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Espectrofotometria
Espectrofotometria
É um método de análise quantitativa instrumental mais usado nas investigações biológicas e físico-químicas.
Método de análise óptico baseado em medidas de absorção de radiação eletromagnética.
Espectrofotometria Óptica Comprimento de onda corresponde à luz visível ou
ultra-violeta: • faixa entre aproximadamente 180 a 800 nm
Quando a luz atravessa uma substância, parte da energia é absorvida absorvância
A cor das substâncias se deve a absorção de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas não absorvidos transmitância
Espectrofotometria
O espectrofotômetro é um instrumento que permite comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de soluto.
Espectrofotômetro
Função de medir e comparar a quantidade de luz (energia radiante) absorvida por uma determinada solução. Ou seja, medir a concentração de substâncias, que absorvem energia radiante, em um solvente.
http://www.infoescola.com/materiais-de-laboratorio/espectrofotometro/http://www.infoescola.com/quimica/solucoes/http://www.infoescola.com/compostos-quimicos/solventes/
Espectrofotômetro
Possui uma fonte estável de energia radiante (normalmente uma lâmpada incandescente);
Um seletor de faixa espectral (monocromatizadores como os prismas, que seleciona o comprimento de onda da luz que passa através da solução de teste);
Um recipiente para colocar a amostra a ser analisada (a amostra deve estar em recipientes apropriados como as cubetas e tubos de ensaio);
Um detector de radiação, que permite uma medida relativa da intensidade da luz.
A base da espectrofotometria, portanto é passar um feixe de luz através da amostra e fazer a medição da intensidade da luz que atinge o detector. O espectrofotômetro compara quantitativamente a fração de luz que passa através de uma solução de referência e uma solução de teste.
Fontes Luminosas
• Luz UV (180 a 400 nm)
– Lâmpada de gás hidrogênio
– Mercúrio
• Luz Visível
(400 a 800 nm)
– Tungstênio
Cubetas
• Espectrofotometria de Luz Visível
– Cubeta de Vidro ou Plástico
• Espectrofotometria de Luz Ultra- Violeta
– Cubeta de Quartzo
Absorção de Radiação
• Vários fenômenos podem ocorrer com a radiação luminosa, como: reflexão, refração, espalhamento ou ser absorvida pelo material.
Absorção de Radiação
• O comprimento de onda que uma certa substância absorverá a radiação luminosa é característico da sua estrutura, diferindo de substância para substância
• Ex:
– DNA e RNA = 260 nm
– Proteínas = 280 nm
– Azul de metileno = 660 nm
Absorção de Radiação
Io = Ia + It + Ir
Transmitância
• Transmitância é a fração da luz incidente em um comprimento de onda específico, que atravessa uma amostra de matéria.
T = I / I0
Absorvância
• É a fração da energia luminosa que é absorvida por um determinado material.
A = - log10 T
Absorbância X Transmitância
Lei de Lambert-Beer
A absorvância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores.
Lei de Lambert-Beer
Por meio dessa lei, intensidades da radiação incidente e emergente podem ser relacionadas com as concentrações do material presente na solução.
Efeitos de reflexão, refração e espalhamento não são considerados nessa lei.
A radiação incidente deve ser monocromática
• I0 = intensidade da radiação incidente
• I = intensidade transmitida pela amostra
• l = comprimento
I = I0 10-Ɛlc
Lei de Lambert-Beer
• Transmitância:
• Na Lei de Lambert-Beer
T = I / I0
T = 10-Ɛlc
Lei de Lambert-Beer
• Absorvância
• Na Lei de Lambert-Beer
A = - log10 T
Lei de Lambert-Beer
A = - log10 T = log10 (1/T ) = log10 (1/10-Ɛlc)
= log10 10Ɛlc = Ɛlc log10 10 = Ɛlc
Lei de Lambert-Beer
Curva padrão
Expressa a relação entre a Absorvância e a Concentração de soluto de uma determinada amostra; A Concentração de um soluto numa solução é diretamente proporcional a absorvância medida por um espectrofotômetro; Por meio da Curva Padrão podemos determinar a relação matemática (equação da reta) Com base na análise gráfica é possível verificar a linearidade da reação e calcular um fator de conversão de valores de absorvância em concentração.
Lei de Lambert-Beer
Curva padrão
X Y
Concentração (M) Absorvância (A)
0,1 0,0025
0,2 0,0058
0,3 0,0081
0,4 0,0104
Inicialmente, verificamos no espectrofotômetro a absorvância (A) das soluções cujas concentrações sejam conhecidas:
Lei de Lambert-Beer
Curva padrão
0,0000
0,0020
0,0040
0,0060
0,0080
0,0100
0,0120
0,0 0,1 0,1 0,2 0,2 0,3 0,3 0,4 0,4 0,5
Curva Padrão A equação da reta é dada por:
Y= a.(x)+ b
Y= 0,0026.(x) + 0,0002
Com a curva padrão, obtendo o valor da absorvância por meio do espectrofotômetro podemos determinar a concentração do soluto a partir da equação da reta.
[ ]
Abs
a
a = tg = y2-y1 x2-x1
Lei de Lambert-Beer
Curva padrão
0,0000
0,0020
0,0040
0,0060
0,0080
0,0100
0,0120
0,0 0,1 0,1 0,2 0,2 0,3 0,3 0,4 0,4 0,5
Curva Padrão A equação da reta é dada por:
Y= a.(x)+ b
Y= 0,0026.(x) + 0,0002
A inclinação da reta (a) é portanto o coeficiente de extinção () da Lei de Lambert-Beer. A = . l . c
[ ]
Abs
a
a = tg = y2-y1 x2-x1