ESERCIZIO.L’assorbanza per una soluzione contenente una miscela di NAD+ e NADH è stata misurata a 340 nm e a 260 nmA340= 0.207 e A260= 0.9Conoscendo i coefficienti di estinzione:

mM340 NADH= 6.2 mM-1 cm-1

mM260 NADH= 18 mM-1 cm-1

mM260 NAD+ = 18 mM-1 cm-1

Calcolare le concentrazioni millimolari della forma ossidata e ridotta

A340 0.207

[NADH] = ----------= --------------------------- = 0.0333mM340· l 6.2mM-1cm-1 x 1cm

A260 0.9 [NAD+] +[NADH]= -------- = ------------------------ = 0.05mM

260 x l 18mM-1·cm-1 x 1cm

[NAD+] = 0.05 mM – 0.0333 mM = 0.0167 mM

PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE TECNICHE CROMATOGRAFICHE

Le tecniche cromatografiche, utilizzate nella purificazione delle proteine, sono basate sulla distribuzione differenziale delle varie proteine presenti in una miscela fra DUE FASI IMMISCIBILI FRA LORO:

• fase stazionaria (matrice)

• fase mobile (eluente, solvente che fluisce in continuo attraverso la fase stazionaria)

➢In base alla forma del letto cromatografico

Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular)

Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)

➢In base allo stato fisico della fase mobile

Cromatografia Liquida (LC)Gascromatografia (GC)Cromatografia fluida supercritica

(SFC)

➢ In base al meccanismo di separazioneAdsorbimentoRipartizioneScambio ionicoEsclusione

Affinità

Le tecniche cromatografiche si distinguono:

CAMPIONE: MISCELA DI PROTEINE ottenuto da frazionamento di unestratto proteico (da tessuto, cellule o fluido biologico)

Le diverse proteine in miscela hanno capacità di distribuirsidiversamente fra FASE MOBLILE e FASE STAZIONARIA, perché hannodiversa sequenza amminoacidica, diversa struttura e quindi diverseproprietà chimico-fisiche.

Le proteine che interagiscono di più con la fase stazionaria, sarannotrattenute più a lungo.

Le proteine che interagiscono di più con la fase mobile transiterannopiù velocemente.

Ogni diversa proteina ha una sua caratteristicadistribuzione fra le due fasi che è espressa come COEFFICIENTE DIRIPARTIZIONE (Kd)

• Coefficiente di ripartizione: definisce come un composto si distribuisce tra due fasi non miscibili

concentrazione proteina nella fase mobile

Kd= ---------------------------------------------------------------

concentrazione proteina nella fase stazionaria

Kd > 1 indica che l’analita interagisce preferenzialmente con la fase mobile → si muove velocemente attraverso la colonna

Kd < 1 indica che l’analita interagisce preferenzialmente con la fase stazionaria

→si muove lentamente lungo la colonna

Kd = 1 indica che l’analita interagisce equamente con entrambe le fasi, il tipo di cromatografia scelto non è efficiente

CROMATOGRAFICA LIQUIDA SU COLONNA

SerbatoioCon fase mobile

Fase mobile

Fase stazion.

Setto poroso

Eluato

rubinetto

rubinetto

Miscela di proteine

Proteineseparate

I componenti della MISCELA cheinteragiscono più fortemente con

la FASE STAZIONARIA sarannorallentati rispetto ad altri

componenti della miscela cheinteragiscono preferenzialmente

con la FASE MOBILE. Questi si muovono più

velocemente lungo la colonna, trascinati dal flusso di fase mobile

FASI OPERATIVE di una SEPARAZIONE PER CROMATOGRAFIA LIQUIDA:

•IMPACCAMENTO della COLONNA

•CARICAMENTO del CAMPIONE

•ELUIZIONE

•RIVELAZIONE degli analiti

•RACCOLTA delle FRAZIONI

•CONTROLLO della PURIFICAZIONE

APPARECCHIATURE:

• Colonna di vetro

Eventualmente:

• Pompa collegata da un lato al Serbatoio con fase mobile e dall’altro alla colonna

• Collettore di frazioni

• Sistema di rivelazione (spettrofotometro)

IMPACCAMENTO DELLA COLONNA

• La fase stazionaria È una polvere che deve essere sospesa eidratata nella fase mobile

• La sospensione con la fase stazionaria va versata ESTRATIFICATA nella colonna in maniera continua,delicatamente senza intrappolare bolle d’aria

COLONNE PREIMPACCATE CON SPECIFICHE FASI STAZIONARIECOLONNE DA IMPACCARE

Rubinetto chiuso

Fase

st

azio

nar

ia

Fase mobile

• Aggiunta di fase mobile x equilibrare la fase stazionaria, nondeve mai andare a secco!

RESERVOIR

https://www.youtube.com/watch?v=UmWMlKJAdSk

CARICAMENTO DEL CAMPIONE

• Aspirare la fase mobile sulla colonna

• Stratificare delicatamente il campionesulla fase stazionaria (rubinetto chiuso)

• Aprire il rubinetto e far adsorbire ilcampione nella fase stazionaria

• Aggiungere la fase mobile prima che illetto della colonna vada a secco

• Collegare al reservoir con la fase mobile

• Eluire le proteine: i componenti dellamiscela si muovono lungo la colonna infunzione della loro interazione con la F.S.e con la F.M.

Fase

sta

zio

nar

ia

Fase mobile

ELUIZIONE COLONNA

• A flusso naturale o impostato con una POMPA PERISTALTICA

• La quantità di liquido che esce dalla colonna non deve superare quella cheentra: FLUSSO COSTANTE DURANTE TUTTA LA SEPARAZIONE

• Eluizione isocratica: utilizzo un singolo solvente

• Eluizione non isocratica: la composizione della fase mobile cambia neltempo, durante l’eluizione (varia il pH, forza ionica, polarità)

ELUIZIONE A STEPvariazioni discontinue impartitemanualmente dall'operatore

ELUIZIONE in GRADIENTEvariazioni continue mediante formatoredi gradiente o miscelatore

Soluzione più concentrata

Soluzione meno concentrata

RACCOLTA DELLE FRAZIONI

• L’eluato in uscita dalla colonna viene raccolto In tempi diversi inprovette poste all’uscita della colonna (raccolta manuale) o permezzo di un collettore di frazioni automatico.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

ASS

OR

BA

NZA

(λ)

RIVELAZIONE: Visualizzazione della separazione

L’eluato deve essere analizzato daun RIVELATORE (per es.SPETTROFOTOMETRO) che misurila presenza dell’analita eluito dallacolonna. Riportando il segnale infunzione del tempo si ottiene ilcromatogramma o profilocromatografico o grafico dieluizione

La posizione dei picchicromatografici sull’asse dei tempi =tempo di ritenzione, serve peridentificare i componenti delcampione

L’area sottesa dai picchi èproporzionale alla quantità di ognisingolo componente e può essereutilizzata a scopo quantitativo

TEMPO DI RITENZIONE O DI ELUIZIONE (Tr o Te)

Tr: Tempo impiegato da ciascun composto per attraversare l’intera colonna eeluire dalla colonna, ed essere rivelato dal detector come un picco.Se la separazione della miscela è efficiente e le proteine da separare hanno undiverso Kd, il Tr è differente per ciascuna proteina

Tempo morto

Tempo ritenzione

Tm

Tr

Cromatogramma per una miscela a due componenti:

• il picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcunainterazione con la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempomorto, Tm

• il picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazionecon la fase stazionaria ed esce al tempo Tr > Tm

Volume di ritenzione o di eluizione (Vr o Ve)

Ve: Volume di fase mobile necessario per eluire un analita che abbia uno specifico Tr

Ve = Tr x Fc

(Fc : velocità di flusso della Fase mobile)

Il Volume di ritenzione dipende da:

• Dimensioni della colonna (diametro e lunghezza)

• Dimensioni, forma e porosità delle particelle della fase stazionaria

• Viscosità della fase mobile

SISTEMA CROMATOGRAFICO a bassa pressione

RACCOGLITORE DI FRAZIONI

Posso collegare direttamente la colonna

al raccoglitore di frazioni, e poi leggere l’assorbanza di ogni

frazione allo spettrofotometro

CROMATOGRAMMA(GRAFICO DI ELUIZIONE)

COLONNA

POMPAPERISTALTICA

UV/VISCella a flusso

Misura continua dell’assorbimento

dell’eluato

AλGRAFICO DI ELUIZIONE(CROMATOGRAMMA)

Tempo ritenzione o Volume di eluizione o Numero provetta

ASS

OR

BA

NZA

MIS

UR

ATA

A 2

80

nm

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

280 nm

Matrici: supporto alla fase stazionaria

• MATRICI più utilizzate in CROMATOGRAFIA su colonna:

INORGANICHE:

- SILICE

POLISACCARIDICHE:

• AGAROSIO

• CELLULOSA

• DESTRANO

POLIMERI ORGANICI SINTETICI:

• POLIACRILAMIDE

• POLISTIRENE

Scelta della fase stazionaria è strettamente correlata al tipo di cromatografia

La MATRICE: deve possedere :

- Elevata Stabilità Meccanica (deve permettereflussi di fase mobile elevati)- Stabilità Chimica: inerte e insolubile nella F.

Mobile e nel Campione- Possibilità di essere modificata con l’introduzione di Gruppi funzionali- Elevata densità di gruppi funzionali = ElevataCapacità

• L’interazione avviene tra la proteina e la matrice polimericache è fatta di microsfere con porosità controllata.

• Le proteine interagiscono con i pori delle microsfere e vengonotrattenute in base alla loro dimensione.

• Se una proteina, molto grande, non interagisce con la matriceesce con un volume di eluente pari al Void Volume (volumevuoto, V0).

Si basa sulle DIFFERENTI DIMENSIONI dei soluti da separare

CROMATOGRAFIA PER GEL FILTRAZIONE(o esclusione molecolare)

Livello minimo di sicurezza dell’eluente

Sistema cromatografico semplice dotato di una colonna impaccata con una fase stazionaria per gel-cromatografia

V0

VR

Vtotale

Proteine ad alto

peso

molecolare

Proteine a peso

molecolare intermedio

Proteine a

basso peso

molecolare

Kd + elevatoKd + piccolo

https://www.youtube.com/watch?v=oV5VB5kO3tQ

https://www.youtube.com/watch?v=q3fMqgT1do8

FASI STAZIONARIE: sono commercialmente disponibili diversi tipi gel polimerici, sidifferenziano per il LIMITE DI ESCLUSIONE e l’INTERVALLO o CAMPO DIFRAZIONAMENTO

Nome commerciale Materiale Campo di frazionamento (Da)

Sephadex G-10 Destrano 50 - 700

Sephadex G-25 Destrano 1000 - 5000

Sephadex G-50 Destrano 1500 - 30000

Sephadex G-100 Destrano 4000 - 150000

Sephadex G-200 Destrano 5000 - 600000

Bio-Gel P-2 Poliacrilammide 100 - 1800

Bio-Gel P-6 Poliacrilammide 1000 - 6000

Bio-Gel P-10 Poliacrilammide 1500 - 20000

Bio-Gel P-30 Poliacrilammide 2500 - 40000

Bio-Gel P-100 Poliacrilammide 5000 - 100000

Bio-Gel P-300 Poliacrilammide 60000 - 400000

Sepharose 6B Agarosio 10000 - 4000000

Sepharose 4B Agarosio 60000 - 20000000

Sepharose 2B Agarosio 70000 - 40000000

Sephadex G-200; range di frazionamento 5000-600000 Da

Miscela di analiti caricata in colonna:

Fase mobile: fosfato di sodio 0.05 M + NaCl 0.15 M, pH 7.0

Vit. B12

MbOvalbumin

Transferrin

IgG

Ferritina

Tiroglobulin