8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 1/21

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 2/21

Betode dalam penelitian dengan #erdasarkan @ Ikatan spesifik antara antigen )Ag* C

antibody)Ab* terdiri dari @

$. 1eknik ualitatif @ 1iap berikatan pada Ag spesifik 

. 1eknik uantitatif @ <umlah Ikatan Ag-Ab ditentukan dengan nilai absorbansi.

Ma'am $i$tem metode an diuna#an da"am e"i$a )- Dire+t

- Indire+t

- Sand"i+h

- apture

 

ME*+E PEMERIKSAAN ELISA

ELISA diperkenalkan pada tahun $%=$ oleh 6eter 6erlmann dan Eva Engvall untuk 

menganalisis adanya interaksi antigen  dengan antibodi  di dalam suatu sampel dengan

menggunakan en(im sebagai pelapor. telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang

medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana,

sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi

spesifik di+u+ikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya.

Antibodi ini terikat dengan suatu en(im, dan pada tahap terakhir, ditambahkan

substansi yang dapat diubah oleh en(im menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA

fluoresensi, saat +ahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel,

kompleks antigen?antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat

disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.6enggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk 

antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu

 permukaan solid )biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene*, baik yang non-spesifik 

)melalui penyerapan pada permukaan* atau spesifik )melalui penangkapan oleh antibodi lain

yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut Fsandwich’   ELISA*. Setelah antigen

diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen.

Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan en(im, atau dapat dideteksi se+ara

langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan en(im melalui biokonjugasi. Di

antara tiap tahap,  plate  harus di+u+i dengan larutan deterjen lembut untuk membuang

kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pen+u+ian terakhir, dalam

 plate ditambahkan substrat en(imatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yangmenunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. 1eknik ELISA yang lama menggunakan

substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik 

yang jauh lebih sensitive.

Prin$i- metode ELISAmereaksikan antibodi dan antigen se+ara spesifik, perbedaannya ada pada substrat

) (at yang digunakan untuk mendeteksi suatu hasil reaksi * yang digunakan. 6ada ELISA,

hasil reaksi akan memun+ulkan "arna yang bisa diukur dengan alat yang disebut olorimetri.

6ada Gluores+en+e, hasil reaksi berupa pendaran +ahaya yang terba+a oleh fluoresensi,

sedangkan pada hemilumines+en+e hasil reaksi berupa pendaran kimia"i yang terba+a olehhemilumines+ent.

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 3/21

 

Jeni$ Pemeri#$aan ELISA

Langkah-langkah Htidak langsungH ELISA mengikuti mekanisme di ba"ah ini@ -

• Sebuah solusi buffer dari antigen yang akan diuji untuk ditambahkan ke setiap sumur 

dari lempeng mikro  , di mana ia diberi "aktu untuk mematuhi plastik melalui

interaksi biaya.

• Sebuah solusi non-protein bereaksi, seperti  bovine serum albumin  atau kasein  ,

ditambahkan untuk memblokir  setiap permukaan plastik di sumur yang masih dilapisi

oleh antigen.

• Selanjutnya antibodi primer   ditambahkan, yang mengikat se+ara khusus terhadap

antigen lapisan tes yang baik. Antibodi primer ini juga bisa dalam serum donor akandiuji untuk reaktivitas terhadap antigen.

• Setelah itu, sebuah antibodi sekunder  yang ditambahkan, yang akan mengikat antibodi

 primer.. Antibodi sekunder ini sering memiliki en(im yang melekat padanya, yang

memiliki efek yang dapat diabaikan pada sifat pengikatan antibodi.

• Sebuah substrat untuk en(im ini kemudian ditambahkan. Seringkali, perubahan "arna

substrat ini pada reaksi dengan en(im. 6erubahan "arna menunjukkan bah"a

antibodi sekunder telah terikat antibodi primer, yang sangat menyiratkan bah"a donor 

memiliki reaksi kekebalan terhadap antigen uji. al ini dapat membantu dalam pengaturan klinis, dan dalam D.

• Semakin tinggi konsentrasi antibodi primer yang hadir dalam serum, semakin kuat

 perubahan "arna. Seringkali spektrometer digunakan untuk memberikan nilai

kuantitatif untuk kekuatan "arna.

En(im bertindak sebagai penguat, bahkan jika hanya sedikit en(yme-linked tetap terikat

antibodi, molekul en(im akan menghasilkan banyak molekul sinyal. Dalam keterbatasan akal

sehat, en(im dapat terus menghasilkan "arna tanpa batas "aktu, tetapi yang lebih utama

antibodi hadir dalam serum antibodi donor lebih sekunder J en(im akan mengikat, dan "arna

lebih +epat akan berkembang.. 0elemahan utama dari ELISA tidak langsung adalah bah"ametode imobilisasi antigen non-spesifik, ketika serum digunakan sebagai sumber antigen tes,

semua protein dalam sampel bisa tetap berpegang pada pelat mikro dengan baik, konsentrasi

 begitu ke+il analit dalam serum harus bersaing dengan protein serum lainnya ketika mengikat

ke permukaan baik. Sand"i+h atau langsung ELISA memberikan solusi untuk masalah ini,

dengan menggunakan HmenangkapH antibodi spesifik untuk antigen tes untuk menariknya

keluar dari +ampuran molekul serum itu.

ELISA dapat dijalankan dalam format kualitatif atau kuantitatif. asil kualitatif 

memberikan hasil positif atau negatif sederhana )ya atau tidak* untuk sampel. utoff antara

 positif dan negatif ditentukan oleh analis dan mungkin statistik. Dua atau tiga kali standar 

deviasi )kesalahan yang melekat dalam tes* sering digunakan untuk membedakan positif dari

sampel negatif. Dalam kuantitatif ELISA, densitas optik )KD* dari sampel dibandingkandengan kurva standar, yang biasanya pengen+eran serial solusi dikenal-konsentrasi dari

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 4/21

molekul target. Sebagai +ontoh, jika sebuah sampel uji mengembalikan KD $,', titik pada

kurva standar yang memberi KD $,' harus dari konsentrasi analit yang sama sebagai

sampel Anda.

7ambar untuk hak tersebut termasuk penggunaan antibodi sekunder terkonjugasi untuk 

en(im, meskipun, dalam arti teknis, hal ini tidak diperlukan jika antibodi primer adalah

konjugasi en(im. 5amun, penggunaan konjugasi antibodi sekunder-menghindari proses yangmahal untuk men+iptakan en(im-linked antibodi untuk setiap antigen yang satu mungkin

ingin mendeteksi. Dengan menggunakan antibodi en(yme-linked yang mengikat "ilayah G+

dari antibodi lain, antibodi ini en(yme-linked yang sama dapat digunakan dalam berbagai

situasi. 1anpa lapisan pertama antibodi HmenangkapH, setiap protein dalam sampel )termasuk 

 protein serum* dapat menyerap kompetitif ke permukaan piring, menurunkan jumlah antigen

amobil. 6enggunaan antibodi spesifik dimurnikan untuk melampirkan antigen ke plastik 

menghilangkan kebutuhan untuk memurnikan antigen dari +ampuran yang rumit sebelum

 pengukuran, menyederhanakan uji, dan meningkatkan spesifisitas dan sensitivitas pengujian

tersebut.

A.*AR P/S*AKA

• 

•  http@??moko2$."ordpress.+om?'$$?'&?M?tinjauan-tentang-elisa?

•  @ http@??id.shvoong.+om?eNa+t-s+ien+es?bioengineering-and-biote+hnology?$$2M-metode-

elisa-en(ym-linked-immunosorbent?OiN(($dla%NpP

http://retha-ithu.blogspot.co.id/2012/06/pemeriksaan-elisa.html

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 5/21

• Skip to navigation

• Skip to main content

• Skip to primary sidebar

• Skip to secondary sidebar

• Skip to footer

Moko Aptenebar !lmu "engetahuan

• #ome

• $%&

• S!'( %"

• )*+(,S )

• (-)) 

•  )3,+%

•

!+ 

• %%%# S*%

4 "enghambatan %ngiogenesis 

ife ong earner 5 

Tinjauan tentang ELISA<un M

6osted by admin

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 6/21

 

1 7otes

 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay )ELISA* adalah suatu teknik biokimia yang terutama

digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam

suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologitumbuhan, dan juga berbagai bidang industri.

6enggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen

tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu

 permukaan solid )biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene*, baik yang non-spesifik

)melalui penyerapan pada permukaan* atau spesifik )melalui penangkapan oleh antibodi lain

yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut F sandwich’  ELISA*.

Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks

dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan en(im, atau dapat dideteksi

se+ara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan en(im melalui biokonjugasi.

Di antara tiap tahap, plate harus di+u+i dengan larutan deterjen lembut untuk membuang

kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pen+u+ian terakhir, dalam

 plate ditambahkan substrat en(imatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang

menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. 1eknik ELISA yang lama menggunakan

substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik 

yang jauh lebih sensitif.

A-"i#a$i ELISA

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya

merupakan metode yang sangat berguna untuk menentukan konsentrasi antibodi dalam

serum )seperti dalam tes I/*, dan juga untuk mendeteksi adanya antigen. Betode ini juga

 bisa diaplikasikan dalam indiustri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam

makanan seperti susu, ka+ang, "alnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan

dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan +epat pada berbagai kelas obat.

e%era-a *i-e ELISA

A. Indirect ELISA

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 7/21

1ahap umum yang digunakan dalam indirect  ELISA untuk menentukan #on$entra$i anti%odi

dalam serum adalah@

$. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada

 permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik

dengan +ara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan

kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel

yang akan diuji.

. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting , seperti bovine serum albumin )#SA* atau

kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. 1ahap ini dikenal sebagai

blocking , karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

2. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari

antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakanuntuk antigen standar. 0arena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-

spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

. Plate di+u+i, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan

dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan

lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.

4. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan

dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi en(im dengan substrat

spesifik. 1ahap ini bisa dile"ati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan en(im.

&. Plate di+u+i untuk membuang kelebihan konjugat en(im-antibodi yang tidak terikat.

=. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh en(im untuk mendapatkan sinyal kromogenik?

fluorogenik? elektrokimia.

M. asil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik?

elektrokimia lainnya.

En(im bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat en(im yang

tetap terikat, molekul en(im akan memproduksi berbagai molekul sinyal. 0erugian utama

dari metode indirect  ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga

setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga

konsentrasi analit yang ke+il dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat

 pengikatan pada permukaan lubang. Bekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di

 ba"ah ini.

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 8/21

. Sandwich ELISA )untuk ujian besok pelajari yang ini saja*

1ahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut@

1. 8isiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi 9penangkap

2. Semua non spesik binding sites pada permukaan diblokir

;. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

.   Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

<. %ntibodi primer ditambahkan= supaya berikatan secara spesik dengan

antigen

6. %ntibodi sekunder yang berikatan dengan en>im dimasukkan= yang akanberikatan dengan antibodi primer

?.   Plate dicuci= sehingga kon@ugat antibodi-en>im yang tidak terikat dapatdibuang

A. 8itambahkan reagen yang dapat diubah oleh en>im men@adi sinyalberBarna/ berCuoresensi/ elektrokimia

D. 8iukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dariantigen

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 9/21

0euntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel

yang tidak murni, dan mampu mengikat se+ara selektif antigen yang dikehendaki. 1anpa

lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel )termasuk protein

serum* dapat diserap se+ara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas

antigen yang terimobilisasi. 6rinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikutini@

2. ELISA kompetitif 

1ahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas

sebelumnya, yaitu@

1. %ntibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya

2. omplek antigen-antibodi ini selan@utnya ditambahkan pada lubang yangtelah dilapisi antigen

;.   Plate dicuci= sehingga kelebihan antibodi tercuci Esemakin banyak antigendalam sampel= semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigenyang menempel pada permukaan lubang= karena inilah disebut kompetisi

. 8itambahkan antibodi sekunder yang spesik utnuk antibodi primer.%ntibodi sekunder ini berpasangan dengan en>im

<. Substrat ditambahkan= en>im akan mengubah substrat men@adi sinyalkromogenik/ Cuoresensi.

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 10/21

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal

yang dihasilkan. 6rinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini@

Se+ara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut@

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 11/21

Sekian dulu artikel tentang ELISA, sampai jumpa.

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 12/21

Sa%tu, 0 A-ri" 2012

*ES* ELISA 

Sejarah ELISA

Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melakukan suatu

immunoassay adalah radioimmunoassay, teknik menggunakan antigen berlabel radioaktif 

atau antibodi. Dalam radioimmunoassay, radioaktivitas memberikan sinyal, yang

menunjukkan apakah suatu antigen tertentu atau antibodi hadir dalam sampel.

adioimmunoassay pertama kali dijelaskan dalam kertas oleh osalyn Sussman !alo" dan

Salomo #erson diterbitkan pada tahun $%&'. Sebuah mikrobiologi menggunakan en(im suatu

Linked tes Assay )ELISA* immunosorbent, dalam rangka untuk mengembangkan metode

untuk deteksi +epat antigen p I/ dalam sampel darah.

0arena radioaktivitas menimbulkan an+aman kesehatan potensial, alternatif yang

lebih aman itu di+ari. Sebuah alternatif yang +o+ok untuk radioimmunoassay akan mengganti

sinyal non-radioaktif di tempat sinyal radioaktif. 0etika en(im )seperti peroksidase* bereaksi

dengan substrat yang sesuai )seperti A#1S atau 2,2 3, 4,43-tetramethylben(idine*, perubahan

"arna terjadi, yang digunakan sebagai sinyal. 5amun, sinyal tersebut harus dikaitkan dengan

keberadaan antibodi atau antigen, yang mengapa en(im harus dihubungkan dengan antibodi

yang sesuai. 6roses menghubungkan se+ara independen dikembangkan oleh Stratis Avrameas

dan 7# 6ier+e. 0arena itu perlu untuk menghilangkan antibodi atau antigen terikat dengan

men+u+i, antibodi atau antigen harus tetap ke permukaan "adah:. !aitu, immunosorbent telah

harus dipersiapkan. Sebuah teknik untuk men+apai hal ini diterbitkan oleh ;ide dan <erker 

6orath pada tahun $%&&.

6ada tahun $%=$, 6etrus 6erlmann dan Eva Engvall di >niversitas Sto+kholm diS"edia, dan Anton S+huurs dan #auke van ;eemen di #elanda mandiri makalah yang

disintesis pengetahuan ini ke dalam metode untuk melakukan EIA ? ELISA.

 

Penertian ELISA

 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay  )ELISA* adalah suatu teknik biokimia yang

terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau

antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidangmedis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana,

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 13/21

sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi

spesifik di+u+ikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya.

Antibodi ini terikat dengan suatu en(im, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang

dapat diubah oleh en(im menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat

+ahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks

antigen?antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan

 berdasarkan besarnya fluoresensi.

6enggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu.

Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid

)biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene*, baik yang non-spesifik )melalui penyerapan

 pada permukaan* atau spesifik )melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk 

antigen yang sama, disebut F sandwich’   ELISA*. Setelah antigen diimobilisasi, antibodi

 pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat

 berikatan juga dengan en(im, atau dapat dideteksi se+ara langsung oleh antibodi sekunder 

yang berikatan dengan en(im melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap,  plate harus di+u+i

dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak 

terikat. Setelah tahap pen+u+ian terakhir, dalam  plate ditambahkan substrat en(imatik untuk 

memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel.

1eknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode

terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.

A-"i#a$i ELISA

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel,

karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi

antibodi dalam serum )seperti dalam tes I/*, dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen.

Betode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi allergen

 potensial dalam makanan seperti susu, ka+ang, "alnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat

digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan +epat pada berbagai kelas obat.

ELISA adalah tes skrining dahulu banyak digunakan untuk I/ karena kepekaan

tinggi. Dalam ELISA, serum seseorang dien+erkan '' kali lipat dan diterapkan pada pelat

yang antigen I/ yang terpasang. <ika antibodi terhadap I/ hadir dalam serum, mereka

dapat mengikat antigen I/. 6elat ini kemudian di+u+i untuk menghapus semua komponen

lain dari serum. Sebuah Hantibodi sekunderH khusus disiapkan - antibodi yang mengikat

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 14/21

antibodi lain - kemudian diterapkan ke piring, men+u+i diikuti oleh yang lain. Ini antibodi

sekunder se+ara kimia"i terkait di muka untuk en(im.

HAnti Ig7 manusiaH Antibodi 7anda Sand"i+h ELISA

Dengan demikian, piring akan berisi en(im sebanding dengan jumlah antibodi

sekunder terikat ke piring. Sebuah substrat untuk en(im diterapkan, dan katalisis oleh en(im

mengarah ke perubahan pada "arna atau fluoresensi. asil ELISA dilaporkan sebagai nomor:

aspek paling kontroversial dari tes ini adalah menentukan H+ut-offH titik antara positif dan

hasil negatif. Sebuah titik +ut-off dapat ditentukan dengan membandingkannya dengan

standar yang dikenal. <ika tes ELISA digunakan untuk skrining obat di tempat kerja,

konsentrasi +ut-off, 4' ng ? mL, misalnya, didirikan, dan sampel yang berisi konsentrasi

analit standar akan disiapkan. Diketahui bah"a menghasilkan sinyal yang lebih kuat daripada

sampel dikenal adalah Hpositif.H Bereka yang menghasilkan sinyal lemah, yang Hnegatif.H

Dokter Dennis E #id"ell dan Alister /oller men+iptakan tes.

0egunaan lain dari ELISA meliputi@

$. deteksi antibodi mikobakteri dalam 1#.

. deteksi rotavirus dalam tinja.

2. deteksi penanda hepatitis # dalam serum.

. deteksi enterotoksin E. +oli dalam tinja.

  *i-e!ti-e ELISAAda beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikut@

$.  Indire+t ELISA

.  Sand"i+h ELISA

2.  ompetitive ELISA

 

1  Indire't ELISA

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 15/21

)7ambar Bekanisme Indirect ELISA*

1ahap umum yang digunakan dalam indirect   ELISA untuk mendeterminasi

konsentrasi antibodi dalam serum adalah@

a*  Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan

lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan +ara

adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar

yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.

 b*  Suatu larutan pekat dari protein non-interacting , seperti bovine serum albumin )#SA* atau

kasein, ditambahkan dalam semua lubang  plate  mikrotiter. 1ahap ini dikenal sebagai

blocking , karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 16/21

+*  Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari

antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan

untuk antigen standar. 0arena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-

spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

d*   Plate di+u+i, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan

dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan

lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.

e*  Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam

lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi en(im dengan substrat spesifik.

1ahap ini bisa dile"ati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan en(im.

f*   Plate di+u+i untuk membuang kelebihan konjugat en(im-antibodi yang tidak terikat.

g*  Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh en(im untuk mendapatkan sinyal kromogenik?

fluorogenik? elektrokimia.

h*  asil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik?

elektrokimia lainnya.

En(im bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat en(im

yang tetap terikat, molekul en(im akan memproduksi berbagai molekul sinyal. 0erugian

utama dari metode indirect   ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik,

sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang  plate mikrotiter, sehingga

konsentrasi analit yang ke+il dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat

 pengikatan pada permukaan lubang.

  2  Sand3i'h ELISA

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 17/21

1ahapan dalam Sand"i+h ELISA adalah sebagai berikut@

a*  Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi FpenangkapQ

 b*  Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir 

+*  Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

d*  6late di+u+i untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

e*  Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan se+ara spesifik dengan antigen

f*  Antibodi sekunder yang berikatan dengan en(im dimasukkan, yang akan berikatan dengan

antibodi primer 

g*  6late di+u+i, sehingga konjugat antibodi-en(im yang tidak terikat dapat dibuang

h* 

Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh en(im menjadi sinyal ber"arna? berfluoresensi?elektrokimia

i*  Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

0euntungan utama dari metode sand"i+h ELISA adalah kemampuannya menguji

sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat se+ara selektif antigen yang dikehendaki.

1anpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel )termasuk 

 protein serum* dapat diserap se+ara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan

kuantitas antigen yang terimobilisasi.

6rinsip kerja sand"i+h ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini@

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 18/21

  4  5om-etiti6e ELISA

1ahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas

sebelumnya, yaitu@

a*  Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya

 b*  0omplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi

antigen

+*  6late di+u+i, sehingga kelebihan antibodi ter+u+i )semakin banyak antigen dalam sampel,

semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan

lubang, karena inilah disebut kompetisi

d*  Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini

 berpasangan dengan en(im

e*  Substrat ditambahkan, en(im akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik?

fluoresensi.

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 19/21

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah

sinyal yang dihasilkan. 6rinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini@

Se+ara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut@

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 20/21

 

7  e%era-a dan Porta%"e ELISA (M P ELISA& (ELISA Re6er$e di

ma#a"ah an diter%it#an&

Sebuah teknik baru )E6 $ %% M% #$ di E6K #uletin 4.'.'% 5. ''%?'%: >S61K

=4$'&M= di >S61K #uletin ''%?'2?2$: RL '2.M$'.'%,' di SI6K #uletin ''%?'M?'*

menggunakan fase padat terdiri dari polistiren immunosorbent batang dengan M-$ ogives

menonjol. Seluruh perangkat direndam dalam tabung reaksi berisi sampel dikumpulkan dan

langkah-langkah berikut )+u+i, inkubasi dalam +onjugate dan inkubasi dalam +hromogenous*

8/15/2019 Elisa Rabu

http://slidepdf.com/reader/full/elisa-rabu 21/21

dilakukan oleh men+elupkan ogives di mi+ro"ells standar mi+roplates pra-diisi dengan

reagen.

0euntungan dari teknik ini adalah sebagai berikut@

  6ara ogives masing-masing dapat peka terhadap reagen yang berbeda, memungkinkan

deteksi simultan dari antibodi yang berbeda dan ? atau antigen yang berbeda untuk multi-

target tes:

 /olume sampel dapat ditingkatkan untuk meningkatkan sensitivitas tes di klinik )darah, air 

liur, urin*, makanan )susu +urah, telur dikumpulkan* dan )air* lingkungan sampel:

  Satu ogive yang tersisa unsensiti(ed untuk mengukur reaksi non-spesifik sampel:

  6enggunaan perlengkapan laboratorium untuk mengeluarkan alikuot sampel, men+u+i

solusi dan reagen dalam mi+ro"ells tidak diperlukan, memfasilitasi pengembangan siap

menggunakan laboratorium-kit dan di tempat kit.

  9  Materia" a"am Metode ELISA

  Antigen

  Bono+lonal Ab

  Bi+roplate

  #lo+king #uffer 

  Serum sample

  onjugate )se+ondary Ab J En(yme*

  Subtrate

  Stop Sol.

Diposkan oleh Arini 0risna Kktavia di '=.4M Label@ Imunoserologi