ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

ESTUDIO DE LA ROBUSTEZ DEPROTOCOLOS PARA LA PREPARACIÓN DEMUESTRAS ORGÁNICAS E INORGÁNICAS

A SER OBSERVADAS EN LOSMICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS DE

BARRIDO Y DE TRANSMISIÓN EN LAESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO

PREVIA A LA OBTENCIÓN DE GRADO ACADÉMICO OTÍTULO DE:

INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA

ELABORADO POR:

SARA ALEJANDRA GUERRA ULLOA

SANGOLQUÍ, FEBRERO DE 2012

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HOJA DE LEGALIZACIÓN DE FIRMAS

ELABORADO POR

Sara Alejandra Guerra Ulloa

COORDINADORA DE LA CARRERA

Ing. Tatiana Páez

SECRETARIO ACADÉMICO

Abogado Carlos Orozco

Sangolquí, Febrero de 2012

ii

CERTIFICACIÓN

Certifico que el presente trabajo fue realizado en su totalidadpor la Srta. SARA ALEJANDRA GUERRA ULLOA como re-querimiento parcial a la obtención del título de INGENIERÍA ENBIOTECNOLOGÍA

_______________________Fecha

Dr. Alexis Debut, Ph.D Ing. Tatiana Páez Barrera

iii

DEDICATORIA

A María José, mi eterna alegría y por quién lo haría todo, a mi madre, mieterna sensibilidad y quién me enseñó a luchar en la vida, a mi padre, mi eternahonestidad, y quién me enseñó a ser correcta en mis actos.

Sara Alejandra Guerra Ulloa

iv

AGRADECIMIENTO

A Jesús, por llevarme en sus brazos cuando yo no podía más, por darme másde lo que necesito cada día y porque me deja sentirlo en las personas que amo.

Al Dr. Alexis, por su confianza depositada en mí y sobre todo por la pacien-cia que tuvo para enseñarme lo que ahora sé acerca de microscopía electrónica.

A la Ing. Tati, por su apoyo para que esta tesis culmine y porque siempreestuvo pendiente de lo que yo necesitaba.

Al Dr. Amano y la Dra. Díaz por darme la oportunidad de trabajar conellos y aprender nuevas cosas aplicables para este estudio.

A mis padres, hermana, mami Yola y Carmelina porque cada uno no aportócon su granito de arena, sino que aportaron con miles de granitos para que yoesté aquí ahora, así que debo decir que nos hemos graduado por fin.

A la ñaña Raquel, Babi y tía Meybol, por ser las tías que están dispuestasa ayudarme en las cosas más pequeñas hasta en los grandes problemas, porbrindarme su apoyo y consejos no solo en mis estudios sino en la vida.

A todos mis primos y primas por darme motivos para sonreír en los tiemposde aventura que Dios nos pone en el camino.

A Cris, Andrey, Christian, Lili, Rose, Ale y Kary por ser los ángeles queDiosito mandó para estar a mi lado, por alegrarse con mis triunfos y por acom-pañarme en mis momentos de tribulación durante el desarrollo de la tesis ydurante cinco años.

Sara Alejandra Guerra Ulloa

v

RESUMEN

Con la finalidad de implementar una nueva área de laboratorio en la carrerade Ingeniería en Biotecnología en la Escuela Politécnica del Ejército, se realizóla adquisición de los microscopios electrónicos de transmisión y de barrido paracontinuar fomentando la investigación en la Universidad. El presente estudiopretende estudiar la robustez de los protocolos para la preparación de muestrasorgánicas e inorgánicas y de esa manera estar en la posibilidad de brindar losmejores servicios de análisis que ofrecen los microscopios a las instituciones yempresas del país. Se estudió protocolos para 13 muestras de referencia, de lascuales 5 fueron tratadas para el MET (microscopio electrónico de transmisión)y 8 para el MEB (microscopio electrónico de barrido); cuando se determinó unprotocolo para cada muestra, se lo repitió 10 veces en las mismas condiciones ycon el mismo operador para determinar el 90% de su robustez. Los resultadosindican que el recubrimiento de las rejillas de cobre con formvar y carbono parasoportar las muestras es estable para las nanopartículas de hierro cero valentey sulfuro de hierro, sin embargo para bacterias y virus es suficiente con unacapa de formvar; mientras que para el MEB, se estableció que el tratamientode fijación con glutaraldehido, post fijación con tetraóxido de osmio, deshidrat-ación alcohólica, secado con freeze drying y metalización con oro es el mejortratamiento para la conservación de la morfología de las muestras. Los proto-colos elegidos para las muestras pueden ser aplicados en el laboratorio ya quelas metodologías utilizadas son válidas y confiables.

vi

ABSTRACT

A Transmission Electron Microscope (TEM) and a Scanning Electron Mi-croscope (SEM) were purchased by Escuela Politécnica del Ejército to promoteresearching in the area of Biotechnology Engineering. This study intends toexamine the robustness of the protocols with SEM and TEM to prepare organicand inorganic samples offering high performance analysis and high quality ser-vice for the scientific community in Ecuador. Protocols were studied for 13 refer-ence samples, where 5 were treated for TEM and 8 for the SEM. In this processeach determined protocol was tested 10 times under same conditions with onlyone researcher to determine its robustness with values equal or greater than90%. The results achieved with TEM showed that formvar and carbon coatingsof the copper grids help to hold the samples, and these coatings are stable forzero-valent iron nanoparticles as much as the iron sulphide, notice that, only onelayer of formvar was required to test the bacteria and viruses. SEM protocol inthis research with glutaraldehyde for the fixation process, osmium tetroxide forpost fixation, alcoholic dehydration, drying with freeze dryer and metallizationwith gold showed that this is the most excellent treatment used to maintain themorphology for these samples. As result of this research the protocols selectedin order to test the samples demonstrate that TEM and SEM protocols arereliable and applicable to the Electron Microscopy Laboratory.

vii

Índice general

1. Generalidades 91.1. Procesos de absorción, difracción, interferencia y límite de resolución . . . 10

1.1.1. Proceso de absorción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101.1.2. Proceso de difracción e interferencia . . . . . . . . . . . . . . . . . 101.1.3. Límite de resolución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.2. Interacción de los electrones con la materia . . . . . . . . . . . . . . . . . 161.2.1. Electrones secundarios (ES) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191.2.2. Electrones retro dispersos (ERD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201.2.3. Rayos X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211.2.4. Electrones Auger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221.2.5. Cátodo luminiscencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

1.3. Características generales para la obtención de una imagen . . . . . . . . . 231.3.1. Sistema de vacío . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231.3.2. Sistema de generación del haz de electrones y su manipulación . . 251.3.3. Ajustes de parámetros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 311.3.4. Aberraciones de los lentes de los microscopios . . . . . . . . . . . . 331.3.5. Sistemas de detección para el MET y el MEB . . . . . . . . . . . . 38

1.4. Preparación de muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401.4.1. Preparación de muestras para el MEB . . . . . . . . . . . . . . . . 40

1.4.1.1. Preparación de muestras para materiales biológicos, or-gánicos, poliméricos e hidratados . . . . . . . . . . . . . . 40

1.4.1.2. Tinción de polímeros y plásticos . . . . . . . . . . . . . . 431.4.1.3. Daños . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 431.4.1.4. Técnicas de recubrimiento y conductividad para el MEB . 46

1.4.2. Preparación de muestras para el MET . . . . . . . . . . . . . . . . 481.4.2.1. Capas de soporte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 481.4.2.2. Tinción negativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

1.5. Robustez de un protocolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

2. Materiales y métodos 512.1. Protocolos para muestras inorgánicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

2.1.1. Protocolo para la preparación de nanopartículas de hierro cero va-lente y de sulfuro de hierro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

2.2. Protocolos para muestras orgánicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 512.2.1. Protocolo para la preparación de bacterias . . . . . . . . . . . . . . 532.2.2. Protocolo para la preparación de virus de plantas . . . . . . . . . . 54

1

Índice general

2.2.3. Protocolo para cortes ultra finos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552.2.3.1. Preparación de la muestra de tejido humano . . . . . . . 552.2.3.2. Preparación de la resina . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552.2.3.3. Cortes semi finos y ultra finos . . . . . . . . . . . . . . . 55

2.2.4. Protocolo para la preparación de polen . . . . . . . . . . . . . . . . 562.2.5. Protocolo para la preparación de garrapatas . . . . . . . . . . . . . 562.2.6. Protocolo para la preparación de moscas de la fruta . . . . . . . . 582.2.7. Protocolo para la preparación de hongos ambientales y vegetales . 582.2.8. Protocolo para la preparación de microalgas . . . . . . . . . . . . 582.2.9. Protocolo para la preparación de cromosomas humanos . . . . . . . 59

3. Resultados 613.1. Nanopartículas de hierro cero valente y sulfuro de hierro . . . . . . . . . . 613.2. Bacterias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613.3. Virus vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 653.4. Cortes ultra finos de tejidos humanos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 653.5. Polen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 653.6. Garrapatas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 653.7. Mosca de la fruta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 723.8. Hongos ambientales y vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 723.9. Microalgas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 723.10. Cromosomas humanos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 723.11. Estadística . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

4. Discusión 86

5. Conclusiones 90

6. Recomendaciones 91

2

Índice de cuadros

1.1. Comparación entre las fuentes de energía del cañón de electrones [31]. . . 281.2. Lista de grupos funcionales específicos y tinciones respectivas para alcanzar

la distinción de capas en polímeros y plásticos [27]. . . . . . . . . . . . . . 441.3. Daños frecuentes que aparecen debido a fallas en la preparación de la

muestra [27]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451.4. Soluciones para tinción negativa [43] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

2.1. Protocolos estudiados para la preparación de rejilla para la observaciónde nanopartículas. TOO: Tetraóxido de osmio. ALL: en agua lluvia. AD:en agua destilada. A dichos tratamientos escogidos como los mejores paralas rejillas se los repitió 10 veces con el objetivo de comprobar que losresultados que se consiguen son robustos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

2.2. Protocolos estudiados para la preparación de rejilla para la observación debacterias. BFP: Bacterias fijadas. BMC: bacterias en medio de cultivo. . . 53

2.3. Protocolos estudiados para la preparación de rejilla para la observación devirus vegetales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

2.4. Descripción de los protocolos usados para la preparación de muestras or-gánicas a ser observadas bajo el MEB. TOO: tetraóxido de osmio al 1%. . 57

3

Índice de figuras

1.1. Esquematización de una muestra delgada irradiada con el haz de electro-nes. Los electrones son emitidos y pasan por 2 o 3 lentes condensadores.El objetivo provee la formación de la imagen o del patrón de difracción [6]. 11

1.2. Imagen de eritrocitos en campo oscuro capturada con el MET [39]. . . . . 141.3. Esquematización de la difracción de Fraunhofer, que muestra el proceso

cuando la luz pasa por un apertura circular. . . . . . . . . . . . . . . . . 141.4. (a) Esquematización de dos puntos de emisión cercanos cuyos puntos de

difracción que también son cercanos describen el criterio de Rayleigh, (b)Discos Airy formados por la difracción de dos puntos adyacentes, (c) Cri-terio de Rayleigh: dos líneas espectrales son todavía distinguibles si elmáximo de uno coincide con el primer mínimo del otro. . . . . . . . . . . 15

1.5. Apertura numérica: n sin (a) [50, 55]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161.6. Ilustración de las reacciones que ocurren al momento en que el haz de

electrones primario llega a la muestra [17]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181.7. Señales útiles que son generadas cuando el haz de electrones enfocado

interactúa con la muestra. Cuando la muestra es gruesa, más de 100 nm, loselectrones son absorbidos por la muestra y por lo tanto no son transmitidos[56]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

1.8. Diagrama esquemático que muestra el camino del electrón primario [56]. . 201.9. Ilustración de la generación de electrones Auger y de rayos X característi-

cos [56]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221.10. (a). Diagrama de la columna y (b) detalle de las partes del MET, (c)

Diagrama de la columna y (d) detalle de las partes del MEB [17]. . . . . 241.11. Esquemas de las bombas donde se muestra las partes principales. (a) Bom-

ba rotatoria, (b) Bomba de difusión, (c) Bomba iónica, (d) Bomba turbomolecular [65, 20]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

1.12. Diagrama de los componentes que conforman el cañón de electrones: fila-mento, cilindro Wehnelt y ánodo [56]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

1.13. Fotografía de bacterias capturada cuando el filamento de tungsteno habíaacabado su tiempo de vida media. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

1.14. (a) Sistema de lentes en el MEB. Las aperturas en los lentes condensadores(gris claro) ayudan a la propagación del haz de electrones y el control de lacorriente del haz, mientras que las aperturas de los objetivos (gris oscuro)determina la convergencia del semi- ángulo a, (b) sistemas de lentes en elMET. [56]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

1.15. Convergencia del semi- ángulo a en los lentes objetivos [56]. . . . . . . . . 31

4

Índice de figuras

1.16. Lentes con aberración esférica, que muestra un enfoque más detallado delos rayos fuera del eje [23]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

1.17. Diagrama de rayos que muestra el efecto de la aberración cromática. Loselectrones con diferentes energías por ende con diferentes longitudes deonda llegan al mismo punto en los lentes y son enfocados en diferentesplanos [56]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

1.18. Efectos de aperturas del objetivo pequeñas (a), medianas (b) y grandes(c) en la resolución de puntos de luz [23]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

1.19. Corrección del astigmatismo de los lentes [23]. . . . . . . . . . . . . . . . 361.20. Ilustración del efecto del astigmatismo en franjas de Fresnel alrededor de

un soporte de carbono con partículas de oro. Las imágenes (a), (b) y(c) muestran el astigmatismo corregido, mientras las imágenes (d) y (e)muestran la presencia de astigmatismo, indicando la ausencia de franjas deFresnel alrededor del agujero, y la presencia de una dirección preferencialde la imagen [29]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

1.21. (a) Esquematización del proceso de detección de la señal para la obtenciónde información topográfica y (b) representación esquemática del detectorde ES Everhart-Thornley [17]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.1. Fotografías de nanopartículas de hierro cero valente preparadas en aguade lluvia. (a) Preparadas en ese momento con TOO al 1% sobre un rejillacubierta con formvar y carbono, (b) Preparadas después de 1 día, coloca-das sobre una rejilla cubierta con formvar y carbono donde la muestra sedejó secar al ambiente, (c) Preparadas después de 2 días colocadas sobreuna rejilla cubierta con formvar donde la muestra fue secada con papelfiltro (d) Preparadas después de 7 días colocadas sobre una rejilla cubiertacon formvar donde la muestra fue secada con papel filtro; tomadas en elmicroscopio electrónico de transmisión a 80 kV. . . . . . . . . . . . . . . . 62

3.2. Fotografía de nanopartículas de sulfuro de hierro preparadas con aguadestilada. (a) Preparadas en ese momento sobre una rejilla cubierta conformvar y carbono donde la muestra se secó al ambiente, (b) Preparadasdespués de 1 día colocadas sobre una rejilla cubierta con formvar y poly-L-lysine donde la muestra se secó con papel filtro, (c) Preparadas después de20 días colocadas sobre una rejilla cubierta con formvar donde la muestrafue secada con papel filtro, (d) Preparadas después de 20 días colocadassobre una rejilla cubierta con formvar y carbona donde la muestra fue se-cada con papel filtro; tomadas en el microscopio electrónico de transmisióna 80 kV. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

3.3. Distribución del tamaño de las nanopartículas de hierro cero valente pre-paradas en agua de lluvia y agua destilada, a diferentes días después de lapreparación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

3.4. Distribución del tamaño de las nanopartículas de sulfuro de hierro prepa-radas en agua de lluvia y agua destilada, a diferentes días después de supreparación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

5

Índice de figuras

3.5. Imágenes capturadas con el MET a 80 kV de Bacillus thuringiensis continción negativa y sometidas a estrés donde se puede identificar la gene-ración de esporas y cristales. (a) Refrigerada 1 hora, preparada en unarejilla cubierta con formvar y secada el exceso con papel filtro, (b) Concontraste, refrigerada 23 horas preparada en una rejilla cubierta con form-var y secada el exceso con papel filtro, (c) Refrigerada 1 día, preparada enuna rejilla cubierta con formvar y carbono y secadas con papel filtro, seobserva la espora dentro de la bacteria sin embargo aún no se forman cris-tales, (d) Refrigerada 1 día, preparada en una rejilla cubierta con formvary carbono y secadas con papel filtro, se observa la expulsión de esporas, (e)Refrigerada por 5 días, preparada en una rejilla cubierta con formvar, seobserva la espora y cristal dentro de la bacteria, (f) Refrigerada por 5 días,preparada en una rejilla a con formvar, se observa las bacterias rodeadasde esporas y cristales, (g) Cristal de B. thuringiensis de 1,59 µm en ladiagonal mayor y 724 nm en la diagonal menor en una rejilla cubierta deformvar y secado el exceso de muestra al ambiente, (h) Refrigerada masde 7 días, preparada en una rejilla de formvar y carbono secado con papelfiltro, se observa gran cantidad de cristales y esporas expulsados por lasbacterias, (i) Bacteria 2 días en refrigeración, preparada en una rejilla deformvar y secada con papel filtro, se observa la división celular. . . . . . . 66

3.6. Imagen virus vegetales. (a) y (b) Imágenes de Potex virus de una muestraconcentrada de virus de orquídea, (c) Poty virus de césped manicero. Lasfotografías fueron capturadas en el microscopio electrónico de transmisióna 80 kV. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

3.7. Tejido humano renal de paciente con lupus eritematoso en donde se mues-tra depósitos de electrón densos subendoteliales capturado con el MET a80 kV. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

3.8. Imágenes de polen de cucarda capturadas con el MEB a 5 kV. (a) Polencolocado directamente en la estufa a 40°C por 24 horas, las líneas marca-das horizontalmente son interpretadas como falta de deshidratación, (b)Polen colocado directamente en el liofilizador a -62°C y vacío de 1,2 Papor 24 horas, de igual manera las líneas horizontales muestran la falta dedeshidratación de la muestra, (c) Polen preparado con el protocolo 3, (d)y (e) Polen preparado con el protocolo 4, nótese la exina desprendiéndosedebido a que la muestra fue tomada de una flor adulta, (f) Polen preparadocon el protocolo 4, nótese la superficie granulosa del polen. . . . . . . . . . 69

3.9. Polen de Polylepis pauta preparado con protocolo 4, observado en el MEBa 5kV. (a), (b) y (c) Antera de flor adulta, se observan los pólenes li-geramente deformados, gran parte de ellos han conservado su forma, (d)Granos de polen maduro sostenidos en los estambres. . . . . . . . . . . . 70

3.10. Polen de Polylepis pauta preparado con protocolo 4, observado en el MEBa 5kV. (a) Grano de polen maduro, capturada a 10kV, (b) y (c) Anterasde flor joven, se observan los pólenes con su morfología conservada, (d)Grano de polen joven. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

6

Índice de figuras

3.11. Imágenes de las garrapatas adquiridas en el MEB a 5 kV. (a) Vista dela parte anterior, tratada con el protocolo 1 sin hipóstomo ni pedipalpo,deformada por el protocolo utilizado además de la falta de deshidratación,(b) Vista de la parte dorsal tratada con el protocolo 2 a -62°C y a unvacío de 1,2 Pa durante 24 horas, se observa la falta de deshidratación yla deformación de la garrapata, (c) Vista de la parte dorsal tratada con elprotocolo 3, se conserva la forma de la garrapata y sus estructuras delicadascomo el hipóstomo, (d), (e) y (f) garrapatas tratadas con el protocolo 4,conserva perfectamente su estructura y forma. . . . . . . . . . . . . . . . . 73

3.12. Imágenes de las espinas de la coxa de una garrapata capturadas con elMEB a 5 kV sometidas a secado en la estufa a 70°C durante un día. . . . 74

3.13. Drosophila melanogaster tratada con los 4 protocolos cuyas imágenes fue-ron adquiridas con el MEB a 5kV. (a) Mosca colocada directamente en laestufa a 70°C, se notan los daños en los ocelos y la falta de deshidrataciónde la muestra porque se observan líneas horizontales en la fotografía, (b)Mosca colocada directamente en el liofilizador a -62°C y a un vacío de 1,2Pa durante 24 horas, se observa claramente la deformación en los ocelosy el exceso de agua en la muestra, (c) Mosca tratada con el protocolo4, se nota claramente que D. melanogaster no resiste al TOO porque sumorfología esta totalmente afectada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

3.14. Drosophila melanogaster tratada con los 4 protocolos cuyas imágenes fue-ron adquiridas con el MEB a 5kV. (a), (b) y (c) Muestras sometidas alprotocolo 3, con la variación de haber aumentado a una hora el tiempo deexposición en glutaraldehido 3%. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

3.15. Fotografías de hongos ambientales adquiridas con el MEB a 5 kV. (a)Hongo sometido a 40°C durante 2 días, se aprecian algunos esporangiosdeformados, (b) Micelios sometidos a estufa a 40°C por 2 días, (c) Vistalejana del micelio de una muestra de hongo sometida al protocolo 2 encondiciones de -62°C y a un vacío de 1,2 Pa durante 24 horas, (d) Acer-camiento del micelio, se observa que el protocolo no ayudó a mantener laestructura de los esporangios. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

3.16. Fotografías de hongos ambientales adquiridas con el MEB a 5 kV. (a) Su-perficie de la muestra de hongo sometida al protocolo 3 se observa unaleve conservación de los esporangios, (b) Micelio bajo el tratamiento delprotocolo 3, (c) Esporangio sometido al protocolo 4, totalmente conser-vado su estructura, (d) Grupo de esporangios que fueron tratados con elprotocolo 4. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

7

Índice de figuras

3.17. Hongos de cítricos crecidos en la corteza, las imágenes fueron tomadas enel MEB a 5 kV. (a) Hongo expuesto a 40°C en estufa por 24 horas, seaprecia la ausencia de mayores daños en la muestra, (b) Hongo secadoen liofilizador a -62°C y a un vacío de 1,2 Pa durante 24 horas, de igualmanera no se observan daños severos en las muestras, (c) y (d) Hongossometidos al protocolo 3, se observa claramente que la muestra no resiste altratamiento, (e) y (f) Hongos tratados con el protocolo 4, los esporangiosse encuentran bien conservados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

3.18. Imágenes de microalgas Tuboc 1obtenidas con el MEB a 5 kV. (a) y (b)Microalgas expuestas a 40°C en la estufa durante 24 horas, la mayoría de lamuestra se encuentra dañada por el calor, (c) y (d) Muestra de microalgassometidas al liofilizador, se observa que el protocolo causa deformación enlas muestras. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

3.19. Imágenes de microalgas Tuboc 1 obtenidas con el MEB a 5 kV. (a) y (b)Microalgas tratadas con el protocolo 3, se puede apreciar que el protocoloforma una estructuras de forma filamentosas sobre la superficie de lasmicroalgas, (c) y (d) Microalgas sometidas al protocolo 4, el espécimen seconservan perfectamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

3.20. Muestras de cromosomas humanos preparados con diferentes protocoloscapturadas en el MEB a 5 kV. (a) Protocolo 4, a más de los cromosomasse observa gran cantidad de impurezas que obstaculizan la visualizaciónde la morfología de los cromosomas, (b) y (c) Protocolo 3 y protocolo 1,se aprecian los cromosomas pero falta definición de su forma, (d), (e) y (f)Protocolo 5 aplicado a muestras teñidas, se observa la morfología de loscromosomas, sus cromátides y su centrómero a 30° de inclinación.En (e)se puede identificar un cuadrado alrededor se los cromosomas debido a lacontaminación que se genera. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

3.21. Imágenes de Muestras de cromosomas humanos capturadas con el MEB a5 kV. (a), (b) y (c) Protocolos 5, que muestra a cariotipos sin tinción, lasimágenes no tienen inclinación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

3.22. Resultados de los protocolos elegidos para el uso en el laboratorio de mi-croscopía electrónica para las muestras de nanopartículas de hierro cerovalente y sulfuro de hierro, bacterias y virus vegetales. A cada uno se lehizo 10 repeticiones con el objetivo de estudiar su robustez. . . . . . . . . 84

3.23. Resultados de los protocolos elegidos para el uso en el laboratorio de mi-croscopía electrónica para las muestras de cortes ultrafinos de tejido hu-mano, granos de polen, garrapatas mosca de la fruta. A cada uno se lehizo 10 repeticiones con el objetivo de estudiar su robustez. . . . . . . . . 84

3.24. Resultados de los protocolos elegidos para el uso en el laboratorio de mi-croscopía electrónica para las muestras de hongos ambientales y vegetales,microalgas y cromosomas humanos. A cada uno se le hizo 10 repeticionescon el objetivo de estudiar su robustez. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

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1 Generalidades

La obtención de las imágenes es un proceso similar entre el microscopio óptico y elmicroscopio electrónico, y para su alcance influyen algunos factores que pueden mejorar odistorsionar el resultado final; aunque existan protocolos establecidos para la preparaciónde muestras a ser observadas en los microscopios es muy difícil hacer que un métodofuncione de igual manera en un lugar que en otro debido a la cantidad de parámetrosque se juegan al momento, no solo de la preparación de la muestra sino también delfuncionamiento de los equipos, su manipulación y de las interacciones que se pueden daren la muestra. Al hablar de los equipos, veremos que su constitución es radicalmenteinfluyente para que un protocolo sea exitoso. De modo que para comenzar a hablar delos equipos utilizados para la obtención de imágenes se inicia diciendo que existen doscomponentes cruciales que forman la imagen, primero los lentes objetivos, que recogenla luz difractada por la muestra y forman una imagen real magnificada en el planointermedio de la imagen real cerca de los oculares, y segundo los lentes condensadores, queenfocan la luz desde el iluminador sobre una pequeña área de la muestra [46]. Entoncescuando la muestra está colocada en el microscopio, es examinada a través de los objetivos,los que producen la magnificación de la imagen real, y en el momento en que nosotrosobservamos, el ocular actúa en conjunto con nuestra cornea y los lentes proyectan unasegunda imagen real en la retina, luego de ser percibida es interceptada por el cerebrocomo una imagen virtual magnificada [46]. En cambio para los instrumentos que poseensistemas para fotografías, la imagen intermedia es grabada directamente o proyectadacomo imagen real en la cámara. En resumen la magnificación de la imagen se da cuandolos rayos luminosos de la fuente de luz pasan por un condensador y desde aquí los rayospasan por el interior del lente objetivo (lente más próximo a la muestra), finalmentela muestra vuelve a ser ampliada por el ocular [25]. A pesar de que la obtención de lasimágenes es similar entre el microscopio óptico y el electrónico, su diferencia fundamentales que el óptico utiliza la luz visible para observar estructuras en las muestras que son delorden de un décimo de micrometro, mientras que el electrónico utiliza un haz de electronespara el mismo fin pero con una longitud de onda que puede ser del orden del picometro,menor a la longitud de onda de la luz visible por un factor de varios miles [3] . El presentecapitulo se enfocará en cinco tópicos principales los cuales facilitarán la comprensión delproceso tan complejo de formación de imágenes en los microscopios electrónicos gracias ala absorción, difracción, interferencia los que nos llevará a definir el límite de resolución;en segundo lugar se explicará la interacción del haz de electrones con la materia y cómoes el funcionamiento básico de los microscopios electrónicos de transmisión (MET) ybarrido (MEB). Se hablará acerca de los protocolos para la preparación de muestraspara que puedan ser observadas bajo los microscopios electrónicos de transmisión y debarrido y por último se realizará un análisis de la robustez de los protocolos garantizando

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1 Generalidades

la eficiencia de los resultados obtenidos en el laboratorio de microscopía electrónica dela Escuela Politécnica del Ejército.

1.1. Procesos de absorción, difracción, interferencia y

límite de resolución

Existen aspectos importantes que se requieren para la formación de la imagen, comoson los procesos de absorción, difracción e interferencia. Los tres son la clave esencial paraobtener imágenes con alta resolución y veremos que ellos también influyen en la robustezde un protocolo, ya que primeramente, si no se dan dichos procesos, no se obtiene unaimagen y segundo, la proporción en que se dé la difracción y por ende la interferencia deelectrones determinará los detalles más finos que pueden ser observados de la muestra.

1.1.1. Proceso de absorción

A la absorción se la puede entender cuando los electrones son absorbidos por el materialy provocan cambio de niveles energéticos, que alteran los modos de vibración, traslacióno rotación de las moléculas [3]. De modo que la absorción de los electrones es la respon-sable de lo que se conoce como contraste de amplitud de la imagen, mientras que loselectrones dispersados en ángulos muy pequeños, forman el contraste de fase. El contras-te de amplitud es determinante en la formación de la imagen de especímenes biológicos,no cristalinos, mientras que el contraste de fase y de difracción son decisivos en los es-pecímenes cristalinos [45]. El contraste es una diferencia en intensidad entre dos zonasadyacentes. En el MET se hace una distinción fundamental entre contraste de amplitudy contraste de fase. En la mayoría de situaciones ambos tipos contribuyen a la formaciónde la imagen pero uno de ellos tiende a dominar [27], en general, el contraste de amplitudes dominante en especímenes con estructuras grandes, y el contraste de fase es efectivoen estructuras finas [5]. En las imágenes de contraste de amplitud se obtienen imágenesde campo claro o campo oscuro seleccionando mediante diafragmas o aperturas, el hazdirecto o los haces dispersados, respectivamente. Dentro del contraste de amplitud existeel contraste debido al grosor o masa de la muestra, que se produce debido a la dispersiónincoherente y elástica de los electrones al atravesar la muestra. El contraste de difracciónde electrones se produce debido a la dispersión coherente y elástica de los electrones alatravesar la muestra y está controlado por la estructura cristalina y la orientación dela misma [27, 6], este proceso se da cuando la dispersión de los electrones se produce aun ángulo determinado, llamado ángulo de Bragg y por tanto sólo aparece en muestrascristalinas [6, 27].

1.1.2. Proceso de difracción e interferencia

Los electrones muestran características tanto de onda como de partícula. Cuando seatiende a su comportamiento ondulatorio se pueden observar variaciones tanto en laamplitud como en la fase de la onda al atravesar la muestra y ambos tipos de variacióndan lugar al contraste en la imagen como se habló anteriormente. El contraste de una

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1 Generalidades

Figura 1.1: Esquematización de una muestra delgada irradiada con el haz de electrones.Los electrones son emitidos y pasan por 2 o 3 lentes condensadores. El objetivoprovee la formación de la imagen o del patrón de difracción [6].

imagen en el proceso de difracción se da por las diferencias de fase, que se forma por lainteracción de más de un haz de electrones y generalmente se asocia con la microscopíaelectrónica de alta resolución (HRTEM) aunque a bajos aumentos también se produceeste tipo de contraste. Este contraste se utiliza ampliamente de tres formas: a) imágenesque se relacionan directamente con la estructura periódica de una muestra cristalina;b) imágenes de franjas de Moiré; c) imágenes de contraste de Fresnel [6]. Por lo tantoen el MET es necesario que se dé la difracción de los electrones, figura 1.1, para que sepueda formar una imagen. La estructura periódica de la muestra actúa como una red dedifracción y esparce los electrones de una manera predictiva, de modo que si se trabajacon el patrón de difracción observado, es posible deducir la estructura de la muestra,resultando en la obtención de imágenes.

En el MET los electrones pasan a través de una capa fina del material estudiado yel patrón de difracción es observado en la pantalla fluorescente o usando dispositivos decarga acoplada, cámara CCD [8]. Los electrones son dispersados por los átomos comoresultado de las interacciones de Coulomb con núcleo de carga positiva y con una nubede electrones de carga negativa [27]. Lo que sucede en el proceso de difracción en elmicroscopio es que la luz desde el iluminador es difractada, en el sentido de que sedispersa o se propaga por la muestra colectada por los lentes objetivos y enfocada en elplano de la imagen donde las ondas interfieren constructivamente y destructivamente para

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1 Generalidades

formar una imagen de alto contraste [46]. La difracción de las ondas y su recombinación(interferencia) son fenómenos de la óptica física o de la óptica ondulatoria y su estudioes importante para entender cómo la onda lleva información de un objeto y es capazde crear una imagen en el plano focal de los lentes [46]. Vemos así que la difracciónocurre cuando una onda interactúa con un objeto, de modo que la preparación de lamuestra debe ser lo menos invasiva para no alterar su geometría y por ende el patrónde difracción; por tanto la imagen que se obtendrá tendrá las características propiasde la muestra y el protocolo será más robusto. Según la muestra, la difracción se dade diferentes maneras; por ejemplo cuando la onda cae directamente en el borde de unobjeto, la onda parece “doblarse” alrededor del objeto en su sombra geométrica [46]. Ladifracción está presente cuando la onda cambia de dirección en los bordes de los objetos yla interferencia es el refuerzo o disminución de la intensidad cuando dos ondas coherentesinciden en el mismo punto [3]. Dependiendo de la naturaleza de la muestra, un patrónde difracción usualmente consiste en una serie de anillos para muestras que consistenen micro cristales orientados al azar o en puntos finos con una distancia discreta paramuestras con un solo cristal. Cada punto fino en el patrón de difracción es una imagen dela fuente de electrones [54]. Las condiciones de difracción pueden ser dichas en términosdel espacio directo, es decir de la red, o en términos del espacio de difracción, es decirde la red recíproca [6]. Si la atención se centra en la red de las condiciones de difracción,la ley que rige es la de Bragg, que establece que los diferentes caminos entre las ondasreflejadas por los sucesivos planos de red son un número entero de longitud de onda [6];y define las direcciones de la difracción del haz que dependen de la longitud de onda delos electrones y del espaciamiento de la red cristalina [54] de la siguiente manera:

n.lhkl = 2.dhkl.sin(j) (1.1)

Donde n es una integral, l es la longitud de onda del electrón, d es la distancia entre lared cristalina y los planos atómicos, j es el ángulo de incidencia y también de reflexión.Esto da las condiciones para la interferencia constructiva de las ondas de electronesdispersos [54]. En cambio, en un espacio recíproco las condiciones de difracción puedenser formuladas en términos de la esfera de Ewald: kg = ko + g donde ko es el vectoronda de la onda incidente del plano y kg es el vector onda de la onda dispersada. Eltérmino g es un vector de red recíproco llamado vector de difracción [6]. La esfera deEwald es una construcción geométrica utilizada en difracción de neutrones, difracción deelectrones y en cristalografía de rayos X, que demuestra la relación entre la longitud deonda del haz incidente y el difractado o la relación entre el ángulo de difracción de unareflexión dada y la red recíproca del cristal [54]. El factor de dispersión atómica contienedos contribuciones de signo opuesto:

frc(j) =me2l2h2

=Z − frx(j)sin2(j) (1.2)

Donde frc(j) es el factor de dispersión atómica para rayos X, los cuales son únicamentedispersados por la nube de electrones, Z es el número atómico, l es la longitud de ondadel electrón, m es la masa del electrón, e es la carga del electrón, h es la constante de

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1 Generalidades

Planck, j es el ángulo de dispersión [6]. La amplitud difractada en cualquier direccióndada por un conjunto de átomos es la suma de las amplitudes dispersadas por átomosindividuales en esa dirección teniendo en cuanta las diferente fases como resultado de lageometría del conjunto. En un cristal, los átomos se localizan en una red tri-dimensionalque pueden ser caracterizadas por 3 vectores base a1, a2, y a3. Un nodo de red en generalestá dado por:

AL = l1.a1 + l2.a2 + l3.a3 (1.3)

donde lj son enteros [6]. Existen dos sitios de difracción primaria: uno en la muestra ensí y otro en la apertura del objetivo. Si la luz pasa por el objetivo y no es difractadaentonces permanece invisible y no se puede observar ninguna imagen [46]. Así comola difracción describe la dispersión de la luz por un objeto en ondas divergentes, lainterferencia describe la recombinación y la suma de dos o más ondas superpuestas. Estosdos procesos son manifestaciones de un mismo proceso [46]. Al hablar de interferenciauno piensa en que las ondas se aniquilan unas con otras, sin embargo, al poder recuperarcompletamente el patrón de difracción, se entiende que lo que sucede no es una autoaniquilación sino que las ondas se redistribuyen, pero el mecanismo por el cual la energíadel haz de electrones es redistribuida aún no se entiende claramente [58]. Es obvio pensarque la difracción de los electrones es útil para el estudio de la materia. La interferenciase da gracias a la dualidad onda –partícula, que establece que una partícula de materia,en este caso el electrón que incide, puede ser descrita como una onda de sonido o deagua. La función de onda de electrones se comporta como si una onda real sólo interfierecon otra onda real y una onda imaginaria sólo interfiere con otra onda imaginaria. Laintensidad de una onda de electrón resulta de la suma de las intensidades de las ondasreales y de las ondas imaginarias [58]. El contraste de imagen es un mapa de distribuciónde intensidades en los puntos de difracción altamente ampliados. La apertura que seencuentra cerca del plano focal de los lentes objetivos permite seleccionar ya sea el hazde ondas transmitido o el haz de ondas difractado. Si se selecciona el haz transmitido, seobtiene una imagen de campo claro, de modo que el área de la imagen que no se cubriópor la muestra es brillante. Si se selecciona el haz difractado, se obtiene una imagen decampo oscuro, figura 1.2, es decir que ahora el fondo es oscuro [6]. Nos damos cuenta locomplejo que es un proceso para la formación de imágenes: se necesita que la muestra estécorrectamente preparada para que no altere su estructura y geometría para que el patrónde difracción e interferencia sean los reales. Sólo en este apartado son varios los factoresque influyen para hacer que un protocolo permanezca inafectado por dichos procesos yasí determinar la fiabilidad de su uso en condiciones normales.

1.1.3. Límite de resolución

La difracción de Fresnel o también difracción del campo cercano es un patrón dedifracción de una onda obtenida muy cerca del objeto causante de la difracción [27], y ladifracción de Fraunhofer o también difracción del campo lejano es un patrón de difracciónde una onda cuyas fuentes se encuentran infinitamente alejadas del obstáculo, por lo quesobre éste y sobre la pantalla incidirán ondas planas. La difracción de Fraunhofer es,

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Figura 1.2: Imagen de eritrocitos en campo oscuro capturada con el MET [39].

Figura 1.3: Esquematización de la difracción de Fraunhofer, que muestra el proceso cuan-do la luz pasa por un apertura circular.

figura 1.3, de esta manera, un caso particular de la difracción de Fresnel, y que tambiénresulta más sencillo de analizar [28] y con cálculos se puede conocer el patrón de difracciónde los obstáculos ya sea que estén cerca o lejos.

Así como los microscopios ópticos, los microscopios electrónicos tienen la capacidadde resolver la imagen [7], es decir, la capacidad de un lente de distinguir una distanciaseparada determinada entre dos puntos, por ende es posible observar detalles finos; porejemplo, si un lente tiene un poder de resolución de 0.4 nm es capaz de distinguir dospuntos como objetos separados si están al menos 0.4 nm de distancia [25]. Así quese entiende que, si es más corta la longitud de onda de la onda utilizada, entonces laresolución será mayor [25, 7]. Debido a que la longitud de onda que se utiliza en unmicroscopio óptico es en el rango de 400-800 nm, no se pueden ver estructuras menoresa 0.2 µm, que representa el límite impuesto por el proceso de difracción. En este sentido,la resolución es un criterio de la habilidad de nuestros ojos para distinguir imágenesseparadas de dos puntos luminosos por ende la robustez de un protocolo también dependede nosotros, de nuestra precisión, sensibilidad y límites para detectar las imágenes. La

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1 Generalidades

Figura 1.4: (a) Esquematización de dos puntos de emisión cercanos cuyos puntos de di-fracción que también son cercanos describen el criterio de Rayleigh, (b) Dis-cos Airy formados por la difracción de dos puntos adyacentes, (c) Criteriode Rayleigh: dos líneas espectrales son todavía distinguibles si el máximo deuno coincide con el primer mínimo del otro.

resolución d está dada por [25]:

d =0,61.l

n.sin(a) (1.4)

Donde l es la longitud de onda de 450 nm, sin(a) es la mitad del ángulo de aperturadel lente objetivo (a= 70°) y n es el índice de refracción de 1.56 [5, 63]; esta expresión serefiere al límite de difracción ya que en efecto es el criterio de resolución de un sistemaóptico [21]. Lo que nos da a entender el límite de difracción es que para un incrementode la resolución uno debe trabajar por ejemplo con un ángulo de iluminación grande dealta energía [21]. Algunas ecuaciones describen el criterio de Rayleigh para la resoluciónde dos puntos de difracción muy próximos entre sí en el plano de la imagen. Según estecriterio, dos puntos de objetos adyacentes se definen como resueltos cuando el punto(spot) central de difracción (disco de Airy) de un punto coincide con la primera mínimadifracción de otro punto en el plano de imagen, figura 1.4[46], en campo lejano.

La apertura de los objetivos captura algunos rayos difractados de la muestra con elobjetivo de formar la imagen, y éstos lentes que pueden capturar la luz sobre un amplioángulo da mejor resolución que un objetivo que colecta la luz sobre un ángulo estrecho[46]. La apertura angular, figura 1.5, se la conoce como apertura numérica (NA) y sedefine como:

NA = n.sin(a) (1.5)

Donde sin(a) es la mitad del ángulo de apertura del lente objetivo y n es el índice derefracción.

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1 Generalidades

Figura 1.5: Apertura numérica: n sin (a) [50, 55].

Dispositivos de grabación

La resolución no solo dependerá de la onda incidente y todos los aspectos de difracciónanteriormente mencionados sino también de las aberraciones que traen consigo los lentesobjetivos y condensadores [6] así como de los dispositivos que posea el equipo para lapresentación de la imagen en la pantalla. La resolución indicará cuánto detalle puedeobservarse en la imagen, los pixeles son aquellos puntos que forman las imágenes digitales,la cantidad de puntos o pixeles con que cuente una imagen va a indicar la calidad de suresolución y se la describe con la cantidad de columnas de pixeles, número de pixeles quetiene la imagen a lo ancho, y la cantidad de filas de pixeles, número de pixeles que tienela imagen a lo alto. En el espacio real se necesita por lo menos tres pixeles por unidadde resolución. De modo que, el dispositivo de grabación debe tener la capacidad deformar la máxima longitud de la fotografía sin pixelarla, es decir, sin hacer que la imagenaparezca granulada. La obtención de imágenes con sus procesos intrínsecos, absorcióndifracción e interferencia, y factores como la resolución son aspectos fundamentales paraconseguir una imagen con excelente calidad, vemos también que son procesos complicadosde cumplir pero que con un equipo calibrado y un operador competente en el trabajocon conocimiento suficiente, es posible demostrar la robustez de un protocolo, es decir,que aunque existan algunos parámetros que pongan en juego la validación, pueden sermanejados y optimizados con esfuerzo.

1.2. Interacción de los electrones con la materia

Cuando los electrones son emitidos desde el cañón de electrones y llegan a la muestraéstos reaccionan con ella y se producen una serie de interacciones las cuales son detectadaspara obtener la imagen. Los electrones acelerados por un alto voltaje pasan por un tubode gran vacío [60] y el haz se enfoca sobre una área pequeña de la muestra mediante uncondensador, primer lente electromagnético, cuya función es dirigir el haz en una línearecta para iluminar la muestra [25]; por último la imagen es observada en una pantallafluorescente [60] o por otros detectores. En los microscopios electrónicos, los objetos nose observan directamente como en el microscopio de luz, sino que la imagen se formaen una pantalla y de esa imagen se forman electromicrofotografías, útiles para estudios[24]. Entre los factores que afectan la formación de la imagen a más de los lentes, son

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la iluminación, la intensidad y la longitud de onda de la fuente de emisión, aquí esimportante mencionar que los electrones emitidos de diferentes posiciones del filamentoson enfocados por la apertura de enfrente del condensador. Debido a que cada puntode fuente contribuye equitativamente para la iluminación de la muestra en el plano, lasvariaciones en la intensidad en la imagen son atribuidas a los objetivos y no la iluminaciónirregular de la fuente de electrones o de luz en el caso del microscopio electrónico yóptico respectivamente [46]. Las lentes electromagnéticas son las que tienen la función decontrolar la intensidad del haz de electrones, el enfoque y el aumento [25]. En el MET elhaz de electrones pasa por la muestra y luego por los lentes del objetivo para que luego laslentes proyectoras enfoquen los electrones sobre una pantalla fluorescente [25, 7] en dosdimensiones. En contraste, el MEB proporciona imágenes tridimensionales. El cañón deelectrones produce el haz de electrones precisamente enfocado, al mismo que se lo conocecomo haz primario [25]. Los electrones que atraviesan las lentes electromagnéticas sondirigidos hacia la superficie de la muestra [25]. La muestra se explora en líneas secuencialescon un haz de electrones, y las interacciones producidas entre el haz primario y la materiason las que sirven para la formación de la imagen [60, 25] . Los electrones son detectadosy posteriormente intensificados por un fotomultiplicador y retro convertidos en señaleseléctricas [25, 60]. El MEB puede discriminar distancias entre dos puntos de apenas 3 nm.Como se ha dicho anteriormente, los dos microscopios electrónicos comparten ciertosaspectos empezando por la fuente de emisión, que se encuentra en la parte superior yemite los electrones que se mueven en el interior en condiciones de alto vacío [7]. Unacaracterística importante es que los lentes son bobinas electromagnéticas por ende desvíanla trayectoria del haz de electrones. Al trabajar con microscopios que utilizan un haz deelectrones como fuente para la visualización de estructuras ultra pequeñas gracias a quesu longitud de onda es muy corta, se observan indiscutiblemente interacciones entrelos electrones del haz que incide sobre la muestra y los átomos de la muestra. Dichasinteracciones son detectadas y de ahí son interpretadas como señales para la formaciónde las imágenes. La detección de la señal sucede cuando el haz de electrones, conocidoscomo electrones primarios, entra a la muestra. Después de golpear un electrón o unnúcleo, los electrones primarios continuarán sobre una nueva trayectoria. El resultadodel golpe del haz de electrones en la muestra es la formación de un vaso de reacción enforma de lágrima, figura 1.6. El vaso de reacción es por definición donde todos los eventosde dispersión ocurren [17]. Los electrones que son transmitidos constituyen las señalesdetectadas en el MET.

El volumen de reacción depende de la densidad del número atómico, de la topografíade la muestra y del potencial de aceleración del haz de electrones primario. Por ejemploa baja densidad del material y alto voltaje dará como resultado un vaso de reaccióngrande ya que el haz de electrones puede penetrar profundamente en la muestra [17, 27],es el caso de la observación de bacterias cuya densidad es baja pero son vistas a altosvoltajes. Se sabe también que cuando la energía del haz incrementa, la trayectoria delos electrones cerca de la superficie llega a ser más fuerte y los electrones penetran másprofundamente dentro del sólido antes de que los efectos acumulativos de los múltipleseventos de dispersión elástica causen que alguno de los electrones se propague de regresoa la superficie [27]. Existen dos clases de interacción del haz de electrones con la muestra:

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Figura 1.6: Ilustración de las reacciones que ocurren al momento en que el haz de elec-trones primario llega a la muestra [17].

1) la dispersión elástica, que afecta la trayectoria del haz de electrones dentro de lamuestra sin alterar notablemente la energía cinética del electrón y es responsable de laformación de una señal importante de imagen en el MET y 2) los eventos inelásticos,que resultan de la transferencia de energía desde el haz de electrones hasta los átomosde la muestra, llevándolos a la generación de electrones secundarios [27] entre otros. Laimagen se formará debido a estas interacciones y será en blanco y negro correspondiendoel negro a las zonas con alta densidad de material capaz de dispersar electrones; elblanco corresponde a los electrones que no fueron desviados y atraviesan el espécimeny constituyen el fondo. El operador tiene control sobre el haz de electrones antes de serliberado pero cuando ingresa en la muestra inicia el proceso de dispersión con importantesconsecuencias. Los electrones dispersos se entienden como la interacción entre la sondade electrones y los átomos de la muestra que resulta en un cambio en la trayectoriade electrones y/ o energía [27]. Cuando se hablaba de la formación de imagen vimosque se las obtenía gracias a la difracción, y que la difracción se daba cuando el haz deelectrones tocaba la muestra, pues bien, cuando el haz de electrones llega a la muestra, loselectrones no son absorbidos (en su mayoría) por la muestra biológica, sino que se pierdenelectrones debido a los procesos de dispersión en los distintos puntos de la muestra o bienson transmitidos, pero cuando la muestra es gruesa los electrones son absorbidos y no setransmiten. En las interacciones elásticas no cambia la dirección detectable del electrónprimario, siendo el resultado de interacciones de Coulomb entre los electrones primariosy el núcleo y todos los electrones alrededor [28, 27]. Como resultado de esta dispersión,los electrones se desvían desde su vía inicial por un ángulo. Estas interacciones sonimportantes en microscopía electrónica de transmisión porque es el mayor mecanismo porel cual los electrones son desviados y además dan la mayor contribución en los patronesde difracción para el MET [28]. Las interacciones inelásticas resultan de la transferenciade energía de los electrones primarios de los átomos de la muestra. Este intercambiode energía está limitado por los electrones atómicos, en lugar de los núcleos ya que sondifíciles de excitar. Los electrones atómicos son cuantificados, acomodando la energía a

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Figura 1.7: Señales útiles que son generadas cuando el haz de electrones enfocado in-teractúa con la muestra. Cuando la muestra es gruesa, más de 100 nm, loselectrones son absorbidos por la muestra y por lo tanto no son transmitidos[56].

un mayor orbital (excitación), o dejando al átomo (ionización). La dispersión inelásticadisminuye la energía cinética del electrón y su desviación de la trayectoria es pequeña(0.1° o menos) [56, 27, 28]. Hay algunos procesos de interacción en los que se pierdeenergía de haz primario y se transfiere a los electrones o átomos de la muestra, figura1.7: los electrones secundarios, electrones Auger, Rayos X característicos y continuos(Bremsstrahlung), cátodo luminiscencia, vibraciones de la red (fonones) y oscilacionescolectivas de electrones (plasmones) [56, 28].

Se debe tomar en cuenta que a baja energía, los electrones pierden más rápido la energíaque los electrones con alta energía, de modo que la distancia entre dos colisiones (meanfree path l) y la profundidad de penetración de los electrones primarios en la muestra sonmás pequeños cuando el haz de energía tiene energía baja y el volumen de interacciónes más pequeño a haces de energía baja que a alta [56]. Los electrones primarios quepenetran el material con un número atómico bajo tienen mayor mean free path que loselectrones con la misma energía en un material pero con un número atómico alto [17]. Porejemplo en una película sólida se dan varias dispersiones de electrones debido al contactocon el haz primario y por consiguiente se dan colisiones entre ellos [27].

1.2.1. Electrones secundarios (ES)

Son el tipo de electrones emitidos más comúnmente usados en el MEB cuando el obje-tivo es obtener información topográfica y alta resolución [17, 65] ; son generados cuandoun electrón primario desaloja un electrón de la superficie de la muestra aunque tambiénpueden ser generados por otros electrones secundarios debido a los eventos de dispersiónmúltiple, así que no son generados de las profundidades de la muestra [17, 27]. El procesose da al momento en que el haz interactúa con la muestra causando la ionización de losátomos de la misma [65] y los electrones de valencia que están débilmente unidos son losque se propagan a través de la muestra, figura 1.8, y experimentan colisiones inelásticas,

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Figura 1.8: Diagrama esquemático que muestra el camino del electrón primario [56].

obviamente con la pérdida de energía por sí mismos; una vez en la superficie de la mues-tra, el electrón puede ser emitido como un electrón secundario [56, 27, 65]. Los que songenerados pero no escapan de la muestra, son absorbidos por la misma [17] provocandoefectos térmicos. Una característica importante de los electrones secundarios, como seacaba de nombrar, es que tienen bajo nivel de energía y solamente unos pocos electrovoltios [17], esto es debido a la gran diferencia en energía entre el haz de electrones y loselectrones de la muestra, entonces solamente una pequeña cantidad de energía cinéticapuede ser transferida eficientemente a los electrones secundarios [27]. El coeficiente deelectrones secundarios es d esta definido por:d = nSE

nB

=iSE

iB(1.6)

Donde nSE es el número de electrones secundarios emitidos desde la muestra bom-bardeada por el haz de electrones, nB el número de electrones incidentes,iSE designa lacorriente equivalente y iB la corriente inyectada.

La utilidad de los electrones secundarios es el contraste en la topografía, es decir, parala visualización de la textura de la superficie así como la aspereza [65] visto que sonelectrones de baja energía que necesitan ser cercanos de la superficie para salir de lamuestra.

1.2.2. Electrones retro dispersos (ERD)

Los electrones retro dispersos son las señales principales cuando se trabaja en el MEBjunto con los electrones secundarios, y su generación depende de la composición y super-ficie topográfica así como su transporte y escape [56, 65]. Se habla de retro dispersiónde electrones cuando uno logra escaparse de nuevo de la muestra [17]. Los electronesretro dispersos son los electrones del haz original y por lo tanto tienen un alto nivel deenergía, los cuales han sido desviados por las colisiones con los átomos de tal manera quesu camino en realidad los lleva de regreso a través de la superficie de la muestra [56].Básicamente es un solo evento de dispersión elástica en la cual la trayectoria del electróncambia por más de 90° desde la dirección del movimiento, de modo que los electrones

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1 Generalidades

dispersos se propagan de nuevo dentro del mismo hemisferio que contiene el haz original[27]. El coeficiente de los ERD h, es la relación entre el número de electrones retro dis-persos emitidos nBSE y el número de electrones primarios que bombardean de la muestranB [56] y se define con la siguiente fórmula:h =

nBSE

nB

=iBSE

iB(1.7)

El coeficiente de retro dispersión también puede ser expresado en términos de corriente,cuando se refiere a la corriente de de electrones dada dentro de la muestra y la corrientede los electrones retro dispersos que pasan por fuera de la muestra. Los electrones retrodispersos responden a la composición, inclinación local de la superficie de la muestra,cristalografía, campos magnéticos internos [27]. La información que se obtiene a partirde los ERD son las características que están muy por debajo de la superficie, que vienea ser alrededor de 0,3 veces la profundidad de la penetración del haz incidente, quedepende de la energía del haz y del número atómico medio de la zona de interacción; estaprofundidad puede ser del orden de centenas de nanometros; es decir, la señal no soloprocede de las inmediaciones de la superficie sino también de bastantes capas atómicaspor debajo de ella [65]. Los electrones retro dispersos aumentan con el aumento delnúmero atómico y no dependen fuertemente de la energía del haz [27].

1.2.3. Rayos X

En el MEB, cuando los electrones son desligados de una órbita específica de un átomoen la muestra, los rayos X son expulsados, es decir que son emitidos como resultado de larelajación de un estado excitado de un átomo, figura 1.9, donde la excitación es causadapor la ionización fuertemente ligado al interior del átomo [56]. Los rayos X tienen unalongitud de onda y energía característica del átomo del cual se originó. Los problemassurgen cuando los rayos X golpean a otras partículas, pierden energía y cambian lalongitud de onda [17], por esto existe un factor de corrección llamado ZAF.

Rayos X continuos

Son generados como resultado de la desaceleración de electrones primarios en el campode Coulomb del núcleo. Debido a este efecto de “frenada” que ejerce sobre el electrón, esteproceso también se conoce como Bremsstrahlung [56, 27] y constituye un ruido de fondo[65]. Los electrones del haz primario pierden energía en un solo evento de desaceleraciónde modo que pueden tomar cualquier valor de energía desde cero hasta toda la energíadel electrón, y así se forma un espectro continuo electromagnético [27], y es despojadode la muestra antes de los análisis aunque contienen informaciones esenciales para elentendimiento correcto y la cuantificación del espectro emitido que corresponde a lacomposición química de la muestra [65].

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1 Generalidades

Figura 1.9: Ilustración de la generación de electrones Auger y de rayos X característicos[56].

Rayos X característicos

Son generados por la relajación de un estado de excitación atómica que surge de unespacio vacante de una capa interna [56]. En otras palabras, un electrón de una capainterna del electrón es desplazado por una colisión con el electrón primario, un electrónde una capa externa cae en la vacante de la capa interna para establecer la carga correctaen los orbitales del electrón seguido con un evento de ionización [65]. Brinda informaciónquímica de la muestra para los estudios de microanálisis.

1.2.4. Electrones Auger

Son producidos después de la ionización de un átomo por el haz de electrones primarioy la posterior caída de un electrón de la capa exterior para ocupar una vacante interior[65, 27]. El exceso de energía liberada es absorbida por un electrón de capa externa yprovoca la expulsión del mismo. Este electrón liberado se llama electrón Auger, figura 1.9.Los electrones Auger son utilizados en el MEB para dar información química de la muestray debido a su baja energía son emitidos únicamente desde muy cerca de la superficie [65],

hasta 10°

A, y aunque dan la misma información que los rayos X característicos, su manerade liberarse de la superficie ocurre bajo condiciones radicalmente diferentes. Los rayos Xse presentan en todo el volumen de interacción, mientras que los electrones Auger tienenuna alta probabilidad de tener dispersión inelástica y perder energía [27].

1.2.5. Cátodo luminiscencia

El proceso es parecido a la producción de rayos X o electrones Auger, pero se refiere ala relajación de un estado excitado en una capa exterior del átomo. Este proceso sucedecon ciertos materiales que liberan exceso de energía en forma de fotones como aislantey semiconductores [65, 27]. La energía que se libera es mucho menor y da lugar a la

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1 Generalidades

liberación de un fotón de energía ultravioleta, visible o infrarroja [56, 27, 65]. Esta fluo-rescencia produce fotones que pueden ser detectados, pero pocos MEB están equipadoscon dichos detectores [17].

1.3. Características generales para la obtención de una

imagen

Como hemos visto, la obtención de imágenes es un proceso complejo, el límite de re-solución es variable en cada muestra y su obtención presenta límites que dependen delinstrumento que se use y por ende de las interacciones que se dé en él; y por último quedichas interacciones sean los suficientemente detectables para poder formar las imágenes.Es muy difícil hacer que todos estos aspectos permanezcan inalterados o por lo menoshacer que el protocolo no se afecte para que así muestre confiabilidad durante su uso enel laboratorio de Microscopía Electrónica y que los resultados sean fiables y adecuadosa la finalidad perseguida puesto que las decisiones que se tomarán estarán basadas en lainformación que proporcionen las imágenes obtenidas. Es importante mencionar acercadel funcionamiento general del MET y del MEB, y veremos que mantienen algunas simi-litudes entre sí, figura 1.10, así como marcadas diferencias; todos sus sistemas funcionanjuntos para determinar los resultados y las cualidades de una fotografía como la amplia-ción, resolución, profundidad de campo, contraste y brillo. Podemos entonces empezara hablar del sistema de vacío indispensable para el correcto funcionamiento de los dosmicroscopios.

1.3.1. Sistema de vacío

El vacío es necesario para utilizar en excelentes condiciones el haz de electrones debidoa que los electrones se dispersan rápidamente debido a las colisiones con otras moléculas,en este caso las moléculas de aire [17]. Es lógico pensar que sin el vacío el haz de electronesno puede ser controlado. El vacío se obtiene removiendo el gas de la columna tanto comosea posible, el vacío necesario es de 1,3−3Pa para operar, aunque la mayoría de losmicroscopios operan a 1,3-4Pa o más [17]. Mientras más alto sea el vacío, menor seránlas interacciones de los electrones y el microscopio funcionará mejor. Para conseguir unapresión hasta 1,3−4Pa, existen dos clases de bombas: una bomba de vacío baja que reducela presión atmosférica hasta 1,3−1 Pa y una bomba de alto vacío que reduce la presióndesde 1,3−1Pa hasta 1,3−4Pa o más dependiendo del tipo de bomba [17]. Los MET yMEB tienen bombas de desbaste o bombas de bajo vacío que remueven el 99.99% deaire, lo hacen mediante la mecánica de rotación de un rotor que se acciona por un motoreléctrico [17], lo que sucede es que el eje de rotación se desplaza desde el eje del cilindrode manera que, como el gas entra, se expande antes de ser sellado por la aleta opuesta;durante el resto del ciclo de rotación, el aire se comprime y es expulsado del tubo desalida, mientras tanto el aire en el lado opuesto del cilindro ya se ha expandido y estáa punto de ser comprimido a la salida [20] . Esta bomba mecánica es muy eficientehasta que llega a 1,3−1Pa, de modo que para alcanzar la presión de operación 1,3−2Pa a

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1 Generalidades

Figura 1.10: (a). Diagrama de la columna y (b) detalle de las partes del MET, (c) Dia-grama de la columna y (d) detalle de las partes del MEB [17].

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1 Generalidades

1,3−4Pa se usan otros tipos de bombas, conocidas como bombas de alto vacío, las cualesposeen válvulas para evitar que el flujo de aire regrese [17, 65]. Entre las bombas de altovacío está la bomba de difusión de aceite, la comúnmente usada en los MET, la cualfunciona como combustible para la calefacción hasta que se evapora; debido a que elaceite se enfría y condensa, el aceite atrapa el aire bajando la presión [17], es decir quedurante su descenso, las moléculas de aceite chocan con moléculas de aire, impartiendouna tendencia baja que resulta en un flujo descendente de gas desde la entrada de labomba; cuando las moléculas de aceite refrigerado llega a la pared interior de la bomba,se condensa y cae a la base de la bomba permitiendo que el aceite se recicle continuamente[20, 65, 6]. La bomba rotatoria, figura 1.11, está conectada a la de difusión, figura 1.11,para que actúe como bomba auxiliar [20]. Las bombas turbo moleculares 1.11tambiénson bombas de alta presión, lo que hacen es soplar el aire por una serie de aspas de unaturbina que gira a una velocidad superior a 10.000 rpm [17] y el aire sale de la cámara yregresa a la bomba [65]; una desventaja de esta bomba es que genera ruido debido a suspartes mecánicas y sus vibraciones pueden ser introducidas en el microscopio [17, 6, 20],disminuyendo el límite de resolución. Por último existe la bomba iónica, figura 1.11, queioniza las moléculas de aire en un campo de alta tensión y absorbe los iones de cargapositiva; como todas las bombas de alto vacío, necesita tener una columna de pre- bombeocon una bomba mecánica o de difusión; estas bombas se caracterizan por ser lentas en suvelocidad de bombeo [17, 6] pero son muy eficientes y permiten conservar limpia la zonade vacío, lo que el aceite de la bomba de difusión no permite; estas bombas se la utilizanpara alcanzar presiones bajo 10−4Pa, requeridos en filamentos de LaB6, Schottky o Fieldemission electrón [20, 65].

1.3.2. Sistema de generación del haz de electrones y su manipulación

Para la generación del haz de electrones se utiliza un cañón de electrones que se en-cuentra en la parte superior de la columna del microscopio, figura 1.12. Este sistemagenera el haz de "iluminación" de electrones conocido como el haz primario de electrones[17] estos electrones tienen energía cinética lo suficientemente alta como para pasar através de áreas delgadas de la muestra [20]. El cañón de electrones más común consisteen un filamento de tungsteno, cristales de hexaboruro de lantano, o hexaboruro de cerio;el cilindro de Wehnelt o capa de rejilla que controla el flujo de electrones y el ánodo queatrae y acelera a los electrones bajo la columna de la muestra [17, 27]. Para controlar elsistema de generación del haz de electrones se toma en cuenta:

1. Amplio rango de voltajes que pueden ser usados en el MEB dependiendo del tipode muestra y de resolución requerida. Los rangos usuales son: 0.1 a 4 kilovoltioscon 10 kV siendo el más común para muestras biológicas o muestras sensibles alcalor, y 20 kV para muestras no biológicas. Altos voltajes dan mejor resolución ymayor es el calor que se genera en la muestra. Para muestras delicadas se debenutilizar voltajes más bajos [17].

2. Un interruptor para prender y apagar el alto voltaje [17].

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1 Generalidades

Figura 1.11: Esquemas de las bombas donde se muestra las partes principales. (a) Bom-ba rotatoria, (b) Bomba de difusión, (c) Bomba iónica, (d) Bomba turbomolecular [65, 20].

3. Una resistencia polarizada para regular la corriente del haz. La corriente de electro-nes es el flujo que golpea a la muestra, si se la aumenta ocasiona que mas electronesgolpeen a la muestra más rápidamente. Esto resulta en la penetración de los elec-trones y un lugar con diámetro más grande. La emisión térmica y de campo sondos tipos de haces de emisión [17].

Filamento

Mantiene un alto potencial negativo debido al suministro de alto voltaje [27], la in-fluencia del tipo de filamento y el control de su flujo también determinan la calidad deimagen resultante así que para estudiar la robustez de un protocolo es elemental esco-ger el filamento con que se desea trabajar. El filamento de tungsteno es un alambre dealrededor de 100 mm de diámetro el cual es doblado en forma de V con un radio de100 mm y la emisión de electrones es baja en comparación con la emisión de electronesdel filamento LaB6 [17, 27]. Hay que tomar en cuenta varios parámetros al momentode utilizarlo, como: brillo, corriente de emisión, tiempo de vida, dispersión de energía yestabilidad [27]. El filamento de W se calienta alrededor de una temperatura de 2700 Ka la cual el filamento empieza a emitir los electrones [20]. Un hecho importante que sepresentó durante este estudio es que el tiempo de vida de éste filamento es en general de40 horas, sin embargo fue utilizado hasta más de 70 horas en el laboratorio; los resulta-dos de la calidad de imagen después de su tiempo de vida fueron negativos obviamente,

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1 Generalidades

Figura 1.12: Diagrama de los componentes que conforman el cañón de electrones: fila-mento, cilindro Wehnelt y ánodo [56].

figura 1.13, no porque el protocolo seguido haya sido insatisfactorio, sino porque la emi-sión del filamento era muy variable, su inclinación era difícil de mantener y por endehabía sitios donde la imagen tenía más intensidad que en otros y era difícil conseguir unenfoque a altas magnificaciones así como el manejo de la luminosidad. La solución paradicho problema fue el cambio de filamento (Ver anexo 1). El filamento de hexaboruro delantano ofrece 5-10 veces más brillo y más tiempo de vida que el de tungsteno, pero encambio requiere condiciones de vacío más estrictas y es costoso, alrededor de 2000 dólares[17, 27, 56]. Opera a temperatura de 1800 K [27], el tamaño de la fuente es cerca de 1 µmcomparado con lo 50 µm del filamento de tungsteno, este aspecto permite obtener imá-genes con mayor calidad [56, 20], porque al ser el diámetro y longitud de menor tamaño,el haz es mucho menor, por lo que puede alcanzar una resolución 50% superior a la quese consigue con el filamento de tungsteno [53] el área de emisión efectiva es mucho máspequeña que el cañón de electrones de tungsteno convencional, el cual reduce el tamañodel punto (spot size) del haz de electrones [65].

En el cuadro 1.1, se detalla una comparación entre las fuentes de emisión de electrones;incluso la estabilidad que brinda el filamento de LaB6 es mucho mejor, porque la energíase propaga menos haciendo que la fracción de electrones emitida sea útil, provocandouna pequeña aberración cromática y alta resolución de imágenes [65, 56]. El filamento dehexaboruro de cesio: tiene las mismas características que el anterior pero este tiene unavida un poco más corta [17].

La emisión térmica usa el calor para excitar a los electrones del filamento, como lacorriente del filamento aumenta entonces el filamento se calienta, como la temperaturaaumenta, el número de electrones emitidos por el filamento también aumentará. Si secalienta mucho, el filamento se puede quemar, es por eso que debe ser cuidadosamente

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1 Generalidades

Figura 1.13: Fotografía de bacterias capturada cuando el filamento de tungsteno habíaacabado su tiempo de vida media.

Cuadro 1.1: Comparación entre las fuentes de energía del cañón de electrones [31].Aspecto W LaB6 FEG (Shottky)

Corriente máxima (nA) 1000 500 300Brillo normalizado (-) 1 10- 30 2500

Propagación de la energía (eV) 3- 4 1.5- 3 0.6- 1.2Tamaño del punto de la fuente 30- 100 µm 5- 50µm 15- 30µm

Vacío requerido (Pa) 10−3 10−3 10−7

Temperatura (K) 2700 2000 1800Tiempo de vida (h) 60- 200 1000 ≥ 2000

Valor normalizado (-) 1 10 100

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1 Generalidades

ajustado al máximo número de emisión de electrones mientras la temperatura no estámás caliente de lo necesario [17]. El efecto Schottky (Field Emission Gun) es la emisióntermo iónica de los electrones que puede aumentar aplicando un campo electrostático enla superficie del cátodo. El campo disminuye la altura del potencial de barrera, el cualmantiene a los electrones dentro del cátodo [20]. El efecto Schottky consta de un cristalpuntiagudo soldado al final del filamento [20] de modo que explica que la forma afiladade la punta del filamento también afecta la emisión, es decir que, el brillo depende de laforma de la punta [27]. Un aspecto significativo para la obtención de buenas imágenes,después de haber elegido el filamento deseado, es la saturación del mismo, ya que parauna operación estable se debe establecer la saturación, en la cual un pequeño incrementoo decremento de corriente de calor en el filamento no hace que cambie la corriente dehaz de electrones [27]. Este aspecto es muy importante porque cuando se determina elnivel de saturación se puede verificar dicha variación de corriente (emisión de energía)y si la corriente no es estable entonces nos indica que el filamento esta desgastado. Aldarle al filamento mayor voltaje de aceleración, la longitud de onda en los microscopiosserá menor, de aquí que a mayor voltaje mayor resolución [53].

Cilindro Wehnelt

Es un electrodo de metal que pude ser movido fácilmente el cual envuelve completa-mente al filamento excepto en un pequeño agujero a través del cual emerge el haz deelectrones. Su función es controlar la corriente de emisión del cañón de electrones. Paraeste propósito su potencial es más negativo que el cátodo [20].

Ánodo

Los electrones son acelerados a partir de un alto potencial negativo del filamento(20 kV) al potencial de tierra en el ánodo. Un hoyo en el ánodo permite que una fracción deestos electrones continúen hacia abajo por la columna hacia los lentes [27]. La proporciónde corriente de electrones que deja pasar a través del hoyo en el ánodo es llamado corrientede emisión y el brillo incrementa linealmente con la aceleración e inversamente con latemperatura del filamento [27].

Pues bien, ahora que se conoce lo fundamental de un sistema de vacío en el funciona-miento de los microscopios electrónico y la influencia del haz de electrones en la imagenque se formará, hablemos de su manipulación, para lo cual se trabaja con lentes electro-magnéticos y bobinas ubicado en la columna del microscopio y controla el tamaño, formay posición del haz de electrones en la superficie de la muestra [17]. En el cañón de elec-trones, los electrones están controlados por el campo electrostático, mientras atraviesanel resto del MEB o del MET los electrones son controlados por los lentes magnéticos.Los lentes electrostáticos se forman cuando los campos positivos y negativos están cer-ca uno de otro; esto es lo que sucede entre el cañón y el ánodo [17] y son usados parademagnificar la imagen del cruce en el cañón de electrones [27]. En la mayoría de los mi-croscopios electrónicos se usan algunos lentes electromagnéticos para reducir el tamañodel lugar por donde atraviesa el haz [17] y para dar forma y enfocar el haz, por lo tanto

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1 Generalidades

Figura 1.14: (a) Sistema de lentes en el MEB. Las aperturas en los lentes condensadores(gris claro) ayudan a la propagación del haz de electrones y el control de lacorriente del haz, mientras que las aperturas de los objetivos (gris oscuro)determina la convergencia del semi- ángulo a, (b) sistemas de lentes en elMET. [56].

determina la resolución [56]. Los lentes condensadores y lentes objetivos correspondena dichos lentes electromagnéticos, los cuales por si mismos tienen aberraciones esféricas[17]. El primer lente condensador controla la cantidad de demagnificación, figura 1.14, yal tener una fuerte demagnificación del haz emitido por el cañón, controla la resoluciónya que se puede controlar el área de la muestra que es golpeada por el haz [27, 31, 28].Los microscopios que contienen un segundo condensador, los cuales son débiles, sirvenpara el control de la intensidad mas no para la magnificación [20, 31], el segundo con-densador es controlado por una perilla la cual es conocida como spot size (apertura delcondensador) [27, 20]. El lente final en la columna es llamado probe- forming o lenteobjetivo, enfoca la imagen por el control del movimiento de la sonda que cruza a lo largodel eje óptico (Z axis) de la columna [27] y suministra mayor demagnificación [65], sonlos lentes que se encuentras más cerca a la muestra; son lentes fuertes con una longitudfocal corta [20]. Debido a que su poder de enfoque depende de la excitación de los lentes,la corriente de los lentes objetivos debe ser estabilizada usando una retro alimentaciónnegativa dentro de su fuente de iluminación, para así mantener la misma longitud focalen diferentes voltajes de aceleración.

El último control en la manipulación del haz de electrones son las aperturas. La aper-tura controla el paso a través de los electrones dispersos del centro óptico sin mover el hazasí como también en los lentes electromagnéticos [17] sirven para excluir a los electronesdispersos y para controlar la aberración esférica al final de los lentes [65]. La seleccióndel tamaño de apertura dependerá del tipo de trabajo que se vaya a hacer en el MEB oen el MET. Si se necesita una alta resolución, una apertura pequeña puede usarse paraminimizar la dispersión del haz y así una menor área de presión es bombardeada en lamuestra [17]. La apertura del condensador consta de tres o cuatro aperturas de diferente

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1 Generalidades

Figura 1.15: Convergencia del semi- ángulo a en los lentes objetivos [56].

diámetro, colocadas a lo largo de soporte de la barra, de modo que al mover la barra haciadentro o hacia afuera varios milímetros se obtiene diferentes aperturas en el eje óptico.Si se escoge un tamaño grande aumenta la convergencia del ángulo a de iluminación peropermite que más electrones alcancen la muestra, dando mayor intensidad a la imagendel microscopio electrónico [20]. Una apertura del objetivo es llamada apertura real delobjetivo, figura 1.15, si está localizada justo antes de la muestra en la grieta de la probe-forming de los lentes. En algunos MEB la apertura final está ubicada entre los lentescondensadores y los lentes objetivos en la posición conocida como apertura virtual delobjetivo [27].

La apertura virtual, la cual limita el haz de electrones, tiene la misma función que laapertura real de afectar la forma y los bordes del haz. La apertura real es la aperturaconvencional, mientras que la virtual se la encuentra en la mayoría de los MEB. Sidisminuye el tamaño de la apertura se reduce el ángulo a, dando como resultado unamayor profundidad de campo y disminución de la corriente en el sonda final [65].

1.3.3. Ajustes de parámetros

Está claro que aspectos como el indispensable sistema de vacío para el buen controldel haz de electrones y el correcto funcionamiento del MET y del MEB, la generacióndel haz de electrones que conlleva varios aspectos como el filamento utilizado y suspropiedades; y el manejo de los lentes condensadores y objetivo así como de las aperturasson indispensables para la manipulación del haz de electrones y así obtener una buenaimagen con sus propiedades de luminosidad, contraste, enfoque y magnificación justos;dichos aspectos provocan cambios significativos y deben ser controlados estrictamentepara la obtención de una imagen de buena calidad. Por lo tanto nos damos cuenta quela imagen también puede cambiar de acuerdo a los ajustes que hagamos en los siguientesparámetros

Brillo

Contraste

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1 Generalidades

Aumento

Profundidad de campo

Manipulación del brillo y contraste

Cada persona tiene su propia preferencia para la calidad de imagen y depende de di-cho criterio para establecer el brillo y contraste deseado. El brillo o la iluminación es elvalor de cada uno de los pixeles individuales que componen una imagen, mientras que elcontraste es la diferencia entre dos pixeles, estrictamente hablando, es la diferencia entreel valor más bajo de pixeles y el mayor valor de un pixel [17]. Una corriente alta da unnivel de brillo alto en un tamaño de sonda dado [48]. El brillo y contraste se los puedemodificar estudiando a los histogramas de imagen, el cual se define como la distribuciónde pixeles como una función de la intensidad (niveles grises) [64] y traza el número depixeles asociados con cada nivel gris (0- 255) [27]. El brillo cambia a expensas del númerode niveles grises que estén disponibles [20]. Estos niveles grises se apilan verticalmenteasí los picos en los histogramas representan los niveles grises que se presentan más fre-cuentemente en la imagen [18]. Una imagen con un buen rango dinámico contiene negroverdadero (nivel gris 0) y blanco verdadero (nivel gris 255) así como también un nivelesgrises intermedios [18], en otras palabras, para una imagen con buen contraste y brillo,la intensidad baja y alta de una imagen debe llegar a los más bajos y los más altosextremos de los niveles de gris de los dispositivos de visualización digital, o al menosla distribución de los niveles de gris de las imágenes grabadas deben difundirse lo másampliamente como sea posible en el rango dinámico [64].

Magnificación

Es una función del área de exploración y visualización de tamaño [56, 17]. En el MEB,las fotografías se pueden hacer a mayores aumentos de la capacidad de resolver; esto seconoce como amplitud de vacío, en la cual se da la ampliación de la imagen pero sinañadir ninguna otra información [17]. Sin embargo según [5] el microscopio electrónicotiene gran poder de ampliación pero su uso no es útil si la resolución no es buena; de modoque la máxima amplificación está relacionada con la resolución. La mínima amplificaciónestá dada por el máximo ángulo a través del cual el haz puede ser desviado y la máximaamplificación se puede alcanzar reduciendo la amplitud de la forma de onda [52].

Profundidad de campo

Es la zona de nitidez aceptable por delante y por detrás del punto de enfoque. Laprofundidad de campo es una función de la distancia de la muestra de la lente final; cuantomás lejos esté la muestra de la lente final, mayor es la profundidad de campo, mientras laresolución sea baja [17]. Dicho en otras palabras, es una medida de la cantidad del objetoque estamos viendo y que se mantiene en foco al mismo tiempo [61]. La lente gobiernalas propiedades de profundidad de campo así como gobierna la resolución; las lentes sonmuy buenas y una manera de mejorar el rendimiento es la inserción de aperturas muy

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1 Generalidades

pequeñas consiguiendo una reducción del haz hasta pequeños micrómetros de diámetro[61]. Estas aperturas, obviamente, reducen la intensidad del haz de electrones y tambiénaumentan la profundidad de campo de la muestra [61, 10]. La profundidad de campo alo largo del eje Z está determinada por varias factores incluyendo los principios ópticosgeométricos y físicos, aberraciones de los lentes y el grado de acomodación por el ojo, ytodas las magnificaciones [46].

1.3.4. Aberraciones de los lentes de los microscopios

Pues bien, como se habló anteriormente, los microscopios poseen lentes que permitenel manejo del haz de electrones y gracias a ellos es posible que la imagen sea formada ymagnificada. Estos lentes electromagnéticos traen consigo defectos que influyen al mo-mento de observar la imagen; estos defectos son conocidos como aberraciones, las cualesafectan el enfoque del haz de electrones, estas aberraciones afectan la resolución final delmicroscopio [56], por tanto en la calidad de una imagen y en el estudio de la robustez deun protocolo.

Aberración esférica

Es cuando cambia el enfoque del rayo fuera del eje [23]. Lo que sucede es que loselectrones que llegan a los lentes lejos del eje óptico son enfocados más fuertementeque los electrones que entran a los lentes más cerca del eje [17, 27, 56]. De modo quemientras el rayo se desvíe más del eje óptico, figura 1.16, mayor será el error de la longitudfocal [23]. Todos los lentes magnéticos tienen un coeficiente de aberración esférica que espositivo [23], así que la calidad del lente está dada por dicho coeficiente [56]. El ángulode iluminación en los lentes es llamado apertura de ángulo, a, y éste ángulo en la imagenplana real es muy pequeño [23]. La aberración esférica provoca un alargamiento de laimagen [23] y baja la resolución [17]. La siguiente expresión es utilizada para determinarel diámetro causado por la aberración esférica, para los lentes magnéticos:

ds´ = 0,5.M.Cs. (aOA)3 (1.8)

Donde Cs es el coeficiente de aberración esférica (usualmente 1-2 mm), aOA es elángulo de apertura de los lentes de objetivo y M es la magnificación [23].

Según la ecuación 1.8 vemos que Cs es proporcional a la longitud focal f de los len-tes, desde este punto se puede decir que los lentes con f pequeñas son preferibles paraminimizar el efecto de la aberración esférica y mantener la correcta orientación del hazprimario [56, 31]. Además la apertura del condensador puede parar los electrones quepodrían viajar a través del borde de los lentes objetivos, e incluso la apertura podría serempleada en los lentes objetivos [56].

Aberración cromática

Los electrones con diferentes energías pasan a lo largo de una misma vía, figura 1.17,al entrar a los lentes pero con diferentes puntos focales (planos) [23]. Particularmente se

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1 Generalidades

Figura 1.16: Lentes con aberración esférica, que muestra un enfoque más detallado de losrayos fuera del eje [23].

da a bajas energías del haz [56]. La extensión de la longitud focal es proporcional a lapropagación en la energía de los electrones [23] de modo que mientras más pequeña seala propagación de energía del haz primario de electrones, más pequeño será el efecto dela aberración cromática [56]:

El cañón de electrones no produce electrones monocromáticos.

El mismo espécimen puede ser una causa de una propagación de energía de elec-trones. La dispersión inelástica de electrones a alta energía debido a la excitaciónpor plasmones es una manera muy común para perder electrones y perder energíade 10-20 eV [23].

El diámetro para la aberración cromática corresponde al diámetro del espécimen, dc:

dc =DE

E.Cc.a.OA (1.9)

Donde DEE

la variación fraccional en el voltaje del haz de electrones, Cc es el coeficientede aberración cromática (aproximadamente 1 mm) y aOA es el ángulo de apertura dellente del objetivo [23].

Difracción de apertura

Cuando los electrones pasan a través de pequeñas aperturas, se difractan de tal maneraque, en lugar de producirse en un lugar en el plano de la imagen, forman una serie deanillos circulares [56]. Esto contribuye al diámetro que corresponde a la distancia delespécimen, dd:

dd =0,61.laOA

(1.10)

Donde l es la longitud de onda del electrón y aOA es el ángulo de apertura del lentedel objetivo [23]. Dada la naturaleza reciproca de la difracción, al aumentar el tamaño de

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1 Generalidades

Figura 1.17: Diagrama de rayos que muestra el efecto de la aberración cromática. Loselectrones con diferentes energías por ende con diferentes longitudes de ondallegan al mismo punto en los lentes y son enfocados en diferentes planos [56].

la apertura, figura 1.18, se reduce el efecto de difracción mejorando la resolución, comose puede ver en la siguiente figura [23, 56].

Astigmatismo

Literalmente hablando, el astigmatismo es una aberración parásita de los lentes, esdecir, que es causada por una imperfección de la superficie de los lentes, falta de ho-mogeneidad en las bobinas de los lentes, posiblemente por pequeños campos magnéticoscausados por la muestra en sí, haz de electrones en forma elíptica, suciedad en la columnay/o distorsión en las aperturas [29, 17]. En los dos lentes se debe corregir el astigmatismo;primero los lentes condensadores, para así producir un haz incidente de forma circular[23]. De igual manera, el astigmatismo de la lente objetivo desenfoca la imagen y degradala resolución, por lo que es necesario ajustar el astigmatismo de la lente a la hora de ob-servar imágenes a alta resolución [23]. A diferencia de una aberración esférica, es posiblecorregir el astigmatismo de los lentes objetivos, ajustando el estigmador, figura 1.19. Alcorregirlo, prácticamente el efecto es despreciable [23]. La manera más fácil de corregirel astigmatismo se basa en el uso de las franjas de Fresnel; estas franjas aparecen si lamuestra tiene un borde o alguna discontinuidad [29]. Los electrones dispersos del bordeinterfieren con el haz de electrones transmitidos y forman un patrón de interferencia; elnúmero de franjas en éste patrón es una medida directa de la coherencia del haz [29]. Sedebe tomar en cuenta que dicha corrección depende del ángulo y de la fuerza, y ademáscuando se corrige, también cambia el enfoque de los lentes. Todos los rayos se dirigen almismo punto focal, pero ahora los puntos están un poco más cerca de los lentes [23].

En los MET, el estigmador es un par de lentes cuadripolares magnéticos localizados

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1 Generalidades

Figura 1.18: Efectos de aperturas del objetivo pequeñas (a), medianas (b) y grandes (c)en la resolución de puntos de luz [23].

Figura 1.19: Corrección del astigmatismo de los lentes [23].

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1 Generalidades

Figura 1.20: Ilustración del efecto del astigmatismo en franjas de Fresnel alrededor de unsoporte de carbono con partículas de oro. Las imágenes (a), (b) y (c) mues-tran el astigmatismo corregido, mientras las imágenes (d) y (e) muestran lapresencia de astigmatismo, indicando la ausencia de franjas de Fresnel alre-dedor del agujero, y la presencia de una dirección preferencial de la imagen[29].

uno encima del otro [23] que aplica un campo magnético suplementario para hacer quelos lentes aparezcan simétricos en el haz de electrones [27]. Éstos lentes polares, los cualesson electromagnéticos y tienen un poder de magnificación diferente en las direcciones xe y, tienen una construcción igual a la del estigmador, normalmente se lo encuentra en lacorrección de Cs. A más de los cuadripolares también son muy comunes los hexapolaresy octopolares [31]. La corrección del astigmatismo de los lentes es una habilidad difícilde poseer, ya que para la obtención de imágenes a alta resolución es indispensable lacorrección de dicha aberración. Cuando se corrige el astigmatismo se debe ajustar: elenfoque principal, estigmador en x, y el estigmador en y [23]. Además uno se puede darcuenta de que el astigmatismo está o no presente; si la franja tiene la misma distanciadesde el borde a la muestra en todo el agujero (tomando como ejemplo a partículas deoro en un soporte de carbono) no existe astigmatismo, figura 1.20. Si la distancia no esconstante o si una parte de la franja es brillante u oscura, entonces el astigmatismo estápresente en la imagen [29].

Las aberraciones son efectos que no son producidos por el investigador sino que sonpropias de los lentes y no es posible evitar totalmente sus consecuencias en la imagenfinal obtenida, los microscopios electrónicos poseen mecanismos de corrección como elestigmador, que en cierta medida disminuye los efectos del astigmatismo, aún así las

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1 Generalidades

imágenes muestran los resultados de las aberraciones; afectando también la determinaciónde que un protocolo pueda ser considerado robusto ya que influyen en el funcionamientode dicho protocolo minorando el grado de confianza en el mismo.

1.3.5. Sistemas de detección para el MET y el MEB

Para la detección de electrones tanto el MET como el MEB utilizan distintos sistemas,iniciando con el MET, tenemos que los detectores de electrones son las pantallas defósforo, dispositivos de carga acoplada (cámaras) CCD, imágenes en platos, entre otros,mientras que los utilizados en el MEB son el detector de electrones secundarios y detectorde electrones retro dispersos [31] cuyas imágenes digitales pueden ser almacenadas enforma de fotos impresas o copias de alta calidad [64].

Sistema de detección de electrones en el MET

En el MET se encuentra la pantalla de fósforo que se utiliza para convertir la imagenelectrónica de una forma visible. Se compone de una placa de metal recubierta con unafina capa de polvo que emite fluorescencia (emite luz visible) bajo el bombardeo deelectrones [20]. El tradicional material de fósforo es el sulfuro de zinc (ZnS) con pequeñascantidades de impurezas metálicas añadidas [20, 28]. El fósforo es elegido porque así la luzes emitida en el centro del espectro, región amarillo-verde, en el cual el ojo humano es mássensible. En la pantalla del MET se enfoca una imagen MET o un patrón de difracción[20, 28]. La ventana de visualización es de un vidrio especial con alto contenido de plomoy de un grosor suficiente para absorber los rayos X que se producen cuando los electronesdepositan su energía en la pantalla [20]. Para grabar una imagen o un patrón de difracciónse puede utilizar una película fotográfica. Esta película tiene una capa de haluro de plata(AgI y/o AgBr) similar al empleado en las fotografías a blanco y negro; los electrones ylos fotones producen un cambio químico sutil que puede ser amplificado por inmersión enuna solución reveladora; sin embargo hoy en día la película fotográfica ha sido sustituidapor medios electrónicos que graban las imágenes en diapositivas, basados en sensores dediodos de carga acoplada (CCD); los cuales contienen una matriz de un millón o másde fotodiodos de silicio, cada uno proporcionando una señal eléctrica proporcional a laintensidad local [20, 28].

Sistema de detección de electrones en el MEB

En el MEB este sistema puede consistir en varios detectores diferentes, cada uno sen-sible a diferentes emisiones de energía o de partículas que se producen en la muestra [17].Por ejemplo el detector Everhart-Thornley reconoce ES y ERD con mayor ganancia deamplificación, bajo ruido y robustez [27, 28]. La información topográfica se proporcionaprincipalmente por electrones secundarios que se producen por la interacción del hazprimario con la muestra. Un detector de electrones secundarios les atrae magnéticamentepor un potencial de 200 voltios que se aplica a un anillo ubicado alrededor del detec-tor [17]. Al entrar en el anillo, los electrones secundarios son atraídos y acelerados por10 kV en un centellador [17]. Los electrones secundarios golpean el centellador, causando

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1 Generalidades

Figura 1.21: (a) Esquematización del proceso de detección de la señal para la obtenciónde información topográfica y (b) representación esquemática del detector deES Everhart-Thornley [17].

la emisión de fotones, figura 1.21. Los fotones emitidos por el centelleo viajan por untubo de luz que llega al fotomultiplicador (PM) [17, 27]. Ahora que están en forma deluz, la señal puede pasar a través de una ventana de cristal de cuarzo, la cual forma unvacío sellado para el primer electrodo del fotomultiplicador. En este fotocátodo, el flujode fotones se convierte de nuevo en una corriente de electrones y los electrones son ace-lerados [27, 65]. La función del fotomultiplicador es amplificar la señal original. Así, porcada fotón generado, varios electrones se producen, esto se traducirá en una ampliaciónsignificativa de la señal original. La cantidad de amplificación del tubo fotomultiplicadores controlada por la tensión PM (control de contraste) [17].

El número de electrones generados es directamente proporcional al área de superficiede emisión. La densidad de la superficie de emisión determinará la intensidad de la se-ñal. Las superficies planas emitirán pocos electrones porque la superficie tiene poca área,mientras que las estructuras puntiagudas emitirán más electrones [17]. Cuando los elec-trones secundarios se emiten tras una pronunciación más grande o en una depresión, loselectrones secundarios se pierden debido a que la muestra los reabsorbe. El resultado es unefecto de sombreado [17]. La imagen es construida en un tubo de rayos catódicos (TRC)escaneada en sincronismo con la imagen escaneada, controlada por el mismo generadorde escáner [6]. El tubo de rayos catódicos (TRC o CRT) es una válvula o tubo electrónicoen el que un haz de electrones se enfoca sobre una área pequeña de una superficie emisorade luz que constituye la pantalla y cuya intensidad y posición sobre ella pueden variar-se [27]. En televisión, el tubo de rayos catódicos se designa frecuentemente como tubode imagen o simplemente como pantalla y tiene características particulares para estaaplicación, distintas a las de los tubos de rayos catódicos utilizados en los osciloscopios,en particular su forma, dimensiones y método de deflexión del haz electrónico [27]. Unaaspecto importante es que debido a que la diferencia de energía entre los electrones retrodispersos y los secundarios es alta, es fácil desarrollar detectores sensibles solo a energíasaltas, de modo que existen detectores exclusivos para los electrones retro dispersos [27].Después de haber conocido acerca de cómo se detecta la imagen y es proyectada para quepueda ser vista por el ojo humano, nos damos cuenta de que, estos procesos representan

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1 Generalidades

factores que influye para que un protocolo pueda ser catalogado como robusto, puestoque gracias a la detección de las señales y su proyección en la pantalla es que uno puedeobservar en qué medida ha sido efectivo el protocolo usado para la preparación de lamuestra.

1.4. Preparación de muestras

Después de haber estudiado el proceso de formación y obtención de la imagen, la partetécnica de los instrumentos con que se trabajarán en este proyecto y los efectos propiosde cada uno, es importante dirigir la atención a los protocolos que se seguirán para lapreparación de las muestras. El MET permite analizar cortes de tejido pequeños (1-3mm2) y muy delgados (30-80 nm) [60] ya que el poder de penetración de los electroneses muy limitado [25], y una de las desventajas paradójicamente es que debido a que lasmuestras son muy delgadas, el contraste entre sus ultraestructuras y el fondo es débil yademás el aspecto de la muestra es bidimensional [25]. Debido a la preparación que sedebe llevar a cabo para la correcta observación de las muestras, y al alto vacío necesario,las muestras pueden sufrir contracción y distorsión, incluso en algunas ocasiones puedenaparentar estructuras adicionales, a las que se conoce como artificios [25]. Por otro ladopara que se puedan observar las muestras en el MEB, ésta debe deshidratarse y cubrirsecon una película delgada de un metal noble para que sean conductoras [60], y para estecaso no son necesarios cortes ultra finos.

1.4.1. Preparación de muestras para el MEB

1.4.1.1. Preparación de muestras para materiales biológicos, orgánicos,poliméricos e hidratados

La interacción del haz de electrones con la muestra puede causar daños térmicos, y lamás alta relación señal-ruido se obtiene a partir de muestras termodinámicamente esta-bles, plana o delgada de alto número atómico [27]. La principal preocupación es convertirla muestra normalmente húmeda a un estado seco, preservando su forma tridimensionaly su constitución química para poder ser examinada en el microscopio en vacíos altos.Esta conversión se divide en tres distintas fases:

1. Fijación: implica la estabilización, ya sea por enlace, denaturación o precipitaciónde las moléculas orgánicas presentes en las células y tejidos [27].

2. Deshidratación, eliminación del agua [27].

3. Recubrimiento: implica la aplicación de una fina capa de material conductor a unasuperficie no conductora para que se vuelva conductora y pueda transmitir loselectrones [27].

Selección de muestra Las muestras pequeñas son más fáciles de manejarlas y proce-sarles durante la fijación y deshidratación. Pueden ser estabilizadas y deshidratadas más

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1 Generalidades

adecuadamente, disminuyendo la oportunidad de que los componentes volátiles sean li-berados dentro del microscopio. Paradójicamente, el tamaño de los microbios y de losorganismos unicelulares es el principal problema; aunque los tiempos de fijación y deshi-dratación son pequeños debido a su tamaño, el manejo es difícil [27]. Lo usual es colectary manejar la muestra por centrifugación de las suspensiones acuosas o fijar la muestrafirmemente en un soporte como filtros de plataforma, sustrato de vidrio o una mica limpia[27].

Limpieza de las muestras La superficie a ser examinada debe estar limpia y libre deescombros extra celulares, ya que estos oscurecen toda la superficie; y otras sustanciascomo el polvo y fragmentos de células y tejidos también oscurecen parte de la superficie aser examinada resultando en una imagen incompleta [27]. Generalmente los contaminan-tes acuosos de tejidos animales pueden ser eliminados lavándolos o regándoles una buffer;por otro lado, si se conoce la naturaleza bioquímica de las muestras, se puede utilizarenzimas de digestión [27]. En las muestras acuosas como algas unicelulares, protozoos einvertebrados pequeños, donde están mezclados con otros escombros de plantas o anima-les, se recomienda centrifugar y repetir el lavado con una buffer apropiada, obviamenteen la centrifugación se separan los organismos de los escombros [27]. Las muestras secascomo tejidos calcificados y tejidos de quitina, como semillas, madera, esporas, granos depolen y partes aéreas de las plantas, necesitan ser quitadas el polvo preferiblemente conaire limpio, aunque un plumero puede ser usado, las muestras más duras, como tejidosde plantas y animales pueden ser limpiadas con un chisguete o con un plasma frío dedescarga de gas [27].

Estabilización de la muestra La estabilización de la muestra o fijación es el procesomediante el cual el estado de gran movilización del citoplasma o de otra estructura, esinmovilizado por procesos de precipitación, denaturación y de enlace. Durante la fijaciónestructural la mayoría de los iones y electrolitos y muchas de las moléculas de bajopeso molecular como azúcares y aminoácidos se pierden irremediablemente de la célulay únicamente las macro moléculas permanecen [27]. Para tener una buena fijación, laosmolaridad de la solución de fijación es tan importante como la concentración real delfijador. En el algunos casos, el tiempo de fijación es corto (1 hora en general), pero en otroscasos es más largo para permitir que el fijador ingrese en el centro de la muestra. Se debenconsiderar otros factores como el pH, el balance de iones, y la temperatura los cualesinfluyen en la obtención de la imagen [27]. La fijación puede darse de diferentes maneras:la muestra puede ser expuesta a una fase de vapor de fijación, o se puede sumergir o flotaren una solución de fijación. El vapor de fijación es útil para preservar estructuras aéreasdelicadas, mientras que la inmersión o perfusión asegura que el fijador llegue a las partesapropiadas de la muestra. La flotación ha sido eficiente en hojas, pétalos y piel [27, 32].El glutaraldehido sigue siendo el fijador de elección para los componentes estructurales yenzimáticos de la célula [32, 17, 43]. Aunque la fijación con glutaraldehido definitivamentedirige hacia la extracción mayor o menor de una gran variedad de componentes, elementosy macro moléculas, la cantidad de material realmente extraído depende también de la

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1 Generalidades

buffer usada para realizar la fijación [27, 17]. Una alternativa en lugar del glutaraldehidopodrían ser los agentes de enlaces bifuncionales como son: dimetiladipimidato, que esusado para enlaces de proteínas [27]. Para actuar a bajas concentraciones del fijadortambién se aplica el tetraóxido de osmio, el cual preserva la estructura de las proteínasy retiene la antigenicidad [27, 32]. Una breve exposición a bajas concentraciones detetraóxido de osmio 1% en general, seguido de tiocarbohidrazado, y después una segundaexposición al tetraóxido de osmio preserva los filamentos de actina [27]. La mayoría delos tejidos se los deja fijándose a temperatura ambiente durante toda la noche y es útilmantenerlos en agitación por este tiempo, sin embargo algunas veces se realiza a 4°Cdebido a la pérdida de material celular que puede ocurrir por efecto post mortem [43];después de la fijación, el tejido puede ser lavado en una buffer isotónica y post fijadapor 4h en tetraóxido de osmio al 1%-2% a la misma temperatura en que se realizó lafijación con el aldehído. Para los componentes lípidos e hidrocarburos es necesario eluso de tetraóxido de osmio a concentraciones algo más altas que las que se da para lapreservación de las proteínas [27].

Deshidratación de la muestra Para la preservación de la muestra en el ambiente devacío usualmente se la debe secar [17]. Se la lleva a cabo en dos pasos: primero el agua esreemplazada por un líquido orgánico o es solidificada; y segundo los fluidos orgánicos soneliminados de la muestra por el secado del punto crítico o por la temperatura ambiente ysolidificación del agua eliminada por sublimación a baja temperatura, llamado secado porcongelación [27]. La deshidratación química implica pasajes a través de concentracionesaltas de líquidos orgánicos, acompañados por la extracción y la contracción de los tejidos[27]. Se logra por el paso de los tejidos fijados a través de series graduales de metanolo etanol o soluciones acetónicas. Una deshidratación química rápida se logra usando2,2-dimetoxipropano. El hexametildisilazano también se lo utiliza para la deshidratación[27] o el tert-butanol [5]. Secado al aire: el secado al aire no es conveniente porquecausa una distorsión significativa de los tejidos debido a la alta tensión superficial delagua. El secado rápido de las muestras de las fases acuosas colocándolas en el vacíotiene una desventaja, y es la formación de hielo debido a la evaporación del agua alreducir la presión; esto distorsiona la muestra [27]. Punto crítico de secado: el puntocrítico es cuando los dos estados, vapor y agua, de la mayoría de los líquidos volátilesdesaparecen a una cierta temperatura y presión, es decir que las dos fases están enequilibrio, el límite de fase desaparece y de ese modo no existe tensión superficial [27, 65].Los aspectos del método implican el paso del tejido por los líquidos de deshidratación(metanol, etanol, acetona, tert butanol o histoclear), a través de fluidos intermedios(amilacetato, freón) en los líquidos de transición, CO2 líquido o Freón 13, en aparatosde secado a punto crítico a altas presiones [17, 27]. Secado a bajas temperaturas: seinfiltra en la muestra un crio protector como el glicerol o el dimetil sulfoxido; el problemacon estos es que se quedan en la muestra después del secado y lentamente oscurecen lamuestra y contaminan el microscopio [27]. El método de secado por congelación es elmejor para preservar los detalles de las muestras. Secado por congelación: es un procesode deshidratación en el cual el agua de la muestra es primeramente convertida en hielo, el

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1 Generalidades

cual es después sublimado a bajas temperaturas y alto vacío [27]. Se debe perfeccionar elproceso especialmente bajo condiciones rigurosas para prevenir el daño por la formaciónde cristales [17].

Soportes para la muestra Después del secado la muestra es montada sobre un soportepara muestras (stub) usualmente de aluminio y la muestra es adjuntada con un adhesivoconductivo como pintura de plata o de carbono [65, 17]

El soporte provee alguna vía de conducción de electrones. Hay diferentes sustratosempezando desde cubreobjetos de vidrio y plástico, discos de metal y cristalinos, plásti-cos, ceras, y filtros de membrana. La mica es un soporte conveniente para las muestrasbiológicas, las hace más resistentes a las cargas que el vidrio [27, 32].

1.4.1.2. Tinción de polímeros y plásticos

Estas técnicas implican la incorporación de elementos con números atómicos altos ensitios específicos o generales según sea necesario para aumentar la dispersión electrónica[27]. En el cuadro 1.2 se muestra una lista de grupos funcionales de polímeros con sutinción respectiva. Son usados 5 grupos para la tinción: tetraóxido de osmio: reaccionacon cualquier enlace insaturado y puede ser usado como una tinción general para unaamplia gama de materiales [27]. Ácido clorosulfónico: estabiliza y tiñe materiales amorfosen olefinas semi cristalinas. Tiñe las regiones laminares de polietileno (PE) [27]. Ácidofosfotúngstico: reacciona con grupos funcionales de la superficie como hidroxi, carboxiy amino; usado para la tinción de nylon y regiones laminares de polipropilenos [27].Tetraóxido de rutenio: es considerado para oxidar anillos aromáticos y éteres, ha sidousado también para teñir inclusiones de goma, nylon, poliestireno y polietileno [27]. Salesde plata: son utilizadas para teñir fibras biológicas y polímeros como cabello, madera ycelulosa [27].

1.4.1.3. Daños

Daños durante la preparación Los más obvios indicativos, cuadro 1.3, de que la muestrase ha dañado en la preparación son: contracción debido a fallas en la fijación, picadu-ras, cracking, y fusión debido a procesos de recubrimiento débiles; pérdida, ganancia yredistribución química de los componentes debido a la estabilización inadecuada de lamuestra; y finalmente, deshidratación y distorsión debido a los cristales de hielo [27].

Daños durante la examinación y análisis Daños observables: la muestra se puede veren una burbuja, ampolla, se mueve, se funde, se observa cavitación, o desaparece porcompleto. Estos fenómenos son debidos principalmente a daños térmicos y las muestrasno pueden ser utilizadas para los estudios [27]. La mayoría de los daños son debidos aastigmatismo, deriva de la vibración o rotación de imagen. Otras fallas son causadaspor la misma muestra, y otras son debido a la interacción del haz de electrones con lamuestra, lo que incluye carga y contaminación. Daños no observables: primeramente esdebido a la radiación ionizante, la cual causa que los materiales orgánicos hidratados

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1 Generalidades

Cuadro 1.2: Lista de grupos funcionales específicos y tinciones respectivas para alcanzarla distinción de capas en polímeros y plásticos [27].

Grupo funcional Ejemplos Tinción

-CH-CH- Hidrocarburossaturados

(polietileno,popropileno)

Ácido clorosulfónico,ácido fosfotúngstico

-C=C- Hidrocarburosinsaturados

(polibutadieno,compuestos de

goma)

Tetraóxido de osmio,tetraóxido de

rutenio, ebonita

-OH , -COH Alcoholes, aldehídos(alcohol polivinil)

Tetraóxido de osmio,tetraóxido de

rutenio, sulfuro deplata

-O- ÉteresTetraóxido de osmio,tetraóxido de rutenio

-NH2 AminasTetraóxido de osmio,tetraóxido de rutenio

-COOH ÁcidosHidrazina, seguidode tetraóxido de

osmio

-COOR Ésteres (butilacrilato, poliésteres,etil-vinil acetato)

Hidrazano seguidode tetraóxido de

osmio, ácidofosfotúngstico,

sulfuro de plata,hidróxido de sodio

-CONH2 ,-CONH- ,

Aromáticos

Amidas, (nylon),Aromáticos(poliamidas

aromáticas, óxidopolifenileno)

Ácido fosfotúngstico,cloruro de estaño,

tetraóxido derutenio, sulfuro de

plata,trifluoroacetato de

mercurio

Bifenoles basadosen epoxis

Resina epoxiTetraóxido de

rutenio

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1 Generalidades

se sequen o se congelen. La energía que se transfiere de los electrones a la muestra esla causa del daño por radiación [27]. La causa principal del daño por radiaciones es laionización de los átomos, lo cual sucede tan rápido que nosotros no podemos evitarlo. Enlos materiales biológicos, hidratados y orgánicos, las reacciones secundarias del daño porradiaciones son debidas principalmente a la difusión de radicales libres, especies atómicasaltamente reactivas y especies moleculares [27].

Cuadro 1.3: Daños frecuentes que aparecen debido a fallas en la preparación de la muestra[27].

Efectos CausasBurbujas y ampollas en

la superficieLavado inicial incorrecto, fijación

hipertónica.Explosión de burbujas Fijación hipertónica

Depresiones en lasuperficie de las células

Aire de secado incipiente

Cristales en lasuperficie

Electrolitos de la buffer, electrolitosdel medio

Separación de células Congelamiento pobreCresta en la superficie Artefactos cortados del material

congeladoRuptura de célula Pobre fijación, pobre congelamiento

y aire desecado incipienteRuptura de la

superficie de las célulasLavado pobre y pobre fijación

Distorsión de la formade la célula

Secado al aire

Material de partículasfinas en la superficie

Demasiado o inapropiadorecubrimiento

Contracción general Fijación hipotónica y lavadosDaños graves Mal manejo del material de

preparación, decadencia microbianaIncremento de las

dimensiones de la célulaDemasiado recubrimiento

Contenidos internosagrupados y coagulados

Pobre fijación, deshidratación

Material particuladogrande

Desintegración de la muestra, polvoy suciedad

Hoyos grandes regulares Daño por congelamientoGrandes grietas

superficialesMovimiento de la capa de

recubrimientoDepósitos de micro

cristalesBuffer incorrecta, fijación o tinción

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1 Generalidades

Detalles oscuros de lasuperficie

Demasiado recubrimiento

Deformación plástica Cortes incorrectos, fracturasDivisiones regulares y

cortesContracción térmica entre células

Ruptura de loscontenidos celulares

Secado por punto crítico pobre

Separación de células Fijación incorrectaApéndices arrugados Fijación hipotónicaCélulas arrugadas Sobrecalentamiento durante la

fijaciónLigera contracción Secado por punto crítico pobre

Pequeños hoyos sobrela superficie

Dispersión del recubrimientoincorrecta

Superposición desuperficies

Secado incorrecto

Superficie moteada Contaminación en la dispersión delrecubrimiento

Superficie de las célulasestirada

Fijación hipotónica

Material sobresuperficies

Lavado incorrecto

Grietas y grabados enlas superficies

Incorrecto dispersión delrecubrimiento

Pliegues o crestas de lasuperficie

Fijación del pH inadecuado

Superficie fusionada Demasiado calentamiento duranteel recubrimiento

Desprendimiento de lasuperficie

Secado por aire del fluido orgánico,aplicación lenta de fijación

Muestra hinchada Buffers hipertónicas y fijación,secado por congelamiento pobre.

1.4.1.4. Técnicas de recubrimiento y conductividad para el MEB

El tratamiento es necesario para eliminar o reducir la carga eléctrica que se acumularápidamente en una muestra no conductora cuando es escaneada por un haz de electronesde alta energía como es el caso de las muestras biológicas [27]. El haz primario tambiéncausa daños termales y de radiaciones, lo cual dirige a una pérdida de material de lamuestra. En algunas ocasiones la muestra puede adquirir suficiente carga como paradesacelerar el haz primario y la muestra puede actuar eventualmente como un espejode electrones [27]. La razón más importante para el recubrimiento o el incremento de la

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1 Generalidades

conductividad eléctrica es aumentar la conductividad eléctrica de la muestra. Una víaadecuada de conducción puede ser establecida con plata o con una pintura de carbono,o una capa fina de oro, o cobre será suficiente para eliminar los problemas asociadoscon la carga [27, 17]. Existen dos métodos comunes usados para cubrir las muestras:recubrimiento por chisporroteo y deposición al vacío o evaporación térmica. El primerprocedimiento se lo hace con varias moléculas de metal, cuando las moléculas golpeanla muestra pueden salpicar como pintura de esa manera se crea una capa fina sobreestructuras de muestras de 20-30 nm[17]. Se realiza bajo un vacío parcial, donde lasmoléculas de argón son ionizadas en alto voltaje entre el ánodo y el cátodo. Este métodoes fácil y barato y la cantidad de oro utilizada es pequeña; el mayor daño que se da enla muestra es debida al calor [17]. El otro método se detalla en el anexo 2.

Daño térmico: El calentamiento de la muestra no es usualmente un problema en lamayoría de las muestras examinadas en el MEB, porque la sonda de corriente está usual-mente en un rango de pico amperios [27]. Los efectos térmicos son más serios en losmicroanálisis de rayos X o de cátodo luminiscencia, en los cuales la sonda de corrienteestá en un rango de nano amperios e incluso en micro amperios. El calentamiento excesi-vo en el MEB puede llevar al movimiento e inestabilidad de la muestra, y en situacionesextremas, a la rotura y destrucción [27]. Muestras sin tratamiento: varios métodos pue-den ser usados para examinar muestras sin tratamiento en el MEB, como operar con haza baja energía, incorporación de un segundo haz de electrones o iones para la descargade la muestra y la examinación de la muestra en presencia de agua.

Métodos de tinción para una mayor conductividad: el uso de metales pesados comoosmio, plomo e iones de uranilo con mordientes bifuncionales, algunos de los cuales sonligandos, como el tiocarbohidrazado, fenilenediaminas y galoilglucosa, pueden conseguirun aumento significativo en la carga de metales sobre las muestras y así un aumento en laconductividad [27]. El tiocarbohidrazado es una sustancia muy útil porque puede formarpuentes entre las moléculas de osmio. Un grupo amino terminal reacciona con el osmioanterior, y el otro grupo terminal a su vez se une a más iones de osmio [27]. Métodode Osmio-Tiocarbohidrazado-Osmio (OTO): las muestras son fijadas en glutaraldehido,lavadas y post fijadas en tetraóxido de osmio. Las muestras pasan luego por lavados enbuffer y son incubadas en una solución de tiocarbohidrazado. Después del segundo lavadose elimina cualquier unión no consolidada del tiocarbohidrazado, la muestra es incubadaalrededor de una hora en tetraóxido de osmio. Después del último lavado la muestra esdeshidratada y secada [27].

Método de Ácido tánico-Osmio (TaO): la muestra fijada con aldehídos es mojada conuna solución de ácido hidroclorhidrico- tánico por varias horas, pasa por lavados, y pasapor tetraóxido de osmio igualmente por un largo período. Las muestras son lavadas,deshidratadas y secadas [27].

Método de Ácido tánico- Osmio- Tiocarbohidrazado (TaOTh): la muestra fijada conaldehído es sumergida en una mezcla de glutaraldehido-ácido tánico. Después se lava, yla muestra pasa por una solución de osmio, se lava y se la coloca en tiocarbohidrazado.Después de otro lavado la muestra pasa a una solución fresca de osmio y subsecuentementese lava, deshidrata y se seca [27].

Método de Osmio- Dimetil sulfoxido- Osmio (ODO): la muestra fijada con osmio es

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1 Generalidades

Cuadro 1.4: Soluciones para tinción negativa [43] .Soluciones comunes utilizadas para la tinción negativa

Acetato de uraniloFormato de uranilo

Fosfotúngstato de sodio o potasioSilicotungstato de sodio o potasio

Molibdato de amonio

sumergida en una solución de dimetil sulfoxido por media hora. Las muestras son conge-ladas y fracturadas utilizando el nitrógeno líquido, los pedazos fracturados se descongelanen una solución DMSO antes de ser post fijadas en una solución de osmio [27].

1.4.2. Preparación de muestras para el MET

1.4.2.1. Capas de soporte

En el MET la muestra debe ser montada en una rejilla de metal de 3 mm de diámetro,usualmente de cobre de 0.01 mm de grosor, esto permite apoyar la muestra entre las barrasde la rejilla y permite a los electrones pasar a través de la muestra que se encuentra enlos agujeros de la red [30]. La rejilla es generalmente cubierta por una película delgadaque provee estabilidad mediante la reducción de la acumulación de carga de superficie[30]. Las películas delgadas de soporte de carbono habitualmente se pueden preparar conla deposición de carbón al vacío (anexo 2) sobre la superficie limpia de una rejilla. Elgrosor deseado se puede alcanzar basándose en el color gris tenue [30, 43]. Las películasde plástico- carbón (colloidon, formvar, butvar y pioloform) que también actúan comosoporte; y pueden ser usadas solas o seguidas de una capa de recubrimiento de carbón[30, 43, 32]. Si la muestra no es más grande que 0.5 µm puede ser directamente adsorbidaen la rejilla, pero si son más grandes, deben ser embebidas en epoxi, cortadas (usualmenteentre 50-300 nm) [30].

1.4.2.2. Tinción negativa

Esta técnica fue aplicada inicialmente para virus y luego para otras partículas biológicascomo proteínas, liposomas, membranas, etc [30, 32, 43]. Lo que sucede es que un metalpesado contiene una sal de tinción negativa que se utiliza para rodear, apoyar y penetrardentro de un compartimento acuoso de una partícula biológica [27]. Se integra al materialbiológico y al mismo tiempo genera la dispersión de electrones diferencial entre el materialbiológico transparente- electrones y electrones- tinción negativa densa [43, 32]. En elcuadro 1.4 se detallan otras soluciones utilizadas para la tinción negativa.

Estas tinciones son generalmente preparadas como soluciones acuosas al 1% o 2% p/v.Preparación general del material con tamaño mayor a 0.5 µm: Los electrones son fuer-

temente dispersados dentro de un sólido debido a las fuerzas que actúan sobre el electróncuando pasa a través del campo electrostático dentro de cada átomo, de modo que el

48

1 Generalidades

espesor de una muestra de MET debe ser muy pequeño, así que la preparación consisteen asegurar que el espesor permanezcan en un rango nanométrico [20, 30]. Uno de losmétodos usados para reducir el tamaño de las muestras es el raleo químico, en el que unasolución química disuelve la superficie original y se reduce el espesor de la muestra a unvalor adecuado para obtener imágenes de MET, tan pronto como se forme un agujero,el chorro de solución química se sustituye con agua de enjuague. Si el procedimiento esexitoso, las regiones de la muestra que rodea el agujero son lo suficientemente delgadascomo para el examen en el MET [20]. Al igual que en el MEB se debe fijar la muestra conglutaraldehido y se puede usar una fijación secundaria con tetraóxido de osmio [32, 43].Luego se prosigue con la deshidratación y finalmente la muestra, ya sea tejidos, cromo-somas, cultivos celulares, virus, etc, son embebidas en resinas epoxi (Epon) y se procedea realizar los cortes utilizando el ultra micrótomo como se detalló en la exposición desuperficies internas. Posteriormente, los cortes ultra finos son recogidos del ultramicró-tomo ya que este instrumento posee el soporte donde van cayendo los cortes en el agua.Por último las secciones ultra finas son teñidas [32, 43, 20]. Dependiendo si son bacteriaso células mamíferas, se deben algunas consideraciones para elegir el tipo de químicospara la fijación y las buffers que se usarán por ejemplo en lugar de glutaraldehido se po-dría usar formaldehido [43]. Los aldehídos penetran en el cultivo de células rápidamente,uniendo proteínas deteniendo la dinámica de la célula viva [32, 43]. La post fijación quese realiza con el tetraóxido de osmio reacciona lentamente con las proteínas, incluyendolas histonas, por lo tanto ayuda a preservar el ADN asociado; los carbohidratos no sonconservados [43]. Después de la reacción de oxidación que se produce, el metal pesado,osmio, es reducido a las macromoléculas mejorando así el contraste cuando se ve en elMET. La actividad enzimática y la reactividad inmunológica se destruyen debido a quelas células son endurecidas considerablemente después de haber recibido osmio [43]. Entrelas buffers usadas para proteger las células durante la fijación están: buffers de fosfato,cacodilato y buffers orgánicas [43]. Después de la fijación y post fijación, la muestra esdeshidratada con etanol con concentraciones incrementadas, luego son infiltradas en elepoxi y ésta es polimerizada y es rodeada por un plástico listo para ser cortado en sec-ciones ultra finas [30, 43]. Al final de revisar la preparación de las muestras tanto para elMEB como para el MET es fácil darse cuenta que el control de las variables es compli-cado porque primeramente son varios los parámetros que se deben tomar en cuenta y lamayoría de ellos están sujetos a efectos del azar, por ejemplo, la temperatura ambienteno se puede controlar, la cantidad de PTA que se usa siempre es variable, el secado dela muestra antes de introducirla en el MET difiere en la cantidad de agua que absorbe elpapel filtro y la cantidad de muestra que se coge para colocar sobre la rejilla no siemprees la misma porque se lo hace utilizando una asa de siembra. Ahora con respecto a lametodología utilizada para el MEB vemos que la fijación de la muestra es el procesomás crucial en la preparación y que depende de la cantidad de solución fijadora que serequiera para poder sumergir la muestra y de la naturaleza de la misma de modo quees variable, de igual manera en el proceso de secado y por último la distribución de lacapa de oro para el recubrimiento de la muestra no es equitativa. Todos estos parámetroshacen que la robustez de un protocolo se ponga en juego en el momento de aplicar unametodología en el laboratorio.

49

1 Generalidades

1.5. Robustez de un protocolo

La validación de un protocolo es uno de los elementos básicos en sistemas de calidad yaque trata de disminuir o controlar los factores que llevan a la imprecisión o inexactitudde un dato generado [51]. Con el fin de implementar una nueva área de laboratorio serealizó la adquisición de los microscopios electrónicos de transmisión y de barrido enla Escuela Politécnica de Ejército y para continuar fomentando la investigación en laUniversidad, se tiene el propósito de estudiar protocolos para la preparación de muestrasorgánicas e inorgánicas y de esa manera estar en la posibilidad de brindar los mejoresservicios de análisis que ofrecen los microscopios a las instituciones y empresas del país.Sin embargo para alcanzar dicho propósito es necesario el estudio de parámetros queinfluirán directamente en los resultados, ésto sustenta el presente trabajo, mismo quedejará establecidas las metodologías a seguir para una muestra específica de referencia,disminuyendo alteraciones de la misma, pérdida de resolución de imágenes, optimizaciónde tiempo de trabajo y costos. Teniendo en cuenta la introducción del complejo procesode obtención de imágenes, los varios factores que intervendrán para la formación deéstas y el no disponer de protocolos para la preparación de muestras que se acoplen alos laboratorios de Microscopía Electrónica, se hace necesario disponer de metodologíasválidas que sean confiables para la ejecución de dichos protocolos y así las muestraspuedan ser observadas; así que para la obtención de resultados exactos y precisos con altogrado de seguridad es indispensable realizar la validación del método para establecer unaevidencia documentada del procedimiento, para alcanzar dicho propósito se consideraráel parámetro de la robustez, que permite expresar la capacidad del método analítico parapermanecer inalterado por ligeras pero deliberadas variaciones que son introducidas enlos parámetros del métodos [37]. Para evaluar la robustez del método hay que identificarcuáles son los factores experimentales críticos en dicho método, luego se hace un estudiode las multivariantes y así se conoce cuales son los factores bajo estudio que ejercen mayorinfluencia [4]. De modo que podremos establecer los márgenes entre los que pueden variarlos factores experimentales críticos para, de esta forma, mejorar la exactitud y la precisiónde los resultados obtenidos con el método. Según [49] la determinación de la robustezde un método consiste en tomar el método oficial y someterlo a un pequeño cambioen el procedimiento y comprobar la influencia que dicho cambio tiene en los resultadosobtenidos, con respecto al método sin modificaciones; además de acuerdo con [12] serecomienda que un método analítico nuevo se someta a pruebas de robustez antes deser aceptado como método autorizado para un laboratorio. Después de haber puesto enconocimiento lo anteriormente mencionado se expresa el objetivo de este estudio quees estudiar protocolos para la preparación de muestras orgánicas e inorgánicas a serobservadas en los microscopios electrónicos de barrido y de transmisión mediante lamodificación de distintos protocolos ya establecidos.

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2 Materiales y métodos

El presente estudio se desarrolló en el Laboratorio de Microscopía Electrónica de laESPE y en el Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Leopoldo Izquieta Perezde Guayaquil, las personas que participaron constantemente en este estudio son la Srta.Sara Guerra, el Dr. Alexis Debut Ph.D, la Ingeniera Tatiana Páez y el Dr. Yasuji AmanoPh.D. La preparación de las muestras orgánicas e inorgánicas a ser observadas en losmicroscopios electrónicos se ha explicado brevemente en el anterior capítulo, en éste sedetallará cuál o cuáles protocolos cumplen con una robustez del 90% para cada muestrade referencia y por consiguiente podrán ser utilizados en el Laboratorio de MicroscopíaElectrónica de la ESPE.

2.1. Protocolos para muestras inorgánicas

Las muestras inorgánicas que se utilizarán en el presente estudio son nanopartículas dehierro cero valente y de sulfuro de hierro, adquiridas gracias al Dr. Cumbal, director delCentro de Investigaciones Científicas (CEINCI) de la Escuela Politécnica del Ejército. Seprobaron varios protocolos para la preparación de las rejillas de cobre para la observaciónde nanopartículas de hierro cero valente y de sulfuro de hierro; en el cuadro 2.1 se detallanlos tratamientos usados para las rejillas. Al observar las fotografías obtenidas con losdistintos tratamientos se escogió el recubrimiento de formvar con carbono y solo formvarcomo el mejor protocolo para la obtención de fotografías de buena calidad.

2.1.1. Protocolo para la preparación de nanopartículas de hierro cerovalente y de sulfuro de hierro

Sobre una rejilla de cobre cubierta con formvar y una fina capa de carbono utilizandoel evaporizador de carbono CEA 2.2 Ladd, se dejó caer una gota de una solución de 1 g/lde nanopartículas y con papel filtro se retiró el exceso de muestra sobre la rejilla. Lasmuestras fueron observadas a 80 kV en el microscopio electrónico de transmisión TecnaiG2 Spirit Twin desde un aumento de 96000 hasta 110000x.

2.2. Protocolos para muestras orgánicas

Las muestras orgánicas de referencia utilizadas para el estudio fueron: bacterias Baci-llus thuringiensis y microalgas, donadas por el laboratorio de Microbiología de la ESPE,las muestras de virus vegetales y los tejidos humanos fueron adquiridas en el InstitutoNacional de Higiene y Medicina Tropical Leopoldo Izquieta Perez, los hongos ambien-tales fueron donados por el laboratorio de Cultivo de Tejidos de la ESPE, el polen de

51

2 Materiales y métodos

Cuadro 2.1: Protocolos estudiados para la preparación de rejilla para la observación denanopartículas. TOO: Tetraóxido de osmio. ALL: en agua lluvia. AD: enagua destilada. A dichos tratamientos escogidos como los mejores para lasrejillas se los repitió 10 veces con el objetivo de comprobar que los resultadosque se consiguen son robustos.

Tratamiento/Nanopartícula

Fe 0valenteALL

Fe 0valente

AD

FeS ALL FeS AD

Recubrimiento decarbono

X

Recubrimiento conformvar y carbono,secado en estufa

X

Recubrimiento deformvar y carbono,secado con papel

filtro

X X X

Recubrimiento conformvar y carbono

secado al aire

X X

Recubrimiento deformvar y carbono,

nanopartículastratadas con TOO

X

Recubrimiento deformvar, secado en

estufa

X

Recubrimiento conformvar, secado al

aire

X

Recubrimiento conformvar y

poly-L-lysine, secadocon papel filtro

X X X

Recubrimiento deformvar, secado con

papel filtro

X X

52

2 Materiales y métodos

Cuadro 2.2: Protocolos estudiados para la preparación de rejilla para la observación debacterias. BFP: Bacterias fijadas. BMC: bacterias en medio de cultivo.Tratamiento/ Bacteria Bacillus

thuringiensisPesudomonaaeruginosa

Recubrimiento conformvar, secado al aire,

BF

X

Recubrimiento conpoly-L-lysine, tinción

negativa, BMC

X

Recubrimiento conformvar, tinciónnegativa, BMC

X X

Recubrimiento conformvar y carbono,

tinción negativa, BMC

X

Recubrimiento conformvar y

poly-L-lysine, BMC

X

Polylepis pauta fue donado por el laboratorio de Biología Molecular Vegetal de la ESPE,las garrapatas fueron donadas por el laboratorio de Inmunología animal de la ESPE,las moscas Drosophila melanogaster fueron donadas por el laboratorio de genética de laESPE y la muestra de cromosomas humanos fue donada por el Hospital Militar.

2.2.1. Protocolo para la preparación de bacterias

Se tomó en consideración la preparación del soporte para las rejillas de cobre, cuadro2.2. Se trabajó con bacterias Bacillus thuringiensis y con Psuedomona aeruginosa, en elprimer caso no representó una amenaza para la salud, de modo que se prepararon lasmuestras en el laboratorio de Microscopía Electrónica utilizando un mechero de alcohol,pero para el segundo caso las muestras fueron preparadas en el laboratorio de BiologíaMolecular Humana, el cual cuenta con cámara de flujo laminar y material destinadoúnicamente para trabajar con dichas bacterias. Luego de haber utilizado el material detrabajo para P. aeruginosa se esterilizó con luz ultravioleta. Los ensayos de los proto-colos se los realizó utilizando la muestra de B. thuringiensis, mientras que las bacteriaspatógenas, P. aeruginosa, fueron utilizadas solo para comprobar que el protocolo elegidopara las rejillas de cobre funciona correctamente. Al realizar los distintos tratamientosse eligió al recubrimiento con formvar como el mejor para la obtención de imágenes conbuena calidad.

A la rejilla de cobre recubierta con formvar se la repitió por 10 veces con el objetivode comprobar que el protocolo escogido es robusto. Se mantuvo el cultivo de Bacillus

53

2 Materiales y métodos

Cuadro 2.3: Protocolos estudiados para la preparación de rejilla para la observación devirus vegetales.

Tratamiento de la rejilla para virus

Recubrimiento con formvarRecubrimiento con formvar y poly-L-lysine

thuringiensis en el refrigerador por 0, 1, 4, 5, 24, 71, 72 y 73 horas para someter a lasbacterias a estrés y tener la posibilidad de observar esporas y cristales producidos porellas; para cada uno de los tiempos se realizó el siguiente protocolo: i) Con una asa desiembra se tomó una pequeña cantidad de bacterias del cultivo, ii) se puso en contactocon una gota de ácido fosfotúngstico (PTA) al 2%, iii) con una pinza se tomó una rejillacubierta con fomvar y se topó en la solución de bacterias y de PTA, iv) con papel filtro seabsorbió el exceso de la solución de la rejilla v) se observó en el microscopio electrónicode transmisión Tecnai G2 Spirit Twin a 80 kV, en aumentos desde 95000 hasta 13000x.

2.2.2. Protocolo para la preparación de virus de plantas

Se probó protocolos tanto para el recubrimiento de la rejilla como para la preparaciónde las muestras de virus vegetales. Los tratamientos para el recubrimiento de la rejilla sepueden apreciar en el cuadro 2.3 y el que mejores resultados ofreció fue el recubrimientocon formvar, mientras que los protocolos usados para la preparación de las muestrasvirales fueron: i) se reconoció hojas infectadas y se recolectó, ii) se maceró las muestrascon agua destilada y se obtuvo una suspensión, iii) se puso en contacto la rejilla tratadacon la suspensión durante 30 segundos, iv) se secó el exceso de muestra en la rejilla conpapel filtro, v) se topó la rejilla en una gota de PTA y nuevamente se secó el exceso conpapel filtro; también a este protocolo se probaron tiempos de PTA de 30 segundos, 1 y 2minutos . Como segundo protocolo, se hizo una modificación al anterior, a la maceraciónobtenida se la centrifugó a 6000 rpm durante dos minutos, se tomó la parte líquida yse siguieron los pasos iii, iv y v. Como tercer protocolo, a la maceración obtenida detejidos vegetales se dejó en refrigeración por un día, como resultado se obtuvo dos fasesy se preparó la muestra utilizando la fase de arriba siguiendo los pasos iii, iv, y se dejóen PTA dos minutos. Como cuarto protocolo se probó la maceración de muestras sinagua destilada y se obtuvo la suspensión que se utilizó como muestra, se dejó en PTApor 5 minutos. Se realizó también la técnica del “Dip Test” [5], a partir de una hojasospechosa de orquídea que estuvo necrótica o con mosaico se obtuvo pequeños pedazosde la muestra, se sumergió la muestra de hoja infectada en un gota de PTA al 2%, setomó la rejilla tratada previamente con polivinil formol, conocido como formvar, se topóen la gota de PTA y se secó con papel filtro. Las fotografías fueron adquiridas con el diptest ya que mostró mejores resultados en el microscopio electrónico de transmisión JoelJem 1010 a 80 kV.

54

2 Materiales y métodos

2.2.3. Protocolo para cortes ultra finos

2.2.3.1. Preparación de la muestra de tejido humano

Se tomó la muestra de tejido humano renal y se realizaron cortes de 1 mm cada uno, selos colocó en glutaraldehido al 3% en buffer fosfato por 1 hora y media a 4°C, se enjuagóel tejido con buffer fosfato tres veces por 10 minutos cada una y se colocó en TOO al 1%por una hora a temperatura ambiente, se enjuagaron nuevamente las muestras de tejidotres veces cada una por 10 minutos con agua destilada y posteriormente se prosiguió conla deshidratación con series crecientes de etanol desde el 70 al 100% cada uno por unahora, se colocó el etanol al 100% 2 veces más cada una por 30 minutos. Se colocaronlas muestras en una solución de partes iguales 1:1 de óxido de propileno:etanol al 100%por 20 minutos, luego se colocó las muestras en óxido de propileno puro por 20 minutosy finalmente se las puso en resina con óxido de propileno en proporción 1:2 por toda lanoche en el rotador. Luego se colocaron las muestras en la resina con óxido de propilenoen proporción 1:1 por 8 horas en el rotador y consecutivamente fueron colocadas en resinacon óxido de propileno en proporción 3:1 durante toda la noche en el rotador, después secolocaron las muestras en resina pura por 6 horas en el rotador, para finalizar se procediócon el embebimiento de las muestras y se las colocó en la estufa previamente caliente a80°C durante 10 horas.

2.2.3.2. Preparación de la resina

El kit cuenta con 4 soluciones: dioxido vinilciclohexano (ERL), Diglicidileter de poli-prolilenglicol (DER), Dimetilaminoetanol (NSA) y Anhidrido nonenilsuccinico (DMAE).La solución standard de resina pura llega a un volumen final de 42,4 ml con las siguien-tes proporciones de los componentes: ERL: 10 ml, DER: 6 ml, NSA: 26 ml y DMAE:0,4 ml. A partir de esta relación se realizó los cálculos necesarios para obtener el volumenrequerido según el número de muestras que vayan a ser procesadas.

A parte se preparó más resina para embeber cada muestra de 1 mm en un molde de0,75 ml.

2.2.3.3. Cortes semi finos y ultra finos

A la muestra embebida en la resina que se encuentra en la punta se la dejó prominenteutilizando una gillete y luego se realizaron cortes semi finos de 100 nm utilizando elultramicrótomo Sorvall MT2-B, se los tiñó con azul de toluidina y se observó el corteen el microscopio óptico para la identificación de las estructuras deseadas. Cuando sehubo encontrado la parte deseada del tejido se prosiguió a los cortes ultra finos de 50 nmen el equipo Leica ultracut UCT, los cuales se los realizó utilizando una cuchilla dediamante ubicada a 6° de inclinación. Los cortes realizados se los recogió en el “barco”que contenía agua para que allí floten, luego se acercó una asa incandescente al aguadonde se encontraban las muestras y sin toparlas se prosiguió a extenderlas. Con unarejilla de cobre previamente cubierto con oro en el Sputtering System Jeol JPC-1000 serecogió los cortes ultra finos del agua y se secó la rejilla de cobre con papel filtro. Se tomó

55

2 Materiales y métodos

un pedazo de papel filtro, se lo humedeció con agua destilada y se colocó en una cajaPetri, sobre este se puso un pedazo de parafilm del mismo tamaño, se hizo gotear una gotade acetato de uranilo y se colocó dentro de la gota a la rejilla con los cortes ultra finos, setapó la caja con papel aluminio y se dejó al ambiente por 45 minutos. Se tomó la rejillade cobre y se hizo 3 lavados en agua destilada sumergiéndola y sacándola del agua variasveces en cada lavado con la ayuda de una pinza, se secó con papel filtro. En otro papelfiltro húmedo de igual manera se colocó parafilm y otra gota de citrato de plomo, se tomóla rejilla de cobre lavada y se colocó dentro de la gota de citrato de plomo, se tapó la cajacon papel aluminio por 15 minutos, ésta vez en una esquina de la caja Petri se colocó unapequeña cantidad de lentejas de hidróxido de potasio para evitar la contaminación. Setomó la rejilla de cobre y se hizo 3 lavados en agua destilada sumergiéndola y sacándoladel agua varias veces en cada lavado con la ayuda de una pinza, se secó con papel filtrotoda la noche. Se observaron las muestras en el microscopio electrónico Joel JEM 1010.

2.2.4. Protocolo para la preparación de polen

Se trabajó con dos clases de polen: el de Hibiscus rosa-sinensis, cucarda, y Polylepispauta, y se aplicó 4 protocolos diferentes detallados en el cuadro 2.4. Los protocolos1 y 2 fueron descartados debido a los resultados obtenidos, el protocolo 3 consistió enobtener muestras de flores lo más frescas posibles. Se desojó a la flor y se obtuvieron lasanteras, se la fijó con glutaraldehido al 3% por 20 minutos. Para la deshidratación seutilizó concentraciones crecientes de etanol, desde 50% hasta el 99%, cada una durante10 minutos, se dejó las muestras secándose en el liofilizador Freeze Dryer iLShinBioBasedurante 18 horas. Para finalizar se montó las muestras en soportes de aluminio y semetalizó las muestras con oro en el Sputtering System Hummer 6.2 Ladd, las cualesfueron observadas en el microscopio electrónico de barrido Zeiss DSM 960A a 5 kV.El protocolo 4 fue una modificación del 3; después de la fijación con glutaraldehido al3% se realizó una post fijación con tetraóxido de osmio al 1% durante 20 minutos yse continuó la preparación. Al protocolo 4 se lo repitió 10 veces para demostrar quefue el protocolo que ofrecía mejores resultados. Las muestras fueron observadas en elmicroscopio electrónico de barrido Zeiss DSM 960A.

2.2.5. Protocolo para la preparación de garrapatas

Se probaron los protocolos 1, 2, 3 y 4 explicados en el cuadro 2.4, la única diferenciafue que el protocolo 1 se mantuvo a 70°C . El protocolo 4 se lo repitió 10 veces ya quefue con el que se obtuvieron mejores fotografías. A las garrapatas se las recolectó enel camal del cantón Rumiñahui y se las transportó en frascos para muestras de orina.Se realizó tres lavados con agua destilada para eliminar los desechos de la superficie delas garrapatas, se las fijó en glutaraldehido al 3% por 20 minutos y se realizó una postfijación con tetraóxido de osmio al 1% durante 20 minutos. Para la deshidratación seutilizó concentraciones crecientes de etanol, desde 50% hasta el 99%, cada una durante10 minutos, se dejó las muestras secándose en el liofilizador Freeze Dryer iLShinBioBasedurante 18 horas. Para finalizar se montó las muestras en los soportes de aluminio y se

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2 Materiales y métodos

Cuadro 2.4: Descripción de los protocolos usados para la preparación de muestras orgá-nicas a ser observadas bajo el MEB. TOO: tetraóxido de osmio al 1%.

Número Protocolo Metodología

1 Estufa Muestras en caja Petri estéril ycolocada en la estufa a 40°C por 24

horas.

2 Liofilizador Muestras en caja Petri estéril ycolocada en el liofilizador a -62°C ya 1.2 Pa por el tiempo necesario.

3 Sin TOO Muestra en glutaraldehido 3% por20 minutos para la fijación,sometida a concentracionescrecientes de etanol para la

deshidratación desde 50 a 99% deconcentración, liofilizada a -62°C ya 1.2 Pa por el tiempo necesario y

cubierta con oro.

4 Con TOO Muestra en glutaraldehido 3% por20 minutos para la fijación,

sumergida en TOO por 20 minutos,sometida a concentracionescrecientes de etanol para la

deshidratación desde 50 a 99% deconcentración, liofilizada a -62°C ya 1.2 Pa por el tiempo necesario y

cubierta con oro.

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2 Materiales y métodos

metalizaron con oro en el Sputtering System Hummer 6.2 Ladd y fueron observadas enel microscopio electrónico de barrido Zeiss DSM 960A a 5 kV.

2.2.6. Protocolo para la preparación de moscas de la fruta

Se aplicaron los protocolos 1, 2, 3 y 4 explicados en el cuadro 2.4, pero la temperaturautilizada en el protocolo 1 fue de 70°C. Además al protocolo 4 se hizo una modificaciónpara perfeccionar aún más la técnica; el tiempo de las muestras sumergidas en glutaral-dehido al 3% fue de 1 hora y se dejó en refrigeración a 4°C, igual tiempo fue utilizadopara el TOO 1% y se refrigeró la muestra a 4°C ; la deshidratación se realizó con lasconcentraciones crecientes de etanol a 4°C y los tiempos que estuvieron sumergidas fue de30 minutos cada una, se liofilizaron las muestras por 20 horas en el Freeze Dryer FreezeDryer iLShinBioBase y se montaron en soportes de aluminio para luego ser cubiertascon oro en el Sputtering System Hummer 6.2 Ladd . Debido a que el protocolo 3 mostrómenores daños a las muestras se lo repitió 10 veces para comprobar que el protocolo esrobusto. Las muestras se observaron en el microscopio electrónico de barrido Zeiss DSM960A a 5 kV.

2.2.7. Protocolo para la preparación de hongos ambientales y vegetales

Los hongos ambientales cultivados en cajas Petri fueron desprendidos del medio decultivo cuidadosamente con una hoja de afeitar, mientras que los hongos vegetales fue-ron cultivados por 6 días a partir de frutos de naranja envueltos en fundas plásticas yfueron rebanados de su corteza evitando cualquier daño a la muestra. Se siguieron losprotocolos detallados en el cuadro 2.4 y el protocolo 4 se lo repitió 10 veces por ser elque mejores resultados presentó. Los hongos ambientales y vegetales fueron sumergidosen glutaraldehido al 3% durante 20 minutos, luego se los sumergió en TOO al 1% por 20minutos más. Posteriormente a las muestras se las sometió a deshidrataciones utilizandoconcentraciones crecientes de etanol desde 50 al 99% cada una de 15 minutos. Se liofili-zaron las muestras por 20 horas en el Freeze Dryer iLShinBioBase y fueron montadas ensoportes de aluminio, las muestras se cubrieron con oro en el Sputtering System Hummer6.2 Ladd. Las muestras se observaron en el microscopio electrónico de barrido Zeiss DSM960A a 5 kV.

2.2.8. Protocolo para la preparación de microalgas

Se repitió 10 veces el protocolo 4, la muestra de microalgas Tuboc 1 fue colocada entubos de ensayo 13x100, se añadió glutaraldehido al 3% y se dejó en refrigeración a 4°Cpor una hora, se centrifugó a 4000 rpm por 10 minutos y se desechó el sobrenadante, seañadió TOO al 1% durante una hora y se dejó en refrigeración a 4°C, se centrifugó a4000 rpm por 10 minutos y se desechó el sobrenadante, se realizaron las series crecientesde etanol desde el 55% hasta el 99% para deshidratar las muestras, cada una de 30minutos y en cada cambio de concentración se centrifugó a 4000 rpm por 10 minutos y sedesechaba el sobrenadante. Se filtró la mezcla de microalgas con etanol al 99% utilizandopapel filtro y se dejó liofilizar en el Freeze Dryer iLShinBioBase por 20 horas. Se recortó

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2 Materiales y métodos

pedazos de 5mm x 5mm del papel filtro que contenía la muestra de las microalgas y sepegó en los stubs para ser cubiertas con oro en el Sputtering System Hummer 6.2 Ladd.Las muestras se observaron en el microscopio electrónico de barrido Zeiss DSM 960A a5kV. También se realizaron estudios aplicando los protocolos 1, 2 y 3 explicados en elcuadro 2.4, para los protocolos 1 y 2 simplemente las muestras se filtraron, una muestrase colocó en la estufa a 70°C y la otra se la liofilizó, y para el caso del protocolo 3 setrabajó siguiendo los pasos del protocolo 4 pero sin la adición de TOO al 1%.

2.2.9. Protocolo para la preparación de cromosomas humanos

Se hizo la solución stock ,en 100 ml de RPMI se añadió 20 ml de solución new born,1 ml de glutamina y 0,5 ml de antibiótico-antimicótico. En 6,5 ml de la solución stockse añadió 0,3 ml de sangre humana con 0,3 ml de fitohemaglutinina y se dejó incubarpor 72 horas a 37°C, después de que se cumplió ese tiempo se añadió a la mezcla 0,3 mlde colcemide y se incubó por 45 minutos, se centrifugó a 2000 rpm por 10 minutos, sedesechó el sobrenadante dejando solo 1 ml y se restauró la mezcla, se añadió 10 ml deKCl con fuerza dentro de los tubos y se incubó por 15 minutos a 37°C, se centrifugó a2000 rpm por 10 minutos, se desechó el sobrenadante dejando solo 1 ml y se restauró lamezcla, se añadió gota a gota el fijador (solución de ácido acético: metanol en relación1:3) hasta que la muestra se torne de un color negruzco y luego se añade 5 ml con fuerza,se incubó a 4°C por 30 minutos, se centrifugó por 10 minutos a 2000 rpm, se retiróel sobrenadante y se mezcló con fuerza, se vuelve a añadir el fijador y se centrifuga a2000 rpm por 10 minutos, se repite este paso hasta que la mezcla se haga transparente.Previamente se mantuvo a portaobjetos estériles en el congelador durante 2 horas. Lamezcla transparente se hace gotear desde una altura de 70 cm en los portaobjetos y sesopla sobre ellas, se deja secar las placas a temperatura ambiente o a 50°C. A partir deeste punto se aplicó distintos protocolos para la preparación de muestras a ser observadasen el MEB. Como primer protocolo se tomó un portaobjetos preparado sin tratamiento yse envolvió la base y los costados con papel aluminio se la cubrió con oro y se observó en elMEB Zeiss DSM 960A a 5 kV a una inclinación de 30°, otro portaobjetos sin tratamientoy sin recubrimiento con oro fue observada en el MEB a 5 kV. Para el tercer protocolose tomó un portaobjetos preparado y se sumergió en glutaraldehido al 3% durante 30minutos, luego se la sumergió en TOO al 1% durante 10 minutos y se lavó con bufferfosfato pH 7.4, se envolvió la base y los costados del portaobjetos con papel aluminio yse cubrió con oro, se observó a 30° de inclinación en el MEB. Para el cuarto protocolose tomó una placa preparada y se sumergió en glutaraldehido al 3% por 1 hora, luegose sumergió en TOO al 1% por 10 minutos, se realizaron series crecientes de etanolpara deshidratar a la muestra desde 50% hasta 90% cada una de 10 minutos, se liofilizóla muestra por 48 horas en el Freeze Dryer iLShinBioBase y se envolvió la base y loscostados del portaobjetos con papel aluminio, se cubrió con oro en el Sputtering SystemHummer 6.2 Ladd y se observó en el MEB a 5 kV a una inclinación de 30°. Los dosúltimos protocolos consistieron en lo siguiente, para uno de los dos protocolos se tomó unportaobjetos preparado teñido con giemsa y se hizo un lavado con buffer fosfato pH 7.4 de5 minutos, se sumergió al portaobjetos en glutaraldehido al 3% por una hora, se hicieron

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2 Materiales y métodos

3 lavados cada uno de 15 minutos con buffer fosfato pH 7.4, se sumergió el portaobjetosen TOO al 1% durante una hora y se hicieron 3 lavados cada uno de 15 minutos conla misma buffer fosfato pH 7.4, se realizó la deshidratación con las series crecientes deetanol cada una de 15 minutos desde el 50% hasta el 99% y se liofilizó en el FreezeDryer iLShinBioBase por 20 horas. Se cubrió la muestra con oro en el Sputtering SystemHummer 6.2 Ladd. y se observó la muestra en el MEB a 5 kV. Para el otro protocolo sehizo lo mismo con la diferencia que el portaobjetos preparado no estuvo teñido. A estosdos protocolos se los repitió 10 veces para comprobar que el protocolo escogido tiene unarobustez del 90%.

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3 Resultados

Los resultados obtenidos en el presente estudio de robustez se muestran en las fotogra-fías tomadas con el microscopio electrónico respectivo para cada una de ellas, en el casodel MEB, todas las imágenes fueron capturadas con el detector de electrones secundarios.En éste capítulo se podrá demostrar gracias a dichas fotografías, el por qué de la elecciónde un protocolo específico para la preparación de las muestras.

3.1. Nanopartículas de hierro cero valente y sulfuro de

hierro

En las fotografías obtenidas se pudo revelar la manera que las nanopartículas de hierrocero valente preparadas en agua de lluvia van aglomerando una a lado de la otra en formade espiral hasta llegar a un tamaño de 200 nm, lo cual no sucede en las nanopartículasde sulfuro de hierro, además los resultados muestran claramente que a medida que pasael tiempo las nanopartículas se van agrupando. En la figura 3.1 se observa la preparaciónde algunos protocolos aplicados y la manera en que se muestran las nanopartículas endistintos días.

Las nanopartículas de sulfuro de hierro muestran conglomerados desordenados a me-dida que van aumentando los días de su preparación, en la figura 3.2 se aprecia algunosprotocolos utilizados para su preparación. Además las imágenes muestran que la capaúnicamente de formvar puede ser utilizada para la preparación de las nanopartículas tan-to de hierro cero valente como las de sulfuro de hierro, en las figuras 3.3 y 3.4 se muestranla distribución del tamaño de las nanopartículas según el tiempo transcurrido después dehaberlas preparado en el CEINCI.

3.2. Bacterias

En la figura 3.5 se aprecian la forma y la generación de esporas y cristales de las bac-terias preparadas con distintos protocolos para ser observadas. Las imágenes de Bacillusthuringiensis dieron a conocer que el tamaño de las bacterias es relativamente grande,entre 3 y 8 µm de longitud y 1,5 µm de ancho, las esporas que generan debido al estréstérmico sometido tienen un tamaño que varía entre 1,3 y 1,7 µm de largo y entre 530 y820 nm de ancho y los cristales miden entre 800 nm y 1,8 en la diagonal mayor y entre 450y 940 nm en la diagonal menor. Además, al realizar los protocolos después de diferentesdías de haberlas sometido a refrigeración se pudo ver que desde las 4 hasta 23 horas aunno generan esporas, al primer día se empiezan a observar estructuras internas redondas

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3 Resultados

Figura 3.1: Fotografías de nanopartículas de hierro cero valente preparadas en agua delluvia. (a) Preparadas en ese momento con TOO al 1% sobre un rejilla cu-bierta con formvar y carbono, (b) Preparadas después de 1 día, colocadassobre una rejilla cubierta con formvar y carbono donde la muestra se dejósecar al ambiente, (c) Preparadas después de 2 días colocadas sobre una re-jilla cubierta con formvar donde la muestra fue secada con papel filtro (d)Preparadas después de 7 días colocadas sobre una rejilla cubierta con form-var donde la muestra fue secada con papel filtro; tomadas en el microscopioelectrónico de transmisión a 80 kV.

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3 Resultados

Figura 3.2: Fotografía de nanopartículas de sulfuro de hierro preparadas con agua desti-lada. (a) Preparadas en ese momento sobre una rejilla cubierta con formvary carbono donde la muestra se secó al ambiente, (b) Preparadas después de 1día colocadas sobre una rejilla cubierta con formvar y poly-L-lysine donde lamuestra se secó con papel filtro, (c) Preparadas después de 20 días colocadassobre una rejilla cubierta con formvar donde la muestra fue secada con papelfiltro, (d) Preparadas después de 20 días colocadas sobre una rejilla cubiertacon formvar y carbona donde la muestra fue secada con papel filtro; tomadasen el microscopio electrónico de transmisión a 80 kV.

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3 Resultados

Figura 3.3: Distribución del tamaño de las nanopartículas de hierro cero valente pre-paradas en agua de lluvia y agua destilada, a diferentes días después de lapreparación.

Figura 3.4: Distribución del tamaño de las nanopartículas de sulfuro de hierro preparadasen agua de lluvia y agua destilada, a diferentes días después de su preparación.

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3 Resultados

sin embargo todavía no generan cristales, desde las 70 horas las bacterias empiezan aexpulsar sus esporas y pasados los 5 días empiezan a generar y expulsar cristales.

3.3. Virus vegetales

Los virus identificados en la muestra de orquídeas tienen la forma tubular y corres-ponden a Potex virus, mientras que el virus tomado del césped manicero correspondea Poty virus, en la figura 3.6, se puede apreciar a dichos virus, lamentablemente en losanteriores protocolos utilizados no se obtuvo ninguna fotografía de virus, únicamente conel dip test se logró encontrar virus siempre y cuando la muestra esté concentrada.

3.4. Cortes ultra finos de tejidos humanos

Los resultados obtenidos de los tejidos humanos fueron excelentes, en la figura 3.7se puede apreciar claramente el capilar de un tejido renal, la técnica utilizada fue ladescrita anteriormente la cual es la que se realiza normalmente en el Instituto Nacionalde Higiene y Medicina Tropical Leopoldo Izquieta Perez, las fotografías fueron adquiridascon el microscopio electrónico de transmisión Joel JEM 1010 a 80 kV.

3.5. Polen

Con el MEB se pudo observar que el mejor tratamiento para la conservación de lamorfología de la mayoría de las muestras de referencia en este estudio fue el protocolo 4que consistía en someter a la muestra a fijación con glutaraldehido al 3%, seguido por unapost fijación con tetraóxido de osmio al 1%, deshidratadas con series crecientes de etanoldesde el 50% al 90% , secadas en liofilizador por lo menos durante 2 días y cubiertascon oro. En la 3.8, se observan fotografías de Hibiscus rosa-sinensis, cucarda, preparadacon los 4 protocolos donde se logra apreciar los daños causados por los tratamientos,mientras que en las figuras 3.9 y 3.10, se hace una comparación de los granos de polende un árbol joven con un árbol maduro de Polylepis pauta preparados con el protocolo4.

Se puede ver que tanto el protocolo 1 y 2 no ofrecen un buen resultado para la pre-paración de la muestra porque no es suficiente la deshidratación y causa deformación dela morfología debido a la eliminación de agua. La conservación de la morfología no solodepende del protocolo a seguir sino también del estado en que se encuentra el polen, esdecir si es joven o maduro.

3.6. Garrapatas

En la figura 3.11 se observan los resultados de los distintos protocolos utilizados pa-ra observar la morfología de las garrapatas. Las imágenes de las garrapatas presentanla resistencia que éstas poseen a los diferentes tratamientos que fueron sometidas, sin

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3 Resultados

Figura 3.5: Imágenes capturadas con el MET a 80 kV de Bacillus thuringiensis con tin-ción negativa y sometidas a estrés donde se puede identificar la generación deesporas y cristales. (a) Refrigerada 1 hora, preparada en una rejilla cubiertacon formvar y secada el exceso con papel filtro, (b) Con contraste, refrigera-da 23 horas preparada en una rejilla cubierta con formvar y secada el excesocon papel filtro, (c) Refrigerada 1 día, preparada en una rejilla cubierta conformvar y carbono y secadas con papel filtro, se observa la espora dentro de labacteria sin embargo aún no se forman cristales, (d) Refrigerada 1 día, prepa-rada en una rejilla cubierta con formvar y carbono y secadas con papel filtro,se observa la expulsión de esporas, (e) Refrigerada por 5 días, preparada enuna rejilla cubierta con formvar, se observa la espora y cristal dentro de labacteria, (f) Refrigerada por 5 días, preparada en una rejilla a con formvar,se observa las bacterias rodeadas de esporas y cristales, (g) Cristal de B. thu-ringiensis de 1,59 µm en la diagonal mayor y 724 nm en la diagonal menoren una rejilla cubierta de formvar y secado el exceso de muestra al ambiente,(h) Refrigerada mas de 7 días, preparada en una rejilla de formvar y carbonosecado con papel filtro, se observa gran cantidad de cristales y esporas expul-sados por las bacterias, (i) Bacteria 2 días en refrigeración, preparada en unarejilla de formvar y secada con papel filtro, se observa la división celular.

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3 Resultados

Figura 3.6: Imagen virus vegetales. (a) y (b) Imágenes de Potex virus de una muestraconcentrada de virus de orquídea, (c) Poty virus de césped manicero. Lasfotografías fueron capturadas en el microscopio electrónico de transmisión a80 kV.

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3 Resultados

Figura 3.7: Tejido humano renal de paciente con lupus eritematoso en donde se muestradepósitos de electrón densos subendoteliales capturado con el MET a 80 kV.

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3 Resultados

Figura 3.8: Imágenes de polen de cucarda capturadas con el MEB a 5 kV. (a) Polencolocado directamente en la estufa a 40°C por 24 horas, las líneas marcadashorizontalmente son interpretadas como falta de deshidratación, (b) Polencolocado directamente en el liofilizador a -62°C y vacío de 1,2 Pa por 24 horas,de igual manera las líneas horizontales muestran la falta de deshidratación dela muestra, (c) Polen preparado con el protocolo 3, (d) y (e) Polen preparadocon el protocolo 4, nótese la exina desprendiéndose debido a que la muestrafue tomada de una flor adulta, (f) Polen preparado con el protocolo 4, nótesela superficie granulosa del polen.

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3 Resultados

Figura 3.9: Polen de Polylepis pauta preparado con protocolo 4, observado en el MEB a5kV. (a), (b) y (c) Antera de flor adulta, se observan los pólenes ligeramentedeformados, gran parte de ellos han conservado su forma, (d) Granos de polenmaduro sostenidos en los estambres.

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3 Resultados

Figura 3.10: Polen de Polylepis pauta preparado con protocolo 4, observado en el MEBa 5kV. (a) Grano de polen maduro, capturada a 10kV, (b) y (c) Anteras deflor joven, se observan los pólenes con su morfología conservada, (d) Granode polen joven.

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3 Resultados

embargo el calor de la estufa y el secado en el liofilizador llegan a alterar la superficiede estos arácnidos. El protocolo que mostró mejores imágenes fue el 4 porque el hipós-tomo y pedipalpo permanecen intactos, siendo estas partes las más sensibles y ademáslas estudiadas por los entomólogos para determinar la clasificación. En la figura 3.12 seaprecia la morfología de la espina de la coxa preparada con el protocolo 1.

3.7. Mosca de la fruta

Para la mosca de la fruta el protocolo que menor daño causó fue el 3, en las figuras3.13 y 3.14, se puede ver claramente los daños causados por los protocolos aplicados,especialmente el 4 le ocasiona a la muestra demasiado daño; los protocolos 1 y 2 ladeforman debido a la temperatura tan brusca sometida.

3.8. Hongos ambientales y vegetales

Las fotografías obtenidas con los hongos revelaron que ellos son muy resistentes a losdiferentes tratamientos ya que los protocolos 1 y 2 no la dañaron, especialmente a loshongos crecidos en la corteza de los cítricos, el protocolo 3 fue el que mas deformacionescausó, mientras que el 4 fue el que mejor conservó la morfología. Las figura 3.15, 3.16 y3.17 permiten hacer una comparación de los 4 protocolos utilizados en la preparación delas muestras tanto de hongos ambientales como de los vegetales respectivamente.

3.9. Microalgas

Los resultados de las microalgas mostraron que no son resistentes para los protocolos1 y 2, el protocolo 3 no es tan conveniente ya que altera su superficie. Mientras queel protocolo 4 fue el que mejor trato dio a las muestras, puesto que conservó su formaa pesar de la deshidratación sometidas. En las figuras 3.18 y 3.19, se puede apreciarclaramente la influencia de los protocolos sobre las microalgas.

3.10. Cromosomas humanos

Las fotografías obtenidas de cromosomas teñidos en el MEB fueron capturadas con 30°de inclinación, mientras que las imágenes de los cromosomas no teñidos fueron capturadassin inclinación. En las figuras3.20 y 3.21, se puede apreciar que cuando se tiene inclinaciónse pueden distinguir de mejor manera la forma de los cromosomas, también se observaque es necesaria la limpieza de la muestra para una mejor nitidez de las imágenes.

3.11. Estadística

La elección del mejor protocolo que se adapta en las condiciones del laboratorio demicroscopía electrónica de la ESPE se la realizó repitiendo 10 veces cada protocolo y

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3 Resultados

Figura 3.11: Imágenes de las garrapatas adquiridas en el MEB a 5 kV. (a) Vista dela parte anterior, tratada con el protocolo 1 sin hipóstomo ni pedipalpo,deformada por el protocolo utilizado además de la falta de deshidratación,(b) Vista de la parte dorsal tratada con el protocolo 2 a -62°C y a unvacío de 1,2 Pa durante 24 horas, se observa la falta de deshidratación yla deformación de la garrapata, (c) Vista de la parte dorsal tratada con elprotocolo 3, se conserva la forma de la garrapata y sus estructuras delicadascomo el hipóstomo, (d), (e) y (f) garrapatas tratadas con el protocolo 4,conserva perfectamente su estructura y forma.

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3 Resultados

Figura 3.12: Imágenes de las espinas de la coxa de una garrapata capturadas con el MEBa 5 kV sometidas a secado en la estufa a 70°C durante un día.

comprobando que la hipótesis planteada, de que existe por lo menos un protocolo depreparación para cada muestra orgánica e inorgánica con un 90% de robustez. Como sepuede apreciar en la figura 3.23 , únicamente el protocolo para las moscas de la fruta,Drosophila melanogaster debe ser estudiado y probado con otra técnica menos invasiva,mientras que en las figuras 3.22 y 3.24 donde se muestran los resultados de los demásprotocolos estudiados, se puede determinar que se cumplió con la hipótesis planteada.

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3 Resultados

Figura 3.13: Drosophila melanogaster tratada con los 4 protocolos cuyas imágenes fueronadquiridas con el MEB a 5kV. (a) Mosca colocada directamente en la estufaa 70°C, se notan los daños en los ocelos y la falta de deshidratación de lamuestra porque se observan líneas horizontales en la fotografía, (b) Moscacolocada directamente en el liofilizador a -62°C y a un vacío de 1,2 Padurante 24 horas, se observa claramente la deformación en los ocelos y elexceso de agua en la muestra, (c) Mosca tratada con el protocolo 4, se notaclaramente que D. melanogaster no resiste al TOO porque su morfologíaesta totalmente afectada.

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3 Resultados

Figura 3.14: Drosophila melanogaster tratada con los 4 protocolos cuyas imágenes fueronadquiridas con el MEB a 5kV. (a), (b) y (c) Muestras sometidas al protocolo3, con la variación de haber aumentado a una hora el tiempo de exposiciónen glutaraldehido 3%.

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3 Resultados

Figura 3.15: Fotografías de hongos ambientales adquiridas con el MEB a 5 kV. (a) Hongosometido a 40°C durante 2 días, se aprecian algunos esporangios deformados,(b) Micelios sometidos a estufa a 40°C por 2 días, (c) Vista lejana del miceliode una muestra de hongo sometida al protocolo 2 en condiciones de -62°C y aun vacío de 1,2 Pa durante 24 horas, (d) Acercamiento del micelio, se observaque el protocolo no ayudó a mantener la estructura de los esporangios.

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3 Resultados

Figura 3.16: Fotografías de hongos ambientales adquiridas con el MEB a 5 kV. (a) Su-perficie de la muestra de hongo sometida al protocolo 3 se observa una leveconservación de los esporangios, (b) Micelio bajo el tratamiento del proto-colo 3, (c) Esporangio sometido al protocolo 4, totalmente conservado suestructura, (d) Grupo de esporangios que fueron tratados con el protocolo4.

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3 Resultados

Figura 3.17: Hongos de cítricos crecidos en la corteza, las imágenes fueron tomadas enel MEB a 5 kV. (a) Hongo expuesto a 40°C en estufa por 24 horas, seaprecia la ausencia de mayores daños en la muestra, (b) Hongo secado enliofilizador a -62°C y a un vacío de 1,2 Pa durante 24 horas, de igual manerano se observan daños severos en las muestras, (c) y (d) Hongos sometidos alprotocolo 3, se observa claramente que la muestra no resiste al tratamiento,(e) y (f) Hongos tratados con el protocolo 4, los esporangios se encuentranbien conservados.

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3 Resultados

Figura 3.18: Imágenes de microalgas Tuboc 1obtenidas con el MEB a 5 kV. (a) y (b)Microalgas expuestas a 40°C en la estufa durante 24 horas, la mayoría de lamuestra se encuentra dañada por el calor, (c) y (d) Muestra de microalgassometidas al liofilizador, se observa que el protocolo causa deformación enlas muestras.

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3 Resultados

Figura 3.19: Imágenes de microalgas Tuboc 1 obtenidas con el MEB a 5 kV. (a) y (b)Microalgas tratadas con el protocolo 3, se puede apreciar que el protoco-lo forma una estructuras de forma filamentosas sobre la superficie de lasmicroalgas, (c) y (d) Microalgas sometidas al protocolo 4, el espécimen seconservan perfectamente.

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3 Resultados

Figura 3.20: Muestras de cromosomas humanos preparados con diferentes protocolos cap-turadas en el MEB a 5 kV. (a) Protocolo 4, a más de los cromosomas seobserva gran cantidad de impurezas que obstaculizan la visualización de lamorfología de los cromosomas, (b) y (c) Protocolo 3 y protocolo 1, se apre-cian los cromosomas pero falta definición de su forma, (d), (e) y (f) Protocolo5 aplicado a muestras teñidas, se observa la morfología de los cromosomas,sus cromátides y su centrómero a 30° de inclinación.En (e) se puede iden-tificar un cuadrado alrededor se los cromosomas debido a la contaminaciónque se genera.

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3 Resultados

Figura 3.21: Imágenes de Muestras de cromosomas humanos capturadas con el MEB a5 kV. (a), (b) y (c) Protocolos 5, que muestra a cariotipos sin tinción, lasimágenes no tienen inclinación.

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3 Resultados

Figura 3.22: Resultados de los protocolos elegidos para el uso en el laboratorio de micros-copía electrónica para las muestras de nanopartículas de hierro cero valentey sulfuro de hierro, bacterias y virus vegetales. A cada uno se le hizo 10repeticiones con el objetivo de estudiar su robustez.

Figura 3.23: Resultados de los protocolos elegidos para el uso en el laboratorio de micros-copía electrónica para las muestras de cortes ultrafinos de tejido humano,granos de polen, garrapatas mosca de la fruta. A cada uno se le hizo 10repeticiones con el objetivo de estudiar su robustez.

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3 Resultados

Figura 3.24: Resultados de los protocolos elegidos para el uso en el laboratorio de mi-croscopía electrónica para las muestras de hongos ambientales y vegetales,microalgas y cromosomas humanos. A cada uno se le hizo 10 repeticionescon el objetivo de estudiar su robustez.

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4 Discusión

Al querer aplicar un protocolo en un nuevo laboratorio es necesario el estudio de surobustez, de ahí la necesidad de realizar varios protocolos para una misma muestra y laelección del que mejor se acople a las condiciones de dicho laboratorio. En el presenteestudio fueron varios los factores que influenciaron en la calidad de una imagen, fuenecesario el correcto manejo de los lentes para así manipular el haz que incidirá sobrela muestra creando las interacciones respectivas para la obtención de la imagen. Nosdimos cuenta que es fácil perjudicar un protocolo de preparación de muestras, medianteel manejo erróneo de los lentes utilizados, especialmente en los objetivos porque de ellosdepende la resolución que deseamos obtener y si su ajuste no es el exacto, aunque elprotocolo para preparar muestras haya sido el justo, la imagen resultante no será de buenacalidad. Otros factores fueron el sistema de detección del equipo donde la resolución quebrinda depende del numero de pixeles con que forma la imagen, los sistemas de vacío paraconseguir una manipulación del haz de electrones idónea, ajustes de parámetros comobrillo, contraste, magnificación y profundidad de campo y la técnica del investigador parala realización de los protocolos elegidos; todos éstos representaron obstáculos de granpeso para el estudio de la robustez de un protocolo, sin embargo bajo un control estrictode estos parámetros se logró determinar un protocolo específico para cada muestra dereferencia. Los microscopios electrónicos proveen la tecnología para la examinación desuperficies biológicas y para el análisis de ultraestructuras respectivamente, el MEB yel MET brindan una resolución de 3 nm y 0,1 nm respectivamente, por lo tanto sonherramientas poderosas para la identificación estructural de muestras. En el presenteestudio se han utilizado dichos equipos en conjunto con protocolos sugeridos en variosartículos científicos para el estudio de muestras de referencia tratadas en el laboratoriode microscopía electrónica de la ESPE. En el MET, las rejillas de cobre necesitan de unsoporte de plástico hidrofílico para permitir la fijación de la muestra y varios soportespueden ser utilizados con éxito según la elección del investigador; siguiendo la metodologíarecomendada por [44] se prepararon las rejillas de cobre, sin embargo mejor resultadosse obtienen cuando las rejillas de cobre son directamente colocadas en el evaporizador decarbono y reciben el depósito de carbono en su superficie. En el caso de las nanopartículas,dos soportes brindaron una buena fijación para las muestras, el de formvar y el de formvarcon carbono. Este último recubrimiento brinda una mayor estabilidad en la superficie yuna mayor uniformidad hidrofílica [1]. La solución de formvar en varias ocasiones sufriórompimientos y visto bajo el estereomicroscopio no mostraba uniformidad, este hechopudo haber sucedido debido a que el tiempo que se ha mantenido almacenado el formvarha sido más de un año, sin embargo su utilidad sigue manteniéndose, y según [1] eltiempo en que debe ser utilizada la solución de formvar debe ser de siete días después dela preparación, pasado este lapso la solución debe ser descartada debido a que empieza

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4 Discusión

a degradarse, sin embargo menciona que si la solución de formvar preparada tiene unaconcentración de 2% es posible almacenarla por una mayor cantidad de tiempo siempre ycuando permanezca en un desecador [1]. Las imágenes obtenidas con la preparación de larejilla de cobre utilizando un recubrimiento de carbono a más del formvar sugieren que elsoporte es mas firme y por ende brinda mayor seguridad para la fijación de la muestra. Seha examinado dicho tratamiento para la observación de una suspensión de nanopartículasde hierro cero valente y de sulfuro de hierro; las nanopartículas de hierro cero valentepreparadas en agua de lluvia presentan una aglomeración ordenada en forma de espirallo que no se muestra en las misma partículas preparadas con agua destilada. Según [57]el tamaño de las nanopartículas de hierro cero valente es menor a 33.2 nm, mientrasque nuestros resultados acerca del tamaño al presentarse más específicamente a medidade que pasa el tiempo; muestran que el tamaño que cita [57] concuerda con el tamañodespués de haber transcurrido un día de preparación de la suspensión de nanopartículas,cuando éstas muestras son frescas tienen un tamaño de 3 a 10 nm. Además, para lavisualización de las nanopartículas, no se usó ninguna tinción metálica, ya que al igualque [38], creemos que éstas tinciones usadas en muestras inorgánicas oscurecen la muestray pueden llevar a una oxidación de las mismas.

Sin embargo las tinciones metálicas generan un buen contraste en las imágenes demuestras biológicas, en el presente estudio se usó la tinción negativa, el ácido fosfotúngs-tico al 2% por ejemplo es el químico neutral comúnmente usado para un amplio rangode muestras [11] a más de que tolera altas concentraciones de sales no volátiles [41], latinción negativa es un método simple y rápido para estudiar la morfología y la estructurade muestras particulares como bacterias, virus, componentes celulares y macromoléculasaisladas; no interactúa con la muestra sino que forma una matriz alrededor de la super-ficie externa y penetra dentro la muestra [41] es así que para las imágenes de bacteriascapturadas en el MET se aplicó dicha tinción siguiendo el procedimiento detallado en[11], con la única diferencia que al formvar no se lo preparó con cloroformo como sugierela bibliografía, sin embargo los resultados fueron lo suficientemente buenos como paradeclarar que dicho protocolo es robusto y puede ser utilizado en el laboratorio de micros-copía electrónica de la ESPE, incluso se recomienda que el soporte de la rejilla de cobresea de carbono debido a que es fuerte y muy estable bajo el haz de electrones [11] peroen el presente estudio se comprobó que con una fina capa de formvar se logran imágenesde bacterias y virus de buena calidad. Las imágenes obtenidas con PTA revelaron lapresencia de esporas y cristales dentro de las bacterias, demostrando que fue útil parala identificación de muestras biológicas, de todos modos [62] utiliza doble tinción conacetato de uranilo y plomo o una tinción con permanganato de potasio para obtener unmejor contraste de los detalles estructurales y menciona que el PTA brinda imágenes debaja calidad en comparación con los otros dos mencionados, sin embargo las bacteriasobservadas en éste estudio presentan claramente su forma, incluso mejor o igual a las ob-tenidas con acetato de uranilo en la investigación de [22]. Hay que tomar en cuenta queson muchos los factores que influyen para que la tinción sea absorbida como la naturalezadel químico, el vehículo utilizado para su dilución, concentración, temperatura y pH dela solución de tinción. Los virus vegetales también pudieron ser observados gracias al usodel PTA, si bien se utilizó la técnica del dip test recomendada por [5], ésta se basa en

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4 Discusión

la aplicación de la tinción negativa, además un factor importante es que para la identifi-cación de los virus en el MET se debe tener la certeza de que en la planta existan virusdebido a que está enferma y además influye en gran medida la concentración de virusque posee la muestra elegida, ya que con esta técnica o con la maceración de la muestra,no solo se toman virus sino que también se toman fragmentos celulares, suciedades de lamuestra vegetal y residuos que pueden dificultar la identificación de los virus. Debido alfuncionamiento del MET, las muestras deben ser lo suficientemente delgadas, ≤ 500nm,como para que los electrones pasen a través de la muestra, consecuentemente el tejido ase analizado debe ser fijado, embebido en una resina y cortado en secciones ultra finasutilizando el ultramicrótomo [38]. Esta técnica también es utilizada ampliamente cuandose desea observar tejidos humanos [47] , como en el presente estudio, donde el objetivoprincipal es mantener la forma de la muestra, eliminar casi por completo el agua quecontienen, y finalmente hacerlas conductoras mediante el recubrimiento con oro; todoeste proceso permite el análisis y descubrimiento de formas de estructuras importantesdentro de las células.

Para la observación de muestras en el MEB se realizaron los mismos protocolos paratodas a excepción de los cromosomas humanos, los cuales necesitaban de un tratamientoespecial. Los aldehídos han sido usados exitosamente en microscopía electrónica paraenlazar una variedad de material biológico, y según [59] el glutaraldehido reacciona pre-dominantemente en las cadenas de lisina, estabilizando dichos enlaces. Las dos especies depólenes usadas en el presente estudio reaccionan muy bien frente al protocolo utilizado,aunque en varias investigaciones como en [13], [14] y [15] sugieren que el polen debe seracetolizado y luego ser fijado y deshidratado; pero se ha demostrado que es suficiente conglutaraldehido y TOO para la fijación y para la eliminación de la carga respectivamente,seguido de la deshidratación con etanol y el secado en el liofilizador, para observar inclusola exina que se desprende el polen, figura 3.8, después de sufrir todo el tratamiento. ElTOO también estabiliza los enlaces de proteínas conservando la forma estructural de lasmuestras [35]; de modo que aunque en el microscopio óptico sea posible la visualizaciónde la escultura del polen de Hibiscus rosa-sinensis, solo con el MEB es posible distin-guir sus espinas y la rugosidad del polen de Polylepis. De igual manera las imágenes delas garrapatas muestran excelentes resultados cuando se aplica el glutaraldehido seguidodel TOO, debido a que la mayoría de las garrapatas que infestan a los animales comoganado son de la familia Ixodidae, también llamadas garrapatas duras porque poseen unescudo protector, mientras que las garrapatas de la familia Argasidae no tienen escudo,sin embargo su resistencia es marcada [36]. Lo que no sucedió con Drosophila melano-gaster, la cual sufrió graves daños en su morfología debido al tratamiento con TOO yaque éste químico tiene un alto poder oxidante, además [42] afirma que la fijación usandotetraóxido de osmio a altas temperaturas causa deformaciones no solamente del ptilinumsino también del cuerpo entero de la mosca, y cuando usa el glutaraldehido y TOO seencogen sus partes, aún así el protocolo utilizado en el presente estudio se lo realizó a 4°Cy se hubiese esperado que la mosca no sufra ningún daño. Un aspecto importante que sedebe mencionar es que aunque las garrapatas resistieron perfectamente al tratamiento ysus imágenes son de buena calidad, también se observa en ellas la falta de limpieza desus estructuras, para ello [2] detalla un protocolo en cual da como resultado imágenes

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4 Discusión

de garrapatas sin suciedades a más de que la conservación del hipóstomo es excelente.Los hongos vegetales y ambientales mantuvieron su estructura después de ser tratadoscon el protocolo 4 sugeridos por [19] y por [16], de igual manera [40] obtuvo los mismosresultados que esta investigación, donde afirma que el tratamiento de glutaraldehido se-guido por TOO preserva las características de los hongos y muestra en sus fotografíasa esporangios y micelios totalmente conservados; de igual manera las microalgas fueronmuestras que mantuvieron su estructura gracias la fijación con glutaraldehido y postfijación con TOO. El manejo de las muestras de cromosomas fue más delicado, debidoa que eran muestras pequeñas y el soporte donde se encontraban era de vidrio y si secolocaba únicamente el portaobjetos en la cámara del MEB la visualización de la muestrase volvía muy complicada puesto que el vidrio no es conductor y los electrones se queda-ban en él; de todos modos para superar este problema se cubrieron los portaobjetos conpapel aluminio el cual es un metal conductor y por ende transmite los electrones. Losmejores resultados obtenidos fueron cuando se realizaron los lavados con buffer fosfatopara eliminar suciedades en la muestra, el protocolo usado en el presente estudio es muyparecido al sugerido por [33], con la diferencia que nosotros hicimos todos los lavadoscon buffer fosfato pH 7.4 y el tiempo de exposición al TOO fue de una hora y no de10 minutos como ellos aconsejan. Al comprar nuestras imágenes con las de [33] vemosque aún nos hace falta mayor limpieza en las muestras y capturar la imagen con mayorinclinación, esto último si se quisiera una mejor visualización del relieve y morfología delos cromosomas, también se debe aclarar que su estudio fue realizado con alta resolución,mientras que el presente estudio muestra imágenes capturadas a 5 kV debido a que cuan-do se aumentó el voltaje de aceleración se producía contaminación en las mismas así quese prefirió adquirirlas a bajo voltaje. Al igual que [34] notamos en las fotografías que latinción Giemsa de las muestras ligeramente perdían su nitidez al colocar el glutaraldehidorequerido para la fijación. Existe también una diferencia significativa entre las imágenesde nuestros cromosomas y los reportados por [9], en donde realizan la deshidratación conacetona y el secado con hexametildisilazano, sus imágenes de los cromosomas en metafaseno muestran un delineamiento de sus formas.

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5 Conclusiones

Tanto para el MET como para el MEB las muestras biológicas reciben un trato di-ferente que las muestras inorgánicas ya que requieren un tratamiento especial debido asu constitución, principalmente en el caso de los protocolos llevados a cabo en el MEB,donde es necesario la deshidratación de las muestras sin causar deformaciones en lasmismas. Gracias al poder de resolución del MET se pudo determinar el grado de agrega-ción de las nanopartículas y su tamaño en el transcurso del tiempo, este hallazgo puedeservir para la realización de estudios de la trayectoria en espiral de las nanopartículas,con la colaboración de matemáticos de la Universidad Central del Ecuador, ya que éstadistribución no ha sido publicada antes. Además se pudo comprobar que la preparacióndel recubrimiento para la rejilla de cobre con formvar y carbono recomendado por labibliografía, es igualmente útil que una rejilla de cobre cubierta únicamente con formvarcoincidiendo así con otras investigaciones, sin embargo el recubrimiento de formvar ycarbono estabiliza la carga que se genera al momento de la emisión del haz de electronessobre la muestra y resiste en gran medida al calentamiento de la muestra. La tinciónnegativa es una técnica sencilla, fácil de realizar y los resultados que ofrece permiten laidentificación de microorganismos para el entendimiento de su morfología y distribución.Con respecto a los protocolos realizados para la preparación de muestras en el MEBpodemos decir que ninguna de ellas resiste a la estufa y al liofilizador sin antes habersido tratadas con algún fijador, debido a que sus estructuras son delicadas y a elevadastemperaturas se produce la pérdida brusca de agua y se deforman, de igual manera elliofilizador a alto vacío provoca que la muestra pierda su forma natural. Los cortes ultrafinos demandan precisión, exactitud, prudencia debido a que las muestras son del rangonanométrico y por ende se requiere de cuidado en su manipulación. Los resultados obte-nidos en el presente estudio de la robustez muestran que son totalmente válidos para serejecutados en el laboratorio de microscopía electrónica

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6 Recomendaciones

Durante el desarrollo de este estudio ciertas medidas y otras acciones no se pudieronlograr, ya sea porque nos hubiésemos desviado de los objetivos de la tesis o por falta desuministros químicos o equipos necesarios. De todas maneras a continuación se recomien-da algunas medidas. Con respecto a las nanopartículas de hierro cero valente y sulfuro dehierro, las cuales poseen una alta rapidez para aglomerarse, se podría utilizar ácido poli-vinil alcohol-co-vinil acetato- co- itaconico, usado en los estudios de [57] para promover elaislamiento de las mismas además se podría probar la tinción con bismuto alcalino paradecorar las nanopartículas de hierro, recomendado en [38]. Con respecto a las bacterias yvirus; para un mejor delineamiento de su morfología se podría usar una buffer fosfato pH7.4 como una pre-tinción antes de usar el PTA, también se recomienda usar poly-L-lysinepara fijarlas en el soporte. Para la observación en el MEB de las muestras orgánicas sepodrían tomar en cuenta varios aspectos que posiblemente lleven a otros resultados talvez mejores que los que se presentan aquí. Por ejemplo, para la fijación de muestras sepuede probar con formaldehido y realizar comparaciones con la fijación que se hizo eneste estudio con glutaraldehido, también se podría repetir las metodologías utilizadas auna temperatura de 4°C y en otro ensayo para la preparación de polen, insectos, hongosy microalgas únicamente con recubrimiento de oro, sin la ejecución de ningún protocoloy comparar con los resultados obtenidos aquí para concluir la necesidad o la influencia dela fijación en las muestras. En esta fase de deshidratación se podría utilizar ter butanolen lugar de etanol y así comparar los resultados, puesto que sería interesante analizarla utilidad de que el punto de fusión del tert butanol sea de 25 a 26°C, mientras que eldel etanol sea de -114°C. Se recomienda también que los tiempos de fijación, post fija-ción y deshidratación sean extendidos debido a que ningún artículo científico especificaun tiempo para cada fase. Para la observación de cromosomas humanos se recomiendautilizar un mayor voltaje de aceleración y por consiguiente una mayor resolución, y si sequisiera estudiar la ultraestructura interna de los cromosomas humanos se podría aplicarcortes ultra finos con la guía de [26].

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