Elektromigrační metody

Princip•metoda využívaná k separaci makromolekul na základ ě náboje, konformace nebo velikosti•migrace nabité částice v elektrickém poli je úm ěrná jejímu celkovému náboji, velikosti a tvaru

fEqv /.=rychlost

celkový nábojintenzita el. pole

frik ční koeficient(popisuje tvar a velikost molekuly)

pI > pH kladný nábojpI < pH záporný náboj ++

+

+

-

-

--

-

--

++

+

•malé částice s velkým nábojem – velká pohyblivost•velké částice s malým nábojem – malá pohyblivost

•volná elektroforesa•zónová elektroforesa•rovnovážná elektroforesa – isoelektrická fokusace•kapilární elektroforesa

Volná elektroforesa

•vložením elektrod do pufru se molekulyprotein ů začnou pohybovat k elektrodáms opačnou polaritou a rozd ělí se na základ ě

rozdílných náboj ů a koeficient ů tření –vzniknou pohyblivá rozhraní mezi jednotlivýmidruhy protein ů

•nevýhody: konvek ční míchání zón, mnohovzorku, složitá aparatura

vzorek

pufr

Zónová elektroforesaelektroforesa na nosi činosi če:

•filtra ční papír – celulosa omezení konven čního míchání•agarosa lepší rozd ělení•polyakrylamid menší spot řeba vzorku

elektroforéza na celulóze•pohyb iontu v rozhodující mí ře závislý na pom ěru náboje k velikosti částice

elektroforéza v gelu•porózní gely umož ňují separaci na principu molekulového síta a zároveň elektroforetické pohyblivosti•provedení

•v trubi čkách•plošná

•vertikální•horizontální

Aparatury pro trubi čkové gely

GelyAGAROSA

•polysacharid z červených mo řských řas•extrémn ě jednoduchá p říprava •pory v ětší než 10 nm•teplota tání 35 °C - 95°C – „low melting“ agarosa (teplota tání ~ 65 °C) •velikost pór ů: 150 nm – 1 % gel

500 nm – 0,16 % gel•široký separa ční rozsah, ale relativn ě nízkou rozpustnost•koncentra ční rozsah – 0,5 % - 4 % fragmenty DNA 100 – 50 000 bp

(větší fragmenty pulsní elektroforesa – 50 000 – 1 000 0 00 bp) •velmi velké proteiny a proteinové agregáty

PUFR: Tris-acetát-EDTA (TAE) nebo Tris-borát-EDTA (TBE)

NANÁŠECÍ PUFR („loading buffer“-PLB): sacharosa, glycerol, ...bromphenolová mod ř a xylen-cyan

Nukleové kyseliny•analysa a purifikace DNA restriki čních fragment ů

•Ethidium bromid, SYBR Greencitlivost 100 pg – 1 ng/proužek

% agarosa

rozsah [kb]

0,7 0,8 - 20

0,9 0,5 - 7

1,2 0,4 - 6

1,5 0,2 - 4

2,0 0,1 - 3

Pulsní gelová elektroforesa (PFG)

použití: separace nukleových kyselin (20 000 až 12 000 000 bp)

field inversion gel electrophoresis ( FIGE)

transverse alternating field electrophoresis ( TAFE)

rotating gel electrophoresis ( RGE)

clamped homogeneous electric field ( CHEF)

Uspo řádání PFG

Figure 2. Increased separation of the 20-50 kb rang e with field inversion gel electrophoresis (FIGE). Run conditions: 230 V, 7.9 V/cm, 16 hrs., 5 0 msec. pulse, forward:reverse pulse ratio = 2.5:1, 1% GTG agarose, 0.5X TBE, 10 C.a) 1 kb lad der, 0.5-12 kb; b) Lambda/Hind III, 0.5-23 kb; and c) High molecular weight markers, 8.3-48.5 kb.

0,5 kb

12 kb

23 kb 48,5 kb

HSI Laboratories, Hoefer Scientific InstrumentsSan Francisco, CA

FIGE

Figure 3. Rotating gel electrophoresis (RGE) separa tion Saccharomyces cercevisiae chromosomes ( 245-2190 kb). Run conditions: 180 V, 5.1 V/cm, 34 hrs., 120 angle, 60-120 sec. pulse ramp, 0.5X TB E, 1.2% GTG agarose, 10 C. Two combs were used on the same gel to load 3 2 samples, a maximum of 72 are possible

HSI Laboratories, Hoefer Scientific InstrumentsSan Francisco, CA

RGE

•směs antigenù je nejprve elektroforeticky rozd ělena, po té je do podélného žlábku nanesena sm ěs protilátek a provedena imunodifuse•tvorba precipita čních linií dojde-li k tvorb ě komplexu Ag-Pl

ImunoelektroforesaZÓNOVÁ ELEKTROFORESA/IMUNODIFUSE

ELEKTROIMUNODIFUSE - RAKETKOVÁ TECHNIKA

•gel obsahuje definovanou koncentraci protilátky

•chemicky inertní a mechanicky stabilní•„obtížn ější“ p říprava oproti agarosovému gelu

T – celková koncentrace akrylamiduC – stupe ň prok řížení – podíl dimeru k monomeru

[%]100.

[%]100.

ba

bC

V

baT

+=

+=

a...hmotnost akryamidu [g]b…hmotnost methylenbisakrylamidu [g]V…objem [ml]

POLYAKRYLAMID

TKUU RT .loglog 0 −= UT...relativní pohyblivostU0...volná relativní pohyblivostKR...tzv. retarda ční koeficient

100

150

200

0 5 10 15koncentrace gelu [% T]

log

UT

rR MK .10.53,510.43,2 72 −− +=

Ferguson, K.A. (1964) Starch-gel electrophoresis-application to the classification of pituitaryproteins and polypeptides.Metabolism 13, 985–1002

Fergusonova analýza

ELEKTRODOVÝ PUFR:

Tris/Glycin/SDS zaostřovcí gelvelké póry

dělící gelmalé póry

princip zaost řování

Uspo řádání: kontinuálnídiskontinuální

PAGE

ZAOSTŘOVACÍ GEL: nižší hodnota pH, nižší koncentrace polyakrylamidu

DĚLÍCÍ GEL: má vyšší hodnotu pH než rozd ělovací

SDS-PAGETris/Gly/SDS

Nevýhody:•za nízkých teplot krystalizuje•mnoho protein ů se chová anomáln ě

-v důsledku neuniformní vazby SDS-proteiny s velkým záporným, velkým kladným nábojem a na prolin bohaté proteiny

NANÁŠECÍ PUFR („loading buffer“-PLB): SDS, glycerol, DTT, pufr, bromfenolová mod ř, H2O

•anionický detergent•po zah řátí na 100 °C rozbaluje protein a váže se na n ěj (1 molekula SDS na 2 AK, 1,4 g SDS na 1 g proteinu) •velký náboj velká pohyblivost•vysoké rozlišení•dobrá fixace proužk ů

•lze odstranit z gelu, aniž by se uvolnily proteiny•10x vyšší detek ční limit než nativní elfo

Tricin = N-Tris(hydroxymethyl) methyl glycine

SDS-PAGETris/Tricin/SDS

separace protein ů < 14 kDa lineární rozlišení 1-100 kDa

SDS-PAGETris/Borát/EDTA

elektroforesa glykoprotein ů SDS se neváže na sacharidy

CTAB•kationický detergent•pro záporn ě nabité proteiny, siln ě bazické nukleoproteiny•nedenaturuje protein, tj. řada protein ů má i po CTAB PAGE enzymatickou aktivitu•kyselé prost ředí – pH 3-5

CTAB-PAGE

Nativní-PAGE

•i jiné pufry HEPES, MOPS, MES•zymogramy

Gradientová gelová elektroforesa

Gradientová gelová elektroforesa

Preparativní PAGE

2D-PAGE

Gradientová gelová elektroforesa

Gradientová gelová elektroforesa

Preparativní PAGE

2D-PAGE

PAGE Nukleových kyselinsekvenování

poslední krok sekvenaceTBE pufrteplota > 50°C, přítomnost močoviny

manuální sekvenování– radioaktivní značení 32P- chromogenní nebo chemiluminiscenční detekce na membráně pomocí značené proby- barvení gelu stříbrem

08_dideoxy_sequencing.swf

automatizované sekvenování

4 rozdílné fluorescenční značky

1 fluorescenční značka - fluorescein

% akrylamid

rozsah [bp]

3,5 100 -1000

5,0 80 -500

8,0 60 - 400

12,0 40 - 200

20,0 10 - 100

PAGE nukleových kyselinfragment ů DNA

ARDRA – restrik ční analysa amplifikované rDNA

rozdělení po restrikčním štěpení specifický obraz

Figure 1. Restriction patterns obtained after restriction digestion with CfoI, AluI, MboI, RsaI and MspI for amplified 16S rDNA of different Acinetobacter species

DNA „fingerprinting“RFLP „restriction fragment lenth polymorphism“

DNA „fingerprinting“Analýza VNTR pomocí PCR

(highly variable repeat sequences)

Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) loci – regiony na chromosomalníDNA, na kterých se různěkrát opakuje krátký motif jako je GC nebo AGCT

RAPD – náhodn ě amplifikovaná polymorfní DNA

•rychlá detekce polymorfismu širokého spektra organismů

•2 krátké primery, nízká teplota amplifikace sady různých DNA fragmentů o různé velikosti

RAPD různých variet kvasinek

Silver-stained polyacrylamide gel showing three distinct RAPD profiles generated by primer OPE15 for Haemophilus ducreyi isolates from Tanzania, Senegal, Thailand, Europe, and North America.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechRAPD.shtml

DGGE –ELEKTROFORESA S GRADIENTEM DENATURUJÍCÍHO ČINIDLA

detekce jednobodové mutacerozdílná elektroforetické pohyblivost částečně denaturovaných molekul (6 M močovina + 20-40 % formamid)

TGGE –ELEKTROFORESA S TEPLOTNÍM GRADIENTEM

teplotní gradient (katoda – 15 °C, anoda 70 °C)

Mixed Populationof DNA

+

16S rRNA Gene G+C-Rich“Clamp”

PCR Primers G+C-TailedProduct

Separate onDenaturing

Gradient Gel

PCR Amplification

Denaturing Gradient Gel ElectrophoresisIncreasing D

enaturant

B CA D

Negative image of an ethidium bromide stained DGGE gel loaded with 16S rRNA coding gene fragments

http://en.wikipedia.org/wiki/Temperature_gradient_gel_electrophoresis

fluorescenční barva – interkalační činidlo

•do gelu•do pufru•barvení po elfu

ETHIDIUM BROMID

SYBR GREEN

Vizualizace DNA

Barvení protein ů

Coommassie Brilliant Blue

Coomassie Blue x barven í stříbrem

Porovnání identických gelů po barvení Coomassie Blue (dráhy 1–3) a po barvení stříbrem (dráhy 4–6).[B. S. Dunbar, ‘‘Two-Dimensional Electrophoresis and Immunological Techniques’’, Plenum Press, New York,1987.]

DIGE – DIFERENČNÍ GELOVÁ ELEKTROFORESA

excitace 488 nmemise 520 nm

Cy2 Cy5Cy3

excitace 633 nmemise 670 nm

excitace 532 nmemise 580 nm

BarvaAmax(nm) Použití

Amidočerň10B 620 barvení proteinů

Coomassie Brilliant Blue R-250 590 barvení proteinů, 10 x citlivější než amidočerň

Coomassie Brilliant Blue G-250 595 barvení proteinů

Alcian Blue 630 Glykoproteiny

Methylene Blue 665 RNA, RNase

Methyl Green 635 Nativní DNA, neutrální nebo kyselá dělící barva

Fast Green FCF 610 barvení proteinů

Basic Fuschin 550Glykoproteiny, nukleové kys., glykoproteiny bohaté na sialovou kys.

Pyronin Y 510 RNA, kyselá dělící barva

Bromocresol Green dělící barva pro DNA agarosovou elfo

Bromophenol Blue 595 neutrání nebo alkalická dělící barva

Crocein Scarlet 505 Immunoelektroforesa

Ethidium Bromide Fluorometrická detekce DNA

Toluidine Blue O 620 RNA, RNase, mukopolysacharidy

Isotachoforesa

•migrace všech iontů stejnou rychlostí•separace složek jako „iontového vlaku“•zonový zaostřovací efekt

diskontinuální systém – vedoucí a terminační elektrolyt

migrace všech iont ů stejnou rychlostí

separace složek jako „iontového vlaku“

zonový zaost řovací efekt

Isoelektrická fokusace

•agarosa nebo polyakrylamid•konstantní teplota - pKa je závislé na teplotě – 10°C

•volné nosiče gradientu pH – pomocí ampholytů•imobilisovaný gradient pH – lineární gradient dvou různých polymerizačních směsí –deriváty akrylamidu

Blotování - p řenos

•difusní přenos•kapilární přenos•přenos vakuem•elektropřenos

Membrány•nitrocelulosa - nejběžnější

•polyviniliden difluorid – vysoká vazebná kapacita

•nylon – nukleové kyseliny

•diazobenzyloxymethyl – chemická aktivace

•ionexové membrány - preparativní

•aktivovaná skleněná vlákna – pro přímou sekvenaci

Detekce

HYBRIDIZACE •radioaktivní proba – vysoká senzitivita, Southern blot•neradioaktivní proba – biotin – streptavidin, dioxigenin

REAKCE SE SUBSTRÁTEM nativní enzym, nedifundující substrát

“IMUNOBLOTTING“ 125I-protein Aenzymem značená sekundární protilátka – konjugace s peroxidasou (tetrazoliová sůl), alkalickou fosfatasou

zlatem značená sekundární protilátka (100 pg)

chemiluminiscence – nejcitlivější

Probrané elektromigrační metody mají tři hlavní nedostatky:

• značná produkce Jouleova tepla během elektroforesy, hodnotavloženého napětí je tím limitována, použití nižšího napětí - odtudčasová náročnost• detekce - nutné barvení po elektroforese• je obtížné automatizovat

Kapilární elektroforesa

metoda byla vyvíjena od počátku 80. let (Jorgensen a Lukacs), první komerční přístroj se objevil v roce 1988

kapilární elektroforesa (CE)

•kapilární zonální elektroforesa

•micelární elektrokinetická chromatografie

•kapilární gelová elektroforesa

•kapilární izoelektrická fokusace

•kapilární izotachoforesa

Způsoby provedení kapilární elektroforesy

-

-

--

-

- ---

-

-

-

-

- -

--

+

+

+ +

++

++

+

+

-

--

-

-

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

stacionární vrstva (Sternova) mobilní vrstva (Guy-Chapmanova)

princip: pohyb podle velikosti náboje + elektroosmotický tok

L

UEv eee .. µµ ==

νe ... rychlost tokuµe …elektroforetická pohyblivostE ... intenzita elektrického poleU ... napětíL ... délka kapiláryD …difusní koeficient analytu

Lineární elektroforetická rychlost

U

LvLt

ee .

/2

µ==

D

UN e

2

.µ=

µµµµ= µµµµe + µµµµEOF

µEOF ... elektroosmotická pohyblivostζ ... zeta potenciálε ... dielektrická konstantaη ... viskosita elektrolytur ... poloměr kapiláry

εµηπζ EOF...4= ηπ

ζεµ..4

...

EEv EOFEOF ==

Elektroosmotický tok

( ) ( )L

UEv EOFeEOFe .. µµµµ +=+= ( )U

LvLt

EOFe ./

2

µµ +==

( )D

UN EOFe

2

.µµ +=

Celková rychlost pohybu analytu

Kapilární zonální elektroforesa

CE Czech.swf

Kapilára•tavený křemen•ochranný polyimidový povlak•délka 25 – 100 cm•vnitřní průměr 25 – 100 µm•vnitřní povrch lze modifikovat

polyimidový povlak

tavený křemen

Detekce•UV/Vis absorpce•fluorescence•radiometrie•MS

Kapilární gelová elektroforesa

•na základě velikosti – polymerní síta (agarosa, bis-polyakrylamid, methylcelulosa)

•kapilára je naplněna gelem - zvyšuje rozdíly mezi elektroforetickými rychlostmi velkých iontů různých tvarů, které jsou nuceny migrovat póry gelu

•nevzniká elektroosmotický tok - lze dělit pouze jeden druh iontů

•používá se pro velké ionty jako peptidy, bílkoviny, sacharidy, štěpy DNA a RNA

Dodnes však nenahradila klasickou gelovou vertikální ahorizontální elfo.

Výhody:- vysoká rychlost průchodu vzorku- přímá kvantifikace-možnost automatizaceNevýhody:-drahé přístrojové vybavení

Pro sekvencování DNAse na přístroji Applied Biosystems3730 DNAanalyzer paralelně používá 96 kapilár, to umožňujeaž 1000 analýz za 24 hodin.

PAA gely pro proteiny, PAAa agarosové gely pro nukleovékyseliny. Modifikace při přípravě gelů (lineárně polymerovanýPAA), možnost použitířidších gelů oproti konvenčním.

•dělení elektroneutrálních látek (hydrofobní a hydrofilní) na základě rozdílných rozdělovacích koeficientů mezi vodní a micelární fází

•povrchově aktivní látka přidána do pufru (detergent, např. SDS, deoxycholát sodný, CTAB)

•koncentrace detergentu musí být větší než je kritická micelární koncentrace (CMC).

•povrchově nabité micely migrují uvnitř pufru vlastní elektroforetickou rychlostí a unáší molekuly a ionty separovaných sloučenin, které jsou více či méně přítomny uvnitř hydrofobních dutin micel

•stupeň solvatace molekul micelami udává rychlost unášení těchto molekul micelami

Micelární elektrokinetická chromatografie

+ -

Kapilární isoelektrická fokusace•dělí molekuly mající amfolytickou povahu na základě jejich rozdílných isoelektrických bodů pI

•dělící kapilára se naplní roztokem dělených amfolytických látek a pomocného amfolytu, který je schopen pufrovat celý rozsah pH

•z opačných konců migrují do kapiláry OH- a H+ ionty, které v ní vytvářejí spojitý lineární pH gradient

•dělené molekuly (ionty) putují roztokem dokud nedosáhnou pH, které se rovná jejich pI vytvoří úzkou zónu (fokusují)

•po fokusaci se zóny mobilizují (uvedou do pohybu), aby prošly detektorem a byly detekovány

•kapilární izoelektrické fokusování je použitelné pouze pro amfolytické molekuly

Kapilární izotachoforesa

•dělí ionty na základě jejich rozdílných elektroforetických mobilit

•roztok dělených iontů je dávkován jako rozhraní dvou rozdílných pufrů – vedoucí, terminační iont

•každý separovaný iont vytváří během analýzy svoji vlastní zónu

•zóny všech dělených iontů jsou uzavřeny mezi vedoucí a terminační pufr a jsou seřazeny bezprostředně za sebou podle klesající elektroforetické pohyblivosti dělených iontů

•kapilární izotachoforéza je použitelná pouze pro molekuly s nábojem

•během jednoho experimentu lze dělit a detekovat pouze jeden druh iontů

• Analysa cukrů• Analysa

anorganických iontů• DNA profil• Identifikace proteinů

• výhody• rychlost• málo vzorku• relativně levný• automatizované

• nevýhody• nelze identifikovat

neutrální látky• nelze rozlišit tvar

Aplikace

Při CE lze měnit několik parametr ů pro lepší separaci.Optimální hodnoty jsou ale vždy důsledkemkompromisu.

Př.Zmenšení průměru kapiláry umožňuje použití vyššího napětí(lepší odvod tepla). Zvýší se rozlišení a sníží doba analýzy.Sníženímprůměru se ale sníží tloušťka optické dráhy detektoru,tím poklesne citlivost detekce.

Prodloužení kapiláry umožňuje opět použití vyššího napětí, avšakprodlouží se doba analýzy, vyšší difuze.

Důležitá je volba vhodného pufru. S rostoucí iontovou silou rostevodivost, ale i produkce tepla.