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INFORME FINAL “ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y SU APLICACIÓN EN LA INNOVACIÓN DE PRODUCTOS BIOLÓGICOS” ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA DRA. ROSA MARÍA RIBAS JAIMES (R.M. RIBAS-APARICIO) Registro asignado por la SIP: 20070693
RESUMEN
Nuestro grupo de trabajo se ha enfocado en estudiar a nivel molecular algunas enfermedades infecciosas
importantes en nuestro país, por su impacto en la salud humana y en el ámbito pecuario. Los
conocimientos adquiridos los hemos aplicado en estrategias de diseño e innovación de productos
biológicos de aplicación profiláctica, terapéutica y diagnóstica. En particular, se están desarrollando dos
vacunas de nueva generación contra rabia bovina y miositis en colaboración de la Productora Nacional
de Biológicos Veterinarios de la SAGARPA. Así mismo, hemos realizados estudios sobre la patogenia
molecular de enfermedades bacterianas y virales, lo cual nos ha permitido incidir en las necesidades de
nuestro país en el sector salud y tecnológico, con estrecha colaboración también de tres laboratorios del
Departamento de Virología del InDRE de la SSa y otros del Hospital de Pediatría del CMN Siglo XXI del IMSS;
así como de la propia ENCB a través de los laboratorios de Bacteriología Médica y más recientemente de
Inmunología Molecular. Los modelos que se investigan en nuestro grupo de trabajo son virales (rabia,
hepatitis B, calicivirus y rubéola) y bacterianos (Clostridium spp, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter
spp, Helicobacter pylori, Aeromonas y Mycobacterium leprae). En todos estos modelos se ha abordado
investigación reflejada en la formación de varios alumnos de licenciatura y posgrado en nuestro instituto. En
este periodo en particular se informan tres tesis de maestría concluidas y presentadas, una tesis de
licenciatura, un artículo científico publicado, entre otros. Se enfatiza en los logros más importantes y en el
impacto que nuestros resultados se han visto reflejados como beneficio social en su aplicación en el
diagnóstico temprano y de desarrollo de productos biológicos de nueva generación, así como en el
ámbito científico y educativo a través de la formación de recursos humanos altamente calificados.
INTRODUCCIÓN
Las enfermedades infecciosas siguen siendo la principal causa de muerte en humanos y animales. Nuestro
organismo está sometido a agresiones por parte de parásitos, hongos, bacterias y virus; cuando esto
sucede el sistema inmune clasifica a los agresores y arma una respuesta efectora capaz de eliminarlos. En el
caso de parásitos, los macrófagos, neutrófilos, eosinófilos y las plaquetas pueden matar protozoarios y
helmintos, y contra los parásitos extracelulares la respuesta puede ser mediada por los anticuerpos, el
complemento, la fagocitosis y la citotoxicidad; la respuesta inmune hacia los hongos parece ser similar a la
que se presenta frente a las bacterias; en el caso de las bacterias extracelulares y de sus productos la
respuesta eficaz consiste en la producción de anticuerpos opsonizantes y neutralizantes y en la fagocitosis;
si se trata de bacterias intracelulares que se replican en el interior de fagosomas la respuesta más
contundente la llevan a cabo las células T, quienes activan a los fagocitos (monocitos, neutrófilos
polimorfonucleares y macrófagos) en un proceso inflamatorio de hipersensibilidad tardía, así como los
linfocitos T citotóxicos; y por último, ante una infección viral, la difusión hacia otras células es limitada en las
primeras fases de la infección por parte de las células NK (asesinas naturales) y del interferón, y más
adelante por los anticuerpos y el complemento, pero sólo la respuesta citotóxica acabará con las células
infectadas y erradicará la infección. Además de eliminar al patógeno, el organismo mantiene una memoria
hacia éste para reconocerlo ante un nuevo contacto por medio de las células B y T de memoria, quienes
pueden sobrevivir durante largos períodos, incluso la vida entera de un individuo y producir citocinas que
activan a las células B productoras de anticuerpos y a las células T citotóxicas precursoras.
Los factores de virulencia y mecanismos de resistencia a antimicrobianos y antivirales, sin duda les dan una
ventaja a estos agentes patógenos y favorecen su supervivencia evolutiva. Más preocupante aún, es que
mucha de la información genética que codifica para estos factores y genes de resistencia, puede
transferirse entre cepas del mismo género o incluso entre diferentes especies bacterianas. En el caso de los
virus, la emergencia de mutaciones relacionadas con resistencia a la terapia antiviral tiene un impacto
negativo en el control de enfermedades como la hepatitis B y el SIDA, entre otras.
La vacunación es la aplicación mejor conocida y más exitosa de los principios inmunológicos a la salud
humana y veterinaria, siendo las vacunas una de las herramientas más poderosas y rentables de la
medicina preventiva. Aunado a esto, el diagnóstico temprano de este tipo de enfermedades puede
impactar en un mejor y más efectivo tratamiento, mayor calidad de vida y control o contención de la
diseminación del patógeno.
Para desarrollar de una forma racional y con metas definidas una estrategia profiláctica, terapéutica o de
tratamiento es necesario conocer lo mejor posible al agente patógeno agresor y la enfermedad que
produce. Actualmente la revolución del conocimiento científico nos permite investigar a nivel molecular la
información que codifica o regula la expresión de características de virulencia o resistencia, que pueden
ser blancos de un diagnóstico temprano y preciso, así como de un producto biológico de nueva
generación como las vacunas que se desarrollan en nuestro equipo de trabajo.
Por medio de la vacunación quedamos expuestos a un “material biológico” que imita al agente infeccioso,
el sistema inmune desencadena resistencia ante el patógeno y la memoriza sin haber experimentado la
infección ni la enfermedad. En la vacunación tradicional se inocula en el organismo un microorganismo
muerto, en el caso de virus un virus inactivado (vacunas inactivadas), un microorganismo vivo pero
incapacitado para desencadenar la enfermedad (vacunas vivas atenuadas) o una porción purificada del
patógeno (vacunas subunitarias). Actualmente, el desarrollo de las vacunas terapéuticas, las cuales
involucran la introducción de un gen funcional para reemplazar la actividad de un gen defectuoso
residente en el organismo, o la introducción de la información para modular al sistema inmune en
enfermedades autoinmunes, alergias, o cáncer, hace que este producto biológico sea, además de un
medio para prevenir enfermedades infecciosas, una estrategia para cambiar el curso de una enfermedad
o para curarla.
En la búsqueda de nuevos productos biológicos que no presenten los problemas asociados a las vacunas
actuales y constituyan otra opción, se ha incursionado en el desarrollo de vacunas de DNA. Ito publicó en
1960 un artículo donde demostró la inducción de papilomas en la piel de conejo mediante la inyección de
ácidos nucleicos extraídos con fenol a partir del virus de papiloma de conejo raza Shope y aunque nadie
prestó suficiente atención al hecho, éste representa la primera evidencia documental de la transducción in
vivo a través de la inyección de DNA purificado. Posteriormente, Ishimoto e Ito (1969) demostraron la
presencia de antígenos de papilomavirus en los conejos inoculados. Sin embargo, la idea de emplear
como vacuna a los ácidos nucleicos desnudos surgió hasta las observaciones de Wolff y Tang (1990), que
descubrieron que al inyectar pDNA desnudo portador del gen de la β-galactosidasa, ésta se expresaba en
el músculo esquelético de ratón. Acsadi y colaboradores (1991) también demostraron que la expresión de
un gen reportero tras la transferencia de pDNA en corazón de rata, desencadenaba una respuesta inmune
contra la proteína codificada por el gen extraño, por ejemplo, luciferasa, β-galactosidasa y cloranfenicol
acetil transferasa. Más adelante, en 1992, Tang y colaboradores demostraron que la inyección
intramuscular del plásmido no sólo permitía la expresión del gen correspondiente, los genes de la hormona
de crecimiento humana y de la anti-tripsina a1 humana en este caso, sino que además se desencadenaba
una respuesta inmune.
Las vacunas genéticas consisten en DNA en forma de plásmidos de expresión o RNA como mRNA o RNA
antisentido codificando el antígeno de interés, el cual es tomado por las células y traducido en proteína;
posteriormente esta proteína (antígeno) puede ser procesada y presentada por las células presentadoras
de antígeno (CPAs) como si se tratara de una infección viral, desencadenando respuestas inmunes de tipo
humoral y celular. En cierto sentido, estas son vacunas subunitarias excepto que el antígeno es producido
en las células del individuo inmunizado.
La expresión duradera de un gen, debida al mantenimiento de los plásmidos en las células transfectadas,
resulta en la presentación sostenida del antígeno en bajos niveles. Pero la presentación crónica del
antígeno plantea la posibilidad de la inducción de anergia, tolerancia o autoinmunidad por lo que es
importante descartar estos eventos. En este aspecto Xiang y colaboradores (1995) hicieron un seguimiento
a largo plazo de los efectos por la inmunización con pDNA portador del gen de la glicoproteína del virus
rábico y demostraron que la vacuna inducía inmunidad protectora duradera sin aparentes efectos
colaterales, tales como el desarrollo de tolerancia de células T o la generación de autoinmunidad
(probado por la ausencia de anticuerpos anti-DNA de cadena sencilla o de cadena doble, o anti
antígenos nucleares).
Desde el punto de vista de la respuesta inmune a las vacunas, las de DNA podrían representar una forma
más potente y eficaz de avivar el sistema inmunológico y de combatir enfermedades infecciosas contra las
cuales han fracasado las vacunas tradicionales.
En este proyecto, informamos sobre la conclusión y avances de las diferentes áreas de nuestra línea de
investigación. A diferencia quizás de otros proyectos, nosotros hemos trabajado por años como un
programa, en donde no solo se presenta un tema o proyecto netamente individual. Se han fortalecido
relaciones de trabajo y colaboración con diversas instituciones y colegas dentro de nuestra misma escuela,
lo que nos ha permitido tener los conocimientos y herramientas necesarias para hacer coincidir todos los
conocimientos que adquirimos y generamos a través de la investigación, en desarrollar nuevas estrategias
de diagnóstico, innovar y diseñar nuevos productos biológicos particularmente vacunas de DNA.
Debido a las características antes mencionadas y como es imposible en el poco espacio que nos dan
informar a detalle todo lo que se ha realizado, este informe se basa estrictamente en las metas generales
que se plantearon y se enfoca principalmente a las tesis terminadas y presentadas. En cada tesis
terminada y presentada, así como en las que están en curso, aunado a la difusión de nuestro trabajo de
investigación en el año que se reporta, se puede apreciar la calidad, formación de recursos, capacidad de
generación de conocimiento y colaboración que se mantuvo durante 2007, a pesar del poco apoyo
económico que recibimos para el proyecto 20060693. El detalle metodológico y conceptual puede
revisarse en las tesis terminadas que están en la Secretaría de Investigación y Posgrado del IPN, aquí daré
algunos aspectos metodológicos generales y los resultados más relevantes en cada caso.
MATERIAL Y MÉTODOS
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD) PARA DIAGNÓSTICO DE RABIA (Meslin et al., 1996)
A partir de los encéfalos de los ratones inoculados, descongelados y homogenizados por medio de un
aplicador de madera, se hicieron improntas en portaobjetos retirando el exceso de tejido con un papel
estraza presionando ligeramente, éstas se fijaron en acetona a -20°C durante 30 min. Concluido el tiempo,
se sacó la muestra y se dejó secar junto al mechero en un área de seguridad (área destinada únicamente
al diagnóstico de rabia, sin corrientes de aire y acceso restringido solo al personal capacitado). El
portaobjetos se marcó con tinta indeleble para delimitar el área de la impronta; se colocaron 10 uL del
conjugado del anticuerpo para detectar la proteína N del virus de la rabia. Se incubaron las improntas en
cámara húmeda a 37°C por 30 min. Las laminillas se colocaron en una rejilla para hacer los lavados,
ayudándose de una cuba de cristal. Los lavados fueron primero en PBS pH 7.6 por 3 min realizando una
agitación manual lenta pero constante y posteriormente se lavó con agua destilada por 3 min también con
agitación manual.
Para realizar la tinción de contraste, se pusieron las laminillas en una cuba de cristal con 4 gotas de azul de
Evans al 0.02% por 3 min. Al finalizar el tiempo se lavaron con agua destilada por 1.5 min con agitación muy
suave. Se retiraron las laminillas de la gradilla y se dejaron secar al aire junto al mechero. En el montaje de
la preparación, se agregó 1 gota de glicerina y se cubrieron las improntas con un cubreobjetos. Para poder
observar la fluorescencia de las muestras se leyeron al microscopio de epifluorescencia en aumento 40X. El
antígeno se identificó en forma de inclusiones (cuerpos obloides), polvo antigénico e hilos de color verde
manzana. Para determinar la positividad de la muestra, se siguen los mismos parámetros de fluorescencia
como se indican más adelante.
CARACTERIZACIÓN ANTIGÉNICA DEL VIRUS DE LA RABIA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES (Meslin et al.,
1996)
Para llevar a cabo la caracterización antigénica, se utilizó un panel de 8 anticuerpos monoclonales (AcMo)
dirigidos contra la proteína N del virus de la rabia, donado por el Centers for Disease Control (CDC) de los
EEUU, los anticuerpos están marcados con isotiocianato de fluoresceína (FITC).
Para realizar esta prueba se utilizaron únicamente los encéfalos de ratones inoculados que presentaron una
intensidad de fluorescencia específica al virus de la rabia de 3+ ó 4+ en la prueba de IFD, en la que se
comprobó que la muerte de los ratones fue por el virus rábico. De estos encéfalos, se tomó una pequeña
muestra y se hicieron improntas en un portaobjetos especial con pozos separados, se realizó 1 impronta por
cada anticuerpo a probar, las cuales se dejaron secar en campana de flujo laminar de bioseguridad tipo II
alrededor de 30 min. Posteriormente, los portaobjetos se introdujeron en acetona a -20°C por 30 min.
Transcurrido el tiempo, se retiraron de la acetona y se dejaron secar junto en la campana.
Para hacer la caracterización, se usó una dilución 1:1000 de cada AcMo en medio esencial mínimo
modificado por Dulbecco (D-MEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 25 mM de amortiguador
Hepes y 1mM de ázida sódica. Se agregaron 10 uL de cada AcMo diluido para cubrir la superficie de las
improntas respectivas, sin derramar el biológico a la siguiente muestra. Los portaobjetos se colocaron en
una cámara húmeda y se incubaron a 37°C por 30 min. Posteriormente, se hicieron dos lavados con PBS y
agua destilada alternadamente con ayuda de una piceta, cuidando que los AcMo no se pasaran de una
muestra a otra, las improntas se dejaron secar. A continuación, a cada muestra se agregaron 10 uL del
anticuerpo secundario, el cual es un conjugado anti-IgG de ratón diluido 1:100 marcado con FITC y se
incubaron a 37°C por 30 min, al término de este tiempo se lavaron dos veces con PBS y con agua destilada
alternadamente.
Por último se agregaron 2 gotas de azul de Evans (colorante de contraste al 0.02%) en una cuba de cristal
con agua destilada por 3 min, después se lavaron con agua destilada por 1.5 min con agitación muy suave
y se dejaron secar dentro de la campana. Para el montaje de la preparación, se agregó 1 gota de
glicerina y las improntas se cubrieron con un cubreobjetos. Las muestras se observaron a 40X en un
microscopio de epifluorescencia, en donde el antígeno se identificó en forma de inclusiones (cuerpos
obloides), polvo antigénico e hilos de color verde manzana, reportando con una intensidad de 3+ ó 4+. Las
improntas se leyeron de acuerdo al orden en como se pusieron los AcMo, para poder tener el patrón de
reacción y poderlo cotejar con el que se presenta en la tabla 1.
PATRONES DE REACCIÓN PARA EL VIRUS DE LA RABIA.
Se revisaron mínimo 10 campos por cada muestra en el portaobjeto y se interpretó de la siguiente forma:
4+ Cuando en el 98% de un campo se observa fluorescencia específica
3+ Cuando en el 90% de un campo se observa fluorescencia específica
2+ Cuando en el 80% de un campo se observa fluorescencia específica
1+ Cuando en el 70% de un campo se observa fluorescencia específica
- Cuando no se observa fluorescencia específica
Tabla 1. Identificación antigénica de las variantes que corresponden a los reservorios del virus de la rabia en
el continente americano por medio de un panel de ocho anticuerpos monoclonales
C1 C4 C9 C10 C12 C15 C18 C19 VAg
CVS/ERA/SAD/PAST + + + + + + + + Laboratorio
Perro / mangosta + + + + + + - + 1
Perro + + - + + + - + 2
Vampiro - + + + + - - + 3
*T. brasilensis - + + + + - - - 4
Vampiro - + v + + v - v 5
*Lasiurus cinereus v + + + + - - - 6
Zorro de Arizona + + + - + + - + 7
Zorrillo - + + + + + + + 8
*Tadarida br. Mex. + + + + + - - - 9
Baja CS zorrillo + + + + - + - + 10
Vampiro - + + + - - - + 11
* Murciélagos insectívoros
v = variable (+/-)
EXTRACCIÓN DEL RNA VIRAL
a) Rabia
Para llevar a cabo la extracción del RNA, se tomó una pequeña muestra de tejido infectado,
aproximadamente 50 mg, y se colocaron en un microtubo estéril. Se agregaron 250 uL de amortiguador de
lisis, se procedió a homogenizar el tejido con ayuda de un aplicador de madera colocando la boca del
tubo hacia el lado opuesto de la cara del operador y después se agitó en un vortex para completar la
homogenización, posteriormente los tubos se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente.
Posteriormente, se agregaron 750 uL de TRIzol LS ® y se homogenizó con vortex por 30 s, se dejó a
temperatura ambiente por 5 min a fin de que se disociaran los complejos de la ribonucleoproteína. Después
se colocaron 200 uL de cloroformo y se agitó vigorosamente en vortex por 15 s, se dejó a temperatura
ambiente por 5 min. Las muestras centrifugaron a 12,000 Xg durante 15 min a 4°C. La fase acuosa se
transfirió a un microtubo estéril, se agregaron 500 uL de isopropanol y el contenido se mezcló por inversión,
se dejó el tubo a -20°C por 30 min. A continuación se centrifugó a 12,000 Xg durante 10 min a 4°C y la
solución se decantó cuidando que la pastilla quedara en el fondo. Se agregaron 300 uL de etanol al 75%
para lavar la pastilla, se mezcló por 10 s y se centrifugó inmediatamente a 7,500 Xg por 5 min a 4°C. El
etanol se decantó y se dejó evaporar el resto de etanol dentro de la campana de flujo laminar. La pastilla
de RNA deshidratada se almacenó a -20°C hasta el momento de su uso; cuando se hidrataron, se
agregaron 40 uL de agua ultrapura Tipo I estéril.
b) Rubéola
EXTRACCIÓN DE RNA CON EL EQUIPO DE REACTIVOS DE QIAGEN QIAamp® Viral RNA Mini Kit
Se adicionan 560µL de buffer AVL acarreador de RNA en microtubos de 1.5 mL, mas 140µL de muestra de
suspensión celular (virus) y se mezclan. Incubar 10min a temperatura ambiente. Se adicionan 560µL de
etanol absoluto (96°), se mezcla y centrifuga. Se adiciona 630µL de la mezcla a una columna y se
centrifuga a 6000 X g durante 1 minuto. Se quita el tubo colector y se cambia por uno nuevo.
Se adicionan los 630�L restantes de la mezcla a la columna y se centrifuga nuevamente. Pasar la columna
a otro tubo, se abre con cuidado la columna QIAamp y se agregan 500 µL de buffer AWI, se centrifuga
durante 1 minuto a 6000 X g. Se coloca en otro tubo la columna y se tira el tubo anterior con lo filtrado.
Adicionar a la columna 500µL de buffer AW2, se cierra y centrifuga 4 min a 10000 X g. Colocar la columna
en otro tubo colector. Se descarta el tubo que contiene lo filtrado, se abre con cuidado la columna y se
agregan 60µL de buffer AVE, centrifugar a 6,000 X g durante 1min. El RNA viral puede durar hasta 1 año a
–20oC ó –70oC. Se cuantifica el RNA espectrofotométricamente.
c) Calicivirus humanos (Norovirus y Sapovirus).
La materia fecal frecuentemente contienen sustancias que pueden inhibir la actividad enzimática de la
transcriptasa reversa y DNA polimerasa usadas en la RT-PCR, por lo que fue necesario tratar la muestra
antes del diseño de la prueba, purificando los ácidos nucléicos del virus. Algunas consideraciones
importantes en la selección del método de extracción del RNA viral son: la eficiencia, concentración y
recuperación del ácido nucleico, así como la capacidad de remoción o inactivación de los inhibidores
presentes en las heces para la RT-PCR. Otras consideraciones secundarias en el desarrollo de la prueba son
el fácil diseño del método y el número de muestras que se pueden procesar al mismo tiempo (Hale y col.,
1996).
Extracción y purificación del RNA viral utilizando el estuche comercial QIAamp Viral RNA Mini Spin.
El RNA viral fue extraído según las instrucciones del fabricante. Brevemente, 140 �l de la muestra es lisada
bajo altas condiciones desnaturalizantes para la inactivación de RNAsas y asegurar el aislamiento del RNA
viral intacto con 560 �l de regulador AVL conteniendo el acarreador. Después de agregar 560 �l de etanol
de alta pureza a la solución e incubar 10 min. la mezcla es cargada en la columna de QIAamp. El RNA se
une a la membrana y los contaminantes son eficientemente eliminados en dos pasos de centrifugación a
6,000 x g usando 500 �l de dos diferentes reguladores de lavado. Por último, RNA viral de alta calidad es
eluido en 60 �l de un regulador especial libre de RNAsas, listo para el uso o almacenamiento. El RNA
purificado está libre de proteínas, nucleasas y otros contaminantes e inhibidores.
d) Hepatitis B
Extracción del DNA viral a partir de plasma
La extracción se realizó utilizando el equipo de reactivos QIAamp® Ultrasense™ Virus kit de QIAGEN,
siguiendo las recomendaciones del fabricante como a continuación se describe: se tomó 1 mL de plasma y
se depositó en un microtubo de 2 mL. Se adicionaron 800 µL del regulador AC (isopropanol) en la superficie
del plasma y 5.6 µL del acarreador de RNA en la tapa del tubo. Se cerró el microtubo y se mezcló primero
por inversión y luego utilizando un mezclador (vórtex) durante 10 s, después se incubó por 10 min a
temperatura ambiente y se centrifugó a 1100 X g por 3 min. Finalmente, se decantó el sobrenadante. Se
resuspendió la pastilla con 300 µL del regulador AR precalentado a 60°C y se adicionaron 20 µL de
proteinasa K, se incubó a 40°C durante 10 min en agitación. Después de esto, se centrifugó brevemente y
se adicionaron 300 µL del regulador AB (etanol y substituto de Nonidet P40) mezclando en un vórtex y
centrifugando brevemente. Se colocó una columna dentro de un microtubo de 2 mL y se adicionaron
dentro de la columna 700 µL del lisado. Se centrifugó a 3000-5000 X g por 1 min y se colocó la columna en
un microtubo limpio de 2 mL, adicionando 500 µL del regulador AW1 (hidrocloruro de guanidina).
Posteriormente, se centrifugó a 6000 X g por 1 min y se colocó la columna en un microtubo limpio de 2 mL,
se adicionaron 500 µL de buffer AW2 y se centrifugó a 20,000 X g durante 3 min. Se eluyó el DNA con 50 µL
de agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) y se dejó en reposo 5 min a temperatura ambiente. Se
centrifugó a 6000 X g por 1min y se adicionaron 30 µL de agua-DEPC para eluir el resto del DNA de la
columna. Se dejó en reposo 5 min a temperatura ambiente y se centrifugó a 6000 X g por 1 min.
TRANSCRIPCIÓN REVERSA DEL RNA VIRAL Y REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (RT-PCR)
a) Rabia
Los iniciadores utilizados para la amplificación del gen de la nucleoproteína (N) del virus de la rabia por
medio de la RT-PCR fueron descritos previamente por Smith (1995). Por otra parte, para la amplificación del
gen de la glicoproteína (G) del virus rábico se diseñaron en este trabajo 2 pares de iniciadores.
b) Rubéola
Para la reacción de transcripción reversa, se utilizó una mezcla de reacción de 45�L que contiene H2O
desionizada, amortiguador 10x sin MgCl2, dNTP´s (Sigma), DTT, MgCl2 (Promega), R2, R7, la transcriptasa
reversa Mo-MLV, ribonucleasa H-, RNA sin (Roche), Taq polimerasa, más 5 �L de RNA total extraído; se
sometió a 30 ciclos de temperatura como sigue: 37ºC por 30min, 94ºC por 2min, 94ºC por 30 s, 56ºC por 45 s,
72ºC por 1min, 72ºC por 7min. Para la RT-PCR del fragmento de RNA de 270pb sintético obtenido por
transcripción in vitro se utilizó el sistema de reactivos “Titan One Tube RT-PCR” de acuerdo a lo especificado
por el manual.
c) Calicivirus humanos (Norovirus y Sapovirus).
En la primera parte de este trabajo se utilizó para la RT-PCR la enzima Titán, una mezcla de iniciadores
previamente reportados (Jiang y col., 2004) dirigidos todos ellos a la misma región del gen de la RNA
polimerasa del virión, siendo P290, P290H, P290I, P290J, P290K los iniciadores de sentido positivo y P289,
P289H, P289I los iniciadores de sentido negativo con los cuales es posible detectar los géneros norovirus y
sapovirus por la producción de un amplicón de 331 pb para el género sapovirus y de 319 para el género
norovirus (Jiang y col., 2004). Los productos de amplificación obtenidos se analizaron mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro de etidio y se visualizaron con un
transiluminador de luz ultravioleta (UV).
PURIFICACIÓN DEL cDNA
A la mezcla de reacción de la RT-PCR se le adicionaron 400 uL de la solución de unión y se mezcló
utilizando el vortex a velocidad baja. Esta mezcla se colocó en la columna provista por el kit y se colocó en
un microtubo de 1.5 mL, centrifugándose a 12,000 Xg por 1 min. El líquido eluído se descartó y la columna
se colocó de nuevo en el microtubo. Posteriormente, se agregaron 700 uL de la solución de lavado a la
columna y se centrifugó a 12,000 Xg por 1 min, la solución de lavado se removió y se volvió a centrifugar
bajo las mismas condiciones para quitar toda la solución de lavado. Finalmente, se puso la columna en un
microtubo estéril de 1.5 mL y se agregaron 50 uL de agua ultrapura Tipo I estéril previamente calentada
(aproximadamente 50-60°C), se dejó el agua en la columna por 1 min a temperatura ambiente y se
procedió a centrifugar a 12,000 Xg por 2 min. El líquido eluído conteniendo el cDNA purificado se
almacenó a -20°C.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
a) Hepatitis B
La estandarización de la técnica de PCR para amplificar la región de ~710 pb de la región precore/core
del VHB y determinar el límite mínimo de detección del DNA viral, se llevó a cabo utilizando como DNA
molde el plásmido de la clona recombinante E. coli pUK21-VHB adw del Laboratorio de Producción y
Control de Biológicos de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del I.P.N. (Dra. Rosa María Ribas Jaimes),
que contiene el genoma completo del VHB adw y la cual se obtuvo a partir de la pAM-6 del ATCC® 45020.
Para realizar este experimento se variaron condiciones tales como la temperatura de fusión, concentración
de magnesio, concentración de iniciadores y el número de ciclos de la PCR, entre otras. Se hicieron
diluciones del DNA molde de tal forma que quedaran representadas 3, 30, 300, 3000, 30000, y 3000000
copias del genoma del VHB.
Purificación de los productos de la PCR
Los productos de amplificación se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1%, los cuales se
tiñeron con bromuro de etidio (1µg/mL), se utilizó TBE 1X como solución amortiguadora. La electroforesis se
realizó a 70 V durante aproximadamente 1.5 h. El gel se visualizó en un transiluminador de luz ultravioleta
(UV) y la banda de DNA de interés se cortó directamente del gel. Los productos esperados fueron de 711
pb. La purificación de los productos de PCR, se realizó con el sistema QIAquick® gel extraction de QIAGEN.
Brevemente se describe a continuación: se adicionaron 3 volúmenes del regulador QG (tiocianato de
guanidina) a un volumen de gel, se incubó a 56°C durante 10 min y se precipitó con un volumen de
isopropanol. Esta solución se colocó en la columna y se centrifugó a 16,000 X g por 1 min. El producto
retenido en la columna se lavó primero con el regulador QG y se centrifugó a 16,000 X g por 1 min.
Posteriormente, se adicionaron 750 µL del regulador PE y se centrifugó bajo las mismas condiciones,
finalmente se realizó una centrifugación extra a 16,000 X g por 1 min para eliminar el exceso de etanol. El
producto de PCR se eluyó con 50 µL del regulador agua-DEPC centrifugando a 16,000 X g por 1 min.
Cuantificación de los productos de la PCR
La cuantificación de los productos purificados se realizó directamente en el gel de agarosa, empleando
marcadores de masa molecular (EZ Load™ Precision Molecular Mass Ruler, Bio-Rad) y por
espectrofotometría (260 nm) colocando un microlitro de producto en un mL de agua-DEPC (1:100).
CLONACIÓN EN pGEM T- Easy ®
Las reacciones enzimáticas, digestiones y ligaciones, se hicieron de acuerdo a técnicas estándares de
laboratorio (Sambrook & Russell, 2001), siguiendo las indicaciones de los proveedores para el uso óptimo de
este material.
Las reacciones se dejaron una hora a temperatura ambiente y posteriormente se dejaron a 4°C durante
toda la noche. Las mezclas de ligación se emplearon para transformar células de E. coli DH5 alfa
previamente inducidas a su estado competente con el método de cloruro de calcio descrito en Sambrook
& Russell (2001). La transformación de las células se hizo agregando la mezcla de ligación a 50uL de células
competentes y se dejaron reposar por 30 minutos a 4°C, posteriormente se indujo un choque térmico de 90
segundos a 42°C y se transfirió de inmediato a 4°C por 2 minutos. Después de esto, se adicionaron 500 µL de
medio LB sin antibiótico para dejar que las células se recuperaran, incubando 1 h a 37°C agitando a 180
rpm. Posteriormente, se sembraron dos alícuotas de 200 uL y una de 100 uL en cada una de 3 placas de
agar LB + ampicilina (100 mg/mL) +X-Gal (40 mg/mL) + IPTG (100mM). De las tres placas, se picaron 4
colonias blancas con un palillo estéril y se cultivaron en 3 mL de medio líquido LB + ampicilina (100 mg/mL),
a partir de estos cultivos se realizó la extracción de DNA plasmídico. En forma paralela también se
trabajaron los testigos de transformación utilizando el vector pGEM, un testigo de viabilidad de células
competentes y otro con el plásmido pcDNA3 para verificar la eficiencia de transformación en el lote de
células competentes.
EXTRACCIÓN DE DNA PLASMÍDICO (Sambrook & Russell, 2001)
Se cultivaron en 3 mL de medio LB + ampicilina cada una de las colonias de bacterias blancas que se
obtuvieron en IV.11, a 37�C durante toda la noche, utilizando medio LB + ampicilina (100 mg/mL). Se
transfirieron 1.5 mL de cada cultivo a un microtubo estéril y se centrifugaron a 8,000 Xg por 1 min. El medio
de cultivo se eliminó por decantación. El botón celular se resuspendió con ayuda del vortex y se añadieron
100 uL de la solución STE (NaCl 0.1 M + Tris-Cl 10 mM pH 8.0 + EDTA 1 mM pH 8.0) fría y se agitaron los tubos
con ayuda del vortex, posteriormente se dejaron en reposo 5 min a temperatura ambiente. Al término de
esto, se añadieron 200 uL de una solución NaOH (10 N) + SDS (10%), y se agitaron los tubos por inversión 10
veces, los microtubos se transfirieron a un baño de hielo por 5 min. Después se agregaron 150 uL de
acetato de potasio 3M y se agitaron los microtubos por inversión 10 veces, colocándose nuevamente en
hielo por 5 min. Estos microtubos se centrifugaron a 12,000 Xg por 5 min. Después de la centrifugación se
recuperaron aproximadamente 400 uL del sobrenadante en cada caso, al cual se le agregaron 200 uL de
una mezcla de fenol: cloroformo (1:1), se agitó por inversión 15 veces y se centrifugó a 12,000 Xg por 5 min.
Se recuperó la fase acuosa en un microtubo nuevo, se agregaron 400 µL de etanol absoluto para precipitar
el DNA plasmídico, dejando los microtubos 30 min a -20°C. Pasado este tiempo, se centrifugó a 12,000 Xg
por 2 min. La pastilla de DNA se lavó con 200 uL de etanol al 70% frío y de nuevo se centrifugó a 12,000 Xg
por 1 min. Para la eliminación del etanol residual se colocaron los tubos en un Speed Vac® de Salvant por
10 min Se resuspendió el DNA plasmídico en 30 uL de agua ultrapura Tipo I estéril.
SECUENCIACIÓN NUCLEOTÍDICA
La secuenciación se realizó en el servicio a cargo de la Dra. Laura Ongay del Departamento de Fisiología
de la UNAM, con los iniciadores universales T7 y SP6 para todas la clonas recombinantes en pGEM o con
iniciadores diseñados por nosotros en caso de productos de amplificación. Los productos se analizaron en
un secuenciador automático ABI PRISM ® 3100.
ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO.
Las secuencias una vez que se hubieron recibido y revisado en el programa ChromasPro versión 1.34, se
procedió a realizar una búsqueda en el BLAST (Basic Local Alignment and Search Tool) disponible en
Internet, en la página principal de NCBI (National Center for Biotechnology Information), usando la versión
Nucleotide Blast, especificando en la base de datos la de Nucleotide collection, delimitando nuestra
búsqueda a base de datos específicas según el caso.
Una vez que se tuvieron las secuencias con la misma longitud, se alinearon en el programa ClustalX 1.83
para Windows (Thommson et al., 1997), dejando los parámetros de alineamiento múltiple que vienen
recomendados por el programa. Una vez alineadas las secuencias, el archivo con extensión *.fas se abrió
con el programa Mega4 (Tamura et al., 1993) y se exportó el archivo para guardarlo con la extensión *.meg.
Este nuevo archivo fue abierto de nueva cuenta con el programa Mega4 (Tamura et al., 1993) y se
procedió a hacer el árbol filogenético por el método de Neighbor-joining aplicando un Bootstrap de 1000
réplicas.
RESULTADOS
METAS 1 y 5
CARACTERIZACIÓN ANTIGÉNICA Y MOLECULAR DE UNA SEMILLA VACUNAL DEL VIRUS DE LA RABIA (CEPA
ACATLÁN-PRONABIVE-SAGARPA). ANÁLISIS DE SECUENCIAS.
Árbol filogenético de la secuencia del gen G de la semilla vacunal del virus de la Rabia. Árbol filogenético donde se muestran las agrupaciones de las secuencias en clusters debido a su similitud, mostrando la cercanía de las cepas de acuerdo al reservorio del cual se aislaron y/o el origen de la cepa viral.
Árbol filogenético de la secuencia del gen N de la cepa vacunal del virus de la rabia. Árbol filogenético donde se muestran las agrupaciones de las secuencias en clusters debido a su similitud, mostrando la cercanía de las cepas de acuerdo al reservorio del cual se aislaron y/o el origen de la cepa viral. En los árboles podemos distinguir dos grandes grupos, el de los carnívoros (parte superior) y el perteneciente
a los relacionados con murciélagos (parte inferior). Dentro del primero de ellos, podemos ver que la cepa
en estudio se agrupa en el mismo cluster de las cepas de laboratorio SADB19, CVS, ERA y SAD Bern con un
valor del bootstrap de 99%, teniendo que SADB19 es la más semejante con pYR-N1 y pYR-N2. Por otro lado,
también se distinguen bien los aislados de perro, zorro y zorrillos, murciélagos y bovinos.
El cumplimiento de esta meta dio lugar a la culminación de una tesis de maestría en donde la alumna
Yazmin Moreno Salcedo obtuvo mención honorífica. Las conclusiones más relevantes de su trabajo fueron:
1) La virulencia de la cepa semilla fue alta en el modelo murino. 2) La cepa del virus rábico en estudio
presentó un patrón de reactividad positivo a los 8 anticuerpos monoclonales proporcionados por el CDC.
3) Se amplificaron y clonaron exitosamente los genes de la nucleoproteína y la glicoproteína de la cepa
semilla vacunal del virus de la rabia de acuerdo a los objetivos. 4) Los genes N y G de la cepa del virus de la
rabia en estudio tienen un 99% de similitud con las cepas SAD, de acuerdo al análisis con el BLAST de NCBI.
5) El análisis filogenético de la región semivariable (264 pb) del gen de la nucleoproteína, muestra similitud
entre la cepa del virus de la rabia en estudio y las cepas de laboratorio, en especial con la cepa SAD B19,
con un valor de 66% en la prueba de bootstrap con 1000 réplicas. 6) El árbol filogenético construido con la
secuencia completa del gen de la glicoproteína, muestra similitud entre la cepa del virus de la rabia en
estudio con las cepas de laboratorio, donde las cepas SAD B19 y SAD Bern, tienen un valor de 89% en la
prueba estadística bootstrap con 1000 réplicas. 7) En el análisis realizado con la secuencia de aminoácidos
del gen de la glicoproteína, la cepa en estudio muestra alta conservación de residuos con las cepas
SADB19 y SAD Bern, teniendo un cambio que no comparte con ellas (Gln255Lys) pero que está presente en
las cepas CVS y ERA. 8) Los análisis realizados a la cepa Acatlán V-319 arrojan mucho más similitud con la
cepa SAD que con aislados del virus de la rabia de murciélago hematófago.
METAS 2, 5, 6 y 7
DISEÑO DE PLÁSMIDOS VACUNALES CON SEÑALES DE SECRECIÓN. ANÁLISIS DE SECUENCIAS. PRUEBAS DE
INOCUIDAD Y DE RESTRICCIÓN.
Se diseñaron y construyeron los plásmidos vacunales con señales de secreción, en este caso en particular
con la secuencia líder kappa de inmunoglobulinas. Esta estrategia se aplicará en genes que lo requieran
tanto para la vacuna de DNA antirrábica como para la vacuna de DNA contra clostridia causantes de
miositis. La información obtenida en la META 1 es fundamental para la obtención de los plásmidos
vacunales prototipo. Los estudios iniciales para la vacuna contra miositis causada por clostridia recibió el
Premio al Tercer lugar en los Premios a la Mejor Tesis que da el I.P.N. Se cumplió con esta meta y los
resultados cristalizarán en dos tesis de maestría que se presentarán durante el semestre enero-junio 2008 y se
informará con detalle en su oportunidad los aspectos relacionados con éstas.
META 3 y 5
ESTUDIO DE LA REGIÓN PRECORE/CORE DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B. ANÁLISIS DE SECUENCIAS.
Se incluyeron 23 pacientes con hepatitis B, uno con infección desapercibida que se detectó en el Banco de
Sangre del IMSS (VHB-66) y que por lo tanto no estaba sujeto a tratamiento en el momento de este estudio,
dos del Hospital de Especialidades que empezaron tratamiento (no especificado) 4 meses y 8 años,
respectivamente, antes de este estudio (VHB-100, VHB-101), así como 20 pacientes del Centro Médico
Nacional la Raza del IMSS con hepatitis B crónica. Todos los pacientes fueron HBsAg positivos. Los resultados
serológicos a HBeAg, Anti-HBeAg y los niveles de alanina amino transferasa (ALT) y aspartato amino
transferasa (AST), así como la carga viral y los datos de tratamiento al momento de este estudio se muestran
a continuación.
Características clínicas de los 23 pacientes con hepatitis B en estudio
Análisis filogenético del VHB
Para estudiar la relación de los 12 aislados del VHB secuenciados, entre si y con cepas del VHB de los
genotipos hasta ahora reportados, se realizó en primer lugar un alineamiento múltiple utilizando el programa
Clustal X con secuencias de la región precore/core depositadas en GenBank y que representan los
genotipos de la A a la H, junto con las 12 secuencias obtenidas en este trabajo.
Posteriormente se realizó un análisis filogenético con el programa Mega 4.0 (Tamura et al., 2007) en donde
se construyó un dendrograma por el método del vecino más cercano o Neighborn-Joining. El árbol
consenso se obtuvo a través de un bootstrap de 1000 réplicas, en éste solo se observan las ramas en las que
al menos en el 75% de las repeticiones, éstas se mantuvieron agrupadas.
Clave Sexo/ Edad
HBsAg HBeAg Anti- HBeAg
ALT (U/L)
AST (U/L)
CV (copias/mL)
Tratamiento
VHB-66 M/45 Positivo Positivo Positivo 87 39 8990 Sin tratamiento VHB-72 M/16 Positivo Positivo Negativo 83 46 139,000,000 IFN (1 año 6 meses) VHB-76 M/46 Positivo Positivo Negativo 101 65 259,000,000 Sin tratamiento VHB-82 M/21 Positivo Positivo Negativo 63 26 41,300,000 Si, no especificado (18 meses) VHB-87 F/31 Positivo Positivo Negativo 86 32 426,000,000 Sin tratamiento VHB-89 M/43 Positivo Positivo Negativo 116 75 19,900,000 LMV , IFN ( 2 años) VHB-91
M/36
Positivo Positivo Negativo 72 40 562,000,000
IFN alfa, LMV (2 años)
VHB-96
M/64
Positivo Positivo Negativo
360
606 2,230,000
Si, no especificado (2 años 5 meses)
VHB-98 M/54 Positivo Positivo Positivo 177 134 364,000 IFN, LMV (12 años) VHB-100 M/55 Positivo Negativo Positivo 90 40 277,000 Si, no especificado (4 meses) VHB-101 M/19 Positivo Positivo Negativo 43 29 19,000,000 Si, no especificado (8 años) VHB-104 F/21 Positivo Positivo Negativo 53 33 1, 960, 000, 000 Sin tratamiento VHB-112
M/39
Positivo Positivo Negativo
58
60 33, 800, 000
IFN, LMV, Combivir, Efavirenz (9 meses)
VHB-115 M/20 Positivo Positivo Negativo 68 34 544,000 Sin tratamiento VHB-117 M/38 Positivo
Positivo Negativo
233 210
290,000.000
Retrovir, LMV, Didanosina, Ritonavir, Saquinavir, Amprenavir, Caletra, Combivir y otros no especifícados (11 años)
VHB-118 M/48 Positivo Negativo Positivo 30 30 435 IFN, LMV (1 año 6 meses) VHB-119 F/39 Positivo Negativo Positivo 35 23 3003 IFN, LMV (sin datos) VHB-120 M/31 Positivo
Positivo Negativo 181 127
147,000,000 Sin tratamiento
VHB-123 F/23 Positivo Positivo Negativo 53 36 210,000,000 IFN, LMV (4 meses) VHB-124 M/20 Positivo Negativo Positivo 277 118 No detectada IFN pegilado, LMV (sin datos) VHB-125 M/37 Positivo Positivo Negativo 53 23 15,000,000 IFN, LMV (8 años) VHB-129 F/19 Positivo Negativo Negativo 34 20 No detectada Sin tratamiento VHB-130 M/38
Positivo Positivo Negativo 141 54 431, 000, 000
Sin tratamiento
Dendrograma de la región precore/core del VHB. Se analizaron las 12 secuencias de la región precore/core del VHB obtenidas en este trabajo junto con 21 secuencias reportadas en el GenBank de los diferentes genotipos descritos en la actualidad, además de una secuencia del VHB aislada del mono lanudo. Se delimitó la región precore/core para realizar el alineamiento con Clustal W a través del programa Mega 4.0. El porcentaje en el que las réplicas del árbol coincidieron en la topología mostrada se muestra con rojo en cada rama. En azul están los números de las muestras en estudio precediendo las letras MX (México), las demás secuencias se presentan con el número de acceso asignado por el GenBank precediendo al genotipo que le corresponde.
La relación evolutiva entre las 34 secuencias se obtuvo utilizando el método de Neighbor-Joining. El
árbol óptimo tuvo una sumatoria de la longitud de las ramas de 0.67948184 . El árbol se linealizó asumiendo
una misma historia evolutiva para todos los linajes y se presenta a escala con las longitudes de las ramas en
las mismas unidades que las distancias evolutivas que se usaron para obtener el dendrograma, en donde se
puede apreciar claramente la agrupación de las secuencias obtenidas de acuerdo al genotipo
identificado. Las distancias evolutivas se obtuvieron utilizando el método de Maximum Composite Likelihood
y son las unidades del número de sustituciones por sitio en las secuencias analizadas.
76MX
112MX
87MX
104MX
82MX
123MX
130MX
120MX
AB27530 H
AB298362 H
AY090460 H
89MX
AY090454 H
98MX
DQ899142 F
DQ899149 F
DQ899150 F
AB036913 F
AB064314 G
EF634480 G6
117MX
EF634481 G1
91MX
AB048704 C
X98077 B
DQ993711 B
DQ478901 C
EU086721 A2
AM282986 A
AB048701 D
AM422939 D
X75657 E
AB219534 E
AF046996 Woolly monkey
100
97
96
77
99
99
98
130MX
112MX
120MX
104MX
123MX
76MX
82MX
87MX
AB27530 H
AB298362 H
AY090460 H
89MX
AY090454 H
98MX
DQ899149 F
DQ899150 F
AB036913 F
DQ899142 F
EF634480 G6
117MX
EF634481 G1
91MX
AB048704 C
X98077 B
DQ993711 B
DQ478901 C
EU086721 A2
AB064314 G
AM282986 A
AB048701 D
AM422939 D
X75657 E
AB219534 E
AF046996 Woolly monkey
0.000.020.040.060.080.10
Árbol de la historia evolutiva de 34 secuencias de la región precore/core del VHB. Se analizaron las 12 secuencias de la región precore/core del VHB obtenidas en este trabajo, junto con 21 secuencias reportadas en el GenBank de los diferentes genotipos descritos en la actualidad, además de una secuencia del VHB aislada del mono lanudo. La relación evolutiva y las distancias se obtuvieron por los métodos de Neighbor-Joining y Maximum Composite Likelihood respectivamente.
Las conclusiones más importantes en este trabajo son: 1) Hubo una mejor eficiencia de la detección y
extracción del DNA-VHB cuando se empleó plasma como fuente de extracción del DNA viral con respecto
a la sangre seca en papel filtro, ya que en estas últimas sólo se tuvo éxito con muestras que presentan un
número de copias virales/mL superior al millón. 2) Se obtuvieron y analizaron las secuencias nucleotídicas de
la región precore/core de 12 muestras (76, 82, 87, 89, 91, 98, 104, 112, 117, 120, 123, 130), en donde 10 se
identificaron como genotipo H y 2 correlacionaron con el genotipo G recientemente reportado en México
y que se encuentra frecuentemente en Francia y en Estados Unidos. 3) Las mutaciones encontradas en este
estudio son G1896A y C1858T, ambas tienen un papel importante en la cronicidad de la enfermedad y
constituyen una señal importante en la terminación del ciclo de replicación viral. 4) Se encontraron
mutaciones no antes reportadas. Por lo que será importante establecer si tienen o no importancia en el
curso de la enfermedad o en la farmacorresistencia del virus.
META 4 Y 5
ESTUDIO DE CALICIVIRUS EN MÉXICO. ANÁLISIS DE SECUENCIAS.
Se realizó la extracción de RNA de 407 muestras fecales negativas a Rotavirus, de pacientes que
presentaron diarrea aguda y que fueron previamente canalizados al SNVER.
RT-PCR para la detección de HuCVs.
Las condiciones para la RT-PCR fueron las antes mencionadas en material y métodos, utilizando la mezcla
de iniciadores P289, P289H, P289I, P290, P290H, P290I, P290J, P290K, para detectar a los géneros Norovirus y
Sapovirus de la familia Caliciviridae por la amplificación de un segmento del gen de la RNA polimerasa de
319 pb para norovirus y de 331 pb para sapovirus.
Se contabilizó el número de muestras positivas por entidad federativa, hallándose un mayor número de
casos positivos a HuCVs en Tamaulipas, Quintana Roo y Chiapas con un número de 49, 27 y 12
respectivamente, seguidos por Yucatán, Campeche, Veracruz, Michoacán, Hidalgo, Distrito Federal y
Nuevo León con 11, 10, 7, 4, 2, 2 y 1 respectivamente. Del 100% de las muestras que resultaron positivas a
HuCVs, el 63% (79) pertenecían a pacientes del sexo masculino, mientras que el 37% restante (46) fueron del
sexo femenino. El intervalo de edad en donde se muestra más afectación es en el de niños menores de 1
año con 74 casos coincidiendo con el grupo de edad que afecta rotavirus, seguido por aquellos que se
encuentran entre 1 y 2 años de edad, disminuyéndose este número conforme aumenta la edad.
Las conclusiones más importantes de este estudio son: 1) Se demostró que al menos el 31 % de los casos de
gastroenteritis aguda infantil en México que no se deben a rotavirus, son originados por calicivirus (125/407).
2) De las 125 cepas de norovirus reportadas en este trabajo, el 41% se agruparon dentro del genogrupo II.
3) La gastroenteritis infantil asociada a HuCVs no está restringida a brotes epidémicos, como se ha
reportado en otros estudios. 4) La infección por calicivirus humanos es más común en niños menores de un
año de edad de población abierta. 5) Las entidades federativas más afectadas se encuentran
principalmente en la costa del Golfo de México y Península de Yucatán. 6) La circulación de calicivirus se
presentó durante todo el periodo de estudio.
Árbol filogenético de las cepas de norovirus en México. Se muestran las relaciones filogenéticas existentes entre las diferentes cepas virales halladas en este estudio y secuencias tipo reportadas en el Genbank. El árbol consenso se generó por la comparación y alineamiento de la región de nucleótidos de la RNA polimerasa dependiente de RNA en ORF1 de 50 secuencias incluyendo cepas tipo de norovirus genogrupo I y II. Las muestras de este estudio se muestran en negritas y en arial simple las secuencias tipo. Un calicivirus porcino sirvió como pie de árbol, marcada aquí como PEC.
Hu/CS-E1/02//US Hu/Tiffin//99/US
Hu/Neustrelitz/260/00/DE
Hu/New Orleans 306/94/US
Hu/Hawaii/71/US
Hu/ Snow Mountain/76/US
Hu/SaitamaU18/97-99/JP
Hu/México/89/Mx
CAL0516 CAL2600 CAL2378 CAL3129
CAL3116 Hu/Farmington Hills//02/US
CAL3103
CAL2919
CAL3114
CAL2835
CAL3098
CAL3019
CAL3120
Hu/Langen1061/02/DE
CAL1839
CAL3101
CAL1697
CAL2900
CAL2307
CAL3124
CAL3013
Hu/Camberbell/94//AUS
Hu/MD145-12/87/US
Hu/Lordsdale/93/UK
Hu/Mc37/00-01/THA
Hu/SaitamaU1/99/JP
Hu/Gifu/96/JP
Hu/SaitamaU16/97/JP
Hu/SaitamaU17/97/JP
Hu/Baltimore/2741993/US
Hu/SaitamaU4/97/JP
Hu/SaitamaU3/97/JP
Hu/Gwyneed/273/94/US
Hu/VA97207/97/US
Hu/SaitamaU25/97-99/JP
Hu/SzUG1/99/JP
Hu/Desert Shield/90/US
Hu/WuG1/00/JP
Hu/BS5/DE
Hu/Southampton/91/UK
Hu/Norwalk/68/US
PEC
0.2
GGII-17
GGII-16
GGII-5
GGII-1
GGII-2
GGII-3
GGII-4
GGII-4
GGII-4
GGII-10
GGII-12
GGII-6
GGII-7
GGII-9
GGII-7
GGI
META 8
ANÁLISIS DEL PATRÓN DE RECONOCIMIENTO ANTIGÉNICO ENTRE PACIENTES MEXICANOS CON LEPRA
PAUCIBACILAR Y MULTIBACILAR.
La lepra es una enfermedad crónica causada por Mycobacterium leprae; aunque las infecciones son
curables y la prevalencia de casos ha disminuido considerablemente, la incidencia se mantiene sin cambio
significativo. En un diagnóstico tardío o deficiente, la enfermedad puede cursar de forma desapercibida y
a la postre ocasionar discapacidades severas. Actualmente la búsqueda y uso de antígenos específicos de
M. leprae es fundamental para el diagnóstico y el desarrollo de nuevas estrategias contra la lepra. Con el
objetivo de establecer componentes antigénicos potencialmente útiles en la diferenciación y eficacia del
diagnóstico entre pacientes paucibacilares (PB) y multibacilares (MB), se compararon patrones de
reconocimiento antigénico de M. leprae a través de anticuerpos presentes en sueros de pacientes
mexicanos PB y MB. Partiendo de los datos del índice bacilar (BI) y del diagnóstico clínico de 55 pacientes
que fueron diagnosticados con lepra, se determinó el patrón antes mencionado de las muestras de suero,
utilizando como testigos sueros de sujetos sanos endémicos y no endémicos, así como de pacientes
infectados con otras micobacterias. Los resultados obtenidos muestran, en general, un patrón antigénico
característico para pacientes MB diferente del grupo de PB y diferentes, a su vez, a los demás grupos.
Dentro de las moléculas usadas, se evaluó mediante Western Blot la respuesta hacía EFTu, MMP-I, Ag85b
(ML2028), MMP-II, CFP-10, GroES y MLSA. Adicionalmente, la presencia de Ag85b, LAM y ND-o-BSA fue
evaluada por medio de ensayos de ELISA. Así como en reportes previos, los niveles de reconocimiento de
Ag85b y MMP-II fueron altos para MB respecto a PB; la respuesta a CFP-10 y GroES fue mejor en MB que PB,
y se observó un ligero aumento en el patrón de reconocimiento de ND-o-BSA y LAM de MB respecto a PB.
De manera general, hay una correlación directamente proporcional entre los datos del BI y los patrones de
reconocimiento antigénico. Los resultados sugieren que es posible usar el panel de moléculas ensayadas
para hacer tanto el diagnóstico diferencial entre PB y MB, así como para el desarrollo de un método
diagnóstico temprano de la lepra.
META 9
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE RUBÉOLA.
Se amplificó la región del gen E1 más conservada de la cepa vacunal RA27/3 con los iniciadores R2 y R7
para obtener un fragmento de 185pb. Después de la electroforesis en gel se observa la banda de
aproximadamente 185pb que corresponde al producto de amplificación esperado.
Debido a que no se contó con una cantidad de muestras positivas adecuado, se realizó un ensayo de
especificidad utilizando la cepa vacunal RA27/3 como control positivo y virus de RNA que se diagnostican
en el Laboratorio de Pruebas Moleculares del InDRE. En la figura siguient se observan los productos de
amplificación esperados de 185pb únicamente para la cepa vacunal RA27/3, y no así para los otros virus
tratados bajo las mismas condiciones de reacción en la RT-PCR.
Electroferograma del producto amplificado por RT-PCR de la región del gen E1. Ensayo de especificidad con virus de Dengue, Sarampión y Fragmento de RNA de Poliovirus sintético. Carril 1 y 2: células Vero infectadas con el Virus de Rubéola/RA27; carril 3: células Vero infectadas con Rubéola/RA27/3 provenientes de un cultivo de la línea celular B95; carril 4: células Vero sin infectar; carril 5,6,7,8: cuatro virus estrechamente relacionados con el virus Dengue (D1, D2, D3 y D4 respectivamente); carril 10: células B95 infectadas con el virus del Sarampión; carril 11: células B95 no infectadas; carril 12,13,14: fragmentos de RNA de Poliovirus sintético de las cepas vacunales Pv1, Pv2, Pv3 respectivamente; carril 15 y 16: testigos positivos de células Vero infectadas con Rubéola/RA27; carril 17: control de reactivos; carril 18 y 19 fragmentos de DNA de 184pb; carril MV: Marcador de bajo peso molecular. Sensibilidad analítica
Se seleccionaron cuatro muestras obtenidas de los cultivos celulares infectados con la cepa vacunal
RA27/3 del VR de primero, segundo y tercer pase. En la figura siguiente se muestran los fragmentos
seleccionados y purificados de 185pb.
El fragmento de 185pb del gen E1 se ligó al vector pGEM-T Easy®, se transformaron células competentes de
E. coli DH5 alfa para obtener las clonas recombinantes por alfa complementación, de las cuales se extrajo
el DNA plasmídico por lisis alcalina.
Se realizó un análisis de restricción del gen E1 de rubéola RA27/3 a partir de la secuencia depositada en
GenBank de NCBI para verificar las enzimas de restricción que no tuvieran sitios de reconocimiento en este
gen y sirvieran para clonar el fragmento de 185 pb en pGEM, EcoRI no digiere el fragmento de interés.
Rubella virus E1 de RA27/3 DQ975202.1 Rubella virus E1 protein gene, partial cds TTCCATACGGAAACCAGGACCGTCTGGCAGCTCTCCGTAGCCGGCGTGTCGTGCAACGTCACAACCGAAC ACCCGTTCTGCAACACGCCGCACGGACAACTCGAGGTCCAGGTCCCGCCCGACCCCGGCGACCTGGTTGA GTACATCATGAATTACACCGGCAACCAACAGTCCCGGTGGGGCCTCGGGAGCCCGAACTGTCACGGCCCC GACTGGGCCTCTCCGGTTTGCCAGCGTCATTCCCCCGACTGTTCGCGGCTCGTGGGGGCCACGCCGGAGC GCCCCCGGCTGCGCCTCGTCGATGCCGACGACCCCCTTCTGCGTACTGCCCCGGGGCCCGGCGAGGTGTG GGTCACGCCTGTCATAGGCTCCCAGGCGCGCAAGTGCGGACTCCACATACGCGCCGGACCGTACGGCCAT GCCACCGTCGAGATGCCTGAGTGGATCCACGCCCACACCACCAGCGACCCCTGGCACCCGCCCGGCCCCC TGGGGCTGAAGTTCAAGACGGTCCGCCCGGTGGTCCTACCACGCGCGTTAGCGCCGCCTCGCAACGTGCG TGTAACTGGCTGCTACCAGTGCGGTACCCCCGCGCTGGTGGAGGGCCTTGCCCCAGGAGGAGGGAACTGC CATCTTACTGTTAACGGCGAGGACGTCGGCGCCTTCCCCCCTGGGAAGTTCGTCACCGCCGCCCTCCTCA ACACCCCCCCGCCCTACCAAGTGAGTTGCGGGGGCGAGAGCGATCGCGCCAGCGCGCGGGTCATTGACCC CGCCGCGCAATCGT
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 MV
185 pb
Secuencia de bases del gen E1 reportada el 16 de octubre de 2006, obtenida de GenBank. cDNA de 784pb y Mapa de restricción del gen E1 de Rubéola con la enzima Eco RI, esta enzima no digiere el fragmento de interés; se utilizaron las herramientas disponibles en REBASE. Secuencia obtenida por medio de un método automatizado con el iniciador universal T7 del plásmido
recombinante. La secuencia marcada corresponde al fragmento de 185pb del gen E1 del VR RA27/3.
pGEM-E1a ACGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTCAACACGCCGCACGGACAACTCGAGGTCCAGGTCCCGCCCGACCCCGGGGACCTGGTTGAGTACATTATGAACCACACCGGCAATCAGCAGTCCCGGTGGGGCCTCGGGAGCCCGAATTGCCATGGCCCCGATTGGGCCTCCCCGGTTTGCCAACGCCATTCCCCTGACTGCTCGCGGCTTGTGGAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCTGACGAGCATCACAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAACCCGACAGGACTATAAAGATACAGCT pGEM-E1b ACGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTCAACACGCCGCACGGACAACTCGAGGTCCAGGTCCCGCCCGACCCCGGGGACCTGGTTGAGTACATTATGAACCACACCGGCAATCAGCAGTCCCGGTGGGGCCTCGGGAGCCCGAATTGCCATGGCCCCGATTGGGCCTCCCCGGTTTGCCAACGCCATTCCCCTGACTGCTCGCGGCTTGTGGAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAgGAAAGATATGTGAGCAAAgGCCAGCAAAGGCAGGAACCGTAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCTGACGAGCATCACAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAACCCGACAGGACTATAAGATACAGGCGTTTCCCCTGG Resultados de la secuenciación de los fragmentos clonados E1a y E1b en el vector pGEM-T Easy®. Las secuenciación obtenida por medio de un método automatizado con el iniciador universal T7.
Las secuencias nucleotídicas obtenidas se compararon con las del GenBank a través del BLAST/blastx de la
NCBI, realizando alineamientos múltiples y comprobando que corresponden a un fragmento de 185pb de
la región diana del gen E1 de rubéola con una identidad máxima del 100% con la cepa vacunal RA27/3.
Una vez que se comprobó que el fragmento clonado correspondía a la cepa vacunal RA27/3 de rubéola,
el gen clonado en pGEM-T Easy® (cDNA-pGEM) fue linearizado con SalI y purificado para ser utilizado como
templete de DNA para llevar a cabo la transcripción in vitro, y con ello asegurar que el RNA sintético
obtenido corresponde al virus de rubéola y así poder cuantificarlo. Se muestran los plásmidos linearizados y
sin linearizar que tienen el fragmento de DNA del VR RA27/3.
Se utilizó el sistema de reactivos “Riboprobe® Transcripción in vitro” de Promega para realizar la reacción de
transcripción y obtener el RNA sintético con la RNApol del fago T7. Después del tiempo de reacción el
templete de DNA fue eliminado por digenstión con la DNasa de Promega RQ1 libre de RNasa que tiene
gran habilidad de degradar DNA mientras mantiene la integridad del RNA. Se utilizaron 4uL de templete de
DNA a una concentración de 640ug/mL (determinada espectrofotométricamente a 260nm).
Se realizaron diluciones seriadas del RNA sintético de 10-1 a 10-10, se cuantifica espectrofotométricamente
ya que una solución de RNA la cual contiene una OD260 = 1, contiene aproximadamente 40mg de RNA por
mL. se determinó el número de copias por mL (91ug/mL; 7.74 x 1013 copias por mL), cada una de las
diluciones se trató con transcriptasa reversa y se someten a las mismas condiciones de reacción de la RT-
PCR con los iniciadores R2 y R7 y una Tm = 61ºC, para determinar la dilución más alta a la cual son
detectados los transcritos de RNA.
Se trabajó a partir de una concentración final de 1.584x10-4ug de RNA/mL. Se determinó que el fragmento
de interés es amplificado hasta una dilución 10-7 la cual corresponde a una concentración de RNA de
1.584x10-11ug/mL, se determinó el número de copias por mL (91ug/mL; 7.74 x 1013 copias por mL) (Bosma &
Col., 1995) que corresponden a 13.47copias de RNA/mL.
Las conclusiones más importantes de este trabajo son: Los tres métodos extracción de RNA probados en
este estudio fueron adecuados para detectar al virus de la rubéola a partir del primer pase en cultivos
celulares. Sin embargo, con el equipo de reactivos de Qiagen se obtuvieron los mejores resultados. 2) Las
condiciones de reacción de la RT-PCR establecidas en este estudio son específicas para el virus de la
rubéola, lo cual fue demostrado al trabajar bajo las mismas condiciones con otros virus de RNA, en donde
únicamente se obtuvo el producto de amplificación de 185pb del gen E1 en la muestra del virus de rubéola.
3) La especificidad de la RT-PCR se corroboró además por medio de la determinación de la secuencia
nucleotídica del fragmento de cDNA de 185 pb del gen E1 del virus de rubéola RA27/3 y algunas muestras
clínicas, en donde se obtuvo una identidad con secuencias del virus de rubéola depositadas en GenBank
del 100%.
La sensibilidad analítica en este trabajo fue de 13.47 copias de RNA/mL en la detección del virus de
rubéola.
METAS 10
Pseudomonas aeruginosa es considerada un serio problema en los hospitales, ya que presenta resistencia a
una gran diversidad de antibióticos y desinfectantes, lo que complica el control de la diseminación de este
microorganismo entre individuos susceptibles. La adquisición de beta lactamasas de espectro extendido,
como las metalo beta lactamasas, son un mecanismo importante de resistencia en P. aeruginosa. Así
mismo la identificación cada vez más frecuente de genes de resistencia asociados con casetes, como
causa de brotes de infecciones bacterianas intrahospitalarias, se ha atribuido a la presencia de elementos
genéticos móviles entre los que destacan los integrones. En la actualidad, los integrones de resistencia se
consideran responsables de la acumulación y diseminación de casetes génicos de resistencia, además de
despertar un gran interés por su implicación en la resistencia que presentan las bacterias a antibióticos
nuevos tales como las cefalosporinas de amplio espectro, carbapenémicos y quinolonas. El objetivo de
este estudio fue demostrar la presencia del gen blaVIM el cual codifica para una metalo beta lactamasa y
el gen int1 que codifica para la integrasa de integrones tipo 1, en cepas nosocomiales de P. aeruginosa. Se
estudiaron 24 cepas de origen intrahospitalario de P. aeruginosa, de las cuales 14/24 fueron multirresistentes
desde 19 a 21 de los antibióticos probados, los cuales son utilizados en la terapéutica contra este agente
infeccioso.
Se amplificó por medio de la PCR el gen blaVIM, utilizando iniciadores previamente reportados, y se
diseñaron iniciadores degenerados a partir de las secuencias nucleotídicas del gen int reportadas en el
Gen Bank. Los amplicones obtenidos se purificaron y se secuenciaron por un método automatizado. El
análisis de las secuencias obtenidas corroboró la identidad del gen blaVIM en 12 de las 24 cepas analizadas,
el cual codifica una metalo BETA lactamasa de tipo VIM. Así como en 3 de las 24 cepas en estudio se
detectó el gen int1, presente en integrones tipo 1. Este es el primer hallazgo en México de la presencia de
blaVIM, lo cual es una llamada de atención en la necesidad de un control más estricto en el uso de los
antibióticos en el ámbito hospitalario.
