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Bolsa de Integraç
Estudo da Camada de Plasma e
Bolsa de Integração na Investigação (BII)
CEFT/BII/2009/01
da Camada de Plasma e
Microcanais
Cátia Marisa Lourenço
Engenharia Biomédica
Porto, Dezembro
o (BII)
da Camada de Plasma em
Marisa Lourenço Fidalgo
Engenharia Biomédica
Dezembro 2010
Estudo da Camada de
Cátia Fidalgo
Bolsa de Integração na Investigação (BII)
CEFT/BII/2009/01
______________________________________________________________________
Estudo da Camada de Plasma e
______________________________________________________________________
Com a colaboração de:
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Bolsa de Integração na Investigação (BII)
______________________________________________________________________
Estudo da Camada de Plasma e
Microcanais
______________________________________________________________________
Orientado por: Rui Lima
Co-Orientado por: Ricardo Dias
Realizado por: Cátia Marisa Lourenço Fidalgo
2
______________________________________________________________________
Estudo da Camada de Plasma em
______________________________________________________________________
Cátia Marisa Lourenço Fidalgo
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 3
Agradecimentos
À Fundação para a Ciência e Tecnologia pela bolsa concedida no âmbito da
Bolsa de Integração na Investigação CEFT/BII/2009/01.
Ao orientador, Professor Drº Rui Lima, por todo o apoio, orientação e dedicação
que me deu na realização deste projecto, fico-lhe muito agradecida.
Ao Drº Ricardo Dias, pelo incentivo, simpatia e atenção ao longo do projecto.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 4
Resumo
Tem havido um interesse crescente, por parte da comunidade científica na área
da Engenharia Biomédica, na concepção de microdispositivos como ferramentas
alternativas no diagnóstico de doenças cardiovasculares e cancerígenas. É, portanto,
importante compreender o comportamento do escoamento sanguíneo neste tipo de
microdispositivos, de forma a optimizar a concepção e utilização de biochips para
análises clínicas. Assim, neste projecto pretendeu-se estudar as principais variáveis que
influenciam a formação da camada de plasma em microcanais circulares de vidro e
polidimetilsiloxano (PDMS).
Após a obtenção de vários vídeos por intermédio de um sistema de
microvisualização confocal, o presente estudo concentrou-se essencialmente na
utilização de um método de análise de imagem para a medição da espessura da camada
de plasma em microcanais de vidro borosilicato com diâmetros de aproximadamente
100µm. Assim, com o auxílio do Image J (NIH) e do plugin MtrackJ foi possível
investigar a influência do hematócrito (Hct) no comportamento da camada de plasma
neste tipo microcanais.
Os resultados sugerem que a espessura da camada de plasma livre de células
sanguíneas tende a aumentar com a diminuição do Hct e com o aumento do diâmetro do
microcanal.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 5
Abstract
In recent years, there has been a growing interest by the biomedical community
to develop biochips as an alternative tool to diagnose both cardiovascular and cancer
diseases. It is therefore important to understand the behavior of the blood flow and this
type of microdevices in order to optimize the design and the use of biochips for clinical
analysis. Thus, in this project it is aimed to study the main variables that influence the
formation of the plasma layer in circular microchannels of borosilicate glass and
polydimethylsiloxane (PDMS).
After obtaining several videos through a confocal microvisualization system,
this study focused primarily on the use of a method of image analysis for measuring the
thickness of the plasma layer in a microchannel of borosilicate glass with diameters of
about 100 µm. With the help of the Image J (NIH) and the plugin MtrackJ it was
possible to investigate the influence of the hematocrit (Hct) on the behavior of the
plasma layer in such kind of microchannels.
The results suggest that the thickness of the blood-cell-free layer tends to
increase with the decrease of the Hct and with the increase of the diameter of the
microchannel.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 6
Índice
Resumo ............................................................................................................................. 4
Abstract ............................................................................................................................. 5
Índice de Figuras .............................................................................................................. 8
Índice de Tabelas ............................................................................................................ 10
Nomenclatura.................................................................................................................. 11
1. Introdução ............................................................................................................ 12
2. O Sangue ............................................................................................................. 14
2.1. Constituição do Sangue ................................................................................... 14
2.1.1. Glóbulos Vermelhos ................................................................................. 14
2.1.2. Glóbulos Brancos ..................................................................................... 16
2.1.3. Plaquetas sanguíneas ................................................................................ 17
2.1.4. Plasma Sanguíneo ..................................................................................... 17
2.2. Comportamento dos Fluidos ............................................................................ 19
2.3. Viscosidade Sanguínea .................................................................................... 20
2.4. Escoamento Sanguíneo .................................................................................... 22
2.5. Velocidade do Sangue ..................................................................................... 24
3. Microcanais e Fluidos Fisiológicos ..................................................................... 25
3.1. Capilares de Vidro Borosilicato ....................................................................... 25
3.2. Dextran 40 (Dx40) ........................................................................................... 26
3.3. Etilenodiamino tetra-acético (EDTA) .............................................................. 26
3.4. Soro Fisiológico ............................................................................................... 27
4. Software para o Estudo da Camada de Plasma.................................................... 28
4.1. Phantom ........................................................................................................... 28
4.2. Image J ............................................................................................................. 28
4.2.1. “Z-Project”................................................................................................ 29
4.2.2. “MTrackJ” ................................................................................................ 30
4.2.3. “Brightness/Contrast” ............................................................................... 31
4.2.4. “Find Edges” ............................................................................................ 32
4.2.5. “Binary” .................................................................................................... 33
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 7
5. Procedimento Experimental ................................................................................ 34
5.1. Materiais e Métodos ......................................................................................... 34
5.1.1. Microcanais e Fluidos Utilizados ............................................................. 34
5.2. Aquisição de Imagens ...................................................................................... 35
5.3. Image J ............................................................................................................. 36
5.3.1. “Z-Project”................................................................................................ 37
5.3.2. “MTrackJ” ................................................................................................ 38
5.4. Processamento em Excel ................................................................................. 41
6. Resultados Experimentais ................................................................................... 42
6.1. Análise e processamento de imagem ............................................................... 43
6.2. Resultados da Espessura da Camada de Plasma .............................................. 49
7. Análise e Discussão dos Resultados .................................................................... 56
8. Conclusões e Trabalho Futuro ............................................................................. 61
8.1. Conclusões ....................................................................................................... 61
8.2. Trabalho Futuro ............................................................................................... 62
9. Referências Bibliográficas ................................................................................... 63
Anexos ............................................................................................................................ 66
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 8
Índice de Figuras
Figura 2.1 Capilar sanguíneo ……………………………………………...………….14
Figura 2.2 Estrutura dos glóbulos vermelhos ……………………………...…………15
Figura 2.3 Técnica de obtenção do hematócrito ……………………………...……....16
Figura 2.4 Representação dos tipos de leucócitos ……………………………...…….17
Figura 2.5 Ilustração do plasma numa amostra sanguínea ………………………...…18
Figura 2.6 Variação da tensão de corte em relação ao gradiente de velocidade
………………………………………………………………………………..………...20
Figura 2.7 Variação da viscosidade com o hematócrito ……………………………...20
Figura 2.8 Efeito da viscosidade do sangue in vitro através de capilares de vidro ......21
Figura 2.9 Escoamento laminar e turbulento num tubo de vidro ……………………..23
Figura 3.1 Modelo do microcanal de vidro …………………………………….……..25
Figura 4.1 Esquematização do procedimento para o comando “Z-Project” ………….29
Figura 4.2 Imagem de um microcanal com 15% Hct ……………………………...…30
Figura4.3 (a) Imagem aplicando a intensidade máxima (15% Hct); (b) Imagem
aplicando a intensidade mínima (15% Hct) ……...…………………………………....30
Figura 4.4 Esquematização do “MTrackJ” ……………………….…………...…..….31
Figura 4.5 Esquematização do “Brightness/Contrast” ……………….…….……...….31
Figura 4.6 (a) Imagem original com 24% Hct; (b) Imagem aplicando o
“Brightness/Contrast” ………………………………………………………………....32
Figura 4.7 (a) Imagem depois de aplicada a intensidade máxima com 9% Hct; (b)
Imagem aplicando o “Find Edges” ……..……………………………………………..32
Figura 4.8 Esquematização do “Binary” ……………………………………………...33
Figura 5.1 Representação da preparação das amostras de sangue …………...……….35
Figura 5.2 Esquematização de todos os elementos usados na aquisição de imagem ...36
Figura 5.3 Procedimento para a análise de imagem: (a) Imagem original; (b) Imagem
resultante da intensidade máxima do “Z-Project”; (c) Imagem resultante da aplicação
do “Find Edges” e (d) Imagem com a análise do MTrack J. ………………………….38
Figura 5.4 Representação de uma análise por trajectória de um GV (neste caso na PB),
com 35% Hct …………...…………………………………………………………...…39
Figura 5.5 Imagem de 15% Hct com os pontos da análise ……...………………...….40
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 9
Figura 6.1 Imagem melhorada com 35% de hematócrito …………………………….42
Figura 6.2 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”) ...……43
Figura 6.3 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………….43
Figura 6.4 Imagem resultante do método das trajectórias dos GVs (“Tracking”) …....44
Figura 6.5 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………….44
Figura 6.6 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”) ..…….45
Figura 6.7 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………….45
Figura 6.8 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”) ...……46
Figura 6.9 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………….46
Figura 6.10 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………...47
Figura 6.11 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”) .……47
Figura 6.12 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………...48
Figura 6.13 Imagem resultante do método do “Z-Project” …………………………...48
Figura 6.14 Representação gráfica da variação da ECP para 35% hematócrito ……...50
Figura 6.15 Representação gráfica da variação da ECP para 24% hematócrito …...…51
Figura 6.16 Representação gráfica da variação da ECP para 15% hematócrito ...……52
Figura 6.17 Representação gráfica da variação da ECP para 9% hematócrito …...…..53
Figura 6.18 Representação gráfica da variação da ECP para 2% hematócrito .……....54
Figura 7.1 Representação gráfica da variação da ECP para todos os hematócritos para
microcanais de vidro ………………………………………………………………......57
Figura 7.2 Representação gráfica da variação da ECP para todos os hematócritos para
microcanais de diâmetro 100µm (35%, 24%, 15% e 2%), 92µm (9%) e 75µm para o
caso dos microcanais em PDMS……………………………………………………….59
Figura 7.3 Representação gráfica da espessura da camada de plasma em função do
diâmetro do microvaso in vivo, adaptado de [31] ………………………………………60
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 10
Índice de Tabelas
Tabela 6.1 Resultados da média da ECP para 35% Hct ……………………………...50
Tabela 6.2 Resultados da média da ECP para 24% Hct ……………………………...51
Tabela 6.3 Resultados da média da ECP para 15% Hct ……………………………...52
Tabela 6.4 Resultados da média da ECP para 9% Hct ……………………………….53
Tabela 6.5 Resultados da média da ECP para 2% Hct ……………………………….54
Tabela 7.1 Resultados da ECP em microcanais de PDMS …………………………...56
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 11
Nomenclatura
GV- Glóbulo vermelho;
Hct – Hematócrito;
ECP – Espessura da Camada de Plasma;
PC – Parede de Cima;
PB – Parede de Baixo;
PDMS – Polidimetilsiloxano;
Dx40 – Dextran 40;
EDTA - Etilenodiamino tetra-acético;
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 12
1. Introdução
Diversos estudos têm demonstrado a importância de estudar o escoamento
sanguíneo na microcirculação. Isto porque existem inúmeras doenças que afectam tanto
os vasos sanguíneos de pequeno calibre como o próprio sangue. Assim, torna-se muito
importante melhorar os nossos conhecimentos por forma a encontrar soluções para estes
problemas. Para tal, já se efectuaram estudos sobre os efeitos de várias doenças nas
propriedades do sangue na microcirculação, que podem afectar a viscosidade do plasma,
a concentração de glóbulos vermelhos (GVs), propriedades mecânicas dos eritrócitos,
viscosidade da membrana, entre outras.
Recentemente, tem havido também interesse por parte da comunidade científica na
área da Engenharia Biomédica, na concepção de microdispositivos como ferramentas
alternativas de análises clínicas. Assim, torna-se imperativo estudar o comportamento
do escoamento sanguíneo em microcanais in vitro, tais como microcanais de vidro em
borosilicato e PDMS, de forma a optimizar a concepção e utilização deste tipo de
microdispositivos em aplicações biomédicas.
O principal objectivo deste projecto consiste na determinação da espessura da
camada de plasma (ECP) em microcanais de vidro borosilicato para diferentes
hematócritos (Hcts). Os microcanais têm diâmetro de 100µm ±2 excepto o caso de 9%
hematócrito em que o microcanal tem apenas 92µm.
O escoamento sanguíneo tem vindo a ser estudado em microcanais de vidro ao
longo dos anos, devido às semelhanças com o escoamento in vivo, apresentando
fenómenos hemodinâmicos como por exemplo o efeito de Fahraeus-Lindqvist. Este
efeito está muito relacionado com o diâmetro do microcanal em análise, tendo grande
importância quando é realizado um estudo como a determinação da ECP em
microcanais de vidro.
Através de um sistema de microvisualização, Micro-PTV Confocal, foi possível,
numa primeira fase, obter as imagens do escoamento sanguíneo com diferentes
hematócritos. Estas imagens foram posteriormente analisadas usando o programa de
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 13
análise de imagem Image J, com o qual foi possível determinar a ECP, sendo este o
principal objectivo deste trabalho.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 14
2. O Sangue
2.1. Constituição do Sangue
O sangue é uma substância líquida que circula nas artérias e veias do organismo.
Pode ser descrito como um fluido opaco, com viscosidade superior à água e heterogéneo
sendo constituído por um líquido claro – plasma – e uma série de componentes
elementares.
Num adulto saudável com cerca de 70Kg de peso, o volume de sangue corresponde
a aproximadamente 7% do peso do corpo, a que correspondem cerca de 5 litros, dos
quais quase 60% é plasma.
Na Figura seguinte (2.1), é possível observar um vaso sanguíneo em corte, onde se
podem visualizar vários elementos (glóbulos vermelhos e brancos e plaquetas)
suspensos no plasma sanguíneo [10].
Figura 2.1 Capilar sanguíneo. [11]
2.1.1. Glóbulos Vermelhos
Os glóbulos vermelhos são unidades morfológicas da parte vermelha do sangue,
também são conhecidos por eritrócitos ou hemácias. São cerca de 700 vezes mais
numerosos que os leucócitos (glóbulos brancos) e 17 vezes mais que as plaquetas. Em
condições normais existem no sangue aproximadamente 4.5 a 6.5x106/mm3, variando
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 15
do sexo masculino (5.2 milhões de eritrócitos/mm3) para o sexo feminino (4.5 milhões
de eritrócitos/mm3).
São constituídos basicamente por globulina e hemoglobina, esta última
composta por 4 moléculas proteicas de estrutura terciária e 4 grupos heme que contêm
ferro. A sua principal função é transportar o oxigénio (maior quantidade) e o dióxido de
carbono (menor quantidade) para os tecidos; têm um período de vida de
aproximadamente 120 dias [1], [12].
Figura 2.2 Estrutura dos glóbulos vermelhos. [13]
Os eritrócitos não se movem activamente, são movidos através da circulação
pelas forças responsáveis pela circulação sanguínea. Apresentam a forma de disco
bicôncavo, com cerca de 7.5 µm (micrómetros) de diâmetro com as extremidades mais
espessas que o centro da célula (Figura 2.2). De modo a tornar mais fácil o seu
movimento pelos pequenos vasos sanguíneos, os eritrócitos dobram-se pelo centro.
2.1.1.1. Hematócrito (Htc)
O hematócrito é a percentagem ocupada pelos glóbulos vermelhos no volume
total de sangue. Antigamente era usado o método do microhematócrito onde a
percentagem de eritrócitos era obtida pela centrifugação a 10000 r.p.m. durante 5
minutos do sangue dentro de um tubo capilar.
Actualmente é obtido recorrendo a aparelhos automatizados. Esta metodologia
automatizada não mede directamente o hematócrito, mede o volume dos eritrócitos ou o
tamanho médio dos eritrócitos (VCM) e quantifica o número de eritrócitos no sangue
(Figura 2.3), sendo calculado da seguinte forma:
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 16
��� � ��� �ú�� �� ��á����
10
Os valores médios diferem segundo o sexo e a idade, podendo variar 36%-52%,
sendo nos homens 42%-52% e nas mulheres 36%-48%. Esta é uma medida cada vez
mais importante para efeitos clínicos. Caso o valor seja inferior à média significa que
existe pouca quantidade de eritrócitos, o que pode levar a hemorragias, anemias e
leucemias. Caso o valor seja superior à média existem muitos eritrócitos em relação ao
volume de sangue, podendo ocorrer doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) [14].
Figura 2.3 Técnica de obtenção do hematócrito. [15]
2.1.2. Glóbulos Brancos
Os glóbulos brancos ou leucócitos são células produzidas na medula óssea, que
estão presentes no sangue, linfa, órgãos linfóides e vários tecidos conjuntivos. Têm a
função de combater os microrganismos que causam doenças fazendo a sua captura ou
usando anticorpos. Existem três tipos de leucócitos: os granulados (50 a 60%), os
agranulados ou linfáticos (30 a 40%) e os monócitos (até 7%) (Figura 2.4).
Os leucócitos são capazes de realizar a diapdese (migrar para fora dos vasos
capilares) e também a fagocitose que é a captura de organismos estranhos por projecção
das suas extremidades (pseudópodes).
Um adulto normal possui entre 3.800 e 9.800 mil leucócitos/mm3 de sangue e
pode produzir aproximadamente 100 milhões de leucócitos por dia. Uma quantidade
muito pequena de leucócitos (leucopenia) ou muito grande de leucócitos (leucocitose)
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 17
indica um distúrbio. No caso da leucopenia, o indivíduo fica susceptível a infecções, no
caso da leucocitose pode ser uma resposta a infecções ou a substâncias estranhas [16].
Figura 2.4 Representação dos tipos de leucócitos. [17]
2.1.3. Plaquetas sanguíneas
A plaqueta sanguínea ou trombócito é um fragmento de célula presente no
sangue que é formado na medula óssea. A sua principal função é a formação de
coágulos, tendo um papel muito importante na coagulação sanguínea. As plaquetas
estão em circulação no sangue durante cerca de 5 dias sendo depois destruídas no baço.
Um indivíduo normal tem entre 150.000 e 400.000 plaquetas/mm3 de sangue. A
sua diminuição (trombocitopenia) ou disfunção pode levar a sangramentos e o seu
aumento (trombocitose) eleva o risco de trombose [18].
2.1.4. Plasma Sanguíneo
Todos os fluidos fora do compartimento celular constituem o fluído extracelular,
do qual 1 4� ou cerca de 3 litros (considerando um adulto com cerca de 70Kg) está no
interior de vasos sanguíneos constituindo o plasma, a porção líquida ou não celular do
sangue.
O plasma é um líquido (92% água) amarelado e claro no qual as células
sanguíneas estão suspensas; é o maior componente único do sangue, correspondendo a
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 18
55% do volume total do sangue, como se pode observar na Figura 2.5. Contém
inúmeras substâncias em solução ou suspensão, substâncias de pequeno e elevado peso
molecular, correspondendo a 10% do volume de plasma. Destas substâncias, as
proteínas plasmáticas correspondem a 7%, os sais inorgânicos são cerca de 0,9% e o
restante são compostos orgânicos diversos: aminoácidos, glicose, vitaminas, mediadores
químicos, entre outros.
A concentração total de proteína plasmática é aproximadamente 7.0-7.5g/dl
incluindo não só proteínas simples mas também conjugadas: lipoproteínas e
glicoproteínas. É possível separar as proteínas plasmáticas em três grupos: as
albuminas, as globulinas e o fibrinogénio (proteínas da coagulação) [10].
Figura 2.5 Ilustração do plasma numa amostra sanguínea. [20]
A principal função do plasma é transportar as proteínas e as substâncias
dissolvidas, como nutrientes, medicamentos, produtos tóxicos (por exemplo o dióxido
de carbono que as células eliminam) e também transporta para todo o corpo os
medicamentos ingeridos.
O plasma permite uma troca livre dos seus componentes com o líquido
intersticial, através dos poros existentes na membrana capilar. As proteínas plasmáticas
em condições normais, não atravessam a membrana devido às suas grandes dimensões,
permanecendo assim no plasma. O mesmo não acontece com a água e outras
substâncias dissolvidas, que atravessam a membrana facilmente.
A saída de água do plasma através dos capilares é controlada pela pressão
coleidosmótica e pelo estado da permeabilidade das membranas, ou seja, as proteínas
extraem água dos tecidos para os capilares mas dificultam a sua saída dos capilares para
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 19
os tecidos. O principal responsável pela manutenção da pressão coleidosmótica no
plasma é a albumina.
Um método simples de separar as células do sangue do plasma é através de
centrifugação, sendo mais específico a plasmaferese que separa o plasma das hemácias.
Se ao plasma sanguíneo forem retirados os factores de coagulação naturalmente
(como a fibrina), este fica com o nome de soro sanguíneo. Este soro é obtido através da
coagulação do sangue total pois os factores de coagulação foram consumidos pela
coagulação das hemácias.
O plasma não é um meio de armazenamento e transporte para os factores de
coagulação, as proteínas envolventes são necessárias para manter a pressão oncótica do
sangue [19].
2.2. Comportamento dos Fluidos
Os fluidos podem ter dois comportamentos distintos: pode ser newtoniano ou não-
newtoniano, como pode ser observado na Figura 2.6.
Um fluido newtoniano é um fluido em que a tensão de corte aumenta
proporcionalmente com a taxa de deformação. Apresentam a mesma viscosidade em
qualquer velocidade do escoamento. Como exemplos temos a água, gases, plasma e
líquidos com uma forma química simples, em condições normais.
Um fluido não-newtoniano é aquele em que a viscosidade varia de acordo com o
grau de deformação aplicado, e sendo assim, não tem viscosidade bem definida. Alguns
exemplos são suspensões coloidais, emulsões e géis, o sangue é também um exemplo de
um fluido não-newtoniano, pois não apresenta um comportamento linear [28],[29].
Estudo da Camada de
Cátia Fidalgo
Figura 2.6 Variação da tensão de corte em relação ao gradiente de velocidade.
2.3. Viscosidade Sanguínea
A viscosidade do sangue depende directamente da quantidade de sangue composta
por hematócrito. Quanto ma
sangue, então a viscosidade aumenta significativamente com o aumento do hematócrito.
É possível observar esta relação
Figura 2.7
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Variação da tensão de corte em relação ao gradiente de velocidade.
Viscosidade Sanguínea
A viscosidade do sangue depende directamente da quantidade de sangue composta
por hematócrito. Quanto maior o hematócrito, maior é o atrito entre as camadas de
sangue, então a viscosidade aumenta significativamente com o aumento do hematócrito.
É possível observar esta relação no gráfico seguinte (Figura 2.7).
Figura 2.7 Variação da viscosidade com o hematócrito. [22]
20
Variação da tensão de corte em relação ao gradiente de velocidade. [29]
A viscosidade do sangue depende directamente da quantidade de sangue composta
ior o hematócrito, maior é o atrito entre as camadas de
sangue, então a viscosidade aumenta significativamente com o aumento do hematócrito.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 21
Como a resistência no sistema circulatório é maior nos vasos de pequeno calibre
(capilares), é importante estudar o comportamento da viscosidade nestes vasos. Além do
hematócrito e das proteínas plasmáticas, existem outros factores que afectam a
viscosidade sanguínea.
Um dos factores é o comportamento da viscosidade nos pequenos vasos em relação
aos grandes vasos; nos pequenos vasos, a viscosidade tem muito menos efeitos. Este
efeito denomina-se efeito de Fahraeus-Lindqvist, que começa a notar-se quando o
diâmetro do vaso é menor que 1.5mm, aproximadamente. Nos capilares, este efeito é
muito acentuado, pois, teoricamente, a viscosidade nos pequenos vasos deveria ser
metade da observada nos grandes vasos, o que não se verifica, como se pode observar
na Figura 2.8.
Figura 2.8 Efeito da viscosidade do sangue in vitro através de capilares de vidro. [23]
O efeito Fahraeus-Lindqvist pode ser causado pelo alinhamento das hemácias
quando atravessam os vasos. As hemácias alinham-se no centro do vaso e o plasma
junto às paredes dos vasos, eliminando-se assim a resistência viscosa característica do
sangue.
Por outro lado, este efeito é compensado pela velocidade do fluxo e pelo
acoplamento de células. A viscosidade sanguínea aumenta significativamente quando há
uma queda na velocidade do fluxo. Assim, como a velocidade do fluxo nos pequenos
vasos é muito baixa, por vezes menor que 1mm/s., a viscosidade pode aumentar até 10
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 22
vezes mais por este motivo. Este efeito pode ser causado pela aderência das hemácias
entre si e às paredes dos vasos [22],[23].
2.4. Escoamento Sanguíneo
O escoamento sanguíneo varia bastante nos diferentes tecidos. Alguns tecidos
necessitam de um escoamento bastante maior do que outros. Os tecidos esqueléticos
apresentam grandes variações no escoamento sanguíneo em diferentes situações.
Durante o repouso, o escoamento é relativamente pequeno, mas aumenta
significativamente durante o trabalho, quando existe um acréscimo não só do consumo
de oxigénio e nutrientes como também da produção de dióxido de carbono.
Através de uma vasoconstrição ou de uma vasodilatação, a cada momento, o
escoamento sanguíneo pode aumentar ou diminuir, devido a uma maior ou menor
resistência proporcionada ao mesmo [1].
O escoamento do sangue nos vasos sanguíneos tem de obedecer aos princípios
físicos do escoamento no interior de condutas, ou seja, da conservação da massa,
energia e quantidade de movimento. As forças que provocam o movimento (circulação
do sangue) são as forças da gravidade e as forças devidas aos gradientes de pressão. A
pressão nos vasos sanguíneos varia de ponto para ponto. É essa variação da pressão com
a distância que provoca o movimento do sangue. As forças que, pelo contrário, se
opõem à circulação do sangue são as forças de corte (tangencial) e as devidas à
turbulência do escoamento [24].
Existem dois tipos principais de escoamento: o escoamento turbulento e o
escoamento laminar, como se pode verificar na Figura 2.9
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 23
Figura 2.9 Escoamento laminar e turbulento num tubo de vidro. [25]
O escoamento laminar é aquele no qual o fluido se move em camadas, ou lâminas,
uma camada deslizando sobre a adjacente e havendo apenas troca de quantidade de
movimento molecular. A viscosidade tende a moderar o aparecimento de instabilidade
ou turbulência. Para o escoamento laminar o número de Reynolds tem um valor inferior
a 2300 em condutas rectilíneas circulares.
No escoamento turbulento, as partículas apresentam um movimento irregular por
isso a velocidade apresenta componentes transversais ao movimento geral do conjunto
do fluido. Tem algumas características especiais, tais como elevado número de
Reynolds (superior a 2300), flutuações tridimensionais e dissipação de energia. [25]
Pode-se analisar se um escoamento é laminar ou turbulento através da sua posição
relativa numa escala de turbulência em que se indica o número de Reynolds (Re). O
número de Reynolds é a relação entre as forças de inércia ���� e forças viscosas ��µ�:
�� �∑��
∑�µ; também pode ser calculado para condutas circulares de diâmetro D: �� �
ρ !
µ�
!
" [24], [25].
A resistência ao escoamento no interior de um tubo é significativamente inferior no
caso de escoamentos laminares quando comparados com os turbulentos. O escoamento
do sangue é em muitos locais turbulento, sendo laminar nos vasos sanguíneos pequenos,
o que dificulta o estudo do seu escoamento, uma vez que escoamentos laminares são
mais fáceis de entender e a sua teoria está bem desenvolvida, ou contrário dos
turbulentos que são mais difíceis de estudar, sem suporte teórico suficiente.
O sangue nos microcanais em estudo, comporta-se como um escoamento laminar,
apresentam um valor de Re de aproximadamente 0.005.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 24
A resistência ao escoamento pode depender de factores como o comprimento do
vaso, o diâmetro do vaso e a viscosidade do sangue [1].
2.5. Velocidade do Sangue
A velocidade do sangue nos vasos depende do diâmetro do vaso e da sua
proximidade ao ventrículo esquerdo. Quanto mais próximo do ventrículo, maior será a
velocidade do sangue. Por outro lado, quando o sangue flui numa velocidade contínua,
através de um vaso liso e longo, a velocidade de escoamento no centro do vaso é maior
do que próximo às paredes [26],{27].
Um exemplo para o cálculo da velocidade no sangue no sistema circulatório seria: a
área de secção de recta da artéria aorta é de aproximadamente 2,5 cm2. Já a área de
secção de recta de todos os capilares existentes no nosso corpo (somados) seria de,
aproximadamente, 1000 vezes maior do que a da aorta (2,5 cm2 x 1.000 = 2500 cm2 =
25 m2). A velocidade do sangue na artéria aorta é de, aproximadamente, 30 cm/segundo.
Sendo assim, a velocidade do sangue num capilar seria de, aproximadamente, 1.000
vezes menor, ou seja, 30 cm/seg / 1.000 = 0,3 mm/seg. [27].
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 25
3. Microcanais e Fluidos Fisiológicos
3.1. Capilares de Vidro Borosilicato
O vidro borosilicato é um tipo de vidro resistente ao calor e aos químicos, sendo
fabricado pela adição de boro aos componentes tradicionais do vidro. O seu baixo
coeficiente de dilatação permite que instrumentos de vidro possam manter a precisão
das suas medidas mesmo quando sujeito ao calor. Este tipo de vidro é resistente ao
calor, o que o torna útil em material de laboratório em que tenha que suportar
temperaturas elevadas.
Além de laboratórios, também pode ser usado em indústrias químicas,
equipamento de cozinha, iluminação, telescópios e armazenamento de resíduos
nucleares.
Os capilares de vidro borosilicato usados neste projecto têm 100µm ±2 com a
excepção de um deles que tinha apenas 92µm, usado para o estudo do hematócrito 9%,
este diâmetro diferente talvez seja erro da empresa. Estes capilares foram fabricados
pela Vitrocom (Mountain Lakes, NJ, EUA), que foram montados sobre uma lâmina de
vidro imersa em glicerina que tem o mesmo índice de refracção, como pode ser
observado na Figura 3.1 [3].
O fluxo laminar através de tais microcanais gera um fluxo meramente axial, que
é semelhante ao comportamento do fluxo através dos capilares [21].
Figura 3.1 Modelo do microcanal de vidro. [21]
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 26
3.2. Dextran 40 (Dx40)
O Dextran 40 é um polissacarídeo modificado, solúvel em água, composto por
resíduos de D-glucose e apresenta ligações glicosídicas. É muito usado medicinalmente
como um antitrombótico (anti-plaquetário), reduzindo a viscosidade do sangue e tem
vindo a ter bastantes aplicações na área farmacêutica e biomédica.
O dextran aumenta a electronegatividade das hemácias, plaquetas e do endotélio
vascularizado, reduzindo assim a agregação das plaquetas e dos eritrócitos.
As grandes vantagens da utilização deste composto são que é biodegradável em
humanos, não é tóxico e não provoca reacções no organismo. Por outro lado, existem
poucos efeitos colaterais mas que podem ser graves [1],[2].
3.3. Etilenodiamino tetra-acético (EDTA)
O ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) é um composto orgânico que actua
como agente quelante, e forma complexos muito estáveis com vários iões metálicos. Os
iões podem ser o magnésio, cálcio (para valores de pH superiores a 7), o manganês,
ferro (II e III), zinco, cobalto e cobre (II), chumbo e níquel (para valores de pH
inferiores a 7). O EDTA é um ácido que actua como um ligante hexadentado.
Como apresenta afinidade com o cálcio este ácido é usado como anticoagulante,
sendo também utilizado como descolorante para cabelos, fabricação de pão e outros
derivados da indústria alimentar [6].
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 27
3.4. Soro Fisiológico
O soro fisiológico é uma solução de água destilada e cloreto de sódio (NaCl) sendo
isotónica em relação aos líquidos corporais. Contém 0,9% (em massa) de NaCl em água
destilada, ou seja, cada 100mL da solução aquosa contém 0,9 gramas de sal. A presença
do sal faz com que a solução apresente, normalmente, um pH=7.
Devido às suas características, é muito usado em variadas situações. Em medicina,
pode ser usado em pessoas que apresentam sintomas diversos como gripes, respostas
alérgicas, limpeza de ferimentos (cortes e queimaduras) e desidratação (meio
intravenoso). Em laboratórios é utilizado como meio de soluções para observação ao
microscópio. Pode ainda ser usado para a limpeza de lentes de contacto [7],[8].
Neste projecto o soro fisiológico foi utilizado para lavagem de células
sanguíneas durante a centrifugação.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 28
4. Software para o Estudo da Camada de Plasma
4.1. Phantom
O progama Phantom faz parte de uma classe de alta velocidade de câmaras digitais
que começou no início de 1990.
O projecto original (patenteado pela Vision Research), inclui num mesmo programa
um sistema completo que inclui um sensor CMOS, um processador e um sistema
operacional interno com memória suficiente para armazenar a enorme quantidade de
informação capturada pelo sensor, um sistema de interface poderosa que permite
downloads e streaming de dados, sinalização de vídeo e controlo do software da câmara,
além da possibilidade de várias redes câmaras sincronizadas. [5]
Com este programa foi possível obter e converter os vídeos numa sequência de
imagens para posterior análise.
4.2. Image J
O Image J é um programa de processamento de imagem desenvolvido no National
Institutes of Health.
Image J permite exibir, editar, analisar, processar, guardar e imprimir de imagens de
8 bits, 16 bits e 32 bits. Este programa possibilita a leitura de variados formatos de
imagem, tais como: TIFF, PNG, JPEG, BMP, DICOM, FITS e também formatos RAW.
Suporta imagens em série, que são partilhadas numa única janela. Permite ainda o
cálculo de ângulos e distâncias, assim como a realização de histogramas de densidade.
Suporta funções de processamento de imagem padrão, tais como operações
aritméticas e lógicas entre imagens, manipulação de contraste, convolução, análise de
Fourier, nitidez, suavização, detecção de bordas e filtragem mediana. Faz
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 29
transformações geométricas como escala, rotação e saltos. O programa suporta qualquer
número de imagens simultaneamente, limitado apenas pela memória disponível. [4]
4.2.1. “Z-Project”
O “Z-Project” é um dos subprogramas usados para efectuar a análise da camada de
plasma. É obtido através dos comandos “Image” – “Stacks” – “Z-Project” (Figura 4.1).
Figura 4.1 Esquematização do procedimento para o comando “Z-Project”.
O “Z-Project” projecta a imagem ao longo de um eixo perpendicular ao plano da
imagem (eixo do z). Existem 5 tipos de projecções: a intensidade média, intensidade
máxima, intensidade mínima, soma e desvio-padrão.
A intensidade média (Average Intensity) caracteriza-se por armazenar a média
da intensidade de todos os pixels de uma imagem. A intensidade máxima (Max
Intensity), permite projectar uma imagem de saída, cujos valores de máxima intensidade
dos pixels são demonstrados. A intensidade mínima (Min Intensity) dá-nos o valor
máximo possível do padrão de intensidade dos brilhos da fonte. A soma (Sum slices),
cria uma imagem real, resultante da soma de todos os pixels de imagem original. O
desvio padrão (Standard Deviation) representa a raiz quadrada da variância e informa
sobre a maior ou menor homogeneidade, ou heterogeneidade, de uma imagem digital.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 30
Deste subprograma foram usadas apenas dois tipos de projecções (intensidade
mínima e máxima) como se pode visualizar nas Figuras seguintes (4.2 e 4.3):
Figura 4.2 Imagem de um microcanal com 15% Hct.
(a) (b)
Figura4.3 (a) Imagem aplicando a intensidade máxima (15% Hct); (b) Imagem aplicando a intensidade mínima (15%
Hct).
4.2.2. “MTrackJ”
O “MTrackJ” permite seguir os GV e determinar a espessura da camada de plasma
(ECP), efectuando a marcação manual, para posterior análise. Pode ser usado para
seguir a trajectória de um GV através de um filme, resultando uma sequência de valores,
ou mesmo ser utilizado numa imagem para marcar a zona da ECP.
Na Figura 4.4 pode-se ver a esquematização do “MTrackJ”.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 31
Figura 4.4 Esquematização do “MTrackJ”.
4.2.3. “Brightness/Contrast”
Este comando é obtido no ImageJ através dos comandos “Image” – “Adjust” -
“Brightness/Contrast”, como é possível observar na Figura 4.5:
Figura 4.5 Esquematização do “Brightness/Contrast”.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 32
Este comando permite fazer uma pré-análise das imagens obtidas, ou seja, ajustar o
contraste (contrast), a luminosidade (brightness), o mínimo (minimum) e o máximo
(maximum). Assim, torna-se mais fácil analisar as imagens pois melhora
significativamente a visualização da ECP, como se pode verificar na Figura 4.6.
(a) (b)
Figura 4.6 (a) Imagem original com 24% Hct; (b) Imagem aplicando o “Brightness/Contrast”.
4.2.4. “Find Edges”
Este comando também foi muito útil para determinar a camada de plasma. É obtido
no Image J através os comandos “Process” – “Find Edges”. Permite encontrar os limites
que temos na imagem a analisar, como se pode verificar na Figura 4.7, muitas vezes é
efectuado um pré-processamento da mesma imagem.
(a) (b)
Figura 4.7 (a) Imagem depois de aplicada a intensidade máxima com 9% Hct; (b) Imagem após a aplicação do “Find
Edges”.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 33
4.2.5. “Binary”
Este é outro comando do ImageJ, que permite fazer o binário de uma imagem,
ficando apenas a preto e branco. Em algumas análises melhora os resultados, devido ao
contraste da imagem. É obtido através dos comandos “Process” – “Binary” – “Make
Binary” (Figura 4.8).
Figura 4.8 Esquematização do “Binary”.
Incluído neste subprograma está também o comando “Erode”, com o qual se pode
fazer, como indica o próprio nome, uma erosão da imagem obtida. Os resultados
obtidos podem ser melhores ou não, dependendo da imagem que estamos a analisar e do
processamento efectuado.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 34
5. Procedimento Experimental
5.1. Materiais e Métodos
5.1.1. Microcanais e Fluidos Utilizados
O fluido utilizado - o sangue - foi obtido a partir de um adulto saudável, sendo
adicionado ácido atilenodiamino tetra-acético (EDTA) para impedir a coagulação. Os
eritrócitos foram separados por centrifugação e de seguida foi feita uma aspiração dos
restantes componentes sanguíneos, sendo lavados duas vezes com soro fisiológico.
Posteriormente, os eritrócitos foram marcados com um marcador de fluorescência
celular (CM-Dill, c-7000, Molecular Probles) e diluídos com Dextran40 (Dx40) para
obter a concentração volúmica necessária aos eritrócitos.
Todas as amostras de sangue foram armazenadas hermeticamente a 4ºC até serem
realizados as experiências a uma temperatura controlada de 37ºC. Assim foram obtidos
cinco fluidos contendo Dx40: um fluido com 35% de hematócrito (35% Hct), 24% Hct,
15% Hct, 9% Hct e 2% Hct (Figura 5.1).
Os microcanais usados neste projecto são microcanais de vidro borosilicato, com
um diâmetro de 100µm ±2, com excepção de um que tem um diâmetro de 92µm para o
caso do hematócrito 9%.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 35
Figura 5.1 Representação da preparação das amostras de sangue [23].
5.2. Aquisição de Imagens
Numa primeira parte experimental, (Figura 5.2) foi usado um sistema denominado
“Micro-PTV Confocal”, que é constituído por um microscópio invertido (IX71,
Olympus, Japão) combinado com uma unidade confocal (CSU22, Yokogawa) e um
laser DPSS (Laser Quantum Ltd) com um comprimento de onda de 532nm. Para a
aquisição de imagens, foi utilizada uma câmara de alta velocidade (Phantom v7.1) que
está ligada à unidade confocal CSU22.
O microcanal obtido anteriormente foi colocado no microscópio invertido onde o
caudal do fluido foi mantido constante com o valor de Re de aproximadamente 0.005
usando uma bomba de seringa (KD Scientific Inc, USA). Para verificar a temperatura
foi usado um sistema controlador de temperatura (Tokai Hit) sendo colocado a 37ºC.
Assim, já é possível fazer a obtenção de imagens. Todas as imagens adquiridas por
este sistema confocal foram captadas no centro dos microcanais com uma resolução de
640x480 pixels, usando uma taxa de 100 imagens/segundo e um tempo de exposição de
9.4ms.
Por fim, estas imagens são transferidas para o computador e no programa Phantom
vão ser convertidas de vídeos para uma sequência de imagens. Esta sequência obtida
pode ser então processada no Image J (NIH) [31], utilizando também os outros
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 36
subprogramas, entre eles o “MTrackJ” [32]. É possível agora determinar a espessura da
camada do plasma no microcanal em análise.
Figura 5.2 Esquematização de todos os elementos usados na aquisição de imagem.[21]
5.3. Image J
Para as imagens poderem ser analisadas neste programa, primeiro têm que ser
importadas, usando os comandos File – Import – Image Sequence, seleccionando a
primeira imagem da sequência e num aviso seleccionar a opção para “8-bit
Grayscale”. Assim as imagens estão prontas a serem analisadas.
Numa primeira parte é efectuado um pré-processamento das imagens usando o
comando “Brightness/Contrast”, para tornar mais fácil a sua análise.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 37
5.3.1. “Z-Project”
Neste subprograma, foram usados os parâmetros de intensidade máxima e
mínima que projectam a imagem num eixo perpendicular ao plano de imagem (eixo
“z”) com o propósito de obter uma distribuição estatística das células ao longo do
microcanal. Em função do hematócrito e da qualidade das imagens, foram usados os
dois parâmetros, sendo de seguida feito outro ajuste de brilho e contraste.
Com o método do “Find Edges”, foram obtidos os contornos da imagem que
possibilitam uma melhor análise da espessura da camada de plasma.
Uma outra forma de efectuar a análise depois de aplicar a intensidade máxima
ou mínima é pelo método “Erode”, que elimina grande parte do ruído existente na
imagem. De seguida, em cada imagem obtida, quer do “Find Edges” quer do “Erode”,
foi medida manualmente a espessura da camada de plasma (ECP) usando o plugin
“MTrackJ”. As medições efectuadas foram obtidas por localização visual do limite da
camada de plasma, tendo um ponto de referência na parede do microcanal para se poder
obter valores de forma a determinar a ECP. Este procedimento pode ser observado na
Figura 5.3.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 38
(a) (b)
(c) (d)
Figura 5.3 Procedimento para a análise de imagem: (a) Imagem original; (b) Imagem resultante da intensidade
máxima do “Z-Project”; (c) Imagem resultante da aplicação do “Find Edges” e (d) Imagem com a análise do
MTrack J.
5.3.2. “MTrackJ”
Esta ferramenta foi das mais usadas neste projecto. Numa primeira parte, antes
de analisar qualquer imagem, é muito importante fazer a calibração da mesma. Para tal,
coloca-se uma linha desde a parede de cima (PC) até à parede de baixo (PB) do
microcanal e usando o Set Scale é possível inserir o valor de referência (100 ±2µm) e a
unidade de medida a usar, que neste caso é pixels/µm. Considerou-se que 1 pixel ≅ 0.56
µm.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 39
5.3.2.1. O método das trajectórias dos GVs (“Tracking”)
O “MTrackJ” permite obter a trajectória dos glóbulos vermelhos (GVs)
“labeled” (células marcadas com corante fluorescente - corados) através de uma
sequência de imagens quando estes estão envolvidos na vizinhança da camada de
plasma, sendo possível adquirir valores viáveis da ECP.
Assim, neste caso, é usado o comando “Add tracks” para colocar um primeiro
ponto de referência na PC e sendo os seguintes pontos colocados de forma a seguir a
trajectória do GV ao longo do microcanal. Este processo é igualmente repetido para a
PB. Com os valores resultantes, é feita uma média dos valores que permite determinar a
ECP.
Como nas imagens obtidas nem sempre se tem uma boa visualização dos GVs
envolvidos na camada de plasma, este processo não foi realizado para todas elas, sendo
apenas efectuado para aquelas que se tem uma boa iluminação dos GVs, como se pode
verificar na Figura 5.4.
Figura 5.4 Representação de uma análise por trajectória de um GV (neste caso na PB), com 35% Hct.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 40
5.3.2.2. O método “Z-Project”
Nas imagens pré-processadas do “Z-Project”, foi efectuada da mesma forma a
calibração. De seguida, com o comando “Add tracks” é colocado o primeiro ponto
(ponto de referência) na PC do microcanal. Neste caso, vão ser distribuídos 25 pontos,
pois este é o valor que é estatisticamente correcto para uma avaliação deste tipo.
Sendo assim, o 1º ponto é o ponto de referência da PC, e são colocados ao longo
da PC 14 pontos; na PB o 16º ponto é o ponto de referência e os restantes são
distribuídos na PB, como se pode visualizar na Figura 5.5.
Figura 5.5 Imagem de 15% Hct com os pontos da análise.
Os valores dos pontos são obtidos recorrendo ao Measure Tracks, que depois de
guardados em formato ‘.txt’, podem transferidos para o Excel de modo a proceder à sua
análise. Para guardar a imagem final com os pontos respectivos foi usado o comando
Make movie, que permite guardar a imagem em formato TIFF, GIF, JPEG, entre outros;
este último procedimento foi igualmente efectuado para o caso da trajectória dos GVs.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 41
5.4. Processamento em Excel
Com os valores obtidos do “MTrackJ” já transferidos para o Excel, foi possível
obter os valores médios da ECP para posterior comparação.
Numa primeira fase é feita a diferença entre o valor de referência e todos os outros
valores quer da PC, quer da PB; de seguida é realizado o cálculo da média e do desvio-
padrão. Este procedimento foi efectuado para todos os resultados obtidos de cada
imagem analisada.
De modo a poder fazer uma comparação de todos os dados de cada hematócrito,
foram colocados os valores da média e desvio padrão de cada análise numa nova folha
de Excel e foram feitos gráficos. Assim, é mais simples fazer um melhor estudo de
resultados.
Estudo da Camada de
Cátia Fidalgo
6. Resultados Experimentais
Após a aquisição das imagens com diferentes hematócritos, verificou
não tinham boa qualidade pois não era possível visualizar com clareza os limites das
paredes do microcanal, os GVs e a espessura da camada de plasma. As
pode verificar na Figura 6.1, a
melhor análise.
Figura 6.1
Este procedimento foi efectuado em todas as imagens independentemente do
método a usar (o método “Tracking”
imagens dos vários hematócritos (35%, 24%, 15%, 9% e 2%), foram realizados os dois
métodos ou apenas um deles
Depois da aplicação de cada um dos métodos, pode
nas Figuras resultantes: Figura
tracks” do “MTrackJ”.
Parede de Cima
Parede de Baixo
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Resultados Experimentais
imagens com diferentes hematócritos, verificou
não tinham boa qualidade pois não era possível visualizar com clareza os limites das
paredes do microcanal, os GVs e a espessura da camada de plasma. As
igura 6.1, após o melhoramento da imagem, já é possível fazer uma
Figura 6.1 Imagem melhorada com 35% de hematócrito.
procedimento foi efectuado em todas as imagens independentemente do
o método “Tracking” ou o método “Z-Project”). Para as
imagens dos vários hematócritos (35%, 24%, 15%, 9% e 2%), foram realizados os dois
métodos ou apenas um deles dependendo da imagem.
Depois da aplicação de cada um dos métodos, pode-se observar a análise realizada
Figura 6.2 até à Figura 6.13, depois da utilização do
Parede de Cima
Baixo Glóbulo Vermelho
Espessura da Camada de Plasma
42
imagens com diferentes hematócritos, verificou-se que estas
não tinham boa qualidade pois não era possível visualizar com clareza os limites das
paredes do microcanal, os GVs e a espessura da camada de plasma. Assim, como se
pós o melhoramento da imagem, já é possível fazer uma
procedimento foi efectuado em todas as imagens independentemente do
). Para as todas as
imagens dos vários hematócritos (35%, 24%, 15%, 9% e 2%), foram realizados os dois
se observar a análise realizada
6.13, depois da utilização do “Add
Camada de Plasma
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 43
6.1. Análise e processamento de imagem
• 35% hematócrito:
Na Figura abaixo (6.2) encontra-se um exemplo dos resultados obtidos pela análise
do seguimento manual por intermédio do “MTrackJ”.
Figura 6.2 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”).
Figura 6.3 Imagem resultante do método do “Z-Project”.
Na Figura 6.3 foi realizado um pré-processamento com a utilização da
intensidade máxima seguido de um “binary” e um “erode”.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 44
• 24% hematócrito:
Na Figura abaixo (6.4) encontra-se um exemplo dos resultados obtidos pela
análise do seguimento manual por intermédio do “MTrackJ”.
Figura 6.4 Imagem resultante do método das trajectórias dos GVs (“Tracking”).
Figura 6.5 Imagem resultante do método do “Z-Project”.
Na Figura 6.5 foi realizado um pré-processamento com a utilização da
intensidade máxima seguido de um binário.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 45
• 15% hematócrito:
Na Figura abaixo (6.6) encontra-se um exemplo dos resultados obtidos pela análise
do seguimento manual por intermédio do “MTrackJ”.
Figura 6.6 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”).
Figura 6.7 Imagem resultante do método do “Z-Project”.
Na Figura 6.7 foi realizado um pré-processamento com a utilização da
intensidade máxima seguido de um “binary”.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 46
• 9% hematócrito:
Na Figura abaixo (6.8) encontra-se um exemplo dos resultados obtidos pela análise
do seguimento manual por intermédio do “MTrackJ”.
Figura 6.8 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”).
Figura 6.9 Imagem resultante do método do “Z-Project”.
Na Figura 6.9 foi realizado um pré-processamento com a utilização da
intensidade máxima seguido de um “find edges”.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 47
Figura 6.10 Imagem resultante do método do “Z-Project”.
Na Figura 6.10 foi realizado um pré-processamento com a utilização da
intensidade mínima seguido de um “find edges”.
• 2% hematócrito:
Na Figura abaixo (6.11) encontra-se um exemplo dos resultados obtidos pela análise
do seguimento manual por intermédio do “MTrackJ”.
Figura 6.11 Imagem resultante do método da trajectória dos GVs (“Tracking”).
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 48
Figura 6.12 Imagem resultante do método do “Z-Project”.
Na Figura 6.12 foi realizado um pré-processamento com a utilização da
intensidade máxima seguido de um “find edges”.
Figura 6.13 Imagem resultante do método do “Z-Project”.
Na Figura 6.13 foi realizado um pré-processamento com a utilização da
intensidade mínima seguido de um “find edges”.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 49
6.2. Resultados da Espessura da Camada de Plasma
De todas as análises efectuadas, apenas foram apresentados anteriormente um
exemplo de cada, ou seja, uma imagem com o método das trajectórias do GV
(“Tracking”) e outra resultante do método “Z-Project”, que pode ser de intensidade
máxima ou mínima.
Em anexos encontram-se os valores retirados do “MTrackJ” para todos os
hematócritos de ambos os métodos (um exemplo de cada método), com os quais foi
possível retirar os resultados seguintes.
Como foram obtidos muitos valores com cada análise, foi feito o cálculo das
médias de cada método para facilitar o estudo. Assim, de seguida são apresentados em
tabelas e gráficos os resultados obtidos.
Para uma melhor compreensão das tabelas e gráficos, é de referir que a
intensidade máxima e mínima das tabelas corresponde ao máximo e mínimo nos
gráficos e que o “Tracking” mencionado refere-se ao método da trajectória dos GVs.
Nas tabelas encontram-se os valores da análise efectuada quer para a parede de
cima (PC) quer para a parede de baixo (PB) do microcanal e as respectivas médias, com
ambos os métodos.
Nos gráficos, estão representados os valores da média da espessura da camada
de plasma (ECP) de cada hematócrito, retirados das tabelas.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 50
• 35% hematócrito:
Assim, para o hematócrito 35%, são apresentados na tabela 6.1 os valores e na
Figura 6.14 o respectivo gráfico.
Tabela 6.1 Resultados da média da ECP para 35% Hct.
35% Hematócrito (µµµµm) Intensidade Máxima
“Z-Project” “Tracking” Média Total
PC 7,0714 --------- 7,0714
PB 6,4552 9,5192 7,9872
Média ECP 6,7633 9,5192 8,1412
Figura 6.14 Representação gráfica da variação da ECP para 35% hematócrito.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média Máximos Média Tracking Média Total
Esp
ess
ura
da
Ca
ma
da
de
Pla
sma
( µµ µµm
)
35% Hct
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 51
• 24% hematócrito:
Para 24% hematócrito, os valores encontram-se na tabela 6.2 e estão
representados no gráfico da Figura 6.15.
Tabela 6.2 Resultados da média da ECP para 24% Hct.
24% Hematócrito (µµµµm)
Intensidade
Máxima
“Z-Project”
Intensidade
Mínima
“Z-Project”
“Tracking” Média Total
PC 5,5931 12,9061 12,2468 10,2486
PB 5,2381 11,1271 11,3132 9,2262
Média ECP 5,4156 12,0166 11,7799 9,7374
Figura 6.15 Representação gráfica da variação da ECP para 24% hematócrito.
0
2
4
6
8
10
12
14
Média Máximo Média Mínimo Média Tracking Média TotalEsp
ess
ura
da
Ca
ma
da
de
Pla
sma
(µµ µµm
)
24% Hct
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 52
• 15% hematócrito:
No caso de 15% hematócrito, na tabela 6.3 estão os valores que estão
apresentados no gráfico da Figura 6.16.
Tabela 6.3 Resultados da média da ECP para 15% Hct.
15% Hematócrito (µµµµm)
Intensidade
Máxima
“Z-Project”
Intensidade
Mínima
“Z-Project”
“Tracking” Média Total
PC 8,2723 19,0988 19,2622 15,5444
PB 8,9379 14,3242 14,2 12,4873
Média ECP 8,6051 16,7115 16,7311 14,0159
Figura 6.16 Representação gráfica da variação da ECP para 15% hematócrito.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Média Máximo Media Mínimo Média Tracking Média total
Esp
ess
ura
da
Ca
ma
da
de
Pla
sma
( µµ µµm
)
15% Hct
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 53
• 9% hematócrito:
Em 9% hematócrito, o gráfico da Figura 6.17 foi obtido com os valores da tabela
6.4.
Tabela 6.4 Resultados da média da ECP para 9% Hct.
9% Hematócrito (µµµµm)
Intensidade
Máxima
“Z-Project”
Intensidade
Mínima
“Z-Project”
“Tracking” Média Total
PC 10,0821 14,4449 -------- 12,2635
PB 10,5944 12,5025 20,95 14,6823
Média ECP 10,3382 13,4737 20,95 14,9206
Figura 6.17 Representação gráfica da variação da ECP para 9% hematócrito.
0
5
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20
25
Média Máximo Média Mínimo Média Tracking Média Total
Esp
ess
ura
da
Ca
ma
da
de
Pla
sma
( µµ µµm
)
9% Hct
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 54
• 2% hematócrito:
Por fim, para 2% hematócrito, os valores da tabela 6.5 estão representados no
gráfico da Figura 6.18
Tabela 6.5 Resultados da média da ECP para 2% Hct.
2% Hematócrito (µµµµm)
Intensidade
Máxima
“Z-Project”
Intensidade
Mínima
“Z-Project”
“Tracking” Média Total
PC 14,5526 13,0462 -------- 13,7994
PB 13,0382 12,2426 26,45 17,2436
Média ECP 13,7954 12,6444 26,45 17,6299
Figura 6.18 Representação gráfica da variação da ECP para 2% hematócrito.
0
5
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30
Média Máximo Média Mínimo Média Tracking Média Total
Esp
ess
ura
da
Ca
ma
da
de
Pla
sma
( µµ µµm
)
2% Hct
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 55
Nos casos em que o método “Tracking” não apresenta valores para a PC ou PB é
devido a não haver GVs excitados pelo laser com os quais é possível realizar o
“tracking”; considera-se que o comportamento é semelhante na PC e PB.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 56
7. Análise e Discussão dos Resultados
Após a análise das imagens, verifica-se que a concentração dos GVs vai sendo
maior no centro do microcanal do que junto às paredes, o que influencia a viscosidade
sanguínea. Assim, a viscosidade é maior no centro do canal e vai diminuindo com a
aproximação da parede. Assim, é importante ter a viscosidade me consideração quando
é feita a análise dos resultados.
Num trabalho realizado anteriormente em microcanais em PDMS [1], foi efectuado
um estudo semelhante ao realizado no presente trabalho. Apesar de os diâmetros serem
diferentes foi decidido compará-los qualitativamente (tabela 7.1)
Tabela 7.1 Resultados da ECP em microcanais de PDMS.[1]
Microcanais
de PDMS
37%
Hematócrito
23%
Hematócrito
13%
Hematócrito
3%
Hematócrito
Média (µµµµm) 7,561 9,283 11,190 22,80
Para se poder comparar os resultados obtidos com microcanais de vidro borosilicato
com os resultados de microcanais de PDMS (tabela 7.1), foram realizados alguns
ajustes, pois a análise foi efectuada para diferentes hematócritos. Assim, vão ser
considerados o Hct 37% como Hct 35%, Hct 23% como Hct 24%, Hct 13% como Hct
15% e Hct 3% como Hct 2%. Estes acertos podem ser considerados válidos pois as
percentagens de hematócrito são muito próximas.
De seguida vai ser feita a análise do gráfico da Figura 7.1, no qual estão
representados todos os resultados obtidos para cada hematócrito.
Estudo da Camada de
Cátia Fidalgo
Figura 7.1 Representação gráfica da variação da
Para 35% hematócrito, foram usados ambos os métodos (“tracking” e “Z
No caso do método do “Z-
intensidade mínima não era possív
considerar ambos os métodos eficazes desde que seja efectuada a intensidade máxima
no método “Z-Project”.
No caso de 24% hct, também foram usados ambos os métodos (
o método “Z-Project”, aplicou
resultados da intensidade máxima estão muito distantes dos outros dois obtidos, por isso
pode-se desde já considerar que esta análise não é eficaz.
tanto o método do “tracking” como o do “Z
métodos para determinar a ECP.
Quanto a 15% hct, pode
para ambos os métodos. Verifica
resultado bastante inferior em relação aos outros dois resultados. Por isso, os melhores
0
5
10
15
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25
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35% Hct 24% Hct
Esp
ess
ura
da
Ca
ma
da
de
Pla
sma
(µµ µµm
)
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Representação gráfica da variação da ECP para todos os hematócritos para microcanais de vidro.
Para 35% hematócrito, foram usados ambos os métodos (“tracking” e “Z
-Project” apenas foi usada a intensidade máxima, pois com a
intensidade mínima não era possível efectuar uma boa análise. Sendo assim, podem
considerar ambos os métodos eficazes desde que seja efectuada a intensidade máxima
No caso de 24% hct, também foram usados ambos os métodos (ver Figura
t”, aplicou-se a intensidade máxima e a intensidade mínima. Os
resultados da intensidade máxima estão muito distantes dos outros dois obtidos, por isso
se desde já considerar que esta análise não é eficaz. Assim pode
“tracking” como o do “Z-Project” de intensidade mínima são bons
métodos para determinar a ECP.
Quanto a 15% hct, pode-se observar no gráfico da Figura 7.1 os resultados obtidos
para ambos os métodos. Verifica-se novamente que a intensidade máxima apresent
resultado bastante inferior em relação aos outros dois resultados. Por isso, os melhores
24% Hct 15% Hct 9% Hct 2% Hct
Z-Project (Máximo)
Z-Project (Mínimo)
Tracking
57
ECP para todos os hematócritos para microcanais de vidro.
Para 35% hematócrito, foram usados ambos os métodos (“tracking” e “Z-Project”).
Project” apenas foi usada a intensidade máxima, pois com a
el efectuar uma boa análise. Sendo assim, podem-se
considerar ambos os métodos eficazes desde que seja efectuada a intensidade máxima
Figura 7.1). Para
se a intensidade máxima e a intensidade mínima. Os
resultados da intensidade máxima estão muito distantes dos outros dois obtidos, por isso
Assim pode-se concluir que
Project” de intensidade mínima são bons
7.1 os resultados obtidos
se novamente que a intensidade máxima apresenta um
resultado bastante inferior em relação aos outros dois resultados. Por isso, os melhores
Project (Máximo)
Project (Mínimo)
Tracking
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 58
métodos para determinar a ECP para este hct são o “tracking” e a intensidade mínima
no caso do “Z-Project”.
Para 9% hct, apresentam-se os resultados obtidos de ambos os métodos no gráfico
da Figura 7.1. Neste caso, tanto a intensidade máxima como a intensidade mínima do
método “Z-Project” têm valores bastante inferiores em relação ao “tracking”. Assim,
pode-se considerar que o método do “Z-Project” não é o mais aconselhável para este
hct. Com o método do “tracking” foram obtidos melhores resultados porque é possível
comparar a imagem original com a análise dos GVs que estão iluminados o que permite
assim ter uma melhor noção do limite da ECP, o que não é possível fazer no caso do
método “Z-Project”.
Por último, para o caso de 2% hct, existe uma grande diferença entre os resultados
da análise pelo método do “Z-Project” e pelo “tracking”, representados no gráfico da
Figura 7.1. Tanto o resultado da intensidade mínima como da intensidade máxima estão
muito abaixo do resultado do “tracking”. Considera-se que a melhor forma para
determinar a ECP neste hct é o “tracking”.
Em termos gerais, os resultados sugerem que a espessura da camada de plasma
aumenta com a diminuição do hematócrito, sendo que o método “tracking” é aquele que
apresenta resultados mais próximos da realidade. Isto também se verifica quando é feita
uma comparação dos resultados do “tracking” obtidos com os resultados de PDMS
apresentados na Figura 7.2.
Estudo da Camada de
Cátia Fidalgo
Figura 7.2 Representação gráfica da variação da ECP para todos os hematócritos
100µm (35%, 24%, 15% e 2%), 92
Para 35% hct, verifica
“tracking” um pouco mais elevado,
Nos casos de 24%, 15% e 2%
“tracking” tem um valor superior
Quanto ao resultado de 9% hct, não estão disponíveis valores de PDMS, por isso
não pode ser feita a comparação. No entanto pode
acordo com a evolução da ECP.
Estudos efectuados in vivo
Figura 7.3. Pela análise dos resultados
hematócrito, o que corrobora com os resultados obtidos no presente de estudo. Por outro
lado, também é possível observar qu
vai ser a ECP. Este aumento dá
representado na Figura 7.3.
0
5
10
15
20
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30
Hct 35%
Esp
ess
ura
da
Ca
ma
da
de
Pla
sma
(µµ µµm
)
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Representação gráfica da variação da ECP para todos os hematócritos para microcanais de diâmetro
m (35%, 24%, 15% e 2%), 92µm (9%) e 75µm para o caso dos microcanais em PDMS.
verifica-se que os valores não diferem muito, sendo resultado do
“tracking” um pouco mais elevado, possivelmente devido à diferença de diâmetros.
24%, 15% e 2% hct, verifica-se novamente que o
“tracking” tem um valor superior ao do PDMS.
Quanto ao resultado de 9% hct, não estão disponíveis valores de PDMS, por isso
não pode ser feita a comparação. No entanto pode-se dizer que este resultado está de
a evolução da ECP.
in vivo [33] obtiveram os resultados apresentados no gráfico da
7.3. Pela análise dos resultados in vivo a ECP aumenta com a diminuição do
hematócrito, o que corrobora com os resultados obtidos no presente de estudo. Por outro
lado, também é possível observar que quanto maior for o diâmetro do microcanal, maior
vai ser a ECP. Este aumento dá-se segundo uma regressão linear para cada hematócrito
7.3.
Hct 35% Hct 24% Hct 15% Hct 9% Hct 2%
59
para microcanais de diâmetro
m para o caso dos microcanais em PDMS. [1]
se que os valores não diferem muito, sendo resultado do
possivelmente devido à diferença de diâmetros.
que o resultado do
Quanto ao resultado de 9% hct, não estão disponíveis valores de PDMS, por isso
se dizer que este resultado está de
obtiveram os resultados apresentados no gráfico da
a ECP aumenta com a diminuição do
hematócrito, o que corrobora com os resultados obtidos no presente de estudo. Por outro
e quanto maior for o diâmetro do microcanal, maior
se segundo uma regressão linear para cada hematócrito
Tracking
Média PDMS
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 60
Figura 7.3 Representação gráfica da espessura da camada de plasma em função do diâmetro do microvaso in vivo,
adaptado de [33].
No entanto, quando se comparam os resultados da ECP do gráfico da figura 7.3
com os resultados deste estudo apresentados no gráfico da Figura 7.2, verifica-se uma
diferença significativa. Por exemplo, para o caso de um hct de 15% os resultados
correspondem a cerca de 17 µm enquanto que o valor para o caso in vivo (ver Figura
7.2 para um diâmetro 10µm) é de aproximadamente 10µm. O mesmo acontece para o
caso de 35% hct, ou seja a diferença é também bastante significativa verifica-se
novamente que o resultado obtido é bastante superior. Esta grande diferença de
resultados pode ser devido ao tipo de microcanais que foram analisados. Os valores do
gráfico da Figura 7.3 são referentes ao estudo de microcanais in vivo, nos quais
interferem vários factores, como por exemplo os factores biológicos, a existência de
bifurcações e de glóbulos brancos em circulação, entre outros. Já no caso dos
microcanais que foram usados neste estudo, estes são microcanais de vidro nos quais
estes factores não são considerados durante o escoamento sanguíneo.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 61
8. Conclusões e Trabalho Futuro
8.1. Conclusões
Este projecto teve como principal objectivo a determinação da espessura da camada
de plasma (ECP) em microcanais circulares de vidro (92 e 100µm) em função do
hematócrito. As principais conclusões retiradas deste estudo são as seguintes:
- O sistema usado para a análise e tratamento de imagens confocais é um sistema
bastante promissor para estudar escoamento sanguíneo ao longo do microcanal;
- Os resultados experimentais sugerem que a trajectória dos GVs e a ECP são
fortemente dependentes do Hct;
- Pelos ensaios experimentais realizados foi possível concluir que aumentando o
hematócrito diminui a ECP, o que corrobora com os resultados encontrados na
literatura.
- Durante a análise dos resultados foi observado, principalmente para hematócritos
elevados, que ECP variava ao longo do microcanal, uma vez que os GVs ao
deslocarem-se ao longo do plasma realizam movimentos rotacionais e translacionais,
chocando uns com os outros e assim movendo-se de uma forma irregular;
- Em termos gerais, os resultados da ECP obtidos em microcanais de vidro são
qualitativamente concordantes com os resultados obtidos em microcanais de PDMS;
- Os resultados da ECP in vivo são qualitativamente semelhantes aos resultados in
vitro, mas o mesmo não se verifica quantitativamente, em que a ECP in vitro é sempre
superior à ECP in vivo;
- Em termos gerais, dos vários métodos de análise de imagem utilizados neste
estudo, aquele que apresentou resultados mais satisfatórios para a determinação da ECP
foi o método de seguimento (“tracking”) dos GVs ao longo de várias imagens. Para o
caso do método “Z-Project”, a opção da intensidade mínima foi aquela que apresentou
melhores resultados quando comparada com os resultados da opção intensidade
máxima;
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 62
- Os métodos usados neste estudo são muito dependentes da perícia do utilizador, ou
seja é um método manual, se fosse usado um método automático ou semi-automático,
talvez houvesse melhoria dos resultados.
8.2. Trabalho Futuro
Uma proposta para a realização de trabalhos futuros será a melhoria das imagens
obtidas, como foi referido durante este estudo, por vezes era complicado efectuar uma
correcta análise devido à qualidade das imagens. Algumas imagens estavam desfocadas,
com ruído e esbatidas, o que dificulta bastante a identificação da zona de transição entre
o escoamento sanguíneo com os glóbulos vermelhos e a camada de plasma, bem como a
correcta identificação dos limites da parede do microcanal.
Por outro lado, uma forma de melhorar os resultados obtidos será com a utilização
de métodos automáticos ou semi-automáticos de modo a melhorar a análise de imagem
e seu processamento. Os métodos automáticos para além de melhorar a qualidade das
imagens, podem também ajudar a ultrapassar os erros humanos associados à análise
manual de uma imagem.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 63
9. Referências Bibliográficas
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[11]http://2.bp.blogspot.com/_S7Qz9a3DX6s/SeKPdGxVQLI/AAAAAAAAAn4/Mrf4
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vermelhos.jpg; (Consultado em 29/06/10)
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Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 64
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Cátia Fidalgo 65
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Physiology 46: 1-14, 1996.
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 66
Anexos
• 35% Hematócrito
“Tracking”
Número de pontos Valores Diferença
Parede Baixo
1 185,2336 11,8744
2 173,3592 11,9261
3 173,3075 12,0375
4 173,1961 12,0321
5 173,2015 12,0279
6 173,2057 12,0624
7 173,1712 12,1344
8 173,0992 12,1138
9 173,1198 12,1173
10 173,1163 12,188
11 173,0456 12,169
12 173,0646 12,1654
13 173,0682 12,2288
14 173,0048 12,2342
15 172,9994 12,2374
16 172,9962 12,3412
17 172,8924 12,33
18 172,9036 12,7282
19 172,5054 12,7693
20 172,4643 13,1758
21 172,0578 13,2181
22 172,0155 13,5845
23 171,6491 13,6642
24 171,5694 13,639
25 171,5946 13,6768
26 171,5568 13,629
27 171,6046 13,5929
28 171,6407 13,3195
29 171,9141 13,3734
30 171,8602 13,3614
31 171,8722 13,4505
32 171,7831 13,8374
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 67
33 171,3962 13,8295
34 171,4041 13,774
35 171,4596 13,7394
36 171,4942 13,756
37 171,4776 13,5998
38 171,6338 13,54
39 171,6936 13,4572
40 171,7764 13,4396
41 171,794 13,3185
42 171,9151 12,937
43 172,2966 13,253
44 171,9806 13,2785
45 171,9551 13,1383
46 172,0953 12,687
47 172,5466 12,7221
48 172,5115 12,6392
49 172,5944 12,6358
50 172,5978 12,6779
51 172,5557 12,4173
52 172,8163 12,9865
53 172,2471 13,0551
54 172,1785 13,1852
55 172,0484 13,1802
56 172,0534 13,0802
57 172,1534 13,2471
58 171,9865 13,2747
59 171,9589 13,2612
60 171,9724 13,3313
61 171,9023 13,1767
62 172,0569 13,1658
63 172,0678 13,3737
64 171,8599 13,1268
65 172,1068 13,3045
66 171,9291 13,25
67 171,9836 13,2779
68 171,9557 13,3435
69 171,8901 13,4854
70 171,7482 13,5564
71 171,6772 13,5724
72 171,6612 12,9129
73 172,3207 13,0241
74 172,2095 13,3883
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 68
75 171,8453 13,3986
76 171,835 13,9048
77 171,3288 13,9485
78 171,2851 13,6181
79 171,6155 13,9575
80 171,2761 13,6051
81 171,6285 13,7269
82 171,5067 13,5989
83 171,6347 13,6152
84 171,6184 13,6052
85 171,6284 13,5674
86 171,6662 13,5479
87 171,6857 13,588
88 171,6456 13,7658
89 171,4678 13,7593
90 171,4743 13,7494
91 171,4842 13,3483
92 171,8853 13,6808
93 171,5528 13,5259
94 171,7077 13,589
95 171,6446 13,8476
96 171,386 13,8861
97 171,3475 13,942
98 171,2916 13,8913
99 171,3423 13,9991
100 171,2345 13,896
101 171,3376 13,8683
102 171,3653 13,8619
103 171,3717 13,8976
104 171,336 13,7196
105 171,514 13,8856
106 171,348 13,91
107 171,3236 13,9406
108 171,293 14,2037
109 171,0299 14,341
110 170,8926 14,2675
111 170,9661 13,6676
112 171,566 13,5857
113 171,6479 13,4437
114 171,7899 13,188
115 172,0456 13,3288
116 171,9048 13,3236
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 69
117 171,91 13,3365
118 171,8971 13,4064
119 171,8272 13,4148
120 171,8188 13,4332
121 171,8004 13,4641
122 171,7695 13,4425
123 171,7911 13,4409
124 171,7927 13,3939
125 171,8397 13,2685
126 171,9651 13,5016
127 171,732 13,4324
128 171,8012 13,4239
129 171,8097 13,4242
130 171,8094 13,432
131 171,8016 13,3848
132 171,8488 13,7525
133 171,4811 13,5675
134 171,6661 13,4307
135 171,8029 12,8355
136 172,3981 13,345
137 171,8886 13,3288
138 171,9048 13,2707
139 171,9629 13,3356
140 171,898 12,4394
141 172,7942 12,3694
142 172,8642 12,6344
143 172,5992 12,7608 Média Desvio-padrão
144 172,4728
13,27207 0,553397715
“Z-Project” – Intensidade Máxima
Número de Pontos Valores Diferença
Parede Cima
1 80,7116 5,8989
2 86,6105 5,4307
3 86,1423 5,3756
4 86,0872 4,4008
5 85,1124 6,7416
6 87,4532 5,8053
7 86,5169 6,5543
8 87,2659 7,0225
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 70
9 87,7341 7,6779
10 88,3895 7,9462
11 88,6578 6,8778
12 87,5894 7,1295
13 87,8411 8,082
14 88,7936 7,8727 Média Desvio-padrão
15 88,5843
6,6297 1,115003934
Parede Baixo
16 181,7884 7,4906
17 174,2978 5,9457
18 175,8427 6,7322
19 175,0562 6,4098
20 175,3786 6,4794
21 175,309 5,6046
22 176,1838 5,848
23 175,9404 5,6086
24 176,1798 6,3277 Média Desvio-padrão
25 175,4607
6,271844 0,60556233
• 24% Hematócrito
“Tracking”
Número de Pontos Valores Diferença
Parede Cima
1 84,1213 12,5106
2 96,6319 12,5755
3 96,6968 12,9507
4 97,072 13,4241
5 97,5454 12,9107
6 97,032 13,0217
7 97,143 13,0419
8 97,1632 13,075
9 97,1963 13,2402
10 97,3615 13,1525
11 97,2738 13,0412
12 97,1625 13,5485
13 97,6698 13,6091
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 71
14 97,7304 13,3067
15 97,428 13,4722
16 97,5935 13,9937
17 98,115 14,038
18 98,1593 14,0294
19 98,1507 13,6135
20 97,7348 13,5302
21 97,6515 13,471
22 97,5923 13,4886
23 97,6099 13,4457
24 97,567 13,3202
25 97,4415 13,4457
26 97,567 13,483
27 97,6043 13,4526
28 97,5739 13,458
29 97,5793 13,3202
30 97,4415 13,4724
31 97,5937 13,4231
32 97,5444 13,4457
33 97,567 13,4457
34 97,567 13,5187
35 97,64 13,4623
36 97,5836 13,5454
37 97,6667 13,1375
38 97,2588 13,4814
39 97,6027 13,1375
40 97,2588 13,1375
41 97,2588 13,3202
42 97,4415 13,6855
43 97,8068 13,3202
44 97,4415 13,4457
45 97,567 12,9464
46 97,0677 12,9335
47 97,0548 12,8978
48 97,0191 12,49
49 96,6113 12,4228
50 96,5441 12,3856
51 96,5069 12,3581
52 96,4794 12,4228
53 96,5441 11,9278
54 96,0491 11,9018
55 96,0231 11,8439
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 72
56 95,9652 11,942
57 96,0633 11,9823
58 96,1036 12,0125
59 96,1338 12,0313
60 96,1526 11,966
61 96,0873 11,5847
62 95,706 11,5894
63 95,7107 11,5641
64 95,6854 11,2992
65 95,4205 11,2881
66 95,4094 11,3745
67 95,4958 11,3703
68 95,4916 11,4937
69 95,615 11,4937
70 95,615 11,8062
71 95,9275 11,8886
72 96,0099 11,8868
73 96,0081 12,3742
74 96,4955 12,3248
75 96,4461 12,2774
76 96,3987 12,2861
77 96,4074 11,8744
78 95,9957 11,4821
79 95,6034 11,7633
80 95,8846 11,756
81 95,8773 11,4937
82 95,615 11,4937
83 95,615 11,4937
84 95,615 11,4937
85 95,615 11,4937
86 95,615 11,4937
87 95,615 11,4937
88 95,615 11,4937
89 95,615 11,4937
90 95,615 11,4937
91 95,615 11,6307
92 95,752 11,2786
93 95,3999 11,2907
94 95,412 11,2662
95 95,3875 11,3269
96 95,4482 11,2662
97 95,3875 11,3469
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 73
98 95,4682 11,3095
99 95,4308 11,285
100 95,4063 11,34
101 95,4613 11,3319
102 95,4532 11,2952
103 95,4165 10,9569
104 95,0782 11,0364
105 95,1577 11,0423
106 95,1636 11,2993
107 95,4206 11,4859
108 95,6072 11,4352
109 95,5565 11,5511
110 95,6724 11,387
111 95,5083 11,527
112 95,6483 11,4732
113 95,5945 11,5403
114 95,6616 11,5804
115 95,7017 11,6309 Média Desvio-padrão
116 95,7522
12,3308 0,908458
Parede Baixo
117 184,1512 8,5086
118 175,6426 8,4231
119 175,7281 7,995
120 176,1562 8,0072
121 176,144 7,7829
122 176,3683 7,859
123 176,2922 7,8525
124 176,2987 7,7483
125 176,4029 8,2792
126 175,872 7,7269
127 176,4243 7,7422
128 176,409 7,7497
129 176,4015 8,217
130 175,9342 8,2086
131 175,9426 8,1935
132 175,9577 8,2406
133 175,9106 8,2292
134 175,922 7,7393
135 176,4119 8,2219
136 175,9293 8,1744
137 175,9768 8,2045
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 74
138 175,9467 7,6798
139 176,4714 7,6901
140 176,4611 7,6812
141 176,47 8,1806
142 175,9706 8,1746
143 175,9766 7,7502
144 176,401 7,7155
145 176,4357 7,7155
146 176,4357 7,7277
147 176,4235 7,6572
148 176,494 7,6455
149 176,5057 7,6812
150 176,47 7,7497
151 176,4015 7,7388
152 176,4124 7,7041
153 176,4471 7,5785
154 176,5727 7,6321
155 176,5191 7,1447
156 177,0065 7,1093
157 177,0419 7,1676
158 176,9836 7,4415
159 176,7097 7,2258
160 176,9254 7,2018
161 176,9494 7,208
162 176,9432 7,2018
163 176,9494 7,2018
164 176,9494 7,2375
165 176,9137 7,2018
166 176,9494 7,2018
167 176,9494 7,2375
168 176,9137 7,2271
169 176,9241 7,1209
170 177,0303 7,1909
171 176,9603 7,2152
172 176,936 7,2577
173 176,8935 7,2628
174 176,8884 7,3842
175 176,767 7,3497
176 176,8015 7,4182
177 176,733 7,4917
178 176,6595 7,6094
179 176,5418 7,3976
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 75
180 176,7536 7,3044
181 176,8468 7,2546
182 176,8966 7,1442
183 177,007 6,6119
184 177,5393 6,5314
185 177,6198 6,2128
186 177,9384 6,1865
187 177,9647 6,1822
188 177,969 6,1675
189 177,9837 6,1789
190 177,9723 6,1416
191 178,0096 6,1182
192 178,033 6,2178
193 177,9334 6,1073
194 178,0439 6,1039
195 178,0473 6,0647
196 178,0865 6,0727
197 178,0785 6,0511
198 178,1001 6,133
199 178,0182 6,249
200 177,9022 6,1529
201 177,9983 6,0736
202 178,0776 6,1021
203 178,0491 6,0979
204 178,0533 6,0839
205 178,0673 6,1098
206 178,0414 6,0962
207 178,055 6,1131
208 178,0381 6,1189
209 178,0323 6,0238
210 178,1274 6,0277
211 178,1235 6,0996
212 178,0516 6,6259
213 177,5253 6,6345
214 177,5167 6,6311
215 177,5201 6,6331
216 177,5181 6,6331
217 177,5181 6,6407
218 177,5105 6,7178
219 177,4334 6,6881
220 177,4631 6,7212
221 177,43 6,1512
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 76
222 178 6,2313
223 177,9199 6,2831
224 177,8681 6,2282
225 177,923 6,2198
226 177,9314 6,2925
227 177,8587 6,2671
228 177,8841 6,2643
229 177,8869 6,2333
230 177,9179 6,2827
231 177,8685 6,7429
232 177,4083 6,6815
233 177,4697 6,6196 Média Desvio-padrão
234 177,5316
7,051867 0,747678
“Z-Project” – Intensidade Máxima
Número de Pontos Valores Diferença
Parede Cima
1 84,9336 6,5834
2 91,517 6,3232
3 91,2568 6,4794
4 91,413 6,4143
5 91,3479 5,5036
6 90,4372 6,2322
7 91,1658 6,2322
8 91,1658 5,8679
9 90,8015 6,2322
10 91,1658 6,2322
11 91,1658 5,5036
12 90,4372 6,5965
13 91,5301 5,5036
14 90,4372 5,5036 Média Desvio-padrão
15 90,4372
6,086279 0,422141849
Parede Baixo
16 185,2757 5,2211
17 180,0546 5,5854
18 179,6903 5,5854
19 179,6903 5,5854
20 179,6903 5,5854
21 179,6903 6,314
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 77
22 178,9617 6,314
23 178,9617 5,2211
24 180,0546 4,8568 Média Desvio-padrão
25 180,4189
5,5854 0,481923601
• 15% Hematócrito
“Tracking”
Número de Pontos Valores Diferença
Parede Cima
1 83,4901 18,796
2 102,2861 18,9227
3 102,4128 19,1171
4 102,6072 19,6988
5 103,1889 19,279
6 102,7691 19,2529
7 102,743 19,1159
8 102,606 19,02
9 102,5101 19,1391
10 102,6292 19,5397
11 103,0298 19,5635
12 103,0536 19,6865
13 103,1766 20,0968
14 103,5869 20,2921
15 103,7822 19,8705
16 103,3606 19,7612
17 103,2513 19,7
18 103,1901 19,5477
19 103,0378 19,6052
20 103,0953 19,734
21 103,2241 20,027
22 103,5171 19,9088
23 103,3989 19,697
24 103,1871 19,7047
25 103,1948 19,828
26 103,3181 20,2417
27 103,7318 20,3817
28 103,8718 20,3242
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 78
29 103,8143 20,2291
30 103,7192 19,9656
31 103,4557 19,7317
32 103,2218 19,6874
33 103,1775 19,7385
34 103,2286 19,712
35 103,2021 19,6477
36 103,1378 19,6073
37 103,0974 19,1063
38 102,5964 18,9092
39 102,3993 18,85
40 102,3401 18,9838
41 102,4739 19,2285
42 102,7186 19,1844
43 102,6745 19,2283
44 102,7184 19,0118
45 102,5019 18,8447
46 102,3348 18,5451
47 102,0352 18,4597
48 101,9498 18,5743
49 102,0644 18,3823
50 101,8724 18,1052
51 101,5953 18,2006
52 101,6907 18,769
53 102,2591 18,8168
54 102,3069 18,9967
55 102,4868 19,139
56 102,6291 19,0982
57 102,5883 19,1007
58 102,5908 18,897
59 102,3871 18,5269
60 102,017 18,6027
61 102,0928 19,0093
62 102,4994 19,2517
63 102,7418 19,37
64 102,8601 19,3467
65 102,8368 19,3894
66 102,8795 19,4113
67 102,9014 19,2943
68 102,7844 19,2891
69 102,7792 19,2946
70 102,7847 19,3514
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 79
71 102,8415 19,6149
72 103,105 19,722
73 103,2121 19,7477
74 103,2378 19,6438
75 103,1339 19,4728
76 102,9629 19,2921
77 102,7822 19,1753
78 102,6654 19,3497
79 102,8398 19,4992
80 102,9893 19,7225
81 103,2126 19,8702
82 103,3603 19,7666
83 103,2567 19,3104
84 102,8005 19,095
85 102,5851 18,9977
86 102,4878 19,1374
87 102,6275 19,1066
88 102,5967 19,4228 Média Desvio-padrão
89 102,9129
19,34871 0,48024
“Z-Project” – Intensidade Máxima
Número de Pontos Valores Diferença
Parede Cima
1 86,9984 9,5096
2 96,508 9,2189
3 96,2173 9,5096
4 96,508 10,0909
5 97,0893 9,5096
6 96,508 9,5096
7 96,508 10,0909
8 97,0893 9,5096
9 96,508 10,0909
10 97,0893 9,5096
11 96,508 10,0909
12 97,0893 10,0909
13 97,0893 10,3816
14 97,38 10,6723 Média Desvio-padrão
15 97,6707
9,841779 0,424401
Parede Baixo
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 80
16 187,5655 8,987
17 178,5785 9,3746
18 178,1909 8,2119
19 179,3536 8,5994
20 178,9661 8,2119
21 179,3536 8,987
22 178,5785 8,987
23 178,5785 8,5994
24 178,9661 8,4783 Média Desvio-padrão
25 179,0872
8,715167 0,394651
• 9% Hematócrito
“Tracking”
Número de Pontos Valores Diferença
Parede Baixo
1 178,086 22,422
2 178,087 22,379
3 178,093 21,931
1 155,664 22,045
2 155,707 22,038
3 156,155 22,042
4 156,041 22,012
5 156,048 21,935
6 156,044 21,933
7 156,074 21,969
8 156,151 22,011
9 156,153 22,017
10 156,117 22,47
11 156,075 22,511
12 156,069 22,503
13 155,616 22,519
14 155,575 22,7
15 155,583 22,78
16 155,567 22,547
17 155,386 22,63
18 155,306 22,555
19 155,539 22,503
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 81
20 155,456 22,516
21 155,531 22,416
22 155,583 23,092
23 155,57 23,08
24 155,67 22,892
25 154,994 23,039
26 155,006 23,764
27 155,194 23,764 Média Desvio-padrão
28 155,047
22,5005 0,494229721
“Z-Project” – Intensidade Mínima
Número de Pontos Valores Diferença
Parede Cima
1 90,6136 12,4075
2 103,0211 12,0047
3 102,6183 12,7929
4 103,4065 12,4989
5 103,1125 13,5153
6 104,1289 15,2273
7 105,8409 14,0188
8 104,6324 13,2132
9 103,8268 12,3023
10 102,9159 11,1991
11 101,8127 11,1991
12 101,8127 11,1991
13 101,8127 12,0047
14 102,6183 12,4075 Média Desvio-padrão
15 103,0211
12,57074 1,140984708
Parede Baixo
16 189,7281 13,1181
17 176,61 12,3867
18 177,3414 12,0846
19 177,6435 12,3867
20 177,3414 10,8761
21 178,852 13,2931
22 176,435 13,5952
23 176,1329 14,1994
24 175,5287 12,9909 Média Desvio-padrão
25 176,7372
12,77009 0,969420672
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 82
• 2% Hematócrito
“Tracking”
Número de Pontos Valores Diferença
Parede Baixo
1 187,05 29,048
2 187,06 28,998
1 158,002 28,921
2 158,052 28,903
3 158,129 28,939
4 158,147 28,921
5 158,111 29,074
6 158,129 29,171
7 157,976 29,171
8 157,879 29,168
9 157,879 29,226
10 157,882 29,289
11 157,824 29,261
12 157,761 29,172
13 157,789 29,141
14 157,878 29,134
15 157,909 29,179
16 157,916 29,323
17 157,871 29,3
18 157,727 29,332
19 157,75 29,295
20 157,718 29,319
21 157,755 29,325
22 157,731 29,397
23 157,725 29,346
24 157,653 29,382
25 157,704 29,336
26 157,668 29,311 Média Desvio-padrão
27 157,714
29,19221 0,151488261
Estudo da Camada de Plasma em Microcanais
Cátia Fidalgo 83
“Z-Project” – Intensidade Mínima
Número de Pontos Valores Diferença
Parede Cima
1 77,5758 8,4105
2 85,9863 8,8033
3 86,3791 8,5205
4 86,0963 11,1051
5 88,6809 10,4812
6 88,057 9,1443
7 86,7201 10,6595
8 88,2353 10,5495
9 88,1253 9,3226
10 86,8984 8,2531
11 85,8289 10,3945
12 87,9703 8,4313
13 86,0071 10,2139
14 87,7897 10,0356 Média Desvio-padrão
15 87,6114
9,594636 0,997803428
Parede Baixo
16 176,836 9,4563
17 167,3797 9,1889
18 167,6471 10,4367
19 166,3993 7,6738
20 169,1622 10,2585
21 166,5775 9,7237
22 167,1123 8,5651
23 168,2709 8,8324
24 168,0036 9,4563 Média Desvio-padrão
25 167,3797
9,287967 0,855386201