Estructura Antigénica de la larva L3 de Contracaecum ...biblio.uabcs.mx/tesis/TE 2620.pdftodas las niñas y no tan niñas del Laboratorio de Parasitología por estar ahí y por aguantarme

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

ÁREA INTERDICIPLINARIA DE CIENCIAS DEL MAR

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MARINA

TESIS

ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA ANTIGÉNICA DE LA LARVA L3 DE

Contracaecum multipapillatum (sensu lato)

QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TÍTULO DE

BIÓLOGO MARINO

PRESENTA:

MARCO ANTONIO SALAZAR BERMÚDEZ

DIRECTORA:

M en C. MARÍA DEL CARMEN GÓMEZ DEL PRADO ROSAS

LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, MARZO 2011

http://www.ejournal.unam.mx/autor1.html?a=141

A mis padres

María Inés y Leonardo

Agradecimientos

Antes que a nadie, a mi Maestra, María del Carmen Gómez del Prado Rosas por su invaluable apoyo a nivel profesional y personal. Por la dedicación, paciencia y congruencia con la que realiza su labor, lo cual me motiva a seguir su ejemplo y por lo que siempre estaré en deuda. Mi primer y única “mamá académica”.

Al Dr. Felipe de Jesús Ascencio Valle, por su atención y apoyo, indispensables para que este trabajo llegara a su culminación y por sus comentarios para mejorarlo. Al Dr. Robin M. Overstreet por su amable ayuda para la identificación taxonómica

Al Dr. Carlos Armando Sánchez Ortiz por su disposición y valiosos comentarios. A todos los que intervinieron directa e indirectamente en la realización de este trabajo en la UABCS, CIBNOR, y el Centro de Investigación Biomédica de Oriente, CIBIOR.

A Ma. de Jesús “Chula” Romero Geraldo por toda su ayuda y a los que fueron mis compañeros durante mi estancia en el laboratorio de Patogénesis Microbiana del CIBNOR, al Dr. Amaury Cordero Tapia y el resto del personal del bioterio.

A las personas cuya amistad me ayudó y sigue ayudando a continuar durante mis ya muchos y antisociales años en La Paz, a Paola “Prieta”, Sr. Horacio, Paty, Isa y a todas las niñas y no tan niñas del Laboratorio de Parasitología por estar ahí y por aguantarme a mí y a mi música.

A los que, estando lejos, llevo a todos lados conmigo, Eliana, Elena, Pepe, Lalo por su amistad y su apoyo.

A toda mi familia “Salazar” y “Bermúdez” y a mis abuelos Leonor y Antonio por su cariño y apoyo.

A Roberto “primature” (R-Bear), ¿qué puedo decir que no sepas ya? Por ser un amigo y un hermano indispensable para mí, todo este tiempo; por crecer y compartir lo bueno y lo malo conmigo (sobre todo lo bueno: apoyo, buena música y jocosidad). No lo hubiera logrado sin vos.

A mi mujer Ana Luisa, por ser mi motivo y voluntad día con día, para intentar ser mejor; por permitirme ser parte de tu vida y ser la mejor parte de la mía. Gracias por todos los años de felicidad que me has dado.

A mi familia; mi hermano Leonardo, mi primer ejemplo a seguir. A mis padres Leonardo y Ma. Inés por ser mi mayor ejemplo de amor, integridad y perseverancia; porque no sería lo que soy de no ser por ustedes.

Estudio de la estructura antigénica de Contracaecum multipapillatum s. l.

I

ÍNDICE

Lista de Figuras II

Lista de Tablas III

Resumen IV

Introducción 1

Antecedentes 10

Justificación 12

Hipótesis 13

Objetivo general 13

Objetivos particulares 13

Área de estudio 14

Material y Métodos 16

Recolecta de material biológico 16

Identificación de las larvas 17

Obtención del extracto crudo de las larvas 17

Obtención de suero hiperinmune 17

Análisis electroforético de los antígenos de larvas

de Contracaecum sp. 18

Inmunoblotting de los antígenos de larvas

de Contracaecum sp. 20

Resultados 22

Identificación taxonómica de hospederos y nemátodo 22

Análisis electroforético de los antígenos de larvas 23

Obtención de suero hiperinmune

e inmunoreconocimiento de los antígenos 26


II

Discusión 29

Identificación taxonómica de los nemátodos 29

Parasitismo por Contracaecum 30

Estructura antigénica e inmunogenicidad

de Contracaecum multipapillatum s. l. 36

Futuro de la línea de investigación 41

Conclusiones 42

Recomendaciones 43

Trabajos Futuros 45

Literatura Citada 46

LISTA DE FIGURAS

1 . Mugil cephalus 2

2 . Ciclo de vida probable de C. multipapillatum s. l. 7

3 . Morfología de la larva L3 de C. multipapillatum s. l. 9

4 . Bahía de La Paz 15

5 . Metodología 21

6 . Perfiles proteicos del extracto crudo

de C. multipapillatum s. l. 24

7 . Antígenos de C. multipapillatum s. l. reconocidos

por anticuerpos en suero de conejo 27


III

LISTA DE TABLAS

1 . Estándar de pesos moleculares 19

2 . Prevalencia e Intensidad parasitaria de C. multipapillatum s. l. 22

3 . Pesos moleculares de los

antígenos de C. multipapillatum s. l. 25

4 . Antígenos de C. multipapillatum s. l. reconocidos

por suero de conejo 28


IV

RESUMEN

El nemátodo Contracaecum multipapillatum (sensu lato) pertenece a la familia

Anisakidae, cuyas larvas son un problema importante para la industria pesquera en

diferentes países, ya que son capaces de infestar el tracto digestivo del humano tras

su ingestión accidental al consumir carne de pescado cruda o poco cocinada,

produciendo la enfermedad conocida como Anisakidosis. Los nemátodos no llegan a

hacerse adultos en el humano, pero sus antígenos pueden ser reconocidos por el

sistema inmune, provocando reacciones alérgicas con niveles elevados de

Inmunoglobulinas específicas. Debido a la alta prevalencia e intensidad parasitaria

de C. multipapillatum s. l. observada en Mugil cephalus, un pez de importancia

comercial en La Paz, Baja California Sur, se realizó el estudio de la composición e

inmunogenicidad de las proteínas somáticas de larvas en tercer estadio obtenidas de

M. cephalus. Se preparó un extracto crudo de las larvas el cual se analizó por medio

de electroforesis en geles de poliacrilamida, obteniendo un perfil de 54 proteínas con

pesos moleculares entre 1.2 y 90.9 kilodaltones (kDa). Con el extracto se inmunizó a

conejos de Nueva Zelandia para obtener suero hiperinmune con Inmunoglobulinas

anti - C. multipapillatum s. l. y se analizó con la técnica de inmunoblotting; el suero

presentó IgG’s capaces de reconocer 33 de los antígenos presentes en el suero, 19

(61%) de ellos (90.94 - 8.55 kDa) reconocidos por IgG’s producidas por la presencia

de los antígenos de C. multipapillatum s. l. y 14 reconocidos por IgG’s presentes

también en el suero del conejo control. Es necesario alertar a las autoridades y a la

población en general, para que adopten medidas precautorias, con el fin de disminuir

el posible riesgo que representa C. multipapillatum s. l. a la salud pública. A partir de

la información obtenida es posible realizar un estudio que determine si existen casos

de infección o reacciones alérgicas producidas por esta especie.


1

INTRODUCCIÓN

Los peces, tanto en estado silvestre como en condiciones de laboratorio,

están sujetos a ser parasitados por organismos pertenecientes a diversos grupos

taxonómicos. Las lesiones causadas por los parásitos, sobre todo en peces

silvestres, por lo general pasan inadvertidas, a menos que el daño sea tan obvio

que demerite su calidad comercial (Roberts, 1981).

Los nemátodos frecuentemente parasitan peces, en ocasiones, como parte

de ciclos de vida complejos que incluyen varios estadios larvarios. Se estima que

cerca de 40,000 especies parasitan vertebrados; se han descrito cerca de

17,000, comprendidas en 256 familias y 2,271 géneros (Anderson, 2000).

Los peces del género Mugil (Lisas) han sido estudiados en Baja California

Sur (B.C.S.) desde 1995 en relación con su helmintofauna, registrando elevada

prevalencia y carga parasitaria por larvas L3 del nemátodo Contracaecum sp.

(Gómez del Prado et al., 2008); estos parásitos parecen acumularse durante el

tiempo de vida de los peces. En el estado de Baja California se ha observado

que la intensidad parasitaria de Contracaecum spp. y otros parásitos

combinados, aumenta respecto al tamaño de Mugil cephalus, (Valles-Ríos et al.

2000).

Las especies de “lisas” son muy abundantes y valiosas en las costas de

México. En el Golfo de California en el periodo de 2001-2005 constituyeron la

segunda mayor captura (en toneladas y ganancias promedio) de la flota ribereña.

En la Bahía de La Paz, B.C.S., es posible encontrar Mugil cephalus (Fig. 1) y M.

curema a lo largo del año. A pesar de que no se encuentran entre las especies

que aportan mayor porcentaje de captura en el área, representan un recurso local


2

importante debido a que se consume a nivel popular por su bajo precio. (Pérez y

Ruiz-Luna, 1985; Plomozo-Lugo, 2011).

Figura 1. Mugil cephalus “Lisa cabezona” de la Bahía de La Paz, B. C. S., México.

Las larvas de nemátodos de la familia Anisakidae en peces, son un

problema importante para las industrias pesqueras de varios lugares de Europa y

Estados unidos de América, siendo Anisakis, Contracaecum, Hysterothylacium

y Pseudoterranova los géneros más frecuentes.

La presencia de los nemátodos anisákidos adultos está asociada a

patologías ligeras en su hospedero definitivo (aves y mamíferos piscívoros). De

acuerdo con Stoskopf, 1993 y Anderson, 2000, las larvas de Anisakis y

Contracaecum pueden causar considerable daño a los órganos viscerales y otros

tejidos de su hospedero intermediario o paraténico (generalmente peces), debido

a la conducta migratoria que tienen para su establecimiento en la serosa de

varios órganos del aparato digestivo. El género Contracaecum en particular,

puede provocar serios daños en hígado y tejidos mesentéricos de sus

hospederos, tales como inflamación extensiva, fibrosis y adhesión visceral pero

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3

sin impacto aparente en la condición corporal. Así ocurre en las lisas en la Bahía

de La Paz, las cuales no presentan alteraciones externas visibles a pesar de las

concentraciones relativamente altas de parásitos en el cuerpo, por lo que su

presencia no afecta significativamente su comercialización, lo que constituye un

peligro potencial de presentar una reacción a los alérgenos en los alimentos que

estuvieron en contacto con las larvas o incluso, contraer la Anisakidosis.

(Mbahinzireki, 1980; Nadler et al., 2005; Gómez del Prado et al., 2008).

La anisakidosis en humanos, es una infestación parasitaria del tracto

digestivo por nemátodos de la familia Anisakidae, resultado de la ingestión

accidental de su tercer estadio larvario (L3) en carne de pescado cruda o poco

cocinada, siendo Contracaecum, Pseudoterranova, Anisakis los géneros más

frecuentes. Se reserva el término anisakiasis a la patología producida

específicamente por el género Anisakis y ambos términos son utilizados en la

literatura (Gómez Sáenz et al., 1999; Noh et al., 2003). La anisakidosis fue

endémica de Japón, pero debido al consumo mundial de pescado crudo, puede

convertirse en una enfermedad cosmopolita, a pesar de que se conoce que las

larvas se destruyen al cocer el pescado a una temperatura de 60°C o por

congelación a -20°C (Noh et al., 2003).

Los nemátodos no llegan a hacerse adultos en el humano, pero su

presencia expone al hospedero a antígenos que pueden ser reconocidos por el

sistema inmune, estos antígenos son usualmente proteínas y glicoproteínas

localizadas en la superficie o en los productos de secreción. La inmunidad contra

las infecciones por nemátodos, al igual que muchas otras helmintiasis, es en su

mayor parte humoral (Perec y Okulewicz, 2006)


4

Tras la ingestión de la larva, ésta penetra activamente la pared del

estómago o del intestino delgado, causando síntomas gastrointestinales agudos

que generalmente se confunden con apendicitis o úlcera gástrica, dichos

síntomas pueden presentarse desde una hora hasta dos semanas después de

consumir el pescado contaminado (Kim et al., 1991; Noh et al., 2003). La

anisakidosis provoca episodios que pueden variar desde una ligera urticaria hasta

anafilaxia recidivante; pueden dar origen a granulomas eosinófilos en la pared

gastrointestinal, además de reacciones alérgicas de tipo 1, con niveles elevados

de Inmunoglobulina tipo E específica (IgE), diagnosticadas generalmente por

serología (Roberts, 1981; Gómez Sáenz et al., 1999; Anderson, 2000; Lorenzo et

al., 2000; Cuellar et al., 2001; Rodero et al., 2001). En algunos pocos casos, se

han encontrado larvas L3 de Anisakis simplex y de Contracaecum sp. en alvéolos

o bronquíolos produciendo hemorragia y enfisema que se ha llegado a confundir

con asma (Matsuoka et al., 1994). Desde hace varios años, en España, ha sido

posible diagnosticar varios casos de Anisakidosis gástrica e intestinal con

endoscopía y tratándose con cirugía (Sugimachi et al., 1985; Isishukura, 1989;

Sakamari, 1990)

Se ha observado que los nemátodos del orden Ascaridida, que incluye a

los anisákidos, son capaces de infectar mamíferos, aun cuando su hospedero

definitivo no sea un organismo de sangre caliente; Contracaecum multipapillatum

parasita el proventrículo de aves piscívoras y al igual que la mayoría de los

miembros del género, no afecta naturalmente a mamíferos terrestres, aunque

varias especies de Contracaecum se presentan en mamíferos marinos (Vidal-

Martínez et al., 1994). Se ha demostrado que C. multipapillatum puede madurar


5

en un mamífero terrestre de manera experimental, señalando el peligro potencial

a la salud pública. Aun cuando los juveniles de esta especie se encuentran

generalmente encapsulados en hígado, riñones y mesenterio de los peces

hospederos, también pueden encontrarse en cualquier otro lugar e incluso

permanecer dentro de ellos después de eviscerar, por lo que podrían ser

ingeridos posteriormente por el humano; si bien las larvas de Contracaecum spp.

no son ingeridas tan frecuentemente como las que se presentan típicamente en

la carne de los peces (ej. Anisakis spp.), esto ha provocado que sean menos

estudiados (Fagerholm, 1988; Vidal-Martínez et al., 1994).

Contracaecum multipapillatum es un parásito de pelícanos, cormoranes y

garzas en América, aunque los registros de juveniles indican que la especie

pudiera extenderse a Asia y África (Vidal-Martínez et al., 1994). El ciclo de vida

del género Contracaecum ocurre en el agua e involucra a invertebrados acuáticos

y peces como hospederos intermediarios o paraténicos (Anderson, 2000).

Las hembras adultas depositan los huevos en el tracto digestivo para ser

expulsados junto con sus excretas. En el agua, los huevos embrionados

contienen el primer estadio larvario, éste muda poco después, dando lugar al

segundo estadio; esta larva eclosiona en el agua y es ingerida por un

invertebrado crustáceo, generalmente copépodos que actúan como primer

hospedero intermediario, la larva migra a su hemocele en donde aumenta

ligeramente su tamaño y presenta un desarrollo parcial de los órganos.

Posteriormente los peces que se alimentan de copépodos, actúan como

segundos hospederos intermediarios o paraténicos, donde alcanzan el tercer

estadio (L3), las larvas crecen notoriamente, atraviesan las paredes del intestino


6

hacia la cavidad corporal y se encapsulan en el mesenterio y diferentes órganos

(hígado, gónadas, riñón); se ha demostrado que la transferencia de las larvas de

un pez a otro es posible mediante depredación. Finalmente, el pez infectado es

ingerido por el ave hospedera, las larvas son liberadas en el tracto digestivo y se

adhieren a la pared del estómago donde se alimentan de lo ingerido por el ave. El

desarrollo posterior de las larvas y paso a la adultez probablemente sucede ya

dentro del proventrículo del ave (Huizinga, 1967; Anderson, 2000) (Fig. 2).


7

Figura 2. Ciclo de vida probable de Contracaecum multipapillatum (sensu lato).

http://masb.carbonmade.com/


8

Las larvas L3 de Contracaecum miden entre 4 y 16 mm, con un extremo

posterior cónico y cola postanal con espina terminal (mucrón). Presentan una

cutícula gruesa con estriaciones transversales. En la parte anterior se encuentran

tres labios poco desarrollados (dos ventrolaterales y uno dorsal) y un diente

cuticular ligeramente romo cerca de los labios ventrolaterales y el poro excretor

inmediatamente posterior al diente. Presentan una faringe muscular y un

ventrículo glandular pequeño y esférico del que deriva un apéndice ventricular

dirigido hacia el extremo posterior. También presenta un ciego intestinal más

grande que el apéndice ventricular, dirigido hacía el extremo anterior (Berland,

1989) (Fig. 3).

El género Contracaecum Railliet y Henry, 1912 incluye aproximadamente

100 especies con una distribución mundial, la cual ocurre de manera natural

debido, probablemente, a las aves migratorias y la baja especificidad para elegir

hospederos intermediarios y definitivos (Deardorff y Overstreet, 1980; Mhaisen et

al., 1988; Anderson, 2000). Es muy complicada la identificación de anisakidos

hasta nivel especie basada en las características morfológicas de adultos

(muchas relevantes solo en machos), y es más difícil aun para las fases larvarias;

además algunos de los caracteres morfológicos que se han usado para

diferenciar especies carecen de valor interespecífico, lo que ha llevado, en parte,

a que algunas morfoespecies de éste y otros géneros de la familia Anisakidae

formen, en realidad, parte de complejos de varias especies diferenciadas

genéticamente, en ocasiones, con distribución geográfica y hospederos distintos

(Labriola y Suriano, 1996; Nadler et al., 2005; Mattiucci y Nascetti, 2008; Shamsi

et al., 2008; Shamsi et al., 2009).


9

Figura 3. Morfología de la larva L3 de Contracaecum multipapillatum (sensu lato) en Mugil

cephalus. Ambos ciegos visibles (flechas). Extremo anterior con diente cuticular. Extremo

posterior con espina caudal (mucrón)


10

Dentro de los complejos multiespecíficos de Contracaecum se ha

observado un nivel bajo de variación en las secuencias genéticas, por lo que es

necesario una caracterización genética que demuestre aislamiento reproductivo

entre especies que en ocasiones son simpátricas en sus hospederos definitivos

(Shamsi et al., 2009; Mattiucci et al., 2010).

Existen varios estudios de caracterización genética de las especies de

Contracaecum parásitas de aves piscívoras, en los que se utilizaron aloenzimas

y las secuencias como las del primer y segundo espaciador transcrito (ITS1,

ITS2) y las subunidades 18s y 28s del ADN ribosomal; así como el citocromo B

(Cyt-B) y citocromo oxidasa 1 y 2 (COx1, COx2) del ADN mitocondrial.

Dentro del complejo multiespecífico de C. multipapillatum propuesto por

Mattiucchi et al. (2010) se encuentran 2 especies nominales nuevas identificadas

mediante COx2: C. gibsoni y C. overstreeti en Pelecanus crispus de Grecia;

antes denominadas C. multipapillatum sp. “A” y C. multipapillatum sp. “B” por

Nascetti et al. (1990). El complejo además incluye a C. multipapillatum sp. “C” de

P. occidentalis en Colombia y C. multipapillatum sp. “D” encontrada en P.

conspicillatus en Australia y caracterizadas utilizando los ITS1 e ITS2 (Shamsi et

al., 2008; Mattiucci et al., 2006 y 2010).

ANTECEDENTES

Los casos de infección por larvas L3 de anisákidos mencionados

anteriormente, han despertado el interés por continuar investigando otros

aspectos relacionados con su sintomatología, lesiones, diagnóstico y prevención

(Kato et al., 1992; Matzuoka, 1994; Angot y Brasseur, 1995; Bouree et al., 1997;


11

Noelle, 1998; Del Pozo et al., 1999; López-Penas et al., 2000; Audicana et al.,

2002).

Moreno-Ancillo, 1997; Moreno et al., 2000 y Pérez-Pérez et al., 2000

realizaron estudios sobre reacciones alérgicas y caracterización de los alérgenos

de las larvas de anisákidos. Por su parte, Gutiérrez-Ramos et al., 2000

identificaron los anticuerpos anti-Anisakis y posteriormente, Rodero et al., 2001

lograron la purificación de antígenos de Anisakis.

Por otro lado, los estudios relacionados con aspectos inmunológicos de

Contracaecum son muy escasos, Coscia y Oreste (1998) identificaron

anticuerpos específicos para proteínas de Contracaecum en diferentes

teleósteos. En México son escasos los estudios que aborden el tema de la

Anisakidosis y no existen casos reportados de esta enfermedad por ninguno de

los géneros de la familia.

En varios estados de México se ha encontrado al género Contracaecum

parasitando gran variedad de hospederos, incluyendo diversas especies de

peces (Juárez, 1985 y 1986; Juárez-Arroyo y Salgado-Maldonado, 1989; Pérez-

Ponce de León et al., 1992; Mendoza, 1994; Flores, 1995; Meléndez y Rosas,

1995; Castillo, 1996; Mendoza et al., 1996; Pérez-Ponce de León et al., 1996;

Castillo-Sánchez et al., 1998; Salgado-Maldonado et al., 2001); en aves

(Caballero, 1935; Caballero y Peregrina,1938; Bravo, 1939; Alencaster, 1948;

Caballero, 1948; Caballero, 1951; Caballero-Deloya, 1960; Amaya, 1990;

Ramos, 1994) y mamíferos (Caballero y Peregrina, 1938; Vidal-Martínez et al.,

1994)


12

En el país, las especies Mugil curema y M. cephalus han sido objeto de

estudio en diversos aspectos: su parasitismo (Salgado-Maldonado y Barquín-

Álvarez, 1978; Juárez-Arroyo y Salgado-Maldonado, 1989; Valles-Ríos et al.,

2000), abundancia y pesquerías (Stuardo y Martínez, 1975; Warbuton, 1979;

Rivas, 1985; Rodríguez-Romero et al., 1994; Plomozo-Lugo, 2010), crecimiento y

sobrevivencia (Muhlia-Melo y Muhlia-Almazán, 1995) y hábitos alimenticios

(Sánchez-Rueda, 2002).

Debido a la amplia distribución que presentan las lisas del género Mugil,

también se han abordado los aspectos antes mencionados en otro lugares como

Egipto (Moravec y Libosvarsky, 1975), Portugal (Varela et al., 1981), Francia

(Hubert, 1989), Italia (De Dominis, 1993), China (Lu Junyi et al., 2001) y Brasil

(Ranzani-Paiva y Tavares-Díaz, 2002).

JUSTIFICACIÓN

Aun cuando los registros de Anisakidosis causada por Contracaecum son

escasos, surge el interés por saber si en la población de La Paz, B.C.S. que

consume pescado que ha sido infectado por el nemátodo, se presentan algunos

de los síntomas identificados y relacionados con los de Anisakis, causados en

parte por una reacción alérgica hacia los antígenos del nemátodo. El presente

trabajo presenta información acerca de la composición antigénica de la larva L3

de Contracaecum multipapillatum sensu lato y evalúa su capacidad de inducir

una respuesta inmune específica (inmunogenicidad), información relevante por 1)

los daños producidos por las especies que conforman a la familia Anisakidae en

el hombre (Anisakidosis); 2) la incidencia de Contracaecum en las lisas, siendo


13

un pez de consumo humano en la localidad; y 3) la posible presencia de

anticuerpos contra un variedad de antígenos que pueden ser identificados por

métodos inmunoquímicos con un extracto somatico total, obtenido de las larvas

L3 de esta especie. Cabe mencionar que éste es el primero de varios estudios

sobre la estructura e inmunogenicidad de los antígenos de la larva L3 de

Contracaecum sp. que ayudarán a establecer el nivel de riesgo a la salud pública

que representa este parásito en productos de consumo humano en la comunidad

de La Paz, B.C.S.

HIPÓTESIS

La larva L3 de Contracaecum sp. en M. cephalus, presenta antígenos que

pueden ser identificables por técnicas inmunoquímicas.

OBJETIVO GENERAL

Estudiar la estructura antigénica de la larva (L3) de Contracacecum sp.

presente en las lisas Mugil cephalus de la Bahía de La Paz.

Objetivos particulares

a) Identificar a nivel especie las larvas (L3) de Contracacecum sp.

b) Obtener el perfil antigénico de la larva (L3) de Contracacecum sp. (por

electroforesis en geles de poliacrilamida)

c) Determinar la inmunogenicidad de los diferentes antígenos de la larva

(L3) de Contracaecum sp. (mediante la inmunización de conejos Nueva Zelandia

bajo condiciones controladas).


14

d) Estandarización de la técnica de ELISA para la cuantificación de

anticuerpos contra L3 en conejos inmunizados.

e) Identificar los anticuerpos que reconocen antígenos de Contracacecum

sp mediante electroforesis en geles de poliacrilamida e inmunoblotting.

ÁREA DE ESTUDIO

La Bahía de La Paz se localiza en la costa occidental del Golfo de

California entre los 24° 06´y 24° 47´ latitud norte y 110° 18´ y 110° 74´ longitud

oeste (Fig. 4). Tiene una extensión de 2,635 km2, una profundidad máxima de

400m y presenta fondos de arena y fragmentos de carbonato de calcio

(Contreras, 1985; Rueda, 1995; Cruz-Orozco et al., 1996).

La bahía tiene una temperatura mínima superficial de 20° y una máxima de

31°C (Espinoza y Rodríguez, 1987). Cuenta con una precipitación media anual

menor a 200mm, siendo septiembre el mes más lluvioso (>100mm) (Robles Gil-

Mestre, 1998). Está separada del Golfo de California por una península estrecha

y el complejo insular Espíritu Santo-La Partida y presenta una ictiofauna diversa

debido a su gran extensión, profundidad y heterogeneidad ambiental; con un

número total de 522 especies nominales conocidas, siendo el Guachinango

(Lutjanus peru) es la especie más importante en cuanto a captura total, con un

promedio de 760.84 toneladas anuales (Balart et al., 1995; Obeso-Nieblas et al.,

2008; Plomozo-Lugo, 2010).


15

Figura 4. Área de Estudio. Bahía de La Paz, B. C. S., México.


16

MATERIAL Y MÉTODOS

Recolecta de material biológico

Hospederos: Se compraron 40 lisas Mugil cephalus de la Bahía de La Paz,

directamente de los pescadores de la marina de la ciudad de La Paz, el mismo

día de su captura y sin eviscerar. Su identificación taxonómica se realizó

mediante el uso de las claves en la Guía FAO para la Identificación de Especies

para los Fines de la Pesca / Pacífico centro-oriental (Fischer et al., 1995).

Nemátodos: Los peces se disecaron en el Laboratorio de Parasitología de

la Universidad Autónoma de Baja California Sur (UABCS) y se realizó una

búsqueda de parásitos por órgano, hasta recolectar 110 larvas de nemátodos de

Contracacecum sp.

Los parámetros ecológicos de prevalencia e intensidad media de infección

por hospedero y por órgano, se obtuvieron de acuerdo al criterio establecido por

Bush et al. (1997).

La prevalencia parasitaria se define como el porcentaje de la población de

hospederos parasitados, respecto a la población de hospederos examinados y se

calcula con la formula:

No. de Hospederos infectados Prevalencia = x 100

No. de Hospederos examinados

La intensidad parasitaria es la cantidad de parásitos encontrados en cada

hospedero revisado y se calcula con la fórmula:

No. de larvas

Intensidad = . No. de Hospederos infectados


17

Animales de laboratorio: Se adquirieron seis conejos de Nueva Zelandia de

3Kg de peso y se les administró un tratamiento para desparasitarlos,

posteriormente se sometieron a un periodo de cuarentena y aclimatación en el

bioterio del Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR).

Identificación de las larvas

Se preservaron 10 de las larvas L3 en etanol 95% y se enviaron al Dr.

Robin M. Overstreet de The University of Southern Mississippi - Gulf Coast

Research Laboratory, para realizar la secuenciación de ADN e identificación

taxonómica de las larvas, comparando las secuencias obtenidas con secuencias

conocidas de varias especies del género Contracaecum.

Obtención del extracto crudo de larvas

Los parásitos se lavaron en solución amortiguadora salina de fosfatos

(PBS) para eliminar los restos de tejido de los hospederos, se homogeneizaron

en un homogeneizador de tejidos y se procedió a centrifugar a 6000rpm durante

30 minutos, a una temperatura de 4°C. Se determinó la concentración proteica

del extracto crudo por el método de Bradford (1976) y se almacenó en alícuotas

de 200μl que se conservaron en congelación a -20° C hasta su uso.

Obtención de suero hiperinmune

Se utilizaron cuatro conejos, uno como control y tres a los que se inmunizó

con el extracto crudo obtenido, en un volumen de 2 ml de antígeno en adyuvante

completo de Freund con una concentración final de 100 μg de antígeno por

http://www.usm.edu/gcrl/cv/overstreet.robin/cv.overstreet.robin.php


18

mililitro, por vía intramuscular cada 14 días hasta cumplir un mes. En el día 16 y

32 se sangraron a los conejos para obtener el suero hiperinmune y el suero

control. A los 37 días los conejos se sacrificaron y se obtuvieron los sueros que

se congelaron hasta su uso en la prueba de inmunoreconocimiento.

Se determinó la concentración de anticuerpos inducidos en conejos, por la

inmunización con los antígenos de Contracaecum sp. por la técnica de ELISA

(Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay) según Yang et al. (1991). En una

microplaca de plástico fueron inmovilizados 10μg (por pozo) de proteínas

somáticas de las larvas, incubándolas toda la noche a 4ºC; después de varios

lavados con PBS-Tween 0.05%, se bloqueó con Albúmina Sérica Bovina al 3%

en PBS. Posteriormente se incubaron con los sueros de los conejos inmunizados

y el conejo control durante dos horas a 37ºC, en dilución seriada y se lavaron

nuevamente con PBS-Tween. Se incubaron 90 minutos a 37ºC con IgG

enlazadas a peroxidasa anti-IgG de conejo, desarrolladas en cabra (Sigma

Inmuno Chemicals / Anti rabbit IgG -whole molecule- peroxidase conjugate).

Después de varios lavados con PBS-Tween, se reveló añadiendo el sustrato y

cromógeno (H2O2, orto-fenil-diamina en solución amortiguadora de citratos pH

5.4) y se incubó en oscuridad a 22ºC durante 30 minutos. Por último, se detuvo la

reacción con H2SO4 1M y se leyó la placa en el cromatógrafo de placas a 492nm.

Análisis electroforético de los antígenos de larvas de Contracaecum sp.

Previo a la realización del análisis, se llevó a cabo el aprendizaje y la

práctica de la técnica en el Centro de Investigación Biomédica de Oriente

(CIBIOR) del Instituto Mexicano del Seguro Social, en Metepec, Puebla.


19

En el laboratorio de Patología Microbiana del CIBNOR, en La Paz, B.C.S.,

se analizó el extracto crudo de las larvas de Contracaecum sp. por medio de

electroforesis en geles de Poliacrilamida - Dodecil sulfato de sodio (PAGE - SDS)

como describe Laemmli (1970), para ello se usó una cámara de electroforesis

Protean II (gel grande) y una Mini Protean II (gel chico).

Los geles consistieron en gel concentrador al 4% y gel separador al 20%.

Se utilizó solución amortiguadora para electrodos (Tris 25mM, glicina 192mM,

SDS 1%, pH 8.3) y solución amortiguadora para muestras (Tris-HCl 50mM pH 8.6

conteniendo SDS 2% glicerol 20%, 2-mercaptoetanol 2% y azul de bromofenol

0.02%) para disolver las muestras 1:1 (18μl-muestra / 18μl-solución

amortiguadora para muestra por pozo en geles chicos y 40μl-muestra / 40μl -

solución amortiguadora para muestra por pozo en geles grandes). Las

electroforesis se realizaron a 100 V durante 2 horas. Se corrieron marcadores de

pesos moleculares “BIO-RAD SDS-PAGE Molecular weight standards” de rango

amplio (200,000 - 6,500 kDa) y rango bajo (97,400 - 14,400 kDa) (Tabla 1) junto

con las muestras.

Tabla 1. Proteínas y sus respectivos pesos moleculares del estándar “BIO-RAD SDS-PAGE Molecular weight standards” (Cat-Num 161-0304)

Proteína Peso molecular (kDa)

Fosforilasa b 97.4

Albúmina Sérica Bovina 66.2

Ovoalbúmina 45

Anhidrasa Carbónica 31

Inhibidor de Tripsina de soya 21.5

Lisozima 14.4


20

Inmunoblotting de los antígenos de larvas de Contracaecum sp.

Previo a la realización del análisis, se llevó a cabo el aprendizaje y la

práctica de la técnica en el CIBIOR del Instituto Mexicano del Seguro Social.

Se realizó un análisis de inmunoreconocimiento mediante una electro-

transferencia de las proteínas del extracto crudo previamente separado mediante

PAGE-SDS, a membranas de polifloruro de vinilideno (Immobilon - P Millipore)

con poros de 0.4 µm utilizando para ello una cámara de transferencia semi-seca

(Bio-Rad Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell) durante 30 minutos a 20V,

utilizando una solución amortiguadora de transferencia (Tris 25mM, glicina

192mM, metanol 20%, pH 8.3). Las membranas se bloquearon con leche

descremada al 5% a 4°C durante toda la noche; posteriormente se lavaron tres

veces con solución de lavado (PBS-BSA 5% Tween20 2%).

Se separó una muestra de cada membrana para ser incubada con suero

de conejo no inmunizado (control), diluido en PBS 1:60 durante 2 horas con

agitación; el resto de las muestras se incubaron con suero de conejo anti-

Contracaecum diluido en PBS al 1:60 por 2 horas con agitación a temperatura

ambiente. Todas las muestras se lavaron tres veces más, con solución de lavado

y se incubaron por 1 hora con un anticuerpo anti-IgG de conejo acoplado a

peroxidasa desarrollado en cabra, diluido 1:1000 en PBS-Tween20 conteniendo

BSA al 1%, a temperatura ambiente. Para visualizar las bandas, se lavaron las

membranas con PBS-Tween 20 y se agregó el sustrato (PBS, H2O2 al 0.006% en

metanol conteniendo 0.03% de 4-cloro-1-naftol); finalmente se detuvo la reacción

con varios lavados de agua destilada (Fig. 5).


21

Figura 5. Diagrama de flujo de los principales pasos de la metodología realizada.

Compra

Compra

Gulf Coast Research Laboratory

Cuarentena y aclimatación

Preparación de

Análisis por

Sangrado Transferencia

a membrana

Inoculación

Inyección intramuscular

Obtención

Cálculo de Pesos moleculares

ELISA

Recolecta de Material Biológico Mugil cephalus Nemátodos

Conejos

Electroforesis en geles de poliacrilamida

SDS-PAGE Inmunización

Inmunoblotting

Suero hiperinmune

Perfil Proteico (Antígenos)

Antígenos reconocidos por IgG’s de conejo

Identificación taxonómica molecular

Extracto crudo

METODOLOGÍA


22

RESULTADOS

Se revisaron 40 lisas presentando un 100% de prevalencia parasitaria y se

obtuvieron un total de 521 nemátodos en su tercer estadio larvario (Tabla 2).

Los órganos en los que se encontraron los parásitos fueron, en orden

descendente de abundancia: el hígado, serosa del estómago-intestino, riñón,

mesenterio de la cavidad celómica (M.C.C) y la musculatura parietal (filete)

(Tabla 2).

Tabla 2. Prevalencia e intensidad parasitaria de C. multipapillatum s.l. (L3) por hospedero y en los diferentes órganos de Mugil cephalus.

No. de Larvas Prevalencia Intensidad

Hospederos 521 100% 13

Hígado 232 100% 5.8

Serosa Estómago-Intestino 171 95% 4.5

Riñón 103 80% 3.2

M.C.C. 12 17.5% 1.7

Músculo 3 5% 1.5

Identificación taxonómica de hospederos y nemátodos

Los peces recolectados fueron identificados como Mugil cephalus

(Linnaeus 1758), basándose en su coloración característica y a la presencia de:

un recubrimiento adiposo extendido sobre el iris; el número de escamas

longitudinales (38 a 42); la segunda aleta dorsal con 9 radios y la aleta anal con 3

espinas y 8 radios.


23

Las larvas de nemátodos extraídas de M. cephalus corresponden a la fase

3 (L3) del género Contracaecum. Dentro de sus características morfológicas se

observan: tres labios y un diente cuticular; un ventrículo pequeño y esférico;

apéndice ventricular dirigido hacia el extremo posterior y un ciego intestinal, más

grande que el apéndice ventricular. No fue posible identificar a nivel especifico los

especímenes obtenidos, pero el análisis molecular indica que pertenecen al

complejo multiespecífico de Contracaecum multipapillatum, taxón dentro del que

se han descrito, hasta el momento, cuatro especies. Los especímenes de este

estudio deben ser referidos como Contracaecum multipapillatum sensu lato.

Análisis electroforético de los antígenos de larvas de C. multipapillatum s. l.

El extracto crudo somático de las larvas L3 de C. multipapillatum s. l.

presentó una concentración de 80 μg/μl·prot. En el extracto crudo se identificaron

54 proteínas por el método de electroforesis SDS-PAGE (Fig. 6). Las proteínas

en el extracto se encuentran en un intervalo de pesos moleculares de 1.2417a

90.9431 kDa (Tabla 3).


24

Figura 6. Perfiles proteicos del extracto crudo de C. multipapillatum s.l. en geles de electroforesis

SDS-PAGE. A1 Marcadores de peso molecular en gel chico. A2 Antígenos de C. multipapillatum

s.l. en gel chico. B1 Marcadores de peso molecular en gel grande. B2 Antígenos de C.

multipapillatum s.l. en gel grande.


25

Tabla 3. Pesos moleculares (kDa) de los 54 antígenos presentes en el extracto crudo de C.

multipapillatum s.l. A.- antígeno. PM.- peso molecular. DE.- desviación estándar

A PM DE A PM DE A PM DE

1 90.94 ±0.24 19 70.57 ±0.10 37 45.06 ±0.15

2 89.30 ±0.12 20 69.55 ±0.20 38 43.43 ±0.13

3 87.87 ±0.24 21 67.55 ±0.19 39 41.90 ±0.24

4 87.01 ±0.26 22 66.42 ±0.11 40 40.45 ±0.21

5 85.72 ±0.15 23 64.82 ±0.15 41 37.36 ±0.32

6 84.77 ±0.14 24 62.79 ±0.25 42 35.81 ±0.32

7 82.81 ±0.14 25 61.16 ±0.11 43 33.92 ±0.24

8 81.65 ±0.11 26 58.98 ±0.38 44 32.36 ±0.21

9 80.60 ±0.16 27 57.65 ±0.20 45 29.42 ±0.21

10 79.71 ±0.20 28 55.82 ±0.24 46 28.01 ±0.24

11 78.96 ±0.15 29 53.97 ±0.27 47 23.81 ±0.28

12 78.16 ±0.11 30 52.25 ±0.21 48 21.18 ±0.26

13 77.31 ±0.16 31 51.63 ±0.08 49 16.12 ±0.19

14 76.69 ±0.17 32 50.77 ±0.12 50 14.44 ±0.25

15 75.40 ±0.14 33 49.85 ±0.14 51 10.77 ±0.16

16 74.32 ±0.15 34 48.52 ±0.18 52 8.55 ±0.63

17 72.40 ±0.13 35 47.28 ±0.21 53 3.43 ±0.24

18 71.54 ±0.10 36 46.23 ±0.14 54 1.24 ±0.09


26

Obtención de suero hiperinmune e inmunoreconocimiento de los antígenos

El suero analizado se obtuvo de tres conejos inmunizados con extracto

crudo de C. multipapillatum s.l., ya que uno de ellos falleció antes del primer

sangrado. La prueba de ELISA practicada, mostró que el suero extraído del

sangrado del día 16 después de la inmunización presentó niveles bajos (no

cuantificables) de inmunoglobulinas G (IgG) anti - Contracaecum, mientras que

los sueros obtenidos de los sangrados de los días 32 y 37 presentaron 0.6μg/μl y

0.57μg/μl respectivamente.

En el suero del conejo control existen anticuerpos tipo IgG que reconocen

14 de los 54 antígenos presentes en el extracto crudo de C. multipapillatum s.l.

(Tabla 3, columna A). El suero de los conejos inmunizados presentó anticuerpos

capaces de reconocer 33 de esos 54 antígenos (Fig. 7) por lo que estos

resultados demuestran que el sistema inmune de los conejos utilizados en este

estudio puede producir IgG’s capaces de reconocer 19 de los antígenos con

aparente especificidad hacia C. multipapillatum s.l. (pesos moleculares entre

90.94 y 8.55 kDa) (Tabla 4, columna B*)


27

Figura 7. Antígenos de C. multipapillatum s.l. reconocidos por IgG’s presentes en suero de conejo.

A. Antígenos reconocidos por suero de conejo control (14). B. Antígenos reconocidos por suero

de conejo inmunizado (33)


28

Tabla 4. Antígenos de C. multipapillatum s.l. reconocidos por suero de conejo. A. Pesos

moleculares (kDa) de los antígenos reconocidos por suero de conejo control (14). B. Pesos

moleculares (kDa) de los antígenos reconocidos por suero de conejos inmunizados (33).

A B - 90.94* - 87.87* - 87.01* - 82.81* - 81.65* - 80.60* - 79.71*

78.96 78.96 78.16 78.16

- 77.31* - 75.40* - 72.40*

71.54 71.54 - 69.55*

67.55 67.55 66.42 69.55

- 69.55* 62.79 62.79 58.98 58.98 53.97 53.97

- 52.25* - 50.77* - 49.85*

46.23 46.23 43.43 43.43 40.45 40.45 35.81 35.81

- 33.92* - 32.36*

23.81 23.81 16.12 16.12

- 10.77* - 8.55*

*Pesos moleculares de los antígenos con aparente especificidad, reconocidos solo por el suero

de los conejos inmunizados (19).


29

DISCUSIÓN

Identificación taxonómica.

En el área de la epidemiología es importante conocer con claridad qué

especies son las causantes de afecciones en el humano. Debido a que algunas

de las características diagnósticas utilizadas en la identificación morfológica de

las especies carecen de valor interespecífico, el uso de herramientas moleculares

para una correcta identificación de los parásitos ha cobrado gran importancia. Se

han descrito numerosas especies nuevas de anisákidos en las últimas dos

décadas, debido a la hallazgo de varias especies hermanas, con pozas genéticas

aisladas reproductivamente pero con morfología muy similar. La falta de

diferenciación puede deberse a que estos parásitos se ven afectados por factores

de selección muy similares, causando la conservación de las características

morfológicas, además de que muchas de estas características parecen ser

altamente homoplásicas o representan estados morfológicos ancestrales

(Mattiucci y Nascetti, 2008).

Los análisis realizados en The University of Southern Mississippi - Gulf

Coast Research Laboratory por el Dr. Robin Overstreet a las larvas de nematodo

obtenidas de Mugil cephalus, indican que éstas pertenecen a una especie

genéticamente muy cercana a las especies del complejo de Contracaecum

multipapillatum, pero no fue posible identificar el nivel específico al que

pertenecen. Es necesario llevar a cabo nuevos análisis que confirmen si estas

larvas pertenecen a una de las 4 especies que están actualmente dentro del

complejo o si es una especie nueva. Por este motivo la manera indicada para

referirse a los especímenes encontrados en las lisas de la Bahía de La Paz es


30

Contracaecum multipapillatum sensu lato, que indica que se trata de una especie

dentro del taxón Contracaecum multipapillatum, cuyo volumen es más amplio que

el descrito en este trabajo en particular.

Parasitismo por Contracaecum

Ecológicamente los parásitos son una parte esencial de la comunidad

acuática y la mayoría de los individuos de las poblaciones de peces, silvestres o

en cultivo, están infectados con uno o más parásitos (Al-Zubaidy, 2009).

Al parecer, los parásitos anisákidos se acumulan durante el tiempo de vida

de los peces; la prevalencia e intensidad de infección por nemátodos aumenta a

lo largo de la ontogenia, conforme crece el pez. De acuerdo con Moravec et al.

(1995) para que un parásito se albergue en un hospedero, éste necesita ser

abundante en el medio. Las posibilidades de infección aumentan debido al

periodo de exposición a las fases infectivas del nemátodo; al aumento en la

cantidad de comida que ingiere; a la acumulación de parásitos a lo largo de la

cadena alimenticia, en particular en el caso de endoparásitos y probablemente

también al cambio de dieta durante su vida (Szalai y Dick, 1990; Aho y Bush,

1993; Bergmann y Motta, 2004; Al-Zubaidy, 2009). En el caso de M. cephalus

Valles-Ríos et al. (2000) han reconocido una correlación positiva entre el tamaño

del pez y la intensidad de infección de Contracaecum spp. y otros parásitos.

Una de las causas de las infecciones en peces son los cambios de

factores bióticos o abióticos en el ambiente. Varias condiciones patológicas como

las alergias y reacciones anafilácticas ocurren en personas que se alimentan de

peces que habitan en cuerpos de agua contaminados, en los que aumenta la


31

concentración de plancton cuyos organismos pueden actuar como hospederos

intermediarios o paraténicos de helmintos, que a su vez, podría incrementar el

número de infecciones en el siguiente nivel de la cadena trófica (Mattiucci y

Nascetti, 2008; Al-Zubaidy, 2009).

En el presente estudio se obtuvo una prevalencia parasitaria por

Contracaecum multipapillatum (sensu lato) de 100% en M. cephalus obtenidas

en los meses de octubre y noviembre, similar a lo encontrado por Gómez del

Prado-Rosas et al. (2008) en M. cephalus parasitadas por Contracaecum sp. en

tres localidades dentro de la Bahía de La Paz (San Juan de la Costa, El Comitán

y Punta Prieta) durante el verano de 1995 y Valles Vega et al. (2010) en M.

curema de la Bahía de La Paz, mientras que la prevalencia de larvas de C.

multipapillatum en M. cephalus de Baja California obtenidas por Valles-Ríos et al.

(2000) fue de 30% y en otros estudios como el de Iannacone y Alvariño (2009) en

Perú, llegan a ser tan bajas como 2.7 %. Esto sugiere que algún factor,

probablemente la eutrofización, en la Bahía de la Paz, conduce a la infección de

un alto porcentaje de las lisas en el área.

Por muchos años la Ensenada de La Paz recibió la descarga directa de

aguas residuales de la ciudad y varios autores registraron altos niveles de

contaminación en las décadas de 1970 y 1980 (Martínez Díaz y Hernández

Rivas, 2010). En la actualidad, del total de aguas residuales tratadas en lagunas

de estabilización, aproximadamente un 35% se utiliza en riego agrícola, el resto

se vierte en la Ensenada de La Paz, por lo que grandes cantidades de materia

orgánica y bacterias son descargadas en la ensenada (Camacho, 1996; Martínez

Díaz y Hernández Rivas, 2010).


32

Olivero et al. (2006) encontraron diferencias dramáticas en las parasitosis

por nemátodos en el pez de agua dulce Halopias malabaricus de Colombia,

registrando mayores prevalencia e intensidad de parasitismo en los peces que

habitan algunos cuerpos de agua que mostraron más contaminación. Por otro

lado, Al Zubaidy (2009) menciona que, como la diversidad de peces disminuye en

ambientes acuáticos contaminados, el problema de las infecciones por helmintos

en humanos, adquiridas por el consumo de pescado, se acrecienta, ya que

solamente pocas especies están disponibles (Sakanari y McKerrow, 1989).

A pesar de que la mayor parte del año, la Ensenada de La Paz posee las

características adecuadas para uso recreativo y pesca, es importante considerar

los efectos naturales como el aumento en la precipitación pluvial y la insuficiencia

de los sistemas de recolección de agua del alcantarillado en el Municipio de La

Paz, que provocan un aumento en la contaminación en algunas temporadas del

año como en la época de huracanes (Martínez Díaz y Hernández Rivas, 2010).

Por el contrario, en la Bahía de La Paz no se tienen registros de

contaminación por aguas residuales, sin embargo, debido al sistema de

circulación de corrientes de la Ensenada de La Paz, las aguas residuales que se

llegan a verter en ésta, terminan finalmente en la bahía. Además de la actual

tendencia al aumento en la infraestructura turística proyectada en todo el margen

de la ensenada y la parte sur de la Bahía de La Paz, que incluye la instalación de

zonas habitacionales, turísticas y recreativas en áreas naturales (Martínez Díaz y

Hernández Rivas, 2010).

Por lo tanto, serían de utilidad estudios que esclarezcan si existe una

relación entre los niveles de contaminación biológica en la Ensenada y la Bahía


33

de La Paz y la presencia de C. multipapillatum s. l. y otros helmintos parásitos en

el ecosistema. Es posible que el ciclo de vida de los nemátodos anisákidos esté

relacionado con la demografía de sus hospederos en un área particular, debido a

que la culminación de sus ciclos de vida tan complejos requiere estabilidad en la

red trófica, ya que interviene en distintos niveles de ésta. Varios estudios indican

que existen efectos e interacciones significativas entre los niveles de parasitismo y

la presencia y concentracion de contaminantes y otros factores de estres en el

en el ambiente que pueden causar la disminución de las poblaciones hospederos

por perturbaciones en el ambiente como la sobrepesca, captura incidental, etc.,

que se manifiestan también en la disminución de las poblaciones de anisákidos

endoparásitos (Vidal - Martínez et al., 1994 y 2009; Coscia y Oreste, 1998;

Mattiucci et al., 2008; Mattiucci y Nascetti, 2008; Al-Zubaidy, 2009; Martínez Díaz

y Hernández Rivas, 2010).

Al peligro potencial que representa la alta prevalencia de Contracaecum

multipapillatum s.l. y otras posibles especies del género en distintos peces de la

Bahía de La Paz, se suma el hecho de que la temperatura del agua en que se

desarrollan los parásitos puede influir en su capacidad de infectar mamíferos y

por lo tanto al humano (Vidal-Martínez et al., 1994).

Ko, (1976, 1977) demostró que una mayor cantidad de infecciones de

distintos mamíferos con el nemátodo Echinocephalus sinensis obtenido de ostión,

se presentaron con especímenes recolectados en ciertos meses con mayores

temperaturas y con especímenes aclimatados a 28 y 33 ºC, temperaturas


34

comunes en las localidades donde Contracaecum multipapillatum es abundante,

mientras que pocas o ninguna infección se presentaron con los nemátodos

aclimatados a 5, 15 y 20 - 24 ºC. Por este motivo también resultan de interés

estudios que exploren las variaciones en la capacidad infectiva de los parásitos

que pueden amenazar la salud pública en la localidad en distintas temporadas del

año, ya que en la Bahía de la Paz existen variaciones significativas en las

temperaturas superficiales del agua, las más altas se registran de julio a octubre

(30 - 32 ºC) y las más bajas de enero a marzo (20 - 22 ºC) (Vidal-Martínez et al.,

1994; López et al., 2001).

Muchos parásitos pueden alterar el funcionamiento de los órganos vitales

de los peces de diversas maneras: pueden afectar la actividad del corazón, en el

intestino pueden inhibir la actividad digestiva y el metabolismo de vitaminas y

azúcar, por lo tanto, de manera indirecta afectan el crecimiento; en el hígado

afectan el metabolismo del glucógeno, en gónadas y cavidad celómica provocan

la reducción del número de huevos o la castración (Rhode, 1993).

En el caso de las lisas capturadas en la Bahía de La Paz, su aspecto

externo no muestra signos de enfermedad, a pesar de la alta intensidad de la

parasitosis en órganos viscerales por larvas del tercer estadio de C.

multipapillatum s. l. El único órgano que, en ocasiones, presenta lesiones

evidentes a simple vista, al abrir la cavidad visceral de los peces, es el hígado,

por lo que su valor y comercialización no disminuye. Por esta razón, aumentan

los riesgos de infección con este parásito o de presentar una reacción alérgica

hacia los antígenos del gusano o los presentes en la carne del pescado que

estuvo en contacto con el parásito (Al-Zubaidy, 2009).


35

Narciso et al. (2010) encontraron en M. cephalus a la venta dentro del área

metropolitana de Monterrey, Nuevo León, México, que los sitios con mayor

número de larvas de Contracaecum sp. son el hígado, seguido por el músculo

(filete), pero no encontró ningún nemátodo en el intestino, lo que hace suponer

que al ser más largo el periodo que pasa el pescado sin ser eviscerado al

transportarse a zonas del país lejanas a la costa, se promueve la migración de

las larvas alojadas en intestino y otros órganos hacia la musculatura, como

sucede con varios anisákidos.

De las 40 lisas recolectadas en el presente trabajo, solamente en dos se

encontraron larvas parasitando el músculo, por ello, se recomienda eviscerar el

pescado inmediatamente después de su captura, con el fin de reducir la infección

en músculo y no consumir pescado que lleve más de un día sin haber sido

eviscerado.

Aun así, probablemente no existe una preparación al momento de cocinar

que elimine por completo el riesgo a la salud humana cuando se consume

pescado que fue parasitado, en parte, porque ningún método garantiza al

consumidor, protección contra una posible reacción alérgica causada por la

ingestión de antígenos del parásito; en especial cuando algunos alérgenos de

larvas en tercer estadio (Anisakis simplex) han mostrado resistencia a

temperaturas elevadas en pruebas in vitro (Buendía E., 2000; Skirnisson, 2006).


36

Estructura antigénica e inmunogenicidad de

Contracaecum multipapillatum s. l.

El reconocimiento de antígenos de nemátodos aumenta nuestra capacidad

de entendimiento de los mecanismos de defensa desencadenados por el

hospedero durante la infección, ya que la respuesta inmune es la responsable de

muchos de los cambios patológicos que se presentan. Esto ha dado lugar al

desarrollo de métodos inmunodiagnósticos específicos, de medicamentos y

vacunas (Perec y Okulewicz, 2006; MacDonald et al. 2002).

En la literatura se menciona que la primera respuesta del sistema inmune

hacia antígenos, “respuesta primaria”, ocurre después de una primera inoculación

con presencia de inmunoglobulinas IgM principalmente y éstas deben alcanzar su

concentración óptima entre los días 10 y 15 después de la inoculación. Después

de este periodo, una segunda inoculación genera la “respuesta secundaria” en la

que, pocos días después, los linfocitos B producen las inmunoglobulinas IgG.

En el presente trabajo, el suero de los conejos inmunizados con proteínas

somáticas de las larvas L3 obtenido del sangrado del día 32, es decir, cuatro días

después de la segunda inmunización, fue el que presentó una mayor

concentración de IgG Anti - C. multipapillatum s. l., sin que existieran diferencias

en cuanto a la cantidad y peso molecular de los antígenos que son capaces de

reconocer, respecto a los sueros obtenidos el día 37. La metodología empleada

es similar a la registrada por Escalante et al. (2005) y López-Arellano et al.

(2005), que estudiaron la inmunogenicidad de los antígenos de nemátodos

Ascaris suum (parásito de roedores y humanos) y Haemonchus contortus

(parásito de rumiantes), utilizando conejos con un protocolo de inmunización con


37

intervalos de 7 o 15 días, inoculando proteínas somáticas junto con adyuvante

completo de Freund, los sueros hiperinmunes que utilizaron, se obtuvieron a

partir de la “respuesta secundaria” del sistema inmune de los conejos. Después

de la reinmunización, la “respuesta secundaria” alcanza niveles mayores de

anticuerpos IgG, que descienden lentamente en los siguientes dos o tres meses

(Calderón-Tinoco, 1984; Tizard, 2002;).

Sin embargo, la sensibilidad y exactitud de las pruebas inmunológicas en

modelos animales se ven afectadas cuando existen factores que modifiquen la

respuesta inmune del sujeto (Perec y Okulewicz, 2006). De los seis conejos

adquiridos que se sometieron al tratamiento de desparasitación y los periodos de

cuarentena y aclimatación en el bioterio del CIBNOR, sobrevivieron cinco, de los

cuales uno sufrió una fractura expuesta en el quinto día después de la primera

inoculación y falleció en el séptimo día sin que se determinara la causa especifica

de la muerte. Se realizó una extracción de sangre de este conejo para obtener

suero, con el que se realizó la prueba de ELISA para conocer la concentración de

IgG’s Antí - C. multipapillatum s.l. tras los siete días de inoculación. Debido a que,

probablemente, en este conejo se produjo un efecto inmunosupresor tras la

fractura y pérdida de sangre y falleció solo siete días después de la primera

inoculación, las concentraciones de IgG’s Antí - C.multipapillatum s. l. presentes

en su suero no fueron identificadas por el método de ELISA.

El reconocimiento de antígenos de helmintos parásitos por parte del

sistema inmune, puede verse afectado como consecuencia a que éstos se han

adaptado a suprimir, contrarrestar o evitar el sistema inmunitario de sus

hospederos. A través de la secreción de hormonas y enzimas pueden evitar la


38

producción o favorecer la degradación de inmunoglobulinas, además, pueden

evadir la acción proteolítica de las células defensivas con inhibidores de

proteasas o antioxidantes (Tizard, 2002).

Las larvas del nemátodo Toxocara canis, al ser expuestas in vitro a

eosinófilos del hospedero, simplemente se desprenden de la cubierta larvaria

junto con las células adheridas, evitando su ataque. Sin embargo, en la respuesta

inmune de los hospederos naturales de algunos parásitos, se ha observado que a

pesar de que no siempre reconocen los antígenos de las superficies corporales

de los helmintos, si son capaces de reconocer los antígenos que no están

comúnmente en contacto directo con ellos como los productos de secreción o

proteínas del tracto digestivo (Tizard, 2002).

Por ello, es importante conocer el total de los antígenos somáticos de un

parásito, capaces de generar una respuesta inmune en mamíferos, para el

desarrollo de métodos de diagnóstico, fármacos y/o vacunas eficientes.

En el extracto crudo somático total de larvas L3 de C. multipapillatum s. l.

se identificaron 54 proteínas de las cuales 14 fueron reconocidas por las IgG en

el suero del conejo control con pesos moleculares entre los 23.81 y 78.96 kDa,

mientras que el suero de los conejos inmunizados reconoció 33 proteínas. Esto

quiere decir que, los conejos inmunizados produjeron IgG’s por la presencia de

los antígenos C. multipapillatum s. l. para 19 antígenos. Es decir, produjo 19

IgG’s anti - C. multipapillatum s. l. sin que esto quiera decir que son específicas

para los antígenos de esta especie, ya que hace falta realizar pruebas que

descarten posibles reacciones cruzadas con antígenos de otros nemátodos u

otros helmintos.


39

En contraste, Perec y Okulewicz (2006) obtuvieron 47 proteínas somáticas

del nemátodo Syphacia obvelata, 11 de éstas con pesos moleculares mayores a

las proteínas somáticas de C. multipapilltum s. l. Debido a que uno de los factores

que determina la inmunogenicidad de los antígenos es su complejidad y peso

molecular, es de suponerse que las proteínas somáticas de S. obvelata tienen la

capacidad de estimular en mayor medida la producción de anticuerpos. Del total

de proteínas de S. obvelata 72 % (34) fueron reconocidas por IgG’s de ratones de

laboratorio de la cepa BALB/c, en contraste, las IgG’s de los conejos inmunizados

de este estudio sólo reconocen un 61% (33).

A pesar de que los resultados indican que C. multipapillatum s. l. posee

menos proteínas inmunogénicas que S. obvelata, el hecho de que en el estudio

de Perec y Okulewicz (2006) no presentan una comparación entre la cantidad de

antígenos reconocidos por IgG’s de ratones infectados y los reconocidos por

IgG’s de ratones no infectados, no nos permite hacer una comparación clara de

cuántos de los antígenos de cada nemátodo son reconocidas por anticuerpos

producidos específicamente por la exposición al parásito (o su extracto crudo) y

cuáles están presentes de manera natural, antes de que sea estimulado el

sistema inmune de los sujetos de estudio.

Coscia y Oreste (1998) observaron solamente 14 bandas

correspondientes a las proteínas de Contracaecum osculatum con pesos

moleculares entre los 21 y 200 kDa. En pruebas de inmunoreconocimiento

encontraron que el pez teleósteo Chionodraco hamatus presentó

inmunoglobulinas que reconocen 21% (3) de estas proteínas con pesos

moleculares de 47, 63 y 91 kDa. Como se mencionó anteriormente los


40

hospederos naturales de algunos helmintos no son capaces de reconocer varios

de sus antígenos, en consecuencia a la adaptación de éstos al medio que

presenta el hospedero y su sistema inmune. Esto podría explicar el bajo

porcentaje de proteínas reconocidas por los peces, hospederos intermediarios

naturales de las larvas de Contracaecum spp. comparado con el porcentaje de

proteínas reconocidas por el sistema inmune de los conejos del presente trabajo,

que no son hospederos naturales de las especies de este género.

Como parte del presente estudio se tenía contemplado la realización de

pruebas de inmunoreconocimiento de los antígenos de C. multipapillatum s. l. en

el suero de sus hospederos intermediarios naturales, M. cephalus, sin embargo,

debido a que el procesamiento de las muestras del suero de los peces no se

realizó de manera adecuada, no fue posible utilizarlas. Estos análisis nos pueden

dar más información y ser un punto de referencia acerca de qué proteínas de las

distintas especies del género Contracaecum presentan mayor inmunogenicidad.

No obstante, para hacer una comparación apropiada con estudios como el

de Coscia y Oreste (1998), es necesaria la homogenización de protocolos que

permitan una mayor eficacia para la obtención de antígenos. A pesar de que

analizaron proteínas de un nemátodo del mismo género al estudiado en el

presente trabajo, el número de proteínas obtenidas en cada uno, es muy distinto.

Los resultados obtenidos a partir de Contracaecum multipapillatum sensu lato son

más similares a los descritos por Perec y Okulewicz (2006) en Syphacia obvelata,

miembro de una familia distinta.


41

Futuro de la línea de investigación

En próximos trabajos se buscará esclarecer si los nemátodos encontrados

en M. cephalus corresponden a alguna de las especies ya descritas dentro del

complejo de Contracaecum multipapillatum, o si se trata de una nueva especie,

para ello será necesario conocer las características morfológicas de los adultos y

qué aves actúan como hospederos definitivos de esta especie. Esto proveerá un

mejor conocimiento de su ciclo de vida, que como ya se mencionó, también

puede ayudar a entender los niveles de infección de la especie en el área.

Además, en los estudios que deriven de los resultados presentados en el

presente trabajo será necesario realizar experimentos en búsqueda de

anticuerpos con mayor afinidad e inmunogenicidad, en modelos animales

mamíferos y sus hospederos peces y aves. Será necesario llevar a cabo un

estudio prospectivo para determinar si existen y con qué frecuencia se presentan

las infecciones o reacciones alérgicas provocadas por las larvas de

C. multipapillatum s. l., en pacientes con alguno o varios de los síntomas

relacionados con la anisakiasis después de haber consumido pescado de la

Bahía de La Paz. Para ello también es recomendable analizar las posibles

reacciones cruzadas de los antígenos aquí mostrados, con antígenos de otros

parásitos presentes en los peces de consumo en la localidad, para determinar

cuáles pueden ser utilizados en pruebas diagnósticas más exactas.


42

CONCLUSIONES

• Las larvas L3 encontradas en Mugil cephalus de la Bahía de La Paz se

ubican taxonómicamente dentro del complejo de Contracaecum multipapillatum,

que incluye a C. gibsoni, C. overstreeti, C. multipapillatum sp. “C” y C.

multipapillatum sp. “D”. Pero es necesario determinar si corresponden a alguna

de estas cuatro especies o se trata de una especie no descrita aún.

• Las lisas M. cephalus de la Bahía de La Paz, parasitadas por larvas de C.

multipapillatum s. l. presentan prevalencias e intensidades inusualmente altas,

siendo mayor la infestación de hígado e intestino y menos común en la

musculatura parietal de peces recién capturados.

• La presencia de larvas de C. multipapillatum s. l. con altas prevalencia e

intensidad en M. cephalus no afecta la comercialización de este pez, por lo tanto,

el peligro potencial de infección o de presentar una reacción alérgica, está

presente en las personas que lo consumen.

• En las larvas L3 de C. multipapillatum s. l. es posible identificar 54

proteínas con pesos moleculares entre 1.24 y 90.94 kDa por medio de

electroforesis SDS en gel de poliacrilamida.

• De las proteínas de C. multipapillatum s. l., 61% (33) son capaces de

inducir la producción de IgG’s en conejos. De estos 33 antígenos, 19 generan la

producción de IgG’s anti - C. multipapillatum s. l.


43

RECOMENDACIONES

Al estudiar los efectos de una determinada especie parásita en el

ecosistema o en la salud pública es de gran utilidad acceder al tema de manera

interdisciplinaria. En primera instancia se debe identificar taxonómicamente de

manera concluyente a la o las especies que son el objeto de estudio, para ello, el

uso de herramientas de biología molecular han probado ser de gran utilidad al

estudiar helmintos.

A su vez, para entender la dinámica de las poblaciones de parásitos dentro

de sus hospederos y en el ecosistema, el estudio de las estrategias que

desarrollan ambos organismos para coexistir, incluyendo la respuesta inmune del

hospedero, podrían ser de gran ayuda para explicar el porqué de temas como: la

capacidad de los helmintos de invadir nuevos tejidos o nuevos hospederos; la

habilidad del hospedero para evitar infestaciones masivas al estar expuesto

constantemente a las fases infectivas de determinados helmintos; la proporción

de parásitos adultos y juveniles dentro de un mismo hospedero, así como la

presencia o ausencia de diferentes especies de parásitos y otros aspectos de la

ecología y epidemiología de los helmintos y sus hospederos, incluido el humano.

También se debe analizar la posibilidad de utilizar el estudio de la ecología

y variabilidad genética de las poblaciones de C. multipapillatum s. l. y otros

parásitos en el área, como parámetros del estado de salud del ambiente, debido

a la estrecha relación que existe entre el ciclo de vida de algunos parásitos con

organismos en diversos nichos de un ecosistema. Probablemente Contracaecum

multipapillatum s. l. puede ser utilizado como indicador de la salud de las

poblaciones de peces y dentro de la Bahía de La Paz, ya que existen datos que


44

indican que la alta prevalencia de infección, puede estar influenciada por la

eutrofización en la Ensenada y Bahía de La Paz, debida a las descargas de

materia orgánica provenientes del drenaje de la ciudad o provocadas por eventos

naturales como huracanes.

Respecto a la amenaza que puede representar C. multipapillatum s. l. a la

salud pública de la región, es recomendable, con el fin de disminuir la

probabilidad de ingerir accidentalmente las larvas o que sus antígenos estén

presentes en la carne del pescado, evitar el consumo de pescado que no ha sido

eviscerado de manera oportuna después de su captura. Pero se deberá exhortar

también a los comerciantes iniciales, los pescadores, y a los intermediarios, a

adoptar medidas de prevención, eviscerando el pescado que comercializan, lo

más pronto que les sea posible.

Por otra parte se debe promover en los grandes establecimientos y

empresas con mayores recursos económicos, la implementación de medidas

como congelar a una temperatura de -20°C durante más de 24 horas todo el

pescado que debe comercializarse crudo, actualmente obligatorio en la

Comunidad Económica Europea.

Se recomienda alertar a las autoridades sanitarias de las circunstancias en

las que se encuentran las lisas de venta en el área, y el posible peligro al que se

exponen sus consumidores, para que tomen medidas precautorias y participen en

las investigaciones que determinen la magnitud del riesgo que representa la

especie objeto de este trabajo y otras especies del mismo género posiblemente

presentes en los organismos de los que se obtienen productos de consumo

humano.


45

TRABAJOS FUTUROS

Actualmente se trabaja en la secuenciación del ITS-1, ITS-2 (rADN) y el

COx2 (mtADN) de las larvas de Contracaecum provenientes de Mugil cephalus y

Mugil curema encontrándose hasta el momento, que estos nemátodos presentes

en ambas, pertenecen al complejo de Contracaecum multipapillatum. Se busca

determinar si se tratan de una nueva especie dentro de este complejo o si

pertenecen a una de las cuatro especies ya descritas. También está en proceso

el análisis de las mismas secuencias en adultos obtenidos de Pelecannus

occidentalis.

Es posible estudiar si la capacidad infectiva de C. multipapillatum s. l. en

mamíferos y por lo tanto en el hombre, está influenciada por la temperatura en la

que se desarrollan sus larvas, como sucede en el nemátodo Echinocephalus

sinensis, que presenta mayor capacidad infectiva cuando se desarrolla en

temperaturas de 28 y 33 ºC.

Es necesario realizar un estudio que demuestre si existen infecciones por

C. multipapillatum s. l. o reacciones alérgicas a sus antígenos, en la gente que

consume pescado de la localidad.

También es necesario realizar pruebas de reacción cruzada entre los

antígenos de C. multipapillatum s. l. y los encontrados en otros nemátodos y

helmintos parásitos de peces, ya que existen estudios que han demostrado que

la presencia de nemátodos parásitos, puede provocar, en el hospedero, la

producción de anticuerpos, que reconocen antígenos de otros parásitos.

Debido a que algunos de los hospederos naturales de parásitos,

reconocen una menor cantidad de antígenos que los que son capaces de


46

reconocer hospederos accidentales o experimentales, es posible determinar la

producción de anticuerpos contra el parásito en sus hospederos intermediarios

naturales peces, realizando pruebas de inmunoreconocimiento, para entender

mejor los procesos de infección de la especie y la respuesta de sus hospederos.

Además de pruebas que demuestren si C. multipapillatum s. l. presenta

antígenos resistentes a temperaturas altas, como se ha demostrado en otras

especies de anisákidos (Anisakis simplex).

LITERATURA CITADA

Aho, J. M. y A. O. Bush. 1993 Community richness in parasites of some

freshwater fishes from North America. In Ricklefs, R. E. and Schluter, D.

(ed.) Species diversity in ecological communities: historical and

geographical perspectives. University of Chicago Press. 185 - 190 pp.

Al-Zubaidy, A. B. 2009. Prevalence and Densities of Contracaecum sp. Larvae in

Liza abu (Heckel, 1843) from Different Iraqi Water Bodies. Marine Science.

20: 3 -17.

Anderson, R. 2000. Nematode parasites of vertebrates. Their Development and

transmission. 2nd Edition. CABI. UK. 650 pp.

Angot, V. y P. Brasseur. 1995. Anisakid larvae and their incidence on fish quality.

Revue de Medecine Veterinaire. 146 (12): 791 - 804.

Audicana, M. T., I. Ansotegui, L. F. de Corres y M. W. Kennedy. 2002. Anisakis

simplex: dangerous - dead and alive?. Trends in Parasitology. 18 (1): 20 -5.


47

Balart, E. F., J. L. Castro-Aguirre, D. Aurioles-Gamboa, F. García-Rodríguez y C.

Villavicencio-Garayzar. 1995. Adiciones a la ictiofauna de la Bahía de La

Paz, Baja Califoria Sur, México. Hidrobiológica. 5 (1-2): 79-85.

Bergmann, G. T. y P. J. Motta. 2004. Infection by Anisakid Nematodes

Contracaecum spp. in the Mayan Cichlid Fish “Cichlasoma (Nandopsis)”

urophthalmus (Günther 1862). Journal of Parasitology. 90 (2): 405 - 407.

Berland, B. 1989. Identification of larval nematodes from fish. Nematode problems

in North Atlantic fish. Reporte de taller en Kiel 3-4 April 1989. Council

Meeting, Session F, Paper No 6: 16-22.

Bouree, P., A. Paugam y Petithory. 1997. Anisakidosis: report of 25 cases and

review of the literature. A collection of publications on nematodes occurring

in cod fish. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious

Diseases. 18 (2): 75 - 84.

Bradford, M. 1976. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of

Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye

Binding" Analytical Biochememistry. 72: 248 - 254.

Bush, A. O., K. D. Lafferty, J. M. Lotz y A. W. Shostak. 1997. Parasitology meets

ecology on its own term: Magolis et al. Revisited. Journal of Parasitology.

83: 575 - 583.

Calderón-Tinoco J. 1984. Fisiología III, Inmunología. Compañía Editorial

Continental, S.A. de C.V. México. 73 pp.

Camacho, M. 1996. Estudios de contaminación bacteriológica del cuerpo de agua

de la Ensenada de La Paz. Tesis de Licenciatura. Biología Marina.

UABCS, La Paz, B.C.S. México. 82 pp.


48

Castillo Sánchez, E. y C. Pérez Ponce de León. 1998. Helminth parasites of

Paralichthys californicus (Osteichthyes: Paralichthydae) in Estero de

Punta Banda, Todos Santos Bay and San Quintin Bay, Baja California,

México. Ciencias Marinas. 24 (4): 443 - 462.

Contreras, F. 1985. Las Lagunas Costeras Mexicanas. Centro de Ecodesarrollo y

Secretaria de Pesca. México. 253 pp.

Coscia, M. y U. Oreste. 2001. Presence of antibodies specific for proteins of

Contracaecum osculatum (Rudolphi, 1908) in plasma of several Antarctic

teleosts. Fish & Shellfish Immunology. 8 (4): 295 - 302.

Cruz-Orozco, R. C. Martínez-Noriega y A. Mendoza-Maravillas. 1996. Batimetría

y sedimentos de la Bahía de La Paz, B.C.S. Oceánides. 11(1): 21-27.

Cuellar, C., M. Perteguer y M. Rodero. 2001. Presence of IL-4-Like molecules in

larval excretory-secretory products and crude extracts from Anisakis

simplex. Scandinavian Journal of Inmunology. 53 (5): 483-488.

Deardorff, T. L., y R. M. Overstreet. 1980. Contracaecum multipapillatum (=C.

robustum) from fishes and birds in the northern Gulf of Mexico. Journal of

Parasitology. 66: 853 - 856.

Del Pozo, V., I. Arrieta, T. Tunon, I. Cortegano, B. Gomez, B. Cardaba, S.

Gallardo, M. Rojo, G. Renedo, P. Palomino, A. Tabar y C. Lahoz. 1999.

Immunopathogenesis of human gastrointestinal infection by Anisakis

simplex. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (3): 637 - 43.

Escalante H., R. Liñan, E. Díaz, K. Davelois y O. Huamanchay. 2005. Antígenos

de larvas pulmonares de Ascaris suum reconocidos por anticuerpos


49

producidos por Oryctolagus cuniculus. Parasitología Latinoamericana. 60:

132 - 137.

Espinoza J. y H. Rodríguez. 1987. Seasonal phenology and reciprocal

transplantation of Sargassum sincola Setchell Gardner in the southern Gulf

of California. Journal Experimental Marine Biology Ecology. 110: 183 - 195.

Fischer W., F. Krupp, W. Schneider, C. Sommer, K. E. Carpenter y V. H. Niem.

Guía para identificación de especies para los fines de pesca. Organización

de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación. Roma.

605 pp.

Flores, H. 1995. Parásitos de las “Cabrillas” del género Mycteroperca (Gill, 1863)

en el sur de la Península de Baja California, México. Tésis de Licenciatura.

Biología Marina, UABCS, La Paz, B.C.S. 147 pp.

Gómez-Sáenz, J. T., M. J. Gérez, M. R. Zángroniz, E. Muro, J. J. González y M.

J. García. 1999. Reacciones de hipersensibilidad y manifestaciones

digestivas producidas por la ingestión de pescado parasitado por Anisakis

simplex. Semergen. 25: 792 - 797.

Gómez del Prado Rosas, M.C., L. Iglesias, F. J. Adroher y A. Valero. 2008.

Contracaecum sp. (Nematoda: Anisakidae) parásito de lisas ¿Riesgo

potencial en la salud pública de La Paz, B.C.S? Memorias del 1er.

Congreso Peruano de Helmintología e Invertebrados Afines – Encuentro

Internacional “New approaches about Neotropical Helminthology”. 30 de

octubre - 01 de noviembre de 2008. Lima, Perú. (Resumen)


50

Huizinga, H. W. 1967. The Life Cycle of Contracaecum multipapillatum (von

Drasche, 1882) Lucker, 1941 (Nematoda: Heterochelidae). The Journal of

Parasitology. 53 (2): 368 - 375.

Iannacone, J y L. Alvariño. 2009. Metazoos parásitos de Mugil cephalus

Linnaeus, 1758 (Mugilidae: Perciformes) procedentes del Terminal

Pesquero de Chorrillos, Lima, Perú. Neotropical Helminthology.

3 (1): 15 - 28.

Isishukura, H. 1989. General survey of Anisakis and anisakiasis in Japan. In

Gastric anisakiasis in Japan. Ishikura H y Namiki M. (ed.). Springer Verlag.

Tokio. 3-11 pp.

Juárez, A. 1986. Helmintos de la lisa Mugil cephalus Linneus, en Topolobampo,

Sinaloa SEDEMAR. Dirección General de Oceanografía, Topolobampo,

Sinaloa. 56 pp.

Juárez-Arroyo, J. y G. Salgado-Maldonado. 1989. Helminths of the "lisa" Mugil

cephalus at Topolobampo, Sinaloa, México. Anales del Instituto de

Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. Serie Zoología.

México. 60 (3): 279-298.

Kato, K., N. Kagei y Y. Hayashi, Ando. 1992. Parasitological and epidemiological

survey of anisakid larvae from sardines, Engraulis japonica, caught in the

sea near Kamogawa City, Chiba Prefecture, Japan, where human

anisakiasis prevailed. Japanese Journal of Parasitology. 41 (5): 425 - 430.

Kim, L. S., Y. H. Lee, S. Kim, H. R. Park y S. Y. Cho. 1991. A case of anisakis

causing intestinal obstruction. Korean Journal of Parasitology. 29 (1): 93 -

96.


51

Ko, R. C. 1976. Experimental infection of mammals with larval Echinocephalus

sinensis (Nematoda: Gnathostomatidae) from oysters (Crassostrea gigas).

Canadian Journal of Zoology. 54: 597 - 609.

Ko, R. C. 1977. Effects of temperature acclimation on infection of Echinocephalus

sinensis (Nematoda: Gnathostomatidae) from oysters to kittens. Canadian

Journal of Zoology. 55: 1129 - 1132.

Labriola J, D. y M. Suriano. 1996. Parasitic nematodes of birds from De Monte

Pond, Buenos Aires, Argentina. Boletín Chileno de Parasitología. 51:59 -

65.

López-Arellano M. E., E. Liébano-Hernández y P. Mendoza de Gives. 2005.

Haemonchus contortus L4: Desarrollo in vitro y análisis de antígenos con

posible potencial inmunoprofiláctico. Memorias del Congreso Nacional de

Buiatria XXIX, 2005. (Resumen)

López Penas, D., L. M. Ramirez Ortiz, R. del Rosal Palomeque, F. López Rubio,

R. Fernandez-Crehuet Navajas y G. Mino Fugarolas. 2000. Anisakiasis in

Spain: an increasing disease. Review. Gastroenterología y Hepatología. 23

(6): 307-11.

López, A. M., R. C. Duarte, A. Reyes-Salinas y J. E. Valdés Holguín. 2001.

Cambio Estacional de Clorofila en la Bahía de La Paz, B.C.S., México.

Hidrobiológica. 11 (1): 45 - 52.

Lorenzo, S., F. Romaris, R. Iglesias, M.T. Audícana, J. Alonso, J. Leiro y F.M.

Ubeira. 2000. O-glycans as a source of cross-reactivity in determinations of

human serum antibodies to Anisakis in determinations of human serum


52

antibodies to Anisakis simplex antigens. Clinical & Experimental Allergy. 30

(4): 551 - 559.

Lu Junyi, Wu Jinying, Yang Dawei, Chen Zhisheng y Zeng Hua. 2001. Analysis of

helminth population and community composition parasitic in striped mullet

(Mugil cephalus). Acta zoologica sinica/Dongwu Xuebao. Beijing. 47 (6):

609 - 615.

MacDonald A. S., M. Araujo y E. J. Pearce. 2002. Immunology of parasitic

helminth infections. American Society for Microbiology. 70 (2): 427 - 233.

Martínez-Díaz S. y M. Hernández Rivas. 2010. Sistema para el monitoreo de la

calidad del agua. Ciencia, tecnología e innovación para el desarrollo de

México. Nolasco-Soria H. (ed.) Año 2, No. 52.

Matsuoka, H., T. Nakama, H. Kisanuki, H. Uno, N. Tachibana, H. Tsubouchi y Y.

Horii, Nawa. 1994. A case report of serologically diagnosed pulmonary

Anisakiasis with pleural effusion and multiple lesions. American Journal of

Tropical Medicine and Hygiene. 51 (6): 819 - 822.

Mattiucci S., J. Olivero, M. Paoletti, B. Arroyo y G. Nascetti. 2006. Genetic

evidence for new species of Contracaecum (Nematoda, Anisakidae)

parasites of the brown pelican, Pelecanus occidentalis, from Columbia:

genetic relationships between congeners and larval identification. 11th

International Congress of Parasitological Associations, 6th –11th August,

Glasgow Scotland. (Resumen)

Mattiucci S., M. Paoletti, A. Consuegra y G. Nascetti. 2010. Contracaecum

gibsoni n. sp. and C. overstreeti n. sp. (Nematoda: Anisakidae) from the


53

Dalmatian pelican Pelecanus crispus (L.) in Greek waters: genetic and

morphological evidence. Systematic Parasitology. 75: 207 - 224.

Mattiucci, S. y G. Nascetti. 2008. Advances and Trends in the Molecular

Systematics of Anisakid Nematodes, with implications for their Evolutionary

Ecology and Host-Parasite Co-evolutionary Processes. En Advances in

Parasitology, Rollinson, D. y S. I. Hay (Ed). Elsevier. 301 pp.

Mbahinzireki, G. B. 1980. Observation on some common parasites of Bagrus

docmac Forskahl (Pisces: Siluroidea) of Lake Victoria. Hydrobiology. 75:

273 - 280.

Meléndez, S. y M. Rosas. 1995. Algunos aspectos ecológicos de los helmintos

que afectan a las especies de peces endémicas del lago de Pátzcuaro

Michoacán, México. Tésis, Facultad de Ciencias, UNAM, México. 83 pp.

Mendoza, C., L. García y Pérez-Ponce de León. 1996. Helmintos de la

“acúmara” Algansea latirostris en el lago de Pátzcuaro Michoacán, México.

Anales del Instituto de Biología, UNAM, México. Serie Zoológica. 67 (1):

71-88.

Mhaisen, F. T., N. K. Al-Salim y N. R. Khamees. 1988. Occurrence of parasites of

the freshwater mugilid fish Liza abu (Heckel) from Basrah, Southern Iraq.

Journal of Fish Biology. 32: 525 - 532.

Moravec, F., C. Vivas-Rodríguez, T. Scholz, J. Vargas-Vázquez, E. Mendoza-

Franco, J.J. Schmitter-Soto y D. González-Solís. 1995. Nematodes

parasitic in fishes of cenotes (=sinkholes) of the Peninsula of Yucatan,

Mexico. Part 1. Adults. Folia Parasitologica. 42: 115-129.


54

Moreno, I., M. Caballero, F. Gomez y E. Ortega and E. Alonso. 2000. Isolation

and characterization of a major allergen from the fish parasite Anisakis

simplex. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 106 (1): 177-82.

Moreno-Ancillo, A., M. Caballero, R. Cabañas, J. Contreras, J. Martin-Barroso, P.

Barranco y P. Lopez-Serrano. 1997. Allergic reactions to Anisakis simplex

parasitizing seafood. Annals of Allergy, Asthma & Immunology. 79 (3): 246

- 250.

Muhlia-Melo, A. y A. Muhlia-Almazan. 1995. Growth and Survival of the Lisa fish,

Mugil curema, Related to Salinity and Temperature in Experimental

Conditions in La Paz, Baja California Sur, Mexico. Aquaculture a95.

(Resumen)

Nadler S. A., S. D'Amelio, M. D. Daileyt, L. Paggi, S. Siu y J. A. Sakanari. 2005.

Molecular phylogenetics and diagnosis of Anisakis, Pseudoterranova, and

Contracaecum from Northern Pacific marine mammals. Journal of

Parasitology. 91 (6): 1413 - 1429.

Noelle, H. 1998. (Clinical aspects of the Anisakiasis of human beings).

(Proceedings of the food science advisory board for the German fisheries.

31. Annual meeting), verhandlungen des ernaehrungs-wissenschaftlichen

beirats der deutschen fischwirtschaft. 31 (13): 77-86.

Noh, J. H., B. J. Kim, S. M. Kim, M. S. Ock, M. I. Park y J. Y. Coo. 2003. A case of

acute gastric anisakiasis provoking severe clinical problems by multiple

infection. Korean Journal of Parasitology. 41: 97 - 100.

Obeso-Nieblas M. y A. R. Jiménez-Illescas. 1989. Propagación de la

constituyente M2 de la marea en La Bahía de La Paz, Baja California Sur,


55

México, mediante un modelo bidimensional hidrodinámico numérico.

Investigaciones Marinas, CICIMAR. 4: 241 - 256.

Obeso-Nieblas M., B. Shirasago-Germán, J. Gaviño-Rodríguez, E. Perez-

Lezama, H. Obeso-Huerta y A. Jiménez-Illescas. Variabilidad hidrográfica

en Bahía de La Paz, Golfo de California, México (1995-2005). Revista de

Biología Marina y Oceanografía. 43(3): 559 - 567.

Olivero-Verbel J., R. Baldiris-Ávila, J. Güette-Fernaández, A. Benavides-Álvarez,

J. Mercado-Camargo y B. Arroyo-Salgado. 2006. Contracaecum sp.

infection in Hoplias malabaricus (moncholo) from rivers and marshes of

Colombia. Veretinary Parasitology. 140: 90 - 97.

Perec, A. y A. Okulewicz. 2006. The presence of Syphacia obvelata in laboratory

mice (BALB/c) – parasite antigens in immune response. Helminthologia.

43 (4): 203 - 207.

Pérez, S. y A. Ruiz-Luna. 1985. Los animales comestibles de importancia

comercial en aguas mexicanas. CECSA. México. 213 pp.

Pérez-Pérez. J., E. Fernández-Caldas, F. Marañón, J. Sastre, M. L. Bernal, J.

Rodríguez y C. A. Bedate. 2000. Molecular cloning of paramyosin, a new

allergen of Anisakis simplex. International Archives of Allergy and

Immunology. 123 (2): 120 - 129

Pérez-Ponce de León, D. García-Prieto, Osorio-Sarabia y V. León-Regagnon.

1996. Listados Faunísticos de México VI. Helmintos parásitos de peces de

aguas continentales de México. Instituto de Biología, UNAM. 100 pp.

Pérez-Ponce de León, G. 1992. Sistemática del género Pogthodiplostomum,

Dubois, 1936 y algunos aspectos epizotiológicos de la Postodiplostomiasis


56

en el lago de Pátzcuaro, Michoacán, México. Tesis doctoral, Facultad de

Ciencias, UNAM, México. 181 pp.

Plomozo-Lugo T. 2010. Propuesta para la regionalización de la pesca ribereña

en el Golfo de California. Tesis de Licenciatura. Biología Marina, UABCS,

La Paz, B.C.S. 42 pp.

Ranzani-Paiva, M. y M. Tavares-Días. 2002. Erythrogram, hepatosomatic,

splenosomatic and viscerosomatic relation in mullet, Mugil platanus

Guenther (Osteichthyes, Mugilidae) parasitized. Revista Brasileira de

Zoología. 19 (3): 807 - 818.

Rivas, L. 1980. Synopsis of knowledge on the taxonomy, biology, distribution and

fishery of the Gulf of Mexico mullets (Pisces: Mugilidae). Proceedings of a

workshop for potential fishery resources of the northern gulf of México.

New Orleans, Louisiana. 34 - 53 pp.

Roberts, R. J. 1981. Patología de los peces. Mundi-Prensa. Madrid. 333 pp.

Robles Gil-Mestre S. 1998. El clima de la ciudad de La Paz. Tesis de Maestría.

UNAM. 233pp.

Rodero, M., T. Jiménez, T. Chivato, R. Laguna y C. Cuellar. 2001. Purification of

Anisakis simplex antigen by chromatography. Parasitology Research. 87:

736 - 740.

Rodríguez Romero, J., L. Abitia Cárdenas, F. Galván Magaña y H. Chávez

Ramos. 1994. Composition, abundance and specific richness of fishes from

Concepcion Bay, Baja California Sur, México. Ciencias marinas. 20 (3):

321 - 350.


57

Rohde, K. 1993. Ecology of marine parasites: An Introduction to Marine

Parasitology, 2a Ed. CAB Interational. 298 pp

Rueda, S. 1995. Patrón de precipitación en la península de Baja California,

México (1894-1981). Investigaciones Marinas, CICIMAR. 10: 43 - 50.

Sakamari, J. A. 1990. Anisakis from the platter to the microfuge. Parasitology

Today. 6 (10): 323 - 327.

Sakanari, J. A. y J. H. Mckerrow. 1989. Anisakiasis. Clinical Microbiology

Reviews. 2: 278 - 284.

Salgado, M., R. Pineda, V. Vidal y C. Kennedy. 1997. A checklist of Metazoa

parasites of cichlid fish from Mexico. Journal of Helminthological Society of

Washington. 64: 195 - 207.

Salgado-Maldonado, G. y N. Barquín-Álvarez. 1978. Floridosentis elongatus

Ward, 1953 and Contracaecum sp., parasitic on Mugil cephalus Linnaeus,

1758. Anales del Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de

México. Zoología. 49 (1): 71 - 82.

Sánchez-Rueda, P. 2002. Stomach content analysis of Mugil cephalus and Mugil

curema (Mugiliformes: Mugilidae) with emphasis on diatoms in the

Tamiahua Lagoon, México. Revista de Biología Tropical. 50 (1): 245 - 252.

Shamsi S., R. Gasser, I. Beveridge y A. A. Shabani. 2008. Contracaecum

pyripapillatum n. sp. (Nematoda: Anisakidae) and a description of C.

multipapillatum (von Drasche, 1882) from the Australian pelican, Pelecanus

conspicillatus. Parasitology Research. 103: 1031 - 1039.


58

Shamsi S., R. Norman, R. Gasser y I. Beveridge. 2009. Redescription and genetic

characterization of selected Contracaecum spp. (Nematoda: Anisakidae)

from various hosts in Australia. Parasitology Research. 104: 1507 - 1525.

Skirnisson, K. 2006. Pseudoterranova decipiens (Nematoda: anisakidae) larval

reported from humans in Iceland after consumption of insufficiently cooked

fish. Laeknabladid. 92: 21 - 25.

Stoskopf, M. 1993. Fish Medicine. Saunders Company. U.S.A. 882 pp.

Stuardo, J. y A. Martinez. 1975. (General results of a biological and fishery survey

of the coastal lagoons of the State of Guerrero, Mexico). Acta Politécnica.

16 (72): 99 - 115.

Sugimachi, E., K. Inocuchi, T. Iowa, T. Fujino y Y. Ishii. 1985. Acute gastric

anisakiasis: Análisis of 128 cases. Journal of American Medicine. 253 (7):

1012 - 1013.

Szalai, H. y P. E. Dick. 1990. Proteocephalus ambloplitis and Contracaecum sp.

From Largemouth Bass (Micropterus salmoides) stocked into Boundary

reservoir, Saskatchewan, Journal of Parasitology. 76 (4): 598 - 601.

Tizard, I. R. 2002. Inmunología Veterinaria. 6ª Ed. McGraw-Hill Interamericana.

México. 517 pp.

Valles Ríos, M., G. Ruiz Campos y L. Galaviz Silva. 2000. Prevalence and

parasitic intensity in Mugil cephalus (Pisces: Mugilidae), from the

ColoradoRiver, Baja California, México. Revista de Biología Tropical. 48 (2-

3): 495 - 501.

Valles Vega, I. y M. C. Gómez del Prado-Rosas 2010. Cambios en la

organización anatómica de la larva L3 de Contracaceum sp. (Nematoda:


59

Anisakidae) por el empleo de distintos métodos culinarios en La Paz,

B.C.S., México. Memorias del Segundo Congreso Internacional de

Parasitología Neotropical "El Rol de la Parasitología Neotropical en la

Salud Global". 9 - 13 de Noviembre de 2010. Lima, Perú. (Resumen)

Valles-Ríos, M. E., G. Ruiz-Campos y L. Galaviz Silva. 2000. Prevalencia e

intensidad parasitaria en Mugil cephalus (Pisces: Mugilidae), del Río

Colorado, Baja California, México. Revista de Biología Tropical. 48 (2-3):

495 - 501.

Vidal-Martinez, V. M., D. Osorio-Sarabia y R. M. Overstreet. 1994. Experimental

infection of Contracaecum multipapillatum (Nematoda: Anisakinae) from

Mexico in the domestic cat. The Journal of Parasitology. 80 (4): 576 - 579.

Villaseñor-Casales, A. 1979. Distribución vertical de temperatura, salinidad y

oxigeno disuelto en La Bahía de La Paz, Baja California Sur, durante la

primavera de 1976. California Cooperative Oceanic Fisheries Investigation

Reports. 20: 146 - 149.

Warburton, K. 1979. Growth and production of some important species of fish in

a Mexican coastal lagoon system. Journal of Fish Biology. 14 (5): 449 -

464.

Vidal-Martinez, V. M., D. Pech, B. Sures, S. T. Purucker y R. Poulin. 2009. Can

parasites really reveal enviromental impact?. Trends in Parasitology. 20 (4):

170 - 177.

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Estructura Antigénica de la larva L3 de Contracaecum ...biblio.uabcs.mx/tesis/TE 2620.pdftodas las niñas y no tan niñas del Laboratorio de Parasitología por estar ahí y por aguantarme