Técnicas de diagnóstico para detección de bacterias que afectan papa destinada a semilla

Rosaima García

Betty Paz

Franci Urbina

Misrael Monsrha

“Estandarización de Protocolos de los Laboratorios de Servicio Fitopatológicos:

Caso producción de semilla de Papa” . Mérida, Noviembre, 2013

Son microorgansismos unicelulares de

tamaño muy pequeño (0,5 y 5 µm).

Son procariotas, no tienen el núcleo definido

ni presentan en general, orgánulos

membranosos internos. Generalmente

poseen una pared celular compuesta

de peptidoglicano.

Se estima que se pueden encontrar en torno

a 40 millones de células bacterianas en un

gramo de tierra y un millón de células

bacterianas en un mililitro de agua dulce. En

total, se calcula que hay aproximadamente

5 1030 bacterias en el mundo.

Más de 2000 especies identificadas, 10%

aproximadamente son fitopatógenos.

¿Por qué se dificulta la detección de Las bacterias?

A-Monotrico; B-Lofotrico; C-Anfitrico; D-Peritrico.

FAMILIA GENERO TINCIÓN DE GRAM

PSEUDOMONACEAE Pseudomonas/Ralstonia, Bukholderia.

(-)

ENTEROBACTERIACEAE Erwinia/Pectobacterium/ Dickeya

(-)

MICROBACTERIACEAE Corynebacterium/ Clavibacter, (+)

STREPTOMYCETACEAE Streptomyces (+)

Principales familias y géneros de bacterias señaladas como causantes de Enfermedades en Papa

Técnicas de diagnósticos de Bacterias

Expresión de Síntomas: Preparaciones

Microscópicas y Pruebas de flujos.

Diagnóstico por Medios diferenciales

Histopatología- Uso de Microscopía

Técnicas Bioenzimáticas

PCR (Biología Molecular): Aún no se ha

estandarizado, está en proceso.

Método: Observación Visual, Diagnóstico por Síntomas

Daños Vasculares: Daño en

médula, taponamiento del

haz vascular, pudrición de

tubérculos.

Ralstonia, Clavibacter,

Pectobacterium .

Dentro del Tallo verdadero

o tubérculos: Pudrición del

tallo o pata negra,

marchitez, colapso,

pudrición blanda

Pectobacterium

Ahuecamiento del Tallo o

tubérculos

Diskeya

Daños superficiales en

superficies de tubérculos,

sarna, acorchamiento.

Streptomyces

Prueba Rápida del flujo bacteriano desde una rama de papa

Marchitez bacteriana de la planta y pudrición parda de tubérculos de papa por Ralstonia solanacearum

Prueba Rápida del flujo bacteriano desde una rama de papa

Marchitez por efecto de pata negra de la planta y pudrición blanda de tubérculos de papa por Pectobacterium carotovora

Sarna Común en papa (Streptomyces scabies). Síntomas

muy severos

Actualmente, se sólo se usa este método

como rutina y se combina con preparaciones

microscocópicas

Dickeya ( Erwinia chrysanthemi )

[Samson et al., 2005]

Tallo y Pudrición hueca de la papa

Dickeya chrysanthemi (Burkholder et al.

1953) Samson et al. 2005

Ultraestructura de un tallo de Papa, afectado por R. solanacearum. Obsérvese el haz vascular taponado por la pus bacteriana. Este Método se combina con el uso de medios diferenciales como rutina de servicio.

Técnica de Histopatología

Algunas Características

Características de las colonias Género TINCIÓN DE

GRAM

Metabolismo Respiratorio Oxidativo

Colonias blancas de bordes irregulares, muy fluídas en el medio Kelman (-) No fluorescentes en KB. Colonias color crema centro rosado semejante a helado en Kelman +TZC

Psudomonas (Ralstonia)

(-)

Metabolismo Respiratorio Fermentativo

Color amarillo en el Medio D3 y Kelman (-) Kelman Negativo y AN: Color crema a gris, algo traslucida bordes lisos a irregulares semejantes a huevo fritos y una estrellita en Kelman (-). Desarrollo de hoyos en el medio CVP

Dickeya Erwinia/Pectobacterium

(-)

Bacterias Corineformes

Colonias Amarilla en el medio YPDA o YPGA.

Corynebacterium/ Clavibacter,

(+)

(+)

Colonias blancas en AN o Agar -Tirosina Streptomyces scabies

Método: Uso de Medios Diferenciales: Clave

Orientadora para Clasificación Genérica

Características de las colonias: Pectobacterium carotovora

Gram (-), Prueba de KOH al 3%

Célula en forma de bastón, flagelos

periticas

Oxidasa negativa, anaeróbica

facultativa

Catalasa positiva

Pudrición de rodajas de papa (+).

Capacidad Pectolítica: produce hoyos

profundos en CVP

Colonias pequeñas, Color blanco a grisáceas, mucoides brillantes algo traslucidas, forma redonda bordes de lisos a levemente ondulada, lobulados, centro levantadas pronunciadas de color amarillo claro, convexas al inicio espumosas que después de 72 horas toman formas de huevos fritos en los medios de cultivos PDA, YCDA, YCA y Kelman(-). Kelman +TZC= Color crema, centro rosado oscuro a rojo, bordes irregulares semejantes a estrellitas. AN= Colonias pequeñas,planas, ligeramente circulares, color blancuzco y bordes irregulares BK: Crecimiento abundante, sin pigmentación, se tornan blanco grisáceos después de varios días.

Actualmente sólo se usa el medio

Kelma (-) y Keman (+) como rutina de

servicio.

Kelman (-)

De Kado D3

Dickeya ( Erwinia chrysanthemi )

Colonias pequeñas, Color crema a amarillo claro, mucoides brillantes algo traslucidas, forma redonda bordes levemente onduladas,, centro levantados de color amarillo claro, convexas después de 72 horas toman formas de huevos fritos en los medios de cultivos PDA, YCDA, YCA y Kelman(-).

Kelman +TZC= Color crema, centro rosado oscuro a rojo, bordes irregulares semejantes a estrellitas.

AN= Colonias pequeñas, planas, ligeramente circulares, color blancuzco y bordes irregulares

BK: Crecimiento abundante, sin pigmentación, se tornan blanco grisáceos después de varios días. Crecen a 35 ºC en YDCA

Aún no se ofrece como servicio, sólo se

determinan como Erwinias

Características de las colonias de R. solanacearum (E.F. Smith).

Células en forma de varillas rectas o ligeramente curvada, Gram negativa y

móviles mediante uno o varios flagelos polares, aérobios, oxidasa positiva, catalasa

positiva, licuan lentamente la gelatina o no lo hacen (Palleron,1984).

TZC: Colonias medianas a grandes, color blanco cremoso con una puntuación rosado en

el centro, de forma irregular, semejantes a un helado, visibles a las 48 horas y desarrollo

completo a las 72 con choque térmicos de 30 a 22ºC. Son muy fluidas se deslizan por todo

el medio.

YDC y Kelman (-): Colonias blancas cremosas, superficie lisas, convexas de bordes

irregulares .

BK: No producen pigmentos fluorescentes.

Para Servicio se usa como rutina medio Kelman (+) y Kelman (-)

Características de las colonias de R. solanacearum, mediante el uso del medio

específico TZC (Hayward, 1967, Kelman, 1953 -1954)

Es un microorganismo filamentoso,

heterótrofo.

Produce un micelio fragmentado que puede

Sub-dividirse asexualmente originando

esporas, presenta gran similitud con hongos

pero tiene un micelio de menor diámetro

(Hooker, 1981).

Tiene una estructura celular Procariota, es

aeróbico en el medio de cultivo produce

filamentos y melanina que es un pigmento

café oscuro (Contreras, 2001).

Es Gram (+).

Streptomyces scabies

Actualmente, no se usa como rutina

Proceso estandarizado para detección de dos de las bacterias que afectan la papa

Muestra de

semilla de papa

Desinfección con alcohol isopropílico

80% y flameados. Se Cortan trozos

delgados del haz vascular del

tubérculo o tallitos

Se coloca en bolsas plásticas

gruesas con 20 mL de agua y se

macera

Muestra de

planta de papa

Siembra del Macerado en

los medios K(-),K (+) o AN Incubar 48 a 72 horas 28+2 Se observan y seleccionan

las colonias en el

Estereoscopio

Muestra de

semilla de papa

Desinfección: 1% Hipoclorito de Na

5min, se secan se coloca alcohol

isopropílico 85% y flamean. Se Cortan

trozos delgados del anillo vascular del

tubérculo o tallitos 2X1 mm (Inferiro a

0,50g/tubérculo)

Se coloca en bolsas plásticas

gruesas con 20 mL de agua y se

macera

Muestra de

planta de papa

0,5 mL SMSA 1X +0,5 mL del

extracto en eppendorf de 1,5L.

Incubar en caldo de

enriquecimiento 48 horas 28+2 se

agitan 2 veces/día

Detección de infección latente de R. solanacearum a través de la Técnica de NCM-ELISA (Gutarra y Gamboa, 1995)

Preparación de muestras de plantas y semilla de papa

Actualmente no se cuenta con reactivos para ofrecer el servicio

Detección de infección latente de R. solanacearum a través de la Técnica de NCM-ELISA (Gutarra y Gamboa, 1995)

La Reacción enzimática se observa a través de una

coloración purpura en las muestras positivas con

diferentes intensidades de claro a oscuro (Morado).

Actualmente no se cuenta con reactivos para ofrecer el

servicio

Detección de bacterias de Muestras de suelo

La técnica de extracción de la muestra, dilución seriada y siembra en plato

agar (Medios Generales Y/o Selectivos)

Muestra de suelo Se Tamiza

Tomar 5 g 50 mL de

agua

+

Agitar 2

horas a 100

RPM

Proceso de extracción de suelo y

enriquecimiento para la detección

de R. solanacearum en suelo

mediante ELISA-DAS Pasos de la Prueba de ELISA-DAS

Reacción Final de la

Prueba de ELISA-DAS

Detección de R. solanacerum en suelos por ELISA-DAS

Actualmente no se

cuenta con reactivos

para ofrecer el

servicio