Click here to load reader

Entwicklung eines Dual-Lucifer s d Enzyme dur eile · PDF fileKatalase (CAT), Glutathion-Peroxidase (GPX) und Superoxid-Dismutase (SOD) sind antioxidative Enzyme, die in aeroben Organismen

  • View
    223

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of Entwicklung eines Dual-Lucifer s d Enzyme dur eile · PDF fileKatalase (CAT),...

  • EEnnttwwiicckklluunngg eeiinneess

    DDuuaall--LLuucciiffeerraassee--RReeppoorrtteerrggeenn--AAssssaayyss

    zzuumm NNaacchhwweeiiss ddeerr IInndduukkttiioonn aannttiiooxxiiddaattiivveerr

    EEnnzzyymmee dduurrcchh NNaahhrruunnggssbbeessttaannddtteeiillee

    Diplomarbeit zur Erlangung des Grades

    “Diplom-Ernährungswissenschaftler“

    der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

    der Universität Potsdam

    vorgelegt von

    Anne Maria Wiencierz

    (Matrikelnummer 71 82 18)

  • 1. Gutachter Prof. Dr. Pablo Steinberg

    Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

    Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik

    2. Gutachter Prof. Dr. Hans-Rudolf Glatt

    Deutsches Institut für Ernährungsforschung

    Abteilung Ernährungstoxikologie

    Online veröffentlicht auf dem Publikationsserver der Universität Potsdam:

    http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2009/2790/

    urn:nbn:de:kobv:517-opus-27901

    [http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-27901]

  • Inhaltsverzeichnis

    iii

    Inhaltsverzeichnis

    Inhaltsverzeichnis ................................................................................................................................................ iii

    Abkürzungen ......................................................................................................................................................... v

    1 Einleitung............................................................................................................................................ 1

    1.1 Reaktive Sauerstoffverbindungen und ihre Rolle in der Pathogenese altersassoziierter Erkrankungen .................................................................................................................................... 1

    1.2 Antioxidative Enzyme ........................................................................................................................ 3

    1.3 Methoden zum Nachweis der Regulation der Aktivität von antioxidativen Enzymen ........................ 5

    1.4 Bekannte und mögliche Induktoren von CAT, GPX1 und SOD1..................................................... 10

    1.5 Zielstellung ...................................................................................................................................... 14

    2 Material und Methoden................................................................................................................... 15

    2.1 Geräte.............................................................................................................................................. 15

    2.2 Materialien ...................................................................................................................................... 16 2.2.1 Verbrauchsmaterial.......................................................................................................................... 16 2.2.2 Reagenzien, Biochemikalien ........................................................................................................... 16 2.2.3 Kits .................................................................................................................................................. 18 2.2.4 Lösungen, Puffer ............................................................................................................................. 18 2.2.5 Enzyme und dazugehörige Puffer.................................................................................................... 21 2.2.6 Plasmide .......................................................................................................................................... 22 2.2.7 Bakterienstämme ............................................................................................................................. 22 2.2.8 Tierische Zelllinien.......................................................................................................................... 22

    2.3 Molekularbiologische Methoden ..................................................................................................... 24 2.3.1 Plasmide .......................................................................................................................................... 24 2.3.2 Transformation von Bakterien......................................................................................................... 25 2.3.3 Isolierung und Quantifizierung von Nukleinsäuren......................................................................... 27 2.3.4 Enzymatische Fragmentierung von Plasmiden................................................................................ 28 2.3.5 Auftrennung und Detektion von Nukleinsäuren in Agarose-Gelen................................................. 29

    2.4 Zellbiologische Methoden................................................................................................................ 32 2.4.1 Standardmethoden der Zellkultur .................................................................................................... 32 2.4.2 Bestimmung der Populationsverdopplungszeit................................................................................ 35 2.4.3 Bestimmung der Reporterenzym-Aktivität...................................................................................... 36 2.4.4 In-vitro-Zytotoxizitätstest ................................................................................................................ 44 2.4.5 Beeinflussung der Aktivität von CAT-, GPX1- und SOD1-Promotor ............................................ 47

  • Inhaltsverzeichnis

    iv

    2.5 Statistische Auswertung................................................................................................................... 49 2.5.1 Überprüfung auf Normalverteilung ................................................................................................. 49 2.5.2 Deskriptive Statistik ........................................................................................................................ 49 2.5.3 Stichprobenvergleich ....................................................................................................................... 49

    3 Ergebnisse......................................................................................................................................... 51

    3.1 Wachstumsverhalten von CaCo2-, IEC-18- und V79-Zellen ........................................................... 51

    3.2 Entwicklung des Dual-Luciferase-Reportergen-Assays................................................................... 53 3.2.1 Reportergenvektoren ....................................................................................................................... 53 3.2.2 Transiente Transfektion ................................................................................................................... 57 3.2.3 Lumineszenzmessung...................................................................................................................... 60 3.2.4 Endogene Aktivität von CAT-, GPX1- und SOD1-Promotor ......................................................... 64

    3.3 in-vitro-Zytotoxizitätstest................................................................................................................. 65

    3.4 Beeinflussung der SOD1-, GPX1- und CAT-Promotor-Aktivität..................................................... 70

    4 Diskussion ......................................................................................................................................... 76

    Zusammenfassung..................................................................................................................................................I

    Summary............................................................................................................................................................... II

    Anhang.................................................................................................................................................................III

    Literaturverzeichnis...........................................................................................................................................XV

    Danksagung ................................................................................................................................................... XXIX

    Eidesstattliche Erklärung...............................................................................................................................XXX

  • Abkürzungen

    v

    Abkürzungen

    Abb. Abbildung

    AOE antioxidatives Enzym

    bp Basenpaare

    bzw. beziehungsweise

    bzgl. bezüglich

    ca. circa

    CAT Katalase

    CMV Zytomegalievirus (engl. Cytomegalovirus)

    DLR Dual-Luciferase-Reportergen

    DMEM Dulbecco´s modified Eagle´s medium

    DMSO Dimethylsulfoxid

    DNA Desoxyribonukleinsäure (engl. deoxyribonucleic acid)

    EC Enzyme Commission/Enzyme Classification number

    EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

    EGCG Epigallocatechingallat

    EYFP verbessertes gelb-fluoreszierendes Protein (engl. enhanced yellow fluorescent protein)

    FBS Fötales Rinderserum (engl. fetal bovine serum)