Entwicklung eines Dual-Lucifer s d Enzyme dur eile · PDF fileKatalase (CAT), Glutathion-Peroxidase (GPX) und Superoxid-Dismutase (SOD) sind antioxidative Enzyme, die in aeroben Organismen

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Diplomarbeit zur Erlangung des Grades

“Diplom-Ernährungswissenschaftler“

der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Universität Potsdam

vorgelegt von

Anne Maria Wiencierz

(Matrikelnummer 71 82 18)

1. Gutachter Prof. Dr. Pablo Steinberg

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik

2. Gutachter Prof. Dr. Hans-Rudolf Glatt

Deutsches Institut für Ernährungsforschung

Abteilung Ernährungstoxikologie

Online veröffentlicht auf dem Publikationsserver der Universität Potsdam:

http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2009/2790/

urn:nbn:de:kobv:517-opus-27901

[http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:kobv:517-opus-27901]

Inhaltsverzeichnis

iii

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ................................................................................................................................................ iii

Abkürzungen ......................................................................................................................................................... v

1 Einleitung............................................................................................................................................ 1

1.1 Reaktive Sauerstoffverbindungen und ihre Rolle in der Pathogenese altersassoziierter Erkrankungen .................................................................................................................................... 1

1.2 Antioxidative Enzyme ........................................................................................................................ 3

1.3 Methoden zum Nachweis der Regulation der Aktivität von antioxidativen Enzymen ........................ 5

1.4 Bekannte und mögliche Induktoren von CAT, GPX1 und SOD1..................................................... 10

1.5 Zielstellung ...................................................................................................................................... 14

2 Material und Methoden................................................................................................................... 15

2.1 Geräte.............................................................................................................................................. 15

2.2 Materialien ...................................................................................................................................... 16 2.2.1 Verbrauchsmaterial.......................................................................................................................... 16 2.2.2 Reagenzien, Biochemikalien ........................................................................................................... 16 2.2.3 Kits .................................................................................................................................................. 18 2.2.4 Lösungen, Puffer ............................................................................................................................. 18 2.2.5 Enzyme und dazugehörige Puffer.................................................................................................... 21 2.2.6 Plasmide .......................................................................................................................................... 22 2.2.7 Bakterienstämme ............................................................................................................................. 22 2.2.8 Tierische Zelllinien.......................................................................................................................... 22

2.3 Molekularbiologische Methoden ..................................................................................................... 24 2.3.1 Plasmide .......................................................................................................................................... 24 2.3.2 Transformation von Bakterien......................................................................................................... 25 2.3.3 Isolierung und Quantifizierung von Nukleinsäuren......................................................................... 27 2.3.4 Enzymatische Fragmentierung von Plasmiden................................................................................ 28 2.3.5 Auftrennung und Detektion von Nukleinsäuren in Agarose-Gelen................................................. 29

2.4 Zellbiologische Methoden................................................................................................................ 32 2.4.1 Standardmethoden der Zellkultur .................................................................................................... 32 2.4.2 Bestimmung der Populationsverdopplungszeit................................................................................ 35 2.4.3 Bestimmung der Reporterenzym-Aktivität...................................................................................... 36 2.4.4 In-vitro-Zytotoxizitätstest ................................................................................................................ 44 2.4.5 Beeinflussung der Aktivität von CAT-, GPX1- und SOD1-Promotor ............................................ 47

Inhaltsverzeichnis

iv

2.5 Statistische Auswertung................................................................................................................... 49 2.5.1 Überprüfung auf Normalverteilung ................................................................................................. 49 2.5.2 Deskriptive Statistik ........................................................................................................................ 49 2.5.3 Stichprobenvergleich ....................................................................................................................... 49

3 Ergebnisse......................................................................................................................................... 51

3.1 Wachstumsverhalten von CaCo2-, IEC-18- und V79-Zellen ........................................................... 51

3.2 Entwicklung des Dual-Luciferase-Reportergen-Assays................................................................... 53 3.2.1 Reportergenvektoren ....................................................................................................................... 53 3.2.2 Transiente Transfektion ................................................................................................................... 57 3.2.3 Lumineszenzmessung...................................................................................................................... 60 3.2.4 Endogene Aktivität von CAT-, GPX1- und SOD1-Promotor ......................................................... 64

3.3 in-vitro-Zytotoxizitätstest................................................................................................................. 65

3.4 Beeinflussung der SOD1-, GPX1- und CAT-Promotor-Aktivität..................................................... 70

4 Diskussion ......................................................................................................................................... 76

Zusammenfassung..................................................................................................................................................I

Summary............................................................................................................................................................... II

Anhang.................................................................................................................................................................III

Literaturverzeichnis...........................................................................................................................................XV

Danksagung ................................................................................................................................................... XXIX

Eidesstattliche Erklärung...............................................................................................................................XXX

Abkürzungen

v

Abkürzungen

Abb. Abbildung

AOE antioxidatives Enzym

bp Basenpaare

bzw. beziehungsweise

bzgl. bezüglich

ca. circa

CAT Katalase

CMV Zytomegalievirus (engl. Cytomegalovirus)

DLR Dual-Luciferase-Reportergen

DMEM Dulbecco´s modified Eagle´s medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure (engl. deoxyribonucleic acid)

EC Enzyme Commission/Enzyme Classification number

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGCG Epigallocatechingallat

EYFP verbessertes gelb-fluoreszierendes Protein (engl. enhanced yellow fluorescent protein)

FBS Fötales Rinderserum (engl. fetal bovine serum)