Aurora Criado FTBQ

Electroforesis de protenas sricas en acetato de celulosa

Objetivo Separar las diferentes fracciones de las protenas sricas mediante electroforesis en acetato de

celulosa y posterior obtencin del proteinograma por fotodensitometra.

Fundamento terico La electroforesis es una tcnica de separacin en la cual una partcula cargada se hace desplazar

a travs de un medio aplicando un campo elctrico: si la partcula est cargada positivamente (catin)

migrar hacia el polo negativo (CTODO), si la partcula est cargada negativamente (anin) migrar

hacia el polo positivo (NODO).

Las protenas del suero se pueden separar mediante esta tcnica. Sus puntos isoelctricos estn

entre 4,9 (Albmina) y 7,4 (Gammaglobulinas). As, al realizar la electroforesis con un tampn de pH=8,6

todas las protenas tendrn carga negativa. La albmina, al tener el pI ms alejado del pH, tiene ms carga

negativa y avanza ms rpido, quedando ms cerca del polo positivo que las gammaglobulinas, que

migran muy poco por ser el pH prximo a su pI. Las restantes protenas sricas quedan situadas entre

estas dos.

Las fracciones de protenas sricas se pueden visualizar por tincin.

Se puede realizar el anlisis cuantitativo de cada fraccin por fotocolorimetra. Se cortan las

distintas fracciones electroforticas de la tira despus de la decoloracin y se colocan en tubos de ensayo.

Se aade una solucin disolvente (cido actico al 80%), 9 mL de solucin para la albmina y 3 mL para

cada globulina, y se leen con un fotmetro a 620 nm para el Negro Amido. Si conocemos la concentracin

de protenas totales de la muestra, y mediante clculos sencillos, se puede calcular la concentracin de

cada fraccin.

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Tambin se puede realizar una cuantificacin de cada fraccin por fotodensitometra, despus de

transparentar las tiras de acetato de celulosa. De esta manera se obtiene el proteinograma, en el que el

rea bajo las curvas es proporcional a la concentracin de cada fraccin.

En los individuos normales existe un patrn electrofortico clsico, en el que aparecen 5 bandas

proteicas al separarse (Albmina, alfa-1-globulinas, alfa-2-globulinas, beta-globulinas y gamma-globulinas)

con determinadas alturas, relacionadas con su concentracin. Cuando existe alguna anomala, se

modifican las concentraciones de alguna o algunas protenas sricas, lo que se traduce en una variacin

de la fraccin proteica en la que migran. Por ello, es una tcnica til en el diagnstico clnico.

Nosotros utilizaremos un suero normal y uno patolgico, para poder ver la diferencia en los

proteinogramas.

Material. Reactivos Cubeta y puente de electroforesis

Fuente de alimentacin

Tiras de acetato de celulosa (Cellogel)

Papel de filtro

Aplicador individual semi-micro

Cubetas

Pinzas

Placas de vidrio de tamao adecuado a las tiras de acetato de celulosa.

Tubos de ensayo

Pipetas graduadas

Cubetas de vidrio de 1 cm de paso ptico

Tampn TRIS Hipurato Buffer pH=8,8

Colorante Negro Amido 10B

Decolorante de Negro Amido: 47,5 mL metanol + 47,5 mL agua + 5 mL de cido actico

Solucin Transparentadora A y B: mezclar 9 partes de A (870 mL metanol + 30 mL ciclohexanona)

y 1 parte de B (100 mL cido actico)

Solucin Disolvente: cido actico al 80%

Procedimiento

ELECTROFORESIS:

1. Sumergir las tiras de acetato de celulosa en tampn TRIS Hipurato Buffer pH = 8,8 durante 10-

15 minutos antes de su uso, para su equilibrado

2. Retiramos las tiras y eliminamos el exceso de tampn poniendo las tiras entre dos hojas de

papel de filtro, con cuidado de que no se sequen por completo

3. Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de electroforesis de modo que la superficie

penetrable quede hacia la parte superior. El lado penetrable es el que se ve cuando la tira se

coloca en vertical delante de nosotros con el corte en la esquina inferior derecha

4. Cargar la muestra en la bandeja de carga, seleccionando una distancia entre pocillos adecuada

para el ancho de la tira y el aplicador. Depositar con ayuda del aplicador las muestras de suero

en cada tira, procurando no coger muestra en exceso. Cargamos dos tiras: tira A, con dos

muestras, la normal y la patolgica, y la tira B, con una muestra patolgica, una muestra normal

bien cargada, que utilizaremos, y una muestra normal mal cargada, con fines educativos.

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5. Colocar el puente con la muestra cargada, teniendo cuidado de dejar la muestra en el ctodo,

para que pueda correr hacia el nodo.

6. Conectar la fuente de alimentacin, aplicando una diferencia de potencial de 200V durante 35

minutos

REVELADO:

7. Finalizada la separacin, depositar las tiras, boca abajo, en una cubeta con solucin colorante

Negro Amido, de modo que queden cubiertas por el lquido, durante 10-12 minutos

8. Preparar tres cubetas con solucin decolorante de negro amido 1,2 y 3 (tienen distinta

concentracin).

9. Despus de pasar las tiras a la primera cubeta y agitarlas durante unos minutos, se introducen

en la nmero 2, se agitan unos minutos, y finalmente, se introducen en la cubeta 3 y se agitan

unos minutos.

ESPECTROFOTOMETRA DE LA TIRA A:

10. Una vez que se ha hecho la decoloracin de la tira, se cortan las fracciones y se coloca cada

una en un tubo de ensayo

11. Aadir 9 mL de cido actico al 80% en el tubo de ensayo de la albmina y 3 mL en los tubos

de ensayo de cada globulina.

12. Preparar un BLANCO con cido actico al 80% y un trozo de tira de acetato de celulosa sin

carga proteica, para eliminar las interferencias

13. Se ajusta a 0 el espectrofotmetro con el blanco, y se realiza la lectura de absorbancia de cada

fraccin a una longitud de onda de 620 nm.

14. Determinamos cuantitativamente las protenas totales en la muestra normal y en la patolgica

(ver prctica de determinacin cuantitativa de protenas por el mtodo de Biuret), realizando

medidas de absorcin a 540 nm de los complejos formados con el reactivo Biuret.

FOTODENSITOMETRA DE LA TIRA B:

15. Deshidratar la tira B en un bao de metanol durante 1 minuto

16. Sumergir la tira en una cubeta con solucin transparentadora durante 1-2 minutos en agitacin

17. Extender la tira entre dos placas de vidrio, y calentarla en la estufa a 60-70o durante 3-4

minutos.

18. Dejar enfriar a temperatura ambiente durante 30 minutos, antes de retirar la tira

19. Hacer una lectura de la tira con el fotodensitmetro

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Resultados. Clculos. Observaciones

ANLISIS CUANTITATIVO MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRA DE LA TIRA A

Las medidas de A620 nm de cada fraccin de la tira A fueron las siguientes:

Muestra Fraccin A620 nm Muestra Fraccin A620 nm

Normal

Albmina 0,155*3=0,465

Patolgica

Albmina 0,126*3=0,378

1-globulinas 0,024 1-globulinas 0,015

2-globulinas 0,046 2-globulinas 0,042

-globulinas 0.071 -globulinas 0,036

-globulinas 0,107 -globulinas 0,061

ATOTAL 0,713 ATOTAL 0,532 Hay que tener en cuenta que como la Albmina se diluy con 9 mL de disolvente, mientras que el resto se diluy con 3 mL, habr que corregir la absorbancia de la fraccin de albmina multiplicando por 3.

Y el porcentaje de cada fraccin ser:

% 100fraccin

TOTAL

Afraccin

A

Fraccin Proteica

Muestra Normal

Muestra Patolgica

Valores de referencia

Albmina 65,22% 71,05% 57-65%

1-globulinas 3,37% 2,82% 1-4% 2-globulinas 6,45% 7,89% 6-10% -globulinas 9,96% 6,77% 8-12%

-globulinas 15,01% 11,47% 12,5-19,5%

Como se puede observar, en la muestra patolgica la albmina est aumentada, mientras que las

y -globulinas estn por debajo de los valores normales.

Determinamos la concentracin de protenas totales en la muestra normal y en la patolgica por el

mtodo de Biuret, de forma que las medidas de A a 540 nm y la concentracin de protenas totales son:

A540 nm [Protenas totales]

Patrn 0,346 7 g/dL

Normal 0,446 9,02 g/dL

Patolgica 0,418 8,46 g/dL

Podemos calcular entonces la concentracin en g/dL de cada una de las fracciones:

%[ ] [ ]

100muestra total muestra

fraccinfraccin prot

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Muestra Fraccin [protena] (g/dL)

Muestra Fraccin [protena] (g/dL)

Normal

Albmina 5,88

Patolgica

Albmina 6,01

1-globulinas 0,30 1-globulinas 0,24

2-globulinas 0,58 2-globulinas 0,67

-globulinas 0,90 -globulinas 0,57

-globulinas 1,36 -globulinas 0,97

FOTODENSITOMETRA DE LA TIRA B

Los proteinogramas obtenidos para la muestra normal y la muestra patolgica fueron los siguientes:

MUESTRA NORMAL

MUESTRA PATOLGICA (Gammapata monoclonal)