1

Escherichia coliEscherichia coli O157:H7 O157:H7 et les et les EscherichiaEscherichia producteurs de producteurs de

Shigatoxines (STEC)Shigatoxines (STEC)dans la viande: Quelles dans la viande: Quelles

sont les dernières sont les dernières découvertes  ?découvertes  ?

2

Intoxication au steak hachéSeize enfants ont été

hospitalisés pour une

« intoxication alimentaire

grave » après avoir

consommé des steaks

hachés surgelés distribués

par Leclerc, dans 19

départements du Sud Ouest.

25 Oct. 2005

3

Alerte à la viande avariée en France

                                                                                                                                    

(24/03/08)

4

DOSES INFECTIEUSESDOSES INFECTIEUSES

TRES BASSESTRES BASSES

QUELQUES BACTERIES /25 gQUELQUES BACTERIES /25 gMultiplication bactérienne Multiplication bactérienne

non nécessaire, contamination suffisante!!!non nécessaire, contamination suffisante!!!Acidoresistance !!Acidoresistance !!

5

La coupable !!

6

Comment faire ?????

7

Vers une nouvelle classification Vers une nouvelle classification des souches pathogènes ?des souches pathogènes ?

8

gène eae ( LEE sur îlot de pathogénicité PAI III)

(nombreux variants !!)

Production de verotoxines = shigatoxines ( gène stx)

(Knutton et al, Infect. Immun. 1987)

Lésions d ’attachement et d’effacement

9

Ancienne dénomination Nouvelle dénomination

gène protéine

Toxine de Shiga stx Stx

Toxine Shiga-like de type I ou(SLT-I) ou vérotoxine 1(VT1) stx1 Stx1

SLT-II ou VT2 stx2 Stx2

SLT-IIc/d ou VT2c/d stx2c/d

SLT-II/f ou VT2e/f stx 2e/f

99 % d'homologie

55 % d'homologie

90% d'homologie

Verotoxine ou shigatoxine

Stx2c/dStx2e/f

Autres variants décrits très récemment : stx2 g, . stx2-NV206

10

Sérotype O157:H7Sérotype O157:H7 Autres sérotypes..mais liste non Autres sérotypes..mais liste non

exhaustiveexhaustive Stx2 et eae et SHU : Stx2 et eae et SHU : (Ethelberg et (Ethelberg et al.al. 2004 2004

(Danemark), Tarr et (Danemark), Tarr et al.al. 2005, Karmali 2004 2005, Karmali 2004

Marqueur de virulence des STEC ?Marqueur de virulence des STEC ?Acidoresistance ???Acidoresistance ???

11

SOUCHE STEC PATHOGENEDéfinition actuelle de l’AFSSA

•Appartient aux sérogroupes O157:H7, O26, O103, O111 ou O145

•ET

•Stx+ et eae+

12

13

14

15

Approche MRA molecular risk Approche MRA molecular risk assessment (Coombs et al 2008)assessment (Coombs et al 2008)

CCongrés du PEN 4-5 mars 2008 à Romeongrés du PEN 4-5 mars 2008 à Rome

Îlots de pathogénicité,Îlots de pathogénicité, O-IslandO-Island SéropathotypeSéropathotype Variants Variants eae eae , , stx stx

16

17

18

19

20

21

22

DETERMINATION DES DETERMINATION DES FACTEURS DE VIRULENCEFACTEURS DE VIRULENCE

- O26O26- flagelle H11flagelle H11- eae (variants)eae (variants)- stxstx commun, commun, stx stx 1 et 1 et stx stx 2 et variants 2 et variants stx2stx2- Îlot O122: Z4321, Z4326, Z4332, Z4333Îlot O122: Z4321, Z4326, Z4332, Z4333

23

Z4332Z4332

Z4333Z4333

Z4321Z4321

Z4326Z4326

24

Les « EHEC typiques »Les « EHEC typiques »

EHEC O157:H7EHEC O157:H7 = = rfbEO157rfbEO157, , flicH7flicH7, , stx1stx1 et/ou et/ou stx2stx2, , eaeeae-gamma, O#122.-gamma, O#122.

EHEC O26:H11EHEC O26:H11 = = wzxO26wzxO26, , flicH11flicH11, , stx1stx1 et/ou et/ou stx2stx2, , eaeeae-beta, O#122.-beta, O#122.

EHEC O145:H28EHEC O145:H28 = = ihp1O145ihp1O145, , flicH28flicH28, , stx1stx1 et/ou et/ou stx2stx2, , eaeeae-gamma, O#122-gamma, O#122..

EHEC O103:H2EHEC O103:H2 = = wzxO103wzxO103, , flicH2flicH2, , stx1stx1 et/ou et/ou stx2stx2, , eaeeae-epsilon, O#122.-epsilon, O#122.

EHEC O111:H8EHEC O111:H8 = = wbd1O111wbd1O111, , flicH8flicH8, , stx1stx1 et/ou et/ou stx2stx2, , eaeeae-theta, O#122-theta, O#122..

25

SOUCHE STEC PATHOGENEDéfinition de l’AFSSA

•Appartient aux sérogroupes O157:H7, O26, O103, O111 ou O145

•ET

•Stx+ et eae+

Mais définition en cours de révision par l’AFSSA (AST de la DGAL transmise début mai 2008)

26

Quels sont les Quels sont les E. coliE. coli que les que les industriels doivent prendre en industriels doivent prendre en considération dans leur plan considération dans leur plan

HACCP, pourquoi ?HACCP, pourquoi ?

27

E. coli O157:H7stx+ et eae+

Séropathotype A

E. coli O26, O111, O103, O145stx+, eae+

Séropathotype B

STEC (autres sérotypes)

28

29

Quelles sont les méthodes de Quelles sont les méthodes de détection actuellement détection actuellement

reconnues ? Quel est le rôle du reconnues ? Quel est le rôle du laboratoire national de laboratoire national de

référence dans la validation référence dans la validation des méthodes de détection ?des méthodes de détection ?

30

E. coliE. coli O157:H7 O157:H7

31

Deux méthodes validées Deux méthodes validées AFNOR en France et une AFNOR en France et une

norme ISO norme ISO

Séparation Séparation Immunomagnétique Immunomagnétique (Dynabeads. Dynal) (Dynabeads. Dynal)

Norme ISO EN 16654Norme ISO EN 16654 Méthode VIDASMéthode VIDASTM TM (bioMérieux)(bioMérieux) Méthode Bax (Oxoid)Méthode Bax (Oxoid)

32

Bactéries E. coli O157et billes magnétiques

(microscopie électronique)

33

VIDAS biomérieux

34

VIDAS: Sample preparationVIDAS: Sample preparation

SampleSample

Heating stepHeating step

TestTest

15 min 95°C15 min 95°C

45min45min

35

)

                                                                              

BAX Oxoid

36

REAL TIME PCR: Sample preparationREAL TIME PCR: Sample preparation

SampleSample

Bacterial lysisBacterial lysis

PCRPCR

Lysis bufferLysis buffer

20min 37°C 20min 37°C 10min 95°C 10min 95°C 5 min 4°C 5 min 4°C

mix PCRmix PCR

37

Real Time PCR: Sample preparationReal Time PCR: Sample preparation

SampleSample

Bacterial lysisBacterial lysis

PCRPCR

45 min45 min

3h 30min3h 30min

38

Enrichissement Enrichissement 8H8H pour les 2 pour les 2 méthodesméthodes

Taux de non isolement du pathogène Taux de non isolement du pathogène après message présomptif (2à 5 pour après message présomptif (2à 5 pour 1000) pour le VIDAS, pas de recul en 1000) pour le VIDAS, pas de recul en France pour le BaxFrance pour le Bax

Attention phase Attention phase d’immunoconcentration nécessaire d’immunoconcentration nécessaire avant isolement !!! Prévoir IMS après avant isolement !!! Prévoir IMS après le BAXle BAX

Boites avec colonies suspectes à Boites avec colonies suspectes à confirmer par le LNRconfirmer par le LNR

Utilisation des caractéristiques Utilisation des caractéristiques biochimiques de biochimiques de E. coliE. coli O157:H7 O157:H7 (Mutants!)(Mutants!)

sorbitol sorbitol – -glucuronidase-glucuronidase – rhamnose –Résistance intermédiaire au céfixime

et au tellurite

40

Milieu CT-SMAC Milieu CHROM agar

Milieu O157:H7

41

Méthodes nouvelles.. Méthodes nouvelles.. Délai d’analyse <8hDélai d’analyse <8h Echantillon composite (375g)Echantillon composite (375g)

METHODES DE DETECTION METHODES DE DETECTION DES STEC non O157DES STEC non O157

AUCUNE CARACTERISTIQUE AUCUNE CARACTERISTIQUE BIOCHIMIQUE BIOCHIMIQUE COMMUNE !!!!!COMMUNE !!!!!

43

eae +

44

45

46

eae +

47

InconvénientsInconvénients PCR (même en temps réel) signification PCR (même en temps réel) signification

d’un message positif. Genesystem d’un message positif. Genesystem Quid de l’enrichissement commun de Quid de l’enrichissement commun de

l’ensemble des 5 sérogroupes de l’ensemble des 5 sérogroupes de STECSTEC ?? ?? Non optimisé à ce jourNon optimisé à ce jour

Quid de l’isolement des souches STEC? Quid de l’isolement des souches STEC? (taux de confirmation??) (taux de confirmation??)

Outil validé pour screening en PCR sur Outil validé pour screening en PCR sur souches STEC pures souches STEC pures mais validation mais validation nécessaire sur matrices nécessaire sur matrices

48

Résultats du Plan de Résultats du Plan de surveillance VH surgelées surveillance VH surgelées

20072007

49

50

3,7%

Taux de confirmation= 9%

51

3354 échantillons analysés: 3354 échantillons analysés: - 964 PCR stx +- 964 PCR stx +- 172 PCR eae +- 172 PCR eae +- 121 PCR + pour les 5 sérogroupes - 121 PCR + pour les 5 sérogroupes d'intérêt parmi lesquels :  d'intérêt parmi lesquels :  * 62  O103 : seulement 13 souches d‘E. * 62  O103 : seulement 13 souches d‘E. coliO103 isolées dont 3 STEC pathogènes coliO103 isolées dont 3 STEC pathogènes * 21  O157 : 5 souches d‘ E. coliO157:H7 * 21  O157 : 5 souches d‘ E. coliO157:H7 isolées (pas d'autres O157 a priori)isolées (pas d'autres O157 a priori)* 16  O26   : 6 souches d‘E. coliO26 isolées * 16  O26   : 6 souches d‘E. coliO26 isolées dont 2 STEC pathogènes (et 4 EPEC)dont 2 STEC pathogènes (et 4 EPEC)* 14  O145 : 1 souche d‘ E. coliO145 * 14  O145 : 1 souche d‘ E. coliO145 isolées(EPEC mais non STEC pathogènes)isolées(EPEC mais non STEC pathogènes)*   8  O111 : 1 souche d‘ E. coli O111 *   8  O111 : 1 souche d‘ E. coli O111 isolées pathogènes.isolées pathogènes.

52

A ce jour, il n’existe pas A ce jour, il n’existe pas de méthode validée pour de méthode validée pour

la détection et l’isolement la détection et l’isolement des STEC pathogènedes STEC pathogène

Role du LNR =validation , Role du LNR =validation , existence de lignes existence de lignes

directrices directrices

53

Maîtrise du danger STEC Maîtrise du danger STEC par les professionnelspar les professionnels

54

Où le gestionnaire du risque Où le gestionnaire du risque place t’il le curseur de la place t’il le curseur de la

maîtrise du danger STEC dans maîtrise du danger STEC dans la filière VH ?la filière VH ?

Risque épidémique (SHU) ?Risque épidémique (SHU) ?

Risque sporadique (SHU) ?Risque sporadique (SHU) ?

55

56

57

58

Maîtriser le risque épidémique de SHUMaîtriser le risque épidémique de SHU

– Contrôler individuellement chaque mêléeContrôler individuellement chaque mêléeEt Et – Lors de résultats d’autocontrôles positifs, Lors de résultats d’autocontrôles positifs,

établir la concentration du pathogène établir la concentration du pathogène dans la mélée contaminée pour une dans la mélée contaminée pour une maîtrise adaptée et plus pertinentemaîtrise adaptée et plus pertinente

59

Gestion des résultats positifs Gestion des résultats positifs

par l’estimation de la par l’estimation de la concentration du pathogèneconcentration du pathogène

60

Un plan d’échantillonnage de 30 fois 25 grammes permet de Un plan d’échantillonnage de 30 fois 25 grammes permet de quantifier la concentration dans la mêlée dans une gamme quantifier la concentration dans la mêlée dans une gamme allant environ de 0,001 à 0,1 cellule par gramme. allant environ de 0,001 à 0,1 cellule par gramme.

61

30 échantillons de 25 g chacun puis regrouper (« pooler ») par 3 les échantillons de 25 g pour constituer des échantillons composites de 75 g soumis à l’analyse. On réduit ainsi par 3 le nombre d’analyses. La limite de détection de l’analyse est identique (Vimont A. et al. 2006)

62

Mêlée contaminée (un autocontrôle positif)29 autres analyses sur 25 g ou 9 analyses sur 75gsur cette mêlée contaminée (total 30 ou 10)

Si tous positifs

Contrôle mêlées aval + amontet cascade d’analyses si positif (arrêt quand négatif ou nettoyage désinfection)Contrôle mêlées issues de la même matière première (+ cascades)Plan d’échantillonnage 10 ou 30

Si au moins un négatif

Contrôle mêlées aval + amontet cascade d’analyses si positif (arrêt quand négatif ou nettoyage désinfection)Plan d’échantillonnage 10 ou 30

63

PerspectivesPerspectives Optimisation des méthodes de détection Optimisation des méthodes de détection

(rapidité , possibilité de tester des (rapidité , possibilité de tester des échantillons composites…)échantillons composites…)

Attention !! La détection ne serait se Attention !! La détection ne serait se substituer à la maîtrise de la substituer à la maîtrise de la contamination fécale lors de l’abattage-contamination fécale lors de l’abattage-habillage des animaux habillage des animaux – Limitation du portage animal, Limitation du portage animal, – animaux animaux PROPRESPROPRES à l’arrivée à l’abattoir, à l’arrivée à l’abattoir,

Hygiènes des opérations d’abattage, Hygiènes des opérations d’abattage, – hygiène des hachoirs…) hygiène des hachoirs…)

64

65

66

67

Selon la distribution de Poisson et en supposant une contamination homogène de la totalité de la mêlée :

P= 1-e-(C*M) C, niveau de contamination et M, masse de steak haché

Niveau de contamination

de la mêlée(UFC E. coli O157:H7.g-1)

Probabilité de détection de E. coli O157:H7

selon la prise d’essai réalisée (%)

25g 75g 125g 375g 750g

4.10-3 (0,1 UFC/25g) 10 26 39 78 95

0,04 (1 UFC/25g) 63 95 99 99,99 1000,1 92 99,9 99,99 100 1001 100 100 100 100 100

1.2 Calcul théorique de la probabilité de détecter E. coli O157:H7 en fonction de la prise d’essai effectuée