EntradayPropagación

TeóricoNº3

Barrerasparalainfeccióndelacélula

-  membranaplasmá?ca-  ac?nacor?cal-  membranasintracelulares

Losvirusaprovechanprocesoscelularesnormalesparaentraralacélulaeiniciarelprogramadereplicacióndelmaterialgené?co

Grove(2011)JCB

Laentradaocurreenvariospasos

1.  uniónareceptoryseñalización

2.  internalizaciónporendocitosis

3.  tráficovesicular4.  penetraciónde

membranas5.  transportecitosólico6.  importaciónalnúcleo7.  desnudamiento

Yamauchi&Helenius(2013)JCS

Unióndelvirusalasuperficiedelacélula

Losvirussóloinfectancélulasalasquepuedenunirse=célulassuscep*bles•  factoresdeadsorción•  receptoresvirales

–  unenalvirusypar?cipandelaentrada–  rangodehuéspedytropismo

lec*nasuniónaN-glicanosricosenmanosavirustransmi?dosporinsectos

(Sindbis,dengue)

GAGs-  herpes,alfa,flavi,retro-  adaptaciónacul?vo

Criteriosparaiden?ficarreceptoresvirales

•  laexpresióndelgenquecodificaparaelreceptorencélulasnosuscep?bles?enequeaumentarlaunióndelvirusalacélula

•  mAbscontraelreceptordebenbloquearlaunión•  laexpresióndelreceptorpuedeaumentarlauniónperonomediarlainfección–  co-receptoresparalainternalizaciónoparalafusióndemembranas

Iden?ficacióndereceptores

•  EltropismodeHCVestárestringidoahumanosychimpancés

•  Lascélulasmurinassonpermisivasperonosuscep?bles

•  elscreeningdebibliotecasdecDNAdecélulasHuh7.5iden?ficóalaocludinahumanacomounfactordeentrada

•  LasobreexpresióndeOCLNencélulasderatónlasvuelvesuscep?bles

Ploss(2009)Nature

Dorner(2011)Nature

LaentradadeHCVencélulasencul?vorequieredereceptoresyco-receptores:CD81,SCARBI(scavengerreceptorclassBtypeI),CLDN1(claudin1),yOCLN(occludin)LaexpresióndelosgeneshumanosCD81yOCLN1essuficienteparapermi?rlainfecciónderatonesinmunocompetentesCD81yOCLNdeterminanelrangodehuéspeddeHCV

Modelosdeinfecciónenanimalesmodificadosgené?camente

Uniónvirus-receptor

Interacciónproteínadecubierta-receptor:•  hespecificidad•  iafinidad• mul?valente

clusteringdereceptores

microdominiosdemembrana:•  endocitosis•  señalizaciónatravésdelamembrana

Proteínasdevirusenvueltos-oligómerosdeglicoproteínasviralesintegralesdemembrana-si?osdeuniónareceptor

HAdeIAVreconocealácidosiálicoenunióncongalactosagbarreraparalatransmisiónentreespecies-  virushumanos:α(2,6)-  virusdeaves:α(2,3) -  virusporcinos:α(2,3)+α(2,6)

Proteínasdevirusnoenvueltos

Uniónareceptoratravésdeestructurasdelacápside:-  proyecciones:rhinovirus?po2>LDL-  indentaciones:poliovirus>CD155

poliovirusVP1VP2VP3-CD155

CD155

rhinovirus?po2-LDL

Cápsidedesimetríaicosaédricadepicornavirus

Dis?ntosviruscompartenelmismoreceptorVirusdelsarampión

MV-Hformaundímeroinclinadohaciaelplanohorizontal.Lossi?osdeuniónaSLAM(rojo)yCD46(azul)estánorientadoshaciaarriba,fácilmenteaccesiblesalosreceptores.ElazúcarunidoaN-125(cyan)bloquealaunióndelbolsilloaan?cuerpos,ácidosiálicouotrosreceptores.

Dis?ntosviruscompartenelmismoreceptorAdenovirus-CD46

LasprotrusionesdelacápsidedeadenovirussonhomotrímerosdelaglicoproteínadefibrasCadafibraenlasuperficiedelvirusesunsi?odeuniónparatresmoléculasdeCD46

Transportedevirusasociadosalasuperficie

Lehmann(2005)JCB

SEMdeMLVasociadoafilopodiossurfingdeparnculasmarcadasconunafusióndeYFPalaenvolturadeMLVsobrefilopodiosdecélulasquesobreexpresanelreceptormCAT1

Elsurfingesdependientedeac?naymiosinaII

cuan?ficacióndelmovimientodesdeelmomentodeinteracciónconfilopodios

Maduracióndelaparnculaviral

Lafusióndebeestarreguladaparaasegurarquenoocurraenelcompar?mientocelularincorrecto•  Lasproteínasdeenvolturaseplieganyse

ensamblanenelREyadquierencapacidadfusogénicamedianteprocesamientoproteolí?coenTGN

•  Lasproteínasdefusiónsonmetaestablesluegodelprocesamientoypuedensufrircambiosconformacionalesirreversibles

•  SeñalescomolacaídadelpHenlosendosomasolainteracciónconreceptoresdisparanloscambiosconformacionales

Perera&Kuhn(2008)CurrOpinMicrobiol

FusióndemembranasLasproteínasdefusiónsonglicoproteínasintegralesdemembranaqueformanhomo-ohetero-oligómeros(uniónareceptor+fusión)

Li&Modis(2014)TrendsMicrobiol

Mecanismogeneraldefusión(A)  uniónareceptor(B)  exposicióndelpép?do

defusión(C)  inserciónenla

membranayformacióndeuntrímero

(D)  plegamientodelaproteínadefusiónsobresímisma

(E)  hemifusión(F)  formacióndelporode

fusión

Lasproteínasdefusiónpresentanunplegamientocomún

Tresclasesdeproteínasdefusión:-  claseI(orthomyxo-,filo-,retro-):

pép?dodefusiónpresentadosenlapuntadeuncoiled-coildetrescadenas

-  claseII(alfa-yflavi-):tressubunidadesestructuralesyasociaciónconunasegundaproteínaviralqiesirvedechaperonaquesufreelprocesamientoproteolí?coparaquelaproteínadefusiónadquierasuestadometaestable

-  claseIII(rhabdo-,herpes-,baculo-):norequiereprocesamientoproteolí?coysufreuncambioconformacionalreversible

proteínasdefusióndeclaseI

Fusiónenlamembranaplasmá?ca

Didigu&Doms(2012)Viruses

-  gp120ygp41sonelproductodelproceamientodegp160yseincorporanalamembranadelviruscomountrímerodeheterodímeros

-  launióndegp120aCD4inducecambiosconformacionalesquepermitenlainteracciónconelco-receptorqueresultaenlaexposicióndelpép?dodefusióncomprendidoengp41

ElpacientedeBerlin…

Infecciónatravésdelarutadeendocitosis

Lopez&Arias(2010)NatureEduca?on

Tráficoatravésdelcitoplasmahastaelsi?odereplicación(losvirussondemasiadograndesparadifundir!)

Endocitosismediadaporclatrina.Internalizacióndeligandosunidosareceptor,proteínasdemembranaylípidospararecicladoydegradaciónenvesículasde~120nm

Macropinocitosis.Internalizacióndevacuolasdegrantamañodisparadaporligandos,transiente,dependientedeac?nayreguladaporrutasdeseñalizacióncomplejas Rutasdependientesdecaveolasylipidra3s.

Inducidasporuncargo,involucranvesículasendocí?caspequeñas,sondependientesdecolesterolyac?vadaspor?rosinquinasas

Rutasdeentradaalterna?vas

Acosta(2009)CellMicrobiol

Lasrutasdeentradapuedenestudiarseempleandoinhibidoresfarmacológicosymoleculares

EntradadependientedeclatrinadeDENV1vs.independientedeclatrinadeDENV-2encélulasdemamífero

Elusodemúl?plesreceptoresyrutasendocí?casredundantesproveealosvirusdeestrategiasflexiblesdeinvasiónquenopuedenseratacadasporelhospedador

Rutasdeentradaalterna?vas

Acosta(2009)CellMicrobiol

LaentradadeDENV2ocurreporunavíaendocí?canoclásicaindependientedeclatrina

ycaveolasperodependientededinamina

Tránsitoendosomal

•  Enlasvacuolasendocí?caslosvirusrecibenseñalescomolacaídadelpHylaexposiciónaproteasasquedisparanlapenetración

•  Enlosendosomastempranos(pH6.6-6)ocurrelapenetracióndevirusconunumbraldepHalto

•  Virusquepenetrantardíamenterequierendelaformacióndeendosomastardíos,lacaídadepHyeltransportedelendosomaalazonaperinuclear

FusióndemembranasCatálisisácida

ProteínasdefusióndeclaseIIsensanlacaídadelpHmediantelaprotonaciónderesiduosHis

H323

fusion loop

fl

FusióndemembranasUniónareceptoresdelendosoma

Cistein-proteasascelularesremuevenelcapdemucinayglicanosdelaglicoproteínadeEBOVparaexponerelsi?odeuniónalreceptorintracelularNiemann-PickC1NPC1asistealadisociacióndeGP1yGP2paradispararelcambioconformacionalenelprimerpasodelafusión

Grove(2011)JCB

Desnudamiento

Cuandoseinfectancélulasencul?voconSFVmarcadocon[35S]me?oninay[3H]uridinayseanalizalasedimentaciónengradientesdesacarosa,seobservaquelaproteínaCsedimentaa60Senunpicoquecorrespondealasubunidadgrandedelribosoma.

Semlikiforest

Mecanismosdepenetracióndevirusnoenvueltos

1.  Perforacióndelamembranaa)  Formacióndeunporoatravésdelcualel

genomaseliberaenelcitosol.b)  Translocacióndelacápsidesinlisisdela

membrana

2.  Lisis.Lamembranadeorganelascitoplasmá?casserompeparaliberaralvirusydemáscontenidosdellumenenelcitosol

Perforacióndelamembrana:PolioEldesnudamientoNOesac?vadoporpHLaunióndeunclusterdemoléculasdereceptorCD155disparauncambioconformacionalconcertadoeirreversibleenlaparnculaVP4seliberayelextermoN-tmiristoiladodeVP1seinsertaenlamembranaendosomalLacápsidenoentraalcitosol

Lisis:Adeno

LalisisocurrecuandounacápsideviralinducelaperforacióndelamembranaendosomalluegodeuncambioconformacionaldisparadoporpHácidoolauniónareceptor.Anivelestrucutralhayuncambioenlabasedelpentonylaexposicióndeunahéliceanfipá?cadelaproteínaVI.Laparnculaviralescapaalcitoplasma(adenovirus)oelgenomaseliberaalcitoplasma(rinovirus).

TransportesobremicrotúbulosMuchosvirusseunenamotoresmolecularesdelacélula(dineínasykinesinas)paramoversesobremicrotúbulosyalcanzarelciclodereplicación.Losvirusneurotrópicosentranenlasterminalessináp?casysemuevenaloslargodelosaxoneshastaelsomamediantetransporteretrógrado.

Asociacióndeadenovirusadineína

Lainteraccióndelaproteínadecápsidehexondeadenoviruscondineínacargaalasparnculassubviralessobremicrotúbulos.Lasparnculassemuevenhaciaelcentrosoma.

Estrategiasdeentradaalnúcleo

transportedelossegmentosdelgenomadeinfluenzaatravésdelcomplejodelporo

dockingdelacápsidedeHSV1ydesensambladoparcialparapermi?reltránsitodelDNAalnúcleo

desensambladototaldelacápsidedeadenovirus

disrupcióndelamembranadelnúcleoatravésdelaunióndeparvoyhepadnavirusalcomplejodelporo

Elestudiodemuchosmodelosviralesdefineseissi?osdepenetración:(1)  membranaplasmá?ca(2)  endosomatemprano(3)  endosomamaduro(4)  endosomatardío(5)  macropinosoma(6)  renculoendoplásmico

Resúmendelosmecanismosdeentradaysi?osdepenetración

Todoslosvirussiguenunprocesocomúndereaccionesdeensamblado

Maduracióndelasparnculasvirales

Liberacióndelacélulahospedadora

Adquisicióndeunaenvoltura

Ensambladoselec?vodelgenomayotroscomponentesesencialesdelvirión

Ensambladodelacápsideatravésdeinteraccionesconcertadasentrelas

proteínasestrucutrales

Formacióndeunidadesestrucutralesindividualesdelasproteínasdelacápsideapar?rdeunaovariasproteínasvirales

Laproduccióndeparnculasviralesdependedelamaquinariadelacélulahospedadora

•  chaperonas

•  sistemasdetráficointracelular

•  víassecretorias

•  maquinariadeimportaciónyexportaciónnuclear

Lasproteínasviralescon*enenlainformacióndesu“dirección”dentro

delacélula

•  lasproteínasdeenvolturasedirigenamembranas

•  secuenciasseñal•  modificacionesdeácidos

grasos

•  lasproteínasdeenvolturasonretenidasenlasmembranas

•  secuenciasdelocalizaciónnucleardirigenproteínasviralesalnúcleo

•  mRNAviralycomplejosRNPseexportanalcitoplasma

•  LascápsidesyloscomplejosRNPsontransportadosdeformaac?va

Ensambladodeloscomponentesdelvirión

•  losvirusnoenvueltosseensamblanenelcitoplasmaoenelnúcleoyengeneralexhibensimetríaicosaédrica

•  losvirusenvueltosadquirenlabicapalipídicademebranascelulares

enveloped non enveloped

Ensambladodevirusenvueltosenmembranascelulares

Losvirusqueadquierensuenvolturaenorganelasdelavíasecretoriadebenatravesarlarutaparaserliberadosdelacélula

Ensambladodevirusnoenvueltosenelnúcleo

-  rutasdetarge5ng/transportealnúcleoexportanlosmRNAsalcitoplasmaeimportanloscomponentesestructuralesalnúcleo

-  proteínasviralesactuancomoadaptadorasparaeltransporteycomochaperonas-  factoresviralesfuncionancomoandamiajeparaelensambladodecápsidesvacías-  laincorporacióndelDNAdependedelreconocimientoespecíficodeseñalesdeencapsidaciónydela

hidrólisisdeATP-  lamaduraciónrequieredelprocesamientodeprecursores

Adenovirus

EnsambladoenelcitoplasmaPoliovirus•  lainfeccióninducela

formacióndevesículasderivadasdelavíasecretoria

•  lareplicacióndeRNAestáasociadaalacaracitoplasmá?cadelasvesículas

•  ensambladosecuencialdelacápside-  procesamientodeP1-  ensambladodemonómeros

5Senpentámeros14S•  laformacióndelacápside

estácoordinadaconlaencapsidacióndelgenoma

•  maduraciónproteolí?ca

Empaquetamientodelgenoma

•  Enlossi?osdeensambladolosgenomasviralesdebendiferenciarsedelasmoléculasdeRNAyDNAcelulares–  elgenomaderetroviruses<1%delRNAtotalcitoplasmá?co

•  Secuenciasdeempaquetamientoenelgenomaviralfuncionancomoseñalesparalaincorporacióndentrodelvirión

EmpaquetamientodegenomasdeDNA

Adenovirus•  señalesde

empaquetamientocercadelaregióninver?daizquierdayelorigen

•  repe?cionesdesecuenciasolapadasconenhancersidequees?mulanlatranscripcióntardía

•  IV2areconocelaseñaldeempaquetamiento

EmpaquetamientodegenomasdeRNAseñaldeempaquetamientoΨ•  extremo5’delgenomadeHIV-1•  interacciónespecíficaconel

mo?vozincknuckledeldominioNCdelprecursordeGag

•  dimerizacióndeRNAgempaquetamientodelgenomadiploide

•  ΨincluyesecuenciasintrónicasyestápresentesóloenRNAquenosufrisplicing

Empaquetamientodegenomassegmentados

Incorporaciónalazar

•  todaslasvRNPcompartenunelementoestrucutralcomún• 400parnculas/pfu• 12segmentos/parnculaa10%deparnculasconelgenomacompleto

Incorporaciónselec?va

•  estructurasespecíficasparacadasegmentodevRNA• vRNPsseorganizanconunpatróndis?n?vodurantelabrotación

Influenza:8segmentosdessRNA-

DeteccióndesegmentosindividualesdevRNAenparnculasdeinfluenza

MicroscopíaTIRFdeparnculasindividualesusandosondasdeDNAmarcadacasparaFISHLahibridaciónconunamezcladesondascontraelmismosegmentomarcadasconcolorescontrastantemostróquelaeficienciadecolocalizaciónesaltaCuandoseusaronsondasdirigidascontraensegmentoPB2combinadasconsondascontracadaunodelosotros7segmentoslacolocalizacióndePB2conlosdemássegmentosfueeficiente

ColocalizacióndelosvRNAsdePB2yNAencélulasinfectadas

Ciné?cadecolocalizacióndedosvRNAsreveladaporFISH:-  losvRNAsdelasparnculas

queentranalacélulaviajanjuntoshastaelnúcleo

-  durantelareplicaciónenelnúcleonohaycolocalización

-  losvRNAsseexportanindividualmentehaciaelcitoplasma

-  a?emposlargoslosvRNAscolocalizanenelcitoplasma

Lossegmentosgenómicosdeinfluenzaviajanasociadosavesículashastaelsi?odebrotación

LasvRNPsexportadasalcitoplasmainteraccionanconRab11paraasociarsealosendosomasdereciclado.Lacuan?ficacióndelniveldecolocalizacióndelosvRNAsasociadosaRab11ydelosvRNAsnoasociadossugierequelainteracciónconRab11promuevelacolocalización

Brotación

Lasproteínasdeenvolturaydecápsidesonesencialesparalabrotacióndealfavirus

Lasproteínasdelamatrizinternaolacápsidedirigenlabrotaciónderetrovirus

Lasproteínasdecubiertadirigenlabrotacióndecoronavirus

Lagemacióndirigidaporlasproteínasdematrizrequieredecomponentesadicionales(glicoproteínas,RNP)paralaeficienciadelproceso

Labrotaciónrequieredelafusióndemembranas

DominiosL(latefunc5on)enlasproteínasestructuralesderetrovirus,filovirus,arenavirusyparamixovirusinteraccionanconlamaquinariacelularESCRT(endosomalsor5ngcomplexrequiredfortransport)LamaquinariaESCRTcatalizalafisióndemembranas•  formacióndeMVByexosomas•  escisióndecélulashijas

Liberacióndelasparnculasnacientes

OrthomixoyParamixovirus.Laac?vidadsialidasaevitalaunióndelaprogenieviralalacélulainfectadaRetrovirus.(i)Laproducciónenexcesodeproteínasdeenvolturaregulanega?vamentealosreceptoresenlasuperficiedelacélulainfectada(ii)VpuyNefdeHIVseunenaCD4yloenvíanadegradación

(1)TransportealolargodeMTdegenomasempaquetadosencápsides(2)TraduccióndeproteínasdemembranaenelREy(3)transportealaparatodeGolgi(4)BrotaciónenMVB(5)Transportedevirioneso(6)deparnculassub-viralesenvesículas(7)Exocitosis(8)Brotaciónenlamembranaplasmá?ca(9)Propagacióndependientedeac?na

Elegresoinvivoesunprocesocontroladoyusualmentepolarizado

(A) PropagacióndeparVculasextracelulares.Diseminacióndelainfecciónentrehuépedes

(B) Propagacióncélula-a-célula.Losvirusnoseexponenalespacioextracelular(alfaherpesvirus,paramyxovirusyalgunosretrovirus)

(C) Propagaciónextracelularycélula-a-célula

Propagacióncélula-a-céluladeherpesvirus

Propagacióncélula-a-céluladependientedeac?na

(a)y(b)PropagacióndeVACVdependientedelaformacióndecolasdeac?na(c)y(d)FilopodiosenmacrófagosinfectadosenASFV(e)TráficodeMLValolargodefilopodiosatravésdelainteracciónvirus-receptor(f)InfeccióndecélulasTCD4+atravésdenanotubos