Ematologia di laboratorio Esame

emocromocitometrico Anemie Malattie dei leucociti

Emostasi e trombosi

Sequenza crescita e maturazione cellule

Sviluppo linfoide (linfoblasto, linfocita B, Sviluppo linfoide (linfoblasto, linfocita B, plasmacellula, linfocita T,plasmacellula, linfocita T, cellule NK)cellule NK)Sviluppo mieloide (eritrociti, piastrine, Sviluppo mieloide (eritrociti, piastrine, leucociti neutrofili, eosinofilileucociti neutrofili, eosinofili e basofili, monociti)e basofili, monociti)

Specifiche AnaliticheSpecifiche Analitiche 25 Parametri: WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT RDW-CV, RDW-SD, MPV, PDW, P-LCR NEUT %, LYMPH %, MONO%, EO%, BASO%

NEUT#, LYMPH #, MONO#, EO#, BASO#HPC#, HPC%

5 Istogrammi: WBC, EO, BASO, RBC, PLT 2 Citogrammi WBC-DIFF, IMI

Principi e Principi e TecnologieTecnologieSette Canali Analitici

WBC (Linfo) DIFF ( Linfo, Mono, Gran.) EOSINOFILI BASOFILI IMI ( Cellule Immature ) RBC / PLT HGB ( Emoglobina )

Principio Resistivo a Volume fisso

Principi e Principi e TecnologieTecnologie

Canale WBC Principi e Principi e TecnologieTecnologie

Segnale RF(Densita' e Volume Nucleare)

Segnale DC(Volume Cellulare)

Rilevazione RF/DCPrincipi e Principi e TecnologieTecnologie

Canale DIFFPrincipi e TecnologiePrincipi e Tecnologie

Rilevazione Resistiva con Focalizzazione Idrodinamica

Conteggio RBC/PLTPrincipi e TecnologiePrincipi e Tecnologie

MCH Emoglobina corpuscolare media

Espresso in pg (26-32)Hb / eritrociti

< 26: IPOCROMIA> 32: IPERCROMIA

MCHC Concentrazione emoglobinica corpuscolare media

Hb (g/dL) / ematocrito

32-36%

Indici EritrocitariIndici Eritrocitari

RDW-SD Rappresenta l'ampiezza aritmetica della curva di distribuzione RBC.

Viene calcolato come differenza volumetrica ad un'altezza pari al 20 %del picco RBC e viene espresso in femtolitri.RDW-CV Rappresenta l'ampiezza di distribuzione espressa in coefficiente di variazione(%). Viene calcolato dividendo la deviazione standard (SD) per il valore di MCV.

Indici EritrocitariIndici Eritrocitari

PDW (Ampiezza Distribuzione PLT )

E' calcolato come differenza volumetrica tra i 2 punti che tagliano la curva di distribuzione al 20% della sua altezza.

MPV (Volume Piastrinico Medio ) E' calcolato dalla seguente formula:MPV(fl)=Pct(%) X 1000 / PLT (x103 /ul)

P-LCR (Percentuale Grandi Piastrine)Rappresenta la percentuale di piastrine aventi volume superiore a 12 fl. rispetto al numero totale di piastrine.

Indici piastriniciIndici piastrinici

Legame tra Globina e gruppo idrofobico SLSModifica di ConfigurazioneOssidazione Fe 2+ Fe 3+Legame con Gruppo Idrofilico SLS e formazione di Fe --> SLS-Hb

Principi e TecnologiePrincipi e Tecnologie

Metodica SulfolyserDeterminazione HGB

Citogramma Citogramma RETICOLOCITIRETICOLOCITI

NRBC = globuli rossi nucleati, ovvero ERITROBLASTI

WBC Maturi WBC Immaturi

• Lipidi• Colesterolo• Fosfo-lipidi• Glico-lipidi• Super Surfactante

• Amino Acidi

Principio di reazione canale IMIPrincipio di reazione canale IMI

PBSC = “peripheral blood staminal cells”

Left shift = spostamento a sinistra della formula leucocitaria (immissione in circolo di leucociti immaturi)

Distribuzione Canale IMIDistribuzione Canale IMI

RefertoReferto

Classificazione delle anemie Ridotta produzione di eritrocitiRidotta produzione di eritrociti

• aplasia midollareaplasia midollare• deficit B12/folatideficit B12/folati• sindromi mielodisplastichesindromi mielodisplastiche• infiltrazione midollareinfiltrazione midollare

Aumentata distruzioneAumentata distruzione• anemie emoliticheanemie emolitiche• cause extracorpuscolari (meccaniche, cause extracorpuscolari (meccaniche,

autoimmuni) autoimmuni) Sintesi emoglobinica anomala o ridottaSintesi emoglobinica anomala o ridotta

• sideropeniasideropenia• disordini cronicidisordini cronici• talassemie e Hb anomaletalassemie e Hb anomale

Parametri per lo studio del metabolismo del ferro

FERRITINAFERRITINA

TRANSFERRINATRANSFERRINA

RECETTORE SOLUBILE DELLA RECETTORE SOLUBILE DELLA TRANSFERRINATRANSFERRINA

Malattie dei leucociti Alterazioni della funzioneAlterazioni della funzioneAlterazioni quantitative non neoplasticheAlterazioni quantitative non neoplastiche

(mononucleosi, reazione leucemoide, (mononucleosi, reazione leucemoide, neutropenia, …)neutropenia, …)

Malattie neoplasticheMalattie neoplastiche• mieloproliferative (acute, croniche, mieloproliferative (acute, croniche,

sindromi mielodisplastiche)sindromi mielodisplastiche)• linfoproliferative (acute, croniche, linfoproliferative (acute, croniche,

linfomi)linfomi)• immunoproliferative (mieloma, immunoproliferative (mieloma,

amiloidosi, gammopatie monoclonali,…)amiloidosi, gammopatie monoclonali,…)

EMOSTASIMECCANISMO DI DIFESA A PROTEZIONE

DELL’INTEGRITA’ DEL SISTEMA VASCOLARE

LO STUDIO DELLA COAGULAZIONE, CHE PUO’ APPARIRE SEMPLICE, IN REALTA’ NASCONDE NON POCHE INSIDIE ANCHE NELL’ESECUZIONE DELLE METODICHE PIU’ COMUNI PER I NUMEROSI FATTORI CHE INFLUENZANO IL DATO FINALE

DA UN PUNTO DI VISTA IDEALE, I RISULTATI ANALITICI DOVREBBERO RIFLETTERE I VALORI DEI PARAMETRI PRESENTI IN VIVO; E’ TUTTAVIA FACILE CAPIRE COME, DAL MOMEMTO IN CUI IL SANGUE FUORIESCE DAI VASI, VADA INCONTRO AD UNA SERIE DI CAMBIAMENTI A CARICO DEI SINGOLI COMPONENTI DELL’EMOSTASI,CHE POSSONO ALTERARE I RISULTATI IN MANIERA CONSIDEREVOLE

ALCUNI DI QUESTI CAMBIAMENTI AVVENGONO IMMEDIATAMENTE, COME L’ATTIVAZIONE DELLE PIASTRINE, LA LIBERAZIONE DEL FATTORE TESSUTALE E L’ATTIVAZIONE DELLA FASE DI CONTATTO; ALTRI SONO PIU’ TARDIVI E RIGUARDANO I FATTORI PIU’ LABILI SOGGETTI A PREMATURO DETERIORAMENTO

GLI ERRORI CHE SI POSSONO VERIFICARE DURANTE LA FASE PREANALITICA SONO PARTICOLARMENTE CRITICI PERCHE’ SFUGGONO AI PROGRAMMI DI VALUTAZIONE ESTERNA ED INTERNA CHE PERMETTONO DI INDIVIDUARE VARIAZIONI NON VOLUTE CHE POSSONO VERIFICARSI DURANTE IL PROCEDIMENTO ANALITICO

VARIABILI PREANALITICHE

LA VARIABILE PREANALITICA PUO’ RIGUARDARE:

LE CONDIZIONI DEL PAZIENTE AL MOMENTO DELPRELIEVO

LA RACCOLTA DEL SANGUE

LA PREPARAZIONE DEL PLASMA

LA CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE

Via intrinsecaChininogeno Precallicreina

Fattore XIIFattoreXIFattoreIX

Fattore VIII

TromboplastinaFattore VII

Fattore XFattore VFattore IIFattore I

Via comune

Fibrina solubileFattore XIIIaFibrina insolubile

APTT PT

Via estrinseca

Schema cascata coagulativa e test di screening

Differenze fra sindromi emorragiche dovute alla fase vasculopiastrinica e alla fase coagulativa

Difetto Vasopiastrinico Difetto Coagulativo

Storia familiare Rara Frequente

Preval. sessuale Femmine Maschi

Tipo di sanguinamento

Cute e mucose,petecchie ed ecchimosi,spontaneo

Ematomi muscolari ed emartri,post-traumatici

Modalita’ di presentazione

Sanguinamento immediato dopo trauma, persistente

Sanguinamento ritardato dopo trauma ,ritardato e ricorrente

Test di laboratorio PT e APTT normaliTE e PLT alterati

PT e/o APTT TE e PLT normali

Test di screening

TEMPO DI EMORRAGIA

CONTEGGIO DELLE PIASTRINE

TEMPO DI PROTROMBINA

TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATO

TEMPO DI EMORRAGIA

Definizione

Il tempo di emorragia (o T. di Sanguinamento o T. di Stillicidio o Bleeding Time) e’ il tempo necessario all’arresto del sanguinamento da un piccolo taglio, di dimensioni standardizzate, provocato sulla superficie cutanea

Intervallo di riferimento per il test secondo Ivy

2 – 9 minuti

TEMPO DI EMORRAGIA

Finalita’ diagnostiche

Il tempo di emorragia valuta l’interazione delle piastrine con la parete vascolare e la successiva formazione del tappo piastrinico.

Un prolungamento del T.E. e’ riscontrabile, oltre che in casi di piastrinopenia o di piastrinopatia, anche in pazienti con carenza di alcuni fattori plasmatici (Fibrinogeno e FvW) e in soggetti con alterazioni della parete vascolare.

TEMPO DI EMORRAGIA

Malattie congenite

Alterazioni della componente vascolare

Alterazioni della adesivita’ piastrinica al subendotelio

Alcune forme di piastrinopatia

Difetti nella formazione di fibrina nel tappo piastrinico

TEMPO DI EMORRAGIA

Malattie acquisite

Difetti di formazione di fibrina nel tappo piastrinico (DIC)

Presenza in circolo di proteine anormali e anticorpi

Anormalita’ di interazione fra endotelio e piastrine (m. renali, m. epatiche, anemie)

Disordini funzionali acquisiti delle piastrine dovuti a farmaci (ASA, Antibiotici)

FIBRINOGENO

FVII

Tissue Factor

Ca2+

FXII

FXI

FIX

VIII

Ca2+

Ca2+

FX

Ca2+ FV

Fibrina Coagulo di FibrinaFII FXIII

Eparina AT

VIA INTRINSECA (aPTT)

VIA ESTRINSECA (PT)

VIA COMUNE

TEMPO DI PROTROMBINA

VII

X Xa

V

II TROMBINA

FIBRINOGENO FIBRINA

TEMPO DI PROTROMBINADefinizione

Tempo di coagulazione del plasma in esame, reso povero in piastrine, dopo aggiunta di quantità ottimali di un estratto tissutale (tromboplastina) e di ioni calcio.

TEMPO DI PROTROMBINA Espressione dei risultati- ieri

1) TEMPO DI PROTROMBINA:ESPRESSIONE IN SECONDI2) ATTIVITA’ PROTROMBINICA : ESPRESSIONE IN

PERCENTUALE RISPETTO AD UN NORMALE sec. paziente3) INDICE DI PROTROMBINA: ------------------- x 100

sec normale

sec. paziente4) RAPPORTO DI PROTROMBINA: …………….. sec normale

TEMPO DI PROTROMBINAEspressione dei risultati-oggi

INR = International Normalized Ratio

modello di espressione standardizzato proposto nel 1983 dall’OMS, definito come il rapporto PT paziente/PT normale elevato all’ ISI (International Sensitivity Index ); l’ISI indica la sensibilità della tromboplastina utilizzata rispetto alla Tromboplastina di Riferimento Internazionale (per definizione ISI = 1) .

L’espressione dei risultati in INR dovrebbe superare il problema della variabilita’ dei sistemi di misura e consentire la comparabilita’ dei risultati ottenuti nei vari laboratori.

TEMPO DI PROTROMBINA Via coagulativa esplorata

Il PT misura l’attività della via estrinseca (F VII) e

della via comune (F II, V, X); fattori sintetizzati dal

fegato e vitamina K dipendenti (F II, VII, X).

Misura inoltre il livello di fibrinogeno (F I).

Popolazione normale: 0.85 – 1.25 INR

Pazienti TAO: 2.00 – 4.5 INR

TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATA ( APTT )Definizione

Tempo in secondi richiesto per la formazione del coagulo di fibrina in un campione di plasma citratato, povero di piastrine, per azione di un attivatore della fase di contatto ed in presenza di fosfolipidi, che simulano quelli piastrinici, e di ioni calcio.

TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATA ( APTT )Procedimento analitico

Il plasma citratato, un attivatore di contatto (farina fossile) e dei fosfolipidi procoagulanti (cefalina) vengono mescolati e incubati a 37° C. L’attivatore di contatto attiva i Fattori XI e XII. I Fosfolipidi forniscono la superficie per l’interazione dei fattori della coagulazione. Dopo l’incubazione viene aggiunta una quantita’ appropriata di ioni calcio, che promuovono l’attivazione della via intrinseca della cascata coagulativa, e misurato il tempo di formazione del coagulo.

TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATA ( APTT )Espressione dei risultati

I valori sono espressi in

SECONDI

RATIO (Rapporto fra il valore in secondi dell’APTT del plasma campione e il valore in secondi dell’APTT del plasma di riferimento )

L’espressione in RATIO dovrebbe migliorare la comparabilità dei risultati tra i vari laboratori e dello stesso laboratorio in giorni differenti.

TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE ATTIVATA ( APTT )Via coagulativa esplorata

Il test APTT esplora la via intrinseca (fattori VIII, IX, XI, XII)e la via comune (fattori I, II, V, X) della coagulazione.

intervalli di riferimentoPopolazione normale: 26 – 42 secondi 0.60 – 1.23 Ratio

Possibili anomalie dell’emostasi esplorata con i test di primo filtro

TE PT APTT

Fase alterata Fase emostasi anormale

N N N N NA N N Vasopiastrinica Piastrinopenie

PiastrinopatieN N A Coagulativa FVIII,FIX,FXI,FXIIIN A N Coagulativa FVIIN A A Coagulativa FX,FV,FII,FIA N N Vasopiastrinica

Coagulativa m vWillebrand

A A A VasopiastrinicaCoagulativa

Difetti Globali emostasi

TEST COMPLEMENTARI

DOSAGGIO FIBRINOGENO

DOSAGGIO ANTITROMBINA

D-DIMERO

TEMPO DI TROMBINA

FIBRINOGENODefinizione

Il fibrinogeno è una glicoproteina sintetizzata dal fegato, costituita da tre coppie di catene polipeptidiche (Aa,Bß, γ) legate da ponti disolfurici S-S, che dopo clivaggio proteolitico da parte dell’enzima procoagulante trombina e l’intervento del F XIIIa è convertita in fibrina insolubile stabilizzata. Ha una emivita di circa 3-5 giorni.

FIBRINOGENOMETODI DI DOSAGGIO

1)METODO IMMUNOLOGICO

2)METODI COAGULATIVI

METODO DI CLAUSS

METODO PT DERIVATO

FIBRINOGENOMetodo di Clauss

Il metodo piu’ usato per il dosaggio del fibrinogeno è il metodo funzionale secondo Clauss. Usando un eccesso di trombina il tempo di formazione del coagulo del plasma diluito è inversamente proporzionale alla concentrazione del fibrinogeno plasmatico.

FIBRINOGENOMetodo PT Derivato

Metodo fotometrico che consente di valutare la concentrazione del fibrinogeno plasmatico dalla variazione di assorbanza durante il dosaggio del tempo di protrombina. Il vantaggio è il contemporaneo dosaggio del Fibrinogeno e del PT. Buona correlazione con il metodo di Clauss per livelli di fibrinogeno normali, scarsa comparabilità dei risultati per PT prolungato (es. in TAO), per valori elevati o bassi di fibrinogeno, in corso di terapia trombolitica.

FIBRINOGENO

Metodo Immunologico

Impiego basilare nella diagnostica delle disfibrinogenemie dove, in presenza di una ridotta fibrinogenemia determinata con metodi funzionali, si osserva una normale concentrazione della proteina valutata come antigene.

FIBRINOGENOEspressione dei risultatieintervallo di riferimento

I risultati vengono espressi in mg/dl

Intervallo di riferimento 200-400

D-DIMERODefinizione

Il d-dimero è il piu’ piccolo frammento del peso di 182 kd resistente alla plasmina, descritto per la prima volta da Gaffney nel 1972.

Puo’ essere considerato un indice globale di attivazione emostatica, in quanto è il prodotto finale di una sequenza di reazioni che portano alla degradazione della fibrina stabilizzata ad opera della plasmina.

Ha una emivita di 4-6 ore.

Attivita fibrinolitica della plasmina

Fibrinogeno

Fibrina I

PLASMINA

Fibrina stabilizzata

Bß1-42

Frammento D

Frammento E

Bß 15-42

Dimero-D

Frammento E

D-DimeroMetodi di determinazione

Dosaggio semiquantitativo mediante utilizzo di particelle di lattice, rivestite di anticorpi monoclonali specifici per i D-Dimeri

Dosaggio immunoenzimatico

Dosaggio immunoturbidimetrico

D-DIMEROProcedimento analitico

Il dosaggio del D-Dimero viene eseguito con un metodo quantitativo immunologico al lattice. Il reattivo è composto da una sospensione di microparticelle del diametro molto piccolo (da 0.1 a 0.2 μ) unite con legame covalente a due anticorpi murini monoclonali anti DD scelti per la loro reattività nei confronti dei diversi prodotti di degradazione della fibrina. La dimensione di queste particelle rende il mezzo di reazione praticamente trasparente e la luce è assorbita in misura molto modesta. In presenza di D-D la reazione antigene-anticorpo provoca un’agglutinazione delle microparticelle che rendono il mezzo opaco. Questo aumento di torbidità è misurato a 540 nm ed è proporzionale alla quantita’ di D-D presenta nel campione.

D-DIMEROSignificato del test

Importante il suo significato prognostico negativo.La sua negatività favorisce l’esclusione di diagnosi di trombosi venosa profonda ed embolia polmonare.

Bassa specificità e basso valore predittivo positivo del D-Dimero nella diagnosi dell’evento tromboembolico.Infatti, aumenta in altre situazioni patologiche quali: Coagulazione intravascolare disseminata, Neoplasie, Patologia epatica, Sindrome Nefrosica, Insufficienza renale, Periodo postoperatorio, Gravidanza, Sforzo fisico eccessivo.

D-DIMEROEspressione dei risultati

I risultati vengono espressi con il metodo in uso, in g/ml di FEU ( Unita’ Fibrinogeno Equivalenti).

FEU = quantità nota di D-Dimero rispetto una quantità nota di fibrinogeno sottoposta all’azione della trombina e della plasmina (standard D-D in FEU).

Intervallo di riferimento fino a 0.80 g/ml FEU.

I risultati possono anche essere espressi in g/ml di D-D.Il valore FEU è il doppio di quello espresso in g/ml di DD.

PT PROLUNGATOAnamnesi

Positiva Negativa

Paziente in TAO

APTT PROLUNGATORicerca eparina

PositivaNegativa

miscela

Nessuna correzione

Ricerca LAC

Inibitori specifici

Correzione

Dosaggio di fattori

DOSAGGIO DEI FATTORI DELLA COAGULAZIONE

Metodo qualitativo: misura l’attivita’ di una molecola

Metodo quantitativo:misura l’intera entita’ molecolare intesa come capacita’di comportarsi da antigene e reagire con anticorpi specifici

DOSAGGIO FUNZIONALE DEI FATTORI

oSi basa sulla modificazione dell’APTT e del PT

oIl plasma in esame viene diluito o miscelato con un plasma contenente in eccesso tutti i fattori della coagulazione tranne il fattore in esame

oL’APTT o il PT, eseguito su questa miscela,fornira’ un tempo di coagulazione dipendente esclusivamente dall’attivita’ del fattore in esame contenuto nel campione

TROMBOFILIA

Gli anticoagulanti naturali modulano i processi emocoagulativi impedendo che essi procedano in modo eccessivo.

La formazione del trombo e’ il risultato di un’insufficiente azione di questi inibitori fisiologici.

La carenza congenita degli anticoagulanti naturali e’ trasmessa generalmente come carattere autosomico dominante ed e’ correlata ad alto rischio di manifestazioni trombotiche anche in giovane eta’. Il rischio e’ ulteriormente aggravato dalla carenza contemporanea di piu’ anticoagulanti naturali.

Gli eventi trombotici possono essere favoriti da eventi esterni quali: traumi, interventi chirurgici ,obesita’,contraccezione orale…

TROMBOFILIA

Il trombo rappresenta la lesione patognomonica della trombofilia.

Si forma all’interno dei vasi per effetto di un abnorme attivazione del sistema emostatico.

Tale condizione puo’ restare a lungo senza conseguenze cliniche, ma puo’ anche determinare l’occlusione vascolare in concomitanza di un’insufficienza relativa o assoluta dei meccanismi naturali di controllo.

Meccanismi di controllo reazioni emocoagulative

XII

XI HMWK P.K.

IXVII

TF

TFVIII

XV

II TROMBINA

PS-PCa TFPI

AtIII

Test di laboratorio nella trombofilia

I test di laboratorio che permettono di diagnosticare predisposizione o stato di tromboembolia sono:

ANTITROMBINA

PROTEINA C

PROTEINA S

APCR (Resistenza alla proteina c attivata)

LUPUS ANTICOAGULANT (LAC)

MUTAZIONE G20210A DELLA PROTROMBINA

ANTICORPI ANTIFOSFOLIPIDI

ANTICORPI ANTICARDIOLIPINA

OMOCISTEINA

DISFIBRINOGENEMIA

DIFETTI DI PLASMINOGENO

DIFETTI DI tPA

DIFETTI DI HC II

AUMENTO DEL PAI -1

Test di laboratorio nella trombofiliaTest di laboratorio che permettono di diagnosticare predisposizione o stato di tromboembolia sono:

ANTITROMBINADefinizione

E’ UNA GLICOPROTEINA PLASMATICA A CATENA SINGOLA DEL P.M. DI 58 Kd.VIENE SINTETIZZATA NEGLI EPATOCITI E NELLE CELLULE ENDOTELIALI ED ESCRETA DAI RENI.LA SUA EMIVITA E’ DI 60 ORE.APPARTIENE ALLA FAMIGLIA DELLE SERPINE (SERIN PROTEINASI INHIBITOR) E INIBISCE LE PROTEASI SERINICHE CHE INTERVENGONO NEL PROCESSO COAGULATIVO.

ANTITROMBINAFunzioni (I)

L’Antitrombina è uno dei principali inibitori fisiologici della coagulazione: la sua azione si estrinseca attraverso l’inattivazione di tutte le proteasi seriniche ad azione procoagulante (IIa,XIIa,XIa,IXa,Xa,Pka) con le quali forma un complesso stabile, equimolare, privo di attivita’ residua.

L’azione inibitoria dell’Antitrombina e’ di per se’ lenta, ma e’ notevolmente accelerata in vitro dall’eparina (cofattore eparinico I). In vivo l’azione dell’AT e’ probabilmente mediata ed accelerata dal suo legame con i glicosaminoglicani eparino-simili che si trovano sulla parete vascolare

ANTITROMBINAFunzioni (II)

ANTITROMBINADiagnosi di laboratorio

Metodi Funzionali

Metodi coagulativiMetodi cromogenici

Metodi Immunologici

Immunodiffusione radialeElettroimmunodiffusione

ELISA

ANTITROMBINAProcedimento analiticoMETODO FUNZIONALE CROMOGENICO:

Plasma diluito + eparina + trombina in eccesso

Complessi Trombina-Antitrombina

+

TROMBINA RESIDUA

Viene misurata utilizzando un substrato cromogenico

ANTITROMBINAEspressione dei risultatieintervallo di riferimento

La densità ottica misurata viene letta sulla curva di calibrazione con ottenimento della % di attività.

I risultati vengono espressi in %

Intervallo di riferimento: 80% -120%

ANTITROMBINADifetti congeniti

Le carenze congenite portano a fenomeni di tromboembolia piu’ frequentemente venosa che non arteriosa.

Le carenze di AT vengono classificate come:

TIPO I: Livelli antigenici e funzionali ridotti

TIPOII: Presenza di livelli plasmatici normali ma riduzione della capacita’ di nautralizzare la trombina o di legare l’eparina

ANTITROMBINADifetti acquisiti

I difetti acquisiti si possono osservare nel corso di svariate condizioni patologiche tra cui:

-Epatopatie (cirrosi,neoplasie)

-CID e Ustioni (per rapido consumo di Antitrombina)

-Sindromi nefrosiche (perdita proteica per compromissione del filtro renale)

-Gastroenterite acuta (Entropatia proteino disperdente)

-Chemioterapia (Maggior attivazione della trombina e conseguente consumo di antitrombina)

-Neoplasie e Leucemie (Immissione di materiale procoagulante e conseguente consumo di antitrombina)

ANTITROMBINACondizioni fisiologiche particolari

Si osserva :

-riduzione fisiologica nei neonati per ridotta sintesi epatica di AT fino al 6° mese;

-riduzione nei maschi adulti dopo i 30 anni,che diventa piu’ marcata dopo i 60 anni;

-riduzione nelle femmine in eta’ fertile con un andamento che segue quello ormonale (massimi durante il mestruo, minimi durante l’ovulazione);

-riduzione durante la gravidanza.

ANTITROMBINACondizioni terapeutiche particolari

Riduzione nella chirurgia maggiore con picco riduttivo in terza giornata post-operatoria e ritorno alla normalita’ intorno alla quinta;

Riduzione nella terapia estroprogestinica (aumenta di 5 volte il rischio tromboembolico);

L’eparina induce un aumentato catabolismo della At (la somministrazione e.v. o s.c. a dosi terapeutiche puo’ causare una riduzione dal 5% al 31% dei livelli di At in circolo);

La TAO aumenta i livelli di At come conseguenza della ridotta sintesi dei fattori del complesso protrombinico.

ANTITROMBINAUtilizzo clinico

L’Antitrombina ha i seguenti utlizzi clinici:

-Dosaggio pre-operatorio

-Dosaggio basale ante terapia eparinica

-Dosaggio in Trombosi venosa profonda giovanile ed embolia polmonare per valutare alterazioni congenite o riduzioni acquisite

-Controllo in terapia estroprogestinica

PROTEINA C COAGULATIVA

La Proteina C coagulativa (PC) e’ un inibitore fisiologico del fattore Va e VIIIa.

Ha una azione inibitrice della trombina attraverso un complesso meccanismo regolatore.

La PC attivata (APC) modula inoltre l’attivazione del plasminogeno e del tPA favorendo la fibrinolisi.

La PC e’ sintetizzata nel fegato ed escreta dai reni.

L’emivita e’ di 7 ore.

Attivazione e azione della PC

APC

T

IXa

PS

V APC

VIIIa

Xa

PS APC

VaV

BLOOD FLOW

THROMBO-MODULIN

PHOSPHOLIPID SURFACE

VIIIa inactive

V a inactive

Ca2+

PC

PC

Ca2+

Ca2+

PROTEINA C Difetti congeniti

I difetti genetici da carenza totale sono incompatibili con la vita

Le carenze congenite parziali possono portare a fenomeni di tromboembolia piu’ frequentamente venosa che arteriosa

La PC e’ vitamina K-dipendente ed ha una emivita breve per cui si manifesta un deficit di PC in anticipo rispetto all’inattivazione degli altri fattori da parte della TAO

Le carenze vengono clessificate come:

TIPO I : livelli antigenici e funzionali ridotti

TIPOII : Presenza di livelli plasmatici normali ma riduzione della funzionalita’

PROTEINA C Difetti acquisiti

Ridotta sintesi Aumentata escrezione

Aumentato consumo

Cirrosi epatica Sindrome nefrosica CID

Epatopatia cronica Plasmaferesi Porpora tromboticatrombocitopenica

Insufficienza epatica fulminante

Intervento chirurgia maggiore

Pazienti con metastasi epatiche

Ictus acuto ischemico

Pazienti con leucemia acuta

PROTEINA CCondizioni fisiologiche

Si osserva riduzione fisiologica nei neonati per ridotta sintesi epatica di PC fino al 6° mese.

La gravidanza dal 1° trimestre induce aumento dei livelli di PC che si mantengono alti fino al momento del parto e del puerperio.

Correlazione positiva fra l’eta’ e la concentrazione plasmatica di PC.

PROTEINA CCondizioni terapeutiche particolari

L’uso della terapia estro-progestinica induce aumento dei livelli di PC (aumento della sintesi epatica dei fattori vitK dipendenti)

Assunzione di anticoagulanti orali causa la riduzione di PC (proteina vitK dipendente)

Il trattamento con L-asparaginasi nelle leucemie acute e nei linfomi causa una riduzione di PC (tossicita’ del farmaco a livello epatico)

La somministrazione orale di uno steroide anabolizzante, lo Stanazololo, provoca un aumento della PC (gli epatociti conterrebbero recettori per gli steroidi capaci di legare gli steroidi anabolizzanti)

PROTEINA C Test di laboratorio

I test di laboratorio di tipo funzionale sono in grado di individuare sia i difetti di Tipo I sia i difetti di Tipo II.

I test si basano sull’attivazione dalla PC presente nel campione in esame mediante veleno di serpente (Protac).

L’azione della proteina C endogena cosi’ attivata, si valuta quindi verificando il prolungamento da essa determinato di un Aptt (metodo coagulometrico) o la capacita’ della stessa di agire su un substrato cromogenico specifico (metodo cromogenico).

PROTEINA S COAGULATIVA

La proteina S (PS) e’ un cofattore della PCa nella inattivazione dei fattori Va e VIIIa, e’ vitamina K dipendente .

Il 35% della PS circola in forma libera. Questa porzione e’ quella che agisce come cofattore della PC. Il restante 65% e’ legata in modo reversibile alla proteina C4b-BP (binding protein) appartenente al sistema del complemento. Questo legame con la PS non modifica l’attivita’ regolatrice della C4b-BP nel sistema del complemento.

La PS e’ sintetizzata dal fegato, dalle piastrine e dalle cellule endoteliali ed e’ escreta dai reni.

•Agisce come cofattore dell’ aPC nell’inattivazione di FVa e FVIIIa, eliminando la protezione di FIXa su FVIII e di FXa su FV.•Da sola inibisce il complesso protrombinasi ed il complesso attivante il FX con interazione diretta con FVa, FXa, FVIII.

PS

C4bBP

PSTF -VIIa

VIIIaXaX

VIIIVa

Protrombina

PSIX IXa

PS

PROTEINA SDifetti congeniti

LE CARENZE DI PS VENGONO CLASSIFICATE COME:

TIPO I : livelli antigenici ridotti della PS totale e libera con conseguente riduzione della funzionalita’.

TIPO II : livelli antigenici normali sia della PS totale e libera, ma riduzione della funzionalita’.

TIPO III: livelli antigenici normali della PS totale ma riduzione del livello della PS libera e riduzione della funzionalita’.

PROTEINA SDifetti Acquisiti

Trattamento con anticoagulanti orali

Gravidanza

Epatopatie

Coagulazione intravascolare disseminata

Diabete

Contraccettivi

Trattamento con l-asparaginasi

Infiammazione

E’ carente nel 3-5% di pazienti con trombosi E’ carente nel 3-5% di pazienti con trombosi ricorrente. ricorrente. Il 50% dei pazienti con deficienza congenita Il 50% dei pazienti con deficienza congenita ha il primo evento trombotico prima dei 25 ha il primo evento trombotico prima dei 25 anni.anni.Trombosi venosa profonda e prossimale, Trombosi venosa profonda e prossimale, embolia polmonare possono intervenire livelli embolia polmonare possono intervenire livelli di Proteina S < 50%.di Proteina S < 50%.

Proteina S Significato Clinico

Evento acuto AT, PC, PS

Terapia eparinica AT

TAO PC, PS

Epatopatie AT, PC, PS

Gravidanza PS, PC

T.estroprogestinica PS, PC

MODIFICAZIONE ACQUISITE DI AT, PC, PS

SINDROME

DA ANTICORPI ANTIFOSFOLIPIDI

La sindrome da anticorpi antifosfolipidi (APS) e’ un disordine acquisito di origine ignota, caratterizzato da trombosi arteriose e/o venose e complicanze della gravidanza che si associano alla presenza nel sangue degli anticorpi antifosfolipidi ( aPL).

Gli aPL allungano i tempi di coagulazione dei tests fosfolipide-dipendenti della coagulazione (LAC), oppure sono evidenziati mediante tecniche ELISA che utilizzano la cardiolipina o altri fosfolipidi a carica netta negativa come antigeni in fase solida.

ANTICOAGULANTE TIPO LUPUS

Diagnosi di laboratorio

1)Allungamento di uno o piu’test fosfolipide-dipendenti

(TEST DI SCREENING)

2)Dimostrazione che l’allungamento sia effettivamente dovuto alla presenza di un anticoagulante circolante

(TEST DI MISCELA)

3)Dimostrazione che l’anticoagulante sia diretto contro i fosfolipidi

(TEST DI CONFERMA)

ANTICOAGULANTE TIPO LUPUS

Diagnosi di laboratorio

TEST DI SCREENING:

� APTT (Tempo di tromboplastina parziale attivato)

� KCT (Tempo di coagulazione al caolino)

� dRVVT (Test al veleno di Vipera Russell diluito)

ANTICOAGULANTE TIPO LUPUS

Diagnosi di laboratorio

TEST DELLA MISCELA:

Si esegue con uno dei test di screening e consiste nella ripetizione del test su una miscela plasma paziente /plasma normale.

La persistenza del prolungamento del tempo di coagulazione eseguito sulla miscela (mancata correzione) suggerisce la presenza di un anticoagulante circolante.

ANTICOAGULANTE TIPO LUPUS

Diagnosi di laboratorio

TEST DI CONFERMA:

Sono basati sull’incremento o la diminuizione della concentrazione dei fosfolipidi o sull’uso di fosfolipidi a conformazione particolare.

Il tempo di coagulazione di un test dipendente dai fosfolipidi,prolungato per la presenza di LA, si accorcia sensibilmente fino a correggere quasi completamente il difetto, se ripetuto aumentando la concentrazione dei fosfolipidi. Alternativamente il test si prolunghera’ se viene diminuita la concentrazione dei fosfolipidi.

APC RESISTANCE

Responsabile di circa il 20% dei casi di trombosi

venose consecutive e di circa il 50% dei casi

selezionati come trombosi eredofamiliari.

MAGGIOR FATTORE DI RISCHIO

GENETICO PER TROMBOSI VENOSA

FINORA SCOPERTO

APC RESISTANCE

E’ una malattia ereditaria congenita scoperta da DAHLBACK nel 1993

I pazienti insensibili all’APC mostrano una diminuzione delloallungamento dell’APTT in presenza di Proteina C attivata

Un anno piu’ tardi Bertina (Leiden Olanda) scopriva una anormalita’ nel Fattore V

C1BA1 A2 A3 C2NH2 COOH

IIa/Xa IIa/Xa Iia/Xa

FactorVa

Fragments

94 kDa 74 kDaCa 2+

ATTIVAZIONE DEL FATTORE V

ZollerB.,Familial Thrombophilia,1996

Heavy chain Light chain

ThrombinHeavy chain

506

Ca2+

APC306 506 679

Light chain

APCFV:R506

FV

FVa

FVi

C1BA1NH2COOH

Ca2+

Ca2+

INATTIVAZIONE FATTORE V

A2 A3

A1 A2

C2

C1A3 C2

Zoller B., Familial Thrombohilia,1996

ThrombinHeavy chain

506 306

Ca2+

APC APC306 506 679

Light chain

APCFV:R506 FV:Q506

Ca2+

306 679

FV

FVa

FVi

C1BA1NH2COOH

Ca2+Ca2+

Ca2+

INATTIVAZIONE FATTORE V

A2 A3

A1 A2

C2

C1A3 C2

Zoller B., Familial Thrombohilia,1996

FATTORE V:Q506 ( LEIDEN)

Mutazione puntiforme nel nucleotide 1691,esone 10 del gene codificante il FV

CGA Arginina

CAA Glutammina

Su un sito che corrisponde ad un sito di clivaggio della APC

APC e’ meno efficiente ad inattivare il FVa

Bertina R M. e altri ,Nature ,1994

MALATTIE TROMBOTICHE EREDITARIE

CARENZA INCIDENZA

AT

PC

PS

MUTAZIONE F II

APCR

1 – 5%

6 – 9%

3 – 13%

5%

> 20%

Lane DA.e altri, Thrombosis Haemostasis, 1996

APC RESISTANCE

PREVALENZADEL FATTORE V LEIDEN NELLA POPOLAZIONE GLOBALE EUROPEA

Austria 2% Italy 0-2%

Finlandia 3% Netherlands 3-5%

France 1-10% Poland 1%

Germany 4-8% Sweden 5-10%

Greece 15% Spain 3%

Iceland 5% UK 3-8%

Rees DC e altri ,Lancet ,1995; Rees DC e altri, Br.J. Haematol.,1996

APC RESISTANCE

PREVALENZA IN PAZIENTI TROMBOTICI

ED IN INDIVIDUI SANI

Koster et al. 1993

Griffin et al. 1993

Svensson et al . 1994

Cadroy et al. 1994

Tosetto et al. 1994

Simioni et al. 1997

Pazienti con trombosi% Individui sani %

21 5

52-64

40 7

19

10 1.5

16.3 1

APC RESISTANCE

DIAGNOSI DI LABORATORIO

PRINCIPIO DEL TEST:

2 APTT su plasma indiluito del paziente

--in presenza di una quantita’ standardizzata di APC

--in assenza di APC

IL RISULTATO SI ESPRIME IN APC ratio:

t (sec) APTT + APC

t (sec) APTT - APC

Dalback e altri, Proc Nat Acad Sci,1993

APC RESISTANCE

INTERFERENZE

ALLUNGAMENTO DELL’APTT per:

• Difetto di fattori

• Presenza di LAC

• Terapia eparinica

• TAO

AUMENTO DEL FATTORE VIII per:

• Gravidanza

• Fase acuta

• Assunzione di estroprogestinici de Ronde e Bertina,1994;Hampton e altri,1994;Bokarewa e altri,1994; Ehrenforth e altri,1995; Martorell e altri,1995