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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACION.
EFECTO DE LA MANOSA Y DEL POLIMERO DE
MANOSA SOBRE LAARTERIA MESENTERICA DE RATA
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR ENINVESTIGACION EN MEDICINA
PRESENTA
M.C. Gustavo Guevara Balcázar.
México, D. F. 2009
Esta tesis fue realizada en el laboratorio multidisciplinario del área de bioquímica de la
Sección de Estudios de Posgrado e Investigación de la Escuela Superior de Medicina,
bajo la dirección del doctor:
Guillermo Manuel Ceballos Reyes.
A G R A D E C I M I E N T O S
Al Dr. Ceballos:
Por su apoyo, amistad y confianza absoluta.
Por sus valiosos comentarios:
Dra. Claudia Calzada Mendoza
Dra. Ivonne Ma. Olivares Corichi
Dra. Ma. Esther Ocharan Hernández
Dr. Alfredo Sierra Ramírez
Dr. Carlos Castillo Henkel
Así como a mis compañeros y amigos, en especial a la Sra. Ma Elena Pardave
INDICE
Lista de figuras I
Resumen IV
Introducción 1
Antecedentes 8
Receptores de manosa 18
Justificación 27
Hipótesis 28
Objetivos generales y específicos 29
Material y Métodos 30
Resultados 38
Discusión 49
Conclusiones 56
Perspectivas 57
Bibliografía 58
Lista de figuras.
Figura 1. Capas histológicas de los vasos sanguíneos. 2
Figura 2. Glicocalix. 6
Figura 3. Estructura de los polisacáridos. 10
Figura 4. Estructura de las hexosas. 12
Figura 5. Familia de receptores a manosa. 17
Figura 6. Receptor de manosa y MBP. 20
I
Figura 7. Interacción del Receptor de manosa con microorganismos. 21
Figura 8. Dextran 24
Figura 9. Efecto del flujo sobre la arteria mesentérica. 39
Figura 10. Efecto de la manosa en la arteria mesentérica. 40
Figura 11. Efecto de la galactosa y glucosa en la arteria mesentérica. 41
Figura 12. Efecto del polímero de manosa en la arteria mesentérica. 43
Figura 13. Efecto del dextran en la arteria mesentérica. 44
II
Figura 14. RT-PCR. 46
Figura 15. Arteria mesentérica con FITC. 47
III
RESUMEN
Algunas de las funciones del glicocalix endotelial, se ejercen por interacciones con los
componentes glicosidicos y con glucidos unidos a proteínas con actividad de lectina. Un
ejemplo importante de estos es el receptor de manosa (MR). El MR se ha descubierto en
varios tipos de células, y se sabe que actúan en la fagocitosis y pinocitosis de partículas y
solutos que contengan manosa.
Usando arterias mesentérica presurizada de rata macho (RMA), nosotros evaluamos los
efectos del polímero de manosa en el tono vascular. La RMA fue precontraida con
fenilefrina 10µmol/L, y perfundida con carbohidratos a 20µl/min. La perfusion de D-
manosa libre [1nmol/L a 100µmol/L] produce un vasodilation dependiente de la
concentración en la RMA precontraida, con un efecto máximo del 40% con respecto al
diámetro basal. La perfusion del polímero de manosa [1nmol/L a 100µmol/L] induce un
efecto vasodilatador mayor que es dependiente de la concentración. El efecto máximo de
polímero de manosa alcanzó un 96% del diámetro basal; esta vasodilation no fue
reversible y no fue dependiente de ON y COX. Nosotros comprobamos que la unión
del polímero de manosa fue al endotelio, por el perfusion del polímero de manosa
fluoresceinado; y también, se describió un nivel significante de mRNA de MR en las
arterias mesentéricas. Con todos éstos, nosotros proponemos un nuevo efecto de un MR
en la regulación de tono vascular.
IV
Abstract.
Several of the luminal endothelial glycocalyx functions are exerted via interactions with
glycosidic components and sugar binding proteins with lectinic activity. One important
example is the mannose receptor (MR). The MR has been detected in cell types that
mediate the phagocytosis and pinocytosis of particles and solutes containing mannose.
Using isolated constant pressurized rat mesenteric arteries (RMA), we evaluated the
effects of a mannose polymer in the vascular tone. RMA were pre-contracted with
10µmol/L phenylephrine and carbohydrates were perfused at 20µl/min. Perfusion of free
D-mannose [1nmol/L to 100μmol/L] induced a concentration-dependent vasodilation of
pre-contracted RMA. Perfusion of mannose polymer [1nmol/L to 100μmol/L] induced a
larger effect in a concentration-dependent vasodilation. Mannose polymer’s maximum
effect reached a 96% of basal diameter; this significant vasodilation was not NO- or
COX-dependent effect. We corroborated the binding of the mannose polymer to the
endothelial lumen, by perfusion of a fluorescently labeled mannose polymer; and also, we
detected a significant level of MR mRNA in whole mesenteric arteries. With all these, we
proposed a novel effect of a MR in the regulation of vascular tone.
v
1
INTRODUCCION.
El sistema circulatorio actúa como medio de transporte de la sangre, así como en la
distribución en ella de substancias esenciales hacia los tejidos, y en la remoción de
productos del metabolismo, también comparte funciones de regulación de mecanismos
homeostáticos, como son; control de la temperatura corporal, comunicación humoral a
través del organismo, transporte de oxigeno y suplemento de nutrientes.
La principal función del sistema arterial, pulmonar y sistémico es la de distribución de
sangre hacia el organismo a través de los lechos capilares.
Existen cuatro tipos de vasos sanguíneos; arterias, arteriolas, capilares y venas, en general
las paredes de los vasos consta de tres capas: La túnica íntima, formada por una capa de
células endoteliales, las cuales se encuentran en contacto con la sangre. La túnica media,
limitada en cada uno de sus lados por una capa de tejido elástico y consta de una capa
circular de músculo liso, la cual esta rodeada por elastina y colágeno, esta capa se encuentra
inervada por fibras nerviosas simpáticas, y provee la fuerza mecánica de los vasos
sanguíneos, la cual es nula o casi inexistente en los vasos sanguíneos venosos y capilares.
La última capa es la túnica adventicia, esta es una línea de tejido conectivo que sirve para
anclar el vaso sanguíneo en su sitio.
2
Figura 1. Capas histológicas de los vasos sanguíneos.
Existen dos tipos vasos sanguíneos: de resistencia y de conductancia. Las arterias de
resistencia se sabe que juegan un papel muy importante en la generación de la resistencia
vascular periférica y están involucradas en el control de la distribución local de sangre y de
la presión capilar (54). Las arterias de conductancia son vasos que presentan una resistencia
al flujo inmutable y relativamente baja Las regiones que están entre el corazón, la aorta y la
arteria pulmonar y sus mayores ramificaciones, constituyen un sistema de conductos de
considerable volumen y de distencibilidad. (54).
3
El músculo liso de los vasos sanguíneos manifiesta un grado de tensión en reposo conocida
como “tono”. Los cambios en el tono vascular, modifican el diámetro de los vasos
sanguíneos, y esto da como resultado cambios en la resistencia vascular (54, 61).
El flujo intraluminal puede causar, tanto incremento, como decremento, en el tono vascular
de las arterias de resistencia y de venas pequeñas (4)
Los vasos sanguíneos responden a la elevación de la presión transmural con constricción y
con dilatación a una disminución de esta. A esta condición se le conoce como tono
miogénico, el cual es inherente al músculo liso, este es más pronunciado en arteriolas, pero
puede presentarse ocasionalmente en arterias, vénulas, venas y linfáticos (19). El tono
miogenico es el mayor determinante de la resistencia periférica y de la perfusión hacia los
órganos,
Muchos estudios han tratado de elucidar los mecanismos, a través de los cuales se modula
el tono miogénico, y varias posibilidades han sido propuestas: por canales iónicos,
transporte de iones, sistemas enzimáticos y segundos mensajeros, sin embargo, todavía el
mecanismo exacto no está completamente entendido (76). El tono vascular es regulado por
el sistema nervioso, hormonas circulantes y productos vasoactivos producidos por el
endotelio (54).
Mecanismos Fundamentales en la Respuesta Vascular Miogenica.
La regulación del tono vascular es dependiente del balance de los principios
vasoconstrictores y vasodilatatadores.
El endotelio también contribuye a la regulación del flujo así como de la presión sanguínea,
por medio de la liberación de sustancias vasodilatadoras, como, la prostraciclina y el oxido
nítrico, así como también de vasoconstrictores como la endotelina, el factor activador de
plaquetas, entre otros.
4
Como se ha mencionado el endotelio participa activamente en la vasoconstricción o
vasodilatación del vaso, pero también tiene otras características importantes: 1) Propiedades
anticoagulantes. 2) Permeabilidad selectiva .3) Remodelación y regulación del crecimiento
vascular. 4) Control del tráfico leucocitario durante reacciones inflamatorias.
El endotelio cuando se encuentra con un estimulo fisiopatológico, modula su fenotipo y se
activa, esta activación puede contribuir en un aumento de la adhesión de leucocitos;
incremento en la permeabilidad a proteínas plasmáticas y alteración en el balance en la
generación de sustancias vasoactivas, sustancias pro y anti trombogenas y estimuladores e
inhibidores del crecimiento vascular (12).
El endotelio presenta una forma plana y elongada, en el sentido del flujo, forma una
monocapa aproximadamente de 0.2-4 m de grosor y de 20 m en la parte del núcleo, que
cubre la superficie luminar de los vasos sanguíneos, se le considera que es el mayor “órgano”
del cuerpo, ya que cerca de 6 trillones de células, cubren aproximadamente un área de
5000m2, la cual forma la red vascular y representando cerca del 1% del peso corporal (12).
El endotelio vascular está cubierto en su superficie luminal, por un complejo molecular,
llamado glicocalix, este se encuentra asociado a; proteoglicanos (polisacáridos unidos a
proteínas), glicosaminoglicanos (están formados por mono, oligo o polisacáridos unidos a
proteínas o lípidos), glicoproteínas (carbohidratos unidos a proteínas), glicolipidos
(carbohidratos unidos a lípidos), y proteínas plasmáticas (35 ,57).
Estudios de microscopia intravital han proporcionado evidencia in vivo, que el glicocalix en
la superficie del endotelio tiene un grosor aproximado de 0.20 a 0.87 m (32, 33,35, 53, 59,
71).
5
EL glicocalix está expuesto directamente hacia el flujo sanguíneo (figura 2); tiene
propiedades antitrombogénicas y participa en la modulación de la interacción leucocito-
endotelial (69).
También participa en la resistencia al flujo microvascular (60,57), aumenta la glicosilación
de estructuras que pueden traducir los estímulos hemodinámicos en la modulación de
homeostasis del parénquima. Hay suficiente evidencia in vivo para sugerir que
componentes del glicocalix se vierten en la señalización
para la transducción de eventos común a la inflamación (32, 34,47), isquemia-reperfusion
(53,57 ), y el proceso de la ateroesclerosis (9).
Se cree que algunas de las funciones del glicocalix endotelial, son ejercidas por
interacciones con componentes glicosídicos y con proteínas unidas a carbohidratos con
actividad de lectina (6, 21, 37). Las lectinas son proteínas no enzimáticas, que presentan
dominios que se unen a carbohidratos de membrana y que presentan funciones
principalmente relacionadas con el sistema inmune, las lectinas se encuentran tanto en el
reino animal como en el vegetal (30).
6
Figura 2, Glicocalix en la superficie arterial.
7
Interacciones entre células o entre sustratos envuelven a receptores específicos y sus
ligandos, varios receptores en la superficie de las células se han descubierto en las pasadas
décadas, por ejemplo proteínas que se unen a carbohidratos, las lectinas son de interés
particular por que interactúan con glicoproteinas, glicolipidos y proteoglicanos, (31).
Se ha propuesto que para el estudio de los efectos fisiológicos de la interacción carbohidrato-
lectina-glicocalix, pueden emplearse in vitro, preparaciones de arterias de resistencia. Uno
de los lechos vasculares, en los cuales pueden llevarse al cabo este tipo de estudios in vitro,
son las arterias mesentéricas, existen diversos estudios realizados en estos vasos, esta dado
en ramificaciones principales de primer y segundo orden.
Las arterias mesentéricas, son arterias de resistencia presentan una gruesa capa muscular y
son capaces de producir una intensa vasoconstricción, las venas mesentéricas presentan
menor capa muscular, son altamente distensibles y por lo tanto son reservorio sanguíneo, las
funciones de las arterias, son la de regular el flujo sanguíneo en el intestino delgado y la de
reservorio esplacnico.
En este trabajo empleamos una preparación de arterias mesentéricas de un diámetro de
287 m aproximadamente, presurizadas y con un flujo de 20 l, para los estudios de los
posibles efectos inducidos, por el monosacárido manosa, en la función vascular, asi como
para explicar la posible existencia de un receptor especifico en la superficie endotelial.
8
ANTECEDENTES
Los carbohidratos constituyen un importante grupo de compuestos que se encuentran en
todos los seres vivos.
De acuerdo a su complejidad estructural y concomitante con su peso molecular, los
carbohidratos se dividen en cuatro categorías:
Monosacáridos; son carbohidratos que no pueden ser hidrolizados a otros más simples, por
ejemplo, las triosas (glicerladheido, dihidroxiacetona), tetrosas (eritrosa), Pentosas (ribosa,
deoxiribosa, xilosa), y Hexosas (glucosa, galactosa, manosa).
Oligosacáridos; son polímeros de varios monosacáridos (2-10) como la maltosa, sacarosa.
Glucosaminoglicanos; polisacáridos no ramificados formados por unidades de disacáridos
repetidos, en los cuales uno de sus carbonos esta sustituido por un grupo amino, acetilo o
sulfato.
Polisacáridos; constituidos por una gran número de monosacáridos, una molécula polimerica
de alto peso molecular, (glucagon, almidón) figura 3. (68).
Los constituyentes más comunes de los glicanos (azucares que se encuentran en las
glicoproteínas y en los glicolipidos) son las hexosas, 4 de los 6 carbonos presentes son
centros quirales, por que están unidos a 4 grupos distintos, solo unas cuantas hexosas son
comúnmente encontradas en los glicoconjugados (proteínas o lípidos unidos a carbohidratos)
entre ellos se encuentras la glucosa, galactosa y la manosa (63,68).
La D-glucosa es un hidrato de carbono que es epímero de la D-manosa en posición dos y
9
en posición 4, de la D-galactosa (figura 4). Esta pequeña diferencia entre estos azucares,
les confieren a cada una de ellas, funciones específicas, así como diferentes vías metabólicas
(15).
10
Figura 3 Estructura de los polisacáridos
11
En este estudio el interés se centra en la D-manosa. A nivel celular, la D-manosa se emplea
en la biosíntesis de oligosacaridos y de glicolipidos. En condiciones normales, no parece
hacer una gran contribución al metabolismo general, la concentración sérica de la manosa es
de 20-50 M por lo menos 100 veces menor que el de la glucosa (51). Varios estudios han
demostrado que la D-manosa puede convertirse en glucógeno, cuando hay una ingestión
excesiva en la dieta. Es metabolizada en el organismo a glucosa a nivel celular. A nivel
extracelular es probable que sea una fuente para la síntesis de glicoproteínas (51).
La manosa plasmática probablemente tiene su origen en la dieta (8). Los residuos de D-
manosa tienen un papel importante en la síntesis de un gran número de proteínas congujadas
en el retículo endoplasmico, y también para su transporte hacia el aparato de golgi, para su
secreción o translocación hacia la membrana plasmática
12
Figura 4. Estructura química de las principales hexosas: glucosa, galactosa y manosa
(2). La manosa también juga un papel muy importante en la respuesta inmune, ya que la
pared celular de microorganismos patógenos, virus y parásitos son ricos en este carbohidrato,
produciendo una respuesta del organismo y originando que los residuos de manosa sean
reconocidos por estructuras especializadas (Receptores a Manosa), que pueden estar
localizadas en el suero, en los macrófagos o en el endotelio de ciertos órganos. (42, 72).
Las estructuras que reconocen a los residuos de manosa están compuestas de dominios de
reconocimiento a carbohidratos que se encuentran unidos a un esqueleto de lectina (son
proteínas capaces de unir moléculas de azucares que son ubicuas en el organismo de seres
13
vivos y que se pueden unir al exterior de las células y causar cambios bioquímicos en ellas).
Existen varios tipos de receptores los cuales reconocen residuos de manosa en los
microorganismos, el primero se localiza en el suero, es una proteína soluble (mannose bindig
protein, MBP) que se une a la manosa y activa la vía alterna del sistema del complemento,
este receptor tiene afinidad a carbohidratos que se localizan en la superficie de los
microorganismos, para neutralizar al patógeno (10, 11, 18 , 73). El MBP se localiza
circulando en el torrente sanguíneo con funciones inmunológicas que activan el sistema del
complemento vía lectina, la cual requiere de producción especifica de anticuerpos y de
celulas T citotóxicas en respuesta a la presencia de sustancias extrañas, la cual activa el
MBP, contra microorganismos patógenos.
La lesión producida, después de la restauración del flujo sanguíneo. Después de un episodio
de isquemia-reperfusion en corazón, trae como consecuencia un cambio morfofisiologico en
los miocitos y por lo tanto daño en el miocardio, esta lesión da como resultado que los
miocitos sean órganos blanco para que el sistema inmune, en particular el sistema del
complemento. El sistema del complemento en una ruta que forma parte del sistema humoral,
este sistema puede ser activado por varias vías: la vía clásica actúa uniéndose a las porciones
del anticuerpo Fc de los complejos antigenos-anticuerpos. La vía alterna se activa por el
reconocimiento de microorganismos patógenos, y la vía de la lectina se activa por el
reconocimiento de la exposición a carbohidratos, es en esta vía donde el MBP actúa (36,
73).
El MBP actúa uniéndose a la superficie de microorganismos y activando al MBP asociado a
serinproteasa, que activa al complejo C2-C4 y después actúan con la C3 y esta interviene en
la fagocitocis de patógenos por medio de un receptor que se localiza en la superficie de los
macrófagos (68)
14
El segundo grupo de lectinas, es el que se encuentran fijas a la superficie membranal del
endotelio y de los macrófagos, en este rubro podemos encontrar a la familia de receptores a
manosa.
La familia de receptores a manosa, es un subgrupo de una superfamilia de lectinas que
comprende a 4 miembros; al Receptor de manosa(MR, CD206), al Endo180(CD180), el
receptor de fosfolipasa A2 (PLA2R) , y el Dec-205(CD205) (figura 5).(15). La
superfamilia de lectinas tipo C son un grupo de receptores transmembranales y de proteínas
solubles, incluidas las selectinas (proteínas membranales tipo C que regulan la adhesión de
leucocitos a las células endoteliales), asialoglicoproteinas ( lectina tipo C la cual se une a
residuos de galactosa) y colectinas (MBP)(13). Esta agrupación familiar está basada en una
conservación estructural global que esta presente en los cuatro receptores,
que contienen un dominio extracelular grande, que comprende una N-terminal, seguidos por
un dominio rico en cisteína, un dominio tipo de fibronectina II, y de 8 a 10 dominios de
lectina tipo C ( son glicanos unidos a proteínas, que se unen a carbohidratos y que son
dependientes de calcio) (CTLDs). Esta familia de receptores tiene dos características
principales; aunque ellos pertenecen a la superfamilia de lectinas tipo C, ellos contienen
CTLDs múltiples dentro de una sola cadena polipeptídica. También, comparten la habilidad
de ser reciclados entre la membrana plasmática y a los compartimientos intracelulares de la
célula (64).
Sin embargo a pesar de que comparten una estructura común, algunos receptores de esta
familia no tienen función de lectina, como por ejemplo el receptor a fosfolipasa que modula
la interacción proteina-proteina (15), solo el MR y el Endo 180 se unen a monosacáridos. En
el MR el dominio rico en cisteína actúa como dominio de lectina al unir glicoproteínas con 4
sulfatos N-acetilgalactosamina 4 unido a N-acetilglucosamina (4-SO4-
15
GalNAc 1,4GlcNAc las cuales se encuentran en hormonas pituitarias, como la
lutropina (hormona luteinizante) y la tirotropina (hormona estimulante de la tiroides).
Estudios recientes han demostrado que los dominios ricos en cisteína también pueden unirse
a dos clases de carbohidratos. El condritin-4- sulfato con terminal 4-sulfato N-
acetylgalactosamina que está unido por un enlace 1-4 al acido iduronico (condritin sulfato
B) o también con el ácido glucóronico. Al segundo tipo pertenecen aquellos con terminación
3-galactosa sulfato 1-4 o con 1-3 unido a N-acetilglucosamina el cual presenta un antígeno
sulfatado de Lewis. También ha sido reportado que une residuos sulfatados de proteínas
transmembranales de las sialoadhesinas y de las CD45.
Mientras que el análisis en la secuencia de la fibronectina tipo II en todos los miembros de
esta familia, presentan una función similar al unir colagena a este dominio, la fibronectina es
una glicoproteína de la matriz extracelular que contiene múltiples dominios incluyendo 2 del
tipo 2 los cuales pueden desnaturalizar colagena.
La caracterización inicial de la familia de receptores para manosa, describe que estos
presentan múltiples dominios de lectinas tipo C o dominios de reconocimiento a
carbohidratos (CTDLs), pero es claro que no todos los dominios tienen actividad de lectina.
Las CTDL contienen aproximadamente 120 aminoácidos formando la estructura, la
interacción con carbohidratos ocurre en la zona hidrofobica en la cual se unen por
coordinación de iones Ca+2
, cada miembro de esta familia contiene múltiples CTDL.
Los miembros de esta familia tienen diversas funciones, por ejemplo; El RM actúa
uniéndose e internalizando glicoproteínas potencialmente dañinas con residuos terminales de
manosa, fucosa o N-acetilglucosamina, también el RM actúa en la fagocitosis de una gran
variedad de microbios incluidos hongos, protozoarios, levaduras y bacterias, todos ellos
16
presentan una gran cantidad de residuos de manosa en sus membranas celulares (16,77). El
Endo180 está relacionado con la remodelación de la matriz extracelular a
través de interacciones con colagena, y en estudios in vivo ha sido implicado en la mayor vía
de recambio durante procesos patológicos. El PLA2R puede internalizar enzimas solubles a
fosfolipasa A2, El DEC-250 está envuelto en la internalización de antígenos presentados por
linfocitos T. (15, 16).
17
18
Figura 5. Estructura de la familia de receptores a manosa. Diagrama de la estructura de los
dominios de la familia de receptores a manosa, se muestran los dominios ricos en cisterna,
seguidos por los dominios a fribonectina II y los múltiples dominios de reconocimiento a
carbohidratos, aunque pertenecen a la misma familia, existen diferencias marcadas entre
ellos, por ejemplo el Endo 180 y el Receptor a Manosa, tiene la capacidad de unirse a
monosacáridos.
Receptor de manosa.
El MR fue originalmente llamado receptor de manosa en macrófago, pero su expresión no
solo esta restringida a macrófagos, el receptor fue inicialmente descrito en macrófagos
alveolares de conejo, siendo un receptor transmembranal con un peso molecular de 175 kDa,
que reconoce enzimas glicosiladas lisosomales, cadenas de sacáridos con manosa, fucosa o
n-acetilglicosamina terminales, el interés inicial en su estudio se centro en habilidad para
reconocer e internalizar monosacáridos y a enzimas lisososmales. Los CTDL del receptor de
manosa son dependientes de calcio y se unen a residuos terminales de manosa, fucosa y N-
acetilglucosamina,, la actividad de unión fue localizada en las CTDLs 4-8 y el análisis por
separado de estos dominios revelan que solo CTDL 4 se une a monosacáridos, sin embargo
CTDLs 5-8 presentan una débil unión a azucares y son capaces de internalizar conjugados de
manosa con albumina bovina, aunque ineficientemente, la actividad de unión a azucares por
parte de las CTDLs 6-8 es nula, y
19
esto indica que solo la CTDL 4 y 5 son capases de unir a monosacáridos y que esta unión es
dependiente de calcio (15,48,49). El CTDL 4 también presenta una similitud estructural con
el dominio central del Mannose binding protein (MBP), con 2 hélices y 2 listones en el
RM la CTDL4 como en muchas otras CTDL de receptores de esta familia, tienen una unión
disulfuro adicional entre la hebra 1 y el asa 0. (figura 6). A pesar de que las dos ocupan 5
residuos de calcio en el sitio principal existen diferencias en esta unión.
20
Figura 6. Comparación entre MBP y el receptor de manosa , existe similitudes entre el RM
en el dominio CTDL4 y el MBP.
MR se le ha relacionado con algunas de las funciones de los macrófagos y de las células
endoteliales (45). Este proceso de endocitosis esta mediado por la polimerización focal de F-
actina, y de la activación de Rho-GTPasa, y de la activación de la p21 kinasa (78). Sin
embargo, sin conocer bien la función del MR, también ha sido asociado con procesos que
afectan la función vascular, como la producción de prostaglandinas por los macrófago
humanos (17,41).
21
El receptor de manosa (MR), se expresa también enhígado, bazo y de células de endoteliales
de microvasos dérmicos (3,25,44). MR juega un papel importante en la homeostasis de estos
tipos celulares. Estos dominios son dependientes de calcio, sensibles al pH y tienen una alta
afinidad y selectividad por residuos terminales de manosa (figura 7).
22
Figura 7. Interacción del receptor de manosa con microorganismos patógenos, y tipos de
bacterias susceptibles al receptor.
DEC-205
Este receptor es quizás el menos conocido de esta familia, fue identificado en las células
dendríticas del ratón, DEC-250 se expresa principalmente en el epitelio de la corteza del timo
y en las dendritas, pero también pueden ser detectadas, pero en niveles muy bajos , en
linfocitos B y T y en otro tipo de células epiteliales, sin embargo presenta diferente patrón de
expresión que se presenta en otros miembros de la familia ( MR y Endo 180), y su actividad
inmunológica se encuentra relacionada con los linfocitos (7). Recientes reportes indican que
la familia de proteínas Rho , Cdc 42 y Rac, así como también acuaporinas, son un importante
factor que regula la endocitosis en las DEC-250 (26)
Receptor a fosfolipasa A2
Es un receptor transmenbranal, actúa como receptor endógeno que induce proliferación y
migración celular y también actúa como mediador en la producción de lípidos, así como en
la liberación hormonal y producción de citoquinas (28). Fue por primera vez clonada
en el musculo esquelético de conejo y el análisis de la secuencia, revela que tiene el 29% de
afinidad con el RM. (15).
Endo 180
Este receptor fue identificado como un receptor endocitico reciclado que se expresa en
fibroblastos, su clonación demostró que se encuentra en diversos tejidos y que generalmente
está restringido a la superficie celular, macrófagos y de células endoteliales, es un receptor
23
dependiente de calcio, su actividad de lectina tipo C, parece ser más activo en el CTLDs 2
con una posible interacción con CTLDs 1 (5,15).
En esta familia de receptores como se ha visto, presentan principalmente funciones
relacionadas con inmunidad y modulación del daño por isquemia en algunos organos, pero
dada su localización en la superficie celular del endotelio (de órganos específicos), y su
contacto directo con el flujo sanguíneo, se ha planteado que estos receptores pudieran estar
relacionados con otros proceso metabólicos. El receptor de manosa, que presenta mayor
afinidad por monosacáridos y que puede utilizar solo un dominio de unión para interactuar
con monosacáridos, en especial por la manosa, puede estar involucrado en respuestas
vasculares.
Rubio I, y col. demostraron que la perfusión intracoronaria de dextran-manosa (0.1pmol/L
a 1nmol/L), en el corazón de cobayo, produce un aumento en el inotropismo, este
inotropismo fue mediado por un lectina proteica como el MR presente en el endotelio
coronario (58). En otro estudio similar, se planteó que cambios en el flujo coronario
modulan la oxigenación, el metabolismo de glucosa y otra funciones vasculares, son a través
de a la deformación de la matrix extracelular , sugiriendo que el shear stress actúa sobre las
proteínas que están presentes en la membrana luminal del endotelio siendo esto a través de
sus moléculas asociadas.
En estudios previos, con la finalidad de explorar los efectos de la manosa sobre la superficie
endotelial, se han utilizado polímeros macromoleculares de manosa, con los cuales se
restringe la presencia del sacárido al lumen vascular
24
Se ha empleado dextran solo y unido a manosa, para confinar el efecto de la manosa sobre la
luz del vaso, ya que con el peso molecular del dextran (260 mil kDa) se hace imposible la
libre difusión de la manosa, con lo que sus efectos se limitan a la interacción con las
moléculas de superficie.
Dextran
El dextran es un polímero de glucosa de alto peso molecular, se obtiene de la fermentación
de la remolacha de azúcar con la bacteria Leuconostoc mesenteroides B512F. Las fracciones
del dextran, son derivados de la hidrólisis del dextran nativo, obteniéndose fragmentos de
distintos pesos moleculares, propiedades y usos.
Es un -D-(1-6) unido al glucano con cadenas laterales unidas a O-3 del esqueleto principal
(Figura 8). El grado de ramificación es aproximadamente del 5%. Las ramificaciones son en
su mayoría de 1 a 2 unidades de glucosa de longitud (Khalikova).
Figura 8 Estructura del dextran.
25
Las soluciones de dextrán han sido utilizadas a nivel clínico como expansores de plasma.
Soluciones del 10% de dextrán (40-70KDa) ejercen una presión osmótica coloidal similar a
la de las proteínas (23). Con una función renal normal, el 70% de dextrán administrado vía
intravenosa, es eliminado en las primeras 24 h vía urinaria, el remanente es metabolizado
lentamente, otra pequeña cantidad es eliminada por heces. El dextrán de alto peso molecular
(250 000 a 2, 000,000) es metabolizado lentamente a glucosa y CO2 por las dextranasas que
han sido identificadas en bazo, hígado, intestino y riñón (79).
Las fracciones del dextran van desde 1000 a 2 millones de Da, son fácilmente solubles en
agua y en soluciones electrolíticas, dando soluciones claras y estables, el pH no afecta
significativamente la solubilidad. Algunas fracciones también son solubles en solventes
como glicerol, etilenglicol, formamida y dimetilsulfòxido.
Los conjugados de dextran ofrecen una solución a muchos problemas en el diseño de drogas.
Los conjugados de dextran pueden: potenciar la solubilidad del fármaco, potenciar la
estabilidad del fármaco e incrementar el tiempo de vida media del conjugado en el plasma
(Rodríguez).
No se han reportado efectos dañinos del dextran cuando se ha evaluado su toxicidad aguda,
subaguda o crónica y carcinogenicidad (79).
Las fracciones de dextran son ideales para esta tecnología, pues son neutrales, solubles en
agua y sustancias biocompatibles fácilmente disponibles en alta pureza.
En nuestro trabajo el dextran conjugado con manosa es utilizado en concentraciones
fisiológicas del monosacárido. El diámetro del complejo es mayor a 1 m lo que permite
mantener el estimulo de la manosa dentro del espacio intravascular y en contacto directo
26
con el endotelio, y en consecuencia, la concentración del dextran es baja y no induce grandes
cambios en la viscosidad de la solución.
En este trabajo, se utilizaron arterias mesentéricas de rata macho para analizar los efectos
producidos por la manosa, sabiendo que varias funciones fisiológicas importantes en los
microvasos son afectadas por las características de la superficie del endotelio . Este trabajo
esta basado en resultados previos en donde se mostro que el aumento en la contracción del
miocardio inducida por manosa, podría relacionarse con un efecto vasodilatador en el
corazón del cuyo aislado. Asumimos que el MR está presente y funcional en el endotelio de
vasos de resistencia (<300µm) y podría estar involucrado en la respuesta al flujo vascular.
Por consiguiente, evaluamos los efectos vasodilatores en la perfusión intraluminal de D-
manosa en arterias precontraidas con fenilefrina; también se evaluó el sitio probable de
acción de la D-manosa confinándola intraluminalmente, con un polímero de manosa con
peso molecular alto que no permite su difusión a través del endotelio. Además, se utilizo RT-
PCR para demostrar la presencia de mRNA de MR en las arterias de mesentérica de rata.
Nosotros también exploramos la participación de cyclooxigenasa (COX) y del óxido nítrico
en los efectos que la manosa produjo en la arteria mesentérica de rata.
27
JUSTIFICACION.
Las células endoteliales están constantemente expuestas a fuerzas hemodinámicas, las
cuales tienen un impacto profundo en su morfología, y así como en sus respuestas
funcionales. En la superficie se localizan ramificaciones de proteoglicanos (glicocalix),
cuya deformación por el flujo, e interacción con sacáridos, juega un papel importante en la
mecanotrasduccion, entre ellos se encuentran algunos receptores de la familia a manosa,
siendo el más estudiado el RM.
El receptor de manosa, relacionado principalmente con procesos de inmunidad. En el
sistema cardiovascular (corazón aislado de cobayo) se ha demostrado que la administración
del polímero dextran-manosa, produce un efecto inotropico positivo dependiente de la
concentración. Lo cual nos sugiere que el receptor de manosa se puede localizar en lechos
vasculares, función no directamente relacionada con procesos inmunes, de ahí la necesidad
de comprobar si este receptor se encuentra en lechos vasculares y si posee función diferente
a las conocidas. De aquí que las siguientes preguntas:
¿Que efectos se pueden presentar si se perfunde manosa libre y el polímero de manosa en
situaciones controladas de presión, flujo en una arteria de resistencia como lo es la arteria
mesentérica de rata? ¿Los efectos inducidos por el complejo dextran-manosa serán
similares a los inducidos por la manosa libre?, ¿Existe un receptor para manosa en estas
arterias?
28
HIPOTESIS
La perfusión de manosa y del complejo dextran manosa en el lumen vascular de la arteria
mesentérica ejercerá un aumento en la relajación en arterias precontraidas con fenilefrina,
este efecto se llevara al cabo por la deformación del glicocalix, presente en la superficie
endotelial, y que esta mediada probablemente por la presencia del receptor de manosa, y
que este efecto sea confinado en el lumen arterial, por el tamaño del complejo dextran
manosa y se comprobara por medio de fluorescencia marcando el complejo.
29
OBJETIVOS GENERALES
Determinar si la perfusión de manosa libre y de dextran-manosa ejerce un efecto sobre el
receptor de manosa en el endotelio, produciendo un efecto vasodilatador en las arterias
mesentéricas de rata, y determinar también si este estimulo se da en la superficie endotelial.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Determinar si el receptor de manosa se encuentra presente en la arteria mesentérica de
rata.
2. Demostrar la localización del receptor de manosa en la arteria mesentérica.
3. Determinar el posible mecanismo de acción de la manosa libre y del dextran-manosa.
30
MATERIAL Y METODOS
El protocolo experimental fue revisado por el comité de ética del la Escuela Superior de
Medicina del Instituto Politécnico Nacional, México. Los reactivos fueron adquiridos por
Sigma-Aldrich (St Luis MO).
Obtención de la arteria mesentérica.
Se utilizaron ratas Wistar macho (250-300g), se anestesiaron con pentobarbital sodico
(60mg/Kg. intraperitoneal). Se ventilaron mecánicamente a través de una cánula
endotraqueal. Se realizó una incisión en abdomen medio para exponer el intestino delgado
y mesenterio, este se cortó rápidamente y se sumergió en una solución de Krebs-Henseleit
fría ( mmol/L) NaCl 117.8; KCl 6; CaCl2 1.75; MgSO4 1.2; NaH2PO4 1.2; NaHCO3 24.2;
glucosa 5 y el piruvato de sodio 5; la cual fue equilibrada con 95% O2 5% CO2, pH 7.4.
Fueron separados segmentos de 2 a 3mm de la segunda rama de la arteria mesentérica
superior. Una vez retirado el tejido adiposo que rodea la arteria, fue transferida y canulada
en un par de micropipetas en una cámara con temperatura y pH controlado, esta es
cuidadosamente montada en un microscopio invertido (el Eclipse de Nikon TS100, Japón)
(14, 46,).
Las arterias mesentéricas son perfundidas y superfundidas con solución de Krebs-Henseleit
31
a 37 C y burbujeada con 95% O2 y 5% CO2, a lo largo del experimento. Cada arteria del
mesenterio se estabilizó por 5min con perfusión fisiológica (20 l/min), para remover la
sangre restante, detritos y metabolitos. Después, se mantiene sin flujo durante 60 minutos,
y a una presión fisiológica (60mmHg). La presión se mantuvo constante por medio del
presure servo control (LSI) conectado a un transductor. El tono arterial se visualizó en un
objetivo 4X (NA0.10; Nikon, Japón) y una cámara de CCD (XC-73 Ejemplar, SONY
Japón) y fue usado para capturar la imagen. La imagen se proyectó en un monitor y
digitalmente se grabó. Las dimensiones del diámetro del lumen y espesor de la pared eran
hechas con un analizador de video (LSI), como esta descrito previamente (27).
Síntesis del polímero de manosa
El polímero de manosa se sintetizó de una matriz de dextran de un peso molecular de
260,000 Da, usando el método descrito por Di el Virgilio et al (Di el et de Virgilio al 1999).
Brevemente, 1g de dextran (260,000 Da) se disolvió en 100ml de 0.5mol/L de una
solución de carbonato de sodio (pH 9.0). Divinilsulfona (DVS, 10ml) se agregó lentamente
gotas de divinilsulfona (DVS, 10ml) en agitación constante por un periodo de15min. La
reacción se mantuvo durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). 10mg de D-manosa se
disolvieron en 10ml de 0.5mol/L de solución de carbonato de sodio a pH 9.0 se agregó a la
32
solución dextran-DVS. La reacción se mantuvo durante una hora adicional a RT. La
adición de 5ml de etilendiamina bloquea el exceso de grupos no reactivos y se continúo
agitando por una hora. Para remover la D-manosa y etilendiamina libre, el polímero de
manosa fue extensivamente el dializado, usando una membrana de 10,000 PM, con agua
destilada a temperatura ambiente. El polímero de manosa se precipitó con el etanol
absoluto, se secó y se guardo en un ambiente seco. Para medir la cantidad de manosa que se
unió al polímero, nosotros medimos azúcares reducidos con acido 3,5-dinitrosalicilico,
según el método previamente descrito (65,66). El polímero de manosa tiene 3.5mg de
manosa por g de polímero.
Protocolos experimentales.
La arteria mesentérica fue fijada longitudinalmente in situ y a una presión intraluminal de
60mmHg sin perfusion durante 1hora. Después de este periodo se comprobó que las
arterias presentaran tono miogénico, Todos los experimentos se realizaron una vez que la
arteria mesentérica desarrolló tono miogénico constante por un periodo de15 minutos. La
presión de perfusion utilizada en todos los experimentos fue similar a la presión que se
presenta en las arterias in vivo.
Para determinar la respuesta de la arteria mesentérica al flujo, se realizaron curvas dosis-
33
respuestas a distintos flujos de perfusion en las arterias (20 l/min cada 5min) de 20 a 100
l/min a presión constante (60mmHg), sin estar precontraida con fenilefrina. El diámetro
de la arteria fue medido en cada cambio de flujo. La vasoconstricción de las arterias
mesentéricas fue evaluada por la adición de fenilefrina en la solución de Krebs-Henseleit
presente en la cámara. La concentración de fenilefrina se evaluó de 1nmol/L a 1mmol/L.
En cada incremento de la concentración, la arteria fue lavada. La presión del perfusion se
mantuvo constante a las 60mmHg durante todo el experimento. El tono arterial fue
medido como efecto máximo desarrollado para cada concentración de fenilefrina.
Las arterias mesentéricas fueron precontraídas con fenilefrina 10µmol/L, la cual induce
una vasoconstricción máxima del 80% para evaluar el efecto del flujo. 5 minutos
después, el flujo fue incrementando de 20 a 100 l/min, con incrementos de 20 l/min cada
5min a una presión constante de 60mmHg, durante todo el experimento, el diámetro arterial
fue medido para cada concertación de fenilefrina.
Se realizaron otros experimentos para evaluar el efecto de los monosacáridos y de dos
polisacáridos con peso molecular alto en las arterias mesentéricas. Después de equilibrar
la presión del perfusión a 60mmHg por una hora, la arteria del mesentérica fue precontraída
con fenilefrina 10 mol/L, e incubado por 5 minutos después de este periodo, fue
34
perfundido intraluminalmente la D-manosa, la D-glucosa, D-galactosa, el dextran (260 000
Da), y el polímero del manosa de 1nmol/L a 100µmol/L. El diámetro de arteria fue medido
en cada concentración.
Detección del mRNA del receptor de manosa y determinación del sitio de unión del
polímero de manosa en la arteria mesentérica.
Para evaluar la presencia del receptor de manosa en las arterias mesentéricas, se extrajo el
RNA total y se realizo RT-PCR para evaluar el mRNA de MR de arterias mesentéricas.
Brevemente, después de extraer las arterias mesentéricas de rata, los tejidos fueron puestos
en nitrógeno líquido y posteriormente se almacenaron a -80 C. El RNA total fue extraído
usando Pefect RNA. Eucarioti Mini (Eppendorf, Boulder CO). El RNA aislado fue
cuantificado usando el GENESYSTM 10 series (ThermoSpectronic) y 5µg de RNA se
puso en un gel de agarosa al 1%, con bromuro de etidio en un buffer de MOPS, El buffer
de corrida y el gel contienen 0.2mol/L de paraformaldehido. Para prevenir contaminación
del DNA, se trataron las muestras de RNA con DNAasa (Invitrogen, Carlsbad CA) antes
de la transcripción inversa. Todas las muestras de RNA se guardaron a las -80C hasta su
futuro uso.
La Síntesis del cDNA y el ensayo en tiempo real: Nosotros usamos 0.5µg de RNA para la
transcripción inversa con hexameros al azar en 20µl, usando el kit de síntesis de
35
transcriptor de hebra de cDNA ( Diagnóstico de Roche GmbH, Basilea Suiza) y las
reacciones se realizaron en el termociclador (Eppendorf). El cDNA amplificado fue
cuantificado a los 260nm. Se realizaron RT-PCR usando Rat Universal Probe Libery
(Roche Diagnostics GmbH, Basilea Suiza). Se generaron los primers del oligonucleotido
específicos con el software en línea (Prove Finder; www.universal-probelibrary.com) y las
secuencia del forward primer de MR en higado fue 5'AGCCACTCCGAACCTGGCAGC3
', y el inverso fue 5’TCATGCGACATGGGTTCCTGG3’. 20µl mezcla de la reacción
contuvo 1X LightCycler la TaqMan (Roche Diagnostig GmbH, Basilea Suiza), 200nmol
de cada primer, y 100nmol/L del primer de Rat Universal Probe Libery,y en un ciclo de
0.5U de uracil-DNA glicosilado y de 2 l de DNA normal en dilución apropiada. La
amplificación se realizó en capilares de borosilicato (Roche Diagnostic GmbH, Basilea
Suiza).
Para analizar si el polímero de manosa se encuentra confinado en el espacio intraluminal,
nosotros mostramos indirectamente que el efecto vasodilatador del polímero de manosa,
es inducido a nivel endotelial al usar el polímero de manosa marcado (FITC). Las arterias
mesentéricas eran perfundidas con el polímero de manosa-FITC por 30 minutos y después
se lavo por otros 30 minutos con solución de Krebs-Henseleit. Las arterias de mesentéricas
36
de rata fueron cortadas en anillos de 1mm, y colocadas con Vecta-shield con yoduro de
propidio y analizadas en el microscopio de fluorescencia.
Bloqueo o inhibición del efecto vasodilatador de la manosa.
Para estudiar la posible existencia de mediadores que inducen la vasodilatación de la D-
manosa en las arterias mesentéricas de rata, se probaron varios antagonistas del receptor y
de posibles inhibidores enzimáticos: La glibenclamida [1µmol/L] antagonista de canales de
K+ sensibles a ATP (KATP) ; el apamin [10µmol/L] un bloqueador de canales de Ca2+
dependiente de K2 (KCa), L-arginine metil ester ( L-Name) [10µmol/L], inhibidor de la
sintasa de óxido nítrico; La indometacina [10µmol/L] inhibidor de la COX; El Reactive
blue [1µmol/L] antagonista de los receptores P2Y ; La aminofilina [10µmol/L], bloqueador
de receptores de adenosina. Cada sustancia fue perfundida durante el experimento, 15min
después de la administración de fenilefrina y previa a la perfusion de D-manosa.
Análisis de datos y estadística
Se normalizaron los datos contra el valor basal del diámetro a perfusion constante y sin
estimulación. Los datos representan significa ± SE. Cada condición experimental tenía
una " n " de 6 ratas. Cada rata proporcionó una arteria. Se utilizaron otros vasos u órganos
de la misma rata en otros experimentos. Las comparaciones entre los grupos y entre los
37
tratamientos se realizaron usando ANOVA y una prueba de Bonferoni para las diferencias
individuales. Las diferencias fueron consideradas estadísticamente significante cuando p es
<0.05.
38
RESULTADOS
El diámetro básal de las arterias mesentéricas a una presión constante de 60 mmHg, fue de
287± 10 micras (n=35). Los cambios en el diámetro basal se expresaron en poncertaje. Las
arterias mesentéricas presurizadas, mostraron una vasoconstricción dependiente a
concentraciones crecientes de fenilefrina (datos no mostrados). La fenilefrina a dosis de
10µmol/L produce una vasoconstricción del 80%. En los experimentos siguientes, las
arterias mesentéricas fueron precontraidas con fenilefrina 10µmol/L. En las arterias con y
sin presurización, el aumento en el flujo, no presento ninguna modificación en el diámetro
básal arterial (datos no mostrados). Posteriormente se realizaron curvas dosis-respuesta a
flujo en las arterias mesentéricas precontraidas. Diferentes flujos (20, 40, 60, 80, 100 y
120 l/min), fueron probados en las arterias mesentéricas. En la figura 4 se muestra que el
aumento en el flujo, si induce un efecto vasodilatador en las arterias precontraídas pero
que este es solo estadísticamente significante a flujos mayores a 60 l/min. El efecto
máximo se observo a un flujo de 120 l/min a con una relajación aproximada del 92% del
diámetro básal de la arteria (fig. 9). Ya que a flujos menores de 60 l/min no se observa
ningún cambio significativo en el diámetro de la arteria mesentérica. se decide usar el
flujo de 20 l/min para los experimentos siguientes.
39
Figura 9. Efecto del flujo en la arteria mesentérica. La perfusión de flujos mayores a
60 l/min en las arterias precontaridas presenta un efecto vasodilatador, a flujos menores no
se observa cambios significativos en el diámetro.
La perfusión intraluminal (a 20 l/min) de D-manosa produce un efecto vasodilator, en la
arteria mesentérica, el cual fue dependiente de la concentración (fig. 10), este efecto se
observó después de la perfusión de D-manosa, y se demostró que el efecto de la manosa
es estadísticamente significante en 0.1µmol/L. El efecto máximo producido por la
perfusión de manosa [100µmol/L] alcanzó 92% de relajación en el diámetro basal de los
vasos. Este efecto vasodilatador fue específico a manosa, ya que la perfusion intraluminal,
de otros dos monosacáridos en un rango de la concentración similar, como de D-galactosa
40
y D-glucosa no indujeron ningún cambio significativo en el diámetro de arterias
mesentéricas de rata precontraídas (fig. 11).
Figura 10. Efecto de la manosa en la arteria mesentérica. El efecto de la manosa perfundida
a concentraciones crecientes produce un efecto vasodilatador en las arterias mesentéricas
precontraidas,
La perfusión intraluminal del polímero de manosa producen un efecto vasodilator similar
al de la manosa libre en las arterias de mesentéricas de rata precontraídas (fig 12). Es
notable que los perfusion del polímero de manosa mostraran una potencia mayor. En la
Figura 10 se muestras que para alcanzar un efecto vasodilatador importante la
concentración de manosa debe alcanza valores de 100 nmol/L para ejercer un efecto en la
41
arteria mesentérica precontraída. El efecto de polímero fue 100 veces más bajo que el de
la manosa El efecto máximo inducido por el polímero de manosa fue a una concentración
1µmol/L (96% del diámetro basal). En comparación la concentración similar de manosa
sólo ejerció un 40% de relajación del vaso (75% del diámetro básal) en las arterias
mesentérica precontraídas.
Figura 11 Efecto de la glucosa y galactosa en la arteria mesentérica. La perfusion de
distintos monosacáridos (hexosas), no produce relajación del la arteria, lo cual indica que la
relajación producida es mediada por el efecto de la manosa sob.re el endotelio arterial
42
En otro experimentos, se perfundió dextran a concentraciones de 0.01nmol/L a 1µmol/L
(2.6µg/L a 0.26g/L ); estas concentraciones eran 5 veces superiores a las concentraciones
producidas al del polímero de manosa 0.515µg/L a 0.0515g/L (0.01nmol/L a 1µmol/L). la
Figura 13 muestras que el dextran 260,000 Da, produce un vasodilatación dependiente de
la concentración.
Los efectos vasodilatores del dextran en las arterias mesentéricas, sólo son
estadísticamente significante a concentraciones de 0.1µmol/L (2.6mg/L). Es notable
observar que el efecto máximo producido por el dextran, solo alcanzó un 66% del diámetro
básal . En la, figura 12 se muestras el efecto vasodilatador (70% de diámetro básal) que se
observa cuando se perfunde el polímero de manosa a dosis de 51.5µg/L (1nmol/). Este
resultado demuestra que el efecto producido por el polímero de manosa es mas
pronunciado que el de la manosa libre.
43
Figura 12. Efecto del polímero de manosa en la arteria mesenterica. La perfusion del
polimero de manosa preoduce un efecto mas pronunciado al de la manosa libre.
En la figura 14 se muestra que en la arteria mesentérica de rata se expresa el mRNA del
MR, resultado obtenido por medio del metodo de RT-PCR. Para descubrir la expresión del
mRNA del RM en las arterias de mesentérica de rata, nosotros utilizamos el termociclador
LightCycler PCR, usando el TaqMan con las condiciónes descritas en materiale y
método. Se realizaron tres repeticiones en los tiempos diferentes utilizando como control
positivo el hígado de la rata, la arteria mesentérica y un control negativo (agua). La
muestra de las arterias mesentéricas mostraron la presencia del mRNA del RM y en el
control negativo no hubo ningun cambio (fig. 14). Con estos resultados, se verifico la
presencia del receptor de manosa en las arterias mesentéricas de rata.
44
Figura 13. La perfusion de dextran en la arteria mesentérica, no produce un cambio
significativamente mayor, al de la manosa solo por lo que se concluye que la viscosidad no
afecta al resultado producido por la manosa libre.
45
Estos resultados sugieren que el efecto producido por la manosa, podrían ser el resultado de
la estimulación de receptores específicos, sin embargo, este efecto no nos permite
localizar en el cual la manosa ejerce su acción. Para identificar el posible sitio de acción, se
utilizo un polímero de manosa unido a FITC, para poder marcar con fluorescencia el sito
de acción de la manosa, en los resultados obtenidos, se observa que el polímero se localiza
confinado al lumen vascular (fig. 15) sugiriendo con esto, que el endotelio podría ser,
donde la manosa ejerza principal estimulo.
La posible participación de óxido nítrico o prostaglandinas en los efectos inducidos por la
manosa, fue explorado, para dilucidar cual podría ser una de las vías o mediadores por el
cual se produzca el mecanismo vasodilatador, se utilizo L-NAME (inhibidor de la sintaza
de oxido nitrico) [10µmol/L] e indometacina [10µmol/L] como el (inhibidor de COX),
fueron utilizadas en las arterias mesentéricas, 15min después de la administración de
fenilefrina y durante la perfusion del polimero de manosa.
46
Figura 14 RT-PCR. La presencia de mRNA de RM, como control positivo se utilizo hígado
(verde), negativo agua (rojo) y la arteria mesentérica (azul)
En la perfusion de L-NAME y de Indometacina no mostraron cambio o inhibición en el
47
efecto vasodilatacion de la manosa libre o la del polímero de manosa. También se
probaron otros farmacos, para tratar de identificar la posible via por la cual la manosa
produce el efecto relajante, Reactive Blue (1µmol/L, bloqueador de purinoreceptores),
glibenclamida (1µmol/L), apamin (10µmol/L), aminofilina (10µmol/L), , KATP y
bloqueadores de K, Ca.
48
Figura 15. Polímero de manosa con FITC, se observa el confinamiento del complejo
manosa-dextran (color verde), sobre la superficieluminal de la arteria, por lo que se
concluye que el efecto de la manosa es sobre el endotelio.
49
Discusión.
En el sistema cardiovascular se realizan ajustes de manera constante en el diámetro de los
vasos sanguíneos, debido a que las necesidades metabólicas del organismo cambian
también en forma constante. El propósito de estos cambios vasculares es, el de controlar la
velocidad del flujo sanguíneo a través de los tejidos, la regulación del volumen sanguíneo y
la del llenado de las cavidades cardiacas. En el interior de los vasos sanguíneos se
encuentran las células endoteliales que son las responsables de las funciones vasomotoras
de los lechos vasculares. En la superficie del endotelio se localiza una capa rica en
carbohidratos llamada glicocalix, esta tiene un grosor aproximado de 0.2-4 m, constituidas
por glicoproteínas, proteoglicanos, glicosaminoglicanos y proteínas plasmáticas asociadas
(24), inclusive en algunas regiones puedes ser más ancho que las mismas células
endoteliales, se ha propuesto que el glicocalix es fundamental, por que esta relacionado con
numerosas funciones fisiológicas y fisiopatologías, esta estructura puede ser sensor del
flujo y del shear stress (55,56).
Las células del músculo liso, normalmente residen en la túnica media del vaso y no están
expuestas directamente, al flujo y por consiguiente al shear stress, solamente se exponen
50
cuando la capa endotelial esta dañada, en estudios recientes se realizaron experimentos en
los cuales la capa del glicocalix era removida con heparinasa II y condrotinasa,
observándose que la respuesta contráctil, al incrementar el shear stress fue
significantemente inhibida, por lo que se concluye que el glicocalix participa de una forma
activa en las repuestas vasomotoras de los vasos sanguíneos (1).
Dentro de estas glicoproteínas membranales del endotelio se localiza el receptor de manosa
(MR), el cual es un receptor que tiene afinidad a los carbohidratos presentes en la pared
celular de los microorganismos, que se expresa principalmente en las células de linaje
mieloide, pero que también se ha descrito, además en endotelio de órganos como en el
riñón, tráquea, retina y piel (25).
El MR también actúa en la mediación de la endocitosis y fagocitosis (34, 38, 39, 43, 52,
62,74, 78), en el cual el receptor es reciclado y regresado a la superficie membranal, listo
para llevar acabo funciones fagociticas (75)
El MR es una lectina tipo C , que contiene varios CRDs que están distribuidos a lo
largo de una sola cadena polipeptídica; también tiene una región extracelular que contiene
una N-Terminal rica en cisteína, seguido de un dominio de fibronectina tipo II, el cual une
colagena ( 16).
51
El MR se une principalmente a oligosacaridos pero también presenta afinidad por
monosacáridos como : la manosa, fucosa y la N-acetilglucosamina, ( 50, 67).
La afinidad de la manosa hacia los CRDs es dependiente de Ca2+
, en por lo menos tres
CRDs (4,5 y 7) se conoce que tienen una gran afinidad por ligandos multivalentes, estudios
recientes, han reportado que la sensibilidad al pH y la unión al Ca2+
, difiere entre CRD-4
aislado y los fragmentos más grandes del receptor (15).
Al unirse a una proteína manosilada el MR la libera en un compartimento endosomal,
después el receptor es reciclado hacia la superficie celular (40).
El MR y su afinidad a proteínas manosiladas, parecen estar relacionadas con otros efectos
vasculares. Por ejemplo en piel normal se encontró, una expresión de MR en el 30-50%
de los vasos sanguíneos pequeños y medianos del plexo vascular profundo de la
dermis. Todos los vasos que presentaron MR, expresaron moléculas CD36 (25).
La perfusión de polímeros de origen sintético con residuos de manosa, activan otras vías
de señalización que inducen un aumento en el inotropismo positivo y del dromotropismo,
que es mediado por el flujo coronario en los corazones aislados de cobayo a través del
glicocalix que se localizan en la membrana endotelial (58).
En este trabajo se utilizaron arterias mesentéricas de rata macho, las cuales presentan una
52
capa muscular gruesa y son capaces de realizar una vasoconstricción intensa, su función
principal es la de regular el flujo sanguíneo hacia el intestino delgado y también como
reservorio esplácnico (14).
Los resultados de este trabajo muestran; primero, que la perfusión intraluminal de
manosa libre, y del polímero de manosa (> 260 kDa), induce vasodilatación, que es
dependiente de la concentración, en las arterias mesentéricas de rata pre-contraídas y
presurizada. El polímero del manosa, produce una vasodilatación 100 veces más potente
que la manosa libre, esta diferencia entre la manosa libre y polímero de manosa podría
sugerir, que el efecto producido por el polímero del manosa podría estar mediado por el
MR, cuya estructura se localiza en la superficie del endotelio de la arteria mesentérica de
rata, como se sugiere en estudios anteriores, en el que prefunden el polímero en corazón de
cobayo, teniendo como resultado un aumento en la fuerza inotropica. (58). Como segundo
punto se obtuvo que el efecto vasodilatador de la manosa, es un efecto específico para este
monosacárido, debido a que no se encontró ningún efecto al perfundir intraluminalmente la
D-glucosa y la D-galactosa en arterias mesentéricas de ratas pre-contraídas y
presurizadas. Como tercer punto tenemos que la manosa unida al dextran genera un
polímero de manosa de manosa, de alto peso molecular que no difunde hacia el espacio
intersticial, por lo que se concluye que el efecto de la manosa se confiere solo a nivel
endotelial; el dextran es un polisacárido constituido por solo residuos de glucosa (la glucosa
1-6 glucosa). La perfusión de dextran de 260,000 Da no aumentó significativamente la
viscosidad de la solución de perfusión; por otra parte como un aspecto importante se
encontró que induce una pequeña vasodilatación dependiente de la concentración en las
arterias de mesentéricas de rata pre-contraídas y presurizada. Sin embargo, el efecto
53
inducido por el dextran es menos potente que el efecto inducido por la perfusión
intraluminal del polímero de manosa, es importante señalar que este efecto no es aditivo al
efecto de la manosa, debido a que la perfusión simultanea intraluminal de manosa libre y
dextran a concentraciones más altas no aumentaron significativamente la vasodilatación
arterial (datos no mostrados). González-Castillo, probaron varios tamaños de dextran en
corazón aislado de cobayo y demostraron que la perfusión de dextran, modifica la
contracción del miocardio, y que este efecto es independiente de la viscosidad de la
solución de perfusión. También demostraron que el dextran 260,000 Da, aumenta solo la
viscosidad marginalmente en el rango de las concentraciones que nosotros probamos en
este estudio (23), por lo que los efectos de nuestros estudios no se deben a los cambios en la
viscosidad. Como cuarto punto los resultados obtenidos con la perfusión intraluminal del
polímero de manosa fluoresceinado sugieren que los efectos vasodilatadores en las arterias
de mesentéricas de rata, están restringidos al lumen vascular lo que sugiere fuertemente, la
presencia de un receptor en la membrana endotelial, por lo que se realizaron pruebas de
biología molecular en donde se encontró el mRNA del MR en la arteria de mesentérica de
rata.
Se ha reportado que el tamaño de la exclusión de dextran es 70,000 Da (71). Basado en
este informe y en nuestros resultados, nosotros proponemos que el sitio principal de
activación del MR o por lo menos el sitio de interacción de la manosa es a nivel de la
superficie endotelial, como se observa en la figura 14 en donde se demostró que los
residuos del polímero de manosa fluorescente se confinaron en el espacio intraluminal.
Como quinto punto se resume lo siguiente, hasta el momento el mediador del efecto
vasodilator no ha sido elucidado, teniendo que los efectos vasodilatadores, como los
54
ejercidos por NO y derivados de la COX fueron excluidos como posibles mediadores del
efecto vasodilatador de la manosa en las arterias mesentéricas presurizadas y pre-
contraídas debido a que al utilizar L-NAME e Indometacina no hubo modificación del
efecto.
Anteriormente, se demostró que la perfusión de manosa y del polímero de manosa, en
corazón aislado y perfundido de cobayo, inducen un efecto inotropico positivo, como
resultado de la unión y de interacción con las lectinas en la superficie endotelial de la
vasculatura coronaria (58). El receptor de manosa puede desencadenar una variedad de
respuestas, como; la secreción de mediadores, secreción de enzimas lisosomales,
producción del citoquinas, y la modulación de otros receptores de superficie de célula.
Recientemente, fue reportado que la activación de MR en los macrófago, induce un
aumento en la producción del prostaglandinas y de la expresión de COX (17). En este
trabajo no se encontró relación alguna, en los efectos de la manosa con el óxido
nítrico, prostaglandinas, con receptores de adenosina, purinoceptores P2Y, canales de K-
ATP y de antioxidantes. De hecho, no pudimos encontrar el mediador por el cual la
manosa y el polímero de manosa producen los efectos en el lecho vascular, éstos podrían
estar relacionarse con la comunicación mio-endotelial electroquímica como él que se ha
propuesto por Figueroa (19,20). Otra vía que podría estar involucrada en el efecto
vasodilatador del polímero, es el cambio en el pH; como se menciona anteriormente, por la
liberación de residuos de manosa por el MR, el pH puede modificar el aumento en la taza
de disociación de este. Los cambios en el pH extracelular e intracelular (el pHo y pHi,
respectivamente), han demostrado que modulan la contractibilidad vascular, por la
afectación en las actividades de canales iónicos así como de las bombas (2). H+ puede
actuar con canales voltaje dependientes de Ca2+
tanto internos y externos (9,11). Estos
55
efectos en los canales de H+, Ca
2+ y de K
+ podrían responder a la disminución intracelular
en la concentración de Ca2+
y también en la disminución en la contractilidad. Por otro lado,
la disminución en el pHi y pHo inhibieron internamente las corrientes de K+ (KIR) (15, 29
, 33). Otra vía propuesta es que el RM al fagocitar, esta asociado a la polimerización focal
de actina y de la activación de Cdc 42, Rac1 y Rho, la fagocitosis es dependiente directa de
la activación de la Cdc 42 y de La Rho, esta vía de la Rho kinasa también ha sido propuesta
que afecta el tono miogénico arterial, ya que la inhibir esta vía se atenúo tanto el tono
miogénico como la reactividad vascular y que se encuentra asociada con un incremento en
la concentración de Ca2+
i en el citosol del músculo liso vascular (22).
Sin embargo, se necesita más trabajo para poder elucidar el mecanismo vasodilatador del
polímero de manosa.
En resumen, el receptor de manosa se expresa y se le relaciona con los efectos
vasodilatadores en las arterias mesentéricas de rata. Su activación induce un efecto
vasodilatador en las arterias pre-contraídas, el cual no se relaciona con el óxido nítrico,
COX, receptores de adenosina, purinoreceptores P2Y y canales KATP de KCa. La
activación de MR parece ser localizada en la superficie endotelial y la función no se
relaciona con procesos de inmunidad. Los efectos observados pueden ser de relevancia
fisiológica porque las concentraciones de manosa utilizadas se encontraban dentro del
rango fisiológico de manosa en sangre [20- mol/L] (50 ).
56
Conclusiones
Los resultados de este trabajo proporcionan evidencia de la presencia del receptor de
manosa en las arterias mesentéricas de rata, y que, además de sus funciones inmunitarias,
se propone que el receptor participa activamente en la relajación vascular de las arterias
mesentéricas aisladas, así como, primera vez es descrita su localizaron en estos lechos
vasculares, pero todavía falta mucho trabajo para poder elucidar por completo su
mecanismo de acción, esto podría ser de gran ayuda por que el implementar manosa a nivel
vascular, lo cual podría dirigir la implementación de estrategias terapéuticas
farmacológicas, para tratar el desarrollo de enfermedades cardiovasculares.
57
PERSPECTIVAS
Es necesario buscar el mecanismo por el cual la manosa libre, produce un efecto
vasodilatador en las arterias mesentéricas de rata y además caracterizar el receptor que se
encuentra presente en el endotelio de estos , por otro lado, de acuerdo con nuestros
resultados, surge la necesidad de evaluar las dosis de manosa en órganos completos.
58
BIBLIOGRAFIA:
1. Ainsle K. Garanich J. Dull RO. and Tarbell JM. Vascular Smooth Muscle Cell
Glycocalyx influences Shear Stress-Mediated Contractile Response. J Appl Physiol 98:
242-249.2005.
2. Anken Ev and Braakman I. Versatility of the Endoplasmic Reticulum Protein
FoldingFactory. Crit Rev Biochem Mol Biol 40: 191-228 (2005).
3. Asumendi A, Alvarez A, Martinez I, Smedsrod B and Vidal-Vanaclocha F. Hepatic
sinusoidal endothelium heterogeneity with respect to mannose receptor activity is
interleukin-1
4. Bevan JA. Kaley G and Rubanyi G. Flow-Dependent Regulation of Vascular Function.
Clinical Physiology Series. Am J of Physiol. 1995.USA.
5. Boskovic J. Arnold JN. Gordon S. Sim R. Rivera-Calzada A. Wienke D. Isacke CH.
Martinez-Pomares L. and Llorca O. Structural Model for the Mannose Receptor Family
Uncoverd by Electron Microscopy of the Endo 180 and the Mannose Receptor. J of Biol
Chem 281.No 13: 8780-8787. 2006.
59
6. Brouland JP, Gilbert MA, Bonneau M, Pignaud G, Bal Dit SC and Drouet L. Macro and
microheterogeneity in normal endothelial cells: differential composition of luminal
glycocalyx and functional implications. Endothelium 6: 251-262 (1999).
7. Buttler H. Morel AS. Jordan W. Efren E. Hue S. Shimpton R. and Rittter M. Altered
Expresion and Endocitic Function of CD 205 in Human Dendritic Cell and Detection of a
CD 205 –DCL Fusion Protein Upon Dendritic Cell Maturation. Inmunol. 120: 362-371.
2006.
8. Cacan R, Villers C, Belard M, Kaiden A, Krag SS and Verbert A. Different fates of the
oligosaccharide moieties of lipid intermediates. Glycobiology 2: 127-136 (1992).
9. Constantinescu AA, Vink H and Spaan JA. Elevated capillary tube hematocrit reflects
degradation of endothelial cell glycocalyx by oxidized LDL. Am J Physiol Heart Circ
Physiol 280: H1051-H1057 (2001).
10. Chan RK, Ibrahim SI, Takahashi K, Kwon E, McCormack M, Ezekowitz A, Carroll
MC, Moore FD, Jr. and Austen WG, Jr. The Differing Roles of the Classical and Mannose-
Binding Lectin Complement Pathways in the Events following Skeletal Muscle Ischemia-
Reperfusion. J Immunol 177: 8080-8085 (2006).
60
11. Chen CB and Wallis R. Stoichiometry of Complexes between Mannose-binding Protein
and Its Associated Serine Proteases. Defining functional units for complement activation. J
Biol Chem 276: 25894-25902 (2001).
12. De Caterina, Endothelial dyssfunctions and vascular disease, ed Blackwell futura, 2007
13. Di Virgilio S, Glushka J, Moremen K and Pierce M. Enzymatic synthesis of natural and
13C enriched linear poly-N- acetyllactosamines as ligands for galectin-1. Glycobiology 9:
353-364 (1999).
14. Dora KA and Garland CJ. Properties of smooth muscle hyperpolarization and relaxation
to K+ in the rat isolated mesenteric artery. Am J Physiol Heart Circ Physiol 280: H2424-
H2429 (2001).
15. East L, Rushton S, Taylor ME and Isacke CM. Characterization of Sugar Binding by
the Mannose Receptor Family Member, Endo180. J Biol Chem 277: 50469-50475 (2002).
16. Feinberg H, Park-Snyder S, Kolatkar AR, Heise CT, Taylor ME and Weis WI.
Structure of a C-type Carbohydrate Recognition Domain from the Macrophage Mannose
Receptor. J Biol Chem 275: 21539-21548 (2000).
17. Fernandez N, Alonso S, Valera I, Vigo AG, Renedo M, Barbolla L and Crespo MS.
Mannose-Containing Molecular Patterns Are Strong Inducers of Cyclooxygenase-2
61
Expression and Prostaglandin E2 Production in Human Macrophages. J Immunol 174:
8154-8162 (2005).
18. Fiane AE, Ueland T, Simonsen S, Scott H, Endresen K, Gullestad L, Geiran OR,
Haraldsen G, Heggelund L, Andreassen AK, Wergeland R, Froland S, Aukrust P and
Mollnes TE. Low mannose-binding lectin and increased complement activation correlate to
allograft vasculopathy, ischaemia, and rejection after human heart transplantation. Eur
Heart J 26: 1660-1665 (2005).
19. Figueroa XF, Isakson BE and Duling BR. Connexins: Gaps in Our Knowledge of
Vascular Function. Physiology 19: 277-284 (2004).
20. Figueroa XF, Isakson BE and Duling BR. Vascular Gap Junctions in Hypertension.
Hypertension 48: 804-811 (2006).
21. Gerritsen ME, Shen C-P, Atkinson WJ, Padgett RC, Gimbrone MA, Jr. and Milstone
DS. Microvascular endothelial cells from E-selectin-deficient mice form tubes in vitro. Lab
Invest 75: 175-184 (1996).
22. Gokina NI. Park K. McElroy-Yaggy and Olson G. Effects of Rho kinase inhibition on
cerebral artery myogenic tone and reactivity. J Appl Physiol 98: 1940-1948.2005
62
23. Gonzalez-Castillo C, Rubio R and Zenteno-Savin T. Coronary flow-induced inotropism
is modulated by binding of dextrans to the endothelial luminal surface. Am J Physiol Heart
Circ Physiol 284: H1348-H1357 (2003).
24. Gouverneur M. Spaan JA. Pannekoek H. Fontijin D. and Vink H. Fluid Shear Stress
Stimulates Incorporation of Hyaluronan into Endothelial Cell Glycocalix. Am J Physiol
Heart Circ Physiol. 290: H458-H462. 2006
25. Groger M, Holnthoner W, Maurer D, Lechleitner S, Wolff K, Mayr BB, Lubitz W and
Petzelbauer P. Dermal Microvascular Endothelial Cells Express the 180-kDa Macrophage
Mannose Receptor In Situ and In Vitro. J Immunol 165: 5428-5434 (2000).
26. Hackstein H. Taner T. Logar AJ and Thomson A. Rapamycin Inhibits
Macropinocytosis and Mannose Receptor-Mediated Endocitosis by Bone Marrow Derived
Dentritic Cell. Blood. 100: 1084-1087. 2002.
27. Halpern W and Kelley M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels
28: 245-251 (1991).
28. Hanasaki R. Mammalian Phospholipase A2: Phospolipase A2 Receptor. Biol Pharm
Bull. 27(8): 1165-1167. 2004
63
29. Hart ML, Ceonzo KA, Shaffer LA, Takahashi K, Rother RP, Reenstra WR, Buras JA
and Stahl GL. Gastrointestinal Ischemia-Reperfusion Injury Is Lectin Complement Pathway
Dependent without Involving C1q. J Immunol 174: 6373-6380 (2005).
30. Hauri HP. Appenzeller C. Kuhn F and Nufer O. Lectins and traffic in the secretory
pathway. FASEB Letters. 476: 32-37. 2000.
31. Hebert E. Endogenous lectins as cell surface transducers. Biosci Rep 20: 213-237
(2000).
32. Henry CBS and Duling BR. Permeation of the luminal capillary glycocalyx is
determined by hyaluronan. Am J Physiol Heart Circ Physiol 46: H508-H514 (1999).
33. Henry CBS and Duling BR. TNF-a increases entry of macromolecules into the luminal
endothelial cell glycocalyx. Am J Physiol Heart Circ Physiol 279: H2815-H2823 (2000)
34. Howard MJ and Isacke CM. The C-type Lectin Receptor Endo180 Displays
Internalization and Recycling Properties Distinct from Other Members of the Mannose
Receptor Family. J Biol Chem 277: 32320-32331 (2002).
35. Jeansson M and Haraldsson B. Morphological and functional evidence for an important
role of the endothelial cell glycocalyx in the glomerular barrier. Am J Physiol Renal
Physiol 290: F111-F116 (2006).
64
36. Jordan J. Montalto MC and Stahl P. Inhibition of Mannose Binding Lectine Reduces
Postischemic Myocardial Reperfusion Injury. Circulation. 104: 1413-1418. 2001.
37. Kanwar S, Steeber DA, Tedder TF, Hickey MJ and Kubes P. Overlapping roles for L-
selectin and P-selectin in antigen-induced immune responses in the microvasculature.
Journal of Immunology 162: 2709-2716 (1999).
38. Kempka G and Kolb-Bachofen V. Binding, uptake, and transcytosis of ligands for
mannose-specific receptors in rat liver: an electron microscopic study. Exp Cell Res 176:
38-48 (1988).
39. Lansink M, Jong M, Bijsterbosch M, Bekkers M, Toet K, Havekes L, Emeis J and
Kooistra T. Increased Clearance Explains Lower Plasma Levels of Tissue-Type
Plasminogen Activator by Estradiol: Evidence for Potently Enhanced Mannose Receptor
Expression in Mice. Blood 94: 1330-1336 (1999).
40. Lennartz MR. Cole S. Sherpherd VL. Wileman T. and Stahl. Insolation and
Characterization of a Mannose-Specific Endocytosis Receptor from Human Placenta. J Biol
Chem. 262. No 21: 9942-9944.1987.
65
41. Linehan SA, Martinez-Pomares L, Stahl PD and Gordon S. Mannose Receptor and Its
Putative Ligands in Normal Murine Lymphoid and Nonlymphoid Organs: In Situ
Expression of Mannose Receptor by Selected Macrophages, Endothelial Cells, Perivascular
Microglia, and Mesangial Cells, but not Dendritic Cells. J Exp Med 189: 1961-1972
(1999).
42. Ma YG, Cho MY, Zhao M, Park JW, Matsushita M, Fujita T and Lee BL. Human
Mannose-binding Lectin and L-Ficolin Function as Specific Pattern Recognition Proteins in
the Lectin Activation Pathway of Complement. J Biol Chem 279: 25307-25312 (2004)
43. Magnusson S and Berg T. Extremely rapid endocytosis mediated by the mannose
receptor of sinusoidal endothelial rat liver cells. Biochem J 257: 651-656 (1989).
44. Martinez-Pomares L, Mahoney JA, Kaposzta R, Linehan SA, Stahl PD and Gordon S.
A Functional Soluble Form of the Murine Mannose Receptor Is Produced by Macrophages
in Vitro and Is Present in Mouse Serum. J Biol Chem 273: 23376-23380 (1998).
45. Martinez-Pomares L, Hanitsch LG, Stillion R, Keshav S and Gordon S. Expression of
mannose receptor and ligands for its cysteine-rich domain in venous sinuses of human
spleen. Lab Invest 85: 1238-1249 (2005).
46. Matsuki T and Duling BR. TNF-alpha modulates arteriolar reactivity secondary to a
change in intimal permeability. Microcirculation 7: 411-418 (2000).
66
47. Mulivor AW and Lipowsky HH. Inflammation- and ischemia-induced shedding of
venular glycocalyx. Am J Physiol Heart Circ Physiol 286: H1672-H1680 (2004).
48. Napper CE and Taylor ME. The mannose receptor fails to enhance processing and
presentation of a glycoprotein antigen in transfected fibroblasts. Glycobiology 14: 7C-12
(2004).
49. Napper CE, Dyson MH and Taylor ME. An Extended Conformation of the Macrophage
Mannose Receptor. J Biol Chem 276: 14759-14766 (2001).
50. Opanasopit P, Shirashi K, Nishikawa M, Yamashita F, Takakura Y and Hashida M. In
vivo recognition of mannosylated proteins by hepatic mannose receptors and mannan-
binding protein. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 280: G879-G889 (2001).
51. Panneerselvam K and Freeze HH. Mannose Enters Mammalian Cells Using a Specific
Transporter That Is Insensitive to Glucose. J Biol Chem 271: 9417-9421 (1996).
52. Pino RM. The cell surface of a restrictive fenestrated endothelium. I. Distribution of
lectin-receptor monosaccharides on the choriocapillaris. Cell Tissue Res 243: 145-155
(1986).
67
53. Platts SH, Linden J and Duling BR. Rapid modification of the glycocalyx caused by
ischemia/reperfusion is inhibited by adenosine A2A receptor activation. Am J Physiol
Heart Circ Physiol 284: H2360-H2367 (2003)
54.Pocock G. and Richards CD. Fisiología Humana. Ed. Masson 2001. España.
55. Pries AR, Secomb TW and Gaehtgens PAL. Structural adaptation and stability of
microvascular networks: theory and simulations. Am J Physiol 275: H349-H360 (1998).
56. Rehm M. Bruegger D. Christ F. Conzen P. Thiel M. Jacob M. Chappel D.
Stoeckelhuber M. Welsch. Reichart B. Peter K. and Becker B. Shedding of the Endothelial
Glycocalyx in Patients Undergoing Major Vascular Surgery with Global and Regional
Ischemia. Circulation. 116: 1896-1906. 2007.
57. Rubio-Gayosso I, Barajas-Espinosa a, Castillo H, Ramiro-Diaz J, Ceballos G and
Rubio R. Enzymatic hydrolysis of luminal coronary glycosidic structures uncovers their
role in sensing coronary flow. Front Biosci 10: 1050-1059 (2005)
58. Rubio-Gayosso, I, Ceballos, G, and Rubio, R. A multimolecular complex sensing
coronary flow (CF) locatred on the luminal endothelial cell surface (LECS) mediates
positive dromotropic (+D) and inotropic (+I) effects of CF. FASEB Journal 16(5), A864. 3-
22 (2002).
68
59. Rubio-Gayosso I, Platts SH and Duling BR. Reactive oxygen species mediate
modification of glycocalyx during ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ
Physiol 290: H2247-H2256 (2006)
60. Rubio R, Ceballos G,. Role of the endothelial glycocalyx in dromotropic, inotropic, and
arrythmogenic effects of coronary flow. Am J Physiol Heart Circ Physiol 278: H106-H116
(2000).
61. Scotland R. Chauhan S. Davis C. De Felipe C. Hunt S. Kabir J. Kotsoins. Oh U. and
Ahluwalia. Vanilloid Receptor TRPV1, Sensor C-Fibers, and Vascular Autorregulacion.A
Novel Mechanism Involved in Myogenic Constriction. Circ Res. 95: 1027-1034. 2004.
62. Sorensen KK, Tollersrud OK, Evjen G and Smedsrod B. Mannose-receptor-mediated
clearance of lysosomal alpha-mannosidase in scavenger endothelium of cod endocardium.
Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 129: 615-630 (2001).
63. Spiro RG. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease
implications of glycopeptide bonds. Glycobiology 12: 43R-456 (2002)
64. Su Y, Bakker T, Harris J, Tsang C, Brown GD, Wormald MR, Gordon S, Dwek RA,
Rudd PM and Martinez-Pomares L. Glycosylation Influences the Lectin Activities of the
Macrophage Mannose Receptor. J Biol Chem 280: 32811-32820 (2005).
69
65. Sumner JB. Dinitrosalicylic acid: a reagent for the estimation of sugar in normal and
diabetic urine. J Biol Chem 47: 5-9 (1921).
66. Sumner JB. The estimation of sugar in diabetic urine, using dinitrosalicylic acid. J Biol
Chem 62: 287-290 (1924).
67. Taylor ME, Conary JT, Lennartz MR, Stahl PD and Drickamer K. Primary structure of
the mannose receptor contains multiple motifs resembling carbohydrate-recognition
domains. J Biol Chem 265: 12156-12162 (1990).
68. Taylor, D and Drickamer, K. Glycobiology, 2nd ed. oxford, 2003.
69. van den Berg BM, Vink H and Spaan JA. The endothelial glycocalyx protects against
myocardial edema. Circ Res 92: 592-594 (2003).
70. van Haaren PMA, VanBavel E, Vink H and Spaan JAE. Charge modification of the
endothelial surface layer modulates the permeability barrier of isolated rat mesenteric small
arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol 289: H2503-H2507 (2005).
71. Vink H and Duling BR. Capillary endothelial surface layer selectively reduces plasma
solute distribution volume. Am J Physiol Heart Circ Physiol 278: H285 (2000).
72. Wallis R and Dodd RB. Interaction of Mannose-binding Protein with Associated Serine
Proteases. Effects of naturally occurring mutations. J Biol Chem 275: 30962-30969 (2000).
70
73. Walsh MC, Bourcier T, Takahashi K, Shi L, Busche MN, Rother RP, Solomon SD,
Ezekowitz RA and Stahl GL. Mannose-Binding Lectin Is a Regulator of Inflammation That
Accompanies Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury. J Immunol 175: 541-546
(2005).
74. Wienke D, MacFadyen JR and Isacke CM. Identification and Characterization of the
Endocytic Transmembrane Glycoprotein Endo180 as a Novel Collagen Receptor. Mol Biol
Cell 14: 3592-3604 (2003).
75. Wileman T. Lennartz M. and Stahl P. identification of the Macrophage Receptor as a
175 k-Da Membrane. Cell Biol. 83: 2501-2505. 1986.
76. Zacharia J. Zhang J. and Wier. Ca2+ Signaling in Mouse Mesenteric Small Arteries
Myiogenic Tone and Adrenergic Vasoconstriction. Am J Physiol. Heart Circ Physiol. 292:
H1523-H1532.2007.
77. Zamze S, Martinez-Pomares L, Jones H, Taylor PR, Stillion RJ, Gordon S and Wong
SYC. Recognition of Bacterial Capsular Polysaccharides and Lipopolysaccharides by the
Macrophage Mannose Receptor. J Biol Chem 277: 41613-41623 (2002).
78. Zhang J, Zhu J, Bu X, Cushion M, Kinane TB, Avraham H and Koziel H. Cdc42 and
RhoB Activation Are Required for Mannose Receptor-mediated Phagocytosis by Human
Alveolar Macrophages. Mol Biol Cell 16: 824-834 (2005).
71
79.Rodriguez, A. Estudio del efecto del 17 beta estradiol restringido al lumen vascular en
un modelo de infarto del miocardio por isquemia- reperfusion. tesis de doctorado, 2008
[Frontiers in Bioscience 5294-5303, May 1, 2008]
5294
Mannose polymer induces vasodilation through a luminal mannose receptor in rat mesenteric arteries Gustavo Guevara-Balcazar1, Ivan Rubio-Gayosso1, Angel Miliar-Garcia1, Carmen Castillo1, Israel Ramirez-Sanchez1, Eduardo Meaney2, Alejandra Meaney2, Enrique Gomez 4 , Rafael Rubio3 , Guillermo Ceballos1 1Seccion de Estudios de Posgrado, Escuela Superior de Medicina, Instituto Politecnico Nacional. Mexico City, 11340 Mexico, 2Unidad Cardiovascular del Hospital 1o de Octubre del ISSSTE, Mexico City, Mexico, 3Facultad de Medicina, Universidad Autonoma de San Luis Potosi, S.L.P. Mexico, 4 Hospital 20 de Noviembre del ISSSTE, Mexico City Mexico TABLE OF CONTENTS 1. Abstract 2. Introduction 3. Material and methods 3.1. Mesenteric artery isolation 3.2. Mannose polymer synthesis 3.3. Experimental protocols 3.4. Mannose receptor mRNA determination of mannose polymer binding Site 3.5. Inhibition or blockade of possible mediators of d-mannose-induce vasodilation 3.6. Data analysis and statistics 4. Results
4.1. Mesenteric arteries become activated with pressure and flow 4.2. D-mannose and mannose polymer perfusion increase the diameter
4.3. MR mRNA is express in mesenteric artery 4.4. FITC-mannose-polymer perfusion remains in the vascular lumen 5. Discussion 6. Acknowledgment 7. References 1. ABSTRACT Several of the luminal endothelial glycocalyx functions are exerted via interactions with glycosidic components and sugar binding proteins with lectinic activity. One important example is the mannose receptor (MR). The MR has been detected in cell types that mediate the phagocytosis and pinocytosis of particles and solutes containing mannose. Using isolated constant pressurized rat mesenteric arteries (RMA), we evaluated the effects of a mannose polymer in the vascular tone. RMA were pre-contracted with 10µmol/L phenylephrine and carbohydrates were perfused at 20µl/min. Perfusion of free D-mannose [1nmol/L to 100µmol/L] induced a concentration-dependent vasodilation of pre-contracted RMA. Perfusion of mannose polymer [1nmol/L to 100µmol/L] induced a larger effect in a concentration-dependent vasodilation. Mannose polymer’s maximum effect reached a 96% of basal diameter; this significant vasodilation was not nitric oxide (NO) or cyclooxygenase (COX) dependent effect. We corroborated the binding of the mannose polymer to the endothelial lumen, by perfusion of a fluorescently labeled mannose polymer; and also, we detected a significant level of MR mRNA in whole mesenteric arteries. With all these, we proposed a novel effect of a MR in the regulation of vascular tone.
2. INTRODUCTION Vascular endothelial cells are covered with a complex surface layer of membrane-associated proteoglycans, glycosaminoglycans, glycoproteins, glycolipids, and adsorbed plasma proteins (1, 2). Intravital microscopic studies provide evidence for an in vivo endothelial surface layer estimated between 0.20 to 0.87µm (1,3,4,5,6,7). Luminal endothelial glycocalyx is directly exposed to the blood stream; it has antithrombogenic properties and modulates leukocyte-endothelial interaction. It also participates in microvascular blood flow resistance (2,8), hence its glycosylated structures may translate hemodynamic stimuli into modulation of parenchymal homeostasis. There is sufficient in vivo evidence to suggest that components of the glycocalyx are shed in response to signal transduction events common to inflammation ( 4,9,10), ischemia-reperfusion (5,6,11), and atherosclerotic processes (12). Several of the luminal endothelial glycocalyx functions are thought to be exerted via interactions with glycosidic components and sugar binding proteins with lectinic activity (13,14,15). One important example is the mannose receptor (MR) (16). MR is a sugar binding C-type
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lectin, type I transmembrane receptor ( 16,17)), mainly expressed in macrophages (18,19), and liver, spleen and dermal microvascular endothelial cells ( 18,20,21). MR plays a key role in the homeostasis of these cell types. MR is the prototype for a family of receptors with C-type carbohydrate recognition domains (17). The MR family comprises the Endo180 receptor, the M-type phospholipase A2 receptor (PLA2R), 1 and DEC-205/MR6-gp200. This family grouping is based on an overall structural conservation with the four receptors containing a large extracellular domain comprising an N-terminal signal sequence followed by a cysteine-rich domain, a fibronectin type II domain, and 8 or 10 C-type lectin-like domains (CTLDs)(22,23). A short cytoplasmic domain follows the single pass transmembrane domains. As a family, these receptors have two striking features. First, although they belong to the large C-type lectin superfamily, they uniquely contain multiple CTLDs within a single polypeptide backbone. Second, they share the ability to be recycled between the plasma membrane and intracellular compartments of the cell. The sugar-binding domains are Ca2+-dependent, pH sensitive and have high and selective affinity for terminal mannose residues. MR has been involved in some of the scavenger functions of macrophages and endothelial cells (16,24). This endocytic process is mediated by focal F-actin polymerization, small Rho-GTPase activation, and p21-activated kinases (25). However, besides this well-know effect of MR, it has also been associated with processes that affect vascular function such as the production of prostaglandins by human macrophages (26). Previously, it was showed that intracoronary perfusion of mannose polymers (0.1pmol/L to 1nmol/L) increase the positive inotropism induced by coronary flow stimuli in isolated and perfused guinea pig hearts. This inotropic effect was mediated by a lectinic MR-like protein present in the coronary endothelium (27).
In the present work, rat mesenteric arteries were used to analyze the mannose-induced effects, since several physiologically important functions of microvessels are know to be affected by surface characteristics of the endothelium (28). Previous work shows an increase in myocardial contraction that might be related to a vasodilation effect in isolated guinea pig heart. We hypothesized that the MR is present and functional in the endothelium of resistance vessels (< 300µm) and might be involved in vascular responses to flow. Therefore, we evaluated the vasodilatory effects of intraluminal infusion of D-mannose in arteries pre-contracted with phenylephrine; we evaluated the site of D-mannose action by confining D-mannose intraluminarly with a high molecular weight mannose polymer that does not permeate the endothelium. Furthermore, we used RT-PCR to demonstrate the presence of MR mRNA in rat mesenteric arteries. We also explored the participation of cyclooxygenase (COX)-derived autacoids and nitric oxide on the mannose-induced effects of rat mesenteric arteries. Our results showed that MR is present and active in rat mesenteric arteries and it is involved in endothelium-induced vasodilation.
3. MATERIALS AND METHODS Experimental protocols were approved by the animal welfare and housing committee of the Escuela Superior de Medicina of the Instituto Politecnico Nacional, Mexico. Reagents unless noted were provided by Sigma-Aldrich (St Luis MO). 3.1. Mesenteric artery isolation Experiments were performed in male Wistar rats (250-300g) anesthetized with sodium pentobarbital (60mg/kg intraperitoneal). Animals were mechanically ventilated with room air via a tracheal cannula. A median incision of the abdomen was performed to expose a segment of the small intestines and the supporting and feeding mesentery was quickly excised and placed in ice-cold Krebs-Henseleit solution (mmol/L) NaCl 117.8; KCl 6; CaCl2 1.75; MgSO4 1.2; NaH2PO4 1.2; NaHCO3 24.2; glucose 5 and sodium pyruvate 5; solution was equilibrated with 95% O2 5% CO2, pH 7.4. 2 to 3mm segments of the second order branch of the superior mesenteric artery were separated from the surrounding connective and adipose tissues. The mesenteric artery was transferred and cannulated onto glass pipettes in a temperature-controlled tissue chamber, which was carefully mounted onto the stage of the inverted microscope (Nikon Eclipse TS100, Japan) (29,30,31). Mesenteric arteries were perfused and superfused with Krebs-Henseleit solution, maintained at 37 C and bubbled with 95% O2 and 5 % CO2, throughout the experiment. Each mesenteric artery was stabilized for 5min at a physiological perfusion flow rate (20µl/min) to remove remaining blood, detritus and metabolites. Then, perfusion solution was maintained with no flow for 60 minutes but at a physiological perfusion pressure (60mmHg). Perfusion flow and perfusion pressure was maintained constant with a pressure servo control (LSI) connected to a transducer. Mesenteric artery tone was visualized using an objective 4X (NA0.10; Nikon, Japan) and a CCD camera (Model XC-73, SONY Japan) was used to capture the image. The image was projected on a monitor and digitally recorded. Measurements of the lumen diameter and wall thickness were made with a video dimension analyzer (LSI), as described previously (32). 3.2. Mannose polymer synthesis Mannose polymer was synthesized from a MW 260,000 dextran matrix, using the method described by Di Virgilio et al (33). Briefly, 1g of Dextran (260,000 Da) was dissolved into 100ml of 0.5mol/L of carbonate sodium solution (pH 9.0). Divinylsulfone (DVS, 10ml) was slowly added drop wise with constant stirring over a 15min period. The reaction was maintained for 1 hour at room temperature (RT). 10mg of D-mannose dissolved in 10ml of 0.5mol/L of carbonate sodium solution pH 9.0 was added to the dextran-DVS activated solution. The reaction was maintained for an additional hour at RT. The addition of 5ml of ethylendiamine blocked excess non-reacted groups and stirring continued for 1hour at RT. To remove unbound D-mannose and ethylendiamine, mannose polymer was extensively dialyzed, using a MW 10,000
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cutoff membrane, against distilled water at room temperature. The mannose polymer was precipitated with absolute ethanol, dried and stored upon utilization. To measure the amount of bound mannose in polymer, we measured reducing sugars with 3,5-dinitrosalicylic acid, according to the previously reported method (34,35). Mannose-polymer has 3.5mg of mannose per g of polymer. 3.3 Experimental protocols The mesenteric artery was set at in situ length and allowed to develop spontaneous tone at 60mmHg luminal pressure with no perfusion flow for 1hour. All experiments started once the mesenteric artery developed a constant tone for over a period of 15min. During this period, the perfused pressure is similar to the blood perfusion pressure measured in these arterioles at in vivo conditions. To determine the response to perfusion flow of the mesenteric artery as follows: perfusion flow of the artery was increased stepwise (20µl/min every 5min) from 20 to 100 µl/min at constant perfusion pressure (60mmHg), without previous stimuli by phenylephrine. The artery diameter was measured at each flow step. The vasoconstriction response of the mesenteric arteries was evaluated by addition of phenylephrine in the superfusion solution dissolved in a Krebs-Henseleit solution. The phenylephrine’s concentration-response was evaluated from 1nmol/L to 1mmol/L. Each concentration increment was added to freshly washed artery. The perfusion pressure was maintained constant at 60mmHg during the experiment. Mesenteric artery tone was measured at maximum effect developed by each phenylephrine concentration. The mesenteric arteries were pre-contracted with 10µmol/L phenylephrine, which induced an 80% maximal vasoconstriction to evaluate the flow-dependent vasodilatory effect. 5 minutes later, the perfusion flow was increased from 20 to 100µl/min with step increments of 20µl/min every 5min at a constant perfusion pressure of 60mmHg, as mentioned above measurements were performed at every flow increase. Other sets of experiments were performed to evaluate the effect of monosaccharides and two different high molecular polysaccharides on the mesenteric arteries. After equilibration at 60mmHg of perfusion pressure for 1hour, the mesenteric artery was pre-contracted with 10µmol/L phenylephrine. 5 minutes of stabilization were arteries incubated, then D-mannose, D-glucose, D-galactose, dextran (260 000 Da), and mannose polymer from 1nmol/L to 100µmol/L were intraluminal perfused. The mesenteric artery diameter was measured at every concentration. 3.4. Mannose receptor mRNA detection and determination of mannose polymer binding site To evaluate the presence of the mannose receptor on mesenteric arteries, we extracted total RNA and performed RT-PCR to assess MR mRNA of isolated mesenteric arteries. Briefly, after extracting the rat
mesenteric arteries, the tissues were snap frozen in liquid nitrogen and kept at –80C. Total RNA was extracted using the Perfect RNATM, Eukaryotic Mini (Eppendorf, Boulder CO). Isolated RNA was quantified using the GENESYSTM 10 series (ThermoSpectronic) and 5µg RNA were placed on a 1.0% agarose gel containing ethidium bromide in MOPS buffer. Running buffer and gel contained 0.2mol/L formaldehyde. To prevent trace amounts of DNA contamination, RNA samples were treated with amplification grade DNase I (Invitrogen, Carlsbad CA) before reverse transcription. All RNA samples were stored at –80C in RNA elution solution until further use.
cDNA Synthesis and real time assays: We used 0.5µg of RNA for reverse transcription with random hexamers in 20µl, using the Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (Roche Diagnostics GmbH, Basel Switzerland) and the reactions were performed in Eppendorf Mastercycle Thermocycler (Eppendorf). The amplified cDNA was quantified at 260nm. RT-PCR reactions were conducted using the Rat Universal Probe Library (Roche Diagnostics GmbH, Basel Switzerland). Specific oligonucleotide primers were originally generated with the online assay design software (Probe Finder; www.universal-probelibrary.com) and the primer sequences of liver MR were forward 5’AGCCACTCCGAACCTGGCAGC3’, and reverse 5’TCATGCGACATGGGTTCCTGG3’. 20µl reaction mixture contained 1X LightCycler TaqMan Master reaction mixture (Roche Diagnostics GmbH, Basel Switzerland), 200nmol/L of each primer, 100nmol/L of Universal Probe Library probe, 0.5U LightCycler Uracyl-DNA glycosylase and 2µl of standard DNA in appropriate dilution. The amplification was performed in borosilicate glass capillaries (Roche Diagnostics GmbH, Basel Switzerland). To analyze whether the mannose-polymer remained confined intraluminal, we indirectly showed that mannose-induced vasodilatory effects were exerted at the endothelial cell level using a FITC-labeled mannose polymer. Mesentery arteries were perfused with labeled mannose polymer by 30 minutes and for another 30 minutes to washout unbound polymer with Krebs-Hensley solution. Rat mesenteric arteries were cut in 1mm slices, mounted with Vecta-shield TM containing propidium iodide and analyzed by epi-fluorescence microscopy. 3.5. Inhibition or blockade of possible mediators of D-mannose-induced vasodilation To study the possible existence of mediators of D-mannose induced vasodilation in rat mesenteric arteries, several receptor antagonists and enzymatic inhibitors were tested: glibenclamide [1µmol/L] an antagonist of ATP-sensitive K+ (KATP) channels; apamin [10µmol/L] a blocker of Ca2+-dependent K+ (KCa) channels, NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) [10µmol/L], an inhibitor of the nitric oxide synthase; indomethacin [10µmol/L] a COX inhibitor; reactive blue 2 [1µmol/L] a P2Y purinoceptor antagonist; aminophylline [10µmol/L], an adenosine receptors blocker. Each substance tested was continuously perfused during the experiment, 15min after phenylephrine administration and previous D-mannose perfusion
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Figure 1. Perfusion Flow induces vasodilation on pre-contracted rat mesenteric arteries. Changes in mesenteric artery diameter were expressed as percent of the baseline diameter. Rat mesenteric arteries were pre-contracted with phenylephrine 10µmol/L (Phe). Step increases of perfusion flow induced statistically different vasodilation after 60µl/min. Data are expressed as mean±SE. * and # compared vs. Baseline diameter, and were statistically different, p<0.05. 3.6. Data Analysis and Statistics Data were normalized against diameter baseline values at constant perfusion pressure and no stimuli. Data represent means ± SE. Each experimental condition had an “n” value of 6 rats. Each rat provided one artery. Other vessels or organs from the same rat were used in other experiments. Comparisons between groups and among treatments were performed using an ANOVA and Bonferoni post-test for individual differences. Differences were considered statistically significant when p<0.05. 4. RESULTS 4.1. Mesenteric arteries becomes activated with pressure and flow The baseline diameter of mesenteric arteries studied at a constant perfusion pressure of 60mmHg was 287±5µ m ( n=35). Changes in mesenteric artery diameter were expressed as a percentage of baseline diameters. Pressurized mesenteric arteries showed a phenylephrine concentration-dependent vasoconstriction (data not shown). 10µmol/L phenylephrine elicited ~80% of the vasoconstriction obtained with 1mmol/L phenylephrine. In the following experiments, mesenteric arteries were pre-contracted with10µmol/L phenylephrine. In pressurized and non pre-contracted mesenteric arteries, the stepwise increase in perfusion flow did not modify the baseline diameter (data not shown). Further analysis of the perfusion flow effects in pre-contracted mesenteric arteries was realized. The effect of different flow levels (20, 40, 60, 80, 100 and 12 µl/min) effects were tested on rat mesenteric arteries. Figure 1 show that step increase in perfusion flow induces a vasodilatory effect in pre-contracted mesenteric arteries and this effect was statistically significant only at higher perfusion flows than 60µl/min. At perfusion flow to 60µl/min, there was observed a marginal vasodilation. The maximal effect was
elicited by a perfusion flow of 120µl/min at 92% of the baseline diameter (fig. 1). There is no significant change in the mesenteric artery diameter at 20 or 40µl/min perfusion flow. Therefore, it was decided to use 20µl/min as the perfusion flow for the following experiments. 4.2. D-mannose and the mannose polymer perfusion increase the vascular diameter The intraluminal perfusion (at 20µl/min) of D-mannose induced a significant concentration-dependent vasodilatory response (fig. 2), this vasodilation response appeared immediately after D-mannose perfusion started. Mannose perfusion-induced vasodilation was statistically significant at 0.1µmol/L. The maximal vasodilation elicited by D-mannose [100µmol/L] reached 92% of the baseline diameter. These vasodilatory effects are carbohydrate specific, since intraluminal perfusion, at a similar concentration range, of D-galactose and D-glucose induced no changes in the diameter of pre-contracted rat mesentery arteries (fig. 3). Similar to free D-mannose (fig. 2), the intraluminal perfusion of the mannose polymer produced a vasodilatory effect (fig. 4) in pre-contracted rat mesenteric arteries. It is noteworthy that the mannose-polymer perfusion showed a greater potency. Figure 2 shows that concentration of free D-mannose had to be 100nmol/L to exert significant vasodilation in pre-contracted mesenteric arteries. The mannose polymer effect was present at 100 times lower concentration of mannose than free D-mannose. Maximum effect induced by the mannose polymer was induced by 1µmol/L (96% of the baseline diameter). The same concentration of free mannose only exerted 40% of vasodilation (75% of the baseline diameter) in the pre-contracted mesenteric arteries (figs. 2 and 4). In another set of experiments, dextran (mannose polymer base matrix) was perfused from 0.01nmol/L to 1µmol/L (2.6µg/L to 0.26g/L to compare with mannose polymer); these concentrations were ~5 times higher than the concentrations of mannose polymer 0.515µg/L to 0.0515g/L (0.01nmol/L to 1µmol/L of mannose content in polymer). Figure 5 shows that dextran 260,000 Da perfusion induced a slightly small concentration-dependent vasodilation. Vasodilatory effect of the dextran perfusion in the pre-contracted mesenteric arteries was only statistically significant at 0.1µmol/L (2.6mg/L) concentration perfused. It is noteworthy that the maximal effect induced by the higher dextran concentrations only elicited a vasodilatory effect that reached 66% of the baseline diameter (fig. 5). Meanwhile, figure 4 shows that the same level of vasodilation (~70% of baseline diameter) was observed when it was perfused 51.5µg/L of the mannose polymer (1nmol/L of mannose content in polymer). These results (50 times-fold) demonstrate that mannose polymer-induced effects are more likely due not by the dextran base matrix itself but by the mannose content of the polymer. 4.3. MR-mRNA is express in mesenteric artery Figure 6 shows that the rat mesenteric arteries and rat liver express MR mRNA detected by RT-PCR. To
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Figure 2. D-Mannose intraluminal infusion induces vasodilation on pre-contracted rat mesenteric arteries. Changes in mesenteric artery diameter were expressed as percent of baseline diameter. Rat mesenteric arteries were pre-contracted with phenylephrine 10µmol/L (Phe). Vasodilation induced by D-mannose intraluminal infusion is concentration-dependent. Data are expressed as mean±SE. * and # compared vs. Baseline diameter, and were statistically different, p<0.05.
Figure 3. Different monosaccharides did not modify the vascular tone on pre-contracted rat mesenteric arteries. Changes in mesenteric artery diameter were expressed as percent of the baseline diameter. Rat mesenteric arteries were pre-contracted with phenylephrine 10µmol/L (Phe). Neither D-glucose nor D-galactose modified the vascular tone on the pre-contracted rat mesenteric arteries. Data are expressed as mean±SE. * compared vs. Baseline diameter, and was statistically different, p<0.05. detect the mRNA expression of the cation-dependent mannose receptor on rat mesenteric arteries, we developed a LightCycler PCR assay using the TaqMan probe with the condition described in the materials and methods. We made three repetitions in different times and used the liver of the rat as positive control and the mesenteric artery and a negative control. The liver sample and mesenteric arteries showed amplification curves and the negative control was not amplified (fig. 6). With these results, we verified the presence of the cation-dependent mannose receptor in the rat mesenteric arteries.
4.4. FITC-mannose-polymer perfusion remains in the vascular lumen These results suggested that the mannose-induced effects might be exerted trough the stimuli of specific receptors, however did not allow us to discriminate the site of action. To explore the possible site of action, we used a FITC-mannose-polymer, our results shown that in fact the polymer remains confined to the vascular lumen (fig. 7) suggesting that the endothelium is the main site of mannose stimuli. The possible participation of nitric oxide or prostaglandins in the mannose-induced effects was explored as mediators of vasodilation mechanism. Nitric oxide synthase inhibitor L-NAME [10µmol/L] and indomethacin [10µmol/L] as COX inhibitor were used and rat mesenteric arteries were incubated 15min after phenylephrine administration, previous and during D-mannose polymer perfusion. Neither the nitric oxide synthase inhibitor nor the COX inhibitor was effective on the inhibition of the vasodilation of the free D-mannose or mannose polymer. It was also assayed the effects of reactive Blue (1µmol/L), glibenclamide (1µmol/L), apamin (10µmol/L), aminophylline (10µmol/L), purinoceptor blocker, KATP and KCa channels blockers, adenosine receptor antagonist, superoxide dismutase scavenger and antioxidant, respectively, (data not shown); unfortunately, at this point no mediator of the mannose polymer induced vasodilation is not yet to be elucidated. 5. DISCUSSION D-Mannose is a single epimerized carbohydrate from D-glucose at the two position. This apparent slight structural difference between these two essential sugars confers each other specific functions and metabolic pathways (16,36). At the cellular level, D-mannose is used for the biosynthesis of oligosaccharides and glycophospholipid anchors. Under normal circumstances, it does not appear to make a large contribution to general energy metabolism (37). Several studies have shown that D-mannose can be converted into glycogen but this is under extreme over dietary mannose ingestion. It is metabolized like glucose at cellular and organism level ( 37). The plasma mannose presumably comes from a combination of dietary sources, normal oligosaccharides processing and turnover of endogenous glycoproteins and free oligosaccharides (38). D-Mannose residues have a key role in the proper folding for a large number of proteins synthesized by the ER, and also for their proper transport to the Golgi, for secretion or membrane translocation (39). Mannosylation of microorganisms cell surface proteins induces the innate immune response through the proper and specific recognition of these carbohydrate residues by several mammal’s lectins (40,41). Alternative complement activation involves the binding of D-mannose residues to a soluble mannose binding lectin (MBL) as the start of the pathway cascade (42,43,44,45). Also, membrane lectins recognition of D-mannose residues mediates the activation of intracellular signal pathways, such as those that internalize mannosylated proteins like asialoglycoprotein or some glycosylated proteins and enzymes that have been
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Figure 4. Mannose-polymer infusion induces a more potent vasodilation on pre-contracted rat mesenteric arteries. Changes in mesenteric artery diameter were expressed as percent of the baseline diameter. Rat mesenteric arteries were pre-contracted with phenylephrine 10µmol/L (Phe). Concentrations on the X-axis are expressed according with the mannose content of the mannose polymer (3.5 mg of mannose per g of polymer). Numbers inside the bars indicate the amount of Mannose polymer in g/L in order to compare the effect with dextran 260,000 Da effect. Data are expressed as mean±SE. * and # compared vs. Baseline diameter, and were statistically different, p<0.05.
Figure 5. A dextran 260,000 Da infusion induces a marginal vasodilation on pre-contracted rat mesenteric arteries. Changes in mesenteric artery diameter were expressed as percent of the baseline diameter. Rat mesenteric arteries were pre-contracted with phenylephrine 10µmol/L (Phe). Higher concentration of dextran 260,000 Da only induced a slightly vasodilation on rat mesenteric arteries, viscosity values are not significantly increased to explain the vasodilatory effect. Data are expressed as mean±SE. * and # compared vs. Baseline diameter, and were statistically different, p<0.05. processed by some exoglycosidases exposing D-mannose residues (17,46,47,48). D-mannose residues in polymers of synthetic origin seem to active other signal pathways that induced an enhancement of the positive inotropism and dromotropism
mediated by the coronary flow in isolated guinea pig hearts through a mannose binding lectin at endothelial membrane level (27). Previous report showed that membrane mannose receptor increases the up-take effect directly proportional to the polymerization of mannose (25). Our findings show; first, that intraluminal perfusion of free D-mannose, or synthetic high molecular mannose polymer (> 260 kDa) induces concentration-dependent vasodilation of pre-contracted, pressurized rat mesenteric arteries. The mannose polymer induced vasodilation is 100 times more potent than free D-mannose, this difference between free mannose and mannose polymer could suggest that the effect induced by the mannose polymer could be mediated by a MR-like structure in the surface of the endothelium of rat mesenteric arteries as previous studies shows ( 25,27). Second, the vasodilation effect is a specific effect for this monosaccharide, because there was no effect by D-glucose or D-galactose intraluminal perfusion on pre-contracted, pressurized rat mesenteric arteries. Third, dextran has been used to modify perfusion solution viscosity, and therefore shear stress, an important vascular tone modulator; dextran is a polysaccharide constituted by glucose residues only (glucose α1-6 glucose). Dextran 260,000 Da concentrations perfused did not increase significantly the viscosity of the perfusion solution; dextran intraluminal perfusion induces a small concentration-dependent vasodilation on pre-contracted, pressurized rat mesenteric arteries. However, dextran-induced effect is less potent than the vasodilation effect induced by the intraluminal perfusion of mannose polymer, and this effect is not an additive effect by D-mannose and dextran, because simultaneous intraluminal perfusion of free D-mannose and dextran higher concentrations did not significantly increase vasodilation effect (data not shown). Gonzalez-Castillo et al (49) tested several sizes of dextran in isolated and perfused guinea pig hearts and they showed that dextran perfusion modified the myocardial contraction and this effect was independent of the perfused solution viscosity. They showed that dextran 260,000 Da increases viscosity marginally in the range of the concentrations that we tested in this study ( 49). Fourth, our findings with the intraluminal perfusion of fluorescent labeled-mannose polymer suggest that vasodilatory effect on rat mesenteric arteries seems to be mediated by the presence of a mannose receptor at luminal endothelium membrane, furthermore macrophage mannose receptor mRNA was found in rat mesenteric arteries. It has been reported that the exclusion size of dextran is 70,000 Da (7). Based on this report and in our results, we propose that the main site of MR activation or at least site of mannose interaction with luminal-related molecules in the mesenteric arteries is the endothelial surface layer. Figure 7 demonstrated that the fluorescent labeled-mannose polymer remains confined to the luminal space. Fifth, at this point vasodilatory mediator has not been elucidated, common vasodilators such as NO and COX-derivatives were ruled out to mediate mannose polymer-induced vasodilation on pre-contracted pressurized rat mesenteric arteries. Mannose receptor (MR) is a carbohydrate pattern recognition receptor expressed mainly on cells of myeloid lineage, with few exceptions. Besides some specialized
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Figure 6. RT-PCR of mannose receptor mRNA in rat mesenteric arteries. Real-Time PCR reactions were conducted using the Rat Universal Probe Library (Roche Diagnostics GmbH, Basel Switzerland). The primer sequences of liver MR were forward 5’AGCCACTCCGAACCTGGCAGC3’, and reverse 5’TCATGCGACATGGGTTCCTGG3’. Triangles show the positive control (liver), mRNA amplification of mesenteric arteries is shown in (+) curve.
Figure 7. FITC-Mannose polymer labels on the endothelial cell surface of the rat mesenteric arteries. A 1mm segment of rat mesenteric artery infused with FITC-Mannose polymer (green) for 5min and extensively washed was mounted with Vectashield with propidium iodide (red). Left image shows the rat artery visualized with DIC. Right image shows that the FITC-mannose polymer (green) binds to the luminal surface of the rat mesenteric artery; propidium iodide (red) labels nuclei of smooth muscle cells (in circular pattern external of the artery lumen). Bar indicates 100µm. cell types in the kidney, trachea and retina, MR has only been described on the endothelial cells of organs which are specialized in antigen uptake/clearing and/or presentation such as the liver, spleen and lymph nodes (18,20,21,47). MR also mediates endocytosis and phagocytosis (9,25,46,48,50,51,52,53,54,55). This receptor is unusual among C-type lectins in having multiple CRDs in a single polypeptide chain; it also has an extracellular region consisting of an N-terminal cysteine-rich domain followed by fibronectin type II (16,17). MR binds the monosaccharide mannose, fucose and N-acetylglucosamine, but displays much higher affinity for the multivalent oligosaccharides, such as those found on
the surface of potentially pathogenic microorganism and mannan like structures (56,57). D-Mannose binding is Ca2+-dependent in the CRD. At least three CRDs (4,5 and 7) are known to be required for high affinity and binding to multivalent ligands. The pH sensitivity of Ca2+ binding differs between isolated CRD-4 and larger fragments of the receptor, which implies that inter-CRD interactions in the intact mannose receptor can tune the pH sensitivity of ligand binding. Mannose receptor releases its bound ligand in early endosomes and recycles to the cell surface. The endocytic vesicle containing the receptor-ligand complex
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becomes progressively more acidic, resulting in titration of Ca2+ off the CRD and loss of the ligand. MR or mannose binding structures seem to be involved in other vascular-related effects. In normal skin specimens MR expression was found on ~30-50% of small and medium-sized blood vessels of the deep vascular plexus of the dermis. All MR-positive vessels coexpressed CD36 molecules (20). In the recent past, we have shown that the infusion of mannose and mannose polymer in isolated and perfused guinea pig hearts induces a positive inotropism as a result of binding to the endothelial surface and interaction with lectin-like proteins on the luminal endothelial cell surface of the coronary vasculature (27). Macrophage mannose receptor may be a signal transducing receptor triggering a variety of responses including secretion of mediators, lysosomal enzyme secretion, cytokine production, and modulation of other cell surface receptors.
Recently, it was reported that activation of MR on macrophages induced increase in prostaglandin production and COX expression (26), we found no relation of mannose-induced effects with nitric oxide, prostaglandin, adenosine receptors, P2Y purinoceptors, KATP channels and antioxidants. In fact, we were unable to find the mediator of mannose and mannose polymer-induced effects, these might be related with electrochemical myo-endothelial communication as it has been proposed by Figueroa et al (58,59). Another pathway that might be involved in the vasodilatory effect of the mannose polymer is the change in the pH; as mention above in order to release mannose residue from MR pH must be modified to increase dissociation rate. The changes in extracellular and intracellular pH (pHo and pHi, respectively) have been shown to modulate vascular contractility by affecting the activities of ion channels and pumps (39). H+ may interact with voltage-operated Ca2+ channels both internally and externally (12,43). These effects of H+ on Ca2+ and K+ channels could clearly account for the decrease in intracellular Ca2+ concentration and also for the decrease in contractility on acidification. On the other hand, decreases in pHi and pHo inhibited inwardly rectifying K+ (KIR) currents (3, 16, 60). However, more work is necessary to elucidate the mechanism behind the vasodilatory effect of mannose polymer. In conclusion, the mannose receptor is expressed and functional in rat mesenteric arteries. Its activation induces a vasodilatory effect in pre-contracted arteries unrelated to nitric oxide, COX derived molecules, adenosine receptors, P2Y purinoceptors and KATP or KCa channels. MR activation seems to be located on the luminal surface of the endothelium and the function is unrelated to immunity or clearance. The observed effects might be of physiological relevance because the assayed D-mannose concentrations were in the physiological range of mannose in the blood [20-50µmol/L] (60). 6. ACKNOWLEDGMENTS This work was founded by a grant to Guillermo Ceballos by Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia (CONACyT) Mexico 39542-Q.
7. REFERENCES 1. Jeansson M and Haraldsson B. Morphological and functional evidence for an important role of the endothelial cell glycocalyx in the glomerular barrier. Am J Physiol Renal Physiol 290: F111-F116 (2006) 2. Rubio-Gayosso I, Barajas-Espinosa a, Castillo H, Ramiro-Diaz J, Ceballos G and Rubio R. Enzymatic hydrolysis of luminal coronary glycosidic structures uncovers their role in sensing coronary flow. Front Biosci 10: 1050-1059 (2005) 3. Henry CBS and Duling BR. Permeation of the luminal capillary glycocalyx is determined by hyaluronan. Am J Physiol Heart Circ Physiol 46: H508-H514 (1999) 4. Henry CBS and Duling BR. TNF-a increases entry of macromolecules into the luminal endothelial cell glycocalyx. Am J Physiol Heart Circ Physiol 279: H2815-H2823 (2000) 5. Platts SH, Linden J and Duling BR. Rapid modification of the glycocalyx caused by ischemia/reperfusion is inhibited by adenosine A2A receptor activation. Am J Physiol Heart Circ Physiol 284: H2360-H2367 (2003) 6. Rubio-Gayosso I, Platts SH and Duling BR. Reactive oxygen species mediate modification of glycocalyx during ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol 290: H2247-H2256 (2006) 7. Vink H and Duling BR. Capillary endothelial surface layer selectively reduces plasma solute distribution volume. Am J Physiol Heart Circ Physiol 278: H285 (2000) 8. Rubio R, Ceballos G,. Role of the endothelial glycocalyx in dromotropic, inotropic, and arrythmogenic effects of coronary flow. Am J Physiol Heart Circ Physiol 278: H106-H116 (2000) 9. Howard MJ and Isacke CM. The C-type Lectin Receptor Endo180 Displays Internalization and Recycling Properties Distinct from Other Members of the Mannose Receptor Family. J Biol Chem 277: 32320-32331 (2002) 10. Mulivor AW and Lipowsky HH. Inflammation- and ischemia-induced shedding of venular glycocalyx. Am J Physiol Heart Circ Physiol 286: H1672-H1680 (2004) 11. van den Berg BM, Vink H and Spaan JA. The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema. Circ Res 92: 592-594 (2003) 12. Constantinescu AA, Vink H and Spaan JA. Elevated capillary tube hematocrit reflects degradation of endothelial cell glycocalyx by oxidized LDL. Am J Physiol Heart Circ Physiol 280: H1051-H1057 (2001) 13. Brouland JP, Gilbert MA, Bonneau M, Pignaud G, Bal Dit SC and Drouet L. Macro and microheterogeneity in normal endothelial cells: differential composition of luminal glycocalyx and functional implications. Endothelium 6: 251-262 (1999) 14. Gerritsen ME, Shen C-P, Atkinson WJ, Padgett RC, Gimbrone MA, Jr. and Milstone DS. Microvascular endothelial cells from E-selectin-deficient mice form tubes in vitro. Lab Invest 75: 175-184 (1996) 15. Kanwar S, Steeber DA, Tedder TF, Hickey MJ and Kubes P. Overlapping roles for L-selectin and P-selectin in antigen-induced immune responses in the microvasculature. Journal of Immunology 162: 2709-2716 (1999) 16. East L, Rushton S, Taylor ME and Isacke CM. Characterization of Sugar Binding by the Mannose
Mannose polymer induces vasodilation
5302
Receptor Family Member, Endo180. J Biol Chem 277: 50469-50475 (2002) 17. Feinberg H, Park-Snyder S, Kolatkar AR, Heise CT, Taylor ME and Weis WI. Structure of a C-type Carbohydrate Recognition Domain from the Macrophage Mannose Receptor. J Biol Chem 275: 21539-21548 (2000) 18. Asumendi A, Alvarez A, Martinez I, Smedsrod B and Vidal-Vanaclocha F. Hepatic sinusoidal endothelium heterogeneity with respect to mannose receptor activity is interleukin-1 dependent. Hepatology 23: 1521-1529 (1996) 19. Zamze S, Martinez-Pomares L, Jones H, Taylor PR, Stillion RJ, Gordon S and Wong SYC. Recognition of Bacterial Capsular Polysaccharides and Lipopolysaccharides by the Macrophage Mannose Receptor. J Biol Chem 277: 41613-41623 (2002) 20. Groger M, Holnthoner W, Maurer D, Lechleitner S, Wolff K, Mayr BB, Lubitz W and Petzelbauer P. Dermal Microvascular Endothelial Cells Express the 180-kDa Macrophage Mannose Receptor In Situ and In Vitro. J Immunol 165: 5428-5434 (2000) 21. Martinez-Pomares L, Mahoney JA, Kaposzta R, Linehan SA, Stahl PD and Gordon S. A Functional Soluble Form of the Murine Mannose Receptor Is Produced by Macrophages in Vitro and Is Present in Mouse Serum. J Biol Chem 273: 23376-23380 (1998) 22. Napper CE, Dyson MH and Taylor ME. An Extended Conformation of the Macrophage Mannose Receptor. J Biol Chem 276: 14759-14766 (2001) 23. Su Y, Bakker T, Harris J, Tsang C, Brown GD, Wormald MR, Gordon S, Dwek RA, Rudd PM and Martinez-Pomares L. Glycosylation Influences the Lectin Activities of the Macrophage Mannose Receptor. J Biol Chem 280: 32811-32820 (2005) 24. Martinez-Pomares L, Hanitsch LG, Stillion R, Keshav S and Gordon S. Expression of mannose receptor and ligands for its cysteine-rich domain in venous sinuses of human spleen. Lab Invest 85: 1238-1249 (2005) 25. Zhang J, Zhu J, Bu X, Cushion M, Kinane TB, Avraham H and Koziel H. Cdc42 and RhoB Activation Are Required for Mannose Receptor-mediated Phagocytosis by Human Alveolar Macrophages. Mol Biol Cell 16: 824-834 (2005) 26. Fernandez N, Alonso S, Valera I, Vigo AG, Renedo M, Barbolla L and Crespo MS. Mannose-Containing Molecular Patterns Are Strong Inducers of Cyclooxygenase-2 Expression and Prostaglandin E2 Production in Human Macrophages. J Immunol 174: 8154-8162 (2005) 27. Rubio-Gayosso, I, Ceballos, G, and Rubio, R. A multimolecular complex sensing coronary flow (CF) locatred on the luminal endothelial cell surface (LECS) mediates positive dromotropic (+D) and inotropic (+I) effects of CF. FASEB Journal 16(5), A864. 3-22 (2002) 28. Pries AR, Secomb TW and Gaehtgens PAL. Structural adaptation and stability of microvascular networks: theory and simulations. Am J Physiol 275: H349-H360 (1998) 29. Dora KA and Garland CJ. Properties of smooth muscle hyperpolarization and relaxation to K+ in the rat isolated mesenteric artery. Am J Physiol Heart Circ Physiol 280: H2424-H2429 (2001)
30. Matsuki T and Duling BR. TNF-alpha modulates arteriolar reactivity secondary to a change in intimal permeability. Microcirculation 7: 411-418 (2000) 31. van Haaren PMA, VanBavel E, Vink H and Spaan JAE. Charge modification of the endothelial surface layer modulates the permeability barrier of isolated rat mesenteric small arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol 289: H2503-H2507 (2005) 32. Halpern W and Kelley M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels 28: 245-251 (1991) 33. Di Virgilio S, Glushka J, Moremen K and Pierce M. Enzymatic synthesis of natural and 13C enriched linear poly-N- acetyllactosamines as ligands for galectin-1. Glycobiology 9: 353-364 (1999) 34. Sumner JB. Dinitrosalicylic acid: a reagent for the estimation of sugar in normal and diabetic urine. J Biol Chem 47: 5-9 (1921) 35. Sumner JB. The estimation of sugar in diabetic urine, using dinitrosalicylic acid. J Biol Chem 62: 287-290 (1924) 36. Spiro RG. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology 12: 43R-456 (2002) 37. Panneerselvam K and Freeze HH. Mannose Enters Mammalian Cells Using a Specific Transporter That Is Insensitive to Glucose. J Biol Chem 271: 9417-9421 (1996) 38. Cacan R, Villers C, Belard M, Kaiden A, Krag SS and Verbert A. Different fates of the oligosaccharide moieties of lipid intermediates. Glycobiology 2: 127-136 (1992) 39. Anken Ev and Braakman I. Versatility of the Endoplasmic Reticulum Protein FoldingFactory. Crit Rev Biochem Mol Biol 40: 191-228 (2005) 40. Ma YG, Cho MY, Zhao M, Park JW, Matsushita M, Fujita T and Lee BL. Human Mannose-binding Lectin and L-Ficolin Function as Specific Pattern Recognition Proteins in the Lectin Activation Pathway of Complement. J Biol Chem 279: 25307-25312 (2004) 41. Wallis R and Dodd RB. Interaction of Mannose-binding Protein with Associated Serine Proteases. Effects of naturally occurring mutations. J Biol Chem 275: 30962-30969 (2000) 42. Chan RK, Ibrahim SI, Takahashi K, Kwon E, McCormack M, Ezekowitz A, Carroll MC, Moore FD, Jr. and Austen WG, Jr. The Differing Roles of the Classical and Mannose-Binding Lectin Complement Pathways in the Events following Skeletal Muscle Ischemia-Reperfusion. J Immunol 177: 8080-8085 (2006) 43. Chen CB and Wallis R. Stoichiometry of Complexes between Mannose-binding Protein and Its Associated Serine Proteases. Defining functional units for complement activation. J Biol Chem 276: 25894-25902 (2001) 44. Fiane AE, Ueland T, Simonsen S, Scott H, Endresen K, Gullestad L, Geiran OR, Haraldsen G, Heggelund L, Andreassen AK, Wergeland R, Froland S, Aukrust P and Mollnes TE. Low mannose-binding lectin and increased complement activation correlate to allograft vasculopathy, ischaemia, and rejection after human heart transplantation. Eur Heart J 26: 1660-1665 (2005) 45. Walsh MC, Bourcier T, Takahashi K, Shi L, Busche MN, Rother RP, Solomon SD, Ezekowitz RA and Stahl GL. Mannose-Binding Lectin Is a Regulator of Inflammation That Accompanies Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury. J Immunol 175: 541-546 (2005)
Mannose polymer induces vasodilation
5303
46. Lansink M, Jong M, Bijsterbosch M, Bekkers M, Toet K, Havekes L, Emeis J and Kooistra T. Increased Clearance Explains Lower Plasma Levels of Tissue-Type Plasminogen Activator by Estradiol: Evidence for Potently Enhanced Mannose Receptor Expression in Mice. Blood 94: 1330-1336 (1999) 47. Linehan SA, Martinez-Pomares L, Stahl PD and Gordon S. Mannose Receptor and Its Putative Ligands in Normal Murine Lymphoid and Nonlymphoid Organs: In Situ Expression of Mannose Receptor by Selected Macrophages, Endothelial Cells, Perivascular Microglia, and Mesangial Cells, but not Dendritic Cells. J Exp Med 189: 1961-1972 (1999) 48. Sorensen KK, Tollersrud OK, Evjen G and Smedsrod B. Mannose-receptor-mediated clearance of lysosomal alpha-mannosidase in scavenger endothelium of cod endocardium. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 129: 615-630 (2001) 49. Gonzalez-Castillo C, Rubio R and Zenteno-Savin T. Coronary flow-induced inotropism is modulated by binding of dextrans to the endothelial luminal surface. Am J Physiol Heart Circ Physiol 284: H1348-H1357 (2003) 50. Hebert E. Endogenous lectins as cell surface transducers. Biosci Rep 20: 213-237 (2000) 51. Kempka G and Kolb-Bachofen V. Binding, uptake, and transcytosis of ligands for mannose-specific receptors in rat liver: an electron microscopic study. Exp Cell Res 176: 38-48 (1988) 52. Magnusson S and Berg T. Extremely rapid endocytosis mediated by the mannose receptor of sinusoidal endothelial rat liver cells. Biochem J 257: 651-656 (1989) 53. Napper CE and Taylor ME. The mannose receptor fails to enhance processing and presentation of a glycoprotein antigen in transfected fibroblasts. Glycobiology 14: 7C-12 (2004) 54. Pino RM. The cell surface of a restrictive fenestrated endothelium. I. Distribution of lectin-receptor monosaccharides on the choriocapillaris. Cell Tissue Res 243: 145-155 (1986) 55. Wienke D, MacFadyen JR and Isacke CM. Identification and Characterization of the Endocytic Transmembrane Glycoprotein Endo180 as a Novel Collagen Receptor. Mol Biol Cell 14: 3592-3604 (2003) 56. Opanasopit P, Shirashi K, Nishikawa M, Yamashita F, Takakura Y and Hashida M. In vivo recognition of mannosylated proteins by hepatic mannose receptors and mannan-binding protein. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 280: G879-G889 (2001) 57. Taylor ME, Conary JT, Lennartz MR, Stahl PD and Drickamer K. Primary structure of the mannose receptor contains multiple motifs resembling carbohydrate-recognition domains. J Biol Chem 265: 12156-12162 (1990) 58. Figueroa XF, Isakson BE and Duling BR. Connexins: Gaps in Our Knowledge of Vascular Function. Physiology 19: 277-284 (2004) 59. Figueroa XF, Isakson BE and Duling BR. Vascular Gap Junctions in Hypertension. Hypertension 48: 804-811 (2006) 60. Hart ML, Ceonzo KA, Shaffer LA, Takahashi K, Rother RP, Reenstra WR, Buras JA and Stahl GL. Gastrointestinal Ischemia-Reperfusion Injury Is Lectin
Complement Pathway Dependent without Involving C1q. J Immunol 174: 6373-6380 (2005) Key Words: Mannose Receptor, Mannose Polymer, Endothelial Glycocalyx, Vascular Endothelium Send correspondence to: Dr. Guillermo Ceballos, Seccion de Estudios de Posgrado, Escuela de Medicina, IPN, Plan de San Luis y Diaz Miron S/N, Mexico City, D. F., 11340 Mexico, Tel: 52-555729600062820, Fax: 52-555729600062794, E-mail: [email protected] http://www.bioscience.org/current/vol13.htm
