Upload
danielamontes
View
244
Download
1
Embed Size (px)
DESCRIPTION
ESTUDIO DE MICROORGANISMOS
Citation preview
ESTUDIO DE LOS MICROORGANISMOS
Microorganismo
Salmonela (Salmonella typhimurium), en rosa, en un cultivo de células humanas.
Un microbio (del griego científico μικρόβιος [microbios]; de μικρός [micrós], ‘pequeño’, y βίος [bíos], ‘vida’;1 ser vivo diminuto), también llamado microorganismo, es un ser vivo, o un sistema biológico, que solo puede visualizarse con el microscopio. La ciencia que estudia los microorganismos es la microbiología. Son organismos dotados de individualidad que presentan, a diferencia de las plantas y los animales, una organización biológica elemental. En su mayoría son unicelulares, aunque en algunos casos se trate de organismos cenóticos compuestos por células multinucleadas, o incluso multicelulares.
El concepto de microorganismo es operativo y carece de cualquier implicación taxonómica o filogenética dado que engloba organismos unicelulares y pluricelulares no relacionados evolutivamente entre sí, tantoprocariotas (como las bacterias), como eucariotas (como los protozoos), una parte de las algas y los hongos, e incluso entidades biológicas acelulares de tamaño ultramicroscópico, como los virus o los priones. Estos últimos generalmente no son considerados seres vivos y por lo tanto no son microorganismos en sentido estricto; no obstante, también están incluidos en el campo de estudio de la microbiología.
Los microbios tienen múltiples formas y tamaños. Si un virus de tamaño promedio tuviera el tamaño de una pelota de tenis, una bacteria sería del tamaño de media cancha de tenis y una célula eucariota sería como un estadio entero de fútbol.[cita requerida]
Algunos microorganismos son patógenos y causan enfermedades a personas, animales y plantas, algunas de las cuales han sido un azote para la humanidad desde tiempos inmemoriales. No obstante, la inmensa mayoría de los microbios no son en absoluto perjudiciales y bastantes juegan un papel clave en la biosfera al proporcionar oxígeno (algas y cianobacterias), y, otros, descomponer la materia orgánica, mineralizarla y hacerla de nuevo accesible a los productores, cerrando el ciclo de la materia.
Tipos de microbios
En los microbios están representados cuatro grupos de seres: bacterias,
protozoos, hongos y algas.
Virus[editar]
Artículo principal: Virus
Los virus son sistemas biológicos que presentan incluso tamaños ultramicroscópicos (los más pequeños y los de tamaños medianos solo se pueden observar mediante microscopio electrónico), los cuales pueden causar infecciones y solo se reproducen en células huésped. Los virus fuera de células huésped están en forma inactiva. Los virus constan de una cubierta protectora proteica o cápside que rodea el material genético. Su forma puede ser espiral, esférica o como células pequeñas, de tamaño entre 10 y 300 nm. Al tener un tamaño menor que las bacterias, pueden pasar filtros que permiten la retención de las mismas.
Al contrario que las bacterias y los protozoos parásitos, los virus contienen un solo tipo de ácido nucleico (ARN o ADN). No se pueden reproducir por sí solos, sino que necesitan de la maquinaria metabólica de la célula huésped para asegurar que su información genética pasa a la siguiente generación.
Al contrario que las bacterias, los virus no están presentes en el ser humano de manera natural (excepto como un elemento viral endógeno). Cuando las personas quedan afectadas por un virus, estos generalmente se eliminan del cuerpo humano mediante secreciones.
En las últimas décadas se han empezado a utilizar virus en medicina, por ejemplo para la debilitación de bacterias, la creación de antitoxinas, la utilización para librerías genómicas, como vectores en terapia génica, para la destrucción de células tumorales2
Micrococcus luteus.Microorganismos procariotas
Artículos principales: Bacteria y Archaea.
Las bacterias y las arqueas son microorganismos procariontes de forma esférica (cocos), de bastón recto (bacilos) o curvado (vibrios), o espirales (espirilos). Pueden existir como organismos individuales, formando cadenas, pares, tétradas, masas irregulares, etc. Las bacterias son una de las formas de vida
más abundantes en la tierra. Tienen una longitud entre 0,4 y 14 μm. Consecuentemente solo se pueden ver mediante microscopio. Las bacterias se reproducen mediante la multiplicación del ADN, y división en dos células independientes; en circunstancias normales este proceso dura entre 30 y 60 minutos.
Cuando las condiciones del medio son desfavorables, cuando cambia la temperatura o disminuye la cantidad de los nutrientes, determinadas bacterias forman endosporas como mecanismo de defensa, caracterizadas por presentar una capa protectora resistente al calor, a la desecación, a la radiación y a la trituración mecánica y que protege la bacteria de manera muy eficiente. De esta manera, pueden soportar temperaturas elevadas, periodos de sequía, heladas, etc. Cuando las condiciones del medio mejoran, se desarrolla una nueva bacteria que continúa el crecimiento y la multiplicación.
Las bacterias tienen un papel funcional ecológico específico. Por ejemplo, algunas realizan la degradación de la materia orgánica, otras integran su metabolismo con el de los seres humanos.
Si bien algunas bacterias son patógenas (causantes de diversas enfermedades), una gran parte de ellas son inocuas o incluso buenas para la salud.
Algas Cianoficeas
Artículo principal: Cyanobacteria
Las algas cianoficeas o Cyanobacterias son bacterias capaces de realizar fotosíntesis oxigénica, cuyas células miden solo unos micrómetros (µm) de diámetro, pero son más grandes que la mayoría de las otras bacterias. Contienen la enzima ribulosa-1,5-bisfosfatocarboxilasa RuBisCO, que realiza la fijación del CO2.
Microorganismos eucariotas
Se denomina eucariotas a todas las células que tienen su material hereditario (su información genética) encerrado dentro de una doble membrana, la envoltura nuclear, que delimita un núcleo celular.
Hay tres tipos de microorganismos eucariotas, los protozoos (heterótrofos y sin pared celular), las algas microscópicas (autótrofos y con pared celular de celulosa) y los hongos microscópicos (heterótrofos y con pared celular de quitina).
Protistas
Artículo principal: Protozoo
Los protozoos son microorganismos unicelulares eucarióticos cuyo tamaño va de 10-50 μm hasta más de 1 milímetro, y pueden fácilmente ser vistos a través de un microscopio. Son heterótrofos, fagótrofos, depredadores o detritívoros, a veces mixótrofos(parcialmente autótrofos), que viven en ambientes húmedos o directamente en medios acuáticos, ya sean aguas saladas o aguas dulces. La reproducción puede ser asexual por bipartición y también sexual por isogametos o por conjugación intercambiando material genético. En este grupo encajan taxones muy diversos con una relación de parentesco remota, que se encuadran en muchos filos distintos del reino protista, definiendo un grupo polifilético, sin valor en la clasificación de acuerdo con los criterios actuales.
Hongos
Artículo principal: Fungi
El reino Fungi incluye muchas especies macroscópicas que en absoluto encajan en la definición de microorganismo, pero también forma microscópicas, como las levaduras, que son campo de estudio de la microbiología. Además, numerosos hongos producenenfermedades infecciosas en animales y plantas y tienen un gran interés sanitario y agropecuario.
Microorganismos patógenos
Artículo principal: Enfermedad infecciosa
Algunos microorganismos son capaces de penetrar y multiplicarse en otros seres vivos, a los que perjudican, originando una infección; son los denominados microorganismos patógenos. Los problemas que causa una infección dependen del tipo de patógeno, el modo en que se transfiere, dosis o concentración de patógenos, persistencia de los microorganismos y la resistencia del organismo infectado.
La dosis de infección significa el número de microorganismos. Esta dosis es muy baja para los virus y protozoos parásitos. La persistencia de los microorganismos depende del tiempo viable de los microorganismos cuando no se encuentran en el huésped humano. Por ejemplo, las bacterias son generalmente menos persistentes mientras los quistes de los protozoos son los más persistentes.
Los jóvenes, personas mayores y enfermos de otras patologías son los menos resistentes a las enfermedades y por lo tanto son más frágiles. Cuando una persona es infectada, los patógenos se multiplican en el huésped, y esto supone un riesgo de infección o enfermedad. No todas las personas infectadas por patógenos enferman. Las personas que enferman pueden contagiar y extender la enfermedad mediante las secreciones y mediante contacto directo de alguna manera con la mucosa del infectado.
ESTEQUIOMETRÍA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
La conversión microbiológica de carbohidratos para obtener biomasa y
productos de interés industrial es tema de constante actualidad debido a la
creciente dependencia de los recursos renovables.
Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia
significativa debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados
en la formulación de medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el
costo de operación de las plantas industriales. El grado en que un
microorganismo puede transformar los componentes del medio de cultivo en
nueva biomasa y productos juega un papel fundamental, a punto tal que puede
llegar a ser factor determinante de la viabilidad de un proceso en gran escala.
Desde este punto de vista, resulta de sumo interés poder llegar a determinar,
estimar o predecir rendimientos que den cuenta de las transformaciones que
se están llevando a cabo en un biorreactor. Los balances de materia y energía
resultan a tal fin de suma utilidad y su empleo se ha extendido ampliamente en
ciencias básicas y aplicadas.
La aparición en el mercado de sensores que permiten medir importantes
variables de los cultivos microbianos y el uso de ordenadores acoplados a los
biorreactores (biorreactor = recipiente en el cual se cultivan los
microorganismos) han ampliado el horizonte para la aplicación de balances de
materia y energía. la producción de biomasa (biomasa = concentración de
microorganismos expresada en gramos de células secas / litro de cultivo),
consumo de las fuentes de C y energía, de nitrógeno y Oxígeno y las producción
de CO2 y desprendimiento de calor son algunas de las variables que pueden ser
estimadas a partir de medidas experimentales y utilizadas en el planteo y
cálculo de balances de materia y energía.
Antes de proceder a considerar el sistema de análisis propuesto, es
conveniente introducir algunas definiciones y hacer ciertas consideraciones
sobre algunas “regularidades” observadas experimentalmente en el cultivo de
microorganismos.
En primer lugar se ha encontrado que la composición elemental de un
importante número de microorganismos, cultivados bajo diferentes
condiciones, se mantiene prácticamente constante; así podemos definir un
“microorganismo promedio” (composición standard) como aquel cuya
composición es (% p/p): C = 46,5; H = 6,94; 0 = 31,0 y N = 10,85, donde el
aproximadamente 5 % restante está representado por sales. Es importante
recalcar que si bien la composición elemental promedio de la biomasa se
mantiene prácticamente constante, la concentración intracelular de proteínas,
RNA y demás constituyentes celulares puede variar sensiblemente entre
diferentes especies e incluso entre diferentes estadíos del cultivo de un mismo
microorganismo.
Teniendo en cuenta esta composición media, podemos escribir lo que
sería la “fórmula mínima” de nuestro m.o. promedio como C H1,79O0,5N0,2 (en la
que está representada el 95% p/p de la biomasa) y con fines netamente
prácticos definir “1 C-mol de biomasa” como la cantidad de biomasa que
contiene 1 átomo gramo de C. Así pues tenemos que:
Para conocer la cantidad de biomasa que corresponde a n C-moles de
biomasa debemos conocer su composición elemental y en base a dicha
composición, el peso de 1 cmol. En términos generales la masa resulta ser:
de biomasa.
De forma análoga a como lo hicimos con la biomasa, podemos definir 1
C-mol de sustrato (entiéndase por sustrato fuente de carbono y energía, FCE), 1
C-mol de fuente de N, etc. Como ejemplo, para la glucosa: C6H12O6, 1 C-mol de
glucosa estará representado por CH2O y pesará 30 g, y para el etanol, 1 C-mol
de etanol (CH3O0,5) pesará 23 g.
Otro concepto que debemos introducir es el de “grado de reducción” o
“grado de reductancia”, el cual será de gran utilidad en el momento de
plantear nuestros balances de materia y energía.
Tomemos como ejemplo las siguientes reacciones de oxidación:
C + O2. CO2 = 4
CH4 + 2O2 CO2 + 2H2O = 8
CO + 0,5 O2 CO2 = 2
CH2O + O2 CO2 + H2O = 4
CH3O0,5 + 1,5 O2 CO2 + 1,5 H2O ` = 6
Podemos observar que los distintos valores de que figuran a la derecha
de cada ecuación coinciden con el número de “electrones disponibles” que
fueron transferidos desde el compuesto a oxidar al oxígeno. En general se
expresa en términos de n de e- disponibles / c-mol.
Para calcular el valor de de un determinado compuesto se toman los
grados de reducción 4 para el C; 1 para el H; -2 para el O y -3 para el N. En el
caso del CO2, H2O y NH3 no se tienen e- disponibles (estados de referencia),
luego CO2 = H2O = NH3 = 0. Se considera además que el estado de oxidación
predominante del N en la biomasa es -3. En términos generales para un
compuesto de fórmula CHaObNc, su grado de reducción vendrá dado por:
= 4 + a - 2b - 3c (1)
Si tenemos un compuesto cuya fórmula es Ch Hi Oj Nk, debemos llevarlo a la
forma
Si tomamos como ejemplo a nuestro m.o. promedio su x (donde el
subíndice x indica biomasa) será:
Este valor, junto a Pcmol = 25,8 son dos de las “regularidades” a las que
nos habíamos referido con anterioridad. Estos valores pueden ser empleados
en balances de materia y energía en aquellos casos en que se desconoce la
composición de la biomasa sin temor de incurrir en errores groseros de cálculo.
Otras regularidades observadas en el cultivo de m.o. es que el calor de reacción
por mol de e- transferidos al O2 es relativamente constante para la oxidación de
una amplia variedad de moléculas orgánicas y corresponde a 27 Kcal/mol e -
disponibles transferidos al O2.
Estamos ahora en condiciones de plantear una serie de balances de
materia y energía, para lo cual trataremos al cultivo de un m.o. como si fuera
una reacción química simple.
Donde X significa “biomasa”, cualquiera sea su naturaleza.
Debemos hacer notar que los coeficientes estequiométricos están
referidos a 1 C-mol de fuente de C y energía. Así pues:
lo mismo para yp e yCO2.
El balance de carbono para esta reacción de formación de biomasa y producto
será:
(2)
De igual forma podemos establecer un balance del grado de reducción:
s + (-4)b = yx . x + yp . p (3)
Reordenando y dividiendo por s obtenemos
(4)
o lo que es lo mismo
+ + = 1 (5)
donde = (fracción de e- disponibles de la FCE transferidos al O2)
= (fracción de e- disp. de la FCE transferidos a la biomasa)
= (fracción de e- disp. de la FCE transferidos al producto)
Estos dos balances obedecen directamente al principio de conservación
de la masa y la energía, en el primero de ellos, no puede haber entre los
productos más carbono del que un c-mol de sustrato puede aportar y el en el
caso del segundo, los electrones disponibles del sustrato deben ir
obligadamente a los distintos productos.
Si asumimos, como ya se mencionó, que el calor de reacción por mol de
e- disponibles transferidos al oxígeno es constante para un importante número
de moléculas orgánicas, el primer término de la ecuación (4) nos da la fracción
de energía del sustrato que evoluciona como calor. Si llamamos qo a esa
constante con qo = 27 Kcal/mol e- disponibles transferidos al O2, el calor
generado en la ecuación l’ vendrá dado por:
q = 4 qo b kcal/C-mol de sustrato (6)
Si conocemos la velocidad de consumo de O2 de nuestro cultivo podemos
calcular la velocidad de producción de calor y por lo tanto los requerimientos
de H2O de enfriamiento para mantener constante la temperatura de nuestro
biorreactor.
El concepto de e- disponibles nos brinda un método simple de cálculo
para chequear los resultados obtenidos experimentalmente en lo que se da en
llamar “análisis de consistencia interna”. Empleando las ecuaciones (2) y (4) o
(5) con datos obtenidos en el laboratorio, podemos estimar parámetros no
medidos y tener idea de cuán confiables fueron nuestras determinaciones.
Medidas realizadas en el laboratorio deben encontrarse dentro de los
intervalos:
0,94 yx + yp + yCO2 1,06
0,93 + + 1,07
Valores inferiores o superiores a estos límites de aceptabilidad
determinados estadísticamente ponen en evidencia errores en las
determinaciones experimentales.
En el trabajo habitual de laboratorio la cuantificación de la biomasa
producida se efectúa gravimétricamente, es decir, se determina el incremento
en biomasa expresado en g/l (x) correspondiente a la utilización de una
determinada cantidad de sustrato (s) (igualmente expresada en g/l) con lo
cual definimos nuestro rendimiento en base a sustrato como al que
tomamos como “rendimiento global” en el que sólo se tienen en cuenta los
valores finales e iniciales de biomasa y sustrato, más rigurosamente Y x debiera
ser expresado por el límite x / s con s 0, esto es: (observar que
el signo negativo es introducido porque x y s varían en sentido contrario).
Estamos ahora en condiciones de calcular los valores de yx, yp, y yCO2
conociendo los respectivos rendimientos globales y los valores de P cmol de X,
S, P y CO2 tal cual vemos a
continuación: (7)
Resulta de gran interés conocer los destinos que toma la fuente de C y energía
durante el crecimiento microbiano y la fracción de la misma empleada por el
m.o. para obtener la energía necesaria para llevar adelante sus funciones
metabólicas.
Por balance de sustrato:
s = sx + sp + sE (8)
donde S = Sustrato total consumido
Sx = Fracción de sustrato utilizado en la formación de biomasa
Sp = Fracción de sustrato utilizado en la formación de producto
SE = Fracción de sustrato utilizado para obtener energía
por consiguiente:
SE = S - Sx - Sp
SE = S + X
fE = 1 - yx - yp = fE : fracc. de FCE destinada a la obtención de E.
(11)
Experimentalmente lo que se hace es determinar la producción global de
CO2 y conociendo la masa de CO2 y sustrato consumido y calcular SE por
estequiometría. Este método presenta dos inconvenientes: en primer lugar
existen reacciones enzimáticas que incorporan O2 a determinados
componentes celulares (O2 que no es empleado para obtener energía) no
obstante este consumo puede ser despreciado frente al global para oxidar la
fte. de C y E; y el más importante es que debemos suponer que x s, caso
contrario se introduce un grosero error en el cálculo.
CINÉTICA
DEL CRECIMIENTO
CINÉTICA DEL CRECIMIENTO
Hasta aquí hemos visto las relaciones estequiométricas que existen en
los cultivos microbianos, y cómo a través de ellas es posible obtener
información del destino que tiene la fuente de carbono y energía. Las
ecuaciones (2) y (4), resumen toda la información que es posible obtener
mediante los balances de materia y energía, pero nada dicen acerca de la
velocidad, r, con que transcurre el proceso; por lo que ahora centraremos la
atención en este aspecto.
Convendrá antes definir la forma en que expresaremos las distintas
velocidades. De este modo llamaremos a:
rx = velocidad de crecimiento microbiano (o, brevemente, velocidad de
crecimiento) y las unidades serán:
del mismo modo:
rs = = velocidad de consumo de sustrato
rp = = velocidad de formación de producto.
r = velocidad de consumo de O2
r = velocidad de producción de CO2
Estas velocidades también pueden ser expresadas en ; y en este caso, para
diferenciarlo del anterior, las denotaremos con R. Por ej.:
Rx =
Análogamente tendremos: Rs, R , etc.
La conversión entre rx y Rx estará dada por:
Rx = 25,8 . rx
Análogamente:
Rs =
R , etc.
Velocidades específicas:
Corresponden alas anteriormente definidas pero referidas a la unidad de
biomasa, es decir:
= ; velocidad específica de crecimiento.
= qs ; velocidad específica de consumo de sustrato (s puede ser la fuente de
carbono y energía o cualquier otro componente del medio)
; velocidad específica de consumo de O2.
; velocidad específica de formación de producto.
etc.
Las velocidades específicas suelen brindar información acerca de cuál es
la actividad metabólica del microorganismo (o de la biomasa) durante el
cultivo, ya que el estar referidos a la unidad de biomasa cualquier modificación
en el valor de , qs, etc. estará indicando que "algo" está ocurriendo en el
metabolismo del microorganismo en cuestión.
De hecho es frecuente que las velocidades específicas varíen durante el
cultivo, y es muy común que por ej. el valor de al principio del cultivo difiera
del que se encuentra en estadios posteriores. Lo mismo vale para qs, , etc.
SISTEMAS DE CULTIVO
BATCH
CONTINUO
Y BATCH ALIMENTADO
CULTIVO EN BATCH
La evolución del cultivo en el tiempo, sigue una curva típica la cual recibe
el nombre de “curva de crecimiento en batch”. Los sucesos que tienen lugar
durante la misma pueden separarse en cuatro fases perfectamente
diferenciables. En primer lugar existe una fase donde prácticamente no hay
división celular pero sí aumento de la masa individual de los microorganismos
(fase “lag” o fase de retardo). Le sigue una etapa donde el crecimiento ocurre a
velocidad específica () máxima y constante = m (fase exponencial). Al final de
esta fase se alcanza la máxima concentración microbiana. Posteriormente hay
un rápido período de desaceleración donde 0 y se entra en la fase
estacionaria la cual es causada por agotamiento de algún nutriente (el sustrato
limitante) o bien por acumulación de inhibidores. Durante esta fase la
concentración microbiana (o de biomasa) permanece constante. Finalmente se
llega a una última etapa donde la concentración de biomasa disminuye por
autolisis o como consecuencia del metabolismo endógeno (fase de
decaimiento).
La duración de cada una de estas fases es función del microorganismo
en estudio y de la composición del medio de cultivo. En particular la fase lag
depende además de la fase de crecimiento en que se encuentran las células en
el momento de ser sembradas y de la composición del medio de cultivo en que
fueron crecidas. Si éste es igual a la composición del medio en que se van a
sembrar y las células están en fase exponencial, la duración de la fase lag, en
general se acorta y puede llegar a desaparecer, lo cual es deseable ya que
constituye tiempo perdido.
La descripción matemática (modelado) de las cuatro fases descriptas es
sumamente compleja y escapa a los fines de esta guía, por lo que sólo veremos
una más simple que sólo contempla la fase exponencial y la estacionaria.
De la definición de obtenemos
rx = . x (12)
donde x = concentración de biomasa. Hemos visto que varía durante el
cultivo, siendo un valor constante y máximo en la fase exponencial (m) y nulo
en la estacionaria. Monod ha propuesto una relación muy simple entre el valor
de y la concentración de sustrato limitante, S, entendiéndose por éste al
componente del medio de cultivo que esté en menor proporción respecto de
las necesidades del microorganismo. Por tanto S puede ser la fuente de N, de C,
algún aminoácido, etc. La ecuación es:
= m (13)
A KS se la conoce como Constante de Saturación, y da una idea de la
afinidad que tiene el microorganismo por el sustrato en cuestión. A menor KS
mayor afinidad. Normalmente KS tiene valores muy pequeños (10-2 - 10-3 g/l)
por lo que concentraciones relativamente pequeñas de S son suficientes para
hacer que:
= m (14)
Reemplazando la ec. (13) en (12) queda:
rx = m . x (15)
Al principio del cultivo todos los nutrientes estarán en exceso, y en particular el
sustrato limitante también, por lo que la ex. (15) se reduce a (fase exponencial)
rx = m x ; o bien: = m . x (16)
La ec. (16) es fácilmente integrable y si hacemos a t = 0; x = xo (concentración
inicial de microorganismos) queda:
ln x = ln xo + m t (17)
o bien
x = xo em t (18)
Por tanto en esta fase la concentración de biomasa aumenta
exponencialmente, y también lo hace rx ya que reemplazando: rx = m xo e m t
A partir de la ec. (17) se puede calcular el tiempo de generación del
microorganismo (período de tiempo en que la biomasa se duplica) haciendo x =
2 xo y nos queda tg =
A medida que transcurre el tiempo de cultivo, S va disminuyendo (y por
tanto rx) hasta que finalmente S = 0 (fase estacionaria), y
rx = 0 (19)
lo que implica:
x = cte = xf (20)
xf = concentración final de biomasa.
Si graficamos ln x vs. t se obtiene un gráfico como el de la fig.
De la fase exponencial se calcula m mediante la ecuación (17). La
duración de la fase lag, tL, se puede calcular del gráfico, o bien haciendo una
corrección en la ec. (17).
ln x = ln xo + m (t - tL)
Si tomamos un valor cualquiera de x que corresponda a la fase
exponencial, xe, podemos calcular tL.
tL = te -
Consumo de Sustrato
Hemos visto que el rendimiento se definía como yx = -
por tanto
rs = (22)
reemplazando en la ec. (22) la ec. (15) queda:
rs = (23)
A medida que S tiende a cero, rs también.
En fase exponencial será S ks y además x estará dado por la ec. (18), por
tanto:
(24)
Si a t = 0 es S = So implica:
S = So - (25)
La ec. (25) da la variación de S en función de t durante la fase
exponencial.
Si se conoce de antemano el rendimiento yx (o Yx) y las concentraciones
iniciales de sustrato y biomasa, es fácil estimar el valor de xf ya que:
x = -Yx . S (26)
x - xo = Yx (S - So) (27)
Si S es el sustrato limitante, se tendrá que para x = x f será Sf = 0, por
tanto:
xf = xo + Yx. So (28)
La ec. (27) permite calcular S para un x dado (o viceversa) en cualquier
parte de la curva de crecimiento, siempre y cuando Yx (o yx) se mantenga
constante. Alternativamente la ec. (27) puede emplearse para verificar si tal
supuesto se cumple ya que la gráfica de (x - xo) en función de (So - S) deberá
ajustarse a una recta. De todos modos siempre es posible calcular un
rendimiento global, independientemente de las variaciones que pueda tener
durante el cultivo, empleando sólo valores iniciales y finales:
Yx = - (29)
Consumo de O2
Hemos visto que realizando un balance entre la composición de los gases
que ingresan y salen del biorreactor se puede calcular r . Con este valor y el
de la concentración de biomasa, x, se puede calcular a distintos tiempos el
valor de , con lo cual tendremos una idea de lo que ocurre con la
capacidad respiratoria de los microorganismos durante el cultivo. Al respecto
es útil estudiar cuáles son las posibles causas de variación de .
1) Sea yx/o = (30) yx/o = rendimiento de biomasa base a O2
consumido
Al igual que en la ec. (21) podemos hacer:
yx/o = (31)
de donde reemplazando por la ec. (13)
(32)
En fase exponencial es S ks y
(33)
es decir que en esta fase se mantiene constante y con un valor máximo. A
medida que S disminuye, también hasta que virtualmente se hace nulo en
la fase estacionaria. Esto es particularmente válido cuando el sustrato limitante
es la fuente de carbono y energía, ya que al agotarse ésta, los microorganismos
se quedan sin “combustible” y por tanto el consumo de O2 cesa. No ocurre lo
mismo cuando el sustrato limitante es por ej. la fuente de nitrógeno, pues si
bien cuando ésta se agote se detendrá el crecimiento, nada impide que los
microorganismos sigan respirando ya que cuentan con “combustible” en
exceso.
2) Otra causa que afecta el valor de es la concentración de O2 disuelto. Por
analogía con la ecuación de Monod, se ha propuesto la ecuación:
(34)
donde C = concentración de Os disuelto.
Al igual que ks, se encuentra que ko es pequeño, y en general valores de C
del orden de 0,8 mg/l (10% de saturación) son normalmente suficientes para
que = m. A la concentración de O2 disuelto por encima de la cual el
valor de se mantiene constante, se la conoce como concentración crítica
(Cc).
PARTE EXPERIMENTAL
Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae.
Medio de cultivo:
Glucosa ..............................................................................10,00 g/l
Urea ................................................................................... 1,50 g/l
K2HPO4 ............................................................................. 1,00 g/l
MgSO4.7H2O ..................................................................... 0,60 g/l
CaCl2.2H2O ........................................................................ 0,10 g/l
ácido cítrico ........................................................................ 0,45 g/l
H3BO3 ................................................................................. 0,10 mg/l
CuSO4 ................................................................................. 0,10 mg/l
KI ........................................................................................ 0,10 mg/l
FeCl3 ................................................................................... 0,10 mg/l
Na2MoO4 ............................................................................. 0,10 mg/l
inositol ................................................................................. 6,00 g/l
biotina .................................................................................. 6,00 g/l
acido fólico .......................................................................... 6,00 g/l
pantotenato de calcio ............................................................ 0,80 mg/l
tiamina .................................................................................. 0,80 mg/l
ácido nicotínico ..................................................................... 0,80 mg/l
ácido p-amino benzoico ......................................................... 0,40 mg/l
riboflavina ............................................................................. 0,40 mg/l
piridoxina .............................................................................. 1,60 mg/l
antiespumante ....................................................................... 3 gotas
pH 5,50 (ajustado con HCl o H2SO4 1N)
Volumen de cultivo: 4,0 l
Los fosfatos se esterilizan por calor húmedo (autoclave), fraccionados en
un erlenmeyer con salida lateral, disolviendo la cantidad necesaria para
preparar 3,7 l de medio de cultivo, en 500 ml de H2O y se ajusta el pH en 5,50.
El resto de los componentes (excepto la urea y la solución de vitaminas) se
disuelven en 3,2 l. de H2O, los microelementos se agregan en solución
concentrada 1000 veces a razón de 1 ml/l, se ajusta el pH en 5,50 y se
esterilizan, en autoclave, en el biorreactor.
El tiempo de esterilización será en ambos casos de 15 minutos. La urea se
esteriliza por filtración. Se prepara una solución madre con 500 g/l de urea y se
esteriliza con membrana absoluta. Esta solución se adiciona en proporción de
6,0- ml por litro de medio de cultivo.
Las vitaminas se preparan en solución concentrada 1000 veces, se
esterilizan por filtración y se adicionan a razon de 1 ml/l de medio.
Inóculo: Tres erlenmeyers de 1000 ml conteniendo 100 ml de medio de cultivo
diluido 2,5 veces se esterilizan por calor durante 10 min. En este caso para
mayor simplicidad se esterilizará el medio de cultivo completo (excepto la urea
y las vitaminas que se adicionarán en proporción de 0,5 ml y de 0,1 ml de las
soluciones madres). Los erlenmeyers serán sembrados el día anterior a la
realización de trabajo práctico con células de levaduras provenientes de un
cultivo en agar inclinado. Las mismas se resuspenden fácilmente en agua. La
temperatura de incubación será en todos los casos de 30C.
Procedimiento:
1.- Termostatizar el biorreactor a 30C
2.- Conectar el sistema de aireación al filtro estéril del biorreactor.
3.- Conectar el sistema de agitación del biorreactor. Fijar la agitación en 600
rpm.
4.- Adicionar en forma estéril los fosfatos, la urea y las vitaminas al resto del
medio de cultivo contenido en el biorreactor.
5.- Calibrar el electrodo para medir O2 disuelto haciendo pasar por el
biorreactor, primero una corriente de nitrógeno y ajustando la lectura a 0%
de saturación (ajuste del cero) y luego aire a un caudal de 2 l/min., ajustando
con la perilla de calibración a 100% de saturación. En ambos casos, antes de
realizar los ajustes, se debe dejar transcurrir 10 a 15 minutos.
Los gases que ingresen al biorreactor deberán pasar por el filtro estéril.
6.- Calibrar los instrumentos de medida para efectuar el análisis de los gases a
la salida del biorreactor (analizador de O2 y de CO2).
7.- Trasvasar, en forma estéril, los tres erlenmeyers de inóculo a otro con salida
lateral.
8.- Sembrar el biorreactor y aguardar 2 a 3 minutos
9.- Tomar 15 mL de muestra (descartar antes 2 o 3 mL) y tomar el tiempo
CERO. Anotar en cada caso el volumen de muestra y el de descarte.
10.-Medir el porcentaje de O2 y CO2 en lo gases de salida del biorreactor
Análisis de las muestras
11.- 10 mL se centrifugan 10 minutos. Guardar el sobrenadante para
determinar concentración de FCE y producto. Lavar (una vez) con agua
destilada el pellet de levaduras, centrifugar, resuspender las células con
más agua destilada y hacer peso seco a 105°C.
12.- Al resto de la muestra medirle:
12.1.- pH
12.2.- DO a 620. La muestra deberá diluirse de forma tal de obtener
lecturas entre 0,1 y 0,6.
12.3.- Control de contaminación por observación microscópica.
13.- Repetir los pasos 9 a 12 cada hora.
14.- Finalizado el cultivo, medir el volumen remanente. Con este dato y los de
volumen de muestra y lavado calcular el volumen de cultivo a la hora CERO,
1; 2, 3; etc. El volumen obtenido en cada caso será el utilizado para el
cálculo de y a los correspondientes tiempos.
Resultados
Los datos se volcarán en una tabla del siguiente formato y luego se harán las
graficas correspondientes en función del tiempo
Hora T pH DO620 X S Vextr Vrem C.R.
I.- Graficar ln x vs. t. y DO vs. t. Calcular µmax .
II.-1 Verificar si YX se mantuvo constante durante el cultivo.
II-2 Calcular YX e yX globales.
II-3 Calcular el consumo global de O2 y el CO2 total producido. Con estos valores
calcular b e yCO2 respectivamente.
III- Verificar si se cumplen los balances de carbono y de grado de reducción.
+ + = 1
yx + yCO2 = 1
CULTIVO CONTINUO
De los tres métodos usuales para el cultivo de microorganismos, batch, batch
alimentado y continuo, es este último el que ofrece mayores posibilidades de
control. Por sus características especiales permite controlar el proceso a un
valor de velocidad específica de crecimiento () prefijado de manera muy
simple. Este punto es de suma importancia ya que el comportamiento de la
mayoría de los microorganismos se ve afectado por el valor de al que están
creciendo.
Mediante el cultivo continuo es posible estudiar el efecto de variables
como PH, temperatura, concentración de nutrientes, etc., a valores constantes
el valor de , o bien, fijadas las anteriores, analizar el efecto de sobre la
estequiometría del crecimiento. De este modo es posible separar los distintos
efectos y obtener información valiosa para la mejora del proceso.
Para poner en marcha un cultivo continuo, se realiza previamente un
cultivo batch y en un momento dado, normalmente antes que se agote el
substrato limitante, se comienza a alimentar con medio de cultivo fresco a un
caudal F (Fig. 1).
F , S , X , P
X SP
F, SR
Fig. 1
El volumen del cultivo se mantiene constante. El líquido que sale del
biorreactor, a un caudal F tendrá células, y la concentración de nutrientes será
menor que en el caudal de entrada debido a que en parte fueron consumidos
por los microorganismos. Eventualmente se encontrará también algún
producto(s) proveniente de la actividad metabólica de los microorganismos.
Una de las variables de operación fundamental en este tipo de cultivos es
la velocidad de dilución, D, la cuál se define como la relación entre el caudal de
alimentación, F, y el volumen de cultivo, V.
D= FV (1)
Teniendo en cuenta las unidades usuales de F (L. h-1) y de V (L), las de D serán
de h-1. El valor de D corresponde a las veces que se renueva el volumen del
biorreactor por unidad de tiempo, así un valor de D= 0.25 h -1 indica que en una
hora se renovó un 25 % del volumen de cultivo, o bien que al cabo de 16 h se
habrá renovado cuatro veces el volumen de cultivo. Podría pensarse que luego
de la renovación reiterada del volumen de cultivo ya no quedan
microorganismos dentro del biorreactor, pero no es así; debe tenerse en
cuenta que estos se están multiplicando activamente lo cual compensa las
“perdidas” debidas a los microorganismos que son arrastrados fuera del
biorreactor por el caudal de salida. Bajo ciertas condiciones ambos procesos se
compensan de modo tal que la concentración de microorganismos se mantiene
constante en el tiempo, es decir que se habrá alcanzado un estado
estacionario. En estas condiciones también se mantendrán constantes en el
tiempo las concentraciones de nutrientes, en particular la del substrato
limitante del crecimiento, y la de producto(s).
Balances de materia:
De acuerdo al esquema de la Fig. 1 podemos plantear los siguientes
balances de materia para la concentración de microorganismos ( X ) , de
substrato ( S ) y de producto (P).
V .dXdt
=V . rx−F . X ( 2 )
V .dSdt
=F .SR−F .~S−V . r s ( 3 )
V .dPdt
=V . rP−F .P ( 4 )
Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P ya no varían con el
tiempo, lo que equivale a igualar a cero las Ecs. (2), (3) y (4), de donde resulta:
r X=D .~X ( 5 )
r S=D .(SR−~S ) ( 6 )
r P=D .~P ( 7 )
donde ~X ,~S ,~P representan las respectivas concentraciones en estado
estacionario. La Ec. (6) es válida para cualquier nutriente del medio de cultivo,
sea el substrato limitante o no, ya que la misma surge de un balance de materia
en el que no se ha hecho ninguna consideración con relación a la naturaleza del
substrato considerado.
Lo primero que debe destacarse en este tipo de cultivo es que permite
determinar experimentalmente y de modo muy simple las velocidades de
crecimiento, consumo de substrato y de formación de producto, tal como se
desprende de las Eqs. (5), (6) y (7). Del mismo modo permite calcular los
rendimientos. Por ej. Si suponemos que S representa a la fuente de carbono y
energía, el rendimiento celular se calcula fácilmente:
Y x/ s=
~X
( SR−~S ) ( 8 )
De modo similar puede calcularse YP/S , o bien las velocidades específicas. Por
ej. Para qs será:
qS=
rSx
=D . (SR−
~S )
~x ( 9 )
mientras que para la velocidad específica de crecimiento será:
μ=rXX
=D .~X~X
=D ( 10 )
La Ec. (10) es de suma importancia pues significa que en estado estacionario es
= D, y como D puede ser variado a voluntad por el operador (variable de
operación) resulta que el cultivo continuo permite “ imponerle” externamente
a los microorganismos el valor de al que deben crecer.
El estado estacionario
En el estado estacionario = D. ¿Cuanto tiempo demora el sistema en
alcanzar este estado?. En rigor, la respuesta surge de la misma definición de
estado estacionario, es decir cuando todas las variables del cultivo (X, S, P,
concentración de O2 disuelto y composición de la biomasa) no varían en el
tiempo. El criterio práctico que se suele seguir es que, una vez fijado el valor de
D, debe esperarse al menos 4.tR, donde tR se conoce como tiempo de retención
medio y puede demostrarse que :
tR = 1 / D
Por tanto si se fija un valor de D= 0.15 h-1, habrá que esperar 26,7 hs. para
suponer que se ha alcanzado el estado estacionario, lo que deberá ser
corroborado experimentalmente midiendo las concentraciones de X, S, P hasta
observar que no varían con el tiempo. Usualmente con 4.tR es suficiente.
PARTE EXPERIMENTAL
Microorganismo y condiciones de cultivo
Los géneros Rhizobium, Shinorhizobium y Bradyrhizobium en relación
simbiótica con plantas leguminosas infectan las raíces de las mismas y
estimulan la producción de nódulos, dentro de los cuales las bacterias fijan
Nitrógeno (bacterias diazótrofas) y la planta responde entregando a la bacteria
nutrientes orgánicos que produce durante la fotosíntesis. La cepa 2011 de
Sinorhizobium meliloti, que es capáz de colonizar y nodular plantas de alfalfa es
la que utilizaremos para realizar el experimento de cultivo continuo bajo dos
condiciones de limitación: - limitado en Carbono, donde esperamos obtener los
mayores rendimientos en biomasa y – limitado en Nitrógeno, donde esperamos
obtener rendimientos menores ya que estamos frente a un exceso de fuente
de Carbono y hay formación de producto extracelular, el exopolisacárido.
Las condiciones bajo las cuales se realizarán los cultivos serán:
T=30CpH (controlado automáticamente)=6.8D (velocidad de dilución)= 0.10 h-1
La velocidad de agitación se mantendrá a un valor tal que asegure alrededor
de 25% de oxígeno disuelto en el cultivo (esta condición es sólo para
asegurarnos que el cultivo no se limite en Oxígeno). La concentración de O2
disuelto se medirá continuamente empleando un electrodo polarográfico
Ingold (Wilmington, MA, USA).
Los pasos a seguir son:
Preparar los reactores. Chequear todo el sistema de mangueras para
agregado de medio de cultivo, de álcali, de antiespumante, entrada y salida de
gases, toma de muestra, inoculación, etc..
Preparar el medio de cultivo y esterilizarlo dentro del biorreactor (30
minutos, 121 oC) junto con los electrodos de pH y oxígeno disuelto.
Conjuntamente esterilizar los reservorios con medio fresco que se emplearán
para alimentar el reactor.
Realizar todas las conexiones necesarias (eléctricas y de tubería), llevar los
reactores a temperatura y calibrar el electrodo de oxígeno disuelto.
Inocular el reactor con aproximadamente 50 ml de un cultivo de
Sinorhizobium meliloti crecido durante 12-18 h en frascos agitados en agitador
rotatorio.
Calibrar el caudal de las bombas peristálticas a un valor tal que satisfaga el
valor de D preestablecido. Nota: los cultivos deben conducirse al mismo valor
de D para su posterior comparación.
Los cultivos serán chequeados periódicamente (una o dos veces por día). Se
determinará: el contenido de O2 y CO2 en los gases de salida del reactor, que el
valor de pH y de O2 disuelto sean los requeridos, los caudales de aire y medio
fresco que están ingresando al reactor y el consumo de álcali. Se tomarán
muestras (alrededor de 30 ml) a las que se les determinará: densidad óptica
(650 nm), peso seco por duplicado y se conservarán congeladas muestras de
los sobrenadantes de los cultivos para luego determinar en los mismos la
concentración residual de fuente de carbono y de nitrógeno. También se
deberán tomar muestras de los reservorios para determinar la concentración
real de glucosa utilizada en la alimentación de los reactores.
Estas determinaciones se realizarán hasta obtener condiciones de estado
estacionario en los parámetros medidos y calculados.
Durante las dos semanas de curso se llevarán a cabo cultivos bajo 2
condiciones de limitación diferentes:
1er. semana: Cultivo limitado en C (glucosa)
2da. semana: Cultivo limitado en N (amonio)
Medios de cultivo
El medio mínimo definido que se utilizará para realizar el C. C. será el medio
de Evans, que limitado en C tiene la siguiente composición:
glucosa 5.0 gKCl 0.3725 gNaH2PO4.2H2O 0.78 g
(NH4)Cl 2.675 gNa2SO4 0.142 gácido cítrico 0.21 gMgCl2.2H2O 0.127 gOligoelementos 5 mlH2O csp 1000 ml
El medio que se empleará para la condición de limitación por Nitrógeno
tiene los mimos nutrientes pero la concentración de glucosa se triplicó (15 g.l -1)
y la de (NH4)Cl se bajó a 0.8 g.l-1 .
CULTIVO DISCONTINUO ALIMENTADO (BATCH ALIMENTADO)
Otro modo de operar un biorreactor es empleando la técnica de batch
alimentado (BA) o fed batch. Esta técnica se define como un cultivo en batch
donde se alimenta continuamente medio nutritivo fresco o alguno de sus
componentes. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento,
esta técnica permite controlar la velocidad de crecimiento () del
microorganismo.
El BA es particularmente útil en procesos en los que el crecimiento
celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del
sustrato limitante, es decir cuando el rendimiento celular o la poductividad de
la biomasa o del metabolito buscado se ven afectados. Así, este método se
emplea cuando se quieren evitar fenómenos de inhibición por sustrato y se
requiere alcanzar una alta concentración de biomasa.
ESQUEMA
Donde F(t): caudal de alimentación
Sr(t):concentración de sustrato de la alimentación
Vf: volumen final de trabajo
Vo: volumen al inicio de la alimentación
Xo: concentración de biomasa al inicio de la alimentación
So: concentración de sustrato limitante al inicio de la alimentación
El cultivo BA se inicia a partir de un cultivo en batch, por lo que Vo, Xo y So
son las condiciones finales de dicho batch.
Es posible elegir distintas condiciones de alimentación, ya sea mediante
el empleo de caudales variables (F = F(t)), o bien mediante la variación de la
concentración de sustrato limitante (Sr=Sr(t)). En el caso del Trabajo Práctico se
utilizará el sistema más simple, es decir F=cte y Sr=cte.
PRODUCCION DE BIOMASA: ECUACIONES Y DISEÑO
El cultivo puede describirse matemáticamente. La resolución de las
ecuaciones así obtenidas permitirá calcular la evolución de la biomasa durante
el cultivo, la velocidad específica de crecimiento, y la productividad. Asimismo
se podrán determinar parámetros de diseño, tales como F y Sr.
Para estudiar la evolución de X durante el cultivo se deben plantear las
ecuaciones de balance de materia.
Sustrato
acumulación = suministro - consumo
(1)
En este caso el volumen no es constante, como ocurre en cultivos en
batch o en continuo. Por lo tanto la expresión (1) quedará:
(2)
La condición final del batch es S = 0, pues, como se intenta controlar µ, S
no puede ser saturante (recordar a Monod).
Si S~ 0, dS/dt = 0, con lo que (2) se transforma en
(3) F . SR -
de aquí, y recordando que rx = µ . X
(4) F . SR =
esta ecuación indica que la velocidad de producción de biomasa se acomoda a
la velocidad de suministro de sustrato, es decir que rx puede controlarse
“externamente”, modificando F y/o Sr.
La ecuación (3) es en realidad un límite superior ya que dados µ, X y V,
cualquier par de valores F, Sr que satisfagan la condición
(4) F . SR
harán que la velocidad de crecimiento esté limitada por la velocidad de
alimentación. Esta ecuación (3) será muy útil en el momento de diseñar la
alimentación.
Biomasa
La velocidad de acumulación de biomasa será:
(5)
o, reordenando,
(6) rx =
Si se reemplaza en (4) se obtiene
(7) F . SR =
que indica que la velocidad de acumulación de biomasa depende de la
velocidad de alimentación de sustrato.
Integrando (7), se llega a
(8) X V = xo Vo + Yx/s F SR t
Uno de los objetivos planteados es conocer cómo varía la concentración
de biomasa con el tiempo. En cultivo en batch, al ser V = cte, X.V es
proporcional a X. En BA V no es constante, sino que varía con el tiempo (F =
dV/dt). Integrando se tiene
(9) V = Vo + F t
reemplazando en (8) y despejando X, se tendrá
(10) X =
expresión que describe la variación de X con t a lo largo del cultivo alimentado.
Puede darse el caso en que el aumento de V sea tal que haya un efecto de
dilución que provoque la disminución de la concentración de biomasa. Así,
puede ocurrir que la concentración final alcanzada sea menor que la inicial,
pero no así la cantidad total X.V.
DISEÑO
Se desea obtener una concentración final de biomasa Xf, con un volumen
final Vf. El volumen total adicionado durante el BA será:
(11) Vf - Vo = F.t
donde tf es el tiempo total de alimentación. Cuando t = t f, la ecuación (8) se
transforma en
(12) XfVf = XoVo + SR F.tf
Reemplazando (11) en (12), y despejando Sr queda
(13) SR =
La ecuación (13) permite calcular la concentración de sustrato limitante
en el reservorio. Resta calcular F, cuyo valor debe ser tal que satisfaga la
ecuación (4). En particular, para t = 0 (inicio de la alimentación )será:
(14) F SR
El valor de tf se calcula a partir de la ecuación (11).
NOTA: o puede ser igual a max si la alimentación se inicia el final de la fase
exponencial del batch.
Debe destacarse que si F.Sr fuera mayor que la velocidad de consumo de
sustrato, habría una acumulación de sustrato en el medio, y el crecimiento no
sería limitado.
Es interesante conocer la variación de durante el batch alimentado.
Recordando el balance de materia para la biomasa
xV =
Por lo tanto se obtiene
(15) =
Si se reemplaza (8) en (15), será
(16) =
expresión que indica que disminuye con t a lo largo del batch alimentado.
Puede representarse un cultivo en batch alimentado operando en las
condiciones halladas.
Al obtener valores de Sr y F, se ha DISEÑADO una alimentación para el
cultivo en batch alimentado. El caso descrito hasta aquí tiene en cuenta que
tanto F como Sr sean constantes. Es claro que en caso de ser F = F(t) y/o S r =
Sr(t), dicha funcionalidad habrá de ser tenida en cuenta para resolver las
ecuaciones planteadas.