ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGIA Y

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGIA Y

PARASITOLOGIA

Efecto in vitro de Rhizobium etli sobre la germinación y

el crecimiento de Spinacia oleracea “espinaca”

TESIS

PARA OBTENER EL TITULO PROFESIONAL DE:

BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO

AUTORA: Br. MAYTE DORIS GALVAN LEON

ASESORA: Dra. BERTHA SOLEDAD SORIANO BERNILLA

TRUJILLO – PERÚ

2014

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.

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i

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

QUE OTORGAN EL TITULO PROFESIONAL DE

BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO

Dr. Orlando Velásquez Benites

RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Dra. Vilma Julia Méndez Gil

VICERRECTORA ACADÉMICA

Dr. Santiago Uceda Duclos

SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO



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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dr. José Mostacero León

DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dr. William Zelada Estraver

SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dra. Bertha Soriano Bernilla

DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE

MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.



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PRESENTACIÓN

SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO:

En cumplimiento a las disposiciones establecidas por el reglamento de Grados y Títulos

de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, presento a

vuestra consideración y claro discernimiento la presente Tesis titulada: Efecto in vitro

de Rhizobium etli sobre la germinación y el crecimiento de Spinacia oleracea

“espinaca” para obtener el Título de Biólogo- Microbiólogo.

Trujillo, Mayo 2014



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MIEMBROS DEL JURADO

Ms.C. Juan Wilson Krugg

Presidente


Secretaria

Ms.C. Eduardo Muñoz Ganoza

Vocal



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APROBACIÓN

Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que la

presente tesis ha cumplido con los requerimientos formales y fundamentos teóricos,

siendo aprobada por UNANIMIDAD

Ms.C. Juan Wilson Krugg

Presidente


Secretaria

Ms.C. Eduardo Muñoz Ganoza

Vocal



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DEL ASESOR

La que suscribe, Asesora de la presente tesis titulada: Efecto in vitro de

Rhizobium etli sobre la germinación y el crecimiento de Spinacia oleracea “espinaca”

CERTIFICA:

Que la investigación ha sido ejecutada de acuerdo al reglamento establecido por

la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en

conformidad con su correspondiente proyecto y que el informe ha sido redactado

acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.

Por lo tanto, autorizo a Mayte Doris Galván León, continuar el trámite del

reglamento correspondiente.

Trujillo, Mayo del 2014


Asesora



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DEDICATORIA

Dedico este trabajo a mis padres,

por su apoyo, comprensión,

cariño demostrado en cada

momento de mi vida, la

culminación de este trabajo es mi

regalo para ellos

También quiero dedicar este

trabajo a mis dos únicos

hermanos que siempre me

apoyaron, demostrándome que

nunca estuve sola en la realización

de esta tesis.



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AGRADECIMIENTO

A mi asesora Dra. Bertha Soriano Bernilla por la confianza brindada, apoyo

incondicional, enseñanza y orientación durante el transcurso del proceso y ejecución de

la tesis.

A mis amigos que me brindaron su apoyo y entusiasmo durante, por brindarme

su compañía e incondicional amistad.

A mis profesores de la Escuela Académica Profesional Microbiología y

Parasitología, por su dedicación y entrega, por transmitir y enseñarme cuán valiosa es la

profesión que escogí.



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RESUMEN

Se evaluó el efecto in vitro de Rhizobium etli sobre la germinación y el crecimiento

de Spinacia oleracea “espinaca”. Para lo cual se reactivó el cultivo de R. etli en agar

extracto de levadura manitol rojo de congo a 28ºC por 4 días. El efecto de R. etli sobre

la germinación de semillas de S. oleracea L. se realizó inoculando 100 uL de una

suspensión bacteriana de R. etli Rf 167-01 aproximada a 1,2x109 cel/mL a las semillas

y 100 uL de agua destilada estéril a las semillas que constituyeron el control; se dejó

germinar por 10 días, evaluando luego el porcentaje de germinación, longitud de

hipocotilo y radícula. El efecto sobre el crecimiento de las plántulas de S. oleracea L, se

realizó inoculando 1 mL de la suspensión de R. etli Rf-167-01 a una concentración de

1,2x109 cel/mL, a cada semilla germinada de S. oleracea L. y 1 mL de agua destilada

estéril a las semillas que constituyeron el control, posteriormente cada semilla

inoculada fue sembrada en cada pocillo del germinador que contenía tierra estéril. A

los 20 días de inoculación se evaluó la longitud de tallo, hoja, raíz, peso seco total, peso

seco de la parte aérea y peso seco de la parte radicular de las plántulas. Estos datos

obtenidos fueron procesados estadísticamente, obteniéndose sólo diferencia significativa

en el peso seco de la parte radicular en el tratamiento inoculado con R. etli Rf 167-01.

Según los resultados obtenidos se tiene que la bacteria de R. etli Rf-167-01 tiene un

efecto positivo sobre el crecimiento de la raíz de las plántulas de S. oleracea L

“espinaca”.

Palabras Clave: Rhizobium etli, Spinacia oleracea, inoculación



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ABSTRACT

The in vitro effect of Rhizobium etli on germination and growth of Spinacia

oleracea “spinach " was evaluated. For which the culture of R. etli was reactivated

yeast extract agar mannitol congo red at 28 ° C for 4 days . R. etli effect on germination

of seeds of S. oleracea L. was performed by inoculating 100 uL of a bacterial

suspension of R. etli Rf 167-01 approximately 1.2 x109 cells / ml to seed and 100 uL of

water sterile distilled seeds within the control ; allowed to germinate for 10 days, then

evaluating the germination percentage , radicle and hypocotyl length . The effect on

seedling growth of S. oleracea L , was made by inoculating 1 mL of the suspension of

R. etli Rf -167- 01 at a concentration of 1.2 x109 cells / mL , to each germinated seed of

S. oleracea L. and 1 mL of sterile distilled water to the seeds within the control , then

each inoculated seed was sown in each well containing sterile soil germinator . At 20

days of inoculation the length of stem, leaf , root, total dry weight , dry weight of shoot

and root dry weight of the seedlings was evaluated. These data were statistically

processed , yielding a significant difference in the dry weight of the root part in the

treatment inoculated with R. etli Rf 167-01 . According to the obtained results, the

bacterium of R. etli Rf -167 -01 has a positive effect on root growth of seedlings of

S. oleracea L " spinach " .



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INDICE

Pág.

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

QUE OTORGAN EL TÍTULO DE BIOLÓGO-MICROBIÓLOGO………..………….i

AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS………………ii

PRESENTACIÓN………………………………………………………………………iii

MIEMBROS DEL JURADO.……………………………………………………..……iv

APROBACIÓN……………………………………………………………..…………...v

DEL ASESOR…………………………………………..………………………………vi

DEDICATORIA……………………………………………………………………......vii

AGRADECIMIENTO……………………………………………...………………….viii

RESUMEN……………………………………………………………...………………ix

ABSTRACT……………………………………………………………………………..x

INDICE GENERAL.……………………………………………………………………xi

I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………….1

II. MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………..7

2.1. MATERIAL DE ESTUDIO………………………………………………...7

2.2. PROCEDIMIENTO………………………………………………………....7

2.2.1 Reactivación del cultivo bacteriano……………………………….....7

2.2.2 Determinación de la pureza del cultivo………………………….......7

2.2.3 Propagación del cultivo ……………………………………………..8

2.2.4 Preparación de la suspensión bacteriana de R. etli Rf 167-01……….8



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2.2.5 Tratamiento de las semillas de S. oleracea L.……………….………8

2.2.6 Determinación del efecto in vitro de R. etli Rf 167-01 sobre la

germinación de semillas de S. oleracea L…………………………...8

2.2.7 Evaluación del efecto de R. etli Rf 167-01 sobre la germinación de

S. oleracea L…………………………………………………………9

2.2.8 Tratamiento del suelo………………………………………………..9

2.2.9 Determinación del efecto in vitro de R. etli Rf 167-01 sobre el

crecimiento de semillas de S. oleracea L…………………………..10

2.2.10 Evaluación del efecto in vitro de R. etli Rf 167-01 sobre el

crecimiento de plántulas de S. oleracea L………………………….10

2.2.11 Recolección de datos……………………………………………….10

2.2.12 Análisis de datos……………………………………………………11

III. RESULTADOS………………………………………………………………...12

IV. DISCUSIÓN……………………………………………………………………23

V. CONCLUSIONES ……………………………………………………………..28

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………....29

ANEXOS



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I. INTRODUCCIÓN

El suelo es uno de los recursos más utilizados en la agricultura para satisfacer las

necesidades de alimento de la población; además de su gran complejidad y debido a su

estructura, función y a la forma en que sus componentes biológicos y minerales se

organizan, el suelo presenta diferentes regiones funcionales. [1]

Actualmente es de gran

interés restaurar la microflora del suelo mediante estrategias que permitan mejorarlo en

relación a la productividad agrícola y de una manera no contaminante. Sin embargo, la

forma más común de incorporar nutrientes al suelo ha sido, en las últimas décadas, en

forma de fertilizantes químicos. [2]

Los fertilizantes son componentes esenciales en la agricultura moderna, no

obstante, el abuso en su utilización genera residuos que producen salinización,

problemas en el drenaje, compactación del suelo y disminución de la actividad

microbiana comprometida en la nutrición vegetal. Cada año se incrementa la cantidad

de fertilizantes aplicados debido a la menor eficiencia de adsorción en el suelo y

absorción por la planta, aumentando los costos de producción. Asimismo, se genera un

problema ambiental debido a la producción de gases tóxicos que se desprenden de los

fertilizantes como los óxidos de nitrógeno que dañan la capa de ozono. [3]

El uso indiscriminado de estos insumos inorgánicos ha alterado también los

constituyentes orgánicos y vivos del suelo, y con ello su equilibrio ecológico,

modificando principalmente las actividades metabólicas de las diferentes poblaciones

microbianas del agroecosistema.[2]

Debido al impacto negativo sobre el medio ambiente

y al alto precio en el mercado internacional que tienen los fertilizantes y pesticidas

químicos, los agricultores del mundo entero, especialmente los de países

subdesarrollados se interesan cada día más por la biofertilización de los cultivos con el

fin de mejorar el rendimiento.[2]

Como una alternativa a los fertilizantes químicos está la posibilidad de utilizar

bacterias del suelo, que como parte de su metabolismo incrementan la fertilidad y

benefician a las plantas.[3]

El suelo en un hábitat complejo donde un gran número de



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poblaciones microbianas interactúan con los diversos sustratos, estando muchas de estas

poblaciones asociadas a las raíces de las plantas en la zona rizosférica.[2]

En los

microambientes de esta zona están asentadas poblaciones microbianas asociadas a la

presencia de los exudados radicales y que participan en la formación de los

microagregados rizosféricos ricos en metabolitos microbianos principalmente del tipo

aminoácidos y polisacáridos.[2]

Todas aquellas bacterias que habitan en las raíces de las plantas y que influyen

sobre el crecimiento de éstas de manera positiva indirecta o directamente por cualquier

mecanismo, se denominan o refieren como rizobacterias promotoras del crecimiento

vegetal (PGPR) término propuesto por Kloepper .[4]

, al incrementar la disponibilidad de

nutrientes al producir sustancias biológicamente activas como hormonas

vegetales.[2,3,5,6]

La rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) son

bacterias benéficas que se presentan como una alternativa a los fertilizantes químicos y

plaguicidas. Estas poblaciones microbianas rizosféricas son capaces de ejercer efectos

específicos sobre el crecimiento vegetal como la producción de fitohormonas,

disolución y mineralización de los fosfatos, fijación asimbiótica del nitrógeno

atmosférico y producción de sideróforos y antibióticos. [2, 3,5]

Un amplio número de

géneros bacterianos están considerados dentro de esta clasificación: Agrobacterium,

Alcaligenes, Arthobacter, Erwinia, Flavobacterium, Hafnia, Kliebsiella, Serratia,

Xanthomonas, Azospirillum, Clostridium, Pseudomonas, Acetobacter, Burkholderia,

Bacillus, Burkholderia, Bacillus, Rhizobium, Herbaspirillum, Enterobacter y

Azotobacter, Rhizobium entre otros. [7]

Según Kloepper las PGPR pueden ser: Bioprotectores (supresión de

enfermedades de plantas), Biofertilizantes (aumentar la capacidad de adquisición de

nutrientes) y Bioestimulantes (producción de fitohormonas).[4]

Posteriormente, Bashan

y Holguin propusieron una nueva clasificación para las PGPR, que incluye a todas las

bacterias benéficas teniendo en cuenta su papel particular, de tal forma, que el termino

se divide en PGPB (Plant growth promoting bacteria- bacterias promotoras del

crecimiento de las plantas) y biocontrol-PGPB (Biocontrol-plant growth promoting

bacteria-bacterias promotoras del crecimiento de las plantas con actividad de

biocontrol).[8]



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La competencia por nutrientes genera en la rizósfera interacciones microbianas

acordes al metabolismo de la planta debido a la liberación de sustancias difusantes,

secreciones, lisados, gases y mucilagos. El establecimiento de poblaciones competitivas

de microorganismos promotores del crecimiento de las plantas depende principalmente

de aspectos puntuales como la colonización rizosférica de la planta, dada por la

liberación de sus exudados radicales y la capacidad de respuesta genética y

quimioatrayente del microrganismo hacia la rizósfera.[2]

La conjunción de ambos

mecanismos de acción han dado como resultado la promoción evidente del crecimiento

en plantas; observándose un incremento en la emergencia, el vigor y el peso, un mayor

desarrollo en sistemas radiculares y un incremento hasta el 30% en la producción de

cultivos de interés comercial, tales como papa, rábano, trigo y soja.[9]

Dentro del grupo de rizobacterias promotoras del crecimiento en plantas (PGPR)

se incluyen a los rizobios. [10,11]

Estas bacterias se caracterizan por su habilidad de

facilitar directa o indirectamente el desarrollo de la raíz y del follaje de las plantas. La

estimulación indirecta del crecimiento de plantas incluye una variedad de mecanismos

por los cuales la bacteria inhibe la acción fúngica sobre el crecimiento y desarrollo de la

planta. [2,11]

En la estimulación directa se encuentra: la producción de promotores de

crecimiento vegetal, como auxina, giberelinas, etileno, ácido abscísico y citoquinas, [9]

pequeñas moléculas que afectan el desarrollo y crecimiento vegetal a muy bajas

concentraciones. Las auxinas son reguladores esenciales del crecimiento y desarrollo

vegetal. El ácido indol acético (AIA) es la auxina más estudiada debido a su clara

acción en la formación de dominios apicales, diferenciación vascular y en el desarrollo

de órganos. [12,13]

Varios géneros bacterianos han sido reportados como productores de

AIA, entre los cuales se pueden citar Azotobacter sp., Pseudomonas sp., Bacillus sp.,

Azospirillum sp. y Rhizobium sp. [14]

La capacidad PGPR de Rhizobium sp. ha sido estudiada por varias décadas, sin

embargo, en los últimos años este estudio ha sido intensificado, porque la agricultura

sustentable demanda mejorar la eficiencia de la fijación de nitrógeno a través de uso de

bacterias competitivas capaces de extender la ventaja de las simbiosis a otros cultivos

no leguminosas. [11, 15,16]



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Rizobacterias simbióticas como Rhizobium sp. u otras de vida libre han sido

empleadas extensivamente como biofertilizantes para mejorar la el crecimiento en

hortalizas como tomate (Lycopersicum esculentum), cebolla (Allium cepa L.) y maíz

(Zea mays L). [10,11]

Las asociaciones entre rizobios y plantas no leguminosas pueden

mejorar el crecimiento de las plantas, aunque no se ha demostrado que sea mediante la

fijación de nitrógeno, sino más bien con la capacidad de aumentar la disponibilidad de

nutrientes en el suelo, como el fósforo, mediante la producción de ácidos orgánicos

capaces de solubilizar los fosfatos que forman complejos insolubles con las bases del

suelo. Los ácidos orgánicos producidos por las bacterias promotoras del crecimiento

incrementan también la disponibilidad de micronutrientes como el hierro (Fe) en la zona

de la rizósfera. El hierro a su vez puede ser captado por sideróforos, moléculas

orgánicas secretadas por estas bacterias, con las que forman quelatos que pueden ser

asimilados por las plantas. [17,18]

Algunos investigadores reportaron efectos positivos en cultivos de alfalfa después

de la inoculación de sideróforos producidos por Pseudomonas, Rhizobium y

Azospirillum (bacterias cultivadas en condiciones limitantes de hierro) se inóculo en las

semillas de alfalfa incrementando su germinación así como el peso seco de la raíz y

tallo. [19]

En el 2006 autores como Graciano, aislaron 43 cepas de Azospirillum spp. y

50 cepas de Rhizobium spp. de la rizósfera, rizoplano, raíz estéril, tallo y semillas de

maíz, todos estos aislamientos sintetizaron diferentes proporciones de sustancias

reguladoras del crecimiento vegetal además se detectó la producción de sideróforos en

20 y 90% de las cepas estudiadas. [20]

Entre las plantas, las hortalizas constituyen un grupo de cultivos fundamentales de

la producción agrícola, representando un renglón importante desde los puntos de vista

tanto económico como social para muchos países, al jugar un papel importante en la

alimentación humana por su riqueza en vitaminas, ácidos orgánicos fácilmente

asimilables, sales minerales y aceites esenciales, lo que ha motivado el incremento

continuo de su producción a escala mundial. [2, 21,22]

Spinacia oleracea “espinaca” es uno de los cultivos hortícolas más importantes.

[23] Es una hortaliza perteneciente a la familia Chenopodiaceae, originaria del centro de

Asia, donde se ha cultivado por más de 1300 años. [24, 25,26]

Tiene un alto valor



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nutricional debido a sus valores de Fe y vitamina A, así como una elevada actividad

antioxidante, por su contenido en ácido ascórbico, tocoferol, carotenoides y diversos

compuestos fenólicos. [24,25]

En el Perú, la producción de espinaca está en crecimiento, tanto en superficie

como en productividad con un rendimiento promedio anual de 18 561 t/ha. [23]

Uno de

los principales limitantes de su produccion son las plagas y enfermedades, entre las

cuales se reportan : mildeo velloso (Peronospora farinosa), Cladesporium sp.,

Phythium sp. y Alternaria sp. El mildiu o “cenicera” (Peronospora farinosa) es la

principal enfermedad que afecta la espinaca, debido a las condiciones climáticas que

favorecen su desarrollo y a que este patógeno puede sobrevivir en suelo y en semillas

por largo tiempo. [27]

Pese a su importancia, son escasas las investigaciones en este cultivo, debido a

que se siembra en rotación con cultivos de más largo periodo y se cultiva en pequeñas

áreas. Por su rápido crecimiento y ser un cultivo de hoja, la producción es muy

dependiente de fertilización nitrogenada o aplicación de estiércol antes de la siembra,

factores que pueden ser limitantes en cuanto a costo y disponibilidad. [25]

Si bien podría mejorarse la producción usando la fertilización química; en la

actualidad el mercado internacional muestra una tendencia a dejarlos de lado.

Recientemente, se encontró que, el uso de biofertilizantes es un medio barato para

suministrar a las plantas nitrógeno y fósforo durante el crecimiento, y así sustituir en

parte la costosa aplicación de fertilizantes químicos conduciendo a la significativa

disminución de los costos de producción. [28]

El uso de biofertilizantes y bioestimulantes

ha mejorado la comprensión de la relación planta microorganismo en su contribución a

minimizar los riesgos de degradación de suelos y a maximizar el regreso de energía a

los sistemas de producción. Estas consideraciones han tomado importancia en los

últimos años para establecer las fronteras a la agricultura, no solo desde el punto de

vista de lograr una máxima producción sostenida, sino buscando la estabilización de los

sistemas de producción a largo plazo. [29]

Actualmente existen muchas publicaciones del

uso de estos microorganismos en cultivos como el tomate, arroz, lechuga, maíz entre

otros. [30]



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La cuarta región con la mayor producción de espinaca es La Libertad, siendo su

producción anual de espinaca de 901 toneladas.[31]

En comparación con otros cultivos

sembrados en esta región, la producción de espinaca es menor, debido a que esta

hortaliza es una especie exigente en cuanto a calidad de suelo y nutrientes, requiriendo

cantidades elevadas de nitrógeno y fósforo, los cuales son suministrados a través de

fertilizantes químicos suponiendo de esta manera un gran costo para la economía de los

agricultores y produciendo consecuencias negativas en el ambiente que repercute sobre

todo en la degradación de los suelos de cultivo de esta hortaliza. En la última década ha

tomado auge, tanto por razones económicas como ecológicas, el empleo de los

biofertilizantes en la producción agrícola de la espinaca, sin embargo en la región los

estudios relacionados con la aplicación de biofertilizantes para este cultivo son escasos.

Numerosos reportes han descrito la asociación benéfica entre plantas y rizobios,

en las que aplicados a la semilla, al suelo o a la planta, colonizan la raíz, la rizósfera o

ambos, promueven el crecimiento de las plantas e incrementan la absorción y

disponibilidad de nutrientes del suelo, estos microorganismos pueden ser empleados

como biofertilizantes en cultivos. Se ha reportado que ciertas cepas de Rhizobium

inoculadas en plántulas de hortalizas como el tomate y la lechuga aumentaron su

germinación y crecimiento debido a la producción de hormonas que promueven el

desarrollo radical o vegetativo [6,11]

, sin embargo el efecto de cepas Rhizobium para

promover la germinación y el crecimiento de plantas no leguminosas como S. oleracea

“espinaca” no es aun conocida.

En una búsqueda de estrategias enmarcadas en el manejo sostenible de rubros

hortícolas, se pretende utilizar a especies del género Rhizobium, a fin de que este

microorganismo sea utilizado como fertilizante biológico en el cultivo de esta hortaliza;

por ello y según los antecedentes que se presentan, el presente trabajo tiene como

objetivo determinar el efecto in vitro de Rhizobium etli sobre la germinación y el

crecimiento de Spinacia oleracea “espinaca”; evaluando los parámetros agronómicos:

porcentaje de germinación, así como longitud de hipocotilo y radícula a los 10 días

después de inoculadas las semillas; la longitud de tallo, hoja, raíz, peso seco total, aéreo

y radicular de las plántulas a los 20 días después de inoculadas; contribuyendo de esta

manera en mejorar su rendimiento, y producción en la región.



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II. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1. MATERIAL DE ESTUDIO

2.1.1 R. etli Rf-167-01 aislado a partir de nódulos de leguminosas de la región

Norte del Perú, procedente del Laboratorio de Microbiología

Ambiental, Departamento Académico de Microbiología y Parasitología,

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Trujillo.

2.1.2 Semillas de Spinacia oleracea L. “espinaca” HORTUS S.A. obtenidas en

la Agropecuaria Chimú S.R.L. ubicado en Av. César Vallejo 220,

Trujillo.

2.2. PROCEDIMIENTO

2.2.1. Reactivación del cultivo bacteriano

A partir de un cultivo puro de R. etli Rf 167-01 se sembró por la

técnica de estría en placas Petri que contenían 15 ml de agar extracto de

levadura manitol rojo de congo (ELMARC) y se incubó a 28º C durante

4 días (Anexo 01).

2.2.2. Determinación de la pureza del cultivo

Se determinó la pureza a partir de una colonia aislada de R. etli Rf

167-01 la cual se sembró por la técnica de estría en frascos de penicilina

que contenían 5 ml de los siguientes medios: agar peptona glucosa-

púrpura de bromocresol (PG-PBC), se utilizó para diferenciarlos de los

contaminantes (Anexo 02); agar extracto de levadura lactosa (LLA).

Después de sembrada la colonia se incubó a 28º C durante 4 días. Al

medio LLA se le añadió el reactivo de Benedict (Anexo 03).



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2.2.3. Propagación del cultivo

A partir del cultivo puro de R. etli Rf 167-01 se procedió a la

propagación en frascos planos de vidrio conteniendo Agar ELMA y se

incubó a 28°C, respectivamente, durante tres días

2.2.4. Preparación de la suspensión bacteriana de R. etli Rf-167-01

A partir de los frascos de propagación de la bacteria se realizó una

suspensión de R. etli Rf-167-01 en un volumen de 60 mL y a una

concentración aproximada de 1,2x109

cel/mL, comparado con el tubo N°

04 del sistema de Mac Farland (Anexo 04). Se sembró al mismo tiempo

por incorporación en Agar ELMARC para recuento inicial de UFC/mL.

2.2.5. Tratamiento de las semillas de S. oleracea L.

Las semillas se lavaron dos veces con agua corriente para eliminar las

impurezas presentes en su superficie. Luego, se sumergieron en alcohol

al 70% durante 30 segundos, se lavó las semillas tres veces con agua

destilada estéril, se desinfectó con hipoclorito de sodio al 2.25% durante

3 minutos y luego se lavaron cinco veces consecutivas con agua destilada

estéril.

2.2.6. Determinación del efecto in vitro de R. etli Rf 167-01 sobre la

germinación de semillas de S. oleracea L.

En una placa petri se colocó una capa de algodón recubierta con

papel de filtro estéril y se agregó 5 mL de Agua destilada estéril (ADE).

En la placa se colocó 10 semillas de S. oleracea L, se inoculó 100 uL de

suspensión de R. etli Rf 167-01 por semilla, la placa se tapó y se dejó a

temperatura ambiente, constituyendo el grupo experimental.

Simultáneamente se instaló un grupo control al cual se agregó ADE a las

semillas. Se realizó tres repeticiones por cada grupo y se emplearon tres

placas petri por repetición. Se realizó observaciones diarias y se tomó



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mediciones a partir de la aparición visible de la radícula durante 10 días

(Anexo 05).

2.2.7 Evaluación del efecto de R. etli Rf 167-01 sobre la germinación de

S. oleracea L.

La evaluación del efecto de R. etli Rf-167-01 sobre la germinación

de semillas de S. oleracea L. se realizó teniendo en cuenta:

Criterio de germinación : la aparición visible de la radícula

(2 mm de longitud).[31]

Porcentaje de germinación (Anexo 06).

Se tomó medida tanto del hipocotilo como de la radícula

(Anexo 07, Anexo 08).

2.2.8 Tratamiento del suelo

2.2.8.1 Evaluación de los parámetros físicos - químicos del suelo.

Se determinó los parámetros físicos y químicos del suelo como:

textura, pH, conductividad eléctrica, materia orgánica, concentración de

nitrógeno, fósforo y potasio en Laboratorio de Servicios a la Comunidad

e Investigación (LASACI), Universidad Nacional de Trujillo (Anexo 09).

2.2.8.2 Preparación del suelo para la siembra de semillas.

El suelo utilizado para la siembra de las semillas en un

volumen aproximado de 8 kg, se tamizó y esterilizó en autoclave por 45

minutos. Luego se distribuyó en los recipientes para los diferentes

tratamientos de estudio.



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10

2.2.9 Determinación del efecto in vitro de R. etli Rf 167-01 sobre el

crecimiento de S. oleracea L.

2.2.9.1 Inoculación de la suspensión bacteriana en S. oleracea L.

La inoculación de los tratamientos se realizó de la

siguiente manera (Anexo 10):

Tratamiento 1: Control, se inoculó 1 mL de agua destilada

estéril a cada semilla germinada de S. oleracea L.

Tratamiento 2: Se inoculó 1 mL de la suspensión de R. etli Rf-

167-01 a una concentración de 1,2x109 cel/mL, a cada semilla

germinada de S. oleracea L.

2.2.9.2 Siembra de las semillas de S. oleracea L. en el suelo.

Las semillas se sembraron en los recipientes con suelo

agrícola estéril a una profundidad de 0.5 cm y a razón de 1

semilla por pocillo. Se regó con solución de Jensen stock 1/5 y

ADE.

2.2.10 Evaluación del efecto in vitro R. etli Rf 167-01 sobre el crecimiento de

plántulas S. oleracea L.

La evaluación del efecto de R. etli Rf-167-01 sobre las plántulas de

S. oleracea L. se determinó mediante la evaluación de variables

agronómicas: longitud de las hojas, tallo, raíz así como el peso de la

materia seca de la parte aérea, radicular y total de la plántula (Anexo 11).

2.2.11 Recolección de datos

A los 20 días de la inoculación bacteriana se cosecharon las

plántulas de S. oleracea L. y se procedió a la recolección de datos de

cada una de las variables agronómicas descritas anteriormente. Las

plántulas fueron lavadas con agua corriente para eliminar los restos del



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suelo presentes en las raíces, se midió la longitud del tallo y de las hojas

(Anexo 12 - 14).Posteriormente, la parte aérea fue separada de la raíz

para ser secadas en el horno a 60ºC por 48 h y se determinó el peso seco

en una balanza analítica (Anexo 15-17). Los valores obtenidos de la

evaluación se organizaron en tablas y figuras.

2.2.12. Análisis de datos

Los datos obtenidos de la evaluación de la germinación de

semillas y de los parámetros agronómicos evaluados en las plántulas de

los tratamientos control y experimental se procesaron mediante la prueba

de Análisis de Varianza Unidireccional (ANOVA) para determinar las

diferencias significativas entre los tratamientos (Anexo 18 - 22).



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III. RESULTADOS

En la figura 1 se muestra el porcentaje de germinación de las semillas de

S. oleracea L. a los 10 días de la inoculación bacteriana in vitro con Rhizobium etli Rf

167-01, donde se aprecia un mayor porcentaje de germinación el inoculado con R. etli

Rf 167-01 en relación al control.

En la figura 2 se muestra la longitud promedio de hipocotilo de semillas de

S. oleracea L. “espinaca” a los 10 días de inoculación con R. etli Rf 167-01 in vitro y

donde se observa una mayor longitud en la inoculación con la bacteria en comparación

al control, pero no existe diferencia significativa entre ambos.

En la figura 3 se muestra la longitud promedio de radícula de semillas de

S. oleracea L. “espinaca” a los 10 días de inoculación con R. etli Rf 167-01 in vitro y

donde se observa una mayor longitud radicular en el inoculado con la bacteria en

comparación al control, pero no existe diferencia significativa entre ambos.

En la figura 4 se muestra el promedio de la longitud de tallo de plántulas de

S. oleracea L. “espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli Rf 167-01

in vitro, donde se observa una mayor longitud en el inoculado con la bacteria en


En la figura 5 se muestra el promedio de la longitud de hojas de las plántulas de




En la figura 6 se muestra el promedio de la longitud de la raíz de las plántulas de



comparación al control, no existiendo diferencia significativa entre ambos.

En la figura 7 se muestra el promedio de peso seco total de las plántulas de




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in vitro, donde se observa un mayor peso en el inoculado con la bacteria en


En la figura 8 se muestra el promedio de peso seco de la parte radicular de las

plántulas de S. oleracea L. “espinaca” a los 20 días después de la inoculación con

R. etli Rf 167-01 in vitro, donde se observa un mayor peso seco radicular en el

inoculado con la bacteria en comparación al control, existiendo diferencia significativa

entre ambos.

En la figura 9 se muestra el promedio de peso seco de la parte aérea de las

plántulas de S. oleracea L. “espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli

Rf 167-01 in vitro, donde se observa un mayor peso seco aéreo en el inoculado con la

bacteria en comparación al control, pero no existe diferencia significativa entre ambos.



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Figura 1. Porcentaje de germinación de S. oleracea L. “espinaca” después de

inoculados con R. etli Rf 167-01 in vitro.

0.0%

10.0%

20.0%

30.0%

40.0%

50.0%

60.0%

70.0%

80.0%

90.0%

100.0%

Control R. etli

78.00% 84%

Po

rce

nta

je d

e g

erm

inac

ion

(%

)

p>0,05

Control

R. etli



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15

15.5

16

16.5

17

17.5

18

18.5

19

Control R.etli

16.81

18.53

Lon

gitu

d h

ipo

coti

lo(m

m)

p>0,05

Control

R.etli

Figura 2. Longitud promedio de hipocotilo (mm) de S. oleracea L. “espinaca” a los

10 días de inoculación con R. etli Rf 167-01 in vitro.



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Figura 3. Longitud promedio de la radícula (mm) de S. oleracea L. “espinaca” a los

10 días de inoculación con R. etli Rf 167-01 in vitro.

20.5

21

21.5

22

22.5

23

23.5

Control R. etli

21.68

23.19

Lon

gitu

d r

adic

ula

(mm

)

p>0,05

Control

R. etli



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Figura 4. Promedio de la longitud de tallo (mm) de plántulas de S. oleracea L.

“espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli Rf 167-01 in

vitro.

47

48

49

50

51

52

53

54

55

CONTROL R. etli

49.9

54.85

Lon

gitu

d d

e t

allo

(mm

)

p>0,05

CONTROL

R. etli



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Figura 5. Promedio de la longitud de hojas (mm) de plántulas de S. oleracea L.


vitro.

28.6

28.7

28.8

28.9

29

29.1

29.2

29.3

29.4

29.5

CONTROL R. etli

28.9

29.45

Lon

gitu

d d

e h

oja

(mm

)

p>0,05

CONTROL

R. etli



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Figura 6. Promedio de la longitud de raíz (mm) de plántulas de S. oleracea L.


vitro.

.

18

19

20

21

22

23

24

25

CONTROL R. etli

20.19

24.04

Lon

gitu

d d

e r

aiz(

mm

)

p>0,05

CONTROL

R. etli



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Figura 7. Promedio del peso seco total (mg) de las plántulas de S. oleracea L.


vitro.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

control R.etli

3.56

4.61

Pe

so s

eco

to

tal(

mg)

p>0,05

control

R.etli



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Figura 8. Promedio del peso seco (mg) de la parte radicular de las plántulas de

S. oleracea L. “espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli

Rf 167-01 in vitro.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

CONTROL R. etli

0.75

1.04

Pe

so s

eco

rai

z(m

g)

p<0,05

CONTROL

R. etli



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Figura 9. Promedio del peso seco (mg) de la parte aérea de las plántulas de S. oleracea

L. “espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli Rf 167-01 in

vitro.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

CONTROL R. etli

2.9

3.6

Pe

so s

eco

ae

reo

(m

g)

p>0,05

CONTROL

R. etli



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IV. DISCUSIÓN

En la actualidad, la agricultura, plantea reducir la utilización de fertilización

química sobre la hortaliza S. oleracea, mediante el uso de microorganismos

competitivos, capaces de ser usados como biofertilizantes promotores de crecimiento de

estas plantas. Se ha demostrado que cepas de Rhizobium pueden estimular la

germinación de semillas y promover el crecimiento de hortalizas como el tomate,

lechuga, cebolla. [6, 10,11]

Dado que un buen crecimiento y desarrollo de la planta se encuentra

influenciado por la capacidad de la semilla de poder germinar y alcanzar un buen

desarrollo de raíces en sus primeras etapas de vida; en este trabajo se determinó el

efecto de la inoculación in vitro de R. etli Rf 167-01 sobre la germinación de semillas de

S. oleracea; al evaluar su porcentaje de germinación, longitud de su hipocotilo y

radícula respectivamente (Fig. 1, 2 y 3)., no existiendo diferencia significativas (p>0,05)

en la evaluación de las variables mencionadas anteriormente (Anexo 18, 19 y 20). Estos

resultados darían a entender que la actividad de la bacteria R. etli Rf 167-01 dependería

de la quimiotaxis generada por las sustancias excretadas por las raíces de S. oleracea, es

decir la bacteria dependería de la presencia de la raíz de la plántula para poner

interactuar ; dado que la actividad de los microorganismos promotores de crecimiento

vegetal como Rhizobium se inicia con mecanismos de quimiotaxis que están

relacionados con la presencia de flagelos, quimiorreceptores y sistemas de regulación

codificados genéticamente. Estos factores tienen gran importancia sobre la habilidad de

colonizar la rizósfera y mantener la comunicación entre las células de la raíz. Las

bacterias capaces de interactuar con las raíces de las plantas son atraídas por sustancias

excretadas por la raíz, que ocasionan el movimiento de la bacteria hacia el rizoplano de

la planta y de esta forma dar inicio a una relación de beneficie mutuo. [32,33]

Se bien no existe una diferencia significativa en relación al porcentaje de

germinación de las semillas de S. oleracea, se pudo observar una tendencia positiva en

la germinación dando un porcentaje superior al 80% en las semillas inoculadas con R.

etli Rf 167-01 en comparación al control (Fig. 1). Este aumento en el porcentaje de

germinación corrobora lo encontrado por diversos autores con relación al empleo del



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género Rhizobium en la germinación de especies no leguminosas, como lo es en el caso

de Gholami quien encontró que la inoculación de semillas con Rhizobium aumentó la

germinación y el vigor de las plántulas de maíz, sin embargo, la tasa de mejora varió de

acuerdo a la cepa bacteriana usada [34]

; estudios como los realizados por Díaz en donde

al evaluar el efecto de 30 cepas bacterianas en la germinación y el crecimiento de

lechuga (L. sativa), obtuvo un incremento en la germinación del 36.5% con respecto al

control sin inocular,[35]

Ogata también encontró que la cepa rP2N3, perteneciente al

género Rhizobium, incrementó el porcentaje de germinación de tara y alfalfa de las

semillas evaluadas en contraste al control sin inocular. [36]

En la evaluación sobre el crecimiento de plántulas de S. oleracea al inocular con

R. etli Rf 167 -01, los resultados obtenidos de los parámetros agronométricos: longitud

de tallo, hoja, raíz, peso seco total y aéreo de las plántulas de S. oleracea (Fig. 4, 5 , 6, 7

y 9), no demostraron que exista diferencias estadísticamente significativas comparadas

con el control sin inocular (Anexo 21,22), esto podría deberse a que la acción de las

cepas de Rhizobium en plantas no leguminosas esta relacionado con la producción de

sustancias promotoras del crecimiento vegetal que activan varias repuestas en la célula

vegetal, a nivel bioquímico, fisiológico y morfológico[32]

, sin embargo las asociaciones

entre rizobios y plantas no leguminosas a pesar que pueden mejorar el crecimiento de

las plántulas no se ha demostrado que sea mediante la fijación de nitrógeno[11]

;

S. oleracea “espinaca” es una de las especies hortícolas más exigentes en nitrógeno,

tanto para suplir sus necesidades bioquímicas, como para la obtención de una buena

calidad, contenidos altos de nitrógeno incrementan las tasas de división y diferenciación

celular y la actividad fotosintética, esto se traduce en mayor biomasa vegetativa o

reproductiva en los cultivos por una alta eficiencia en la intercepción y conversión de la

radiación, se ha demostrado que altas dosis de nitrógeno repercute en un mayor

desarrollo de área foliar, altura del tallo, raíz, acumulación de masa seca de hojas y total

de la planta[37]

.

Se considera además que el terreno de cultivo de la espinaca debe ser fértil, rico

en materia orgánica , nitrógeno, fosforo y potasio; según el análisis realizado en el suelo

utilizado en la presente investigación (Anexo 9); este poseía bajos niveles de nitrógeno,

cantidad moderada de materia orgánica , niveles normales de fósforo y potasio;

encontrándose estos valores por debajo de los requerimientos óptimos de los suelos de



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cultivo de esta hortaliza que son de 1.6% a 4.5% de nitrógeno, 5 ppm a 15 ppm de

fósforo y 300 ppm a 500 ppm de potasio [38]

. Todo esto, sumado al escaso contenido

inicial de nitrógeno en el suelo así como el que la bacteria R. etli no tiene como

mecanismo de acción la producción de nitrógeno en especies no leguminosas

necesarias para esta hortaliza, podrían ser motivo de que los resultados obtenidos no

sean estadísticamente significativos en las plántulas de S. oleracea inoculadas con

R. etli Rf 167-01.

Si bien no se ha demostrado que R. etli ejerza un efecto estimulante y significativo

sobre el crecimiento de esta hortaliza, se ha reportado investigaciones en donde la

aplicación de cepas de Rhizobium a plantas de cebada y maíz, tienen solo un efecto

positivo y significativo principalmente sobre el crecimiento y el desarrollo de la raíz,

debido a que la principal fitohormona producida es el AIA, la cual interviene en el

desarrollo de la parte radicular, produciendo de este modo un crecimiento en la raíz de

las plantas. [10, 15, 39,40]

En la Figura 8 se evidencia un efecto positivo y significativo de R. etli Rf 167-

01 en el peso seco de la raíz de las plántulas de S. oleracea a comparación del control

sin inocular, esto evidenciaría la capacidad de la bacteria de ejercer un efecto promotor

sobre el crecimiento radicular de las plántulas. Wang et al., reportó algunas evidencias

directas de la colonización de raíces y la actividad PGPR de Rhizobium con no

leguminosas, en donde existen diversos mecanismos directos o indirectos. [41]

En cuanto

a los mecanismos directos realizados por Rhizobium se encuentra la producción de

fitohormonas como las auxinas, citosinas, giberelinas y la enzima 1-aminociclopropano-

1-acido carboxílico (ACC) - desaminasa que cumplen propiedades de regulación y

crecimiento de las plántulas. [40,42,43]

La auxina producida mayormente es el ácido indo

acético (AIA) el cual se sintetiza a partir del triptófano en el meristemo apical y en las

hojas jóvenes de donde se transporta a través del floema al resto de los tejidos vegetales,

el AIA producido por las rizobacterias es el principal metabolito que induce el

crecimiento radicular de las plántulas , al aumentar la división celular y la

diferenciación de los tejidos provocando en primera instancia un alargamiento y

posteriormente su engrosamiento, efectos que se ven reflejados en un mayor contenido

de biomasa. [44]



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Según Tsavkelova et al. los más eficientes productores de auxinas son las

bacterias habitantes de la rizósfera de las plantas. El AIA producido por las bacterias

representa una capacidad PGPR importante ya que beneficia a la planta contribuyendo

con el crecimiento radicular, sin embargo el efecto de ésta sobre la planta depende de

su concentración y el tipo de cultivo en el que éste se evalúe. Existen investigaciones

donde se reporta a las bacterias del género Rhizobium como

Productoras de ácido indol acético (AIA), una de las auxinas más estudiadas hasta el

momento. [13]

El AIA absorbido por las raíces de las plantas también podría estimular la

actividad de la enzima ACC sintasa, la cual está involucrada en la síntesis del etileno.

Se ha encontrado que bajas concentraciones de etileno promueven el crecimiento de los

pelos radicales de las plantas, y así aumentan el área superficial de la raíz para una

mayor absorción de nutrientes. Las bacterias promotoras del crecimiento evitan las altas

concentraciones de etileno, las cuales tienen efectos inhibitorios en el desarrollo de las

plantas. [44]

Las rizobacterias productoras de AIA frecuentemente poseen la enzima 1-

aminociclopropano-1-acido carboxílico (ACC)-desaminasa, la cual degrada al ACC,

precursor del etileno. El Etileno es una hormona vegetal producida bajo estrés, que en

altas concentraciones inhibe el crecimiento vegetal. Se ha reportado que la reducción en

los niveles de etileno por acción de las rizobacterias promotoras del crecimiento, podría

resultar en un mayor desarrollo de las raíces de las plantas inoculadas, dado y que al

disminuir el ACC de la raíz, no se produce suficiente etileno para detener el crecimiento

de esta y su engrosamiento como lo observado en esta investigación. [45,46]

Los resultados obtenidos corroboran a otros autores en donde la inoculación de

Rhizobium en plantas no leguminosas incrementan la materia seca de la raíz [37, 38,40]

, así

como lo obtenido en esta investigación en donde la inoculación de R. etli Rf 167 - 01

en plántulas de S. oleracea L “espinaca” estimula el desarrollo de la raíz dando lugar a

un mayor incremento de la materia seca de la parte radicular de las plántulas. Teniendo

en cuenta entonces las capacidades de R. etli Rf 167 - 01 sobre el peso seco de la raíz

de plántulas de S. oleracea en esta investigación; sería recomendable futuras

investigaciones en las que, considerando la capacidad productora de AIA que posee



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Rhizobium se realice una interacción entre bacterias de este género con especies

fijadoras de nitrógeno asimbióticamente como Azotobacter [39]

, de las cuales se ha

demostrado su acción promotora sobre el crecimiento de hortalizas en diferentes

investigaciones[45]

; y de esta manera poder disminuir la cantidad de fertilizantes

aplicados al suelo del cultivo , mejorando así las practicas agrícolas cotidianas.



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V. CONCLUSIONES

Según los resultados obtenidos se concluye que:

La inoculación de R. etli Rf-167-01 in vitro sobre la germinación de S. oleracea

“espinaca”, no tiene efecto estimulante y significativo al evaluar el porcentaje de

germinación, longitud de radícula e hipocotilo, a los 10 días después de su inoculación.

La inoculación R. etli Rf-167-01 in vitro sobre el crecimiento de las plántulas de

S. oleracea “espinaca”, no tiene efecto estimulante y significativo al evaluar longitud de

tallo, hoja, raíz, peso seco total y peso seco aéreo de las plántulas a los 20 días después

de su inoculación.

La inoculación R. etli Rf-167-01 in vitro tiene un efecto estimulante y

significativo sobre el peso seco radicular de las plántulas de S. oleracea “espinaca”

evaluadas a los 20 días después de su inoculación.



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ANEXOS



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Anexo 01. Morfología de R. etli Rf 167-01. A: Observación macroscópica de colonias

de R. etli. B: Observación microscópica de bacterias R. etli coloreadas con

Gram (1000 X).

A

B



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Anexo 02. R. etli Rf 167-01 en medio de control de pureza A. Medio Peptona-Glucosa-

Púrpura de Bromocresol (Ausencia de crecimiento); B. Agar Extracto de

Levadura Lactosa (Presencia de crecimiento).

A B



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Anexo 03. Composición de los medios utilizados para el aislamiento, purificación,

caracterización bioquímica y fisiológica y de los reactivos de lectura para

los cultivos aislados.

AGAR EXTRACTO DE LEVADURA ROJO DE CONGO

(ELMARC)

Manitol 10.0g

K2HPO4 0.5 g

MgSO4.7H2O 0.2g

NaCl 0.1g

Extracto de levadura 0.4g

Agar – agar 15.0g

Agua destilada 1000 mL

Rojo de Congo 10 gotas

pH 6.8± 0.2 a 25°C

AGAR PEPTONA-GLUCOSA-PURPURA DE BROMOCRESOL

(PG-PBC)

Glucosa 10.0 g

Peptona 0.5 g

Agar-Agar 15.0 g

Agua destilada 1000 mL

*Solución Stock de Púrpura de Bromocresol 10.0 mL

*Solución Stock de Púrpura de Bromocresol: Disolver 1 g del indicador en

100 mL de etanol al 70%.



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AGAR EXTRACTO DE LEVADURA LACTOSA (LLA)

Lactosa 1.0g

K2HPO4 0.5 g

MgSO4.7H2O 0.1g

NaCl 0.2g

Extracto de levadura 0.5g

Agar – agar 15.0g

Agua destilada 1000.0g

pH 6.8± 0.2 a 25°C.

REACTIVO DE BENEDICT

Solución A Solución B

Citrato de sodio 17.3 g Sulfato de cobre 17.3 g

Carbonato de sodio 10.0 g Agua destilada 10.0 mL

Agua destilada 60.0 mL

Uso: Como reactivo de lectura en el medio LLA, para evidenciar la formación

de la enzima cetolactasa.



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Anexo 04. Suspensión de R. etli Rf- 167 – 01 a una concentración aproximada de

1,2 x109

ufc/ml, comparado con el tubo Nº 04 del sistema de MacFarland

(A) y por recuento en placa en agar ELMARC (3,4 x109 ufc/ml).

A B



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Anexo 05. Promedio del porcentaje de germinación de semillas de S. oleracea

inoculadas con R. etli Rf 167-01 (Tratamiento) y sin inocular ( control).

ENSAYOS (%)

E- 1 E-2 E-3 PROMEDIO

CONTROL 78.12 78.00 78.83 78.31

TRATAMIENTO 86.00 83.63 83.71 84.45



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Anexo 06. Crecimiento de la radícula e hipocotilo de las semillas de S. oleracea L

inoculadas con R. etli Rf 167-01 (Tratamiento) y sin inocular (control) a los

diez días. (A) Primer ensayo (B) Segundo y Tercer ensayo

A

B



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Anexo 07. Longitud de hipocotilo de semillas de S. oleracea L inoculadas con R. etli

Rf 167-01 y sin inocular (control) a los diez días.

HIPOCOTILO (mm)

ENSAYOS E1 E2 E3 Yi

Control 17,2 16,6 16,7 16,81

Rhizobium etli 21,48 16,2 17,93 18,54



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Anexo 08. Longitud de radícula de semillas de S. oleracea L inoculadas con R. etli Rf

167-01 y sin inocular a los diez días.

RADICULA (mm)

ENSAYOS E1 E2 E3 Yi

Control 21,61 21,58 21,85 21,68

Rhizobium etli 26,98 19,3 23,3 23,19



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Anexo 09. Características físicas y químicas de suelo agrícola obtenido del distrito

Moche - La Libertad: Laboratorio de Servicios a la Comunidad e

Investigación (LASACI), Universidad Nacional de Trujillo.



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Anexo 10. Inoculación de semillas de S. oleracea con R. etli Rf 167-01(A:

Tratamiento) y sin inocular (Control) para su evaluación a los 20 días.

A

B



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Anexo 11. Plántulas de S. oleracea a los 20 días después de la inoculación con R. etli

Rf 167-01 y sin inocular (control)



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Anexo 12. Longitud del tallo de plántulas de S. oleracea L inoculadas con R. etli Rf

167-01 y sin inocular a los 20 días.

TALLO (mm)

ENSAYOS E1 E2 E3 Yi

Control 52,0 49,80 47,79 49,90

Rhizobium etli 58,90 65,75 39,9 54,85



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Anexo 13. Longitud de hoja de plántulas de S. oleracea L inoculadas con R. etli Rf


HOJA (mm)

ENSAYOS E1 E2 E3 Yi

Control 26,89 33,67 27,16 28,90

Rhizobium etli 25,57 40,25 22,53 29,45



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Anexo 14. Longitud de raíz de plántulas de S. oleracea L inoculadas con R. etli Rf


RAIZ (mm)

ENSAYOS E1 E2 E3 Yi

Control 16,56 20,16 25,67 20,19

Rhizobium etli 19,76 25,70 26,67 24,04



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Anexo 15. Peso seco total de plántulas de S. oleracea L inoculadas con R. etli Rf 167-

01 y sin inocular a los 20 días.

PESO SECO TOTAL(mg)

ENSAYOS E1 E2 E3 Yi

Control 3.90 3.40 3.40 3.60

Rhizobium etli 5.00 4.60 4.30 4.60



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Anexo 16. Peso seco de la parte aérea de plántulas de S. oleracea L inoculadas con

R. etli Rf 167-01 y sin inocular a los 20 días.

PESO SECO PARTE AEREA(mg)

ENSAYOS E1 E2 E3 Yi

Control 3.00 2.90 2.70 2.90

Rhizobium etli 4.10 3.70 2.80 3.60



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Anexo 17. Peso seco de la parte radicular de plántulas de S. oleracea L inoculadas con

R. etli Rf 167-01 y sin inocular a los 20 días.

PESO SECO PARTE RADICULAR(mg)

ENSAYOS E1 E2 E3 Yi

Control 0.80 0.70 0.60 0.70

Rhizobium etli 0.80 0.90 1.40 1.00



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Anexo 18. Análisis de varianza del porcentaje de germinación de S. oleracea al décimo

día de inoculado con R. etli Rf 167-01.

tto Media N Desv. típ. Mínimo Máximo Varianza % de la suma

total

Sig

1,00 733,0000 1 . 733,00 733,00 . 71,0%

2,00 100,0000 1 ,00000 100,00 100,00 ,000 29,0% ,342



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Anexo 19. Análisis de varianza de longitud de hipocotilo de S. oleracea al décimo día

de inoculado con R. etli Rf 167-01.

ANOVA de un factor

Longitud hipocotilo

Suma de

cuadrados

gl Media

cuadrática

F Sig.

Inter-grupos 52,343 1 52,343 ,833 ,364

Intra-grupos 6915,887 110 62,872

Total 6968,230 111



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Anexo 20. Análisis de varianza de longitud de radícula de S. oleracea al décimo día de

inoculado con R. etli Rf 167-01.

ANOVA de un factor

Longitud radícula

Suma de

cuadrados

gl Media

cuadrática

F Sig.

Inter-grupos 40,449 1 40,449 ,272 ,603

Intra-grupos 16339,620 110 148,542

Total 16380,069 111



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Anexo 21. Análisis de varianza de longitud de tallo, longitud de hoja y longitud de raíz

de plántulas de S. oleracea de inoculado con R. etli Rf 167-01.

ANOVA de un factor

Longitud tallo

Suma de

cuadrados

gl Media

cuadrática

F Sig.

Inter-grupos 24,766 1 24,766 ,109 ,742

Intra-grupos 18622,222 82 227,100

Total 18646,988 83

ANOVA de un factor

Longitud hoja

Suma de

cuadrados

gl Media

cuadrática

F Sig.

Inter-grupos 62,004 1 62,004 ,825 ,366

Intra-grupos 6162,413 82 75,151

Total 6224,417 83

ANOVA de un factor

Longitud raíz

Suma de

cuadrados

gl Media

cuadrática

F Sig.

Inter-grupos 217,286 1 217,286 2,738 ,102

Intra-grupos 6506,667 82 79,350

Total 6723,952 83



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Anexo 22. Análisis de varianza de peso seco total, peso seco de la parte aérea y peso

seco de la parte radicular de plántulas de S. oleracea inoculado con R. etli

Rf 167-01.

ANOVA de un factor

Peso seco total

Suma de

cuadrados

gl Media

cuadrática

F Sig.

Inter-grupos ,000 1 ,000 1,477 ,228

Intra-grupos ,001 82 ,000

Total ,001 83

ANOVA de un factor

Peso seco raíz

Suma de

cuadrados

gl Media

cuadrática

F Sig.

Inter-grupos 116,036 1 116,036 4,521 ,036

Intra-grupos 2104,381 82 25,663

Total 2220,417 83

ANOVA de un factor

Peso seco aéreo

Suma de

cuadrados

gl Media

cuadrática

F Sig.

Inter-grupos ,000 1 ,000 ,553 ,459

Intra-grupos ,001 83 ,000

Total ,001 84



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