Validación del método Colilert®-18/Quanti-Tray®

para el recuento de E. coli y debacterias coliformes en muestras de agua

enero de 2008

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Validación del método Colilert®-18/Quanti-Tray® para el recuento de E. coli y de

bacterias coliformes en muestras de agua

1 Introducción El método Colilert®-18/Quanti-Tray® es una prueba diseñada específicamente para el recuento NMP (Número Más Probable) de E. coli y bacterias coliformes a partir de muestras de agua potable u otras aguas de características similares, ya sea tratada o sin tratar. Colilert-18 detecta de manera simultánea el número de coliformes totales y E. coli en el agua. Se basa en la Tecnología de Sustrato Definido (Defined Substrate Technology, DST). El reactivo DST se mezcla con 100 ml de muestra y se incuba como prueba de presencia/ausencia (PA) o prueba para determinar el número más probable (NMP). Cuando las bacterias coliformes metabolizan el nutriente indicador ONPG, el color de la muestra se vuelve amarillo. Cuando E. coli metaboliza un segundo nutriente indicador (MUG), la muestra emite fluorescencia con luz UV. El método Colilert-18 permite la detección simultánea de estas bacterias en 18 horas, a una concentración de 1 ufc/100 ml y en presencia de números tan elevados de bacterias heterótrofas como 2 x 106/100 ml de muestra. El método Quanti-Tray está diseñado para obtener recuentos bacterianos cuantitativos a partir de muestras de 100 ml utilizando los reactivos DST. La mezcla de reactivo/muestra se añade a la bolsa Quanti-Tray y, antes de la incubación, se sella utilizando el dispositivo de sellado para Quanti-Tray. La bolsa está diseñada para que, tras el sellado, 51 pocillos contengan la mezcla de reactivo/muestra. El dispositivo de sellado es un instrumento que consta de unos rodillos calientes, accionados por motor, que se ha diseñado para el sellado de las bolsas Quanti-Tray. Se cuenta el número de pocillos positivos y, a partir de la tabla correspondiente, se determina el NMP de bacterias coliformes y/o E. coli. 2 Alcance de la aplicación del método Colilert®-18/Quanti-Tray® El método Colilert®-18/Quanti-Tray® está diseñado principalmente para el análisis de agua potable y otros tipos de agua de características similares. Cuenta con un gran número de autorizaciones en Norteamérica (EE.UU, Canadá y Méjico), Sudamérica (Brasil, Argentina, Chile y Colombia), Europa (Dinamarca, Alemania, Hungría, Islandia, Irlanda, Italia, Noruega, España y Reino Unido) y Extremo Oriente (Japón y Corea). Además, cuenta con la autorización para el análisis de aguas embotelladas (Asociación Internacional de Agua Embotellada) y para el análisis de agua purificada para uso farmacéutico (Farmacopea de los EE.UU). En los EE.UU. también recibió la autorización por parte de la EPA (Agencia de protección medioambiental) para el análisis de bacterias coliformes y E. coli en aguas de manantial y aguas freáticas, y para el recuento de E. coli en aguas ambientales, de uso recreativo y residuales. 3 Identificación de microorganismos diana (ISO/TR 13843 apartado 10.2.1 y 9.2) En el método Colilert®-18/Quanti-Tray®, las bacterias coliformes son aquellas que producen un color amarillo por acción de la β-galactosidasa sobre el orto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG), y E. coli son aquellas bacterias coliformes que,

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además, emiten una fluorescencia azul con luz UV por la acción de la β-glucuronidasa sobre el 4-metil-umbeliferil-β-D-glucurónido (MUG). 3.1 Modelo de exposición basado en un cultivo puro (ISO/TR 13843 apartado 10.2.1) Las definiciones de las reacciones por bacterias diana y no diana se confirmaron mediante la exposición del sistema Colilert-18/Quanti-Tray a cultivos puros de cepas de referencia de E. coli, bacterias coliformes y bacterias Gram-negativas no coliformes obtenidas a partir de las colecciones de la ATCC. Las reacciones típicas de estas cepas de referencia aparecen recogidas en la tabla 1. IDEXX utiliza estas cepas para realizar los análisis de control de calidad rutinarios del método Colilert-18/Quanti-Tray. Tabla 1 Cepas de referencia de E. coli, bacterias coliformes y bacterias

Gram-negativas no diana, utilizadas para confirmar las reacciones positivas y negativas típicas del método Colilert®-18/Quanti-Tray®

Bacteria Nº ATCC* Reacción método Colilert-18

Escherichia coli 25922 Color amarillo intenso Fluorescencia azul intenso con luz UV

Citrobacter freundii 8090 Color amarillo intenso No emite fluorescencia con luz UV

Klebsiella pneumoniae 31488 Color amarillo intenso No emite fluorescencia con luz UV

Enterobacter aerogenes 13048 Color amarillo intenso No emite fluorescencia con luz UV

Pseudomonas aeruginosa 10145 No hay crecimiento No hay color amarillo No emite fluorescencia con luz UV

Aeromonas hydrophila 35654 No hay crecimiento No hay color amarillo No emite fluorescencia con luz UV

* Colección Americana de Cultivos Tipo 3.2 Estudios de sensibilidad, especificidad y selectividad (ISO/TR 13843 apartado 9.2) En lo que respecta a los métodos microbiológicos, el informe técnico ISO/TR 13843 define estas características de la siguiente forma: Sensibilidad - la fracción del total de positivos que se asigna correctamente en el

recuento obtenido; Especificidad - la fracción del total de negativos que se asigna correctamente en el

recuento obtenido; Selectividad - el cociente ente el número de colonias diana y el número total de

colonias en el volumen de muestra. En el caso del método Colilert-18/Quanti-Tray, estas características están relacionadas con el número de pocillos positivos para coliformes o E. coli que, efectivamente, contienen la bacteria diana, y con el número de pocillos negativos que realmente son negativos para la bacteria diana. La valoración de la sensibilidad,

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la especificidad y la selectividad del método Colilert-18/Quanti-Tray se logró identificando los aislamientos β-galactosidasa y β-glucuronidasa positivos de los pocillos positivos obtenidos a partir de muestras naturales en las que se añadieron cantidades conocidas de agua de río a muestras de agua potable sin cloro. Se obtuvo 1 litro de muestra de agua potable sin cloro al que se añadieron cantidades conocidas de tres fuentes de aguas superficiales (dos ríos y un embalse). Tras la incubación, se seleccionaron 100 pocillos de color amarillo, pero que no emitían fluorescencia, de las 30 muestras (3-5 pocillos por cada muestra). La selección se llevó a cabo de forma que se garantizara la inclusión de toda la gama de intensidades posibles para el color amarillo. Asimismo, se seleccionaron 100 pocillos de color amarillo, y que emitían fluorescencia, para abarcar toda la gama de intensidades posibles para la fluorescencia. De las 30 muestras, sólo se dispuso de 54 pocillos negativos, de los cuales dos mostraron un crecimiento turbio. Las reacciones β-galactosidasa y β-glucuronidasa positivas y/o negativas se verificaron y los aislamientos se identificaron utilizando paneles miniaturizados para la identificación de tipo BBL CrystalTM E/NF (Entéricos/ No Fermentadores, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, EE.UU.). 3.2.1 Cálculo de la sensibilidad, especificidad, selectividad, tasa de falsos positivos y tasa de falsos negativos Para cada parámetro los datos de identificación se dividieron en cuatro categorías: a = número de pocillos positivos que contenían coliformes o E. coli (verdaderos positivos); b = número de pocillos negativos que contenían coliformes o E. coli (falsos negativos); c = número de pocillos positivos que no contenían coliformes, ni E. coli (falsos positivos); d = número de pocillos negativos que mostraban crecimiento y que no contenían ni coliformes, ni E. coli (verdaderos negativos). A partir de los datos obtenidos, la sensibilidad, especificidad, selectividad, tasa de falsos positivos y tasa de falsos negativos para coliformes y E. coli se calcularon de la siguiente forma: Sensibilidad = a / (a+b)

Especificidad = d / (c+d) Selectividad = log10 [(a+c) / (a+b+c+d)] Tasa de falsos positivos = c / (a+c) Tasa de falsos negativos = b / (b+d)

Además se calculó un parámetro adicional, la eficiencia (E; fracción de pocillos que se asignan correctamente), mediante la fórmula E = (a+d) / (a+b+c+d). 3.2.2 Coliformes distintos a E. coli De los 100 pocillos amarillos sin fluorescencia con los que se realizaron subcultivos, se obtuvieron aislamientos β-galactosidasa. En estas placas no se observaron reacciones β-glucuronidasa. En el Apéndice A1 se muestran las reacciones oxidasa e indol, los perfiles BBL CrystalTM E/NF y las identificaciones de estos aislamientos. Todos se identificaron como miembros de la familia Enterobacteriaceae distintos a E.

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coli, β-galactosidasa positivos y β-glucuronidasa negativos. En total, se recuperaron 23 especies de coliformes (Tabla 2). 3.2.3 E. coli De los 100 pocillos amarillos con fluorescencia con los que se realizaron subcultivos, se obtuvieron aislamientos β-glucuronidasa. En el Apéndice A2 se muestran las reacciones oxidasa e indol, los perfiles BBL CrystalTM E/NF y las identificaciones de estos aislamientos. Se identificaron 99 aislamientos como E. coli. El último se identificó como Klebsiella oxytoca. Este aislamiento presentó una reacción β-glucuronidasa positiva en el panel CrystalTM E/NF. 3.2.4 Pocillos negativos Se realizaron subcultivos con 54 pocillos negativos, de los cuales únicamente dos habían presentado crecimiento. Estos dos pocillos presentaron colonias β-galactosidasa y β-glucuronidasa negativas, que resultaron ser oxidasa positivas e indol negativas (Apéndice A3). Ambas colonias se identificaron como Shewanella putrefaciens en el sistema BBL CrystalTM E/NF. No se obtuvo crecimiento en los 52 pocillos restantes. Tabla 2 Identificación de bacterias coliformes (número de aislamientos)

recuperadas a partir de pocillos positivos Colilert®-18/Quanti-Tray®

para coliformes distintos a E. coli

Cedecea lapegei (1) Kluyvera ascorbata (12) Citrobacter amalonaticus (2) Kluyvera cryocrescens (3) Citrobacter freundii (10) Leclercia adecarboxylata (1) Enterobacter aerogenes (1) Pantoea agglomerans (9) Enterobacter asburiae (1) Serratia fonticola (1) Enterobacter cancerogenus (1) Serratia liquefaciens (3) Enterobacter cloacae (25) Serratia marcescens (1) Enterobacter sakazakii (7) Serratia odorifera (1) Escherichia vulneris (4) Serratia plymuthica (4) Hafnia alvei (1) Serratia rubidea (1) Klebsiella oxytoca (4) Serratia spp (1) Klebsiella pneumoniae (6)

3.3 Determinación de las características relacionadas con la sensibilidad y la especificidad 3.3.1 Bacterias coliformes En el contexto de la prueba Colilert-18/Quanti-Tray, los coliformes son microorganismos que dan lugar a un color amarillo, emitiendo o no fluorescencia. Los resultados para los parámetros calculados son los siguientes: Sensibilidad = a / (a+b) = 200 / (200+0) = 1 Especificidad = d / (c+d) = 2 / (0+2) = 1 Selectividad = log10 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log10 [(200+0) / (200+0+0+2)] = - 0,004 Tasa de falsos positivos = c / (a+c) = 0 / (200+0) = 0 Tasa de falsos negativos = b / (b+d) = 0 / (0+2) = 0 Eficiencia (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (200+2) / (200+0+0+2) = 1

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3.2.3 E. coli En el contexto de la prueba Colilert-18/Quanti-Tray, E. coli son microorganismos que dan lugar a un color amarillo y emiten fluorescencia. Los resultados para los parámetros calculados son los siguientes: Sensibilidad = a / (a+b) = 99 / (99+0) = 1 Especificidad = d / (c+d) = 102 / (1+102) = 0,99 Selectividad = log10 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log10 [(99+1) / (99+0+1+102)] = - 0,305 Tasa de falsos positivos = c / (a+c) = 1 / (99+1) = 0,01 Tasa de falsos negativos = b / (b+d) = 0 / (0+102) = 0 Eficiencia (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (99+102) / (99+0+1+102) = 0,995 Los resultados del análisis de los datos demuestran que, para las bacterias coniformes, el método Colilert-18/Quanti-Tray tiene una sensibilidad y especificidad elevadas y una tasa de falsos positivos y falsos negativos igual a cero. El método es también muy selectivo, con un valor de - 0,004, superior al valor de referencia -1 que sugiere el informe técnico ISO/TR 13843 para los métodos de recuento de colonias. Se puede decir que el método es muy eficiente para bacterias coliformes, con un valor de eficiencia de 1. Los datos de identificación demuestran que el método Colilert-18/Quanti-Tray recupera una amplia gama de bacterias coliformes. El método Colilert-18/Quanti-Tray también es muy sensible y específico para E. coli. La selectividad (-0,305) es inferior a la obtenida para las bacterias coliformes. Este es un resultado que cabe esperar en un sistema de análisis dual en el que E. coli es un subgrupo dentro de las bacterias coliformes. Aún así, el valor sigue siendo mejor que el valor de referencia del informe técnico ISO/TR 13843. El método sigue siendo muy eficiente (E = 0,995) para la detección de E. coli. 4 Incertidumbre del recuento (ISO 13843 apartado 10.2.1 y Apéndice B) La repetibilidad y la reproducibilidad son dos estimaciones de la fiabilidad que se puede alcanzar con un método analítico. Pueden ser valoraciones respecto al método en su conjunto utilizando muestras naturales adecuadas, o respecto a la incertidumbre del recuento asociada con la lectura de resultados de un método en concreto. El resultado obtenido con cualquier método dependerá de la facilidad con la que los analistas puedan realizar un recuento de colonias o considerar una reacción NMP como positiva, lo que dependerá de lo distinta que sea la morfología de las colonias de los microorganismos diana o no diana a la hora de hacer un recuento en agar, o de la nitidez de las reacciones positivas o negativas de las pruebas NMP realizadas en caldo de cultivo. Por lo tanto, las valoraciones de la incertidumbre del recuento son una indicación de los posibles problemas que podrían darse al adoptar un método de manera generalizada. La repetibilidad (r) y la reproducibilidad (R) se definen de la siguiente forma: Repetibilidad concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas de la

misma medida, llevadas a cabo en las mismas condiciones de medición.

Reproducibilidad concordancia entre los resultados de mediciones de la misma

medida, llevadas a cabo en distintas condiciones de medición.

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Cuando esto se aplica a los recuentos de colonias microbiológicas en placas de agar o reacciones positivas en una prueba NMP, esas “mismas” o “distintas condiciones” se refieren al analista que hace el recuento. Por lo tanto, en este contexto, la repetibilidad es la concordancia entre los recuentos obtenidos por un mismo analista tras repetir los recuentos y la reproducibilidad es la concordancia entre los recuentos obtenidos por dos o más analistas tras repetir los recuentos. Normalmente, la valoración de la reproducibilidad brinda más información que la valoración de la repetibilidad. El Apéndice B del informe técnico ISO/TR 13843 proporciona unas directrices sobre la valoración de la repetibilidad y la reproducibilidad del recuento utilizando desviaciones estándar relativas (DER) de los recuentos repetidos. Además, recomienda que, en el caso de cultivos puros, las DER deberían ser < 0,02 (es decir, una desviación máxima del 2 %). Los analistas de IDEXX llevaron a cabo estudios sobre la incertidumbre de los recuentos. Los datos están incluidos en el Apéndice B. El recuento se realizó de manera que cada analista desconociera los recuentos realizados por otros analistas, y los NMP resultantes se registraron como números enteros. Las DER calculadas para los NMP del sistema Colilert-18/Quanti-Tray inoculado con un coliforme típico (Klebsiella pneumoniae ATCC 33186) y E. coli (ATCC 25922) fueron:

Klebsiella pneumoniae Repetibilidad = 0,022 Reproducibilidad = 0,020

Escherichia coli Repetibilidad = 0,000 Reproducibilidad = 0,007

Los valores para el coliforme típico son del orden del valor de referencia < 0,02 (ISO/TR 13843 apartado B1), mientras que los valores para E. coli están muy por debajo del valor de referencia, indicando que con el método Colilert-18/Quanti-Tray puede lograrse un recuento del NMP fiable para Klebsiella pneumoniae y para E. coli. 5 Robustez – sensibilidad a lo largo del tiempo (ISO/TR 13843 apartado 10.2.2 y B.4) Dos aspectos de la robustez son importantes para el método Colilert®-18/Quanti-Tray®: el periodo de incubación recomendado de 18-22 horas y el periodo de validez de hasta 15 meses cuando Colilert-18 se almacena entre 4 y 25 ºC. En el Apéndice C se incluyen los recuentos realizados por duplicado de suspensiones con un número bajo de cultivos de referencia de E. coli, Klebsiella pneumoniae y Citrobacter freundii tras 18 horas y 22 horas de incubación para el mismo lote de Colilert-18, almacenado durante 541 días a 25 °C. 5.1 Robustez del tiempo de incubación

Se obtuvieron 48 resultados emparejados para realizar los recuentos tras 18 horas y 22 horas de la incubación. Para E. coli los 48 recuentos emparejados fueron los mismos tras los dos tiempos de incubación. Pero, para Klebsiella pneumoniae 47 de los recuentos (98 %) resultaron iguales, mientras que el último recuento emparejado mostró un incremento de un único pocillo positivo a las 22 horas de incubación. Sin embargo, para Citrobacter freundii hubo un incremento en los recuentos en 13 de las muestras (27%) tras las 22 horas de incubación, en comparación con las 18 horas de incubación. Todos estos recuentos más elevados, excepto uno, fueron incrementos en un único pocillo positivo o dos. Esta cepa de Citrobacter parece

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mostrar una tasa de crecimiento relativamente más lenta o una cinética enzimática más débil, en comparación con las otras bacterias analizadas. Los datos demuestran que para E. coli y para bacterias coliformes robustas, como Klebsiella pneumoniae, el periodo de incubación recomendado de 18-22 horas es robusto. Pero en el caso de algunas bacterias con crecimiento más lento, o productoras de enzimas débiles, puede haber un aumento en los recuentos a las 22 horas de incubación, en comparación con los recuentos obtenidos a las 18 horas de incubación. El fenómeno de los incrementos en los recuentos a lo largo de un periodo de incubación recomendado (por ejemplo, de 18-24 horas para los métodos típicos de filtración con membranas de la norma ISO 9308-1) es muy conocido, especialmente en el caso de coliformes ambientales. Sin embargo, siempre que los incrementos en los recuentos tras una incubación más larga no sean excesivos, los recuentos obtenidos a las 18 horas de incubación, con fines prácticos y operativos, se consideran aceptables. 5.3 Robustez del almacenamiento del medio Colilert-18 El medio Colilert-18 tiene un periodo de validez de 12 meses cuando se almacena entre 4 y 25 °C. Los datos de las tres bacterias analizadas con el mismo lote de medio, conservado a 25 ºC y tras 541 días de almacenamiento (muy por encima del periodo de un año establecido), no muestran ninguna diferencia en el rendimiento. Se eligió la temperatura de almacenamiento superior ya que, en comparación con un almacenamiento a temperaturas de refrigeración, representa un mayor reto a la estabilidad del medio Colilert-18. 6 Límite superior de trabajo (ISO/TR 13843 apartado 10.2.4 y 6.3.3) La prueba Colilert®-18/Quanti-Tray® es un método de NMP con un rango de recuento arbitrario entre 0 y 201, determinado por el número de pocillos de la bolsa Quanti-Tray. Según el apartado 6.3.3 del informe técnico ISO/TR 13843, no puede establecerse un límite superior para los métodos de NMP por razones prácticas y estadísticas, “ya que la precisión no depende de forma sencilla del número de partículas introducido en la unidad de detección". 7 Precisión (ISO/TR 13843 apartado 10.2.5 y 9.5.5) La precisión de un método de NMP se describe mediante los intervalos de confianza del 95% calculados para cada uno de los valores de NMP (ISO/TR 13843 apartado 9.5.5). En el Apéndice D se incluyen los intervalos de confianza para los recuentos obtenidos con el método Colilert®-18/Quanti-Tray®, calculados a partir del programa del Manual online para el Análisis Bacteriológico (Bacteriological Analytical Manual, BAM; http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html#excl) de la FDA (Food and Drug Administration) de los EE.UU. Para cada NMP puede obtenerse una repetibilidad teórica, basándose en el valor de NMP y sus intervalos de confianza. En el Apéndice D también se incluyen los valores de incertidumbre relativa para cada NMP (log10DE, calculados a partir de los intervalos de confianza del 95% del NMP) y de repetibilidad (incertidumbre estándar relativa) expresados como coeficientes de variación (CV%). Estos valores de Poisson pueden utilizarse como valores de precisión mínima con los que cualquier dato apropiado que pueda tener un laboratorio (por ejemplo, sobre la variación a la hora de decantar el volumen de análisis o la incertidumbre de un recuento) puede combinarse para obtener una estimación global de la repetibilidad para cada NMP.

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8 Bibliografía 8.1 Normas ISO ISO 9308-1:2000 Water Quality – Detection and enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria – Part 1: Membrane filtration method. Ginebra: Organización Internacional para la Estandarización. ISO/TR 13843:2000(E) Water Quality – Guidance on validation of microbiological methods. Ginebra: Organización Internacional para la Estandarización.

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Apéndice A: Datos de los estudios de sensibilidad, especificidad y selectividad (véase el apartado 3.2)

Apéndice A1 Identificación de aislamientos de pocillos amarillos sin

fluorescencia del método Colilert®-18/Quanti-Tray®

Ref. aislamiento Oxidasa Indol Perfil Crystal E/NF Identificación Confianza

Y1 - + 5765637153 Enterobacter sakazakii 0,5861 Y2 - - 4764417153 Pantoea agglomerans 0,7217 Y3 - + 4724477151 Kluyvera cryocrescens 0,9829 Y4 - - 7764477153 Enterobacter cloacae 0,9962 Y5 - + 4764477151 Kluyvera cryocrescens 0,6287 Y6 - - 4724467153 Pantoea agglomerans 0,7127 Y7 - + 5764475555 Klebsiella oxytoca 0,9825 Y8 - - 4760427053 Pantoea agglomerans 0,9481 Y9 - - 5764637051 Kluyvera ascorbata 0,9264

Y10 - - 5766477152 Enterobacter cloacae 0,9886 Y11 - - 7424676151 Citrobacter freundii 0,9335 Y12 - - 7764672153 Enterobacter cloacae 0,8268 Y13 - - 7764476157 Enterobacter sakazakii 0,6102 Y14 - + 5764637151 Kluyvera ascorbata 0,9925 Y15 - + 5765677151 Kluyvera ascorbata 0,8702 Y16 - - 4764627151 Escherichia vulneris 0,5764 Y17 - - 7734457051 Pantoea agglomerans 0,9932 Y18 - + 5765477157 Klebsiella oxytoca 0,8524 Y19 - - 7766276157 Serratia liquefaciens 0,5712 Y20 - - 5764476153 Enterobacter cloacae 0,8943 Y21 - - 3764217153 Cedecea lapagei 0,9835 Y22 - - 5764427151 Pantoea agglomerans 0,7613 Y23 - + 7764637157 Enterobacter sakazakii 0,9734 Y24 - + 5764627452 Leclercia adecarboxylata 0,999 Y25 - - 7764627555 Klebsiella pneumoniae 0,9154 Y26 - - 0764437152 Pantoea agglomerans 0,8776 Y27 - - 7765275557 Serratia rubidaea 0,9942 Y28 - - 4760056153 Enterobacter asburiae 0,9504 Y29 - - 5765276157 Serratia liquefaciens 0,5545 Y30 - + 5764617151 Kluyvera ascorbata 0,982 Y31 - + 5764677557 Klebsiella oxytoca 0,9555 Y32 - - 7564677151 Enterobacter cloacae 0,9987 Y33 - - 4560477153 Enterobacter cloacae 0,9961 Y34 - - 5464454151 Citrobacter freundii 0,9998 Y35 - - 5464654155 Citrobacter freundii 0,9994 Y36 - - 5764427151 Pantoea agglomerans 0,7613 Y37 - - 5664456055 Citrobacter freundii 0,9973 Y38 - - 4764475555 Klebsiella pneumoniae 0,9241 Y39 - + 5760467555 Klebsiella pneumoniae 0,9413 Y40 - - 4764627051 Escherichia vulneris 0,9475 Y41 - - 5764677150 Enterobacter cloacae 0,8043 Y42 - - 4760473151 Enterobacter cloacae 0,9673

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Y43 - + 5764637151 Kluyvera ascorbata 0,9925

Y44 - - 5766476156 Enterobacter sakazakii 0,8111 Y45 - - 7765627157 Enterobacter sakazakii 0,9416 Y46 - + 5774677153 Kluyvera ascorbata 0,9439

Y47 - - 7775677555 Klebsiella pneumoniae 0,9853

Y48 - - 7765627157 Enterobacter sakazakii 0,9416 Y49 - - 5464477553 Enterobacter cloacae 0,9999 Y50 - - 7775637153 Enterobacter cancerogenus 0,5033 Y51 - + 4774437151 Kluyvera cryocrescens 0,8422 Y52 - - 5764677557 Enterobacter aerogenes 0,8747 Y53 - - 5464457051 Citrobacter freundii 0,9962 Y54 - - 7764272153 Enterobacter cloacae 0,8189 Y55 - - 5766477152 Enterobacter cloacae 0,9886 Y56 - - 5764476152 Enterobacter cloacae 0,9048 Y57 - - 5764256057 Serratia plymuthica 0,8677 Y58 - + 5764676557 Serratia odorifera 0,7963 Y59 - + 5420677151 Citrobacter amalonaticus 0,8735 Y60 - - 5766476152 Enterobacter cloacae 0,6927 Y61 - - 5470473153 Enterobacter cloacae 0,9996 Y62 - + 5774637151 Kluyvera ascorbata 0,9864 Y63 - + 5764676153 Kluyvera ascorbata 0,9308 Y64 - - 4764476057 Enterobacter sakazakii 0,7089 Y65 - - 5766476153 Enterobacter cloacae 0,6618 Y66 - - 7765671151 Enterobacter cloacae 0,937 Y67 - - 7764477153 Enterobacter cloacae 0,9962 Y68 - - 5764276057 Serratia plymuthica 0,8302 Y69 - - 4675477153 Enterobacter cloacae 0,9921 Y70 - - 5765276057 Serratia plymuthica 0,6877 Y71 - - 5624657151 Citrobacter freundii 0,996 Y72 - - 5725654447 Serratia fonticola 0,9933 Y73 - - 5766477152 Enterobacter cloacae 0,9886 Y74 - - 5764477555 Klebsiella pneumoniae 0,9919 Y75 - - 5724627052 Escherichia vulneris 0,9987 Y76 - - 5766476153 Enterobacter cloacae 0,6618 Y77 - + 5420677151 Citrobacter amalonaticus 0,8735 Y78 - - 7767276157 Serratia liquefaciens 0,6819 Y79 - - 5420444051 Citrobacter freundii 0,9799 Y80 - - 7764276557 Serratia marcescens 0,9547 Y81 - - 5766477153 Enterobacter cloacae 0,9872 Y82 - - 5423614153 Hafnia alvei 0,9847 Y83 - + 5764627151 Kluyvera ascorbata 0,9942 Y84 - + 5765677557 Klebsiella oxytoca 0,9715 Y85 - - 5765476553 Enterobacter cloacae 0,9226 Y86 - - 5767476152 Enterobacter cloacae 0,7434 Y87 - + 5764637051 Kluyvera ascorbata 0,9876 Y88 - - 5764276057 Serratia plymuthica 0,8302 Y89 - + 5664677151 Kluyvera ascorbata 0,9349 Y90 - - 4464654141 Citrobacter freundii 0,999 Y91 - - 5764627051 Escherichia vulneris 0,6454 Y92 - - 5764455555 Klebsiella pneumoniae 0,9504 Y93 - - 5765647151 Pantoea agglomerans 0,6856

11

Y94 - - 7765256157 Serratia spp. 0,9846

Y95 - - 5765477153 Enterobacter cloacae 0,9957 Y96 - + 5464654151 Citrobacter freundii 0,9771 Y97 - + 5765637151 Kluyvera ascorbata 0,8306

Y98 - - 5764427151 Pantoea agglomerans 0,7613

Y99 - - 5764077153 Enterobacter cloacae 0,9948 Y100 - - 5420656050 Citrobacter freundii 0,994

12

Apéndice A2 Identificación de aislamientos de pocillos amarillos con fluorescencia del método Colilert®-18/Quanti-Tray®

Ref.

aislamiento Oxidasa Indol Perfil Crystal E/NF Identificación Confianza F1 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F2 - + 5461444171 Escherichia coli 0,9737 F3 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F4 - + 4464444171 Escherichia coli 0,9813 F5 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991 F6 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F7 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F8 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F9 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998

F10 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F11 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997 F12 - + 4464444171 Escherichia coli 0,9813 F13 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997 F14 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F15 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F16 - + 5425444571 Escherichia coli 0,9679 F17 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F18 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F19 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F20 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F21 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997 F22 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F23 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997 F24 - + 5465444161 Escherichia coli 0,9976 F25 - + 5465444161 Escherichia coli 0,9976 F26 - + 5464044171 Escherichia coli 0,999 F27 - + 5465446071 Escherichia coli 0,9945 F28 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F29 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F30 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F31 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F32 - + 5425444571 Escherichia coli 0,9679 F33 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F34 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F35 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997 F36 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F37 - + 5464044171 Escherichia coli 0,999 F38 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F39 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F40 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991 F41 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F42 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F43 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F44 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F45 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997 F46 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998

13

F47 - + 5665444171 Escherichia coli 0,9962

F48 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F49 - + 5465404171 Escherichia coli 0,9314 F50 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F51 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991 F52 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F53 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F54 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F55 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997 F56 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F57 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F58 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F59 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F60 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F61 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F62 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F63 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F64 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F65 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997 F66 - + 5665444171 Escherichia coli 0,9962 F67 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F68 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F69 - + 5435444171 Escherichia coli 0,9803 F70 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F71 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F72 - + 4464444171 Escherichia coli 0,9813 F73 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F74 - + 5724444571 Escherichia coli 0,9999 F75 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991 F76 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997 F77 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997 F78 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F79 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F80 - - 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F81 - + 5424444061 Escherichia coli 0,8035 F82 - + 5464044171 Escherichia coli 0,999 F83 - + 5465446071 Escherichia coli 0,9945 F84 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F85 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F86 - + 5564044171 Escherichia coli 0,9911 F87 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F88 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F89 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F90 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997 F91 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F92 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F93 - + 5424444171 Escherichia coli 0,9997 F94 - + 5420444571 Escherichia coli 0,9983 F95 - + 5425444571 Escherichia coli 0,9679 F96 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998 F97 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998

14

F98 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998

F99 - + 5465464171 Escherichia coli 0,991 F100 - + 5765475577 Klebsiella oxytoca 0,7486

15

Apéndice A3 Identificación de aislamientos de pocillos negativos del método Colilert®-18/Quanti-Tray®

Ref. aislamie

nto β-Gal β-Gluc Oxidasa Indol Perfil Crystal

E/NF Identificación Confianza

N1 NO HAY CRECIMIENTO N2 NO HAY CRECIMIENTO N3 NO HAY CRECIMIENTO N4 - - + - 3103310212 Shewanella putrefaciens 0,9994 N5 NO HAY CRECIMIENTO N6 NO HAY CRECIMIENTO N7 NO HAY CRECIMIENTO N8 NO HAY CRECIMIENTO N9 NO HAY CRECIMIENTO N10 NO HAY CRECIMIENTO N11 NO HAY CRECIMIENTO N12 NO HAY CRECIMIENTO N13 NO HAY CRECIMIENTO N14 NO HAY CRECIMIENTO N15 NO HAY CRECIMIENTO N16 NO HAY CRECIMIENTO N17 - - + - 3103310212 Shewanella putrefaciens 0,9994 N18 NO HAY CRECIMIENTO N19 NO HAY CRECIMIENTO N20 NO HAY CRECIMIENTO N21 NO HAY CRECIMIENTO N22 NO HAY CRECIMIENTO N23 NO HAY CRECIMIENTO N24 NO HAY CRECIMIENTO N25 NO HAY CRECIMIENTO N26 NO HAY CRECIMIENTO N27 NO HAY CRECIMIENTO N28 NO HAY CRECIMIENTO N29 NO HAY CRECIMIENTO N30 NO HAY CRECIMIENTO N31 NO HAY CRECIMIENTO N32 NO HAY CRECIMIENTO N33 NO HAY CRECIMIENTO N34 NO HAY CRECIMIENTO N35 NO HAY CRECIMIENTO N36 NO HAY CRECIMIENTO N37 NO HAY CRECIMIENTO N38 NO HAY CRECIMIENTO N39 NO HAY CRECIMIENTO N40 NO HAY CRECIMIENTO N41 NO HAY CRECIMIENTO N42 NO HAY CRECIMIENTO N43 NO HAY CRECIMIENTO N44 NO HAY CRECIMIENTO N45 NO HAY CRECIMIENTO

16

N46 NO HAY CRECIMIENTO N47 NO HAY CRECIMIENTO N48 NO HAY CRECIMIENTO N49 NO HAY CRECIMIENTO N50 NO HAY CRECIMIENTO N51 NO HAY CRECIMIENTO N52 NO HAY CRECIMIENTO N53 NO HAY CRECIMIENTO N54 NO HAY CRECIMIENTO

17

Apéndice B: Datos de los estudios sobre la incertidumbre del recuento (véase el apartado 4)

Apéndice B1 Incertidumbre del recuento para NMP* de pocillos amarillos sin

fluorescencia de un sistema Colilert®-18/Quanti-Tray® inoculado con Klebsiella pneumoniae ATCC 33186

*Número Más Probable registrado como números enteros

Analista A Lectura 1

Analista A Lectura 2

Lectura Analista

B

Lectura Analista

C Repetibilidad Reproducibilidad

Muestra NMP NMP NMP NMP Media Desv. Est.

DER al cuadrado Media Desv.

Est. DER al

cuadrado 1 2 2 2 2 2,00 0,0000 0,0000 2,00 0,0000 0,0000 2 6 6 6 6 6,00 0,0000 0,0000 6,00 0,0000 0,0000 3 19 19 19 19 19,00 0,0000 0,0000 19,00 0,0000 0,0000 4 18 18 18 18 18,00 0,0000 0,0000 18,00 0,0000 0,0000

5 36 36 36 36 36,00 0,0000 0,0000 36,00 0,0000 0,0000

6 34 34 34 36 34,00 0,0000 0,0000 34,67 1,1547 0,0011 7 31 31 31 31 31,00 0,0000 0,0000 31,00 0,0000 0,0000 8 27 27 27 27 27,00 0,0000 0,0000 27,00 0,0000 0,0000 9 56 56 56 56 56,00 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000

10 50 50 50 50 50,00 0,0000 0,0000 50,00 0,0000 0,0000 11 41 41 41 41 41,00 0,0000 0,0000 41,00 0,0000 0,0000 12 48 48 48 48 48,00 0,0000 0,0000 48,00 0,0000 0,0000 13 56 56 56 56 56,00 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000 14 89 89 89 89 89,00 0,0000 0,0000 89,00 0,0000 0,0000

15 78 78 78 78 78,00 0,0000 0,0000 78,00 0,0000 0,0000

16 66 70 70 70 68,00 2,8284 0,0017 68,67 2,3094 0,0011 17 109 109 109 109 109,00 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000 18 78 89 89 89 83,50 7,7782 0,0087 85,33 6,3509 0,0055 19 95 95 95 95 95,00 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000

20 95 95 95 95 95,00 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000 21 95 101 101 101 98,00 4,2426 0,0019 99,00 3,4641 0,0012 22 83 89 89 89 86,00 4,2426 0,0024 87,00 3,4641 0,0016 23 109 109 109 109 109,00 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000 24 101 101 109 109 101,00 0,0000 0,0000 106,33 4,6188 0,0019

25 145 145 145 145 145,00 0,0000 0,0000 145,00 0,0000 0,0000 26 145 145 145 145 145,00 0,0000 0,0000 145,00 0,0000 0,0000 27 201 201 201 201 201,00 0,0000 0,0000 201,00 0,0000 0,0000 28 165 165 165 165 165,00 0,0000 0,0000 165,00 0,0000 0,0000 29 165 165 165 165 165,00 0,0000 0,0000 165,00 0,0000 0,0000

30 201 201 201 201 201,00 0,0000 0,0000 201,00 0,0000 0,0000

Suma

de DER 0,0147 Suma de

DER 0,0125 DERc 0,0221 DERc 0,0204

18

Apéndice B2 Incertidumbre del recuento para NMP* de pocillos amarillos con fluorescencia de un sistema Colilert®-18/Quanti-Tray® inoculado con E. coli ATCC 25922

*Número Más Probable registrado como números enteros

Analista A Lectura 1

Analista A Lectura 2

Lectura Analista

B

Lectura Analista

C Repetibilidad Reproducibilidad

Muestra NMP NMP NMP NMP Media Desv. Est.

DER al cuadrado Media Desv.

Est. DER al

cuadrado 1 6 6 6 6 6,00 0,0000 0,0000 6,00 0,0000 0,0000 2 11 11 11 11 11,00 0,0000 0,0000 11,00 0,0000 0,0000 3 9 9 9 9 9,00 0,0000 0,0000 9,00 0,0000 0,0000 4 29 29 29 29 29,00 0,0000 0,0000 29,00 0,0000 0,0000

5 32 32 32 32 32,00 0,0000 0,0000 32,00 0,0000 0,0000 6 21 21 21 21 21,00 0,0000 0,0000 21,00 0,0000 0,0000 7 36 36 36 36 36,00 0,0000 0,0000 36,00 0,0000 0,0000 8 32 32 32 32 32,00 0,0000 0,0000 32,00 0,0000 0,0000 9 56 56 56 56 56,00 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000

10 50 50 50 50 50,00 0,0000 0,0000 50,00 0,0000 0,0000 11 48 48 48 48 48,00 0,0000 0,0000 48,00 0,0000 0,0000 12 45 45 45 48 45,00 0,0000 0,0000 46,00 1,7321 0,0014 13 78 78 78 78 78,00 0,0000 0,0000 78,00 0,0000 0,0000 14 70 70 70 70 70,00 0,0000 0,0000 70,00 0,0000 0,0000

15 66 66 66 66 66,00 0,0000 0,0000 66,00 0,0000 0,0000

16 78 78 78 78 78,00 0,0000 0,0000 78,00 0,0000 0,0000 17 95 95 95 95 95,00 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000 18 109 109 109 109 109,00 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000 19 101 101 101 101 101,00 0,0000 0,0000 101,00 0,0000 0,0000

20 89 89 89 89 89,00 0,0000 0,0000 89,00 0,0000 0,0000 21 130 130 130 130 130,00 0,0000 0,0000 130,00 0,0000 0,0000 22 95 95 95 95 95,00 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000 23 70 70 70 70 70,00 0,0000 0,0000 70,00 0,0000 0,0000 24 74 74 74 74 74,00 0,0000 0,0000 74,00 0,0000 0,0000

25 109 109 109 109 109,00 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000

26 101 101 101 101 101,00 0,0000 0,0000 101,00 0,0000 0,0000 27 145 145 145 145 145,00 0,0000 0,0000 145,00 0,0000 0,0000 28 165 165 165 165 165,00 0,0000 0,0000 165,00 0,0000 0,0000 29 118 118 118 118 118,00 0,0000 0,0000 118,00 0,0000 0,0000

30 130 130 130 130 130,00 0,0000 0,0000 130,00 0,0000 0,0000

Suma

de DER 0,0000 Suma de

DER 0,0014

DERc 0,0000 DERc 0,0069

19

Apéndice C: Recuentos por duplicado de suspensiones de E. coli, Klebsiella pneumoniae y Citrobacter freundii de un sistema Colilert®-18/Quanti-Tray® tras 18 horas y 22 horas de incubación utilizando Colilert-18 almacenado a 25 °C durante 541 días (véase el apartado 5)

Número de pocillos positivos

Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Citrobacter freundii Días desde fabricación

18 h 22 h % de

cambio 18 h 22 h

% de cambio

18 h 22 h % de

cambio 8 2

4 7

2 4 7

0 0 0

12 11 15

12 11 15

0 0 0

11 14 16

11 14 16

0 0 0

15 9 16 8

9 16 8

0 0 0

9 19 13

9 19 13

0 0 0

2 5 7

3 5 7

+ 50 % 0 0

24 14 9 10

14 9 10

0 0 0

14 12 16

14 12 16

0 0 0

14 16 18

14 16 18

0 0 0

30 13 17 11

13 17 11

0 0 0

18 16 13

18 16 13

0 0 0

18 18 8

18 18 8

0 0 0

36 8 13 14

8 13 14

0 0 0

18 13 17

18 13 17

0 0 0

16 15 16

16 15 16

0 0 0

44 8 5 9

8 5 9

0 0 0

24 14 19

24 14 19

0 0 0

11 16 10

12 18 11

+ 9 % + 13 % + 10 %

56 13 4 4

13 4 4

0 0 0

10 16 14

10 16 14

0 0 0

6 7 11

7 14 11

+ 17 % + 100 %

0 84 10

8 8

10 8 8

0 0 0

14 16 19

14 16 19

0 0 0

11 8 12

11 8 12

0 0 0

111 9 5 21

9 5 21

0 0 0

20 12 12

20 12 12

0 0 0

20 17 17

20 17 17

0 0 0

138 3 2 9

3 2 9

0 0 0

14 15 12

14 15 12

0 0 0

8 10 13

9 10 13

+ 13 % 0 0

175 7 11 12

7 11 12

0 0 0

15 20 22

16 20 22

+ 7 % 0 0

16 20 30

16 21 30

0 + 5 %

0 205 10

8 14

10 8 14

0 0 0

17 20 18

17 20 18

0 0 0

18 18 22

18 18 22

0 0 0

269 8 10 10

8 10 10

0 0 0

13 26 19

13 26 19

0 0 0

14 17 14

14 17 14

0 0 0

319 13 18 13

13 18 13

0 0 0

15 17 11

15 17 11

0 0 0

4 13 13

5 15 14

+ 25 % + 15 % + 8 %

367 2 11

2 11

0 0

12 21

12 21

0 0

17 20

17 20

0 0

20

10 10 0 20 20 0 21 21 0 541 7

10 9

7 10 9

0 0 0

13 17 16

13 17 16

0 0 0

11 11 8

11 12 9

0 + 9 %

+ 13 %

Apéndice D: Intervalos de confianza del 95% y repetibilidad teórica para cada uno de los valores de NMP para el sistema Colilert®-18/Quanti-Tray® de 51 pocillos (véase el apartado 7)

Intervalos de confianza del 95% Repetibilidad teórica

Nº de pocillos reacción positiva

NMP por 100 ml de muestra

Inferior Superior

Desviación estándar de la repetibilidad

Log10 DE

Incertidumbre estándar relativa

CV% 0 <1,0 0,0 3,7 - - 1 1,0 0,3 5,6 0,4343 100,0 2 2,0 0,6 7,3 0,3071 70,7 3 3,1 1,1 9,0 0,2508 57,7 4 4,2 1,7 10,7 0,2172 50,0 5 5,3 2,3 12,3 0,1943 44,7 6 6,4 3,0 13,9 0,1774 40,9 7 7,5 3,7 15,5 0,1643 37,8 8 8,7 4,5 17,1 0,1537 35,4 9 9,9 5,3 18,8 0,1450 33,4

10 11,1 6,1 20,5 0,1376 31,7 11 12,4 7,0 22,1 0,1313 30,2 12 13,7 7,9 23,9 0,1257 29,0 13 15,0 8,8 25,7 0,1209 27,8 14 16,4 9,8 27,5 0,1166 26,8 15 17,8 10,8 29,4 0,1127 26,0 16 19,2 11,9 31,3 0,1092 25,1 17 20,7 13,0 33,3 0,1061 24,4 18 22,2 14,1 35,2 0,1032 23,8 19 23,8 15,3 37,3 0,1005 23,1 20 25,4 16,5 39,4 0,0981 22,6 21 27,1 17,7 41,6 0,0959 22,1 22 28,8 19,0 43,9 0,0938 21,6 23 30,6 20,4 46,3 0,0919 21,2 24 32,4 21,8 48,7 0,0902 20,8 25 34,4 23,3 51,2 0,0885 20,4 26 36,4 24,7 53,9 0,0870 20,0 27 38,4 26,4 56,6 0,0856 19,7 28 40,6 28,0 59,5 0,0843 19,4 29 42,9 29,7 62,5 0,0830 19,1 30 45,3 31,5 65,6 0,0819 18,9 31 47,8 33,4 69,0 0,0809 18,6 32 50,4 35,4 72,5 0,0799 18,4

33 53,1 37,5 76,2 0,0791 18,2 34 56,0 39,7 80,1 0,0783 18,0 35 59,1 42,0 84,4 0,0776 17,9 36 62,4 44,6 88,8 0,0770 17,7 37 65,9 47,2 93,7 0,0765 17,6 38 69,7 50,0 99,0 0,0761 17,5 39 73,8 53,1 104,8 0,0758 17,4 40 78,2 56,4 111,2 0,0756 17,4 41 83,1 59,9 118,3 0,0756 17,4 42 88,5 63,9 126,2 0,0757 17,4 43 94,5 68,2 135,4 0,0761 17,5 44 101,3 73,1 146,0 0,0768 17,7 45 109,1 78,6 158,7 0,0778 17,9 46 118,4 85,0 174,5 0,0794 18,3 47 129,8 92,7 195,0 0,0819 18,9 48 144,5 102,3 224,1 0,0859 19,8 49 165,2 115,2 272,2 0,0929 21,4 50 200,5 135,8 387,6 0,1094 25,2 51 > 200,5 146,1 infinite - -