MÉTODOS DE TRANSFERENCIA GÉNICA EN ANIMALES

Iliana Ximena Pardo Rojas

RESUMEN

Desde la demostración del primer animal transgénico en 1980, la ingeniería genética ha revolucionado todos los aspectos de la investigación biológica y biomédica. Desde entonces, se ha logrado la generación de varios tipos de animales transgénicos, incluyendo vacas, cerdos, ovejas, cabras y conejos. Hasta muy recientemente, la generación de animales transgénicos involucraba la microinyección de pequeñas cantidades de ADN en el pronúcleo de un embrión al estado de dos células, técnica conocida como microinyección pronuclear. El descubrimiento de que los animales podrían ser clonados mediante transferencia nuclear de células mantenidas en cultivo abrió las puertas para realizar recombinación homóloga en estas especies. Esto podría tener importantes implicaciones especialmente para los propósitos del descubrimiento de nuevas drogas, para mejorar características productivas de los animales, en la clonación de cerdos como fuentes de órganos para trasplantes y en la producción de proteínas farmacéuticas. En esta ensayo se resumen los avances que ha tenido la tecnología para la generación de animales transgénicos y los beneficios de la transferencia nuclear como una nueva ruta para la generación de animales transgénicos de granja. INTRODUCCION

Todo organismo, aún el más simple, contiene una enorme cantidad de información. Esta información se encuentra almacenada en una macromolécula que se halla en todas las células: el ADN. Este ADN está dividido en gran cantidad de sub-unidades (la cantidad varía de acuerdo con la especie) llamadas genes. Cada gen contiene la información necesaria para que la célula sintetice una proteína. Así, el genoma va a ser el responsable de las características del individuo. Los genes controlan todos los aspectos de la vida de cada organismo, incluyendo metabolismo, forma, desarrollo y reproducción. Por ejemplo, la síntesis una proteína X hará que en el individuo se manifieste el rasgo "pelo oscuro", mientras que la proteína Y determinará el rasgo "pelo claro"(Basrur, 2005). Desde sus primeros inicios el hombre ha seleccionado plantas y domesticado animales mediante el cruzamiento selectivo de individuos con el fin de transferir los caracteres deseados. La principal limitante de este proceso radica en la incompatibilidad sexual observada cuando los organismos son muy divergentes genéticamente, lo que impide esta transferencia entre especies. La ingeniería genética permite romper esta barrera posibilitando la incorporación de genes desde otras especies que de otra forma sería imposible con los métodos de mejoramiento tradicional. De esta forma los organismos genéticamente modificados o más comúnmente denominados transgénicos son organismos vivos (plantas, animales o bacterias) manipulados genéticamente mediante la inserción de un gen que habitualmente no formaba parte de su repertorio genético. La finalidad de esto es proporcionar a la planta o animal nuevas características productivas y hacerlos más eficientes y competitivos (Clark, 2002). Todos estos avances han sido gracias al desarrollo de la ingeniería genética que es una parte de la biotecnología que se basa en la manipulación genética de organismos con un propósito

predeterminado, aprovechable por el hombre, se trata de aislar el gen que produce la sustancia e introducirlo en otro ser vivo que sea más sencillo de manipular. Lo que se consigue es modificar las características hereditarias de un organismo de una forma dirigida por el hombre, alterando su material genético. El proceso puede utilizarse ya en bacterias y en células eucariotas vegetales o animales. Una vez adicionada o modificada la carga cromosómica, el organismo en cuestión sintetiza la proteína deseada y el aumento del rendimiento de la producción puede obtenerse mediante el aumento en la población portadora. Las bases de la ingeniería genética han consistido en resolver el problema de la localización e inserción de genes y la multiplicación redituable de las factorías logradas. Las técnicas utilizadas por la ingeniería genética son varias, y cada una atiende un aspecto de la tarea de preparación y solución de los problemas específicos de esta tecnología, sin embargo muchas de ellas ha tenido éxito en otros campos tecnocientíficos. (Felmer, 2004). El gen a ser introducido consiste básicamente de una construcción de ADN que contiene una región promotora y la región codificante para la proteína de interés, los que se insertan en el genoma en forma artificial mediante alguna de las técnicas disponibles como se detalla más adelante. Esta región de ADN es denominada comúnmente transgen y puede provenir de otro animal de la misma especie o desde una bacteria o planta. El lugar del animal donde se expresa el transgen está dirigido por la región promotora o las regiones reguladoras de la región promotora (Felmer, 2004). Hasta muy recientemente, la tecnología para generar animales de granja modificados genéticamente involucraba la micro-inyección pronuclear, en la cual pequeñas cantidades del ADN de interés (transgen) eran inyectadas en el pronúcleo de un embrión al estado de dos células. Aunque ampliamente aceptada y utilizada en forma rutinaria en muchos laoratorios, ha habido muy poco progreso para mejorar su eficiencia, la que se mantiene en el orden 0.1-5%, dependiendo de la especie considerada (Wall,1997). Otra técnica utilizada es la Recombinación homóloga entre células madres embrionarias que fueron desarrolladas y utilizadas para experimentos de recombinación homóloga en el ratón. Esta tecnología ha sido tremendamente eficiente para explotar la capacidad de las células en contribuir a la línea germinal y realizar recombinación homóloga con ADN exógeno, permitiendo la introducción de cambios precisos en el genoma del animal ( Hooper, 1992). Sin embargo, a pesar de los esfuerzos de muchos laboratorios, no se han descrito aún células madre embrionarias en otras especies distintas al ratón (Stice, 1998), lo que ha frenado muchas aplicaciones potenciales de esta tecnología en animales de granja. En 1997 un método nuevo revoluciono la ingeniería genética, en la Revista Nature se dio a conocer al mundo el producto de de la fusión de un núcleo procedente de una célula mamaria extraída de una oveja adulta con un óvulo al que previamente se le había extraído el material genético (proceso conocido como enucleación) dando como resultado el primer animal clonado la famosa oveja Dolly. Hoy en día, la transferencia nuclear se ha convertido en una alternativa real a la microinyección pronuclear debido a que permite un acortamiento del tiempo entre la obtención de un animal transgénico fundador y el establecimiento de un rebaño transgénico. Además, la transferencia nuclear abrió las puertas a la recombinación homóloga de animales de granja que había sido restringida sólo al ratón mediante la tecnología de células madre embrionarias. Esto posibilita la eliminación de genes endógenos en animales de granja (gene knock out) y/o la inserción de genes específicos en regiones transcripcionalmente activas del genoma, favoreciendo altos niveles de expresión de la proteína de interés. En la actualidad se han desarrollado varias técnicas implicadas en la transferencia genética relacionada con los animales. (Felmer, 2004). DESARROLLO

a lo largo de los años se han desarrollado varios métodos de Transferencia genética que se

detallan a continuación:

1) Transformación genética mediante el uso de vectores retrovirales: que

transfectan las células integrando en ellas su genoma previamente modificado que se

conoce como virus recombinantes( Wolfgang. et al,2001). Los primeros animales

transgénicos fueron producidos hace ya casi 30 años mediante la microinyección de

ADN viral (SV40) en la cavidad del blastocele de embriones de ratón (Jaenish y Mintz,

1974). Los próximos intentos involucraron embriones de ratón infectados con el

retrovirus Moloney de la leucemia murina (MoMuLV), lo que resultó en la transmisión

estable hacia la línea germinal (Jaenish, 1976). Esto se logró reemplazando genes que

no son esenciales para el virus por genes heterólogos, aprovechando así la capacidad

de los virus de infectar un amplio espectro de células y con una gran eficiencia. Una de

las grandes desventajas de este método radica en que la integración del ADN se

produce en diferentes etapas del embrión en desarrollo, lo que implica que el ADN no

se integra en todas las células somáticas o en la línea germinal y por lo tanto no hay

transmisión del transgen a la descendencia. Además, los animales generados por este

método tienen a menudo más de un sitio de integración, lo cual ocurre cuando más de

una célula del embrión es infectada por el virus (Palmiter y Brinster, 1985).

La ventaja de los vectores virales en la gran eficacia de transferencia y la posibilidad, en algunos casos, de integrar el transgen en el genoma de la célula hospedadora. Por otro lado presentan desventajas como su falta de especificidad celular en la mayoría de los casos, la limitación del tamaño (debido a que han de empaquetarlo en la cápsida), su elevada inmunogenidad y el riesgo biológico que conllevan (reconstitución de partículas replicativas por recombinación, y oncogenidad inducida por integración inespecífica Se han usado retrovirus y lentivirus como vectores para integrar transgenes en genomas animales. Esta técnica se ha usado en ratones con éxito y se ha extendido a gallinas, vacunos y suinos (Nabón,2008).

2) Transformación genética mediante inyección pronuclear: Este experimento

demostró que era posible usar un plásmido recombinante como vector para transferir

genes foráneos directamente hacia el embrión. El ADN inyectado de esta forma se

integró en el genoma y pudo ser heredado por la descendencia de los animales

transgénicos fundadores. La inyección de embriones al estado de una célula fue clave

para obtener una integración temprana del transgen, permitiendo al ADN foráneo

contribuir en el genoma de todas las células somáticas y la línea germinal. En ciertos

casos la integración del transgen también ocurrió después de la primera división del

zigoto, lo que resultó en animales fundadores mosaicos. Estos animales mosaicos aún

transmiten el transgen a la descendencia pero lo hacen a una frecuencia menor al

50%. Desgraciadamente, la eficiencia para generar animales transgénicos utilizando

esta tecnología es baja, particularmente en animales de granja. La eficiencia de la

inyección pronuclear está controlada por una serie de factores como quedara

demostrado por los trabajos de Brinster y colaboradores, quienes entregaron valiosa

información sobre la integración de los transgenes y permitieron establecer que la

concentración y la forma (circular o linear) del ADN eran los factores más críticos para

una eficiente integración (Brinster et al., 1985). El procedimiento es el siguiente:

Se extraen óvulos de hembras en las que se ha inducido una superovulación y

han sido fertilizadas “invivo”, o bien se fertilizan posteriormente “in vitro”.

Utilizando un microscopio, con una micropipeta, se inmoviliza el óvulo

fecundado y se inyecta en uno de sus pronúcleos una solución que contiene

muchas copias del transgén.

Posteriormente, estos óvulos fecundados y microinyectados se introducen en

madres receptoras, previamente sincronizadas hormonalmente, para

gestarlos, aplicando la técnica de la transferencia de embriones.

Finalmente, los recién nacidos son examinados para ver si en ellos se ha

producido la incorporación del transgén. La microinyección es un método para

generar animales transgénicos muy ineficiente, debido a que conlleva la

integración aleatoria del gen foráneo en el genoma receptor con las siguientes

consecuencias:

El transgén se introduce en el genoma receptor de forma aleatoria, por lo que

sólo en un pequeñ porcentaje se sitúa en el lugar adecuado para conseguir una

buena expresión en el animal transgé- nico.

No todos los animales que nacen han incorporado a su genoma el transgén (no

son transgénicos, por tanto).

El gen exógeno puede insertarse en un lugar erró- neo, por ejemplo en medio

de un gen del genoma receptor, interrumpiéndolo y causando su mutación y,

con ello, la muerte del embrión o alteraciones en el animal transgénico nacido.

Se produce un patrón variable de expresión del gen exógeno en la progenie

transgénica, a menudo en mosaico. En ocasiones, el transgénmicroinyectado

no es heredable porque no se inserta en la línea germinal del animal

transgénico.

No se pueden encontrar dos animales transgénicos fundadores con el transgén insertado en

el mismo lugar, por locual, para conseguir animales homocigóticos para este gen exógeno sólo

pueden serfabricados mediante el cruce de los nacidos de un único animal fundador (en el

caso de la vaca, la producción de una línea homocigótica apartir de un único fundadorrequiere

alrededor de 5 años) ( Wolfgang et al,2001)

La microinyección de DNA en cigotos es una de las técnicas más extendidas en la generación

de ratones transgénicos. Sin embargo, esta técnica tiene un éxito limitado en mamíferos

superiores, debido a problemas específicos inherentes y a su baja eficacia. Así, para producir

un único animal fundador, son necesarios cerca de 1000 cigotos en el caso de los bóvidos, 300

cigotos en el de los óvidos y 200 en el de las cabras. Por ello, el coste de producción de

animales de granja mediante microinyección pronuclear de DNA es altísimo y, en la práctica,

inabordable ( Wolfgang. et al,2001)

3) Transformación genética mediante recombinación homologa entre células

madres embrionarias: El aislamiento de células madre embrionarias de ratón, en

1989, abrió nuevas posibilidades para estudiar la función génica en animales

transgénicos (Thompson y col., 1989). Las células madre embrionarias se obtienen

desde el macizo celular interno de blastocistos y se pueden mantener en cultivos sin

perder su estado indiferenciado gracias a la presencia en el medio de cultivo de

factores inhibitorios de la diferenciación. Estas células pueden ser manipuladas in

vitro vía recombinación homóloga, permitiendo así alterar la función de genes

endógenos. Las células así modificadas pueden ser entonces reintroducidas en

blastocistos receptores contribuyendo eficientemente a la formación de todos los

tejidos en un animal quimérico incluyendo la línea germinal (Evans y Kaufman,

1981; Martin, 1981).).

Esta técnica requiere la utilización de células madrs embrionarias (ES “cells”, “embrionic stem cells”), que son pluripotentes y que, una vez modificadas genéticamente,son inyectadas en blastocistos para generar embriones quimera (Wobus y Boheler ,2005). Esta técnica conocida como “gene targeting se detalla a continuación:

a) Obtención de embriones de ratón en fase de blastocistos. b) Aislamiento de células ES de los blastocistos. c) Cultivo “in vitro” de las células ES. d) Introducción de la modificación genética, mediante “gene targeting”, en las células ES en cultivo. e) Selección de clones individuales de las células ES en cultivo y realización de réplicas para mantener stock congelado a -80ºC y para screening de DNA genómico. f) Screening de DNA genómico de los clones de células ES, para comprobar cuál ha conseguido introducir la modificación genética en el sitio deseado, así como análisis del cariotipo y de la presencia de micoplasmas. g) Generación de los embriones quimera: se inyectan las células ES, que portan la modificación genética deseada, en la cavidad de un blastocisto h) Transferencia de estos blastocistos resultantes, con ES modificadas y ES originales, a hembras sincronizadas para gestarlos. i) Estudio de las quimeras generadas (animales con dos tipos de células: algunas con la modificación genética, porque proceden de las microinyectadas en los blastocistos, y otras no). j) Realización de cruces entre machos y hembras heterocigotos para el gen modificado, con el fin de obtener homocigosis en dicho gen (Wobus y Boheler ,2005).

4) Transformación genética mediada por semen: Consiste en la introducción de ADN

foráneo en gametos masculinos antes del proceso de fertilización. Las células

espermáticas están consideradas por algunos autores como células inertes dado que

no cuentan con la mayoría de la maquinaria molecular y bioquímica que existe en las

células somáticas para permitir la replicación de ADN, la transcripción de los genes y

la síntesis de proteínas. Su morfología es particular, y se caracteriza por un

compartimento extremadamente reducido y un núcleo que contiene en ADN

compactado a modo de cromatina condensada, conectados a un largo flagelo. Estas

observaciones de la morfología llevan a la conclusión de que las células espermáticas

tienen como única misión actuar de vectores de su propio genoma durante la

fertilización. La primera evidencia de que las células espermáticas de mamífero

podían incorporar ADN foráneo cuando eran incubadas en solución con estas

macromoléculas fue descrita por Brackett et al. en 1971(Nabón,P.2008).

En síntesis, la aplicación de este método consiste en: • Obtención del eyaculado a partir de animales previamente seleccionados. • Conversión de los espermatozoides del eyaculad en células transgénicas mediante la incubación conjunta del esperma con el plásmido qu contiene el DNA de interés. En este proceso se suceden las siguientes etapas:

a) la unión del DNA exógeno a la superficie del espermatozoide; b) seguida de la internalización de este DNA en el espermatozoide; c) y, posteriormente, la integración del transgén en el genoma del espermatozoide (hecho que se ha demostrado que no ocurre al azar, sino en lugares concretos del genoma).

• Inseminación artificial, con elesperma transgénico, de hembras previamente sincronizadas (en cerdos) o inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI, “intracytoplasmic sperm injection”) transgénico en ovocitos para generar embriones que posteriormente sean transferidos a hembras sincronizadas para gestarlos (en ratones). • Obtención de las camadas, seguida del estudio de la eficiencia de la transgénesis en ellas, seleccionando los animales ransgénicos fundadores que serán capace de transmitir el transgén a las sucesivas generaciones. (Lavitrano, et al.2006)

Una ventaja de la transferencia génica mediada con semen frente a la microinyección, es que la segunda requiere manipulación individual de los embriones, mientras que con la segunda se pueden transformar genéticamente un alto número de embriones en un solo paso. Esto es particularmente interesante cuando se quieren obtener especies acuáticas transgénicas. Existen investigaciones que sugieren que el control y captación del ADN exógeno por parte de las células espermáticas de mamíferos está altamente regulada y es muy específica. De hecho, el fluido seminal antagoniza fuertemente la unión de ADN foráneo y bajo condiciones normales es una fuerte protección de las células espermáticas contra el ADN foráneo. (Nabón,P.2008).

5) Transformación genética mediante transformación de células somáticas y

transferencia nuclear (Clonación); La transferencia nuclear se describió por

primera vez en 1952 en anfibios y consiste en extraer el material genético de un

ovocito para posteriormente introducirle el material genético de una célula del animal

a clonar( Meissner y Jaenisch ,2006)

En la clonación, se introduce el núcleo de la célula somática donante en la célula

receptora u oocito, se efectúa un proceso similar de sincronización o reprogramación

del ciclo celular, con la finalidad de que ocurra un acoplamiento fisiológico entre el

núcleo y el citoplasma. La reprogramación del ciclo celular, o lo que es lo mismo, la

reprogramación nuclear, son términos que describen los cambios en la actividad

génica inducida experimentalmente por el transplante de un núcleo dentro de un

medio citoplasmático diferente. La reprogramación es un requisito indispensable para

el éxito del procedimiento, pues permite que la expresión génica de la célula somática

sea la apropiada para un desarrollo embrionario normal. Esta reprogramación se

efectúa en el tiempo transcurrido entre la fusión núcleo-citoplasma y la activación del

producto resultante Si se transplantan núcleos de células somáticas, parcial o

totalmente diferenciadas, dentro de oocitos enucleados de anfibios o de mamíferos en

metafase de la segunda meiosis, se podrán obtener blastocistos, a partir de los cuales

se formará un amplio rango de tejidos y de tipos celulares.El proceso de

sincronización o reprogramación se efectúa mediante el estímulo de la entrada de

Ca2+al oocito, ya sea con un impulso eléctrico suave o con la utilización de ionomicina

(Polejaeva et,al.200).

A diferencia de la microinyección pronuclear, donde sólo un 3-5% de los animales

nacidos son transgénicos (cifra que es inferior en animales mayores), la transferencia

nuclear asegura que el 100% de los animales nacidos sea transgénico, eliminándose,

por lo tanto, una generación de animales Además, estos animales presentan un bajo

índice y/o ausencia total de mosaiquismo. Esto permite producir varios animales

transgénicos en la primera generación, posibilitando hacer pruebas de expresión del

transgen en un grupo de animales mientras el resto se utiliza para propagar la línea.

En forma adicional es posible seleccionar el sexo del animal sin necesidad de incurrir a

biopsias del embrión, lo que permitiría incrementar la masa ganadera por

multiplicación (clonación) en forma más rápida y eficiente. Finalmente, la posibilidad

de recombinación homóloga (gene targeting) en células somáticas previo a la

transferencia nuclear abre infinitas posibilidades de manipulación genética en

animales de granja que habían sido restringidas sólo al ratón, a través de

recombinación homóloga en células madre embrionarias. Esto permitirá expandir el

horizonte de posibilidades a esta tecnología, posibilitando la eliminación de genes de

interés en el animal (gene knock out), como, por ejemplo, la eliminación del gen del

cerdo responsable del rechazo a los trasplantes de órganos (Phelps et al,

2003;Ramsoondar et al, 2003) o la eliminación del gen de la oveja responsable de la

producción de priones (Denning et al, 2001), además de la posibilidad de insertar

genes específicos en regiones definidas del genoma del animal, favoreciendo un sitio

permisivo para asegurar altos niveles de expresión de la proteína de interés.

El primer animal clonado fue una oveja llamadaDolly que fue el resultado de la fusión

de un núcleo procedente de una célula mamaria extraída de una oveja adulta con un

óvulo al que previamente se le había extraído el material genético (proceso conocido

como enucleación). El equipo escocés demostraba así que las células adultas y

especializadas podían ser reprogramadas.La etapa clave de este proceso fue la

coordinación del ciclo celular de la célula receptora y el de la célula donante de

núcleos que se logró mediante la deprivación de suero de estas últimas (Campbell et al

1996; Wilmut et al, 1997). La deprivación de suero, previo a la transferencia nuclear,

induce a las células a salir del ciclo de crecimiento y entrar en un estado de arresto

celular o quiescencia (G0/G1 en el ciclo celular), el cual potenciaría el desarrollo

embrionario, permitiendo a los factores en el ooplasma reprogramar el núcleo

donante (Campbell y col., 1996).Los requisitos mínimos para la SCNT incluyen el uso

de dos tipos de células: somáticas o no sexuales, y sexuales femeninas, u oocitos. Los

núcleos de células somáticas de individuos postnatales se transfieren dentro de

oocitos o de cigotos enucleados. Esta técnica tiene la ventaja que permite conservar el

genoma durante la diferenciación celular y la capacidad del citoplasma celular 25para

reprogramar la actividad génica y aumentar la redireccionalidad de la diferenciación

celular. Sin la aplicación de estos dos principios, la clonación no es posible (Grobet et

al, 2003).

CONCLUSIONES

La combinación de las tecnologías de transferencia nuclear y recombinación homóloga

hacen posible actualmente realizar modificaciones genéticas muy precisas en el

genoma del animal y han contribuido a incrementar la eficiencia del proceso de

generación de animales transgénicos de granja.

Por el momento muchas de las aplicaciones de esta tecnología están orientadas

principalmente a la industria farmacéutica, es posible que se utilizadas con una mayor

eficiencia en la conversión de alimentos y la resistencia a enfermedades, entre otras,

serán más fácilmente abordadas gracias a esta tecnología.

La transformación genética en animales abrirá nuevas puertas en la investigación

biomédica que permitirá descubrir tratamientos y curas para enfermedades y así

poder tener un mejor estilo de vida.

BIBLIOGRAFÍA

CLARK, A. 2002. Generation of transgenic livestock by pronuclear injection. Methods Mol. Biol. 180: 273-

87.

BASRUR PK, KING WA. Genetics then and now: breeding the best and biotechnology. Rev Sci Tech

2005;24(1):31-49.

FELMER, R.. (2004). Animales transgénicos: pasado, presente y futuro. Archivos de medicina

veterinaria, 36(2), 105-117. Recuperado en 10 de julio de 2013, de

http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0301-732X2004000200002&lng=es&tlng=es.

10.4067/S0301-732X2004000200002.

WALL, R., D. KERR, K. BONDIOLI. 1997. Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large

scale. J. Dairy Sci. 80: 2213-2224

STICE, S., J. ROBL. 1988. Nuclear reprogramming in nuclear transplant rabbit embryos. Biol Reprod. 39:

657-64.

WOLFGANG, M.J. ET AL. (2001) Rhesus monkey placental transgene expression after lentiviral gene transfer into preimplantation embryos. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98, 10728–10732.

NABÓN,P.2008. Transferencia génica en animales.PhD.disertación. Universidad Nacional de Educación

a Distancia. Madrid, España.

BRINSTER, R., H. CHEN, M. TRUMBAUER, M. YAGLE, R. PALMITER. 1985. Factors affecting the efficiency

of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci. U S A. 82: 4438-42.

THOMPSON, S., A. CLARKE, A. POW, M. HOOPER, D. MELTON. 1989. Germ line transmission and

expression of a corrected HPRT gene produced by gene targeting in embryonic stem cells. Cell 56:313-

21.

EVANS, M., M. KAUFMAN. 1981. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse

embryos. Nature. 9: 154-6.

MARTIN, G. 1981. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium

conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 78: 7634-8.

WOBUS AM; BOHELER K.2005. Embryonic Stem Cells: Prospects for Developmental Biology and cell Therapy. Phisiol Rev : 635-678. LAVITRANO M, BUSNELLI M, CERRITO MG, GIOVANNONI R, MANZINI S, VARGIOLU A. 2006. Sperm-mediated gene transfer. Reprod Fertil Dev;18(1- 2):19-23. Meissner A, Jaenisch R. 2006. Mammalian nuclear transfer. Dev Dyn;235(9):2460-9. POLEJAEVA IA, CHEN SH, VAUGHT TD, PAGE RL, MULLINS J, BALL S, ET AL. 2000. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature;407(6800):86-90. PHELPS, C., C. KOIKE, T. VAUGHT, J. BOONE, K. WELLS, S. CHEN, S. BALL, S. SPECHT, I. POLEJAEVA, J. MONAHAN, P. JOBST, S. SHARMA, A. LAMBORN, A. GARST, M. MOORE, A. DEMETRIS, W. RUDERT, R. BOTTINO, S. BERTERA, M. TRUCCO, T. STARZL, Y. DAI, D. AYARES. 2003. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science299: 411-4. DENNING, C., P. DICKINSON, S. BURL, D. WYLIE, J. FLETCHER, AJ. CLARK. 2001. Gene targeting in primary fetal fibroblasts from sheep and pig.Cloning Stem Cells 3: 221-31 CAMPBELL, K., J. MCWHIR, W. RITCHIE, I. WILMUT. 1996. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 7: 64-6. WILMUT, I., A. SCHNIEKE, J. MCWHIR, A. KIND, K. CAMPBELL. 1997. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385: 810-3 GROBET, L., L. MARTIN, D. PONCELET, D. PIROTTIN, B. BROUWERS, J. RIQUET, A. SCHOEBERLEIN, S. DUNNER, F. MENISSIER, J. MASSABANDA, R. FRIES, R. HANSET, M. GEORGES. 1997. A deletion in the bovine myostatin gene causes the doublemuscled phenotype in cattle. Nat. Genet. 17: 71-