Upload
buikhuong
View
228
Download
2
Embed Size (px)
Citation preview
ELEKTRONSKI MIKROSKOP U ELEKTRONSKI MIKROSKOP U BIOLOGIJI ĆELIJABIOLOGIJI ĆELIJABIOLOGIJI ĆELIJABIOLOGIJI ĆELIJA
Matthias Jakob Schleiden Theodor Schwann Rudolf Virchow
ćelijska teorija1838-39.
Početak biologije ćelija
Matthias Jakob Schleiden (1804-1881)
botaničar
Theodor Schwann (1810-1882)
fiziolog, citolog i histolog
Rudolf Virchow (1821-1902)
lekar
1. Svi organizmi se sastoje od jedne ili više ćelija.
2. Ćelije su osnovne strukturne jedinice svih organizama.
3. Ćelija može nastati samo od prethodno postojeće (omnis cellula e cellula) (1858)
- Sva živa bića izgrađena su od ćelija- Ćelija je strukturna i funkcionalna jedinica svih živih bića- Ćelija može nastati samo od prethodno postojeće, deobom. Spontana generacija nije moguća- Ćelije sadrže nasledne informacije koje se prenose sa ćelije na ćeliju tokomdeobe- Sve ćelije u osnovi imaju isti hemijski sastav- Svi metabolički i biohemijski procesi značajni za održavanje života odvijaju se u ćelijama
Razvoj elektronske mikroskopijeu svetu
1929. Ruska publikuje prvi naučni rad koji se bavi uticajem magnetnog polja na kretanje elektrona
1931. Ruska i Knoll konstruišu prvi elektronski mikroskop kojije uveličavao samo 17 x.
1933. Prvi put se pomoću elektronskog mikroskopa dobija boljadefinicija objekata nego pomoću svetlosnog mikroskopa, uz uveličanje od 12 000 x (E. Ruska, doktorska teza)
Ernst Ruska(1906-1988)
Max Knoll(1897–1969)
Helmut Ruska(1908-1973)
Ernst RuskaThe development of the electron microscope and of electron microscopyNobel lecture, December 1986.Nobel lecture, December 1986.
1939. Isporučen prvi serijski proizvedeni mikroskop Siemens Super Microscope, uveličavao do 30 000 x.
Porter, Claude and Fullam: A study of tissue culture cells by electron microscopy. Journal of Experimental Medicine, March 1945.
Fibroblast embriona pileta gajen u kulturi, fiksiran u OsO4, ispran i osušen; uveličanje 1600 x.
1948. Pease i Baker razvijaju metod pravljenja preseka biološkog materijala debljine 0.1-0.2 µm
1952. Palade, Porter i Sjöstrand usavršavaju postupak fiksiranja i sečenja biološkog materijala
1956. Glauert i saradnici uvode Araldite kao medijum za kalupljenje
1963. Sabatini, Bensch i Barrnett uvode glutar-aldehid, praćen 1963. Sabatini, Bensch i Barrnett uvode glutar-aldehid, praćen OsO4, kao metod fiksacije
kasnije se uvode i usavršavaju tehnike za trodimenzionalnu rekonstrukciju objekata viđenih elektronskim mikroskopom ifiksiranje materijala zamrzavanjem
30
Srčana muskulatura - miš Interkalarni disk
Kontraktilni filamenti
Dobitnici Nobelove nagrade za fiziologiju ili medicinu 1974. godine
George Emil Palade(1912-2008)
Albert Claude(1899-1983)
Christian de Duve(1917-2013)
Razvoj elektronske mikroskopijekod nas
1954. Prvi jugoslovenski model elektronskog mikroskopa –diplomski rad Nedeljka Košute iz Zagreba
“Iskra” iz Kranja je kratko vreme bila važan domaći proizvođač elektronskih mikroskopa
1956-58. U Beogradu počinje sa radom Univerzitetska laboratorija za elektronsku mikroskopiju, u prostorijama Medicinskog fakulteta
Prvi EM proizveden u našoj zemlji –LEM “Iskra” Kranj
1962. Na kongresu u Pragu predstavljena prva elektronska mikrografija maligne ćelije
1979. Osnovano Društvo za elektronsku mikroskopiju Srbije
Srbija ima oko 20 laboratorija za elektronsku mikroskopiju i preko 20 elektronskih mikroskopa. Centri: Beograd, Novi Sad, Niš
Prvi EM u Srbiji – ELMI – D2, Carl Zeiss, Jena
Elektronski mikroskop –dizajn i primena
Philips CM 12
Transmisioni elektronski mikroskop
Skening elektronski mikroskop
Tipovi elektronskog mikroskopa
Skening elektronski mikroskop
Visokovoltažni elektronski mikroskop
Ljudsko oko 0.2 mmSM 0.2 �mSEM 2.5 nmSM 0.2 �mSEM 2.5 nmTEM – teor. 0.05 nmTEM - prakt. 1 nmAFM 50 pm
Mogućnosti elektronskog mikroskopa u poređenju sa svetlosnim
Biljna ćelija (tkivo korena luka) posmatrana pomoću svetlosnog i elektronskog mikroskopa; uveličanje 1000 x.
Transmission Electron Microscope TEM demo sessionhttps://www.youtube.com/watch?v=zkr3JmhjKbg&list=PLhn3D8Mrx2LIqoO1Z2HzO9qGdhcowwu7Y
Priprema uzoraka za posmatranje pod elektronskim mikroskopom
- fiksacija- fiksacija- ispiranje, dehidratacija i kalupljenje- sečenje- kontrastiranje
� glavni ograničavajući faktor za dobijanje detaljnijih i pouzdanijih informacija je preparacija uzorka
� elektronska mikrografija je slika uzorka izmenjenog preparativnom procedurom
Fiksacija
Cilj fiksacije
Očuvati strukturu ćelije uz minimalne izmene zapremine, morfologije i prostornih odnosaorganela i makromolekulaorganela i makromolekula
Minimalizovati gubitak konstituenata
Maksimalno zaštiti uzorak od budućih postupaka
Jednako očuvati sve konstituente ćelije
Koagulantni i nekoagulantni fiksativi
Koagulantni (neaditivni) fiksativi ETANOLgranularni/retikularni čvrst materijal suspendovan u tečnosti
Nekoagulantni (aditivni) fiksativi GA, FA, OsO4transparentni gel – stabilizacija proteina, lipida
Uticaj na transparentnost citoplazme
Uticaj na zapreminu tkiva –parenhim, stroma, lumeni
Faktori koji utiču na kvalitet fiksacije
fiziološko stanje ćelije u trenutku fiksacije
veličina uzorka
toničnost, jonski sastav i pH rastvora fiksativa(pufer)
koncentracija fiksativa, temperatura i dužina fiksacije
Fiziološko stanje ćelije u trenutku fiksacije
Primer
- GA u STH-ćelijama miša u ponoć i u podne(mali, jasno definisan/hipertrofisan)(mali, jasno definisan/hipertrofisan)
- struktura membrana EPR u jetri tokom 24h; regionalne razlike u zastupljenosti gl- i gr-ER
- mitohondrije – nabubrele vs. kondenzovane(nestimulisani vs. stimulisani nervni završeci)
Veličina uzorka tkiva
~ 60 µm od površine
dublji sloj tkiva
Izbor pufera i recept za pravljenje Sörensen-ovog fosfatnog pufera
• fosfatni pufer• kakodilatni pufer (arsen)• veronal-acetatni pufer (pH 4,2-5,2)
0.2 M stok rastvori:
Rastvor A:
Na2HPO4 x 2H2O 35.61 g
ili Na2HPO4 x 7H2O 53.65 g
ili Na2HPO4 x 12H2O 71.64 g
Rastvor B:
NaH2PO4 x H2O 27.6 g
ili NaH2PO4 x 2H2O 31.21 g
Destilovane vode do 1000 ml Destilovane vode do 1000 ml
0.1 M fosfatni pufer : pomeša se x ml rastvora A sa y ml rastvora B
pH (na 250C) x ml A y ml B
5.8 4.0 46.0
6.0 6.15 43.85
6.2 9.25 40.75
6.4 13.25 36.756.4 13.25 36.75
6.6 18.75 31.25
6.8 24.5 25.5
7.0 30.5 19.5
7.2 36.0 14.0
7.4 40.5 9.5
7.6 43.5 6.5
7.8 45.75 4.25
8.0 47.35 2.65
Dodati dH2O do 100 ml
Osobine GA kao fiksativa za EM
- komercijalno se proizvodi kao 25% rastvor- lako se rastvara u vodi- blago do umereno toksičan- fiksira brzo, efikasno i ireverzibilno- fiksira brzo, efikasno i ireverzibilno- minimalno menja strukturu tkiva- preporučuje se fiksacija 2 h na 4°C, 1.5-4%
2.5% GA u fosfatnom puferu:0.2 M fosfatni pufer 50 ml25% GA u H2O 10 mldH2O dopuniti do 100 ml
Reakcije GA
• Sa proteinimareakcija sa NH2-grupama, naročito lizina
• Sa lipidimareakcija sa fosfolipidima koji imaju NH -grupereakcija sa fosfolipidima koji imaju NH2-grupeznačaj postfiksacije OsO4-om
• Sa nukleinskim kiselinamareakcije nisu do kraja poznate
• Sa ugljenim hidratimazadržava 40-65% glikogena
Ograničenja fiksacije GA-om
- ne kontrastira tkivo- menja morfologiju nekih struktura u ćeliji- ne čuva većinu lipida, može da dovede do formiranja
mijelinskih figuramijelinskih figura- inhibira aktivnost enzima, blokira antigene- ne sprečava sasvim ekstrakciju tkivnih konstituenata
- preporučuje se dvostruka fiksacija (OsO4)
hemijska fiksacija
fiksacijazamrzavanjem
Ispiranje, dehidratacija, kalupljenje
- Ispiranje u puferu
- Dehidratacija u alkoholu i propilen-oksiduNeželjeni efekti dehidratacije:Neželjeni efekti dehidratacije:- smanjenje uzorka- promena konformacije proteina- gubitak lipida
- Infiltracija i kalupljenje – smoleSmole su toksične i mogu da izazovu alergiju
Neželjeni efekti- smanjenje uzorka tokom polimerizacije
Reprezentativni protokol fiksacije i kalupljenja za EM
1. GA u puferu 2-4 h, 4°C2. Ispiranje u puferu 3x20'3. Postfiksacija u OsO4 1-4 h4. 50% etanol 15'5. 70% etanol 15'5. 70% etanol 15'6. 96% etanol 15'7. 100% etanol 15'8. 100% etanol:propilen-oksid 1:1 15'9. propilen-oksid 15'10. propilen-oksid:smola 2:1 20'11. propilen-oksid:smola 1:1 45'12. propilen-oksid:smola 1:2 60'13. smola 3x45', 45°C14. stavljanje u modle 72h, 56- 60°C
Sečenje
vrsta nožadebljina presekabrzina sečenjamrežice
30 nm30 nm
70 nm
100 nm
150 nm200 nm300 nm
Problemi pri sečenju
- kompresija- tragovi noža
http://sydney.edu.au/video/play.php?video=/ict/videos/introduction-to-microtomy.mp4&poster=/ict/images/videos/introduction-to-ultramicrotomy.jpg&widescreen=true&download=false
Kontrastiranje preseka
osmijumkontrastira lipide i proteine
uranil-acetatkontrastira nukleinske kiseline, proteine,kontrastira nukleinske kiseline, proteine,fosfolipide membrana
olovo-citratkontrastira ugljene hidrate, vezuje se zastrukture kontrastirane uranil-acetatom
Postupak
Nastanak slike na fluorescentnom ekranu
Rad u EM-laboratoriji -rizici, mere opreza i bezbednost pri
rukovanju reagensima
- toksičnost (kontakt, inhalacija)- toksičnost (kontakt, inhalacija)- zapaljivost- odlaganje otpada
Perspektive razvoja elektronske mikroskopije
kombinovanje sa metodima detekcije molekula
usavršavanje metoda fiksacije
udruživanje različitih metoda
Immunolabelling
SM
EM
Korelacija SM i EM
Correlative LM-airSEM microscopy
Scientific Reports 4: 5987, 2014
• 3D tomografija
Multi-lysosomal body (A.J. Koster and W.J.C. Geerts, Utrecht University)