8/14/2019 En Do Toxins in Vaccines

1/5

A P P L I E D AND E N V I R O N M E N T A L M I C R O B I O L O G Y , S e p t . 1 9 7 8 , p . 4 4 5 4 4 90 0 9 9 - 2 2 4 0 / 7 8 / 0 0 3 6 - 0 4 5 $ . 0 0 / 0C o p y r i g h t C ) 1 9 7 8 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g yV o l . 3 6 , N o . 3

P r i n t e d i n U . S . A .

E n d o t o x i n s i n C o m m e r c i a l V a c c i n e sMARK R . G E I E R , t * HELEN S T A N B R O , 4 A N D C . R . MERRIL

L a b o r a t o r y o f G e n e r a l a n d C o m p a r a t i v e B i o c h e m i s t r y , N a t i o n a l I n s t i t u t e o f M e n t a l H e a l t h , B e t h e s d a ,M a r y l a n d 2 0 0 1 4R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 2 J u n e 1 9 7 8

T w e n t y s a m p l e s o f c o m m e r c i a l v a c c i n e s i n t e n d e d f o r a d m i n i s t r a t i o n t o h u m a n sw e r e a s s a y e d f o r t h e p r e s en ce o f b a c t e r i a l e n d o t o x i n s b y u s i n g t h e L i m u l u sa m e b o c y t e l y s a t e t e s t . S i x t e e n o f t h e v a c c i n e s c o n t a i n e d m o r e t h a n 0 . 1 n g o fe n d o t o x i n p e r m l ( w h i c h c o r r e s p o n d s t o 1 0 3 b k c t e r i a l c e l l w a l l e q u i v a l e n t s p e r m li n t h e u n d i l u t e d v a c c i n e s ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t a t s o m e s t a g e o f p r e p a r a t i o n ,t h e v a c c i n e s h a v e c o n t a i n e d v a r y i n g a m o u n t s o f g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a a n d mayi n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f o t h e r b a c t e r i a l p r o d u c t s a s w e l l . I t m i g h t b e u s e f u l t o l i s tt h e l e v e l o f e n d o t o x i n s , p h a g e , a n d o t h e r c o n t a m i n a n t s o n e a c h v a c c i n e l o t t of a c i l i t a t e s t u d i e s o n a n y s i d e e f f e c t s o f t h e s e c o n t i n a n t s . S e l e c t i o n o f v a c c i n el o t s w i t h t h e l e a s t e n d o t o x i n m i g h t r e d u c e s o m e o f t h e a d v e r s e e f f e c t s o f v a c c i -n a t i o n s .A f t e r t h e d i s c o v e r y a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o fb a c t e r i a l v i r u s e s i n c o m m e r c i a l s e r a ( 2 , 8 , 9 , 1 8 ,2 2 ) a n d v a c c i n e s m a n u f a c t u r e d w i t h c o m m e r c i a ls e r a ( 1 9 , 2 4 ) , we i n i t i a t e d s t u d i e s f o r o t h e r b a c -t e r i a l p r o d u c t s i n s e r a a n d v a c c i n e s . A l t h o u g hs e r u m u s e d i n v a c c i n e p r o d u c t i o n i s f i l t e r s t e r i -l i z e d , b a c t e r i a l p r o d u c t s s u c h a s n u c l e i c a c i d s ,p r o t e i n s , e n d o t o x i n s , a n d v i r u s e s m i g h t p a s s

t h r o u g h t h e f i l t e r s .The f i n d i n g o f l i v e g r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a , c o l -i p h a g e s p l a t i n g o n E s c h e r i c h i a c o l i C 3 0 0 0 ,a n d / o r b a c t e r i a l e n d o t o x i n s i n 2 3 o u t o f 2 4 l o t so f u n f i l t e r e d c a l f s e r a c o l l e c t e d b y a " c l e a nc a t c h " m e t h o d ( 2 2 ) i n d i c a t e d t h a t e v e n t h o u g hg r a m - n e g a t i v e orgni c o u l d n o t a l w a y s b ec u l t u r e d f r o m t h e s e r a , t h e i r p r e s e n c e c o u l d a tl e a s t b e t r a c e d b y t h e p e r s i s t e n c e o f t h e i r s p e c i f i cp h a g e s a n d e n d o t o x i n s .T h e a b i l i t y t o m o n i t o r f o r s o m e c o n t a m i n a n t s ,s u c h a s b a c t e r i a l v i r u s e s , may b e h a m p e r e d b yt h e p r e s e n c e o f b a c t e r i o c i d a l p r e s e r v a t i v e s i nc o m m e r c i a l v a c c i n e s . I t i s a l s o o f t e n u n c l e a rw h i c h b a c t e r i a h o s t s t r a i n s a n d g r o w t h c o n d i -t i o n s t o u s e f o r t h e d e m o n s t r a t i o n o f c o n t a m i -n a t i n g v i r u s e s . The L i m u l u s a m e b o c y t e l y s a t e( L A L ) a s s a y f o r e n d o t o x i n p r o v i d e s a c o n v e n i e n ta l t e r n a t i v e f o r s c r e e n i n g b i o l o g i c a l p r o d u c t s f o rc u r r e n t o r p r e e x i s t i n g g r a m - n e g a t i v e c o n t a m i -n a t i o n .A r e p o r t d e t e c t i n g b a c t e r i o p h a g e s a n d e n d o -t o x i n i n c e r t a i n c o m m e r c i a l l i v e - v i r u s v a c c i n e s

t P r e s e n t a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f O b s t e t r i c s a n d G y n e c o l -o g y , T h e J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y H o s p i t a l , B a l t i m o r e , MD2 1 2 0 5 .t P r e s e n t a d d r e s s : G e o r g e W a s h i n g t o n U n i v e r s i t y G r a d u -a t e S c h o o l , W a s h i n g t o n , D C 2 0 0 0 7 .

( a g a i n s t p o l i o , m e a s l e s , mumps a n d r u b e l l a )d e m o n s t r a t e s t h a t t h e LAL a s s a y f o r e n d o t o x i nc a n b e u s e d a s a s c r e e n f o r p r i o r c o n t a m i n a t i o nw i t h g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a ( 1 9 ) . T h e p r e s e n ts t u d y c o n f i r m s t h e s e o b s e r v a t i o n s a n d e x t e n d st h e m t o i n c l u d e a d d i t i o n a l v a c c i n e s a n d s i m i l a rp a r e n t e r a l p r o d u c t s .MATERIALS A N D METHODSL i m u l u s P y r o t e s t k i t s w e r e p u r c h a s e d f r o m D i f c oL a b o r a t o r i e s ( D e t r o i t , M i c h . ) . T h e y c o n t a i n e d i n d i -v i d u a l t e s t t u b e s o f l y o p h i l i z e d L A L , a p y r o g e n - f r e e ,d i s t i l l e d w a t e r n e g a t i v e c o n t r o l , a n d t w o p o s i t i v e c o n -t r o l s c o n t a i n i n g , r e s p e c t i v e l y , 0 . 5 a n d 5 . 0 n g o f p u r i f i e de n d o t o x i n p e r m l .S o m e v a c c i n e s w e r e d o n a t e d b y W y e t h ; M e r c k ,S h a r p & D o h m e ; S m i t h , K l i n e & F r e n c h L a b o r a t o r i e s ;P f i z e r I n c . ; E l i L i l l y & C o . ; M e r r e l l - N a t i o n a l ; a n dP a r k e , D a v i s & C o . O t h e r v a c c i n e s w e r e p u r c h a s e d .A l l v a c c i n e s t e s t e d w e r e i n t e n d e d f o r human a d m i n -i s t r a t i o n .S a m p l e s ( 2 0 0 p 1 ) o f v a c c i n e w e r e w i t h d r a w n s t e r i l e l yb y s y r i n g e a n d i n j e c t e d d i r e c t l y i n t o t h e t e s t v i a l sc o n t a i n i n g l y s a t e . A f t e r m i x i n g a n d 1 h o f i n c u b a t i o na t 3 7 0 C i n a w a t e r b a t h , t h e t u b e s w e r e g e n t l y i n v e r t e d .F o r m a t i o n o f a f i r m g e l w a s d e s i g n a t e d a s a p o s i t i v er e s u l t ( 5 ) . A w e a k g e l w h i c h c o u l d b e b r o k e n b y g e n t l yt a p p i n g w a s s c o r e d , w h e r e a s a w a t e r y f l u i d w a sc o n s i d e r e d n e g a t i v e . When i t w a s n e c e s s a r y t o d i l u t et h e s a m p l e , s e r i a l d i l u t i o n s w e r e made w i t h t h e n e g a -t i v e c o n t r o l s o l u t i o n a s d i l u e n t . S a m p l e s o f t h e n e g a -t i v e c o n t r o l w e r e r u n t h r o u g h a n i d e n t i c a l mock d i l u -t i o n p r o c e d u r e t o r u l e o u t c o n t a m i n a t i o n d u e t o o u rm a n i p u l a t i o n s . U n d i l u t e d v a c c i n e s w h i c h g a v e a n e g -a t i v e r e a c t i o n w e r e t e s t e d f o r t h e p r e s e n c e o f i n h i b i t o r

b y a " s p i k i n g " p r o c e d u r e ( 5 ) : 2 0 - p l s a m p l e s o f t h e 5 -n g / m l p o s i t i v e c o n t r o l were m i x e d w i t h 1 8 0 p l o fv a c c i n e , g i v i n g a f i n a l e n d o t o x i n c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 5n g / m l , a n d t h e n t h i s m i x t u r e was t e s t e d . B e c a u s e t h i s4 4 5

8/14/2019 En Do Toxins in Vaccines

2/5

446 G E I E R , STANBRO, A N I ) MERRILc o n c e n t r a t i o n i s c l o s e t o t h e l o w e r l i m i t o f r e s o l u t i o no f t h e t e s t , t h e p r e s e n c e o f i n h i b i t o r s w o u l d y i e l d an e g a t i v e r e s u l t ; a p o s i t i v e r e s u l t w o u l d mean l i t t l e o rn o i n h i b i t i o n . Th e v a c c i n e s t e s t e d i n t h i s manner a l lg a v e c l e a r p o s i t i v e s , w i t h t h e e x c e p t i o n o f o n e p o l i ov a c c i n e w h i c h g a v e a w e a k p o s i t i v e , p o s s i b l y r e f l e c t i n ga l o w l e v e l o f i n h i b i t o r i n t h a t p o l i o v a c c i n e s a m p l e .E n d o t o x i n s a r e l i p o p o l y s a c c h a r i d e s , t h e l i p i d A m o i e t yo f w h i c h i s c h l o r o f o r m s o l u b l e . E x t r a c t i o n o f c h o l e r aa n d i n f l u e n z a v a c c i n e s w i t h c h l o r o f o r m s h o w e d t h a tt h e g e l a t i o n a g e n t p r e s e n t i n t h e v a c c i n e s w a s c h l o -r o f o r m s o l u b l e ( 1 7 ) .The LA L a s s a y w a s a l s o p e r f o r m e d o n f i v e r e l a t e dp r o d u c t s : d i p h t h e r i a t o x o i d ( c o u r t e s y o f C . H a r d e g r e e ,B u r e a u o f B i o l o g i c s , F o o d a n d D r u g A d m i n i s t r a t i o n )l o t 4 0 1 0 3 - 4 2 8 ; t e t a n u s t o x o i d ( L e d e r l e L a b o r a t o r i e s )l o t 4 6 3 - 3 5 6 ; t e t a n u s t o x o i d a d s o r b e d a n d P u r o g e n a t e d( L e d e r l e ) l o t 4 6 6 - 3 4 0 ; s t a p h y l o c o c c u s t o x o i d ( L e d e r l e )l o t 4 6 3 - 3 1 4 ; a n d a n t i r a b i e s s e r u m ( L e d e r l e ) l o t 4 6 0 -2 2 8 . RESULTS

O f t h e 2 0 v a c c i n e s t e s t e d ( i n c l u d i n g t h e s w i n ef l u s a m p l e n o t s h o w n o n t h e t a b l e ) , o n l y t h r e ev a c c i n e s p r o v e d f r e e o f d e t e c t a b l e e n d o t o x i n( T a b l e 1 ) . The v o l u m e o f o n e s m a l l p o x s a m p l ew a s t o o s m a l l t o t e s t u n d i l u t e d i n o u r a s s a y ,w h e r e a s t h e o t h e r s m a l l p o x s a m p l e g a v e a +r e s u l t w h i c h was i n t e r p r e t e d a s i n d i c a t i n g s m a l la m o u n t s o f e n d o t o x i n ( a p p r o x i m a t e l y 0 . 1n g / m l ) . The h i g h l e v e l s o f e n d o t o x i n o b s e r v e di n t h e c h o l e r a a n d c o m b i n e d DPT v a c c i n e s mostp r o b a b l y r e f l e c t t h e i r g r a m - n e g a t i v e o r i g i n s a n da r e i n h e r e n t i n t h e p r o d u c t s p e r s e ( u n l e s s t h eb i o l o g i c a l a c t i v i t y o f e n d o t o x i n s c o u l d b e d e -s t r o y e d w h i l e t h e a n t i g e n i c i t y i s r e t a i n e d ) . A l l o ft h e o t h e r v a c c i n e s w h i c h s h o w e d some l e v e l o fe n d o t o x i n d i d s o i n s p i t e o f t h e f a c t t h a t nog r a m - n e g a t i v e o r g a n i s m s w e r e d e l i b e r a t e l y i n -v o l v e d i n t h e i r m a n u f a c t u r e . T h e r e were v a r i a -t i o n s b e t w e e n some b a t c h e s o f t h e same t y p e o fv a c c i n e f r o m d i f f e r e n t l o t s o r d i f f e r e n t m a n u f a c -t u r e r s . A l l v a c c i n e s p r e p a r e d i n e m b r y o n a t e dc h i c k o r d u c k e g g s s h o w e d some l e v e l o f contam-i n a t i o n . T h i s i s p r o b a b l y d u e t o c o n t a m i n a t i o no f s u c h e g g s w i t h S a l m o n e l l a ( 3 4 ) . O f t h e 1 9v a c c i n e s s t u d i e d , 1 3 c o n t a i n e d l e v e l s ( - 1 n g / m l )s u f f i c i e n t t o c a u s e a f e b r i l e r e a c t i o n i n t h e r a b b i tp y r o g e n t e s t .The u n d i l u t e d s a m p l e s o f a n t i r a b i e s s e r u m ,d i p h t h e r i a t o x o i d a n d t e t a n u s t o x o i d ( b o t h p l a i na n d a d s o r b e d ) g a v e + r e s u l t s . T h e s t a p h y l o c o c -c u s t o x o i d r e s u l t was n e g a t i v e .

DISCUSSIONTh e i m p l i c a t i o n s o f e n d o t o x i n c o n t a m i n a t i o na r e n o t y e t f u l l y u n d e r s t o o d . A d v e r s e r e a c t i o n sr a n g i n g f r o m m i l d f e v e r t o a t l e a s t o n e f a t a lg e n e r a l i z e d S c h w a r t z m a n n r e a c t i o n ( 1 0 , 1 4 , 3 3 )h a v e b e e n a t t r i b u t e d t o t h e p r e s e n c e o f e n d o -

t o x i n i n v a c c i n e s . H o w e v e r , i t s h o u l d b e n o t e dt h a t t h e f a t a l S c h w a r t z m a n n r e a c t i o n o c c u r r e dd u r i n g t h e u s e o f a t y p h o i d v a c c i n e f o r f e v e rt h e r a p y a n d n o t i m m u n i z a t i o n ( 3 3 ) .T he f e b r i l e r e s p o n s e t o a v a c c i n e i s d u e t o anumber o f f a c t o r s , a s i n d i c a t e d b y t h e l a c k o fc o r r e l a t i o n b e t w e e n human f e b r i l e r e s p o n s e a n de n d o t o x i n l e v e l s i n i n f l u e n z a v a c c i n e s ( 1 ) . On t h eo t h e r h a n d , a d v e r s e r e a c t i o n s t o p o l y s a c c h a r i d ev a c c i n e s d i d c o r r e l a t e w i t h e n d o t o x i n c o n t e n t a sm e a s u r e d b y t h e LA L a s s a y a n d t h e r a b b i t t e s t( 1 4 ) . E f f e c t s o f e n d o t o x i n s o n t h e c e n t r a l n e r v o u ss y s t e m , c a r d i o v a s c u l a r s y s t e m , k i d n e y s , l i v e r ,h y p o t h a l a m u s , a n d l y m p h a t i c s y s t e m h a v e b e e nn o t e d i n e x p e r i m e n t a l a n i m a l s t u d i e s ( 1 5 , 3 7 ) .M o s t o f t h e s e s t u d i e s i n v o l v e d l a r g e r c o n c e n t r a -t i o n s o f e n d o t o x i n s t h a n we h a v e o b s e r v e d i nt h e s e v a c c i n e s t u d i e s ; h o w e v e r , t h e y may i n d i -c a t e some p o i n t s o f c o n c e r n p a r t i c u l a r l y i nc h r o n i c a l l y i l l o r e l d e r l y i n d i v i d u a l s . A f a t a l a d -d i t i v e e f f e c t o f i n f l u en z a v a c c i n e a n d e n d o t o x i nh a s a l s o b e e n o b s e r v e d i n g u i n e a p i g s ( 2 5 ) . As ar e s u l t o f t h a t o b s e r v a t i o n , t h e f e d e r a l g o v e r n -ment h a s s e t p e r m i s s i b l e l e v e l s o f e n d o t o x i n f o ri n f l u e n z a v a c c i n e s o n l y ( 2 5 ) .I n v i e w o f t h e s e f a c t s , i t w o u l d o b v i o u s l y b ed e s i r a b l e f o r c l i n i c i a n s t o know t h e e n d o t o x i nl e v e l s o f b i o l o g i c a l p r o d u c t s i n t e n d e d f o r humana d m i n i s t r a t i o n .The s p e c i f i c i t y a n d c o n v e n i e n c e o f t h e LA La s s a y ( 5 , 1 6 , 2 6 , 3 5 ) m a k e s t h i s a n i d e a l r a p i ds c r e e n i n g p r o c e d u r e f o r v a c c i n e s a m p l e s a n do t h e r b i o m e d i c a l p r o d u c t s . T h e t e s t d e t e c t s a sl i t t l e a s 0 . 1 n g o f e n d o t o x i n p e r m l ( 3 ) , w h i c hc o r r e s p o n d s t o a b o u t 1 0 3 b a c t e r i a l c e l l w a l le q u i v a l e n t s p e r m l ( 1 1 ) . T h e commonly u s e dr a b b i t t e s t f o r e n d o t o x i n d e t e c t s o n l y 1 n g / m la n d , f u r t h e r m o r e , i s s u b j e c t t o m i s i n t e r p r e t a t i o nb e c a u s e p y r o g e n i c v a c c i n e c o m p o n e n t s o t h e rt h a n e n d o t o x i n a l s o g i v e p o s i t i v e r e s u l t s ( 4 , 2 6 ) ,m a k i n g i t i m p o s s i b l e t o d i s t i n g u i s h e x t r a n e o u sp y r o g e n s f r o m t h o s e i n h e r e n t i n t h e v a c c i n ec o m p o n e n t s t h e m s e l v e s . A l t h o u g h t h e p o s s i b i l -i t y t h a t s u b s t a n c e s o t h e r t h a n e n d o t o x i n m i g h tc a u s e a p o s i t i v e LA L r e a c t i o n c a n n o t b e r i g o r -o u s l y e x c l u d e d , we c o n s i d e r i t t o b e u n l i k e l yb e c a u s e s e v e r a l s t u d i e s h a v e shown t h a t a n t i -b i o t i c s , n o r m a l p l a s m a a n d i t s v a s o a c t i v e c o m -p o n e n t s , c a l c i u m , h e m o g l o b i n , a n d v a r i o u sg r a m - p o s i t i v e p r o d u c t s ( 2 8 ) f a i l t o g i v e a n y f a l s ep o s i t i v e s w i t h t h e LA L a s s a y ( 3 , 1 1 , 1 7 , 2 8 , 2 9 ) .Some i n v e s t i g a t o r s h a v e r e p o r t e d f a l s e p o s i t i v e si n d u c e d b y p r o t e i n s , s y n t h e t i c p o l y n u c l e o t i d e s( 7 ) , a n d p u r i f i e d g r a m - p o s i t i v e p e p t i d o g l y c a n s( 3 6 ) . T h r o m b i n a l s o h a s b e e n s u g g e s t e d a s ap o s s i b l e s o u r c e o f f a l s e p o s i t i v e t e s t s ( 7 ) ; h o w -e v e r , more r e c e n t r e p o r t s ( 2 8 , 3 1 ) i n d i c a t e t h a tt h r o m b i n p e r s e d o e s n o t i n d u c e LA L c o a g u l a -

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

8/14/2019 En Do Toxins in Vaccines

3/5

V O L . 3 6 , 1 9 7 8 ENDOTOXINS I N COMMERCIAL VACCINES0 2E 0 0 -.......I..I..*.

~ ~ ~ ~ :::

* ~ ~ ~ 0 2C Dcn~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~I

o

1 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ +I + + + I + + + + 0 00 I ~~~~~~~~~~~~~~~~~+I+++++ ++000 + 1 1 + 1 1 + cm0 -z > > ,- 0 > 0 I 00000 0 00 o 0 Eo 0E~~0C

E JIEZ. E EEE E E E E E w0 0000 0w 0 0o . .e. E 0 . u0=u ,C O C D C O LOCCCI>)-DOIDO vo 0 LCO N)C&I NL)~'UA52 V)0 II< 0 c n )

() . C-LC

L L J O a C 0 1D~~ ~~~ 0 0 > > .wz x Cu.0cc0( N ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ f .=I0~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~> E 0 Cocnr - c c a . c r r 4 4 700I0-C. )z0- J. 00 1 .0 4I 1 1 1N

8/14/2019 En Do Toxins in Vaccines

4/5

4 4 8 G E I E R , STANBRO, AND MERRILt i o n . I n f a c t , t h e r e i s a g r e a t e r l i k e l i h o o d o f f a l s en e g a t i v e s ( 2 6 , 3 4 ) b e c a u s e some s e r u m c o m p o -n e n t s , a n t i c o s t e r o i d s , c o r t i c o s t e r o i d s , a n d v a c -c i n e p r e s e r v a t i v e s i n h i b i t t h e r e a c t i o n ( 1 6 , 2 6 ) .The p r e s e n c e o f s u c h i n h i b i t o r s c a n b e r u l e d o u tb y t h e s p i k i n g p r o c e d u r e ( d e s c r i b e d a b o v e ) .N u m e r o u s s t u d i e s ( 3 , 6 , 1 4 , 2 0 , 2 6 , 3 2 , 3 5 ) h a v eb e e n made t o c o m p a r e t h e e f f i c i e n c y a n d s p e c i -f i c i t y o f t h e LA L a s s a y a n d t h e s t a n d a r d r a b b i tt e s t . The c o n s e n s u s ( 2 6 ) a t p r e s e n t a p p e a r s t ob e t h a t a l t h o u g h n e i t h e r t e s t i s i d e a l , t h e r e i sg e n e r a l l y a g o o d a g r e e m e n t b e t w e e n t h e m , w i t ht h e LA L t e s t b e i n g more s e n s i t i v e , l e s s e x p e n -s i v e , a n d more c o n v e n i e n t . The m a j o r d i s a d v a n -t a g e s f o r t h e LA L a s s a y w e r e d i f f i c u l t y i n s t a n d -a r d i z i n g d i f f e r e n t b a t c h e s o f l y s a t e a n d t h e p o s -s i b i l i t y o f m i s s i n g p y r o g e n s o t h e r t h a n g r a m -n e g a t i v e e n d o t o x i n s . F a l s e n e g a t i v e s d u e t o t h ep r e s e n c e o f o t h e r c h e m i c a l s , a s n o t e d a b o v e , c a na l s o i n t e r f e r e . F o r s c r e e n i n g p u r p o s e s w h e r eg r a m - n e g a t i v e c o n t a m i n a t i o n i s s u s p e c t e d , h o w -e v e r , t h e LA L a s s a y c e r t a i n l y i s more s p e c i f i ca n d s e n s i t i v e . A l t h o u g h t h e r a b b i t t e s t i s s t i l lt h e s t a n d a r d t e s t f o r p y r o g e n s a n d t h e LALa s s a y h a s n o t y e t b e e n o f f i c i a l l y r e c o g n i z e d , i t i sc u r r e n t l y b e i n g u s e d a s a n a d d i t i o n a l s c r e e n f o ri n f l u e n z a v a c c i n e s b y t h e B u r e a u o f B i o l o g i c s ,F o o d a n d D r u g A d m i n i s t r a t i o n . I t i s a l s o b e i n gu s e d t o e x a m i n e o t h e r p a r e n t e r a l p r o d u c t s , i n -c l u d i n g a n t i t u m o r d r u g s ( 3 0 ) , r a d i o p h a r m a c e u -t i c a l s ( 2 0 ) , d r i n k i n g w a t e r ( 1 2 ) , i n t r a v e n o u sf l u i d s ( 2 1 ) , a n d i n t r a t h e c a l d r u g s ( 2 6 ) . T h e r e -p o r t s o f LA L t e s t s g e n e r a l l y a r e n o t i n c l u d e d i nt h e l i t e r a t u r e w h i c h a c c o m p a n i e s t h e v a c c i n e .W e f e e l t h a t t h e B u r e a u o f B i o l o g i c s s h o u l dr e q u i r e t h a t t h e e n d o t o x i n l e v e l s b e i n d i c a t e d o na l l v a c c i n e l o t s .W h e r e t h e o b s e r v e d e n d o t o x i n s a r e a n i n e v i -t a b l e p a r t o f t h e v a c c i n e p r o d u c t i o n ( a s w i t hc h o l e r a ) o r r e s u l t f r o m o t h e r p r o c e d u r e s s u c h a st h e i n ad v e r t e n t u s e o f c o n t a m i n a t e d s e r u m o re g g s , i t may b e p o s s i b l e t o e l i m i n a t e t h e m f r o mt h e v a c c i n e s . T h e a b s e n c e o f e n d o t o x i n f r o m a tl e a s t t h r e e v a c c i n e s s h o w s t h a t t h i s i s n o t i m -p o s s i b l e . V a r i o u s c h e m i c a l m e t h o d s o f r e m o v i n go r i n a c t i v a t i n g e n d o t o x i n e x i s t ( 2 3 , 2 7 ) , s o m e o fw h i c h m i g h t e v e n b e a d a p t e d t o s e l e c t i v e l y r e -move t h e e n d o t o x i n f r o m t h e a n t i g e n i c d e t e r -m i n a n t s i n t h e g r a m - n e g a t i v e v a c c i n e s t h e m -s e l v e s . F o r t h e v i r a l v a c c i n e s , e s p e c i a l l y , t h er e m o v a l o f e n d o t o x i n w i t h o u t l o s s o f a n t i g e n i c i t ymay b e e c o n o m i c a l l y f e a s i b l e . A r e c e n t r e p o r tf r o m t h e B u r e a u o f B i o l o g i c s , F o o d a n d D r u gA d m i n i s t r a t i o n ( 2 7 ) , d e s c r i b e s a s i m p l e a d s o r p -t i o n a n d e l u t i o n t e c h n i q u e w h i c h r e d u c e d t h ee n d o t o x i n l e v e l s o f i n f l u e n z a v a c c i n e 1 0 - t o 2 0 -f o l d w i t h o u t s i g n i f i c a n t l y a f f e c t i n g i t s a n t i g e n -i c i t y a n d a t t h e s a m e t i m e p e r f o r m i n g t h e n e c -

e s s a r y c o n c e n t r a t i o n s t e p i n t h e p r o d u c t i o n o ft h e v a c c i n e .I t i s o u r o p i n i o n t h a t t h e m o n i t o r i n g a n dr e p o r t i n g o f e n d o t o x i n s a n d o t h e r c o n t a m i n a n t si n v a c c i n e s m i g h t b e u s e f u l i n u n d e r s t a n d i n gs o m e o f t h e s i d e e f f e c t s o b s e r v e d i n v a c c i n er e c i p i e n t s . I t w o u l d b e u s e f u l f o r c l i n i c i a n s t oh a v e t h e i r l a b o r a t o r i e s m e a s u r e t h e e n d o t o x i nl e v e l s i n v a r i o u s v a c c i n e l o t s f r o m d i f f e r e n t c o m -p a n i e s u s i n g t h e LAL a s s a y . S e l e c t i o n o f t h ev a c c i n e s w i t h t h e l o we s t e n d o t o x i n l e v e l s m i g h th e l p t o a v o i d s o m e o f t h e a d v e r s e e f f e c t s o fv a c c i n a t i o n s .

LITERATURE CITED1 . B a r r y , D . W . , R . E . M a y n e r , H . D . H o c h s t e i n , R . C .D u n l a p , S . C . R a s t o g i , J . E . H a n n a h , R . J . B l a c k -b u r n , J . L . S u l l i v a n , and R . J . G e r e t y . 1 9 7 6 . C o m -p a r a t i v e t r i a l o f i n f l u e n z a v a c c i n e s . I I . A d v e r s e r e a c t i o n s

i n c h i l d r e n a n d a d u l t s . Am. J . E p i d e m i o l . 1 0 4 : 4 7 - 5 9 .2 . C h u , F . C . , J . B . J o h n s o n , H . C . O r r , P . G . P r o b s t ,a n d J . C . P e t r i c c i a n i . 1 9 7 3 . B a c t e r i a l v i r u s c o n t a m i -n a t i o n o f f e t a l b o v i n e s e r a . I n V i t r o 9 : 3 1 - 3 4 .3 . C o o p e r , J . F . , J . L e v i n , and H . N . W a g n e r . 1 9 7 1 .Q u a n t i t a t i v e c o m p a r i s o n o f i n v i t r o a n d i n v i v o m e t h o d sf o r t h e d e t e c t i o n o f e n d o t o x i n . J . L a b . C l i n . M e d .7 8 : 1 3 8 - 1 4 8 .4 . D a o u s t , D . R . , S . J . O r l o w s k i , G . McMahon, C . K .W e b e r , W. C . S h a w , T . C . F i s h e r , C . R . B e n n e t t ,a n d A . G r a y . 1 9 7 6 . T h e L i m u l u s a m e b o c y t e l y s a t e t e s ta s a m e t h o d f o r d e t e c t i o n o f e n d o t o x i n s a n d e n d o t o x i n -l i k e m a t e r i a l s . B u l l . P a r e n t e r . D r u g A s s o c . 3 0 : 1 3 - 2 0 .5 . D i f c o L a b o r a t o r i e s . 1 9 7 5 . T h e L i m u l u s l y s a t e t e s t f o rt h e d e t e c t i o n o f e n d o t o x i n u s i n g D i f c o P y r o t e s t . m a n dP y r o t r o l . , T e c h n i c a l i n f o r m a t i o n s h e e t , D i f c o P y r o t e s tK i t . D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t .6 . E l i n , R . J . , A . L . S a n b e r g , a n d D . L R o s e n t r e i c h .1 9 7 6 . C o m p a r i s o n o f t h e p y r o g e n i c i t y , L i m u l u s a c t i v i t ym i t o g e n i c i t y a n d c o m p l e m e n t r e a c t i v i t y o f s e v e r a l b a c -t e r i a l e n d o t o x i n s a n d r e l a t e d c o m p o u n d s . J . I m m u n o l .1 1 7 : 1 2 3 8 - 1 2 4 2 .7 . E l i n , R . J . , a n d S . M . W o l f . 1 9 7 3 . N o n s p e c i f i c i t y o f t h eL i m u l u s a m e b o c y t e l y s a t e t e s t : p o s i t i v e r e a c t i o n s , w i t hp o l y n u c l e o t i d e s a n d p r o t e i n s . J . I n f e c t . D i s .1 2 8 : 3 4 9 - 3 5 2 .8 . G e i e r , M . R . , A . F . M . A t t a l l a h , and C . R . M e r r i l . 1 9 7 5 .C h a r a c t e r i z a t i o n o f E . c o l i b a c t e r i a l v i r u s e s i n c o m m e r -c i a l s e r a . I n V i t r o 1 1 : 5 5 - 5 8 .9 . H a s e l k o r n , R . 1 9 7 3 . B a c t e r i a l v i r u s e s i n f e t a l b o v i n e s e r a .P r o c e e d i n g s o f t h e W o r k s h o p o n t h e P r o b l e m s o f B a c -t e r i o p h a g e C o n t a m i n a t i o n . FDA/BB, B e t h e s d a , M d .1 0 . H M o r t , P . F . , and S . L . R a p o p o r t . 1 9 6 5 . The S c h w a r t z -mann r e a c t i o n : p a t h o g e n e t i c m e c h a n i s m s a n d c l i n i c a lm a n i f e s t a t i o n s . A n n u . R e v . M e d . 1 6 : 1 3 5 - 1 6 8 .1 1 . J o r g e n s e n , J . H . , H . F . C a r v a j a l , B . E . C h i p p s , and R .F . S m i t h . 1 9 7 3 . R a p i d d e t e c t i o n o f g r a m - n e g a t i v e b a c -t e r i u r i a b y u s e o f t h e L i m u l u s e n d o t o z i n a s s a y . A p p l .M i c r o b i o l . 2 6 : 3 8 - 4 2 .1 2 . J o r g e n s e n , J . I L , J . C . L e e , and H . R . P a h r e n . 1 9 7 6 .R a p i d d e t e c t i o n o f b a c t e r i a l e n d o t o x i n s i n d r i n k i n gw a t e r a n d r e n o v a t e d w a s t e w a t e r . A p p l . E n v i r o n . M i c r o -b i o l . 3 2 : 3 4 7 - 3 5 1 .1 3 . K r e e f t e n b e r g , J . G . , H . G . L o g g e n , J . D . Van Ram-s h o r s t , and E . C . B e u v e r y . 1 9 7 7 . The L i n u l u s a m e -b o c y t e l y s a t e t e s t m i c r o m e t h o d a n d a p p l i c a t i o n i n t h ec o n t r o l o f s e r a a n d v a c c i n e s . D e v . B i o l . S t a n d . 3 4 : 1 5 - 2 0 .1 4 . K u r o n e n , T . , H . P e l t o l a , T . N o r s , N . H a q u e , and P . H .M a k e l a . 1 9 7 7 . A d v e r s e r e a c t i o n s a n d e n d o t o z i n c o n t e n to f p o l y s a c c h a r i d e v a c c i n e s . D e v . B i o l . S t a n d .3 4 : 1 1 7 - 1 2 5 .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

8/14/2019 En Do Toxins in Vaccines

5/5

ENDOTOXINS I N COMMERCIAL VACCINES 4491 5 . L a n d y , M . , a n d W. B r a u n . 1 9 6 4 . B a c t e r i a l e n d o t o x i n s ,p . 9 8 4 3 4 . I n s t i t u t e o f M i c r o b i o l o g y , R u t g e r s U n i v e r s i t y ,New B r u n s w i c k , N . J .1 6 . L e v i n , J . , and F . B . B a n g . 1 9 6 8 . C l o t t a b l e p r o t e i n i nL i m u l u s : i t s l o c a t i o n a n d k i n e t i c s o f i t s c o a g u l a t i o n b ye n d o t o x i n . T h r o m b . D i a t h . H a e m o r r h . 1 9 : 1 8 6 - 1 9 7 .1 7 . L e v i n , J . , T . P o o r e , N . P . Z a u b e r , and R . S . O s e r .1 9 7 0 . D e t e c t i o n o f e n d o t o x i n i n t h e b l o o d o f p a t i e n t sw i t h s e p s i s d u e t o g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . N . E n g l . J .M e d . 2 8 3 : 1 3 1 3 - 1 3 1 6 .1 8 . M e r r i l , C . R . , T . B . F r i e d m a n , A . F . M . A t t a l l a h , M . R .G e i e r , K . K r e l l , and R . Y a r k i n . 1 9 7 2 . I s o l a t i o n o fb a c t e r i o p h a g e s f r o m c o m m e r c i a l s e r a . I n V i t r o 8 : 9 1 - 9 3 .1 9 . M o o d y , E . E . , M . D . T r o u s d a l e , J . H . J o r g e n s e n , andA . S h e l o k o v . 1 9 7 5 . B a c t e r i o p h a g e s a n d e n d o t o x i n i nl i c e n s e d l i v e v i r u s v a c c i n e s . J . I n f e c t . D i s . 1 3 1 : 5 8 8 - 5 9 1 .2 0 . M u r a t a , H . , M . K o b a y a s h i , M . D o , H . Yamada, andK . C h i l b a . 1 9 7 6 . S e n s i t i v i t y o f t h e L i m u l u s t e s t a n di n h i b i t o r y f a c t o r s i n t h e r a d i o p h a r m a c e u t i c a l s . J . N u c l .M e d . 1 7 : 1 0 8 8 - 1 0 9 2 .2 1 . N a n d a n , R . , and D . R . B r o w n . 1 9 7 7 . An i m p r o v e d i nv i t r o p y r o g e n t e s t , t o d e t e c t p i c o g r a m s o f e n d o t o x i nc o n t a m i n a t i o n i n i n t r a v e n o u s f l u i d s u s i n g L i m u l u sa m o e b o c y t e l y s a t e . J . L a b . C l i n . M e d . 8 9 : 9 1 0 - 9 1 8 .2 2 . O r r , H . C . , K . H . S i b i n o v i c , P . G . P r o b s t , H . D . H o c h -s t e i n , a n d D . C . U t t l e j o h n . 1 9 7 5 . B a c t e r i o l o g i c a l a c -t i v i t y i n u l f i l t e r e d c a l f s e r a c o l l e c t e d f o r t i s s u e c u l t u r eu s e . I n V i t r o 1 1 : 2 3 0 - 2 3 3 .2 3 . P a r k e , D a v i s & C o . 1 9 7 5 . P r o d u c t i n f o r m a t i o n s h e e t f o r" F l u o g e n " b i v a l e n t i n f l u e n z a v i r u s v a c c i n e . P a r k e ,D a v i s & C o . , D e t r o i t .2 4 . P e t r i c c i a n i , J . C . , F . C . C h u , and T . B . J o h n s o n . 1 9 7 3 .B a c t e r i o p h a g e s i n l i v e v i r u s v a c c i n e s . P r o c . S o c . E x p .B i o l . M e d . 1 4 4 : 7 8 9 - 7 9 2 .2 5 . R a n d o l p h , W. A . 1 9 7 4 . F e d . R e g . 3 9 : 4 0 0 1 4 .2 6 . R e g a m e y , R . H . ( e d . ) . 1 9 7 7 . I n t e m a t i o n a l S y m p o s i u m o nP y r o g e n i c i t y , I n n o c u i t y a n d T o x i c i t y T e s t S y s t e m s f o r

B i o l o g i c a l P r o d u c t s . D e v . B i o l . S t a n d . 3 4 : 5 - 1 4 2 ,2 2 0 - 2 2 4 .

2 7 . R e i c h e l d e r f e r , P . S . , J . F . M a n i c h e w i t z , M . A . W e l i s ,H . D . H o c h e s t e i n , and F . A . E n n i s . 1 9 7 5 . R e d u c t i o no f e n d o t o x i n l e v e l s i n i n f l u e n z a v i r u s v a c c i n e s b y b a r i u ms u l f a t e a d s o r p t i o n - e l u t i o n . A p p l . M i c r o b i o l . 3 0 : 3 3 3 - 3 3 4 .2 8 . R e i n h o l d , R . B . , a n d J . F i n e . 1 9 7 1 . A t e c h n i q u e f o rq u a n t i t a t i v e m e a s u r e m e n t o f e n d o t o x i n i n humanp l a s m a . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 3 7 : 3 3 4 - 3 4 0 .2 9 . R o j a s - C o r o n a , R . R . , R . S k a r n e s , S . Tamakuma, a n dJ . F i n e . 1 9 5 9 . The L i m u l u s c o a g u l a t i o n t e s t f o r e n d o -t o x i n : a c o m p a r i s o n w i t h o t h e r a s s a y m e t h o d s . P r o c .S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 3 2 : 5 9 9 - 6 0 1 .3 0 . S i e g l e , S . E . , R . N a c h u m , S . L e i m b r o c k , a n d M . K a -r o n . 1 9 7 6 . D e t e c t i o n o f b a c t e r i a l e n d o t o x i n i n a n t i t u m o ra g e n t s . C a n c e r T r e a t . R e p . 6 0 : 9 - 1 5 .3 1 . Thye Y i n , E . 1 9 7 5 . E n d o t o x i n , t h r o m b i n , a n d t h e L i m u l u sa m e b o c y t e l y s a t e t e s t . J . L a b . C l i n . M e d . 8 6 : 4 3 0 - 4 3 4 .3 2 . T o m a s u l o , P . A . , J . L e v i n , P . A . M u r p h y , and J . A .W i n k e l s t e i n . 1 9 7 7 . B i o l o g i c a l a c t i v i t i e s o f t r i t i a t e de n d o t o x i n s : c o r r e l a t i o n o f t h e L i m u l u s l y s a t e a s s a y w i t hr a b b i t p y r o g e n a n d c o m p l e m e n t - a c t i v a t i o n a s s a y s f o re n d o t o x i n . J . L a b . C l i n . M e d . 8 9 : 3 0 8 - 3 1 5 .3 3 . U r b a c h , E . , H . G o l d b u r g h , a n d P . M . G o t t l i e b . 1 9 4 4 .G e n e r a l S a n a r e l l i - S c h w a r t z m a n n p h e n o m e n o n w i t h f a -t a l o u t c o m e f o l l o w i n g t y p h o i d v a c c i n e t h e r a p y . A n n .I n t e r n . M e d . 2 0 : 9 8 9 - 9 9 4 .3 4 . Van N o o r d w i j k , J . , a n d Y . d e Y o u n g . C o m p a r i s o n o ft h e L i m u l u s t e s t f o r e n d o t o x i n w i t h t h e r a b b i t t e s t f o rp y r o g e n s o f t h e E u r o p e a n P h a r m a c o p o e i a . J . B i o l .S t a n d . 4 : 1 3 1 - 1 3 9 .3 5 . W a c h t e l , R I E . , a n d K . T s u j i . 1 9 7 7 . C o m p a r i s o n o fL i m u l u s a m e b o c y t e l y s a t e s a n d c o r r e l a t i o n w i t h t h eU n i t e d S t a t e s P h a r m a c o p e i a l P y r o g e n T e s t . A p p l . E n -v i r o n . M i c r o b i o l . 3 3 : 1 2 6 5 - 1 2 6 9 .3 6 . W i l d f e u e r , A . , B . H e y m e r , K . H . S c h l e i f e r , a n d 0 .H a f e r k a m p . 1 9 7 4 . I n v e s t i g a t i o n s on t h e s p e c i f i c i t y o ft h e L i n u l u s t e s t f o r t h e d e t e c t i o n o f e n d o t o x i n s . A p p l .M i c r o b i o l . 2 8 : 8 6 7 - 8 7 1 .

3 7 . Z w e i f a c h , B . W . , a n d A . J a n o f f . 1 9 6 5 . B a c t e r i a l e n d o -t o x e m i a . A n n u . R e v . M e d . 1 6 : 2 0 1 - 2 2 0 .

V O L . 3 6 , 1 9 7 8