UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS(UNIVERSIDAD DEL PERÚ, DECANA DE AMERICA)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA

CURSO: MICROBIOLOGÍA APLICADA

Cardenas Camacho CynthiaCastillo Laborio MayrelliCieza Heredia Maria del RosarioChaupis Pahuachon Kenneth David Loayza Sosa Luis SalvadorValdivia Angulo RosaVillar Arias Mayra

INTEGRANTES

MICROBIOLOGÍA APLICADA

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I. INTRODUCCIÓN

Se define como desinfección proceso mediante el cual se produce la eliminación o destrucción de agentes infecciosos y contaminantes que se encuentran fuera del organismo, por la aplicación directa de medios físicos y químicos.

Los agentes químicos se utilizan para el control del crecimiento microbiano tanto en tejidos vivos como en objetos inanimados. Lamentablemente son pocos los agentes químicos que logran la esterilidad; la mayor parte de ellos sólo reducen las poblaciones microbianas a niveles seguros o eliminan las formas vegetativas de los patógenos. Un problema frecuente en la desinfección es la selección de un agente. No existe un desinfectante único que sea apropiado para todas las circunstancias.

Mediante la lectura del rotulo del envase es posible obtener bastante información acerca de las propiedades de un desinfectante. El rotulo suele indicar los grupos de microorganismos contras los que actúa de manera eficaz el desinfectante. Es necesario recordar que la concentración de un desinfectante influye en su actividad, de modo que siempre se lo debe diluir exactamente según las indicaciones del fabricante.

Existe la necesidad de evaluar la eficacia de los desinfectantes y los antisépticos. Durante muchos años la prueba de referencia fue la prueba del coeficiente fenólico, que comparaba la actividad de un desinfectante dado con la del fenol. Sin embargo, el estándar actual es la prueba de utilidad de la dilución de la American Official Analytical Chemist. Para la mayoría de los propósitos las tres bacterias utilizadas en esta prueba son Salmonella choleraesuis, Staphylococcus aureus y Pseudomona aeroginosa. Existen factores que inciden sobre la actividad antimicrobiana. Tiempo de contacto: los m.o. no mueren instantáneamente ni simultáneamente. La cinética de muerte de un tipo de m.o. sigue una curva con pendiente constante en la que el número de m.o. muertos en cada fracción de tiempo es un porcentaje constante del número de m.o. vivos al comienzo del período. La concentración, temperatura, reacción del medio (pH), influencia de sustancias presentes son algunas de los factores.

El mecanismo de acción de los desinfectantes suelen ser complejos; Agentes activos sobre la membrana celular, produce desorganización de la membrana; agentes activos sobre la pared celular y material nuclear; agentes oxidantes, fenoles y derivados; alcoholes; sales de metales pesados dentro de un grupo enzimático o proteínas encontramos a los agentes oxidantes, halógenos, alcoholes, ácidos, álcalis, metales pesados y agentes alquilantes (formaldehído y glutaraldehído).

II. OBJETIVOS

Objetivo general:

Evaluar la eficacia letal del desinfectante QUATVET en cepas bacterianas ATCC, realizando la prueba de dilución “in use” en condiciones controladas de tiempo.

Objetivos Específicos:

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1. Determinar la eficacia bactericida de la solución QUATVET con respecto al tiempo óptimo requerido frente a cepas de Staphylococcus aureus ATCC. 6538

2. Determinar la eficacia bactericida de la solución QUATVET con respecto al tiempo óptimo requerido frente a cepas de Escherichia coli ATCC 5922.

3. Determinar la eficacia bactericida de la solución QUATVET con respecto al tiempo óptimo requerido frente a cepas de Pseudomona aeruginosa ATCC 8735.

4. Determinar la eficacia bactericida de la solución QUATVET con respecto al tiempo óptimo requerido frente a cepas de Bacillus subtilis (ATCC 6633).

III. DISEÑO METODOLÓGICO

a) Materiales: Desinfectante: QUAVET®Microorganismo: Staphylococcus aures, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa.Beaker 250 mLPipetas 1mL y de 2mLBombillaEstufa a 36°C + 2Asa de colPipetas estérilesCronometroMatraz ErlenmeyerMateriales de protección ( gorro, guantes y mascarilla)PisetaAgua destiladaPlacas petri con medio de cultivo TSA

b) Metodología

Para comprobar la eficacia de los desinfectantes se utiliza el método de dilución “in use” para la evaluación de la actividad bactericida. Se trabajó con Glutaraldehído diluido al 1% mezclado con sales de amonio cuaternario. Se evalúa la eficacia porcentual del desinfectante variando el tiempo de exposición (se toma 4 puntos 0, 5,10 y 15 minutos; se aplicará la eficacia porcentual a los tres últimos puntos).1

La determinación de la actividad antimicrobiana se efectuó poniendo en contacto los microorganismos en concentraciones de 106ufc/mL con el producto en estudio, en volúmenes iguales (1mL de microorganismo y 1mL del desinfectante) sacando una alícuota de la suspensión a los tiempos establecidos y sembrando en medio de cultivo TSA con incubación a 36°C + 2 durante 18 a 24 horas. Las cepas evaluadas fueron: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomona aeruginosa ATCC 8735.

c) Método de Dilución en Uso

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1º Descripción:

1. Dividir la placa petri con TSA en 4 partes iguales. Marcar cada cuadrante para evitar cualquier error.

2. En el primer cuadrante, inocular el microorganismo. Empezar el conteo de 5 minutos.

3. Mientras transcurre los 5 minutos, Agregar 1 mL de la solución al 1% que preparamos a partir del QUAVET®.

4. Ya transcurrido los 5 minutos, Agregar al 2do cuadrante la mezcla del microorganismo-solución desinfectante.

5. Realizar el mismo procedimiento descrito en el punto 4 a los 10 y 15 minutos en el 3er y 4to cuadrante, respectivamente.

6. Lugo de realizado este procedimiento, llevar a la estufa a 35 +/- 2 x 24 horas

2º Preparación del Glutaraldehído al 1 %:

3º Acción del desinfectante QUATVET®:

1. Dividir la placa petri con TSA en 4 partes iguales. Marcar cada cuadrante para evitar cualquier error.

2. En el primer cuadrante, inocular el microorganismo. Empezar el conteo de 5 minutos.

3. Mientras transcurre los 5 minutos, Agregar 1 mL de la solución al 1% que preparamos a partir del QUAVET®.

4. Ya transcurrido los 5 minutos, Agregar al 2do cuadrante la mezcla del microorganismo-solución desinfectante.

5. Realizar el mismo procedimiento descrito en el punto 4 a los 10 y 15 minutos en el 3er y 4to cuadrante, respectivamente.

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Composición

Cada 100 mL contiene:Gluraldehído : 12 gr.Amonio Cuaternario: 6 grFormaldehído: 3 grexcipientes c.s.p 100 mL

Hallar los cálculos

respectivos

PreparaciónAgregar 8.3 mL de la Soluciñon de QUAVET a 100mL de agua destilada.

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6. Lugo de realizado este procedimiento, llevar a la estufa a 35 +/- 2 x 24 horas.

IV. RESULTADOS

A. En el presente trabajo se ha evaluado la eficacia letal del Glutaraldehído diluido al 1% frente a cuatro cepas de referencia ATCC (ya que estos cumplen la condición de ser sensibles a los agentes químicos): Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa. Realizando la prueba de Dilución en uso, establecidas según normas vigentes. Podemos observar muy poca diferencia entre las concentraciones establecidas como óptimas de Glutaraldehído utilizadas en la esterilización de material clínico delicado y de superficies de alto riesgo hospitalario, desinfección de áreas o ambientes de fabricación de productos estériles, con la empleada en este estudio frente a todas las cepas, excepto a la de Bacillus subtilis.

B. Acción del desinfectante QUATVET® al Staphylococcus aureus

4

Tiempo: 10 minutosSe sembró la solución de

microorganismo-solucion al 1% de QUATVET

Se observó que no habia presencia de ningun

microorganismo.

Tiempo: 15 minutosSe sembró la solución de microorganismo-solucion al 1% de QUATVETSe observó que no habia presencia de ningun microorganismo.

Tiempo: 5 minutosSe sembró la solución de microorganismo-solucion al 1% de QUATVETSe observó que no habia presencia de ningun microorganismo.

Tiempo: 0 minutosSiembra solo del microorganismose observó creciemiento de 16 colonias de Staphylococcus aureus

I II

IIIIV

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C. Acción del desinfectante QUATVET® a Escherichia coli

D. Acción del desinfectante QUATVET® a Pseudomona aeruginosa

De acuerdo a la tabla, se observa que el Glutaraldehído 1%, presenta una adecuada eficacia bactericida y con tiempos de exposición superiores a los 5 minutos para Pseudomona aeruginosa ATCC 8735.

TIEMPO (minutos)

GLUTARALDEHÍDO 1%

Ufc/placa

0 17

5 1

10 1

15 0

5

T0:0,

T0:15,

T0:10,

T0:5,

T0:15 T

0:10,

T0:5,T0:0

Tiempo de exposición Resultado en UFC

0 minutos 52

5 minutos ------------------------

10 minutos ------------------------

15 minutos ------------------------

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E. Acción del desinfectante QUATVET® a Bacillus subtilis .

V. DISCUSIÓN

La desinfección es el proceso que consiste en eliminar a microorganismos infecciosos mediante el uso de agentes químicos o físicos. Los agentes antimicrobianos designados como desinfectantes son a veces utilizados alternativamente como agentes esterilizadores, agentes de saneamiento o antisépticos. En la práctica se trabajó con QUATVET desinfectante concentrado que en su composición contiene glutaraldehído, amonio cuaternario y formaldehido (en proporción de 4:2:1) que también son desinfectantes los tres tienen un amplio espectro de acción, no están influenciados por la temperatura y son apto para todo tipo de superficie, muy eficiente en el control de los microorganismos patógenos usuales y muy efectivo con un correcto programa de higiene. En la práctica presente, deseábamos comprobar la eficacia de un desinfectante, en nuestro caso, QUAVET ®. De los resultados obtenidos podemos observar que

6

PREPARACION DEL GLUTARALDEHIDO AL 1%

SIEMBRA DEL Bacillus subtilis EN LOS 4 CUADRANTES,EN MEDIO TSA

ACCION DEL DESINFECTANTE FRENTE AL MICROORGANISMO (Bacillus

Subtilis )EN FUNCIÓN DEL TIEMPO

TIEMPO (MINUTOS) QUATVET

Ufc/placa

0 50

5 42

10 3815 34

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el QUAVET®, en especial el Glutaraldehído y los demás componentes, tienen una gran acción antimicrobiana debido a que no se observó ningún crecimiento de Staphylococcus aureus en ningún cuadrante.

El mecanismo de acción microbicida del glutaraldehído se basa en sus dos grupos toxofóricos (aldehídos) los cuáles pueden interaccionar con los constituyentes de la célula microbiana, como por ejemplo los grupos amino y tiol de las proteínas. En un estado ácido, la adición de surfactantes permite una mayor penetración del aldehído a través de la pared celular, incrementado su actividad. Dentro de los surfactantes disponibles para la combinación con aldehídos están incluidos los agentes catiónicos.

En cuanto a Escherichia coli el ensayo demostró la efectividad del desinfectante hasta el minuto 15 (no fue evaluado a mayor tiempo) ya que no hubo crecimiento de Escherichia coli (microorganismo en evaluación) esto se pudo deber a que los tres componentes antes mencionados se potencian actuando sinérgicamente proporcionando una amplia acción antimicrobiana que evita el crecimiento de dicha bacteria. De acuerdo a artículos encontrados las bacterias Gram negativos son por lo general son más resistentes a los antisépticos y desinfectantes que las gran positivas. Se han hecho estudios donde se midieron las concentraciones mínimas inhibitorias (CIM) que presentan tanto las Gram positivas como las Gram negativas, y se estableció que hay diferencias marcadas entre Staph. aureus y E. coli a los compuestos de amonio cuaternario (CAC), hexaclorofeno, diamidinas y triclosán, pero poca diferencia en la susceptibilidad a la clorhexidina.Pseudomonas aeruginosa es más resistente a la mayoría de estos agentes, incluyendo la clorhexidina es por ello que es necesario su sinergismo para obtener mejores resultados.

La mayoría de estudios indican que el Glutaraldehído al 1 – 1.5 % es la Concentración Mínima Eficaz (CME) y al 2% si se usa como desinfectante de alto nivel en instrumental médico; debido a que el Glutaraldehído se va diluyendo con el uso, reforzando la necesidad que los equipos semicríticos se desinfecten con una concentración mínima eficaz.6 La rápida actividad bactericida de la solución del Glutaraldehído a 2% está bien reportada., capaz de aniquilar cepas de P. aeruginosa en menos de 1 minuto.7 Un estudio realizado por Rubbo eat col. Demostró la eficacia de una solución de Glutaraldehído al 0.02% alcalinizada sobre P. aeruginosa, en 20 minutos de exposición a esta baja concentración se inactivó más de 104 ufc.8

El Bacillus subtilis está considerado como un microorganismo ubicuo, saprófito y no patógeno humano, que tiene la capacidad de formar endosporas de gran resistencia ,que le proporciona una gran ventaja para subsistir en condiciones extremas.9 Esta forma de vida microbiana (endospora) tiene una alta resistencia frente a los desinfectantes ,como se evidenció en la práctica frente al glutaraldehído. El glutaraldehído es un desinfectante de alto nivel ampliamente aceptado, cuyo mecanismo de acción es la alquilación de los grupo amino, altera el ARN y ADN y síntesis de proteínas, cuya concentración de uso no puede ser inferior al 2%, con un nivel alto de desinfección a los 30 minutos y es inactivado por dilución.10 En la práctica se trabajó con glutaraldehido al 1% en tiempos de 5,10 y 15 minutos. Dichas condiciones no fueron las apropiadas para la correcta acción del desinfectante frente a las cepas de Bacillus subtilis.

VI. CONCLUSIONES

1. Se evaluó la eficacia letal de la solución QUATVET, definiendo experimentalmente el tiempo de exposición del desinfectante, realizando pruebas “in vitro”.

2. La solución QUATVET es eficaz frente a las colonias de Staphylococcus aureus durante un tiempo mayor o igual a 15 minutos.

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3. La solución QUATVET es eficaz frente a las colonias de Escherichia coli durante un tiempo mayor o igual a 15 minutos.

4. La solución QUATVET es eficaz frente a las colonias de P. aeruginosa durante un tiempo mayor o igual a 15 minutos.

5. La solución QUATVET es eficaz frente a las colonias de Bacillus subtilis. durante un tiempo mayor o igual a 15 minuto.

VII. BIBLIOGRAFÍA

1. Wilfried Paulus .Microbicides for the protection of material.1993. Pp 46.

2. Pfister R., Juan Enrique;Cortés Jorquera, Javier;Núñez Asecio, María Pilar;Zillmann Geerdts, Gisela. Control in vitro de la eficacia del glutaraldehído como desinfectante de alginato. p. 50-5.

3. Pharma –vet.corporationss.a.c. visto en: http://www.pharmavetcorporation.net/products.html

4. Cabrera, Cristina; Fabián Gómez, Rommel; Zúñiga, Andrés Edmundo. La resistencia de bacterias a antibióticos, antisépticos y desinfectantes una manifestación de los mecanismos de supervivencia y adaptación. Colomb. Med. vol.38 no.2 Cali Jan./Mar. 2007. Disponible en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S1657-95342007000200008&script=sci_arttext.

5. AOAC Official Method 955.15. 2006. Testing Disinfectants. Use Dilution Method. AOAC International.6.2.04

6. Gustavo A. Quintero, Julio Alberto Nieto, Carlos H. Lerma. Infección en cirugía. Bogotá. Ed. Médica Panamericana, 2001.

7. Rubbo SD, Gardner JF, Webb RL. Biocidal activities of glutaraldehyde and related compounds. J Appl Bacteriol.1967; 30: 78 – 87.

8. Borick PM. Chemical sterilizer (chemosterilizers). Adv. Appl Microbial. 1968; 10: 291 – 312

9. Agentes antimicrobianos, disponible en: http://www.agro.unlpam.edu.ar/catedras-pdf/AGENTES-ANTIMICROBIANOS, pdf revisado el 06/04/2013.

10. Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case, Introduccion a la microbiología, novena edición, editorial medica panamericana, Argentina, Buenos Aires, 2007. Pág: 200-204

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11. J. A. González, C. S. Gallardo. Estudio de la efectividad de desinfectantes de amonio cuaternario y glutaraldehído frente a cepas de origen alimentario. ISSN 0300-5755, Nº 361, 2005, págs. 35-42. Desinfectantes Y Antisépticos. Disponible en: http://www.elgotero.com/Archivos%20zip/Desinfectantes%20y%20Antis%C3%A9pticos.pdf

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