UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS

Erliquiose Monocítica Canina:

Revisão sobre a doença e o diagnóstico

Herika Xavier da Costa

Orientador: Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares

Goiânia

2011

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HERIKA XAVIER DA COSTA

Erliquiose Monocítica Canina:

Revisão sobre a doença e o diagnóstico

Seminário apresentado junto à

Disciplina Seminários Aplicados do

Programa de Pós-Graduação em

Ciência Animal da Escola de Veterinária

da Universidade Federal de Goiás.

Nível: Doutorado

Área de concentração:

Sanidade animal, Higiene e tecnologia de alimentos

Linha de pesquisa:

Parasitos e doenças parasitárias dos animais

Orientador:

Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares – UFG

Comitê de orientação:

Prof. Dra. Valéria de Sá Jayme –UFG

Dr. Sabrina Castilho Duarte

Goiânia

2011

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1

2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 3

2.1 Erliquiose Monocítica Canina (EMC) ............................................................ 3

2.1.1 Agente etiológico, histórico e distribuição geográfica ................................ 3

2.1.2 Transmissão .............................................................................................. 6

2.1.3 Patogenia e Manifestação Clínica ............................................................. 8

2.1.4 Achados laboratoriais .............................................................................. 11

2.1.5 Diagnóstico .............................................................................................. 12

A) Exame parasitológico direto ...................................................................... 12

B) Testes sorológicos .................................................................................... 14

C) Isolamento ................................................................................................. 16

D) Biologia Molecular ..................................................................................... 17

CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................................... 26

REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 27

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1.Mórula de E. canis infectando leucócito de cão. Objetiva 100x. .............. 5

Figura 2.Vista dorsal de exemplares de carrapatos adultos, machos e fêmeas, vetores da Erliquiose Monocítica Canina. (A) Rhipicephalus sanguineus (B) Dermacentor variabilis. ........................................................................................... 7

Figura 3. Cão com epistaxe severa devido a infecção por E. canis. ..................... 9

Figura 4. Fotomicrografia de células DH82 infectadas com E. canis com reação fluorescente positiva (setas). Notar a fluorescência positiva de forma difusa, caracterizando aparentemente antígenos solúveis (A) no citoplasma celular, corpúsculos elementares e iniciais (B), bem como a presença de mórulas (C). Imunofluorescência indireta; 40. ........................................................................... 15

Figura 5. Fotomicrografias de células DH82 provenientes de monocamada inoculada com o isolado de Jaboticabal, SP, apresentando mórulas de E. canis (setas) aos 28 dias pós-inoculação. Panótico rápido (Laborclin®); 100X. ........... 17

Figura 6. Curva de amplificação do PCR em Tempo Real. CT-Cycle Threshold. A amplificação mostra 3 fases distintas (1) linha basal: Não houve produtos da PCR suficiente para detectar a fluorescência; (2) fase log: a quantidade de produtos da PCR dobra a cada ciclo e (3) fase platô: não há mais aumento no número de produtos. .............................................................................................................. 21

Figura 7. Molécula de SYBR Green entre a fita dupla de DNA. .......................... 22

Figura 8. Ilustração de uma sonda TaqMan. F- Fluoróforo e Q- Quencher. ........ 23

Figura 9. PCR em Tempo Real com sonda TaqMan ........................................... 24

1

1. INTRODUÇÃO

A Erliquiose Monocítica Canina (EMC) é uma doença causada por

bactérias estritamente intracelulares, Gram-negativas, pertencentes à ordem

Rickettsiales, família Anaplasmataceae, gênero Ehrlichia e espécie Ehrlichia

canis (DUMLER et al., 2001).

A EMC foi descrita inicialmente por DONATIEN & LESTOQUARD

em um cão Pastor Alemão no Instituto Pasteur na Algéria em 1935. Desde

então, a EMC tem sido reconhecida mundialmente e é considerada uma das

doenças mais importantes que acometem os cães, podendo causar infecções

graves e fatais (NAKAGHI et al., 2008; DA SILVA et al., 2010). No Brasil, a

EMC foi diagnosticada pela primeira vez em Belo Horizonte, Minas Gerais

(COSTA et al., 1973).

A transmissão de E. canis ocorre durante o repasto sanguíneo do

carrapato Rhipicephalus sanguineus infectado, o qual mantém a bactéria por

transmissão transestadial (BREMER et al., 2005). No Brasil, as frequências de

carrapatos R. sanguineus encontrados naturalmente infectados por E. canis

têm variado de 2,3 a 6,2% (AGUIAR et al., 2007a). Este carrapato encontra-se

preferencialmente em regiões urbanas do país, porém também ocorre em

menores densidades nas áreas rurais e provavelmente, em todo o território

nacional. É uma espécie de difícil controle, o que contribui para a manutenção

da E. canis em regiões tropicais e subtropicais (LABRUNA et al., 2001).

No Brasil, a EMC já foi relatada em cães de praticamente todos os

estados brasileiros. Estudos epidemiológicos no país têm revelado

prevalências de EMC que variam de 4,8 a 65% em cães de ambiente urbano

ou rural (COSTA Jr. et al., 2007; SAITO et al., 2008). A estimativa da

prevalência da EMC é muito variada e está intimamente relacionada com a

população animal estudada, região, época e técnica de diagnóstico

empregada. Para cães atendidos em clínicas e hospitais veterinários, a

frequência de animais positivos aos testes sorológicos ou moleculares tem

oscilado entre 20 a 30% (DAGNONE et al., 2003; LABARTHE et al., 2003;

BULLA et al., 2004; TRAPP et al., 2006).

2

A patogênese da EMC envolve três fases clínicas consecutivas:

aguda, subclínica e crônica. Na fase aguda, os sinais clínicos podem variar de

leves a graves e incluem sinais inespecíficos como anorexia, depressão e

febre, e ocasionalmente, petéquias, equimoses e epistaxe podem

aparecem. Anormalidades hematológicas nesta fase podem incluir

trombocitopenia, anemia e leucopenia leve (BORIN et al., 2009).

O tratamento adequado na fase aguda resulta em recuperação

completa, porém, com tratamento inadequado ou a falta dele, a doença pode

progredir para a fase subclínica, que pode durar anos. O diagnóstico da EMC

comumente ocorre durante a fase crônica da doença, a qual é caracterizada

por supressão medular, sangramentos por mucosas e alta letalidade (HARRUS

et al., 1997). O tratamento nesta fase comumente é trabalhoso e de custo

elevado, muitas vezes necessitando de hospitalização prolongada e

transfusões de sangue. E apesar do intenso cuidado, o resultado geralmente é

pouco gratificante (MYLONAKIS et al., 2004).

O Diagnóstico da EMC frequentemente é desafiador para o clínico

veterinário de pequenos animais devido a característica multissistêmica da

doença (HARRUS & WANER, 2011). A presença do carrapato e a ocorrência

de outros casos da doença na região, são importantes para se confirmar a

suspeita clínica. O diagnóstico pode ser feito através do exame parasitológico

direto, cultura, testes sorológicos e técnicas de biologia molecular (DAGNONE

et al., 2003).

Em virtude da gravidade da EMC e do seu caráter endêmico em

regiões tropicais e subtropicais, a detecção precoce da infecção é

extremamente importante. Dessa forma, há grande preocupação com o

desenvolvimento e uso cada vez maior de novas técnicas para o diagnóstico da

infecção por E. canis (HARRUS & WANER, 2011). As tradicionais técnicas de

diagnóstico (exame parasitológico direto e sorologia) são valiosas ferramentas

de diagnóstico para EMC, no entanto, o diagnóstico definitivo de infecção por

E. canis de forma mais eficaz e rápida requer o uso de técnicas moleculares.

Assim, buscou-se com esta revisão de literatura ressaltar a importância da

EMC e do estabelecimento de um diagnóstico precoce em cães a fim de

contribuir com o prognóstico da doença em cães.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Erliquiose Monocítica Canina (EMC)

2.1.1 Agente etiológico, histórico e distribuição geográfica

As espécies do gênero Ehrlichia são pequenos organismos cocóides

ou elipsoidais, frequentemente pleomórficos, Gram-negativos e parasitas

intracelulares obrigatórios de leucócitos. O gênero Ehrlichia inclui as espécies

Ehrlichia canis, E. chaffeensis, E. muris, E. ruminantium e E. ewingii (DUMLER

et al., 2001).

As espécies de Ehrlichia são transmitidas aos hospedeiros

principalmente através da picada de um carrapato infectado. O que explica

a maior prevalência da erliquiose em regiões tropicais e subtropicais devido

à distribuição geográfica dos vetores (ANDEREG & PASSOS, 1999). E. canis

é transmitida aos cães principalmente pelo Rhipicephalus sanguineus

(BREMER et al., 2005), E. ruminantium (ruminantes) por carrapatos do gênero

Amblyomma, E. chaffeensis (humanos e veados) e E. ewingii (humanos e

cães), por Amblyomma americanum e Dermacentor variabilis (DUMLER et al.,

2001) e E. muris (roedores) por Haemaphysalis flava e Ixodes persulcatus

(INOKUMA et al., 2007). Espécies de carrapatos, tais como A. cajennense,

foram suspeitos para atuar como vetores de E. canis em áreas rurais (COSTA

JR et al., 2007).

A EMC ganhou importância mundial durante a

Guerra do Vietnã, devido as perdas de um grande número de cães

militares dos Estados Unidos (HUXSOLL et al., 1970).

A EMC é amplamente detectada em todo o Brasil. Três

espécies foram descritas até o momento no Brasil: E. canis (COSTA et al.

1973; LABRUNA et al, 2007; UENO et al,.2009) e E. ewingii acometendo cães

(OLIVEIRA et al., 2009) e E. chaffeensis acometendo um veado pantaneiro

(MACHADO et al., 2006). O DNA de E. muris e E. ruminantium ainda não foram

identificadas no Brasil, este agentes etiológicos frequentemente acometem

4

roedores e ruminantes, respectivamente (VIEIRA et al., 2011). Ehrlichia canis é

a principal espécie acometendo cães no Brasil. No entanto, existe um relato

recente comprovando a infecção por E. ewingii em cinco cães de Viçosa, Minas

Gerais (OLIVEIRA et al., 2009).

A Ehrlichia canis foi descrita inicialmente por DONATIEN &

LESTOQUARD em um cão Pastor Alemão no Instituto Pasteur na Algéria em

1935, os quais observaram no esfregaço sanguíneo de cães infestados por R.

sanguineus a presença de pequenos organismos semelhantes a rickettsia no

interior de monócitos, que foram nomeados Rickettsia canis. No ano de 1945,

MOSHKOVSHI renomeou a Rickettsia canis para Ehrlichia canis, em

homenagem ao famoso bacteriologista alemão, Paul Ehrlich (McDADE, 1990).

Existem três cepas de E. canis, isoladas e caracterizadas

geneticamente como: “Flórida” (M73226), “Oklahoma” (M73221) e “Israeli”

(U26740). Apesar das cepas terem origens geográficas distintas, existe uma

grande similaridade genética entre elas, de acordo com a sequência do RNA

ribossomal 16S (DAGNONE et al., 2001).

No cão, E. canis invade predominantemente os leucócitos

mononucleares (linfócitos e monócitos), onde se replicam por divisão binária. O

microrganismo se localiza no citoplasma celular e se reproduz no interior de

fagossomos na forma de corpúsculos iniciais. Os corpúsculos iniciais são

unidades do microrganismo que se unem para formar a mórula (ALMOSNY &

MASSARD, 2002).

À microscopia ótica, E. canis pode ser visualizada no citoplasma de

células sanguíneas mononucleares caninas como colônias de corpos cocóides,

denominadas mórulas intracitoplasmáticas (Figura 1).

5

Figura 1.Mórula de E. canis infectando leucócito de cão. Objetiva 100x. Fonte:http://thelifeofroyal.blogspot.com /2010/06/what-is-ehrlichiosis.html

O destino das mórulas são as células do sistema fagocitário

mononuclear (SFM), que são normalmente distribuídas pelo baço, fígado,

sangue e linfonodos). Por meio de estudos com microscopia eletrônica

constatou-se que a mórula é formada por um conjunto de microrganismos

pleomórficos, firmemente envoltos por uma dupla membrana, densamente

compactados dentro de um vacúolo. As mórulas medem cerca de 1.0 a 6.0 µm

de largura e contém de 1 a 40 organismos firmemente envoltos por uma

membrana (MENDONÇA et al., 2005; GREENE, 2006).

A infecção por E. canis é relatada mundialmente sendo mais

comumente encontrada nas regiões tropicais e subtropicais do mundo

(GREENE, 2006). A EMC é frequentemente diagnosticada acometendo cães

na América do Norte (TZIPORY et al., 2010), América do Sul (BULLA et al.,

2004), Europa (COCCO et al., 2003), Ásia (SUTO et al., 2001) e África

(GHORBEL et al., 2001).

No Brasil, a primeira descrição da doença causada por E. canis foi

feita em Belo Horizonte, Estado de Minas Gerais por COSTA et al. (1973).

Desde então, a E. canis foi diagnosticada em praticamente todos os Estados

brasileitos. Apesar da existência de relatos da EMC acometendo cães em todo

o país, dados precisos sobre a prevalência da doença nas diferentes áreas do

Brasil ainda são muito escassos (VIEIRA et al., 2011).

6

De acordo com Labarthe et al. (2003), aproximadamente 20%

dos cães atendidos em clínicas e hospitais veterinários nas regiões

sul, sudeste, centro-oeste e nordeste do Brasil são sorologicamente positivos

para E. canis.

O risco de infecção por E. canis é maior em cães que vivem em

casas do que aqueles que vivem em apartamentos. Provavelmente em virtude

da maior exposição dos cães que vivem em casas com quintais aos carrapatos

do que aqueles que vivem em apartamentos (COSTA Jr et al., 2007).

De acordo com Solano-Gallego et al. (2006), a variação na

prevalência da infecção por E. canis relaciona-se com o tipo de população

estudada, a região geográfica, o número total de cães avaliados em cada

estudo e o método de diagnóstico empregado.

A frequência de animais reagentes a E. canis obtida por dot-ELISA é

de 15,5% (104/671) para o Estado de São Paulo, 29,6% (125/422) no Rio de

Janeiro e 20,9% (93/446) em Minas Gerais (LABARTHE et al., 2003). Já a

frequência de E. canis obtida pela técnica de PCR, é de 21% no Paraná

(DAGNONE et al, 2003), 15% no Rio de Janeiro (MACIEIRA et al., 2005) e

7,8% em Ilhéus e Itabuna (Bahia) (CARVALHO et al., 2008).

A frequência de sororreagentes entre cães sintomáticos comumente

é elevada, sendo observada em 92,3% (48/52) dos cães avaliados por dot-

ELISA, na cidade de Jaboticabal/ SP (OLIVEIRA et al., 2000) e 88% dos cães

testados por nested-PCR do gene 16S rRNA, em Jaboticabal, SP (DAGNONE

et al., 2009).

2.1.2 Transmissão

O principal vetor da espécie E. canis em todo o mundo é o carrapato

Rhipicephalus sanguineus (Figura 2A), o qual é conhecido como carrapato

marrom do cão, uma espécie cosmopolita amplamente encontrada no Brasil,

assim como em outras áreas de clima tropical e subtropical (SHAW et al., 2001;

BREMER et al., 2005). Embora o Rhipicephalus sanguineus seja reconhecido

como o principal vetor da EMC, acredita-se que este não seja o único vetor da

doença. Johnson et al. (1998) demonstraram experimentalmente que o

Dermacentor variabilis (Figura 2B), também é capaz de transmitir E. canis aos

7

cães. Porém, não se tem relatos sobre o papel de outras espécies de

carrapatos na transmissão natural de E. canis em cães.

Figura 2.Vista dorsal de exemplares de carrapatos adultos, machos e fêmeas, vetores da Erliquiose Monocítica Canina. (A) Rhipicephalus sanguineus (B) Dermacentor variabilis. Fonte: LITTLE, 2010.

O R. sanguineus é encontrado principalmente em áreas urbanas,

onde atua ao longo do ano. Embora não muito comum, populações de

R. sanguineus também são encontradas em áreas rurais (Labruna et al. ,

2001).

No carrapato, as erliquias se disseminam a partir do intestino para

os hemócitos e para a glândula salivar. Durante a alimentação, os carrapatos

inoculam a secreção salivar contaminada com erlíquias no interior do sítio de

alimentação no hospedeiro. Os carrapatos sobrevivem como adultos sem se

alimentar, por 155 a 568 dias, e podem transmitir a infecção por até 155 dias

após se tornarem infectados (DAGNONE et al., 2001).

A contaminação de carrapatos por E. canis comumente ocorre

quando os carrapatos se alimentam nos estágios larval ou ninfal em

cães durante a fase aguda da infecção. Tentativas de transmissão de

E. canis para carrapatos que se alimentaram como ninfas em cães durante as

fases subclínica e crônica da infecção não foram bem sucedidas (LEWIS et al.,

1977).

A transmissão da EMC aos cães ocorre durante o parasitismo por

ninfas e/ ou adultos do carrapato R. sanguineus parasitados com E. canis, o

qual mantém a bactéria por transmissão transestadial. Como não ocorre

transmissão transovariana de E. canis em carrapatos, as larvas de R.

sanguineus não são importantes na transmissão, porém podem se infectar pelo

8

agente, e esta infecção se mantém nos estágios de ninfa e adultos (BREMER

et al., 2005). Embora a infecção natural nos cães ocorre principalmente durante

o repasto sanguíneo de carrapatos infectados com E. canis, transmissão de E.

canis aos cães também pode ocorrer por meio de transfusões sanguineas de

um cão infectado para outro suscetível (BORIN et al., 2009).

O vetor da EMC, R. sanguineus, é capaz de transmitir inúmeros

outras hemoparasitoses caninas, fato este que torna relativamente comum a

coinfecção de E. canis com outros hemoparasitos, como o Anaplasma sp.

(MOREIRA et al, 2003; DAGNONE et al, 2009), Babesia sp. (TRAPP et al.,

2006; BORIN et al., 2009), Hepatozoon sp. (MUNDIM et al., 2008) e

Mycoplasma sp. (MOREIRA et al., 2005).

Os hospedeiros vertebrados mais importantes e comuns da EMC

são os membros da família Canidae (cães, coiotes, raposa e chacal). Porém, já

foi relatado ocorrência na Venezuela de pelo menos seis casos clínicos

descritos de erliquiose humana causada por E. canis, indicando que este

agente pode causar infecções no homem (PEREZ et al., 2006).

2.1.3 Patogenia e Manifestação Clínica

Uma grande variedade de fatores, incluindo o tamanho do inóculo de

E. canis, podem influenciar o curso e o resultado da infecção nos cães. A

manifestação da doença pode ser afetada pela patogenicidade das diferentes

cepas de E. canis e por co-infecções com outros patógenos, como Babesia

canis vogeli e Hepatozoon canis transmitida pelo mesmo vetor (GREENE,

2006; HARRUS & WANER, 2011).

Durante o período de incubação de 8 a 20 dias, a E. canis se

multiplica em macrófagos do sistema mononuclear fagocitário, por fissão

binária, disseminando por todo o corpo. O curso subsequente da EMC tem sido

dividido em três fases, aguda, subclínica e crônica, baseada nos sinais clínicos

e anormalidades clínico-patológicas demonstradas em estudos por infecção

experimental. Porém a diferenciação precisa das fases da EMC na ocorrência

natural da infecção é difícil (GREENE, 2006).

A EMC é caracterizada por manifestações clínicas multissistêmicas,

que variam na intensidade de acordo com as fases da doença. Não existe

9

predileção de idade ou sexo para EMC, sendo relatada em cães com dois

meses a 13 anos de idade (SOUZA et al., 2010). Entretanto, cães pastor

alemão parecem ser mais suscetíveis do que outras raças (BORIN et al., 2009;

UENO et al., 2009).

A fase aguda da EMC dura de duas a quatro semanas. Durante esse

período, o microrganismo replica-se nas células mononucleares da circulação

sanguínea, e o parasita dissemina-se para órgãos como baço, fígado e

linfonodos, infectando as células mononucleares. Nesta fase ocorre

trombocitopenia entre 10 e 20 dias pós infecção e um aumento no número de

plaquetas imaturas circulantes, que persiste por toda a doença na maioria dos

animais (GREENE, 2006).

As principais alterações clínicas observadas na fase aguda são

apatia, anorexia, vômito, secreção oculonasal, esplenomegalia, mucosas

pálidas, petequias, epistaxe (Figura 3) e uveíte (NAKAGHI et al., 2008; BORIN

et al., 2009; HARRUS & WANER, 2011). Estes sinais clínicos geralmente

diminuem espontaneamente dentro de uma a quatro semanas, porém os cães

podem entrar numa fase assintomática ou subclínica, podendo permanecer

infectados por longos períodos (ORIÁ et al., 2004; GREENE, 2006).

Figura 3. Cão com epistaxe severa devido a infecção por E. canis. Fonte: LITTLE, 2010.

10

Os sinais oculares podem estar presentes em todas as fases da

doença e envolvem a maioria das estruturas oculares. A prevalência de lesões

oculares em casos de infecção natural varia de 10% a 15% e a severidade do

comprometimento ocular muda de paciente para paciente (ORIÁ et al. ,2004).

As lesões oftalmológicas incluem uveíte anterior, coriorretinite,

hemorragia da retina. A cegueira pode ocorrer como resultado da

hiperviscosidade sanguínea levando à hemorragia sub-retiniana e

descolamento de retina (HARRUS & WANER, 2011).

A fase subclínica da infecção ocorre após seis a nove semanas da

inoculação, mas pode durar meses ou ano. Nesta fase os cães

imunocompetentes podem eliminar o parasito e cessarem a doença, não

entrando na fase crônica (BREITSCHWERDT, 2004). Durante a fase subclínica

da EMC, o peso dos animais normaliza e a febre cessa (UENO et al., 2009).

Cães na fase subclínica apresentam-se clinicalmente saudáveis e

permanecem potenciais portadores persistentes por anos. Resultados de

infecções experimentais indicam que durante a fasesubclínica da EMC, a E.

canis encontra-se em maior quantidade no baço, sendo este o último órgão a

acomodar o parasita antes da sua eliminação (GREENE, 2006).

A fase crônica desenvolve-se em alguns animais após a fase

subclínica, e caracteriza-se por supressão medular, sangramentos por

mucosas e conjuntivas e alta letalidade, sendo comumente mais grave que as

outras fases da EMC. Nesta fase ocorre grave comprometimento da medula

óssea, a produção de elementos sanguíneos fica prejudicada, resultando em

pancitopenia (DAGNONE et al., 2001). Os sinais clínicos desta fase são

semelhantes aos observados na fase aguda, porém com maior intensidade e

gravidade. Frequentemente observa-se palidez das mucosas, fraqueza,

sangramento e perda de peso significativa (HARRUS & WANER, 2011).

Cães nesta fase podem eventualmente morrer por infecções

secundárias ou sangramentos incontroláveis. Portanto, a identificação da

doença antes de entrarem na fase crônica da EMC é muito importante para o

prognóstico (GREENE, 2006).

11

2.1.4 Achados laboratoriais

As anormalidades laboratorias tipicas na fase aguda inclui

tromboctipenia, leucopenia e anemia leve. De acordo com Nelson & Couto

(2006), a anemia nesta fase é do tipo normocítica normocrômica regenerativa,

devido à perda de sangue. A trombocitopenia nesta fase pode ocorrer por

aumento no consumo de plaquetas, aumento no sequestro esplênico e

destruição imunomediada ou por diminuição da meia vida das plaquetas. A

própria infecção por E. canis causa lise de plaquetas, porém, casos sem

trombocitopenia podem ocorrer. Ocorre também alteração na função das

plaquetas, com muitos animais apresentando sangramento superficial, mesmo

com o número de plaquetas e perfil de coagulação normais (ALMOSNY &

MASSARD, 2002; ACCETTA, 2008).

A fase sub-clínica da EMC é caracterizada por persistência variável

de trombocitopenia, leucopenia e anemia na ausência de sinais clínicos

(BREITSCHWERDT, 2004).

Dentre as alterações hematológicas relatadas com maior frequência

na fase crônica da EMC, destaca-se a anemia arregenerativa. Das alterações

presentes no leucograma, destacam-se o desvio nuclear de neutrófilos para a

esquerda, trombocitopenia e a eosinopenia. Outros achados como leucopenia

e monocitopenia são considerados menos frequentes (BORIN et al., 2009).

Após o exame clínico de rotina de animais suspeitos, e na ausência

de qualquer sinal clínico de outras doenças, o achado de trombocitopenia

frequentemente é usado como método de triagem ou mesmo para

diagnosticar EMC, seguido pelo tratamento com antibióticos. O problema é que

os sinais clínicos da EMC são comuns a outras enfermidades e a

trombocitopenia não ocorre apenas em cães com EMC (BULLA et al., 2004;

MACIEIRA et al., 2005; SANTOS et al., 2009).

A plaquetometria pode ser considerado um teste sensível, embora

pouco específico na triagem de cães clinicamente suspeitos de erliquiose

(BULLA et al., 2004; MACIEIRA et al., 2005). A magnitude da trombocitopenia

pode aumentar a fidedignidade do diagnóstico (BULLA et al., 2004).

12

A ocorrência de trombocitopenia em cães com EMC é muito comum.

De acordo com Bulla et al. (2004), 98,5% (66/67) dos cães de Botucatu/SP com

EMC apresentaram trombocitopenia no hemograma. Macieira et al. (2005) no

Rio de Janeiro/SP e Santos et al. (2009) em Ribeirão Preto/SP, encontraram

dados semelhantes relatando uma frequência de trombocitopenia em cães com

EMC de 88,23% (30/34) e 66,27% (57/86), respectivamente.

Em virtude da alta incidência de E. canis e de outros hemoparasitos

em cães no Brasil, a identificação correta do agente etiológico (ou de outras

doenças como a causa da trombocitopenia, especialmente quando E. canis é

descartada) continua a ser um problema para o veterinário clínico.

2.1.5 Diagnóstico

O diagnóstico da EMC é difícil e complexo, geralmente começa com

a avaliação clínica de um paciente com sinais clínicos, histórico da presença de

carrapatos e achados de trombocitopenia. A confirmação laboratorial do

diagnóstico pode ser realizada por meio do exame parasitológico direto, cultivo,

sorologia e técnicas de biologia molecular (DAGNONE et al., 2003). Para

maximizar a probabilidade de se chegar a um diagnóstico, ensaios sorológicos

e testes de biologia molecular devem ser realizados em conjunto com uma

avaliação cuidadosa de esfregaços de sangue em qualquer paciente com

suspeita de EMC. A cultura de células geralmente é reservado para

laboratórios de pesquisa especializados (LITTLE, 2010).

A) Exame parasitológico direto

O exame parasitológico direto é um método de diagnóstico

rotineiramente utilizado em clínicas e hospitais veterinários para pesquisa de

hemoparasitos por ser de rápida execução e possuir um baixo custo (ALVES

et al., 2005).

A suspeita clínica de EMC pode ser confirmada por meio de achados

de mórulas (inclusões) de E. canis em leucócitos de esfregaços sanguíneos

(Figura 1) ou creme leucocitário (WOODY & HOSKINS, 1991). No entanto, é

13

importante ressaltar que a ausência de parasitos em esfregaços de sangue ou

creme leucocitário não exclui a possibilidade de infecção (BORIN et al., 2009).

Figura 1. Mórula de E. canis infectando leucócito de cão. Objetiva 100x. Fonte:http://thelifeofroyal.blogspot.com /2010/06/what-is-ehrlichiosis.html

O exame parasitológico direto do esfregaço sanguíneo é específico

porém pouco sensível. E de acordo com Harrus & Waner (2011) esta técnica é

mais indicada para o diagnóstico na fase aguda da infecção, pois a detecção

de mórulas de E. canis ocorre por um curto período de tempo nos leucócitos

(monócitos e macrófagos), e a visualização durante as fases subclínicas e

crônicas é extremamente rara, conduzindo a resultados falsos negativos.

Todavia, a busca por mórulas em monócitos circulantes é o método de

diagnóstico mais rotineiro para a EMC, mas em muitos casos ineficaz, pois a

detecção direta de E. canis é dificil e incomum (NAKAGHI et al., 2008).

Na EMC, a identificação de mórulas no esfregaço sanguíneo ocorre

apenas nas duas primeiras semanas da infecção e em pequenas quantidades,

devido à baixa parasitemia e a porcentagem de células infectadas raramente

ultrapassarem 1%. A visualização de mórulas de E. canis nos monócitos é

observada em apenas 4% dos casos de erliquiose (HARRUS & WANER,

2011).

Oliveira et al. (2000) ao analisarem através do exame parasitológico

direto, 48 amostras de sangue de cães de Jaboticabal-SP, positivas no dot-

14

ELISA, verificaram a presença de mórulas de E. canis em apenas uma das

amostras avaliadas, obtendo uma frequência de apenas 2% (1/48). Resultados

semelhantes foram observados por Faria et al. (2010), os quais verificaram

pelo exame parasitológico direto uma frequência de E. canis de 5,7% (2/35) em

cães sintomáticos de Jaboticabal-SP.

O exame parasitológico direto embora seja um exame altamente

conclusivo para o diagnóstico das hemoparasitoses, apresenta pouca

sensibilidade devido ao nível de parasitemia flutuante do agente etiológico,

mesmo em casos de doença clínica, principalmente nas fases crônicas

(GREENE, 2006).

B) Testes sorológicos

As bactérias do gênero Ehrlichia induzem resposta humoral

específica, base para o diagnóstico sorológico, ocorrendo soroconversão nos

animais algumas semanas após a infecção (OTRANTO et al., 2009).

Vários métodos sorológicos têm sido desenvolvidos para o

diagnóstico da EMC e são considerados valiosas ferramentas de triagem.

Dentre os testes sorológicos, a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) é

utilizada no diagnóstico da erliquiose, sendo aplicável tanto para estudos de

infecções experimentais quanto naturais. A propagação de E. canis em cultura

celular tem sido a base para produção de antígenos a serem aplicados em

testes sorológicos, havendo detecção de anticorpos precoces em até sete dias

pós-infecção, embora a maioria dos cães se tornam soropositivos somente

após 28 dias da infecção (HARRUS et al., 1997).

Pela RIFI, a soropositividade começa entre 7 a 21 dias após a

infecção, chega a níveis máximos após 80 dias e persiste, a menos que se

efetue o tratamento (ALMOSNY & MASSARD, 2002).

A RIFI é um teste para a pesquisa de anticorpos anti- E. canis.

Porém, embora ocorra o emprego de testes sorológicos para o diagnóstico da

erliquiose, sabe-se que as várias espécies de erlíquias dividem antígenos em

comum, gerando reações cruzadas entre espécies do mesmo gênero. Além

disso, os testes sorológicos não são capazes de distinguir uma infecção

15

corrente de uma exposição prévia sem estabelecimento ou persistência de

infecção (AGUIAR et al., 2007b).

Títulos de IgG 1:40 são considerados positivos para a exposição por

E. canis (Figura 4). Para infecções agudas, são recomendados dois testes

consecutivos, com intervalo de 7-14 dias, um aumento de 4 vezes em

títulos de anticorpos é sugestivo de uma infecção ativa. Anticorpos IgG anti-

Ehrlichia persistem por vários meses após o tratamento

e eliminação da bactéria (WANER & HARRUS, 2011).

Figura 4. Fotomicrografia de células DH82 infectadas com E. canis com reação fluorescente positiva (setas). Notar a fluorescência positiva de forma difusa, caracterizando aparentemente antígenos solúveis (A) no citoplasma celular, corpúsculos elementares e iniciais (B), bem como a presença de mórulas (C). Imunofluorescência indireta; 40. Fonte: AGUIAR et al., 2007b.

Além do RIFI, testes imuno enzimáticos (ELISA) têm sido

desenvolvidos e utilizados no diagnóstico da doença. Kits ImmunoComb Dot-

ELISA para a detecção de anticorpos IgG contra E. canis estão disponíveis

comercialmente (HARRUS et al., 2002). Oliveira et al., 2000 ao utilizarem o Kit

Dot-Elisa em 52 cães com sintomatologia compatível com EMC, relataram uma

frequência de animais sororeagentes em 92,32% dos cães estudados, apenas

quatro cães, foram negativos através do emprego do Kit ImmunoComb,

demonstrando uma boa sensibilidade do teste. Os resultados do dot-ELISA são

de fácil leitura por pessoal não treinado.

16

O kit Immunocomb (BIOGAL), é capaz de determinar anticorpos do

tipo IgG específicos para o parasito. O teste pode ser realizado com sangue

total ou soro, é de fácil execução, rápido, e a leitura é direta, observando-se a

coloração final da reação (ANDEREG & PASSOS, 1999). Este teste é muito útil

no monitoramento dos níveis de anticorpos, principalmente nas fases

subclínica e crônica, onde é muito difícil o encontro da E. canis em esfregaço

sanguíneo. Também é útil no monitoramento dos níveis de anticorpos pós

tratamento (VIGINARD-ROSEZ et al., 2001).

Após o tratamento, os títulos de anticorpos tendem a diminuir de

forma lenta e gradual e o animal torna-se comumente negativo após 15 a 30

meses. Em áreas endêmicas, cães podem apresentar um alto título de IgG

para E. canis, sem demonstrar a doença clinicamente, causando um aumento

no número de falsos-positivos nessas regiões (BULLA et al., 2004).

A principal desvantagem dos métodos sorológicos é a dificuldade de

distinguir uma infecção atual de uma exposição prévia. Além disso, pode

ocorrer reação cruzada com outras espécies de Ehrlichia (DAGNONE et al.,

2001; WANER et al., 2001).

A interpretação dos resultados de exames sorológicos deve

considerar o curso da doença, a reatividade cruzada com outras espécies de

Ehrlichia, infecções múltiplas com outros agentes transmitidos por carrapatos e,

também, títulos de anticorpos persistentes após o tratamento.

C) Isolamento

O cultivo in vitro de E. canis vem sendo realizado em diversas partes

do mundo (KEYSARY et al., 1996; UNVER et al., 2001). A E. canis pode ser

cultivada in vitro em células DH82 (células histiocitárias de cães), linhagem

originária de monócitos caninos, que foi adaptada em cultivo celular a partir de

células obtidas de um caso de histiocitoma (WELLMAN et al., 1988). Até o

momento, são vários os isolados de E. canis cultivados in vitro e geneticamente

caracterizados na América do Norte e no Velho Mundo. No caso da América

Latina, o isolamento in vitro de E. canis cães tem sido reportado apenas na

Venezuela (UNVER et al., 2001) e no Estado do Rio de Janeiro (TORRES et

al., 2002) e São Paulo (Figura 5) (AGUIAR et al., 2007b), no Brasil. Outras

17

linhagens celulares têm se mostrado útil para o isolamento in vitro de E. canis,

como macrófago peritoneal canino (STEPHENSON & OSTERMAN, 1977),

monócito primário canino (HEMELT et al., 1980), célula endotelial humana

(DAWSON et al., 1993) e células macrofágicas de camundongos BALB/C

(KEYSARY et al., 2001).

Figura 5. Fotomicrografias de células DH82 provenientes de monocamada inoculada com o isolado de Jaboticabal, SP, apresentando mórulas de E. canis (setas) aos 28 dias pós-inoculação. Panótico rápido (Laborclin®); 100X. Fonte: AGUIAR et al., 2007b.

No entanto, esta é uma técnica demorada não disponíveis na

maioria dos laboratórios. Culturas também exigem instalações especializadas

de laboratório e pessoal altamente treinado.

D) Biologia Molecular

O surgimento e desenvolvimento da biologia molecular foi um dos

maiores passos das ciências biológicas durante o século XX. A descoberta da

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) trouxe inúmeros benefícios para o

desenvolvimento científico, destacando-se o sequenciamento de genomas, a

expressão de genes em sistemas recombinantes, o estudo de genética

molecular, a determinação rápida da paternidade e o diagnóstico rápido de

deonças infecciosas (NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004).

A técnica de amplificação de DNA de E. canis pela reação em

cadeia da polimerase (PCR) têm promovido maior sensibilidade, especificidade

e diagnóstico direto de confiança, podendo ser empregado com eficácia nas

diferentes fases clínicas da infecção (NAKAGHI et al., 2008; HARRUS &

WANER, 2011).

18

A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR, do inglês Polymerase

Chain Reaction) é uma metodologia que pode ser executada inteiramente In

vitro sem o uso de células. A técnica da PCR foi desenvolvida nos anos 80 por

Kary Mullis, que recebeu, em 1994, o prêmio Nobel (NOVAIS & PIRES-ALVES,

2004).

A PCR possibilita a síntese de fragmentos de DNA-polimerase, a

mesma que participa da replicação do material genético nas células. Esta

enzima sintetiza uma sequência complementar de DNA, desde que um

pequeno framento (o iniciador, oligonucleotídeo, ou primer, em inglês) já esteja

ligado a uma das cadeias do DNA no ponto escolhido para o início da síntese.

Os iniciadores definem a sequência a ser replicada e o resultado obtido é a

amplificação de uma determinada sequência DNA com bilhões de cópias

(MULLIS, 1990).

A técnica de PCR comumente é realizada em uma única etapa e é

capaz de diferenciar as espécies de Ehrlichia, pela detecção de sequências

específicas no DNA da bactéria. O desenvolvimento de ensaios moleculares

para a detecção rápida e eficaz da EMC vem se mostrado eficaz. Um número

limitado de genes alvos estão disponíveis para a detecção espécie específica

de E. canis. Ensaios de PCR para E. canis tem como alvo mais comum o gene

16S RNA (ALVES et al., 2005; PINYOOWONG et al., 2008), mas outros alvos,

incluindo P28 (NAKAGHI et al., 2010) e a protéina dsb (DOYLE et al., 2005)

têm sido utilizados para a detecção de E. canis.

Uma das variações da técnica de PCR é a nested-PCR, em que o

segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até

mesmo seqüências localizadas fora dela, e utilizando-se este primeiro produto,

segue-se à amplificação da real seqüência-alvo. Estas duas etapas podem ser

realizadas concomitantemente, ou em duas reações separadamente,

caracterizando o Semi-Nested PCR. Alguns trabalhos ressaltam que a

utilização da nested-PCR aumenta a sensibilidade da técnica (WEN et al.,

1997; MURPHY et al., 1998).

A nested-PCR é muito sensível e específica para a detecção de E.

canis, sendo útil para o diagnóstico laboratorial (MURPHY et al., 1998) e para

verificação da eficácia in vivo de antibióticos contra essa infecção (WEN et al.,

19

1997; BRANGER et al., 2004). A nested-PCR em virtude da sua sensibilidade

elevada, tem sido usado com frequência para a detecção de E. canis, (WEN et

al., 1997; MURPHY et al., 1998; VINASCO et al., 2007; MACIEIRA et al., 2005;

MYLONAKIS et al., 2009), porém como é realizado em duas etapas envolve

custo e trabalho adicional e pode ser mais suscetível a falsos positivos como

resultado de contaminação da primeira etapa.

Uma análise comparativa entre a PCR (gene dsd) e a nested-PCR

(16S rRNA), realizada em 24 amostras de sangue de cães naturalmente

infectados por E. canis, demonstrou que as duas técnicas são adequadas ao

diagnóstico da EMC (MACHADO, 2004). As vantagens adicionais da PCR em

etapa única são a redução de falsos-positivos devido à contaminação por

amplicons da primeira etapa e a diminuição no tempo de execução da técnica,

sendo também muito utilizada no diagnóstico da EMC (ALVES et al., 2005;

SIARKOU et al., 2007; PINYOOWONG et al., 2008).

A infecção concomitante de E. canis com outros hemoparasitos

comumente é frequente em regiões endêmicas. Dessa forma, buscando

facilitar o diagnóstico das principais hemoparasitoses caninas, protocolos que

detectam mais de um agente etiológico em uma mesma reação têm sido

desenvolvidos. KLEDMANEE et al. (2009) desenvolveram um Multiplex de PCR

convencional capaz de realizar a detecção simultânea de E. canis, Babesia sp.

e Hepatozoon canis, em uma mesma amostra de sangue canino.

A técnica de amplificação do DNA a partir de amostras clínicas é

importante para a detecção e diferenciação das espécies de Ehrlichia porque

esses organismos crescem lentamente e em limitadas linhagens celulares e,

ainda, há vários níveis de reação cruzada limitando a diferenciação sorológica

entre várias espécies. A PCR possui a vantagem de detectar o DNA erliquial

nos primeiros dias pós-infecção e é bastante específica, desde que usados

oligonucleotideos que amplifiquem o DNA da espécie investigada (SUMMER et

al., 1997). Utilizando PCR, é possível isolar DNA e identificar E. canis a partir

de amostras de sangue, baço, linfonodos, rins, fígado, médula óssea (GAL et

al., 2008) e soro (MYLONAKIS et al., 2009).

A PCR convencional é um método que possui alta especificidade e

sensibilidade, mas possui algumas limitações, como a possibilidade de

20

contaminação com o brometo de etídio no processamento pós amplificação, os

resultados não são expressos em números (não é quantitativa) e a

discriminação é baseada apenas no tamanho do fragmento. Além da

possibilidade de ocorrer resultados falso-positivos ocasionados por

contaminação do ambiente de trabalho por DNA amplificado em virtude da alta

sensibilidade do método de PCR. E estas restrições podem ser minimizadas ou

até mesmo evitadas com o uso da PCR em Tempo Real (DO CARMO &

FIORINI, 2007).

A inovação tecnológica resultante da PCR, denominada de PCR em

Tempo Real, vem ganhando espaço nos diagnósticos clínicos e nos

laboratórios de pesquisa por apresentar a capacidade de gerar resultados

quantitativos. Essa técnica permite o acompanhamento da reação e a

apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, em relação à

PCR que apresenta somente resultados qualitativos (NOVAIS & PIRES-

ALVES, 2004).

A PCR em tempo real requer uma plataforma de instrumentação que

contém um termociclador acoplado a um sistema ótico para a excitação da

fluorescência e captura da emissão, além de um computador para aquisição de

resultados e análise final da reação. Durante a PCR em Tempo Real, o

acúmulo de amplicons é detectado em "tempo real", para cada ciclo da reação,

por meio da excitação de fluorocromos que marcam sondas seqüência-

específicas ou primers usados na reação (HEID et al., 1996; NOVAIS & PIRES-

ALVES, 2004).

O PCR em tempo real é mais sensível do que PCR convencional,

além de permitir a quantificação da carga bacteriana. Esta técnica de

diagnóstico tem sido utilizada para quantificar a carga de Ehrlichia em cães

infectados naturalmente e experimentalmente (BANETH et al., 2009). A

probabilidade de contaminação na PCR em tempo real é menor do que a

PCR convencional. Dessa forma, a PCR em tempo real vem se tornando

rapidamente o método preferencial para o diagnóstico de E. canis (HARRUS &

WANER, 2011).

A detecção de E. canis pelo PCR em tempo real torna-se

interessante uma vez que esta técnica permite a quantificação e rapidez de

21

resultado, pois não requer a detecção em gel de eletroforese, necessário na

análise da PCR convencinal.

A PCR em tempo real realiza a quantificação dos ácido nucléicos de

maneira precisa e com maior reprodutibilidade, porque determina valores

durante a fase exponencial da reação. O ponto que detecta o ciclo na qual a

reação atinge o limiar da fase exponencial é denominado de Cycle Threshold

(CT) (Figura 6). Este ponto permite a quantificação exata e reprodutível

baseado na fluorescência. A emissão dos compostos fluorescentes gera um

sinal que aumenta na proporção direta da quantidade de produto da PCR. Os

compostos fluorescentes mais utilizados são o SYBR Green e o TaqMan

(NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004).

Figura 6. Curva de amplificação do PCR em Tempo Real. CT-Cycle Threshold. A amplificação mostra 3 fases distintas (1) linha basal: Não houve produtos da PCR suficiente para detectar a fluorescência; (2) fase log: a quantidade de produtos da PCR dobra a cada ciclo e (3) fase platô: não há mais aumento no número de produtos. Fonte: NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004.

O desenvolvimento de protocolos Multiplex de PCR em tempo real é

possível e pode ser utilizado na detecção simultânea e quantificação

22

de diversos patógenos na mesma amostra, diminuindo assim o tempo de

trabalho e o custo da reação. No entanto, comumente ocorre uma redução da

sensibilidade e precisão (FERRIE et al., 1992). Existem duas principais

abordagens para a detecção quantitativa de patógenos usando PCR em

tempo real: uma com compostos fluorescentes inespecíficos tais

como SYBR Green e outra com sondas específicas, tais como sondas TaqMan

(LIVAK et al., 1995).

O composto florescente SYBR Green se liga entre a fita dupla de

DNA (Figura 7) e com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do

termociclador, emite uma fluorescência verde. No começo da amplificação, a

mistura da reação contém o DNA desnaturado, os iniciadores e o SYBR Green

(NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004).

Figura 7. Molécula de SYBR Green entre a fita dupla de DNA.

Fonte: NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004

As vantagens da utilização do SYBR Green são: baixo custo,

facilidade no uso e sensibilidade. A desvantagem é a ligação em todo DNA fita

dupla que surge durante a reação, incluindo produtos inespecíficos, podendo

superestimar a concentração do fragmento alvo (NOVAIS & PIRES-ALVES,

2004).

O composto fluorescente TaqMan é uma sonda (fragmento de DNA

marcado usado para hibridizar outra molécula de DNA) utilizada para detectar

sequências específicas nos fragmentos de DNA amplificados na PCR. Por ser

mais específica que o SYBR Green, a sonda TaqMan é a mais utilizada no

desenvolvimento de protocolos de PCR em tempo real para o diagnóstico da

EMC (DOYLE et al., 2005; BANETH et al., 2009; PELEG et al., 2010).

23

A sonda TaqMan apresenta em uma extremidade um floróforo, e na

outra extremidade um quencher (molécula que aceita energia do floróforo na

forma de luz e a dissipa na forma de luz ou calor) como mostrado na Figura 8.

Figura 8. Ilustração de uma sonda TaqMan. F- Fluoróforo e Q- Quencher. Fonte: NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004.

Os podutos da reação são detectados pela fluorescência gerada

após a atividade exonuclease 5‟ → 3‟ da Taq DNA polimerase. Durante a PCR

em tempo real a sonda TaqMan hibridiza com a sequência da fita simples de

DNA complementar alvo para amplificação. No processo de amplificação a

sonda TaqMan é degradada devido à atividade exonuclease 5‟ → 3‟ da Taq

DNA polimerase, separando o quencher da molécula fluorescente durante a

extensão. A separação do fluoróforo do quencher resulta em um aumento da

intensidade de fluorescência (Figura 9). Assim, durante o processo de

amplificação a emissão de luz é aumentada de forma exponencial. Esse

aumento da fluorescência ocorre apenas quando a sonda hibridiza e quando a

amplificação da sequência alvo é estabelecida (HEID et al., 1996; NOVAIS &

PIRES-ALVES, 2004).

24

Figura 9. PCR em Tempo Real com sonda TaqMan Fonte: NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004

A reação com TaqMan é considerada um método sensível para

determinar a presença ou ausência de sequência específicas. Vários

protocolos de multiplex de PCR em tempo real já estão disponíveis para a

detecção simultânea de diversos patógenos. Porém, protocolos de PCR em

tempo real e Multiplex PCR para a detecção de E. canis e detecção específica

de espécies do gênero Ehrlichia ainda são muito escassos.

O primeiro multiplex de PCR em tempo real capaz de detectar e

discriminar três espécies de Ehrlichia clinicamente importantes em uma única

reação de amplificação do gene da proteína (dsb) foi descrito por Doyle et al.

(2005). O multiplex desenvolvido possui uma satisfatória sensibilidade analítica

e é capaz de distinguir especificamente amplicons de E. chaffeensis, E.ewingii

e E. canis, detectando também coinfecções em uma mesma amostra.

Este protocolo inovador, é útil para o diagnóstico e tratamento tanto de animais

de companhia como de pacientes humanos infectados, podendo também ser

utilizado em estudos epidemiológicos.

25

Baneth et al., em 2009, desenvolveram um protocolo de PCR em

tempo real usando a região 16S rRNA de E. canis. As sondas e primers

desenhados foram espécie específica para E. canis e apresentou sensibilidade

satisfatória. Peleg et al., em 2010 ao analisarem a importância da detecção

simultânea de mais de um hemoparasito em uma mesma amostra devido a

redução dos custos e tempo de execução da técnica descreveram um

protocolo de PCR em tempo real capaz de detectar simultaneamente

E. canis e B. canis vogeli, os quais são dois importantes patógenos de

cães transmitidos pelo mesmo vetor, R. sanguineus.

É inegável a contribuição dos ensaios de biologia molecular, tais

como PCR em tempo real para o diagnóstico precoce da EMC, bem como para

o desenvolvimento de estudos epidemiológicos na identificação de agentes

infecciosos potencialmente letais e de difícil cultivo. A necessidade de

desenvolvimento de métodos de diagnóstico altamente sensíveis é cada vez

maior em decorrência da importância de um diagnóstico precoce. E o emprego

de testes de diagnóstico rápido e altamente sensível e específico capaz de

detectar E. canis, incluindo co-infecções de E. canis com outros hemoparasitos

em uma mesma amostra é extremamente valioso para o diagnóstico eficaz, o

qual servirá para sustentar o emprego da terapêutica adequada e contribuirá

para o prognóstico da doença.

26

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A Erliquiose Monocítica canina é uma doença multissistêmica

potencialmente fatal para os cães, sendo frequente nas regiões tropicais e

subtropicais. É transmitida pelo carrapato R. sanguineus, o qual é abundante

no Brasil e ocorre durante todo o ano, contribuindo dessa forma para a

manutenção da E. canis no país. O controle da infestação por carrapatos em

cães é muito difícil e representa um grande desafio para os proprietários e

clínicos veterinários.

A EMC é endêmica no Brasil e por apresentar alta letalidade quando

não tratada, necessita de um diagnóstico rápido e preciso para que o

tratamento específico seja instituído. Porém, o diagnóstico da EMC é

extremamente complicado e trabalho e requer o uso em conjunto de várias

técnicas de diagnóstico. Avaliação das manifestações clínicas, testes

sorológicos e moleculares são todos importantes e necessários para o

diagnóstico preciso dessa doença.

Os sinais clínicos da doença são inespecíficos e comuns a inúmeras

outras doenças transmitidas por carrapatos e a sorologia não é capaz de

diferenciar uma infecção atual de uma exposição prévia, além de apresentar

reação cruzada entre as espécies do mesmo gênero.

Avanços na área de biologia molecular têm proporcionado métodos

altamente específicos e sensíveis, para identificação direta do agente etiológico

da EMC. Entre estas técnicas, destaca-se a reação em cadeia da polimerase

(PCR), que possibilita um diagnóstico preciso e seguro. Vários protocolos

de PCR têm sido desenvolvidos para o diagnóstico da infecção por E. canis em

cães, sendo capazes de indicar uma infecção ativa e identificar a espécie

infectante, constituindo importantes ferramentes de diagnóstico da doença.

Dessa forma, as técnicas moleculares surgem como metodologia

alternativa que sobrepõem as limitações das técnicas convencionais de

diagnóstico, identificação e diferenciação de microrganismos.

27

REFERÊNCIAS

1. ACCETTA, E.M.T. Ehrlichia canis e Anaplasma platys em cães (canis familiaris, linnaeus, 1758) trombocitopênicos da região dos lagos do Rio de Janeiro. 2008. 73f. Dissertação (Mestrado em medicina veterinária), Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica. 2. AGUIAR, D. M.; GUACYARA T. CAVALCANTE, G.T.; ADRIANO PINTER, A.; SOLANGE M. GENNARI,S.M.; CAMARGO, L.M.A.;LABRUNA, M.B. Prevalence of Ehrlichia canis (Rickettsiales: Anaplasmataceae) in dogs and Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) ticks from Brazil. Journal of Medical Entomology, v. 44, n. 1, p. 126-132, 2007a. 3. AGUIAR, D.M.; SAITO, T.B.; HAGIWARA, M.K.; MACHADO, R.Z.; LABRUNA, M.B. Diagnóstico sorológico de erliquiose canina com antígeno brasileiro de Ehrlichia canis. Ciênc. Rural., v. 37, p. 796-802, 2007b. 4. ALMOSNY, N.R.P; MASSARD, C.L. Erliquiose em pequenos animais e como zoonose. In: ALMOSNY, N.R.P. Hemoparasitoses em Pequenos Animais Domésticos e como Zoonoses. 1 ed. Rio de Janeiro: L.F. Livros Ltda., 2002. p. 14-56. 5. ALMEIDA, P.S.R.; SADDI, V.A. Monitoramento de doença residual mínima em leucemia mielóide crônica por PCR em tempo real. Rev. bras. hematol. hemoter., v.29, n.4, p.382-386, 2007. 6. ALVES, L. M.; LINHARES, G. F. C.; CHAVES, N. S. T.; MONTEIRO, L. C.; LINHARES, D. C. L. Avaliação de iniciadores e protocolo para o diagnóstico da pancitopenia tropical canina por PCR. Ciên Animal Bras. Goiânia, v. 6, n. 1, p. 49-54, 2005. 7. ANDEREG, P. I.; PASSOS, L. M. F. Erliquiose canina – Revisão. Clinica Veterinária, v. 4, n. 19, p. 31-38, 1999. 8. BANETH, G.; HARRUS, S.; OHNONA, F.S.; SCHLESINGER, Y. Longitudinal quantification of Ehrlichia canis in experimental infection with comparison to natural infection. Veterinary Microbiology, V.136, p. 321–325, 2009.

9. BORIN, S.; CRIVELENTI, L.Z; FERREIRA, F.A. Aspectos epidemiológicos, clínicos e hematológicos de 251 cães portadores de mórula de Ehrlichia spp. naturalmente infectados. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.61, n.3, p.566-571, 2009.

10. BRANGER, S.; ROLAIN, J. M.; RAOULT, D. Evaluation of Antibiotic Susceptibilities of Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, and Anaplasma phagocytophilum by Real-Time PCR. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.48, n.12, p. 4822-4828, 2004. DOI: 10.1128/AAC.48.12. 4822-4828.2004

28

11. BREITSCHERDT, E.B. Riquetsioses.In: ETTINGER, S.J.; FELDMAN, E.C. Tratado de Medicina Interna Veterinária. Doenças do Cão e do Gato. 5 ed. Rio de Janeiro: Guanabara koogan, 2004, p.422-429.

12. BREMER, W. G.; SCHAEFER, J.J.; WAGNER, E.R.; EWING, S.A.; RIKIHISA, Y.; NEEDHAM, G.R.; JITTAPALAPONG, S.; MOORE, D.L.; STICH, R.W.Transstadial and intrastadial experimental transmission of Ehrlichia canis by male Rhipicephalus sanguineus.Veterinary Parasitology, v. 131, n. 1-2, p. 95-105, 2005. 13. BULLA, C.; TAKAHIRA, R.K.; ARAUJO, J.P.; TRINCA, L.A.; LOPES, R.S.; WIEDMEYER, C.E.The relationship between the degree of thrombocytopenia and infection with Ehrlichia canis in an endemic area. Vet. Res., v. 35, p. 141-146, 2004. 14. CARVALHO, F. S.; WENCESLAU, A.A.; CARLOS, R.S.A.; ALBUQUERQUE, G.R. Epidemiological and molecular study of Ehrlichia canis in dogs in Bahia, Brazil. Genetic and Molecular Research, v. 7, n. 3, p. 657-662, 2008. 15. COCCO, R; SANNA, G.; CILLARA, M.G.; TOLA, S.; XIMENES, L.; PINNAPARPAGLIA, M.L.; MASALA, G. Ehrlichiosis and rickettsiosis in a canine population of Northern Sardinia. Annals of the New York Academy of Sciences,v. 990, p. 126-130, 2003. 16. COSTA, J.O.; BATISTA-JÚNIOR, J.A.; SILVA, M.; GUIMARÃES, M.P. Ehrlichia canis infection in dog in Belo Horizonte, Brazil. Arq. Esc. Vet. UFMG., v. 25, p. 199-200, 1973. 17. COSTA Jr, L.M.; REMBECK, K.; RIBEIRO, M.F.; BEELITZ, P.; PFISTER, K.; PASSOS, L.M. Sero-prevalence and risk indicators for canine ehrlichiosis in three rural areas of Brazil. Vet J., v.174(3), p. 673-676, 2007. 18. DA SILVA, J. N.; DE ALMEIDA, A. B. P. F.; SORTE, E.V.B.; DE FREITAS, A.G.; DO SANTOS, L.G.F.; AGUIAR, D. M.; SOUSA, V. R. F. Soroprevalência de anticorpos anti-Ehrlichia canis em cães de Cuiabá, Mato Grosso. Rev. Bras. Parasitol. Vet., Jaboticabal, v. 19, n. 2, p. 108-111, abr.-jun. 2010. doi:10.4322/rbpv.01902008. 19. DAGNONE, A.S.; MORAIS, H. S A.; VIDOTTO, O. Erliquiose nos animais e no homem. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 22, n.2, p. 191-201, 2001. 20. DAGNONE, A.S.; MORAIS, H.S.A.; VIDOTTO, M.C.; JOJIMA, F.S.; VIDOTTO, O. Ehrlichiosis in anemic, thrombocytopenic, or tick-infested dogs from a hospital population in south Brazil. Vet. Parasit., Estados Unidos, v. 117, p. 285-290, 2003. 21. DAGNONE, A. S.; DE SOUSA, A.I; ANDRÉ, M.R.; MACHADO, R.Z. Molecular diagnosis of Anaplasmataceae organisms in dogs with clinical and

29

microscopical signs of ehrlichiosis.Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 18, n. 4, p. 20-25,2009. 22. DAWSON, J.E.; CANDAL, F.J.; GEORGE, V.G.; ADES, E.W. Human endothelial cells as an alternative to DH82 cells for isolation of Ehrlichia chaffeensis, E. canis, and Rickettsia rickettsii. Pathobiol, v.61, p.293-296, 1993. 23. DO CARMO, E.F.S.; FIORINI, A. Principais técnicas moleculares para detecção do papilomavírus humano. Sabios-rev. saúde e biol., v. 2, n. 1, p. 29-31, 2007. 24. DONATIEN, A.; LESTOQUARD, F. Existence en Algére d´une Rickettsia du chien. Bull. Soc. Pathol. Exot., v. 28, p. 408-409, 1935. 25. DOYLE,C.K.; LABRUNA, M.B.; BREITSCHWERDT, E.B. ; TANG,Y.W.; CORSTVET, R.E.; HEGARTY, B.C.; BLOCH, K.C.; LI,P.; WALKER, D.H.; MCBRIDE, J.W. Detection of Medically Important Ehrlichia by Quantitative Multicolor TaqMan Real-Time Polymerase Chain Reaction of the dsb Gene. Journal of Molecular Diagnostics, v.7, n.4, p. 504-510, 2005. 26. DUMLER, J. S.; BARBET, A. F.; BEKKER, C. P.; DASCH, G. A.; PALMER, G. H.; RAY, S. C.; RIKIHISA, Y.; RURANGIRWA, F. R. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and „HGE agent‟ as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila. Int. J. S. E. Microbiol., California, v. 51, p. 2145-2165, 2001. 27. FARIA, J. L. M. et al. Ehrlichia canis morulae and DNA detection in whole blood and spleen aspiration samples. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 19, n. 2, p. 98-102, 2010. 28. FAWLEY, W.N.; WILCOX, M.H. Molecular diagnostic Techniques. Medicine, v.33, n.3, p. 26-32, 2005.

29. FERRIE, R.M., SCHWARZ, M.J., ROBERTSON, N.H., VAUDIN, S., SUPER, M., MALONE, G., LITTLE, S. Development, multiplexing, and application of ARMS tests for common mutations in the CFTR gene. Am. J. Hum. Genet, v.51, p. 251-262, 1992. 30. GAL, A.; LOEB, E.; YISASCHAR-MEKUZAS, Y.; BANETH, G. Detection of Ehrlichia canis by PCR in different tissues obtained during necropsy from dogs surveyed for naturally occurring canine monocytic ehrlichiosis. The Veterinary Journal, v. 175, p. 212–217, 2008. 31. GHORBEL, A.; AYED, M.B.;DIWANI, E.; GHRAM, A.; LANDOLSI, F.; MESSAADI, L.; ZRELLI, S.; CHABCHOUB, A. Incidence and seroprevalence of

30

canine ehrlichiosis in the Medjez El Bab region (northewestern Tunisia) during 1994, 1995 and 1996. Arch. Inst. Pasteur Tunis., v. 78, p. 41-47, 2001. 32. GREENE, C.E. Infectious Diseases of the dog and cat. 3 Ed., St. Louis, Elsevier, 1387 p., 2006. 33. HARRUS, S.; WANER, T.; BARK, H. Canine monocytic ehrlichiosis update. Compendium for Continuing Education for the Practicing Veterinarian, v.19, p. 431–444, 1997. 34. HARRUS, S., ALLEMAN, A.R., BARK, H., MAHAN, S.M., WANER, T. Comparison of three enzyme-linked immunosorbant assays with the indirect immunofluorescent antibody test for the diagnosis of canine infection with Ehrlichia canis. Veterinary Microbiology, v.86, p. 361–368, 2002. 35. HARRUS, S.; WANER, T. Diagnosis of canine monocytotropic ehrlichiosis (Ehrlichia canis): An overview. The Veterinary Journal, v. 187, p. 292–296, 2011. doi:10.1016/j.tvjl.2010.02.001. 36. HELMET, I.E. et al. Serial propagation of Ehrlichia canis in primary canine peripheral blood monocytes cultures. Cornell Vet., v.70, p.37-42, 1980.

37. INOKUMA, H.; OHASHI, M.J.; TANABE S.; MIYAHARA, K. Prevalence of tick-borne Rickettsia and Ehrlichia in Ixodes persulcatus and Ixodes ovatus in Tokachi district, Eastern Hokkaido, Japan. Journal of Veterinary Medical Science, v. 69, n. 6, p. 661-664, 2007. 38. JOHNSON EM, EWING SA, BARKER R.W.; FOX, J.C.; CROW, D.W.; KOCAN, K.M. Experimental transmission of Ehrlichia canis (Rickettsiales: Ehrlichieae) by Dermacentor variabilis (Acari: Ixodidae). Vet. Parasitol., v. 74, n.(2–4), p. 277-88, 1998. 39. KEYSARY, A. et al. The first isolation, in vitro propagation, and genetic characterization of Ehrlichia canis in Israel. Vet Parasitol, v.62, p.331-340, 1996. 40. KEYSARY, A. et al. Cultivation of Ehrlichia canis in a continuous BALB/C mouse macrophage cell culture line. J. Vet. Diagn. Invest., v.13, p.521-523, 2001. 41. LABARTHE, N.; PEREIRA, M.C.; BARBARINI, O.; MCKEE, W.; COIMBRA, C.A. E HOSKINS,J. Serologic prevalence of Dirofilaria immitis, Ehrlichia canis and Borrelia burgdoferi infections in Brazil. Veterinary Therapeutics, v.4, n.1, p. 67-75, 2003.

42. LABRUNA, M. B.; SOUZA, S.L.P.; GUIMARÃES JR., J.S.; PACHECO, R.C.; PINTER, A.; GENNARI, S.M. Prevalência de carrapatos em cães de áreas rurais da região norte do Estado do Paraná. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 53, n. 5, p. 553-556, 2001.

31

43. LABRUNA, M.B; MCBRIDE, J.W; CAMARGO, L.M; AGUIAR, D.M; YABSLEY, M.J; DAVIDSON, W.R; STROMDAHL, E.Y; WILLIAMSON, P.C; STICH, R.W; LONG, S.W; CAMARGO, E.P; WALKER, D.H. A preliminary investigation of Ehrlichia species in ticks, humans, dogs, and capybaras from Brazil. Vet. Parasitol., v. 143, p.189-195, 2007.

44. LEWIS JR., G.E.; RISTIC, M.; SMITH, R.D.; LINCOLN, T.; STEPHENSON, E.H. The brown dog tick Rhipicephalus sanguineus and the dog as experimental hosts of Ehrlichia canis. Am. J. Vet. Res, v.38, p.1953-1955, 1977.

45. LITTLE, S.E. Ehrlichiosis and Anaplasmosis in Dogs and Cats. Vet Clin Small Anim, v. 40, p.1121-1140, 2010. doi:10.1016/j.cvsm.2010.07.004

46. LIVAK, K.J., FLOOD, S.J., MARMARO, J., GIUSTI, W., DEETZ, K. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl., v.4, p.357-362, 1995. 47. MACHADO, R.Z. Ehrlichiose canina. Rev Bras Parasitol Vet, v.13, supl.1, p.53-57, 2004. 48. MACHADO, R.Z.; DUARTE, J.M.B.; DAGNONE, A.S.; SZABÓ, M.J.P. Detection of Ehrlichia chaffeensis in Brazilian marsh deer (Blastocerus dichotomus). Veterinary Parasitology, v.139, p.262-266, 2006. 49. MACIEIRA, D.B.; MESSICK, J.B.; CERQUEIRA, A.M.; FREIRE, I.M.; LINHARES, G.F.; ALMEIDA, N.K.; ALMOSNY, N.R. Prevalence of Ehrlichia canis infection in thrombocytopenic dogs from Rio de Janeiro, Brazil. Vet. Clin.Pathol, v.34, n.1, p. 44-8, 2005.

50. McDADE J. E. Ehrlichiosis a disease of animals and humans. J. Infect. Dis. Chiago, n.161, p.609-617, 1990. 51. MENDONÇA, C.S; MUNDIM, A.V; COSTA, A.S ; MORO, T.V. Erliquiose canina: alterações hematológicas em cães domésticos naturalmente infectados. Biosci. J., Uberlândia, v. 21, n. 1, p. 167-174, Jan./April 2005. 52. MOREIRA, S.M; BASTOS, C.V; ARAÚJO, R.B; SANTOS, M; PASSOS, L.M.F. Retrospective study (1998–2001) on canine ehrlichiosis in Belo Horizonte, MG, Brazil. Arq Bras Med Vet Zootec, v.55, p.141-147, 2003. 53. MOREIRA, S. M.; MACHADO, R. Z.; PASSOS, L. F. Detection of Ehrlichia canis in bone marrow aspirates of experimentally infected dogs.Ciência Rural, v. 35, n. 4, p. 958-960, 2005. 54. MULLIS, K.B. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. Scientific American April, p. 56-65, 1990.

32

55. MUNDIM, A.V; DE MORAIS, I.A; TAVARES, M; CURY, M.C; SANTOS MUNDIM, M.J. Clinical and hematological signs associated with dogs naturally infected by Hepatozoon sp. and with other hematozoa: a retrospective study in Uberlandia, Minas Gerais, Brazil. Vet. Parasitol., v.153, p.3-8, 2008.

56. MURPHY, G.L.; EWING S.A.; WHITWORTH, L.C; FOX, J.C.; KOCAN, A.A. A molecular and serologic survey of Ehrlichia canis, E. chaffeensis and E. ewingii in dogs and ticks from Oklahoma. Veterinary Parasitology, v. 79, n. 4, p. 325-339, 1998. 57. MYLONAKIS, M.E.; SIARKOU, V.I.; LEONTIDES, L.; BOURTZI-HATZOPOULOU, E.; KONTOS, V.I.; KOUTINAS, A.F. Evaluation of a serum-based PCR assay for the diagnosis of canine monocytic ehrlichiosis. Veterinary Microbiology, v.138, p. 390–393, 2009. 58. NAKAGHI, A.C.H.; MACHADO, R.Z.; COSTA, M.T.; ANDRÉ, M.R.; BALDANI, C.D. Canine Ehrlichiosis: clinical, hematological, serological and molecular aspects. Ciência Rural, v.38, n.3, p.766-770, 2008.

59. NAKAGHI, A.C.H; MACHADO, R.Z.; FERRO, J.A.; LABRUNA, M.B.; CHRYSSAFIDIS, A.L.; ANDRÉ, M.R.; BALDANI, C.D. Sensitivity evaluation of a single-step PCR assay using Ehrlichia canis p28 gene as a target and its application in diagnosis of canine ehrlichiosis. Rev. Bras. Parasitol. Vet., Jaboticabal, v. 19, n. 2, p. 75-79, 2010. doi:10.4322/rbpv.01902001 60. NELSON, R.W; COUTO, C.G. Medicina interna de pequenos animais. 3ed. São Paulo: Elsevier, 2006. 1360 p. 61. NOVAIS, C.M.; PIRES-ALVES, M. PCR em tempo real. Revista Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento, p.10-13, n.33, 2004. 62. OLIVEIRA, D.; NISHNIMORI, C.T.; COSTA, M.T.; MACHADO, R.Z.; CASTRO, M.B. Anti- Ehrlichia canis antibodies detection by “Dot- ELISA” in naturally infected dogs. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 9, n. 1, p. 1-5, 2000. 63. OLIVEIRA, L.S.; OLIVEIRA, K.A. ; MOURÃO, L.C.; PESCATORE, A.M.; ALMEIDA, M.R.; CONCEIÇÃO, L.G.; GALVÃO, M.A.M.; MAFRA, C. First report of Ehrlichia ewingii detected by molecular investigation in dogs from Brazil. Clinical Microbiology and Infection, v. 15, Supl. 2, p. 55-56, 2009. 64. ORIÁ, A.P.; PEREIRA, P.M.; LAUS, J.L. Uveíte em cães infectados com Ehrlichia canis. Cienc. Rural, v.34, p.1289-1295, 2004. 65. OTRANTO, D.; DANTAS-TORRES, F.; BREITSCHWERDT, E. Managing canine vector-borne diseases of zoonotic concern: part one. Trends in Parasitology, v. 25, p. 157-163, 2009.

33

66. PEREZ, M; BODOR, M; ZHANG, C; XIONG, Q; RIKIHISA, Y. Human infection with Ehrlichia canis accompanied by clinical signs in Venezuela. Ann N Y Acad Sci. n.1078, p.110-117, 2006.

67. PINYOOWONG, D.; JITTAPALAPONG, S.; SUKSAWAT, F.; STICH, R.W.; THAMCHAIPENET, A. Molecular characterization of Thai Ehrlichia canis and Anaplasma platys strains detected in dogs. Infection, Genetics and Evolution, v.8 , p. 433-438, 2008. 68. SAITO, T.B.; CUNHA-FILHO, N.A.; PACHECO, R.C.; FERREIRA, F.; PAPPEN, F.G.; FARIAS, N.A.R.; LARSSON, C.E.; LABRUNA, M.B. Canine Infection by Rickettsiae and Ehrlichiae in Southern Brazil. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene,v. 79, n. 1, p. 102-108, 2008. 69. SANTOS, F.; COPPEDE, J.S.; PEREIRA, P.L.A.; OLIVEIRA, L.P.; ROBERTO, P.G.; BENEDETTI, R.B.R.; ZUCOLOTO, L.B.; LUCAS. F.; SOBREIRA, L.; MARINS, M. Molecular evaluation of the incidence of Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Babesia spp. in dogs from Ribeirão Preto, Brazil. The Veterinary Journal, v. 179, p.145–148, 2009. 70. SHAW, S.E.; DAY, M.J.; BIRTLES, R.J.; BREITSCHWERDT, E.B. Tick-borne infectious diseases of dogs. Trends Parasitol., v.17, p.74-80, 2001. 71. SIRIGIREDDY, K.R., GANTA, R.R. Multiplex detection of Ehrlichia and Anaplasma species pathogens in peripheral blood by real-time reverse transcriptasepolymerase chain reaction. Journal of Molecular Diagnostics, v. 7, p. 308–316, 2005. 72. STEPHENSON, E.H.; OSTERMAN, J.V. Canine peritoneal macrophages: cultivation and infection with Ehrlichia canis. Am J Vet Res, v.38, n.11, p.1815-1819, 1977. 73. SOLANO-GALLEGO, L. et al. Serological and molecular evidence of exposure to arthropod-borne organisms in cats from northeastern Spain.Veterinary Microbiology, v. 118, n. 3-4, p. 274-277, 2006. 74. SOUZA, B. M. P. S.; LEAL, D.C.; BARBOZA, D.C.P.M.; UZÊDA, R.S.; DE ALCÂNTARA, A.C.; FERREIRA, F.; LABRUNA, M.B.; GONDIM, L.F.P.; FRANKE, C.R. Prevalence of ehrlichial infection among dogs and ticks in Northeastern Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 19, n. 2, p. 89-93, 2010. 75. SUMNER, J. W.; NICHOLSON, W. L.; MASSUNG, R. F. PCR amplification and comparison of nucleotide sequences from groESL shock operon of Ehrlichia species. Journal Clinical Microbiology, v. 35, n. 8, p. 2087-2092, 1997. 76. SUTO, Y.; SUTO, A.; INOKUMA, H.; OBAUASHI, H.; HAYASHI, T. First confirmed canine case of Ehrlichia canis infection in Japan. Vet. Rec., v.148, p.809-811, 2001.

34

77. TORRES, H.M. Massard, C.L.; Figueiredo, M.J; Ferreira, T.; Almosny, N.R.P. Isolamento e propagação da Ehrlichia canis em células DH82 e obtenção de antígeno para a reação de imunofluorescência indireta. Rev Bras Cien Vet v.9, n.2, p.77-82, 2002. 78. TRAPP SM, DAGNONE AS, VIDOTTO O, FREIRE RL, AMUDE AM, MORAIS HS: Seroepidemiology of canine babesiosis and ehrlichiosis in a hospital population. Vet Parasitol., v.140, p.223-230, 2006. 79. TZIPORY, N.; CRAWFORD, P.C.; LEVY, J.K. Prevalence of Dirofilaria immitis, Ehrlichia canis, and Borrelia burgdorferi in pet dogs, racing greyhounds, and shelter dogs in Florida. Vet. Parasitol. (2010). doi:10.1016/j.vetpar.2010.03.016 80. UENO, T.E.H; AGUIAR, D.M; PACHECO, R.C; RICHTZENHAIN,L.J; RIBEIRO, M.G; PAES, A.C; MEGID, J.; LABRUNA, M.B. Ehrlichia canis em cães atendidos em hospital veterinário de Botucatu, Estado de São Paulo, Brasil. Rev. Bras. Parasitol. Vet., Jaboticabal, v. 18, n. 3, p. 57-61, 2009. 81. UNVER A.; PEREZ, M.; ORELLANA, N.; HUANG, H.;RIKIHISA, Y. Molecular and antigenic comparison of Ehrlichia canis isolates from dogs, ticks, and a human in Venezuela. J Clin Microbiol, v.39, p.2788-2793, 2001. 82. VIEIRA, R.F.C; BIONDO, A.W.; GUIMARÃES, A.M.S.; DOS SANTOS, A.P.; DOS SANTOS, R.P.; DUTRA, L.H.; DINIZ, P.P.V.P.; DE MORAIS, H.A.; MESSICK, J.B.; LABRUNA, M.B.; VIDOTTO, O. Ehrlichiosis in brazil. Rev. Bras. Parasitol. Vet., Jaboticabal, v. 20, n. 1, p. 1-12, 2011. 83. VIGINARD-ROSEZ, K.; ALVES, F.R.; BLEICH, I. Erliquiose Canina. Cães e Gatos, v.96, p.25-28, 2001. 84. VINASCO, J.; LI, O.; ALVARADO, A.; DIAZ, D.; HOYOS, L.; TABACHI, L.; SIRIGIREDDY, K.; CAROLYN FERGUSON, C.; MORO, M.H. Molecular Evidence of a New Strain of Ehrlichia canis from South America. Journal of Clinical Microbiology, v.45, n.8, p. 2716–2719, 2007. 85. WANER, T., HARRUS, S., JONGEJAN, F., BARK, H., KEYSARY, A., CORNELISSEN, A.W. Significance of serological testing for ehrlichial diseases in dogs with special emphasis on the diagnosis of canine monocytic ehrlichiosis caused by Ehrlichia canis. Veterinary Parasitology, v. 95, p.1-15, 2001. 86. WELLMAN, M.L.; KRAKOWKA, S.; JACOBS, R.M.; KOCIBA, G.J. A macrophage-monocyte cell line from a dog with malignant histiocytosis. In Vitro Cell Dev Biol, v.24, p.223-229, 1988. 87. WEN, B.; RIKIHISA, Y.; MOTT, J.M.; GREENE,R.; KIM, H.Y.; ZHI, N.; COUTO,G.C.; UNVER, A.; BARTSCH, R. Comparison of nested PCR with immunofluorescent‑ antibody assay for detection of Ehrlichia canis infection in

35

dogs treated with doxycycline. Journal Clinical Microbiology, v. 35, n. 7, p. 1852-1855, 1997. 88. WOODY, B.J.; HOSKINS, J.D. Ehrlichial diseases of dogs. Vet. Clin. North Am.: Small Anim. Pract., v.21, p.75-98, 1991.