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QTL (Quantitative trait loci)
Locus genetico in corrispondenza del quale alleli diversi da un punto di vista funzionale segregano e causano effetti significativi sul carattere quantitativo
QTL mapping
Locus: posizione fisica del gene sul cromosoma Mappa genetica: serve per determinare la posizione del locus
Localizzare ed identificare il locus che regola il QTL
-‐ Iden'ficare il QTL che regola il cara4ere studiato
-‐localizzare la regione del genoma dove un QTL che regola il cara4ere è ospitato
Caratteri quantitativi e postulati di Mendel
Ø Più geni responsabili del carattere fenotipico (poligeni)
Ø Alleli plus & minus
Ø Geni associati
Ø Geni su uno stesso cromosoma vengono ereditati insieme (linkage)
Legge della dominanza gli individui nati dall'incrocio tra due individui omozigoti che differiscono per una coppia allelica, avranno il fenotipo dato dall'allele dominante
Legge della segregazione alleli differenti di uno stesso gene
segregano a meiosi Legge dell'assortimento indipendente (o legge di indipendenza
dei caratteri): gli alleli posizionati su cromosomi non omologhi si distribuiscono in modo casuale nei gameti.
Caratteri quantitativi e postulati di Mendel
Deviazione rapporti mendeliani Esperimento Bateson & Punnet
Incrocio diibrido tra una linea pura con fiori viola e granuli pollinici allungati ed un’altra linea pura con fiori rossi e granuli pollinici rotondi
Si concluse che gli alleli parentali erano accoppiati e non andavano incontro assortimento indipendente
geni sullo stesso cromosoma
possono essere ereditati in
maniera accoppiata
Esperimenti di Morgan
Biologia.blu, D.Sadava G.Heller G.Orians W.Purves D.Hillis M.Pignocchino, Zanichelli
Gli studi di Morgan hanno dimostrato che nella drosofila i geni responsabili del colore del corpo e delle dimensioni delle ali sono
associati, cosicché i rispettivi alleli non seguono un assortimento indipendente. Questa associazione è responsabile della
discordanza dei fenotipi osservati rispetto a quelli attesi in base alla legge mendeliana
dell’assortimento indipendente
Calcolo chi2
Analisi dei rapporti di segregazioni a ciascun locus per vedere se i valori osservati differiscono da attesi
Geni concatenati hanno rapporti atipici
Osservati
Attesi
(575-965)2/965 (575-944)2/944 (575-206)2/206 (575-185)2/185
156,81 144,24 660,97 822,16
1784.18
I valori di χ2 elevati indicano che le differenze osservate sono statisticamente significative, e che quindi l’ipotesi che i geni si
assortiscano in modo indipendente deve essere rigettata
4 classi fenotipiche -> 3 gradi di libertà valore χ2 1784,18
Se p>0.05, la deviazione tra Osservati ed Attesi non è significativa
Se p<=0.05, la deviazione è statisticamente significativa; ciò significa che i geni possono essere legati
Geni indipendenti Seguono le leggi di Mendel
sull’assortimento indipendente Sono su cromosomi diversi
Geni in linkage Geni fisicamente uniti sugli
stessi cromosomi
§ Nuove associazioni di alleli parentali si ottengono a seguito della ricombinazione genetica
§ Tests crosses determinano quali geni sono
legati, e la mappa genetica si contruisce per ogni cromosoma
Linkage
Si analizza la frequenza allelica di ricombinazione nella progenie di un incrocio
Alla meiosi:
Segmenti di DNA che sono su diversi cromosomi si distribuiscono a caso nei gameti
Segmenti che sono sullo stesso cromosoma vanno soggetti a ricombinazione. Questa è tanto più frequente quanto più distanti sono i due segmenti di DNA sul cromosoma
DISTANZA DI MAPPA è misurata dalla % di RICOMBINAZIONE
Ricombinazione
Grazie alla ricombinazione risulta possibile mappare i geni
1) Non si trasmettono insieme a causa della ricombinazione, quindi si separano per l’avvento del CROSSINGOVER nel tratto di cromosoma compreso tra i due geni. (assortimento indipendente)
2) Si trasmettono insieme, ciò accade quando sono molto vicini tra di loro
I geni associati sul cromosoma possono avere duplice destino:
scambio fisico reciproco di parti tra i due cromosomi omologhi (tra cromatidi non fratelli) con la formazione di nuove combinazioni alleliche
Crossing over
Frequenze di Ricombinazione
Progenie ricombinante Totale progenie
%
Geni associati Geni non associati
50% 0%
Geni con frequenza di ricombinazione minore del 50% si trovano sullo stesso cromosoma => linked (ricombinazione intracromosomica) crossing over
Geni che si sottopongono ad assortimento indipendente hanno una FR del 50 % e sono posizionati in cromosomi non-omologhi oppuri di lontani e sullo stesso cromosoma=> unlinked (ricombinazione intercromosomica)
Tipologie di mappe
§ Mappe genetiche o di linkage § Distanza che separa i geni basata su rapporti di
ricombinazione
§ Citogenetiche § Visulizzazione al microscopio dei cromosomi
§ Mappe fisiche § Posizione fisica di una sequenza di DNA o di un
gene § “Nucleotide Sequence Maps”
§ Genomi sequenziati
Mappe genetiche
§ La mappa genetica determina l’ordine di geni
§ Le frequenze di ricombinazione tra alleli determinano le distanze tra essi
§ Le distanze tra geni si misurano in termini di unità di mappa
§ 1 unità di mappa = 1 cM (centimorgan) (1% fenotipi ricombinanti)
§ Tali frequenze sono inveramente proporzionali alla distanza tra alleli
§ Calcolare ricombinazioni in cis ed in trans
§ Calcolare crossing over multipli
Calcolo distanza mappa
A1 B1 C1
A2 B2 C2
A1 B2 C2
A2 B1 C1
A1 B2
C2 A2 B1
C1
Singolo CO Doppio CO
Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
st+ A
e+ B
ss+ C
st a
e b
s c
Abc
aBC
ABc
abC
AbC
aBc
ABC
abc
Vogliamo stabilire l’ordine dei geni sul cromosoma e stimare le distanze tra questi
ABC 283
abc 278
Abc 50
aBC 52
ABc 5
abC 3
AbC 43
aBc 41
Genotipi più frequenti sono i parentali
Genotipi meno frequenti sono i doppi ricombinanti
Calcolo dell’ordine dei geni
A-B-C? C-B-A? B-A-C? ecc….
ABC 283 ACB
abc 278 acb
Abc 50 Acb
aBC 52 aCB
ABc 5 AcB
abC 3 aCb
AbC 43 ACb
aBc 41 acB
A C B
a c b
A c b
a C B
A
b a C
B c
A
c
b
a
C
B
Il doppio crossing over sposta l’allele centrale da un cromatidio fratello all’altro
A questo punto bisogna calcolare la distanza tra A - C e C - B
A –C = (5+3+50+52)/755 * 100 = 14.6
283 ACB
278 acb
50 Acb
52 aCB
5 AcB
3 aCb
43 ACb
41 acB
C –B = (5+3+43+41)/755 * 100 = 12.2
A –B = [50+52+43+41+ (5*2) + (3*2)]/755 * 100 = 26,8
Esempio Drosophila distanza Additiva (14,6 + 12,2 = 28,8)
Distanza genetica
CROSSOVER MULTIPLI
Aumentando la distanza tra due loci, aumenta la probabilità di crossing over doppi o multipli
A
a b
A
a b
B B
B
B
B
b
b
b
Gli effetti del crossing-over multiplo sono annullati, pertanto la frequenza di ricombinazione, sottostima la distanza genetica
Interferenza Coincidenza
Il Crossover in una regione diminuisce la
probabilità di altri nella medesima regione
cromosomica
Tendenza a non vedere doppi crossover in
piccole regioni cromosomiche
Numero di doppi ricombinanti osservati
diviso il numero di attesi
28,8 cM
14,6 cM 12,2 cM
A C B
• Probabilità di doppi CO tra A e B = frAC x frCB
0,146 X 0,122 = 0,0178
• Numero di doppi CO attesi = 0,0178 X 755 (progenie totale) = 13,4 • Numero di doppi CO osservati = 5 + 3 = 8
283 ACB
278 acb
50 Acb
52 aCB
5 AcB
3 aCb
43 ACb
41 acB
Coefficiente di coincidenza = doppi CO oss./ doppi CO att. = 8/13,4 = 0,6
Coefficiente di coincidenza = 0,6
Interferenza = 1 - coefficiente di coincidenza => 1 – 0,6 = 0,4
Il 40% della progenie attesa e derivante da doppio crossing over non sarà osservata
Interferenza
0>1 0
No doppi crossing over doppi crossing over
Crossing over più frequenti in regioni subtelomeriche rispetto le centromeriche, quindi ad una piccola distanza
nella mappa genetica può corrispondere una grande distanza in quella fisica
Costruzione mappa genetica
• Si scelgono due parentali distanti dal punto di vista genetico con caratteri agronomici utili
• Incrocio e sviluppo popolazione segregante
• Genotipizzazione con marcatori molecolari
q Associazione del fenotipoà Alleli di interesse
RICERCA DI MARCATORI MOLECOLARI
Trovare marcatori polimorfici tra i due parentali
Analizzare la segregazione di tali marcatori nella popolazione segregante
Ricercare l’associazione tra i diversi marcatori
Calcolare la % di ricombinazione tra i marcatori associati
COSTRUZIONE DI UNA MAPPA GENETICA CON MARCATORI MOLECOLARI
Associazione di un marcatore ad un gene di resistenza
§ Progenie da incrocio Resistente X Suscettibile
§ Testare la progenie con marcatori equamente distribuiti sul genoma (~ogni 10cM)
§ Lod score (“log of the odds”) – punteggio risultante da un test statistico che confronta la probabilità di osservare due marcatori, legati o meno. Punteggi LOD positivi favoriscono la presenza di linkage, mentre i punteggi LOD negativi indicano che il legame è meno probabile
Linkage mapping
Mapping function
• Formule matematiche per definire le relazioni tra ricombinazione e distanza di mappa
• Tali formule mettono in relazione la frequenza dei CO e la distanza tra I geni
1. LOD >3.0 evidenza del legame 2. LOD <-2.0 non legati 3. Intermedi – dati inconclusivi, collezionare maggiori individui
Associazione del fenotipo
1 3 2 3 2 3 2 2 2 2 2 3 1 2 2 2 2 1 1 1 1 2 2 1Genotipo
Fenotipo S R R R R R R R R R R R S R R R R S S S S R R S
100
150
80
70
40
500
450
300
250
280
290
310
240
540
320
310
160
180
230
440
310
420
400
250
Linkage = Co-segregazione
A2A4
A3A4
A1A3
A1A2
A2A3
A1A2 A1A4 A3A4 A3A2
Marker allele A1 cosegrega con un Carattere dominante per resistenza
Mappatura di geni agronomicamente interessati
Elevato n° di markers = consentirà la saturazione delle mappe genetiche, ottenendo distanze di mappa tanto ridotte da consentire la dissezione di caratteri quantitativi nelle diverse componenti geniche.
Vantaggi = possibilità di trovare una stretta associazione tra il marcatore ed i geni di interesse.
L’associazione tra il marcatore molecolare ed il gene permette di inferire la presenza del gene in un individuo o in un gruppo di individui mediante l’identificazione del marcatore ad esso legato.