manilkara floribunda (Mart.) Dubard, Mimusops floribunda Mart., Mimusops
subsericea var. acmanthera Miq., Mimusops subsericea var. acuminata Pierre, Mimusops
subsericea var. massaranduba Pierre, Synarrhena floribunda (Mart.) Fisch. & C. A. Mey. e
Synarrhena subsericea (Mart.) Fisch. & C. A. Mey.
Figura 3. A) Ilustração de Manilkara subsericea (Disponível em
http://www.avidepa.org.br/plantas%20de%20restinga/maca.htm), acesso em: 30/06/2011. B)
foto de caule, folhas e frutos coletados no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba
A espécie Manilkara subsericea possui altura de 4-26 m, é muito lactescente, de copa
ampla e ramos novos marrons, glabros ou pubérulos, com tronco ereto e cilíndrico, de 30-60
cm de diâmetro, com casca grossa e rugosa, acizentada, descamando em placas estreitas.
Folhas concentradas no ápice dos ramos, com pecíolo de 0,7-2,4 cm, lâmina oblanceolada ou
cuneiforme, de ápice obtuso, cuspidado a emarginado e base aguda ou atenuada, coriácea,
glabra na face superior e inicialmente com pelos brancos e deitados na inferior, de 5-12 x 2,2-
5,5 cm, com 12-16 pares de nervuras secundárias. Flores em número de 3-10 em fascículos
axilares e nas axilas de flores já caídas, com pedicelo de 0,7-2,4 cm. Fruto elipsóide ou
globoso, de polpa mucilaginosa, com 1-2 sementes achatadas (figura 4) (LORENZI, 2009).
A B
8
Figura 4. Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (LORENZI, 2009)
Em estudo realizado recentemente, Gomes e colaboradores (2010) descreveram a
biologia floral de Manilkara subsericea. Segundo estes autores, „„Manilkara subsericea tem
flores creme-amareladas, com 9,2 mm de diâmetro e 7,3 mm de comprimento. O cálice é
dialissépalo (figuras 5b-c), de cor verde claro, bisseriado, com três sépalas internas e três
sépalas externas, cuculadas, com tricomas de cor marrom na superfície abaxial e 4,7 mm de
comprimento. A corola é gamopétala, com seis pétalas, cada uma delas dividida em três
segmentos: um mediano e dois laterais, aqui chamados de lacínios. Os seis lacínios medianos
da corola posicionam-se internamente na flor, são eretos, lanceolados, apresentam 4,3 mm de
comprimento e têm consistência crassa. Cada lacínio forma uma espécie de canaleta, voltada
para o eixo floral, na qual um estame fica alojado sob tensão, constituindo este conjunto,
lacínioestame, um dispositivo que tem que ser acionado para ocorrer a liberação explosiva de
grãos de pólen. Cada flor apresenta, portanto, seis desses dispositivos (figuras 5d-f). Os 12
lacínios laterais, por sua vez, apresentam cerca de 4,0 mm de comprimento, são
9
membranáceos, cuculados e assumem uma posição externa e deflexa nas flores. Estes lacínios
encontram-se posicionados sobre as sépalas – dois lacínios laterais sobre cada sépala – e
alternados por um lacínio mediano (figuras 5d-e). O androceu possui seis estames alternados
com seis estaminódios, é epipétalo e conato em sua parte basal (figura 5i), contribuindo para
a formação de um pequeno tubo floral, com 3,7 mm de comprimento. Cada estame é
constituído por um filete branco, com porção livre de 2 mm de comprimento e uma antera
amarela, rimosa, versátil, dorsifixa e extrorsa (figuras 5f-h) que, mesmo deiscente, só
dispersa seus grãos de pólen quando liberada do lacínio mediano que a envolve. Os
estaminódios são petalóides, com ápice bi ou tripartido. Os grãos de pólen medem 38 μm (n =
10), são brancos, secos, apresentam exina pouco esculturada e uma viabilidade de 91% (n =
388 grãos de pólen). O conjunto lacínio-estame constitui um dispositivo semelhante a uma
catapulta (figuras 5f-g), que depende de um fator físico para ser acionado, proporcionando a
liberação dos grãos de forma explosiva. Quando o polinizador toca neste dispositivo e o
impulsiona, o lacínio desloca-se para trás, acionando o dispositivo e ocasionando a explosão
de uma nuvem de grãos de pólen. As observações no campo, utilizando-se tanto flores
marcadas e disponíveis aos polinizadores quanto flores ensacadas, mostraram que: 1. as
anteras, mesmo depois de deiscentes, não liberam os grãos de pólen antes que os dispositivos
lacínios-estames sejam acionados; 2. a liberação dos grãos de pólen dá-se concomitantemente
com o acionamento dos dispositivos; 3. cada dispositivo pode ser acionado isoladamente
pelos polinizadores, de modo que não há simultaneidade na liberação do pólen pelos seis
estames de cada flor; 4. a nuvem de grãos de pólen resultante de uma visita pode alcançar
botões e flores vizinhas; 5. toda a carga de grãos de pólen é liberada no momento em que o
polinizador aciona o dispositivo; 6. as flores não visitadas permanecem com seus seis
dispositivos intactos, mas, ao final da antese, flores ensacadas em processo de senescência
apresentam dispositivos acionados, independentemente das visitas; 7. em raras ocasiões, na
presença de vento forte, pode ocorrer o acionamento dos dispositivos, independente do
impulso decorrente de uma visita. O estigma é arredondado, lobulado, diminuto, com
aproximadamente 0,36 mm de diâmetro (n = 10), do tipo papiloso e úmido. O canal estilar
alcança a superfície estigmática, tem formato estrelar com seis a oito braços (n = 10) e
apresenta lúmen pequeno e grande superfície. A epiderme que reveste o canal estilar é
unisseriada e secretora, proporcionando um tecido de transmissão do tipo superficial. O
exame de seções transversais do estigma e do estilete revela que o número de braços, seis a
10
oito, da superfície estigmática receptiva e do canal estilar é equivalente ao número de lóculos
do ovário. O estilete tem cor esverdeada, possui 3,6 mm de comprimento (n = 10) e é
persistente nos frutos. O ovário é súpero, com 2 mm de comprimento, com seis a oito lóculos
e um óvulo por lóculo (figura 5k). O nectário tem formato anelar e localiza-se na base do
ovário(figura 5j)”.
Figura 5. Desenho botânico de Manilkara subsericea. a. Ramo. b. Botão. c. Flor na fase
feminina, com estilete exteriorizado. d. Flor na fase hermafrodita. e. Flor na fase hermafrodita
com lacínios laterais (ll) deflexos e lacínios medianos (lm) com as anteras, notar a
hercogamia. f-g. Acionamento do dispositivo lacínio-estame. h. Estame. i. Androceu. j.
Gineceu. k. Ovário (corte transversal). (GOMES et al., 2010)
11
Esta espécie é popularmente conhecida como “guracica” e ocorre naturalmente na
floresta pluvial atlântica de restinga (SANTOS et al., 2009), apresentando grande abundância
e ampla distribuição no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (MONTEIRO et al.,
2007). Foi possível observar que neste local a espécie Manilkara subsericea se apresenta sob
forma de arbustos (figura 6), contrariando sua descrição arbórea (LORENZI, 2009). As
condições rígidas do habitat de restinga podem explicar este menor desenvolvimento da
espécie neste local. Seu período de frutificação é anual e regular, ocorrendo durante a estação
com maior pluviosidade e temperaturas mais elevadas (GOMES et al., 2008).
Até o momento não foram realizados estudos biológicos e fitoquímicos referentes a
esta espécie.
Figura 6. Manilkara subsericea situada no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba
(Fonte: próprio autor)
12
1.3 - Triterpenos
Os terpenóides compreendem o maior grupo de substâncias de origem natural,
possuindo mais de 35000 moléculas conhecidas (DEWICK, 2009) derivadas de unidades do
isopreno (4).
4
Alguns substâncias desta classe, como o geraniol (C10), farnesol (C15) e
geranilgeraniol (C20) são formadas através de um encadeamento denominado cabeça-cauda de
unidades isoprênicas (figura 7). As unidades bioquimicamente ativas do isopreno foram
identificadas como os ésteres pirofosfato de dimetilalila (DMAPP) e o pirofosfato de
isopentenila (IPP) (figura 8) (MISAWA, 2011).No caso do esqualeno (C30) e do fitoeno (C40)
as unidades isoprênicas se unem em uma formação cauda-cauda, unidas no centro das
moléculas (figura 9).
Figura 7. Formato cabeça-cauda de unidade isoprênica
13
OPP OPP
(DMAPP) (C5) (IPP) (C
5)
C10 Monoterpenos (C
10)
C15
C20
C25
Sesquiterpenos (C15
)
Diterpenos (C20
)
Sesterterpenos (C25
)
C30
Triterpenos (C30
)
C40
Tetraterpenos (C40
)
Hemiterpenos (C5)
IPP
IPP
IPP
(C18
- C30
)
2x
2x
Iridóides
Carotenóides
Esteróides
Figura 8. Rota biossintética de formação de terpenóides (adaptado de DEWICK, 2009)
14
Figura 9. Esquema de formação de terpenóides por encadeamento cabeça-cauda e cauda-
cauda (adaptado de DEWICK, 2009)
Os triterpenóides compreendem um grupo de substâncias de origem natural derivados
predominantemente do esqualeno, um precursor acíclico com 30 átomos de carbono. Este
grande grupo de produtos naturais reúne cerca de 100 esqueletos químicos distintos. Durante
o processo bioquímico de formação dessas substâncias podem ocorrer diversas ciclizações,
gerando moléculas complexas como os triterpenos tetracíclicos e pentacíclicos (XU et al.,
2004).
Sob uma perspectiva biológica, normalmente as estruturas triterpênicas mais
importantes tem como base os esqueletos oleano (5), ursano (6), lupano (7) e damarano (8).
Estas estruturas policíclicas podem ocorrer como unidades triterpênicas livres ou na forma
15
glicosilada. Dentre as diversas atividades biológicas relatadas para triterpenos, podemos citar
os efeitos antiinflamatórios, hepatoprotetores, analgésicos, antimicrobianos, antimicóticos,
imunomodulatórios e tônicos (MUFFLER et al., 2011).
5 6
7 8
16
2 – OBJETIVO
2.1 – Objetivo geral
O objetivo deste trabalho é avaliar o potencial biotecnológico da espécie Manilkara
subsericea (Mart.) Dubard, através da realização de testes de atividade biológica e do
isolamento de suas subtâncias ativas, valorizando o potencial das espécies nativas do Parque
Nacional da Restinga de Jurubatiba.
2.2 Objetivos específicos
Efetuar a extração de folhas, caules e frutos de M. subsericea e particionar os
extratos obtidos de caules e frutos com solventes de polaridade crescente.;
Efetuar testes para avaliar as atividades antibacteriana, anticolinesterásica e
inseticida dos extratos e partições obtidos;
Realizar o isolamento bioguiado das substâncias responsáveis pela atividade
apresentada nos ensaios de atividade anticolinesterásica e inseticida;
Elucidar as estruturas das substâncias isoladas e obter o perfil cromatográfico da
partição hexânica de frutos por CG-EM
17
3 – MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 - Material Vegetal
Folhas, caules e frutos de M. subsericea foram coletados na Restinga de Jurubatiba,
RJ, Brasil em janeiro de 2009. As coletas foram realizadas de acordo com a autorização
13659-2 do IBAMA/SISBIO para atividades com finalidade científica. A identificação da
espécie foi realizada pelo botânico Marcelo Guerra Santos, professor adjunto da Universidade
do Estado do Rio de Janeiro. A herborização do material vegetal foi realizada e a exsicata
(figura 10) depositada no Herbário da Faculdade de Formação de Professores da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro (RFFP 13.416).
Figura 10. Exsicata de M. subsericea coletada na Restinga de Jurubatiba, RJ, Brasil em
janeiro de 2009
18
3.2 – Solventes
Os solventes utilizados na preparação de reagentes, soluções, extração, partições e
métodos cromatográficos apresentaram grau de análise (P.A.) e foram obtidos do fabricante
VETEC®
(RJ, Brasil).
Água destilada foi utilizada para a realização dos métodos cromatográficos ou demais
procedimentos.
3.3 - Extratos e partições
Os frutos frescos (1.136 kg) foram triturados em turbilhonador e extraídos pela técnica
de maceração em etanol 96 % (v/v) até completo esgotamento. Após este período o extrato
obtido foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório (Fisatom), obtendo-se o extrato
etanólico dos frutos (170 g). Este extrato foi ressuspendido em etanol 90º (v/v) e particionado
até completo esgotamento com hexano, obtendo o extrato hexânico de frutos (FH). Em
seguida a fração hidroalcoólica foi evaporada até a secura, ressuspendida em água e
posteriormente particionada até completo esgotamento com solventes de polaridade crescente
(diclorometano, acetato de etila e butanol), fornecendo os seguintes extratos de frutos:
diclorometânico (FD), acetato de etila (FAE) e butanólico (FB).
Folhas (1,94kg) e caules (0,96 kg) foram submetidos a processo de secagem em estufa
com ventilação forçada (QUIMIS), com temperatura de aproximadamente 35°C pelo período
de 2 dias e posteriormente moídos separadamente em moinho de facas e em seguida
submetidos à extração por maceração em etanol 96 % (v/v) até completo esgotamento. Após
este período, cada extrato obtido foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório (Fisatom),
obtendo-se o extrato etanólico de folhas (FE) (611,4g) e o extrato etanólico de caules (CE)
(169,3g). Em seguida, o extrato bruto de caules foi ressuspendido em etanol 90º (v/v) e
particionado até completo esgotamento com de hexano, obtendo-se o extrato hexânico de
caules (CH). Posteriormente, a fração hidroalcoólica foi evaporada até a secura, ressuspendida
em água e particionada até completo esgotamento com solventes de polaridade crescente(
diclorometano, acetato de etila e butanol), fornecendo os seguintes extratos de caules:
diclorometânico (CD), acetato de etila (CAE) e butanólico (CB). O esquema de partições e
rendimentos de frutos e caules encontra-se ilustrado na figura 11.
19
Figura 11. Esquema de partição dos extratos etanólicos de frutos e caules (mfrutos / mcaules g)
de M. subsericea.
3.4 – Ensaios fitoquímicos
3.4.1 – Cromatografia em Camada Fina (CCF)
Escala analítica
Para a realização dos ensaios cromatográficos qualitativos, utilizou-se gel de Sílica G
60 de fase normal em cromatofolhas de alumínio ALUGRAM® SIL G/UV254 20 x 20 com
0,20 mm de espessura.
Escala preparativa
Para isolamento por cromatografia em camada fina, foi necessária a prévia preparação
das placas cromatográficas. Para obtenção de quatro placas cromatográficas, foi preparada
uma suspensão homogênea contendo 200 g de sílica gel 60 PF254 (Merck, Alemanha) e 520
mL de água destilada. Após agitação manual por 5 minutos, esta suspensão homogênea foi
20
vertida sobre placas de vidro com tamanho de 20 x 20 cm previamente lavadas e secas. Após
24h, as placas foram colocadas em estufa (100 ºC) para ativação.
3.4.2 – Reveladores
Solução de anisaldeído sulfúrico – solução de 0,5 mL de p-anisaldeído, 98%
(Aldrich Chemical Company, Inc, Milwaukee, USA) em 10 mL de ácido acético glacial,
seguida da adição de 85 mL de metanol e 5 mL de ácido sulfúrico concentrado (WAGNER &
BLADT, 1996).
Solução de ácido sulfurico a 10 % em etanol (v/v) (WAGNER & BLADT, 1996).
3.4.3 – Fracionamento do extrato hexânico de frutos
O isolamento das substâncias do extrato hexânico de frutos (8,2 g) de M. subsericea
foi realizado através de cromatografia de adsorção em coluna de vidro contendo gel de sílica
60 com partículas de 0,063-0,2 mm de diâmetro de fase normal como fase estacionária
(VETEC®, RJ, Brasil) com fluxo contínuo e controlado. O extrato a ser fracionado foi
dissolvido em quantidade mínima possível de diclorometano e em seguida adicionado de
quantidade suficiente do adsorvente SiO2. A suspensão obtida foi levada para o evaporador
rotatório e o material resultante foi aplicado sob a forma de pastilha na parte superior da
coluna de vidro, previamente empacotada com suspensão homogênea de sílica gel 60 em
hexano. As amostras foram eluídas em um sistema gradiente com polaridade crescente,
utilizando-se hexano, hexano:acetato de etila, acetato de etila, acetato de etila:metanol e
metanol.
O fracionamento do extrato hexânico forneceu 2 frações principais: FH1 (n-
hexano:acetato de etila, 98:2, v/v) e FH2 (n-hexano:acetato de etila 90:10, v/v) (figura 12).
21
Figura 12. Fracionamento do extrato hexânico resultante da partição do extrato etanólico de
frutos
A fração FH1 (0,460g) foi submetida a purificação por cromatografia em camada fina
em escala preparativa (item 3.4.1) utilizando-se tolueno como eluente. Através desta técnica,
foi possível observar duas manchas principais, que foram raspadas e extraídas com metanol.
Após a evaporação, foram obtidos 460 mg de um sólido branco amorfo, denominado FH1X e
22 mg de um sólido branco amorfo, denominado FH1Y.
A fração FH2 (27mg) obtida do fracionamento do extrato hexânico foi submetida a
lavagem com hexano e acetona, resultando após processo de centrifugação 13 mg de um
sólido branco amorfo purificado, denominado FH2P.
3.5 – Elucidação estrutural
3.5.1 - Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM)
Os cromatogramas e espectros de massas do extrato hexânico de frutos e de produtos
do seu fracionamento foram obtidos em cromatógrafo gasoso acoplado à espectrômetro de
Extrato hexânico
8,2g
FH1 (25-37)
1,23g
FH2 (51-56)
0,027g
FH1X
0,460g
FH1Y
0,022g
FH2P
0,013g
22
massas (GCMS-QP5000,SHIMADZU) equipado com detector por impacto de elétrons. As
amostras foram solubilizadas na concentração de 1 µg/mL em clorofórmio e 1 µL desta
solução foi injetado em coluna ZB-5MS (30m x 0,25 mm x 0,25 µm). As condições de análise
foram: hélio como gás de arraste; fluxo com taxa de 1mL/min; injeção de split com taxa de
1:50; temperatura do injetor, 270°C; temperatura inicial da amostra 60ºC e final 290 ºC, com
taxa de variação de 10º/min. As condições da EM foram: voltagem de ionização de 70eV e
taxa de varredura 1 scan/s.
3.5.2 – Espectro de Ressonância Magnética Nuclear
Os espectros de RMN 1H e RMN
13C foram obtidos no equipamento Varian VNMRS
com freqüência de 300 e 500 MHz 1H e 75 e 125 MHz para
13C. O solvente deuterado para
obtenção dos espectros de RMN (CDCl3) foi obtido da Cambridge Isotope Laboratories
(USA). Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm). A
edição dos espectros foi realizada utilizando-se os programas SpinWorks 3.1.5.0 (University
of Manitoba, 2009) e MestReNova 6.0.2- 5475 (Mestrelab Research S.L., 2009)
3.6 - Atividade antibacteriana
Microrganismos
Cepas de referência da American Type Culture Collection (ATCC) foram utilizadas
durante o estudo. Os microrganismos utilizados foram: Staphylococcus aureus ATCC 25923
e Escherichia coli ATCC 25922.
Preparação da suspensão bacteriana
As cepas bacterianas foram semeadas em placas de Petri contendo meio TSA (Difco).
Os inóculos foram prepadados a partir da suspensão direta das colônias em solução salina,
com 18-24h de crescimento e ajustados a escala 0,5 de Mc Farland (1-2 x 107-8
UFC/mL)
(CLSI, 2002).
23
3.6.1 - Método de difusão em disco
A análise qualitativa da atividade antibacteriana de Manilkara subsericea foi realizada
seguindo os padrões internacionais (CLSI, 2006). Discos de papel de filtro Whatmann (n°3)
foram impregnados com soluções dos extratos em uma concentração de 100 mg/mL. Após a
evaporação total do solvente, os discos foram aplicados de maneira asséptica em placa de
Petri contendo 20 mL de ágar Mueller-Hinton (MHA, Difco) inoculadas de maneira
confluente com os microrganismos em análise. Em seguida, as placas foram incubadas a 37ºC
por 24h. Foram usados como controle positivo do teste, discos de vancomicina (30µg) para
Staphylococcus aureus ATCC25923 e ampicilina (30µg) para Escherichia coli ATCC36298.
Os testes foram realizados em duplicata. A leitura foi realizada com a medição do diâmetro
dos halos de inibição de crescimento.
3.6.2 - Concentração Mínima Inibitória (CMI)
A metodologia do teste de sensibilidade antimicrobiana por microdiluição em caldo
foi realizada segundo recomendações do CLSI (2002). Em um tubo de 16x160 mm contendo
10 mL de caldo Mueller-Hilton, a cepa em questão foi inoculada e incubada a 37 °C durante
24 h. Após a incubação, a suspensão bacteriana foi ajustada de modo a se obter uma
concentração final de 105 UFC/mL.
Em uma microplaca estéril de 96 orifícios ou poços, foram depositados 100 µL de
caldo Muller Hinton, Na coluna 1 foram acrescentados 100 µL de cada extrato, de
concentração conhecida (um extrato diferente para cada linha). A partir deste orifício foram
feitas diluições sucessivas, rejeitando-se no final 100 µL da mistura, com o intuito de se obter
as concentrações finais: 500, 250, 125, 64 e 32µg/mL. A seguir, 100 µL da cepa bacteriana foi
acrescentada nos orifícios e a placa foi incubada a 37 °C por 24 h. Após este período foram
acrescentados 50 µL de uma solução aquosa de TTC (cloreto de trifenil tetrazolium) à 2,5%,
e a placa re-incubada por 3 horas na referida temperatura. A CMI foi definida como a menor
concentração capaz de impedir o crescimento bacteriano, ou seja, impedir o aparecimento da
coloração vermelha.
O controle negativo do experimento foi feito com meio de cultura inoculado com
bactéria e solução salina e meio de cultura inoculado com bactéria e dimetilsulfóxido
24
(DMSO). Já o controle positivo foi feito com vancomicina nas concentrações de 10; 5; 2,5;
1,2 e 0,6µg/mL.
3.7. – Atividade anticolinesterásica
3.7.1 – Teste de Bioautografia
O ensaio para a identificação de inibidores da acetilcolinesterase foi realizado segundo
o método qualitativo descrito por Marston e colaboradores (2002) utilizando-se a técnica de
cromatografia em camada fina (CCF), com modificações. Neste ensaio 100 µg da partição
hexânica de frutos e 100-6,25 µg das substâncias isoladas foram aplicados em placas
cromatográficas (ALUGRAM® SIL G/UV254). Como controle positivo do ensaio, foi aplicado
1 µL de uma solução padrão de fisostigmina (5mM, Sigma) em metanol. Depois da
evaporação do solvente, foi aplicada uma solução (6,67 U/mL) de acetilcolinesterase de peixe
elétrico tipo VI-S (Sigma, C3389-2KU), contendo 0,0083% de albumina sérica bovina fração
V (Sigma, A4503), diluída em tampão fosfato 0,1 M, pH=7,5. Em seguida, a placa foi
incubada em estufa com ambiente úmido a 37 ºC por 20 min. Posteriormente, borrifou-se uma
solução contendo 12,5 mg de acetato de α-naftila (Sigma) em 5 mL de etanol e 50 mg do sal
Fast Blue B (Sigma) em 20 mL de água, preparadas e misturadas na hora. O substrato
enzimático, acetato de α-naftila, sofre hidrólise catalizada pela enzima formando como
produto o α-naftol, que reage com o agente colorimétrico, sal Fast Blue B, formando uma
substâncias azólica de coloração roxa. A ausência de coloração roxa indica a presença de
inibidor da enzima acetilcolinesterase (figura 13).
25
O
O
OH
O
OH
O
O
N+
NN+
N
n
OH
N N
O
O
N N
OH
+
Sal Fast Blue B
Substância azólica (roxa)
Acetato de alfa-naftila alfa-naftol
Figura 13. Reação colorimétrica de formação da substância azólica (roxa) que ocorre no
ensaio anticolinesterásico qualitativo
3.8 – Avaliação da atividade inseticida
Os ensaios para avaliação de atividade inseticida foram realizados em colaboração
com a Prof. Maria Denise Feder do Laboratório de Biologia de Insetos do GBG/UFF.
3.8.1 - Colônias
As colônias de Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus foram mantidas em
cubas de vidro fosco (de aproximadamente 19 cm de profundidade por 17 cm de diâmetro) em
uma temperatura média entre 20-23 ºC para D. peruvianus (MILANO et al., 1999) e 19-30 ºC
para O. fasciatus (FEIR, 1974), umidade relativa de 70-75% e ciclos de 16h (dia) e 8h (noite).
26
A abertura da cuba deve estar tampada com um pano (filó) para entrada de ar e os insetos
tinham livre acesso a água. O. fasciatus e D. peruvianus foram, respectivamente, alimentados
com sementes de girassol e sementes de algodão.
Dentro das cubas, foram utilizados dois pedaços de papel filtro: um cortado em circulo
para ser depositado no fundo e outro retangular e sanfonado, depositado verticalmente, para
aumentar a área de movimentação dos insetos. Um bebedouro ficava pendurado por um arame
preso no topo da cuba, a fim de evitar vazamento no fundo da mesma. Placas de petri eram
colocadas no fundo, contendo gazes ou algodão, para que os insetos realizassem as posturas.
3.8.2 - Bioensaio
Os extratos e partições avaliados foram solubilizados na concentração de 100 mg/mL e
frações obtidas foram solubilizadas na concentração de 20 mg/mL, utilizando-se etanol como
solvente.
Os testes foram realizados através de tratamento tópico, conforme descrito por
Raguraman & Singh (1998). Ninfas do 4º estágio foram separadas em grupos de 20
indivíduos e após aplicação das amostras, foram colocadas em frascos pequenos de
aproximadamente 7 cm de profundidade por 5 cm de diâmetro. Em seguida, iniciou-se a
contagem diária, acompanhando o desenvolvimento dos insetos até atingirem o estágio adulto,
copularem, depositarem os ovos e estes eclodirem, o que levou em média 30 dias. O controle
negativo foi efetuado com aplicação de 1µL de etanol no dorso dos insetos, submetidos às
mesmas condições do grupo experimental.
A significância dos resultados foi analisada utilizando-se programa ANOVA e teste de
Turkey utilizando-se o programa Stats Direct Statistical Software, versão 2.2.7 (Windows 98).
As diferenças entre os grupos testados e controle foram considerados estatisticamente sem
significância para p>0,05. Todos os experimentos foram feitos em triplicata.
27
4 – RESULTADOS E DISCUSSÂO
4.1 - Análise química dos extratos e frações obtidas
4.1.1 - Cromatografia em camada fina
O extrato etanólico de folhas e os extratos hexânico e diclorometânico resultantes das
partições efetuadas nos extratos etanólicos de caules e frutos foram avaliados utilizando
técnica de cromatografia em cama fina (CCF) (figura 14). As amostras foram eluídas em
tolueno e reveladas com solução de anisaldeído sulfúrico e apresentaram padrão
cromatográfico bem similar, com coloração característica para terpenóides.
Figura 14. Cromatografia em camada fina de extratos e fração obtida de M. subsericea. FE
(extrato etanólico de folhas); CD (extrato diclorometânico de caules); CH (extrato hexânico
de caules); FD (extrato diclorometânico de frutos); FH (extrato hexânico de frutos); FH1X
(fração obtida de FH). Fase estacionária silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC
(MACHEREY – NAGEL).Eluente: tolueno, revelador: anisaldeído sulfúrico.
FE CD CH FD FH FH1X
Rf 1
Rf 0
28
O fracionamento do extrato hexânico de frutos forneceu uma fração denominada FH1
(n-hexano:acetato de etila, 98:2, v/v). Após o procedimento de purificação por cromatografia
em camada fina (escala preparativa) as frações FH1X e FH1Y obtidas foram solubilizadas em
diclorometano e submetidas a nova análise por cromatografia em camada fina utilizando-se
relevador universal (ácido sulfúrico a 10% em etanol, v/v). Foi possível observar que a fração
FH1X (Rf 0,43) estava aparentemente pura e a que a fração FH1Y apresentava duas manchas
em Rf 0,59 e 0,63 (Figura 15).
Figura 15. Cromatografia em camada fina das frações FH1X e FH1Y obtidas do extrato
hexânico de frutos de M. subsericea. Fase estacionária: silica gel ALUGRAM® SIL
G/UV254 TLC (MACHEREY – NAGEL).Eluente: tolueno, revelador: ácido sulfúrico 10%
em etanol, v/v.
A fração FH1X (Rf 0,43, tolueno) foi avaliada em conjunto com os extratos e a
comparação do fator de retenção sugere uma ampla distribuição nos órgãos analisados e a
revelação positiva com anisaldeído sulfúrico sugere seu caráter terpênico.(figura 14)
FH1Y FH1X
Rf 1
Rf 0
29
O fracionamento da partição hexânica de frutos também forneceu uma fração
denominada FH2 (n-hexano:acetato de etila 90:10, v/v). Esta fração foi sucessivamente
centrifugada com hexano e acetona, fornecendo um material branco amorfo (FH2P), pouco
solúvel em diclorometano e solúvel em metanol. Este sólido foi então solubilizado em
metanol e submetido a análise cromatográfica em camada fina (CCF). Após eluição com
Hexano:Acetato de Etila (1:1), a placa foi revelada com anisaldeído sulfúrico e foi possível
observar o surgimento de uma mancha de coloração rosa em Rf = 0,5 (figura 16), sugerindo
se tratar de terpenóide. Uma nova placa foi preparada sob as mesmas condições descritas
anteriormente, revelada com solução de ácido sulfúrico 10% em etanol (v/v) e aquecida. Não
houve surgimento de manchas com Rf distinto do observado anteriormente.
Figura 16. Cromatografia em cama fina da fração FH2P obtida do extrato hexânico de frutos
de M. subsericea. Fase estacionaria: silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC
(MACHEREY – NAGEL). Eluente: hexano:acetato de etila (1:1), revelador: anisaldeido
sulfúrico
Rf 1
Rf 0
FH2P
30
4.2 - Elucidação estrutural
4.2.1 - Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
4.2.1.1 - Análise do extrato hexânico
A análise do cromatograma do extrato hexânico resultante da partição efetuda no
extrato etanólico de frutos de M. subsericea (figura 17) indicou que 20 substâncias eluíram e
as substâncias com tempo de retenção (min) 34,63 (10,27%) e 36,15 (42,34%) foram as
majoritárias. Essas duas substâncias totalizaram 52,61 % da composição relativa do extrato
hexânico analisado.
Figura 17. Cromatograma obtido por CG-EM do extrato hexânico (FH) resultante da partição
efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea. Aparelho GCMS-QP5000
(SHIMADZU); coluna ZB-5MS (30m x 0,25 mm x 0,25 µm); gás de arraste: hélio; fluxo de
1mL/min; injeção de split 1:50; temperatura do injetor: 270°C; temperatura inicial da amostra
60ºC e final 290 ºC; taxa de variação de 10º/min. Condições da EM: voltagem de ionização de
70eV e taxa de varredura 1 scan/s.
A comparação dos espectros de massas correspondentes aos tempos de retenção 16,84;
16,99; 18,71 e 18,94 com a base de dados da biblioteca NIST (National Institute os Standards
and Technology), sugeriu a presença de ácidos graxos com alto índice de similaridade. Desta
forma, foi possível identificar as seguintes substâncias presentes no extrato hexânico de frutos
de M. subsericea: Ácido hexadecanóico (9), Hexadecanoato de etila (10), (E)-9-octadecenoato
31
de etila (11) e octadecanoato de etila (12). Os tempos de retenção correspondentes, pesos
moleculares e a abundância relativa destes ácidos graxos encontram-se listados na tabela 1.
Tabela 1. Ácidos graxos e ésteres presentes no extrato hexânico resultante da partição efetuda
no extrato etanólico de frutos de M. subsericea
Ácido graxo / Éster
Tempo de
retenção
(min)
Peso molecular Abundância
relativa (%)
Ácido hexadecanóico (9) 16,84 256 5,41
Hexadecanoato de etila (10) 16,99 284 3,57
(E)-9-octadecenoato de etila (11) 18,71 310 3,95
Octadecanoato de etila (12) 18,94 312 1,45
OH
O
9
O
O
10
O
O
11
O
O
12
32
Os espectros de massas das substâncias correspondentes aos tempos de retenção 34,63
e 36,15 min foram bastante similares, diferindo basicamente na intensidade dos sinais. Foram
observados sinais típicos de substâncias com esqueleto olean-12-eno (13) e ursan-12-eno (14)
em m/z 218; 203 e 189.
13 14
. O padrão de fragmentação característico para triterpenos pentacíclicos que possuem
ligação dupla na posição C-12, incluindo aqueles do tipo β-amirina (15) e α-amirina (16),
ocorre via uma reação Retro-Diels-Alder. Uma diferença significativa nos espectros das duas
substâncias foi a intensidade do pico em m/z 203, que encontra-se mais intenso para
substâncias do tipo β-amirina em relação a substâncias do tipo α-amirina (ZANON et al,
2008).
OHOH
15 16
33
Ambos os espectros apresentaram picos em m/z 468, correspondentes aos íons
moleculares dos dois isômeros, e a comparação com a base de dados NIST indicou alto grau
de similaridade para acetatos de amirina. Foi possível então sugerir que as substâncias com
tempos de retenção 34,63 e 36,15 min são respectivamente, acetato de beta amirina (17) e
acetato e alfa amirina (18).
O
O
O
O
17 18
As substâncias com tempos de retenção 53,31/56,55 min e 71,70/76,99 min
apresentaram padrões de fragmentação característicos para pares de isômeros do tipo
beta/alfa-amirina. Os sinais característicos para triterpenos do tipo amirina m/z 218; 203 e 189
foram visualizados, porém, a ausência do pico do íon molecular e o baixo percentual de
similaridade das substâncias propostas pelo banco de dados NIST, não permitiram a
elucidação de tais estruturas neste momento. Entretanto, foi observada a diferença
característica na intensidade relativa do sinal em m/z 203 em ambos os pares, indicando que
as substâncias com tempos de retenção 53,31 e 71,70 min possuem estrutura de derivados da
beta-amirina e que as substâncias com tempos de retenção 56,65 e 76,99 min possuem
estrutura de derivados da alfa-amirina.
A análise dos espectros de massas das substâncias presentes no extrato hexânico
resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea, permitiu
identificar estruturas fundamentais de triterpenos do tipo beta- e alfa- amirina. Estas
substâncias totalizaram 72,81% da composição relativa deste extrato, sugerindo que ele pode
ser utilizado como uma fonte rica de triterpenos do tipo amirina.
34
4.2.1.2 - Análise de FH1X
A análise de CG-EM indicou que a amostra FH1X obtida do extrato hexânico
resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea é constituída por
uma mistura de duas substâncias com tempo de retenção de 37,10 min (A) e 38,33 min (B) e
com as respectivas proporções relativas de 76,3 % e 23,7 %. (figura 18).
Figura 18. Cromatograma obtido por CG-EM da fração FH1X obtida do extrato hexânico
(FH) resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea. Aparelho
GCMS-QP5000 (SHIMADZU); coluna ZB-5MS (30m x 0,25 mm x 0,25 µm); gás de arraste:
hélio; fluxo de 1mL/min; injeção de split 1:50; temperatura do injetor: 270°C; temperatura
inicial da amostra 60ºC e final 290 ºC; taxa de variação de 10º/min. Condições da EM:
voltagem de ionização de 70eV e taxa de varredura 1 scan/s.
O espectro de massas de ambas as substâncias apresentou o sinal do íon molecular em
m/z 468 e um pico em m/z 453, correspondente a perda de ácido acético. Também foi
observada uma maior intensidade do pico em m/z 203 para a substância correspondente ao
tempo de retenção de 37,10, típico para substâncias do tipo β-amirina, que apresentam este
sinal mais intenso em relação à substâncias do tipo α-amirina (ZANON et al., 2008) (figura
19).
35
Figura 19. Espectro de massas de A + B (17 e 18). Aparelho GCMS-QP5000 (SHIMADZU);
detecção: impacto de elétrons; voltagem de ionização de 70eV
A presença dos fragmentos em m/z 218; 203 e 189, correspondentes a triterpenos do
tipo β-amirina (figura 20) e α-amirina (figura 21) podem ser explicados através de um
mecanismo via reação Retro-Dies-Alder (Silva, 2007).
Figura 20. Fragmentação característica de triterpenos pentacíclicos (série oleano) com dupla
ligação na posição C12, via reação Retro-Dies-Alder (Silva, 2007)
A
B
36
Figura 21. Fragmentação característica de triterpenos pentacíclicos (série ursano) com
dupla ligação na posição C12, via reação Retro-Dies-Alder (Silva, 2007)
Estes dados sugerem que estas substâncias correspondem aos triterpenos 17 e 18
apresentados no cromatograma do extrato hexânico (figura 17). Portanto, a análise por CG-
EM sugere que A e B tratam-se, respectivamente, do acetato de beta amirina (17) e acetato de
alfa amirina (18) e que a mistura das substâncias majoritárias do extrato hexânico resultante
da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea foi obtida com sucesso.
4.2.2 – Ressonância Magnética Nuclear
4.2.2.1 – A+ B (17 e 18)
O fracionamento do extrato hexânico de frutos por cromatografia em coluna com gel
de sílica e posterior purificação por cromatografia em camada fina (escala preparativa),
forneceu uma fração denominada FH1X, que através de análise por cromatografia gasosa, se
mostrou ser constituída por duas substâncias (A+B). Sua estrutura foi elucidada com base nos
dados de RMN de 1H e
13C e comparação com dados da literatura (SOLDI et al., 2008;
BALESTRIN et al., 2008).
37
O
O
O
O
Acetato de alfa-amirina (B) (18)Acetato de beta-amirina (A) (17)
34
1´
21
5
2´
2324
67
89
10
25 26
27
11
1213
14
15
16
1718
28
22
2120
30
2919
34
1´
21
5
2´
2324
67
89
10
25 26
27
11
1213
14
15
16
1718
28
22
2120
29
19
30
No espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) (figura 22) foi possível observar um singleto
com deslocamento químico de 2,05 ppm referente aos hidrogênio metílicos do grupamento
acetila (figura 23). O multipleto observado com deslocamento químico de 4,50 ppm é
característico para próton metínico H-3 dos acetatos de beta- e alfa amirina (figura 24). A
presença de dois tripletos com deslocamentos químicos de 5,13 ppm (J = 3,5 Hz) e 5,18 (J =
3,5 Hz) estão de acordo com os respectivos prótons H-12 olefínicos dos acetatos de beta- e
alfa-amirina (figura 25).
O perfil de sinais obtido no espectro de RMN 1H foi comparado e se mostrou de
acordo com os dados da literatura para os triterpenos pentacíclicos acetato de beta amirina e
acetato de alfa amirina. (Soldi et al., 2008).
38
Figura 22. Espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 300 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18).
Figura 23. Expansão (δ 2,02-2,08) do espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 300 MHz;
CDCl3) de A+B (17 e 18).
39
Figura 24. Expansão (δ 4,40-4,60) do espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 300 MHz;
CDCl3) de A+B (17 e 18).
40
Figura 25. Expansão (δ 5,02-5,30) do espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 300 MHz;
CDCl3) de A+B (17 e 18).
41
O espectro de RMN de 13
C exibiu um perfil característico para mistura de
triterpenos, (figura 26).
Figura 26. Espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 75 MHz; CDCl3) de A+B (17 e
18).
Segundo Olea & Roque (1990), “os deslocamentos dos carbonos sp2, quando
presentes, são altamente característicos de cada esqueleto, no caso de triterpenos oxigenados
apenas em C-3. Essa característica fornece informações valiosas na elucidação estrutural de
misturas de triterpenos, através da comparação de valores característicos de deslocamentos
químicos com dados tabelados, permitindo a elucidação estrutural de isômeros que possuam a
mesma função em C-3 através da comparação dos dados para carbonos olefínicos obtidos com
valores conhecidos (tabela 2).
42
Tabela 2. Deslocamentos químicos de RMN 13
C (ppm, CDCl3) característicos dos átomos de
carbono oxigenados dos triterpenos mais freqüentes (OLEA & ROQUE, 1990)
Foram observados dois pares característicos de sinais com deslocamentos químicos de
121,7/145,2 ppm e 124,3/139,6 ppm (figura 27). Estes pares coincidem, respectivamente,
com o esperado para carbonos olefínicos C-12/C-13 de triterpenos do tipo olean-12-eno e
ursan-12-eno, indicando a presença de uma mistura de triterpenos com estes esqueletos. Além
disso, foi possível observar um sinal com deslocamento químico de. 81,0 ppm (figura 28) e
um sinal altamente desblindado com deslocamento químico de 171,0 ppm (figura 29). Esses
sinais são típicos para acetatos de triterpenilas.
43
Figura 27. Expansão (δ 121-145) do espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 75 MHz;
CDCl3) de A+B (17 e 18).
Figura 28. Expansão (δ 75-82) do espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 75 MHz; CDCl3)
de A+B (17 e 18).
44
Figura 29. Expansão (δ 164-176) do espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 75 MHz;
CDCl3) de A+B (17 e 18).
O fato dos valores de deslocamento químico dos carbonos olefínicos C-12/C-13 serem
bem característicos para certas classes de triterpenos e o assinalamento inequívoco dos sinais
da carbonila de acetatos de triterpenila, foi de fundamental importância para a elucidação
estrutural de FH1X. A comparação dos demais assinalamentos com dados da literatura
(BALESTRIN et al., 2008; GAYDOU et al., 1996) permitiu identificar as substâncias acetato
de beta-amirina (A) (17) e acetato de alfa-amirina (B) (18). Os valores de deslocamentos
químicos de 13
C e comparação com dados da literatura encontram-se listados na tabela 3.
O
O
O
O
Acetato de alfa-amirina (B) (18)Acetato de beta-amirina (A) (17)
34
1´
21
5
2´
2324
67
89
10
25 26
27
11
1213
14
15
16
1718
28
22
2120
30
2919
34
1´
21
5
2´
2324
67
89
10
25 26
27
11
1213
14
15
16
1718
28
22
2120
29
19
30
45
Tabela 3. Comparação de deslocamento químicos de RMN de 13
C de A e B (17 e 18) (Varian
VNMRS; 75 MHz, CDCl3) obtidos de frutos de M. subsericea com acetato de beta amirina e
acetato de alfa amirina (50 MHz, CDCl3)a.
A Acetato de
beta amirinaa B
Acetato de
alfa amirinaa
C δC δCa δC δC
a
1 38,3 38,5 38,5 38,5
2*
23,7 28,7
23,7
28,0
3 81,0 80,6 81,0 80,6
4 37,7 38,3 37,7 38,0
5 55,3 55,2 55,3 55,2
6 18,3 18,3 18,3 18,1
7 32,6 32,9 32,9 33,0
8 38,3 38,5 40,0 40,0
9 47,6 47,6 47,7 47,5
10 37,7 37,7 36,8 36,8
11 23,5 23,6 23,4 23,4
12 121,7 121,6 124,3 124,3
13 145,2 145,2 139,7 139,2
14 41,7 41,7 42,0 42,1
15 26,1 26,1 28,7 28,7
16 27,0 26,6 26,6 26,9
17 32,5 32,6 33,7 33,7
18 47,2 47,5 59,1 59,0
19 28,0 28,0 39,7 39,6
20 31,1 31,1 39,6 39,6
21 34,7 34,7 31,3 31,2
22 37,2 37,1 41,5 41,5
23 28,0 28,0 28,0 28,0
24 15,6
15,5 15,7 15,7
25 16,7 16,0 16,7 16,2
26 16,8 16,9 16,9 16,8
27 26,0 25,9 23,2 23,2
28 28,4 28,4 28,1 28,1
29 33,3 33,3 17,5 17,5
30 23,6 23,7 21,3 21,3
1´ 171,0 171,0 171,0 171,0
2´ 21,3 21,4 21,4 21,4
a Dados da literatura para acetato de alfa amirina e acetato de beta amirina (BALESTRIN et
al., 2008)
46
*Deslocamento químico de C-2 para triterpeno do tipo acetato de β-amirina (δ 23,6; 100 MHz,
CDCl3) (GAYDOU et al., 1996)
Os triterpenos pentacíclicos beta- e alfa-amirina e seus derivados, como os acetatos de
beta- e alfa-amirina, foram isolados de várias espécies como Dorstenia multiformis, Pouteria
torta, Protium kleinii, Vernonia tweediana e diversos estudos foram realizados com esses
triterpenos, relatando vários efeitos, como atividade antiinflamatória, atividade antinoceptiva
e atividade antimicrobiana (BALESTRIN et al., 2008; CHE et al., 1980; LIMA et al., 2005;
ZANON et al., 2008)
O uso da técnica de cromatografia em camada fina (figura 14) permitiu sugerir uma
ampla distribuição destes triterpenos em diversos órgãos de M. subsericea. Também foi
possível observar um alto percentual de abundância relativa destas substâncias no extrato
hexânico de frutos, quando analisa por CG-EM (figura 17). Por fim, a análise estrutural
possibilitou a identificação dos acetatos de beta- e alfa amirina presentes na espécie M.
subsericea.
4.2.2.2 – C+D (19 e 20)
O fracionamento do extrato hexânico de frutos em coluna de gel de sílica e processos
de purificação com solventes forneceu uma fração denominada FH2P. A elucidação estrutural
foi realizada com base nos dados de RMN de 1H e
13C e comparação com dados da literatura
(MALDANER, 2005; MAHATO & KUNDU, 1994; BOTAS, 2010).
OH
COOH
OH
COOH
Ácido ursólico (C) (19) Ácido oleanólico (D) (20)
34
21
5
2324
67
89
10
25 26
27
11
1213
14
15
16
1718
28
22
2120
30
2919
34
21
5
2324
67
89
10
25 26
27
11
1213
14
15
16
1718
28
22
2120
29
19
30
47
O espectro de RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) da mistura apresentou perfil
característico para triterpenos pentacíclicos do tipo ursano e oleanano. Foi possível observar
um tripleto com deslocamento químico de 5,29 ppm (J = 3,5 Hz) e um tripleto de maior
intensidade com deslocamento químico de 5,26 ppm (J = 3,7 Hz). Esses sinais mais
desblindados estão condizentes, respectivamente, com o esperado para hidrogênios olefínicos
H-12 de ácido oleanólico e ácido ursólico (MALDANER, 2005; BOTAS, 2010). Também foi
visualizado um duplo dubleto com deslocamento químico de 3,22 ppm J = 4,9; 11,1 Hz),
correspondende ao hidrogênio carbinólico H-3 destas substâncias. O espectro de RMN de 1H
e as expansões dos sinais descritos encontram-se apresentados na figura 30.
Figura 30. Espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 500 MHz; CDCl3) de C+D (19 e 20).
48
O espectro de RMN de 13
C exibiu um perfil característico para mistura de triterpenos, (figura
31).
Figura 31. Espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 125 MHz; CDCl3) de C+D (19 e 20).
No espectro de RMN de 13
C foi visualizado um sinal em 78,9 ppm, indicando a
presença de uma hidroxila ligada a C-3 (figura 32). Foram observados dois pares de sinais em
125,8/137,8 ppm e 122,6/143,4 ppm (figura 33), que estão em concordância,
respectivamente, aos carbonos olefínicos C12/C13 dos ácidos ursólico e oleanólico
(MALDANER, 2005; MAHATO & KUNDU, 1994). Também foi possível observar um sinal
altamente desblindado em δ 181,0 referente ao C-28 ligado à carboxila dos ácidos ursólico e
oleanólico (figura 34). Os demais sinais encontrados foram comparados com dados da
literatura (MALDANER, 2005; MAHATO & KUNDU, 1994) e permitiram a identificação da
mistura contendo ácido ursólico (C) (19) e ácido oleanólico (D) (20) (tabela 4)
49
Figura 32. Expansão (δ 67-89)do espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 125 MHz; CDCl3)
de C+D (19 e 20)
50
Figura 33. Expansão (δ 121-145)do espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 125 MHz;
CDCl3) de C+D (19 e 20).
51
Figura 34. Expansão (δ 179-183) do espectro de RMN 13
C (Varian VNMRS; 125 MHz;
CDCl3) de C+D (19 e 20).
52
Tabela 4. Comparação de deslocamentos químicos de RMN de 13
C de C+D (19 e 20) (Varian
VNMRS 125 MHz; CDCl3) obtidos de frutos de M. subsericea e comparação com ácido
ursólico e ácido oleanólico
Ácido ursólico Ácido oleanólico
Pos. δC δCa δC δC
b
1 38,5 38,6 38,3 38,5 2 27,1 27,2 27,2 27,4 3 78,9 78,9 78,9 78,7 4 38,7 38,7 38,7 38,7 5 55,1 55,2 55,1 55,2 6 18,2 18,2 18,2 18,3 7 32,9 32,9 32,6 32,6 8 39,4 39,4 39,2 39,3 9 47,8 47,1 47,5 47,6 10 36,9 36,9 37,0 37,0 11 23,2 23,2 22,6 23,1 12 125,8 125,5 122,5 122,1 13 137,8 138,1 143,4 143,4 14 41,9 41,9 41,6 41,6 15 27,9 28,0 27,1 27,2 16 24,1 24,2 22,9 23,4 17 47,4 47,0 46,4 46,6 18 52,6 52,8 41,0 41,3 19 38,7 38,8 45,8 45,8 20 39,0 39,0 30,6 30,6 21 30,5 30,6 33,7 33,8 22 36,6 36,6 32,3 32,3 23 28,0 28,1 28,0 28,1 24 15,5 15,5 15,4 15,6 25 15,4 15,4 15,2 15,3 26 16,9 16,8 16,9 16,8 27 23,5 23,5 25,8 26,0 28 181,0 180,0 181,0 181,0 29 17,0 16,9 32,5 33,1 30 21,1 21,1 23,3 23,6
aMALDANER, 2005 (CDCl3, 100 MHz)
bMAHATO & KUNDU, 1994
53
4.3 – Atividade antibacteriana
Foi realizado o teste de difusão em disco (CLSI, 2006) para avaliação da atividade
antimicrobiana de extratos de M. subsericea frente a cepa padrão de Staphylococcus aureus
ATCC 25923 e Escherichia coli ATCC36298. Dentre os extratos testados frente a S. aureus,
o que apresentou o maior halo de inibição foi o extrato etanólico de caule. Apenas os extratos
acetato de etila e butanólico de frutos não inibiram o crescimento desta cepa. Todos os
extratos testados foram considerados inativos frente a E. coli, com exceção da partição
butanólica de caules, que apresentou um halo de inibição de 7 mm. Os resultados obtidos,
expressos em termos de halo de inibição (mm) encontram-se listados na tabela 5.
Para determinação da concentração mínima inibitória frente a S. aureus, optou-se pela
utilização dos extratos que inibiram o crescimento desta cepa no ensaio qualitativo. Todos os
extratos testados foram capazes de impedir o aparecimento da coloração vermelha nas
concentrações de 500 µg/mL e 250 µg/mL. Foi possível então determinar que todos estes
extratos possuem uma concentração mínima inibitória (CMI) de 250 µg/mL (figura 35).
Figura 35: Avaliação da CMI de M. subsericea frente à S. aureus 25923. Concentrações dos
extratos e controle positivo (vancomicina), respectivamente: Coluna 1 e 7: 500 e 10µg/mL;
coluna 2 e 8: 250 e 5µg/mL; coluna 3 e 9: 125 e 2,5µg/mL; coluna 4 e 10: 64 e 1,25µg/mL e
coluna 5 e 11: 32 e 0,6µg/mL.
54
Tabela 5. Atividade antibacteriana de extratos e fração obtida de M. subsericea frente a S.
aureus e E. coli
Halo de inibição (mm)
Staphylococcus aureus Escherichia coli
FE 7 0
CE 8 0
CH 6 0
CD 7 0
CAE 7 0
CB 6 7
FH 6 0
FD 7 0
FAE 0 0
FB 0 0
A+B 6 0
Vanco 18 Não testado
Amp Não testado 32
Discos impregnados com extratos na concentração de 100 mg/mL: Extrato etanólico de folhas (FE),
Extrato etanólico de caules (CE), extrato hexânico de caules (CH), extrato diclorometânico de caules
(CD), extrato acetato de etila de caules (CAE), extrato butanólico de caules (CB), extrato hexânico de
frutos (FH), extrato diclorometânico de frutos (FD), extrato acetato de etila de frutos (FAE), extrato
butanólico de frutos (FB), mistura de acetatos de beta- e alfa-amirina (A+B). Controle positivo: discos
de vancomicina (30µg) para Staphylococcus aureus ATCC25923 e ampicilina (30µg) para
Escherichia coli ATCC36298
55
Terpenóides têm demonstrado serem ativos frente a diferentes bactérias. Contudo, o
mecanismo de ação ainda não é totalmente compreendido, apesar de especular-se que envolva
o rompimento da membrana celular (OLIVEIRA et al., 2010). A mistura isomérica de beta-
amirina e alfa-amirina é conhecida por sua atividade antimicrobiana (PINTO et al., 2008) e os
componentes majoritários isolados do extrato hexânico de frutos são derivados destes
triterpenóides. De acordo com Hichri et al. (2003), o triterpeno acetato de beta-amirina foi
capaz de inibir o crescimento microbiano de Staphylococcus aureus ATCC25923 na
concentração de 90 µg/mL. A avaliação da atividade antimicrobiana da mistura de acetatos de
beta- e alfa amirina proveniente de M. subsericea, indicou uma atividade frente à cepa testada,
através da observação de um halo de inibição de 6 mm (tabela 5). Estes resultados sugerem
que tais triterpenos são possivelmente responsáveis, total ou parcialmente, pela atividade
antibacteriana encontrada nos extratos menos polares testados frente à cepa Staphylococcus
aureus ATCC25923.
4.4 – Atividade anticolinesterásica
Diversas espécies vegetais têm sido descritas por suas atividades inibitórias sobre a
enzima acetilcolinesterase (OLIVEIRA et al., 2010) e o bioensaio de atividade
anticolinesterásica se configura como um método simples e rápido para identificação de
substâncias com tal atividade.
A principal função da acetilcolinesterase é interromper a transmissao do impulso
nervoso nas sinapses colinérgicas, através da rápida hidrólise da acetilcolina (MUKHERJEE
et al., 2007). Substâncias inibidoras da acetilcolinesterase têm sido utilizadas para diferentes
finalidades, dentre as quais podemos destacar o tratamento de doenças neurodegenerativas e a
utilização como pesticidas.
As drogas aprovadas pelo FDA (U.S. Food and Drug Administration ) para o
tratamento da disfunção cognitiva e perda de memória associada ao Mal de Alzheimer têm
sido geralmente inibidores da acetilcolinesterase, como a tacrina (Cognex™, 1993), donepezil
(Aricept™, 1996), rivastigmina (Exelon™, 2000), e galantamina (Reminyl™, 2001). Esta
abordagem terapêutica se baseia na hipótese de que esta doença é resultante de um deficit da
função colinérgica no cérebro (NUKOOLKARN et al., 2008; LÓPEZ et al, 2002).
56
O desejo de se realizar o isolamento bioguiado de substâncias apolares com atividade
anticolinesterásica levou a escolha do extrato hexânico resultante da partição efetuada no
extrato etanólico de frutos de M. subsericea para o ensaio. A investigação inicial permitiu a
visualização de três principais áreas de inibição nesta partição, nos Rf 0,58-0,64, 0,43 e 0,1
(eluente: tolueno) (figura 36).
Figura 36. Ensaio bioautográfico para inibidores da acetilcolinesterase realizado com placa
cromatográfica de silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC (MACHEREY – NAGEL) e
tolueno como sistema de eluição. A) extrato hexânico de frutos, 100µg aplicados. B)
fisostigmina, 1 µL de uma solução padrão de fisostigmina (5mM) aplicado. Protocolo descrito
no item 3.7.1
O fracionamento por cromatografia em coluna de gel de silica deste extrato permitiu a
obtenção de uma mistura dos triterpenos acetato de beta amirina e acetato de alfa amirina,
com Rf 0,43 (sistema de eluição: tolueno), sugerindo que tais substâncias eram responsáveis
por uma das áreas de inibição observadas no extrato hexânico. Em seguida, foram preparadas
Rf 1
Rf 0
A B
57
diversas diluições da mistura triterpênica obtida, para que esta fosse aplicada em diferentes
concentrações na placa (100 – 6,25 μg). Esta etapa teve o intuito de avaliar o limite de
detecção da mistura de acetatos de beta- e alfa-amirina no ensaio biautográfico avaliado. A
menor concentração capaz de inibir a enzima que pôde ser observada visualmente, foi
identificada quando aplicou-se 12,5 μg na placa cromatográfica. (figura 37).
Figura 37. Limites de detecção no ensaio bioautográfico para inibidores da acetilcolinesterase
por uma mistura contendo 76,3% de acetato de beta amirina e 23,7% de acetato de alfa
amirina (100 – 6,25 μg aplicados). O ensaio foi realizado com placa cromatográfica de silica
gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC (MACHEREY – NAGEL) e tolueno como sistema de
eluição. Protocolo descrito no item 3.7.1
O ácido ursólico apresenta inibição da enzima acetilcolinesterase de forma dose-
dependente e tipo competitivo/não-competitivo (CHUNG et al., 2001) e o ácido oleanólico é
considerado inativo (ALI et al., 2002).
O fato dos acetatos de beta- e alfa- amirina não possuírem outro grupamento polar
58
além da carbonila do éster, dificulta a realização do teste quantitativo, uma vez que este utiliza
diversas soluções aquosas. Contudo, isto pode se tornar uma vantagem se esta característica
apolar for capaz de aumentar a permeação por tecidos lipofílicos, atingindo mais facilmente
seu local de ação. Portanto, este trabalho abre a possibilidade de que modificações estruturais
e/ou soluções em termos tecnológicos permitam estudos destas substâncias como matéria-
prima para obtenção de inibidores da acetilcolinesterase.
4.5 - Atividade inseticida
Os inseticidas convencionais são frequentemente utilizados com sucesso frente a
pragas agrícolas. Entretanto, danos ao meio-ambiente e efeitos prejudicais à saúde animal,
têm estimulado o desenvolvimento de programas modernos para o controle de pragas com
impacto econômico relevante.
Neste contexto, reguladores de crescimento de insetos produzidos por plantas
aparecem como candidates promissores, uma vez que essas substâncias podem interferir em
processos hormonais e fisiológicos de artrópodes, além de serem considerados
ecologicamente seguros por sua natureza biodegradável. Os efeitos de indução da mortalidade
e defeitos morfogenéticos, redução da fertilidade e atrasos na muda, estão entre alguns
daqueles promovidos por inseticidas de origem natural. (SCHUMUTTERER, 1990; ISMAN,
2006).
Os metabólitos secundários representam uma interface química entre as plantas e o
ambiente circundante. Portanto, sua síntese é freqüentemente afetada por diferentes fatores,
dentre os quais podemos citar a radiação ultra-violeta, ritmo circadiano, sazonalidade,
herbivoria e ataque de patógenos (figura 38). Danos causados a plantas por ferimentos ou
ataque de herbívoros ou patógenos, freqüentemente levam a uma resposta bioquímica, que
reduz a aceitabilidade do órgão ou de todo o organismo a ataques futuros. (GOBBO-NETO &
LOPES, 2007).
Uma das espécies economicamente mais importantes é Dysdercus peruvianus, que
causa graves danos nos frutos, sementes e fibras de algodão, gerando grandes perdas nas
lavouras. (GALLO, 1988). A espécie Oncopeltus fasciatus, como inseto modelo para
pesquisas em entomologia, é também utilizado para testes de avaliação da atividade inseticida
(FEIR, 1974).
59
M. subsericea é descrita como uma planta hospedeira para diferentes espécies de
larvas (MONTEIRO et al. 2007). Com base nos conhecimentos de que a co-evolução de
espécies vegetais com insetos é capaz de induzir plantas a produzirem substâncias como
mecanismo de defesa, foi efetuada a avaliação da atividade inseticida de extratos e partições
de M. subsericea frente a duas espécies de fitófagos.
Figura 38. Influência de fatores externos na produção de metabólitos secundários
(GOBBO-NETO & LOPES, 2007)
Os resultados indicaram que estes extratos foram capazes, sob condições
experimentais, de inibir, ao menos parcialmente, a muda e a metamorfose, além de induzir a
mortalidade de ninfas de O fasciatus e D.peruvianus. Consequentemente, após o tratamento,
foi observado um baixo índice de indivíduos adultos. Além disso, 1 ± 1 % dos insetos da
espécie D. peruvianus tratados com os extratos hexânico, butanólico e diclorometânico de
frutos, apresentaram má-formação na asa (figura 39).
O tratamento tópico de D. peruvianus (4º estágio) com extrato hexânico de frutos de
M. subsericea (FH) causou uma mortalidade de 80% ±17,32 em 28 dias, enquanto nenhuma
morte foi observada no grupo controle (p<0,0001). Considerando as ninfas sobreviventes, o
periodo entre mudas foi maior (1-20 dias) quando comparado com o grupo controle (2-7 dias)
(p<0,0001).
60
Figura 39. A) D. peruvianus adulto saudável. B) D. peruvianus tratado com extrato hexânico
de M. subsericea com mal formação na asa e cutícula enrugada (estágio adulto).
O extrato acetato de etila resultante da partição efetuada no extrato etanólico de frutos
(FAE) não induziu mortalidade após 24 horas, porém, 66,66 % ± 30,55 (p <0,0001) das ninfas
morreram após 28 dias. Somente 3,33 % ± 5,77 de mudas entre os 4º e 5º períodos foram
observados (p<0.0001) após um período de 26 dias de muda (p<0,0001). Neste grupo,
nenhuma ninfa sofreu metamorfose. O extrato butanólico resultante da partição efetuada no
extrato etanólico de frutos (FB) causou mortalidade de 40% ± 20 no periodo de 28 dias
(p<0,001) e promoveu um atraso na muda do 4º para o 5º estágio (1-24 dias) (p<0,0001) e do
5º estágio para o estágio adulto 13-29 dias (p<0,0001). O extrato diclorometânico resultante
da partição efetuada no extrato etanólico de frutos (FD) causou 10% ± 10 de mortalidade em
24 horas (p<0,01) e 60% de mortalidade em 28 dias (p<0,001), além de promover um atraso
no muda para o 5º estágio (7-28 dias) (p<0,0001) e para o estágio adulto 14-21 dias
(p<0,001). Somente 10% ±10 dos insetos neste grupo efetuaram muda para o 5º estágio
(p<0,0001) e 3% sofreram metamorfose (p<0,0001). O extrato etanólico das folhas (FE)
apresentou 6,66% ± 5,77 de mortalidade em 24 horas (p<001) e 26,66% ± 20,81 (p<0,01) em
28 dias. Apenas 6,6 % ±11,54 das ninfas sofreram muda do 4º para o 5º estágio (p<0,0001),
em um período de (1–21 dias) (p<0,0001). Além disso, o periodo de muda do 5º estágio para
o estágio adulto foi de 14-21 dias (p<0,001), com 4.88 ± 5,77 % de metamorfose. Os demais
resultados encontram-se listados na tabela 6.
A B
61
Tabela 6. Avaliação da atividade biológica de extratos de M. subsericea no desenvolvimento
de Dysdercus peruvianus
Grupos Mortalidade
24hrs (%)
Mortalidade
28 dias (%)
* Muda para o
5º estágio (%)
Período
de
muda
para o
5º
estágio
(dias)
**Metamorfose
(%)
Período
de
muda
para
estágio
adulto
(dias)
Controle - - 100 ± 0 2-7 100 ± 0 12-16
FH 0,66 ± 1,15 80 ± 17,32c
3,33 ± 5,77c
1-20c
3,33 ± 5,77c
13-17
FAE - 66,67 ± 30,55c
3,33 ± 5,77c
3-29c
- 13-18a
FB - 40 ± 20b
20 ± 17,32c
1-24c
12 ± 5,77c
13-29c
FD 10 ± 10a
60b
10 ± 10c
7-28c
3 ± 1c
14-21b
FE 6,66 ± 5,77a
26,66 ± 20,81a
6,66 ± 11,54c
1-21c
4,88 ± 5,77c
14-21b
p > 0,05
– Sem significância; a (p< 0,01);
b (p< 0,001);
c (p< 0,0001)
* Muda das ninfas sobreviventes para o 5º estágio (%)
**Muda das ninfas sobreviventes para o estágio adulto (%)
Extrato hexânico de frutos (FH), extrato diclorometânico de frutos (FD), extrato acetato de etila de
frutos (FAE), extrato butanólico de frutos (FB), extrato etanólico de folhas (FE), controle (etanol 96 %
v/v)
A avaliação da atividade dos extratos de M. subsericea frente a O. fasciatus indicou
que o tratamento tópico com o extrato hexânico resultante da partição efetuada no extrato
etanólico de frutos (FH) causou uma mortalidade de 10% nas primeiras 24 horas (p<0,01) e
60% em 28 dias (p<0,001), enquanto no grupo controle houve uma taxa de mortalidade de
13,33 ± 15,27 % após o término do experimento (28 dias). O periodo de muda para o 5º
estágio foi de 1-43 dias com uma taxa de 3,33±5,77 % (p<0.0001) de muda, enquanto o grupo
controle atingiu este mesmo estágio em período mais curto (1-8 dias) (p<0,0001). Somente
3,33±5,77 dos insetos sofreram metamorfose para o estágio adulto (p<0,0001), após um
periodo prolongado de 14-21 dias (p<0,01). O extrato acetato de etila resultante da partição
efetuada no extrato etanólico de frutos (FAE) induziu 50±20 % (p<0,001) de mortalidade
após 28 dias e apenas 3,33±5,77 % atingiram o 5º estágio (p<0,0001) após 26 dias de muda
62
(p<0,0001). Entretanto, apenas 1,58±1% de metamorfose (p<0,0001) foi observada. O extrato
butanólico resultante da partição efetuada no extrato etanólico de frutos (FB) causou
26,66±5,77 de mortalidade em 28 (p<0.01). Foi verificado um período prolongado de muda
para o 5º estágio (1–30 dias) (p<0,0001), porém, somente 3,33±5,77 % (p<0,0001) das ninfas
no 4º estágio sofreram muda. Somente 2,3±1% das ninfas no 5º estágio sofreram
metamorfose para o estágio adulto (p<0,0001), em um intervalo curto de apenas um dia
(p<0,01). O extrato diclorometânico resultante da partição efetuada no extrato etanólico de
frutos (FD) induziu taxas de mortalidade de 10% (p<0,01) em 24 horas e 60% (p<0,001) em
28 dias. Foi observado um período prolongado de muda para o 5º estágio de 19 dias
(p<0,0001), sendo que apenas 10% das ninfas atingiram este estágio (p<0,0001). Além disso,
o tratamento com este extrato reduziu a taxa de metamorfose para 4±1 % (p<0,0001) em um
curto espaço de aproximadamente um dia. O extrato etanólico de folhas (FE) causou
66,66±5,77 % (p<0.001) de mortalidade após 28 dias e apenas 3,33±5,77 % (p<0,0001) das
ninfas atingiram o 5º estágio (3-14 dias) (p<0,001). Os resultados encontram-se listados na
tabela 7.
63
Tabela 7. Avaliação da atividade biológica de extratos de M. subsericea no desenvolvimento
de O. fasciatus
Grupos Mortalidade
24 hrs (%)
Mortalidade
28 dias (%)
*Muda para o 5º
estágio (%)
Período de muda
para o 5º estágio
(dias)
**Metamorfose
(%)
Período de
muda para o
estágio adulto
(dias)
Controle - 13,33±15,27 86,67±15,25 1– 8 86,67±15,27 12 – 16
FH 10±10 a 60±20
b 3,33±5,77
c 1 – 43
c 3,33±5,77
c 14 – 21
a
FAE - 50±20 b 3,33±5,77
c 3 – 29
c 1,58±1 c 14 – 15
a
FB - 26,66±5,77 a 3,33±5,77
c 1 – 30
c 2,3±1c 14 – 14
a
FD 10 a 60
b 10
c 2 – 21
c 4±1c 14 –14
a
FE - 66,66±5,77 b 3,33±5,77
c 3 – 14
c - -
p > 0,05
– Sem significância; a (p< 0,01);
b (p< 0,001);
c (p< 0,0001)
* Muda das ninfas sobreviventes para o 5º estágio (%)
**Muda das ninfas sobreviventes para o estágio adulto (%)
Extrato hexânico de frutos (FH), extrato diclorometânico de frutos (FD), extrato acetato de etila de
frutos (FAE), extrato butanólico de frutos (FB), extrato etanólico de folhas (FE), controle (etanol 96 %
v/v)
O extrato hexânico resultante da partição efetuada no extrato etanólico de frutos
induziu os maiores indices de mortalidade em D. peruvianus. Quando testado frente a O.
fasciatus, a partição hexânica de frutos gerou o maior período entre muda, tanto para o 5º
período quanto para o estágio adulto.
Com o intuito de identificar quais possíveis substâncias eram responsáveis pela
atividade, foi avaliada a atividade inseticida de uma mistura contendo acetato de beta-amirina
e acetato de alfa-amirina. Esta mistura de triterpenos foi isolada por coluna cromatográfica
contendo gel de sílica a partir do extrato hexânico, uma vez que este foi considerado ativo
frente aos insetos testados.
Na avaliação da atividade inseticida frente a D. peruvianus, a mistura dos acetatos de
beta- e alfa-amirina induziram uma mortalidade de 10 ± 0 % no período de 24 horas e 46,66 ±
64
11,54 % no período de 28 dias. Dentre as ninfas sobreviventes, 16,66 ± 28,86 % sofreram
muda do 4º para o 5º estágio, em um intervalo de 1-16 dias e 53,33 ± 11,54 % sofreram
metamorfose do 5º estágio para o estágio adulto em um período de 14-29 dias.
Quando testada frente a O. fasciatus, essa mistura induziu 10 % de mortalidade em 24
horas e 20 % de mortalidade em 28 dias. Das ninfas sobreviventes, 10 % sofreram muda do 4º
para o 5º estágio (1-21 dias) e 80 % sofreram metamorfose do 5º estágio para o estágio adulto
(14-28 dias).
Apesar de ter sido consideravelmente ativa, a mistura dos acetatos de beta- e alfa-
amirina apresentou efeitos menos expressivos que o extrato hexânico dos frutos. Os
terpenóides são capazes de produzir efeitos sinérgicos com substâncias de outras classes,
gerando atividades tóxicas mais pronunciadas e uma menor geração de resistência (RATTAN,
2010). O fato de vários mecanismos de ação estarem envolvidos, modulados por diferentes
substâncias presentes nos extratos, pode contribuir para o menor desenvolvimento de
resistência aos bioinseticidas obtidos de fontes naturais.
Portanto, este estudo realizado com extratos e partições de M. subsericea frente aos
fitófagos D. peruvianus e O. fasciatus, indica o potencial deste espécie como fonte para novos
bioinseticidas. Além disso, foi possível identificar que os componentes majoritários do extrato
hexânico de frutos também exerceram atividade, indicando que o acetato de beta amirina e o
acetato de alfa amirina podem ser utilizados como marcadores químicos para o controle de
qualidade de possíveis produtos bioinseticidas obtidos do extrato proveniente da espécie
Manilkara subsericea.
65
5 – CONCLUSÃO
O fracionamento da partição em hexano do extrato etanólico dos frutos permitiu o
isolamento de uma fração denominada FH2P. A elucidação estrutural por RMN de 1H e
13C
permitiu a identificação desta como uma mistura dos ácidos ursólico e oleanólico.
O teste biautográfico para pesquisa de substâncias inibidoras da acetilcolinesterase
realizado com a partição em hexano do extrato etanólico dos frutos, permitiu a visualização de
áreas correspondentes a inibidores desta enzima. O isolamento da fração FH1 por
cromatografia de adsorção em coluna de gel de sílica e posterior purificação por
cromatografia em camada fina em escala preparativa (fase normal), permitiu a obtenção da
fração FH1X. Uma nova realização do teste bioautográfico indicou que esta era responsável
pela inibição da acetilcolinesterase em Rf 0,43 (tolueno). A análise por cromatografia gasosa
acoplada a espectrometria de massas indicou que a fração FH1X era, na verdade, constituída
por dois isômeros estruturais com pico do íon molecular em m/z 468. Esta técnica, em
conjunto com dados obtidos de RMN de 1H e
13 C permitiu identificar FH1X como uma
mistura contendo 76,3% de acetato de beta amirina e 23,7% de acetato de alfa amirina. Foi
possível verificar com sucesso o limite de detecção desta mistura no ensaio biautográfico
(12,5µg). Este resultado também abre a oportunidade de realizar um trabalho tecnológico, em
que o incremento na solubilidade, tal como na incorporação de substância apolares em
nanoemulsões estáveis, aparece como uma alternativa para a realização de testes para
substâncias com tais características.
O teste de atividade inseticida, onde os extratos de M. subsericea foram testados frente
a Dysdercus peruvianus e Oncopeltus fasciatus indicou que o extrato hexânico resultante da
partição do extrato etanólico de frutos induziu uma taxa de mortalidade de aproximadamente
80 % e 60% após 28 dias, respectivamente, para ninfas de D. peruvianus e O. fasciatus. O
teste com os acetatos de beta e alfa amirina isolados deste extrato induziu uma mortalidade de
aproximadamente 46,66 % e 20 % após 28 dias de tratamento, respectivamente, para ninfas de
D. peruvianus e O. fasciatus. Esse resultado indica que tais substâncias atuam, ao menos
parcialmente na modulação da atividade inseticida do extrato hexânico resultante da partição
do extrato etanólico de frutos e pode ser utilizada como marcador químico em uma futura
formulação para esta finalidade.
66
No teste de difusão em disco foram observados diferentes halos de inibição para os
extratos testados frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923, sendo que o extrato etanólico
de caules apresentou o maior deles (8 mm). Contudo, o fato de um halo ser visualizado com
menor diâmetro, como no caso da mistura de acetato de beta e acetato de alfa amirina (6 mm),
não exclui uma atividade em potencial. Os halos estão relacionados a capacidade do extrato
de permear pelo meio de cultura, e consequentemente inibir o crescimento bacteriano.
Portanto, aqueles menos polares terão mais dificuldade de se difundir pelo meio, gerando
halos menores. Em um segundo momento, os extratos que apresentaram halo de inibiçãos
foram testados frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 para avaliação de sua
concentração mínima inibitória (CMI) e todos apresentaram uma mesma CMI (250 µg/mL).
Quando testados frente a Escherichia coli ATCC 25922., apenas o extrato butanólico
resultante da partição do extrato etanólico de caules se mostrou ativo pelo método de difusão
em disco (7 mm).
A realização deste trabalho permitiu o isolamento e identificação de duas frações
contendo uma delas os acetatos de beta e alfa amirina, e outra contendo os ácidos ursólico e
oleanólico. Também foi possível identificar um ácido graxo e 3 ésteres presentes no extrato
hexânico de frutos resultante da partição do extrato etanólico de M. subsericea (ácido
hexadecanóico, hexadecanoato de etila, (E)-9-octadeeanoato de etila e octadecanoato de etila).
Também foi possível observar a atividade antibacteriana, anticolinesterásica e inseticida dos
extratos desta espécie, além da atividade anticolinesterásica e inseticida da mistura de acetatos
de beta e alfa amirina.
Esperamos com este estudo, contribuir para a valorização desta espécie, através da
divulgação de sua constituição química e atividades biológicas. Acreditamos que este trabalho
também contribuirá para a preservação desta e de outras espécies nativas do Parque Nacional
da Restinga de Jurubatiba.
67
6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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