Henry

Laboratorio en el

Diagnostico Clinico

Homenaje a Todd-Sanford & Davidsohn J o h n B e r n a r d H e n r y , M . D .

Distinguised Service Professor Director. Pathology 200 College of Medicine

Dircelo): Transfusion Medicine and Transfusion Medicine Fellowship Program Attending Pathologist, University Hospital

Siale University of New York Upstate Medical University

Syracuse, New York

Frederick R. Davey, M.D. Prolessor and Chair. Department ot Pathology. State University ot New York Upstate Medical University. Syracuse. New York

Chester J. Herman, M.D, Ph.D. Professor ot Pathology, Emory University School ol Medicine: Director. Pathology. Grady Health System, Atlanta. Georgia

Richard A. McPherson, M.D. Prolessor ot Pathology; Chair. Division ot Clinical Pathology. Department ot Pathology. Medical College ot Virginia. Virginia Commonwealth University; Director. Clinical Pathology. Medical College ot Virginia Hospitals, Richmond. Virginia

Matthew R. Pincus, M.D , Ph.D. Prolessor ol Pathology. State University of New York Downstate Medical Center; Chair. Department ot Pathology and Laboratory Medicine. Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New York

Gregory A.Threatte, M.D. Professor ot Pathology; Director ot Core Laboratories and Outreach. Upstate Medical University. Syracuse, New York

Gail L. Woods, M.D. Prolessor ot Pathology; Director. Clinical Microbiology. University of Texas Medical Branch. Galveston. Texas

Contenido

Seccin I. Patologa clnica / Medicina de laboratorio Gregory A. Tetrault, M.D., John Bernard Henry, M.D.

1. Labora to r io clnico: organizacin, objetivos y prct ica 3 John Bernard Henry, MD,Anthony S Kurec, M S . H I A S C P I DiM.WiUam K Dcnwyler.M.7

2. Laborator ios de consulta mdica . . . 50 Gregory A. Threatte, M o

3. Principios de ins t rumentac in . . 60 Andy N.D. Nguyen. MSM. MD.. Robert L Sunheimer, M S , MriASCPiSC, John Bernard Henry, M D.

4. A u t o m a t i z a c i n del labora tor io clnico 79 Rodney S. Markin, /no, cft.O.

5. In te rpre tac in de los resultados de labora tor io 92 Motthew R. Pincus, M D, pii D, Naif Z. Abraham.]r.. M a. i o.

6. In formt ica , t r a t a m i e n t o de imgenes e interoperabi l idad 108 Raymond D.Aller, A I O , Ulysses J. Balis, MD

7. Estadstica e x p e r i m e n t a l 138 Gregory A. Tetrault. M.D.

8. G a r a n t a de calidad del labora tor io clnico 148 Gregory A. Tetrault, M.D.

Seccin II. Qumica clnica Mathew R. Pincus, M.D., Ph.D., John Bernard Henry, M.D.

9. Evaluacin de la funcin renal , balance de agua, e lectrl i tos, equi l ibrio cido-base y gases sanguneos

D. Roben Dufour, M D

10. In te rmediar ios metabl icos, ionesinorgnicos y marcadores bioqumicos del m e t a b o l i s m o del hueso

Elena Nkolova Hrstova, M D, John Bernard Henry. M D

11. H idra tos de carbono Paul . Knudson, Mo, Ruth S.Weinstock, M.R.PhO,John Bernard Henry. MD

12. Lpidos y d is l ipoprote inemia Paul S. Bachorik, BiO, Margo A. Denke. MD . van A. Stem, M D PhD. re A P. Bosyl M. Rifikind, MD.FR.CP

13. Protenas especficas Richard A. McPherson. M o

14. Evaluacin de la funcin y el dao hept ico D. Roben Dufour. M D

/5. Enzimologa clnica D. Roben Dufour, MD. John A. Loa, n D.,John Bernard Henry, MD

16. Evaluacin de la funcin endocr ina Joan H. Howanitz. Mo,John Bernard Henry. M o

17. Toxicologa y mon i to r i zac in te raput ica de frmacos Matthew R. Pincus, M o, Hi a, Naif Z. Abraham Jr., M.D.. PhD.

159

180

21 I

224

249

264

281

304

335

III

Seccin III. Orina y otros fluidos Gregory A. Threatte, MD.. John Bernard Henry, M.D.

18. E x a m e n bsico de la or ina 367 Christine Fller, M), Gregory A. Threatte, M D, John Bernard Henry, M.D

19. Lquido cefalorraqudeo, sinovial y lquidos serosos del organismo 403 Gregory P. Smith, M.D., Carl R. Kjeldsberg, M.D

20. Labora to r io en androloga y la evaluacin de la fert i l idad 425 Siddhartha Sarkar, Pi-.D.John Bernard Henry. M.D

21. T r a t a m i e n t o en el labora tor io de las tecnologas de reproduccin asistida 432 AndrVan Steirteghem.MD.PhD.

22. Aspectos del labora tor io en el t r a t a m i e n t o de la gestacin 446 Robert Wenk, M D . . M S , Miriam Blitzer. Hi..

23. Diagnst ico de laborator io de las al teraciones gastrointestinales y pancreticas 462

David G. Heisig. M.D.. Gregory A. Theatte. MD., John Bernard Henry, M.D.

Frederick R. Davey, MD., John Bernard Henry, M.D.

24. E x a m e n bsico de la sangre 479 Michael W. Morris. M S , DLMIASCPISH., Frederick R. Davey. M D

25. Hematopoyes is 520 Frederick R. Davey. Mo, Robert . Hutchison. MD

26. Trastornos er i t roci tar ios 542 M. Torek Elghetany, M D, Frederick R. Dovey, M D

27. A l terac iones de los leucocitos 586 Robert . Hutchson, M D, Frederick R. Davey, M.D

28. P laquetas en sangre 623 Jonathan L Miller, MO.Ph.D.

29. Coagulacin, fibrinlisis e hipercoagulacin . . 642 Elizabeth M. Van Cott, M D , Michael Laposata, M D ,PhD.

30. I n m u n o h e m a t o l o g a 660 WendyV. Beadlyng, M s. MTIASCPISRB, Laura Cooling, MD.MSI ,ohn Bernard Henry, Mo

31. Medicina transfusional 718 Leonard I. Borat, MD.MBA, Eduardo Delaflor Weiss, M D , John Bernard Henry, MO

32. Hemafres is . . 776 Jeffrey L Winters, M D . Alvaro A. Pineda, M D

33. A l m a c e n a m i e n t o de tejidos y clulas m a d r e 806 Charlene A. Hubbell. 6 s. MTIASCPISB. John Bernard Henry, M D

Seccin V. Inmunologa e inmunopatologa Richard A. McPherson, M.D., John Bernard Henry, M.D.

34. Visin general del sistema inmune y de los t rastornos inmunolgicos 817 Richard A. McPherson, M.D.

35. Inmunoensayos e inmunoqu mica 821 Ybshiro Ashihara, PII.D., Yosushi Kasahara, Pii.o., D.M.SC., Roben M. Nakamura, M D

36. E x a m e n de laborator io del sistema inmune celular 850 He/ene MA Paxton. M.SMTIASCPI, Susanna Cunningham-Rundles, . Maurice R.G. 0 Gorman, M.Sc...D/ABMUI

V

Contenido

37. Evaluacin del func ionamiento de las inmunoglobulinas y la inmunidad h u m o r a l 878

Richard A. McPherson, MD

38. C o m p l e m e n t o y cininas: med iadores de la inf lamacin 892 Ene Wagner, pto. Haixiang Jiang, Mo.f to. Michael M Frank. MD

39. Ci tocinas y molculas de adhesin 914 H Dons Massey, MD. FI D. DO S . Richard A. McPherson, M D

40. A n t g e n o leucocitar io h u m a n o : comple jo m a y o r de histocompat ibi l idad del h o m b r e 927

Armead H. Johnson. iD. Carolyn Katovich Hurley. f i D . Roben]. Haraman. cwrMC.usn.MD,udnh A.Wade. 8 k 41. C o m p l e j o m a y o r de histocompat ibi l idad y e n f e r m e d a d 949

julio C Delgado. M o, Edmond j.Yunis, MD 42. Trastornos inmunodef ic i tar ios 963

Charlotte Cunnmgham-Rundles. MD.fhD.

43. Evaluacin clnica de labora tor io de las en fe rmedades reumt icas sistmicas 974

Carlos Alberto Yon Mhlen, MO.F*D.. Roben M. Nakamura. M O

44. Vasculitis 990 Rex M. McCallum. MD. David] Bylund. MD.

45. Enfermedades auto inmunes organoespecficas 1000 David / Bylund. M D. Roben M. Nakamura. M D

46. Enfermedades alrgicas 1016 Henry A. Homburger.MD.

47. Diagnstico y m a n e j o del cncer m e d i a n t e marcadores t u m o r a l e s serolgicos 1028

Jomes T.Wu. rto

Gail L. Woods, M.D., John Bernard Henry, MD

48. Infecciones vricas 1045 Michael Coste/lo, w D, Margaret Yungbluth, MD

49. Infecciones causadas por clamidias, rickettsas y micoplasmas 1072 Gail L Woods, D. David H. Walker, MD

50. Bacter iologa mdica 1088 barbara S. Reisner, i* o. Gail L Woods, M O

51. Pruebas de sensibilidad in vitro a los ant imicrobianos 1119 Michael B. Smitli. MD, Gail L. Woods. Mo

52. Infecciones por espiroquetas 1131 Michael 8. Sm;(i, M D . Randall T. Hoyden, MD . David H. Persing. M D . m D., Gail L Woods. M D

53. Micobacter ias 1144 Gail L Woods. MD

54. Enfermedades mict icas 1158 Washington C.Wmn.jr, MD.MRA, Fred W.Westenfeld. MIIASCPISM

55. Parasitologa mdica 1196 Thomas R. Fritsche, Mr>,mo,ames W. Smith, MD.

56. Patologa molecular de en fe rmedades infecciosas 1241 Martn G. Cormican, MD, Michael A. Pfaller, M.D

57. Mane jo y recogida de muestras para el diagnstico de las enfermedades infecciosas 1254

Gail L. Woods, MD

V

Contenido

Chester, J. Hermn. M.D.. Ph.D., John Bernard Henry. MD.

58. Introduccin a la patologa molecular 1273 Chester / Hermn. MD..PII.D, John Bernard Henry. * I . D

59. Diagnsticos moleculares: tcnicas y principios bsicos 1275 Ehzabelli R. Unger. PIo. MD, Margaret A. Piper. PhD.MP.H.

60. Reaccin en cadena de la pol imerasa y ot ras tecnologas de amplif icacin 1287 james C. Zimring, MD. PID. Frederick S. No/te, no.

61. Tecnologas de la hibridacin en serie 1296 jacques Scnrenzet. Mo Jonathan R. Hibbs. M D . David H. Persing. MD.PhD.

62. Aplicaciones de la c i togent ica en la patologa m o d e r n a 1304 Constance K. Stein, PhD.

63. O r g a n i z a n d o un labora tor io de diagnstico molecular 1333 Andrea Ferreira-Gonzalez. PhD, DavidA.WHkinson. MD.PhD.. Coreton T. Garren, MD..PI.D.

64. Oncoprote nas y deteccin t u m o r a l precoz . 1344 Motthew R. Pincus, M D Hi D, Paul W Brandl-Rauf. M D , Ph o. D . P H . William Koslosky, M o., William Appruzzese, PhD.

65. Tcnicas moleculares en el diagnstico de neoplasias hematopoyt icas 1355 David S.Viswanatha, MD, Ridiard S. Larson, M D , PhD

66. Diagnst ico molecular de las en fe rmedades genticas 1372 Wayne W. Grody. MD.. PhD, Walter W. Noli, MD.

67. Pruebas de patern idad: e m p l e o del A D N , po l imor f ismo y otros marcadores genticos 1390

Herbert F. Polesky, M D.

68. Pruebas forenses de ident idad med ian te anlisis del A D N 1402 Vctor W. Weedn. M o) D, Rlionda K. Roby, M P H

1. Soluciones fisiolgicas, t a m p o n e s , indicadores cido-base, mater ia les de referencia estndar y tabla de conversin de t e m p e r a t u r a s 1417

2. Pesos ideales, superficie corpora l e ndice de masa corpora l ( I M C ) 1420 3. Clculo aprox imado del v o l u m e n sanguneo tota l ( V S T ) 1424 4. Tabla peridica de los e lementos .. 1425 5. Unidades del sistema internacional (S I ) . . . 1426

H. Peter Lehmann. Pt 0, jolin Bernard Henry, MD

VI

Autores

Naif Z. A b r a h a m , Jr., M.D.. Ph.D. Staff Pathologist. Veterans Affairs Medical Center; Assistant Professor. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse. New York

Raymond D. Aller, M.D. Clinical Professor. Department of Pathology and Laboratory Medicine. Emory University School of Medicine. Atlanta. Georgia: Vice President. Medical Affairs and Informatics. MDS Laboratory Services (United States). Nashville. Tennessee

Wil l iam A p p r u z z e s e , Ph.D. Staff Member and Clinical Assistant Professor. Department of Environmental Sciences. Columbia College of Physicians and Surgeons. New York. New York

Yoshihiro Ashihara , Ph.D. General Manager. Research Laboratories. Fujirebio Incorporated. Tokyo. Japan

Paul S. Bachor ick , Ph.D. Professor (retired). The Johns Hopkins University School of Medicine. Baltimore. Maryland

Ulysses J . Bal is, M O Instructor in Pathology. Harvard Medical School and Massachusetts General Hospital. Boston. Massachusetts

Wendy V. Beadl ing , M.S., MT

Michael M. Frank, M.D. Samuel L. Katz Professor and Chairman of Pediatrics, and Professor of Immunology and Medicine, Duke University Medical Center, Durham. North Carolina

T h o m a s R. Fr i tsche, M.D . Ph.D. Associate Professor, Department of Laboratory Medicine, University of Washington; Head, Clinical Microbiology Division. University of Washington Medical Center. Seattle. Washington

Christ ine E. Fuller, MD. Fellow, Department of Pathology, Washington University School of Medicine; Fellow. Department of Pathology, Barnes- Jewish Hospital, St. Louis, Missouri

Carleton T. Garret t , M.D., Ph.D. Professor of Pathology, Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University; Medical Director, Molecular Diagnostics Laboratory, Department of Pathology, Medical College of Virginia Hospitals, Richmond. Virginia

Wayne W. Grody, M.D., Ph.D Professor. Divisions of Molecular Pathology and Medical Genetics, Departments of Pathology and Laboratory Medicine and Pediatrics, UCLA School of Medicine: Director, Diagnostic Molecular Pathology Laboratory, UCLA Medical Center, Los Angeles, California

Robert J . H a r t z m a n , CAPT, M C , U S N , M.D. Director, C. W. Bill Young Marrow Donor Recruitment Program and Research Program, Naval Medical and Research Insitute, Bethesda. Maryland

Randal l T. Hayden , M.D. Director. Clinical Microbiology, St. Jude Children's Research Hospital. Memphis, Tennessee

David G. Heis ig , M.D. Associate Professor of Medicine. Department of Medicine, State Universit of New York Upstate Medical University Syracuse. New York

J o h n Bernard Henry, M.D. Director, Pathology 200, College of Medicine; Distinguished Service Professor; Director, Transfusion Medicine & Transfusion Medicine Fellowship; Hemapheresis. HLA, Progenitor Cell and Parentage Testing Laboratories; Attending Pathologist, University Hospital. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York

Chester J. H e r m a n , M.D.. Ph.D. Professor of Pathology, Emory University School of Medicine; Director. Pathology, Grady Health System, Atlanta. Georgia

J o n a t h a n R. H ibbs , M.D. Director, Bacteriology Laboratory Wadsworth Center. New York State Department of Health. David Axelrod Institute, Albany, New York

Henry A. Homburger , M.D. Professor of Laboratory Medicine, Mayo Medical School and Mayo Graduate School of Medicine. Rochester, Minnesota

Joan H. Howani tz , M.D. Vice Chair, Department of Pathology. State University of New York at Brooklyn; Director of Laboratories. Kings County Hospital Center, Brooklyn. New York

Elena Nikolova Hristova, M.D. Resident in Anatomic and Clinical Pathology. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse. New York

Char lene A. Hubbel l , B .S MT

Autores

Paul E. K n u d s o n , M.D. Associate Professor of Medicine, Division of Endocrinology. Diabetes and Metabolism: Joslin Diabetes Center. State University of New York Upstate Medical University. Syracuse, New York

Wil l iam Koslosky, M.D. Consultant. Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New York

Anthony S. Kurec, M.S., H ( A S C P ) D L M Clinical Associate Professor. Department of Clinical Laboratory Science, College of Health Professions: Administrator for Pathology Marketing and University Pathologists Laboratories, State University of New York Upstate Medical University. Syracuse. New York

Michael Laposata , M.D.. Ph.D. Professor. Department of Pathology: Director of Clinical Laboratories. Harvard Medical School. Boston, Massachusetts

Richard S. Larson, M.D.. Ph.D. Assistant Professor, Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine; Laboratory Director, University Hospital Rapid Response Laboratories. University Hospital. Albuquerque. New Mexico

H. Peter L e h m a n n , Ph.D. Professor Emeritus. Department of Pathology. Louisiana State University Medical Center. New Orleans. Louisiana

John A. Lott, Ph.D. Professor. Department of Pathology, The Ohio State University; Director of Clinical Chemistry, The Ohio State University Hospitals, Columbus. Ohio

Rodney S. Mark in , M . D . Ph.D. Professor and Vice Chair, Department of Pathology and Microbiology: Associate Dean for Clinical Aftairs. College of Medicine, University of Nebraska Medical Center. Omaha. Nebraska

H. Davis Massey, M . D , Ph.D., D.D.S. Chief Resident in Pathology. Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia

Rex M. M c C a l l u m , M.D. Associate Clinical Professor of Medicine. Division of Rheumatology. Allergy and Clinical Immunology. Duke University School of Medicine; Vice Chair for Clinical Services. Department of Medicine. Duke University School of Medicine and Hospital. Durham. North Carolina

Richard A. M c P h e r s o n , M.D. Professor of Pathology; Chair. Division of Clinical Pathology, Department of Pathology. Medical College of Virginia. Virginia Commonwealth University; Director. Clinical Pathology. Medical College of Virginia Hospitals. Richmond. Virginia

J o n a t h a n L. Miller, M . D . Ph.D. Professor of Pathology; Director of Academic Aftairs. Department of Pathology: Director of Special Hematology Laboratory. University Hospital, State University of New York Upstate Medical University. Syracuse, New York

Michael W. Morr is , M.S.. D L M I A S C P I S H Professor. Department of Clinical Laboratory Science; Manager. Department of Pathology. University Hospital. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse. New York

Robert M. Nakamura , M.D. Professor. Departments of Immunology and Experimental and Molecular Medicine. The Scripps Research Institute: Senior Consultant and Chairman Emeritus, Department of Pathology. Scripps Clinic and Research Foundation. La Jolla. California

A n d y N.D. Nguyen , M S M E , M.D. Associate Professor. Department of Pathology. University of Texas Medical School at Houston; Director. Hematology Laboratory and Chemistry Laboratory. Lyndon B. Johnson Hospital; Director. Coagulation Laboratory. Memorial Hermann Hospital. Houston, Texas

Walter W. Nol l , M.D Professor of Pathology. Dartmouth Medical School. Hanover. New Hampshire; Director. Clinical Chemistry and Molecular Genetics Diagnostic Laboratories, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, Lebanon. New Hampshire

Freder ick S. Nol te , Ph.D. Associate Professor. Pathology and Laboratory Medicine, Emory University School of Medicine; Laboratory Director, Clinical Microbiology and Molecular Diagnostic Laboratories. Emory Medical Laboratories, Atlanta. Georgia

Maurice R.G. O ' G o r m a n , M Sc.. Ph.D.. D(ABMLi) Associate Professor-Pediatrics. Northwestern University Medical School; Director. Diagnostic Immunology and Flow Cytometry Laboratories. The Children's Memorial Hospital. Chicago. Illinois

ix

Autores

Helene M.A. Paxton, M.S., MT IASCP) Vice President of Manufacturing. Regulatory Affairs and Research and Development, PanBio InDx, Incorporated. Baltimore. Maryland

David H. Pers ing, M.D.. Ph.D. Medical Director. Infectious Disease Research Institute; Vice President, Diagnostics Research. Corixa Corporation, Seattle. Washington

Michael A. Pfaller, M.D. Professor. Department of Pathology; Director, Molecular Epidemiology and Fungus Testing Laboratory, University of Iowa College of Medicine. Iowa City, Iowa

Matthew R. P incus, M . D , Ph.D. Professor of Pathology. State University of New York Downstate Medical Center; Chair. Department of Pathology and Laboratory Medicine, Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New York

Alvaro A. Pineda, M.D. Professor of Laboratory Medicine and Director of Transfusion Medicine Fellowship Program. Mayo Medical School and Mayo Graduate School of Medicine: Consultant. Transfusion Medicine. Mayo Clinic. Rochester. Minnesota

Margaret A. Piper, Ph.D.. M .RH. Senior Consultant. Technology Evaluation Center. BlueCross BlueShield Association, Chicago, Illinois

Herbert F. Polesky, M.D. Professor (retired), Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Minnesota School of Medicine, Minneapolis. Minnesota: Formerly Director, Memorial Blood Centers of Minnesota, Minneapolis, Minnesota

Barbara S. Reisner, Ph.D. Assistant Professor, Department of Pathology: Associate Director. Clinical Microbiology Laboratory, University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas

Basil M. Ri fk ind, M.D., F.R.C.P. Special Assistant for Clinical Studies, National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute. Division of Heart and Vascular Diseases, Bethesda. Maryland

Rhonda K. Roby, M.RH Senior Forensic Specialist, Human Identification, Applied Biosystems. Foster City, California

Siddhar tha Sarkar, Ph.D. Clinical Professor, Department of Pathology: Director. Andrology Service. University Hospital, State University of New York Upstate Medical University. Syracuse, New York

Jacques Schrenze l , M.D Assistant Professor. Geneva University Medical School: Consultant. Division of Infectious Diseases, Geneva University Hospital. Geneva, Switzerland

Gregory P. Smi th , M.D. Assistant Clinical Professor. Department of Pathology. University of Utah; Staff Pathologist, Department of Pathology. St. Mark's Hospital. Salt Lake City. Utah

J a m e s W. Smi th , M.D. Professor Emeritus. Department of Pathology and Laboratory Medicine, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, Indiana

Michael B. Smi th , M.D. Assistant Professor; Associate Director, Clinical Microbiology and Laboratory Information System. University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas

Constance K. Ste in , Ph.D. Associate Professor of Pathology and Pediatrics; Director of Cytogenetics and Associate Director of Molecular Diagnostics. University Hospital. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York

Evan A. Stein, M . D , Ph.D.. F.C.A.P Voluntary Professor. Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati. Cincinnati, Ohio: President and Chief Executive Officer, Medical Research Laboratories, Highland Heights, Kentucky

Robert L. Sunheimer , M.S., MT(ASCP)SC Associate Professor in Clinical Laboratory Science. State University of New York Upsate Medical University, Syracuse, New York

G r e g o r y A. Tetrault , M.D. Medical Director, Shared Laboratory Services. L.C.. Chesapeake, Virginia

G r e g o r y A . T h r e a t t e , M.D. Professor of Pathology; Director of Core Laboratories and Outreach, Upstate Medical University, Syracuse, New York

El izabeth R. Unger, Ph.D., M.D. Acting Chief, Human Papillomavirus Section. Centers for Disease Control and Prevention; Clinical Associate Professor, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University School of Medicine. Atlanta. Georgia

x

Autores

Elizabeth M. Van Cott , M.D. Director, Coagulation Laboratory, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Boston. Massachusetts

Andre Van S te i r teghem, M.D.. Ph.D. Full Professor, Medical School; Scientific and Laboratory Director. Center for Reproductive Medicine, Medical School and University Hospital, Dutch-Speaking Brussels Free University. Brussels. Belgium

David S. V iswanatha , M.D Assistant Professor. Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine; Staff Hematopathologist. University of New Mexico Health Sciences Center. Albuquerque. New Mexico

Car los Alber to Von Mi ih len , M.D.. Ph.D. Full Professor of Rheumatology and Internal Medicine, Pontifical Catholic University School of Medicine, Porto Alegre, RS, Brazil

Judith A. W a d e , B Sc. Professor, Department of Surgery, and Faculty of Medicine, University of Toronto; Formerly Head, Histocompatibility Laboratory, Toronto Hospital University Health Network, Toronto. Ontario. Canada

Eric Wagner, Ph.D. Immunologist, Ste-Justine Hospital, Montreal. Quebec, Canada

David H. Walker, M.D. Professor and Chairman. Department of Pathology; Director, World Health Organization Center for Tropical Diseases. University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas

Victor W. W e e d n , M . D , J.D. Principal Research Scientist and Director of Biotechnology and Health Initiatives, Carnegie Mellon University, Pittsburgh. Pennsylvania

Ruth S. Weinstock , M . D , Ph.D. Professor of Medicine; Chief, Endocrinology. Diabetes and Metabolism; Medical Director. Joslin Diabetes Center. State University of New York Upstate Medical University; Chief. Endocrinology Veterans Affairs Medical Center, Syracuse, New York

Eduardo Delaflor Weiss , M.D. Attending Pathologist and Director, Transfusion Service, Monmouth Medical Center, Long Branch, New Jersey

Rober t E. Wenk , M.D.. M.S. Clinical Professor of Pathology. Pennsylvania State University, Hershey, Pennyivania; Clinical Associate Professor of Human Genetics, University of Maryland; Attending Pathologist, Division Head of Clinical Pathology, Sinai Hospital, Baltimore. Maryland

Fred W. Westenfe ld , MT(ASCP>SM Clinical Faculty. University o Vermont: Microbiology Manager (Chief Technologist) Fletcher Allen Health Care. Burlington. Vermont

David S. Wi lk inson , M . D . Ph.D. Professor and Chairman, Department of Pathology; Professor of Health Administration. Medical College of Virginia Campus. Virginia Commonwealth University. Richmond, Virginia

Washing ton C. W i n n , Jr., M . D , M.B.A. Professor of Pathology. University of Vermont College of Medicine; Director, Clinical Microbiology Laboratory, Fletcher Allen Health Care. Burlington, Vermont

Jeffrey L. Winters , M.D. Assistant Professor. Department of Pathology and Laboratory Medicine; Associate Director of the Blood Bank. University of Kentucky Chandler Medical Center: Associate Medical Director. Central Kentucky Blood Center; Director of Transfusion Service. Cooper Drive Division of the Veterans Affairs Medical Center, Lexington, Kentucky Hemapheresis

Gail L. W o o d s , M.D. Professor of Pathology; Director. Clinical Microbiology, University of Texas Medical Branch. Galveston. Texas

J a m e s T . W u , PhD Professor of Pathology, University of Utah Health Science Center; Director of Special Chemistry Laboratory. Associate Regional University Pathologists (ARUP). Salt Lake City. Utah

Margaret Yungbluth, M.D. Associate Professor of Clinical Pathology, Northwestern University Medical School. Chicago: Staff Pathologist, St. Francis Hospital. Evanston, Illinois

E d m o n d J. Yunis, M.D. Professor, Department of Pathology. Harvard Medical School: Director. HLA Laboratory, Dana-Farber Cancer Institute. Boston. Massachusetts

J a m e s C. Z imr ing , M . D . Ph.D. Pathology Resident, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University. Atlanta. Georgia

CAPTULO 33 ALMACENAMIENTO DE TEJIDOS Y CLULAS MADRE 811

de la sangre perifrica tanto de pacientes como de donantes normales e incluso de placenta o sangre de cordn.

Clulas madre de sangre perifrica El impulso para el desarrollo de tecnologas que permitieran la recogida

de CMH de sangre pentrica fue su uso potencial para trasplante autlogo, en que el riesgo de contaminacin de la mdula con clulas tumorales es alto. Debido a la relativa facilidad de recogida de mdula sea por hemaf-resis, las clulas madre obtenidas de sangre perifrica se usan de forma creciente en el entorno alognico. Un rea de gran importancia puede ser la donacin de no familiares o voluntarios, en la que ms individuos pueden prestarse de forma voluntaria para los programas nacionales de donacin de mdula cuando la hemafresis se ofrece como opcin frente a la recogi-da tradicional de mdula sea. El procedimiento e instrumentacin utiliza-dos para la recogida de clulas madre de sangre perifrica se describen el Capitulo 32.

De forma clara, la mayor ventaja de las clulas madre obtenidas de sangre perifrica frente a la mdula sea es el tiempo de injerto de neutrfilos y pla-quetas, con una media de 8 a 12 das para las clulas madre de sangre peri-frica frente a las dos a cuatro semanas de la mdula sea (Gianm, 1989). Esta rpida recuperacin claramente reduce la morbimortalidad asociada por neutropenia/trombopenia graves, asi como los costes asociados a la estancia hospitalaria, soporte transfusional. tratamiento de complicaciones y dems.

Se saba que las CMH estaban presentes en sangre perifrica tras la recu-peracin de la quimioterapia (Richman. 1976). pero quedaba pendiente el desarrollo de sistemas de hemafresis que permitieran una recogida segura de un adecuado nmero de estas clulas para proporcionar el injerto al receptor tras la quimioterapia (Kessmger. 1988). En la mayor parte de pacientes para trasplante autlogo. se ha establecido actualmente la recogi-da de un gran volumen de afresis I14-201/ procedimiento) como un proce-dimiento eficaz para recoger un nmero adecuado de CMH en un razonable nmero de procedimientos para proporcionar una recuperacin hematopo-ytica adecuada.

Las CMH son morfolgicamente indistinguibles de otras clulas mononu-cleares de la mdula sea o sangre perifrica, por lo que resulta esencial la recogida de un nmero adecuado de clulas para asegurar el injerto medular en el receptor. El objetivo tradicional para las recogidas de muestras de mdula sea persegua obtener un nmero suficiente de clulas nucleadas que permitiera asegurar un nmero mnimo de clulas madre. Los injertos de mdula sea pueden tambin ser evaluados para la actividad de clulas madre mediante el uso de tcnicas de unidades formadoras de colonias (UFCs) (Iscove. 1971). Una muestra de clulas mononucleares del injerto se cultiva en medio de metilcelulosa con suplementos de factores de crecimien-to hematopoyticos y aminocidos esenciales durante 10 a 14 das. Al final de este periodo, se examinan las placas buscando el nmero y caractersti-cas de las CFU, incluyendo Unidades Formadoras de Colonias Eritroblsticas (BFU-E), Unidades Formadoras de Colonias Granulociticas (CFU-GM) y Uni-dades Formadoras de Colonias mixtas de granulocitos, eritrocitos, monocitos y megacanocitos (CFU-GEMM). Los grupos celulares que contienen ms de 50 clulas se valoran como una colonia. Las muestras con ms de 1 x 10: UFC por kg de peso del receptor se consideran adecuadas. A medida que la reco-gida de clulas madre evolucion hacia el uso de procedimientos de hemaf-resis de sangre perifrica, se hizo necesario desarrollar un mtodo que se

pudiera realizar en el mismo da y que determinara el nmero de muestras de hemafresis necesarias. El mtodo ms aceptado para valorar las muestras de clulas madre de sangre perifrica es la cuantificacin del nmero de clu-las con antigeno CD34 por citometria de flujo. El antigeno CD34 se encuen-tra limitado a las clulas primitivas de todas las estirpes (Civin, 1989). La reco-gida de productos de hemafresis utilizando el recuento de clulas CD34-como ndice de la eficacia del injerto se ha mantenido para el injerto hemato-poytico (Berenson. 1991). La estandarizacin de la valoracin de las clulas CD34 y la disponibilidad de los anlisis de citometria de flujo han ocasionado que la medida de las clulas CD34+ se utilice por la mayor parte de los pro-gramas para determinar el nmero y adecuacin de las muestras de clulas madre de sangre perifrica (Sutherland, 1994). Generalmente, las muestras de clulas madre de sangre perifrica con mas de 3 x 10f clulas CD34+ por kg de peso corporal del receptor se consideraban adecuadas para conseguir el injerto de neutrfilos entre 8 y 10 das.

La recogida de CMH en el paciente no "movilizado' o donante requerira mltiples procedimientos de recogida y afresis, dado que el nmero de CMH en sangre perifrica se encuentra entre 1/10 y 1/100 del nmero de clulas en la mdula. En consecuencia, se requieren terapias de "movili-zacin" para aumentar el numero de CMH circulantes y mejorar la eficien-cia de la recogida por hemafresis. Richman (1976) descubri que mien-tras hay una cada en el nmero de clulas CD34+ circulantes despus de la quimioterapia, esto era seguido por un aumento entre 4 y 5 veces en el porcentaje de clulas CD34+ a medida que el recuento absoluto de neu-trfilos comenzaba a recuperarse, a menudo entre 14 y 21 das despus de la terapia. Este aumento en clulas CD34+ circulantes es mayor con agentes quimioterpicos como citoxano y etopisida. Si la recogida por hemafresis se realiza en este periodo ventana, se pueden recuperar gran-des nmeros de CMH con un limitado numero de procedimientos, incluso aunque el recuento total de leucocitos sea menor de 10.000'ul. Como el periodo de aumento de clulas CD34+ circulante es breve (dos a tres das), son crticos un estrecho control del recuento de leucocitos y clulas CD34+ circulantes del paciente, as como el control de los tiempos de reco-gida por hemafresis. Adems, algunos investigadores han sealado que la recogida de CMH en la fase de recuperacin tras quimioterapia reduce la probabilidad de contaminacin por clulas tumorales en el producto de afresis. El uso de factores de crecimiento hematopoytico como el Factor Estimulante de Colonias de Granulocito-Macrfago (GM-CSF) y el Factor Estimulante de Colonias de Granulocito (G-CSF) produce igualmente un aumento significativo en el nmero de clulas CD34+ en sangre perifrica (Siena, 1989). Dosis de 5 a 10 ug/kg de peso corporal durante 4 a 5 das causan un aumento de 5 a 10 veces en el nmero de CMH en sangre peri-frica. El uso de G-CSF aislado ha probado ser ms eficiente que el ceba-do con quimioterapia para la recogida de clulas CD34*. La combinacin de cebado con quimioterapia y el uso de factores de crecimiento (en espe-cial G-CSF) provoca la mxima movilizacin de clulas madre pluripoten-ciales en sangre perifrica, as como la necesidad de menor nmero de procedimientos de hemafresis para recoger una dosis de CMH para tras-plante, una estrategia empleada por la mayor parte de los programas de trasplante autognico.

Se ha investigado el uso de G-CSF en el donante alognico sano para movilizar CMH y. salvo efectos leves como dolor seo y cefalea, resulta bien tolerado (Anderlmi. 1997). De forma creciente, los programas de trasplantes

Tabla 33-6 Comparacin de las tuentes y productos de clulas madre hematopoyticas. Lugar de recogida y complicaciones

Sangre de cordn (CMSC) Autlogas

(CMMO + CMSP) Alognicas

(CMMO + CMSP) Tipo de donante Sangre de cordn umbilical Paciente Donante compatible familiar o no Producto Clula madre de sangre de cordn Mdula sea o CMSP Mdula sea o CMSP Lugar de recogida Cordn umbilical de placenta

en el nacimiento Mdula intraoperatona o

hemafresis Mdula intraoperatona o hemafresis

Complicacin principal Insuficiencia de clulas madre Recurrencia de la enfermedad original

Enfermedad injerto contra husped

CMSP= clulas madre en sangre perifrica; CMMO= clulas madre en medula Osea; CMSC= c l u l a s madre en sangre de cofdon

8 1 2 SECCIN IV HEMATOLOGA, C O A G U L A C I N Y MEDICINA TRANSFUSIONAL

estn utilizando sangre perifrica como fuente de CMH en lugar de mdula sea, tanto para trasplantes alognicos como autognicos.

Sangre de cordn umbilical

Durante muchos aos, se saba que gran cantidad de unidades formado-ras de colonias o clulas madre estaban presentes en la sangre del cordn umbilical, pero no fue hasta 1989 que se realizaron los primeros ensayos para utilizar clulas recuperadas de cordn umbilical de placenta para el trasplante hematopoytico (Gluckman. 1989). El xito aparente de muchos de estos trasplantes precoces de sangre de cordn ha dado lugar a la orga-nizacin de diferentes bancos de clulas de cordn en EE.UU. y en Europa en un intento por proporcionar otra fuente de clulas madre para los pacien-tes que necesitan un trasplante alognico. Adems, como las clulas madre se obtienen de sangre del cordn, parece haber un mayor grado de toleran-cia para algunos tipos de incompatibilidad HLA entre donante y receptor sin que aparezcan los grados 3 4 de la GVH. Como consecuencia, el tras-plante podra estar disponible para algunos pacientes que de otra forma no tienen donante HLA compatible (Cairo, 1997). Las clulas madre de cordn umbilical se obtienen por canulacin de los vasos placentarios, con la pla-centa todava in tero o ms frecuentemente, despus del parto o por expre-sin directa de la sangre del cordn de la placenta despus del mismo. El nmero de CMH recuperadas es directamente proporcional al volumen de sangre de cordn recogido, lo que depende del tamao del nio/placenta y tambin de la experiencia del personal que recoge la muestra (Wagner. 1992). Volmenes entre 40 y 150 mi son frecuentes en centros con experiencia. Esto permitir obtener, aproximadamente, una muestra de 4 a 11 x 106 clulas nucleadas. Las muestras de volumen insuficiente (

CAPTULO 33 ALMACENAMIENTO DE TEJIDOS Y CLULAS MADRE 8 1 3

Tabla 33-8 Mtodos de deplecin de linfocitos Leclinas

Lectina de soja con formacin de rosetas E Centrifugado a contracorriente Inmunolgicos

Anticuerpos + complemento Anticuerpos + lase slida

Seleccin positiva

La dilucin a contracorriente es un mtodo utilizado para la deplecin de clulas T que utiliza la separacin caracterstica de clulas en un campo de centrifugado, de acuerdo con el tamao y densidad de las diversas pobla-ciones celulares. Una de las ventajas del sistema es que no se aaden agentes quimioterpicos o anticuerpos a la poblacin de clulas madre hematopoyticas, por lo que no se deteriora su funcin celular. Los concen-trados de capa leucoctica a partir de mdula sea se introducen en la cen-trfuga a diferentes velocidades de giro, permitiendo la recogida de fraccio-nes celulares de diferentes tamaos y densidades. El sistema posee una alta eficiencia en la separacin de la fraccin rica en CFU-GM de la fraccin de linfocitos CD3+. Como no se provocan cambios en las clulas, la frac-cin CD3+ puede ser cuantificada y parcialmente aadida de nuevo a la faccin CFU-GM para proporcionar una dosis controlada de clulas CD3+. si se desea clnicamente (Noga, 1990). La recuperacin celular es alta y. como los medios de dilucin son biocompatibles. los productos se pueden redifundir sin etapas de lavado adicional. La principal desventaja del proce-dimiento es el coste del equipo necesario y la necesidad de personal expe-rimentado.

La introduccin de tcnicas con esferas inmunomagnticas para la selec-cin positiva de clulas CD34+ ha llevado al uso de estas tcnicas en el tras-plante alognico para la deplecin resultante de clulas T CD3+, en especial de muestras obtenidas de clulas madre de sangre perifrica. La tecnologa con esferas inmunomagnticas se aplica con facilidad a las clulas madre obtenidas por hemafresis as como a los productos de mdula sea de gran volumen. Muchos centros han comunicado xitos con estos nuevos mtodos en la reduccin de clulas T CD3+ en trasplantes alognicos. en especial cuando donante y receptor no son totalmente HLA-compatibles (Henslee-Downey, 1997).

Otra ventaja adicional tanto de las tcnicas de depuracin como de selec-cin positiva es que ambas producen un volumen significativamente inferior de clulas madre para congelacin, recuperacin y reinfusin al paciente. Esto reduce de forma importante la toxicidad asociada con la difusin de pro-ductos que contienen DMSO, al tiempo que reduce los costes derivados de la congelacin y almacenamiento para el laboratorio de clulas madre. En el momento actual, las tcnicas autorizadas para la depuracin y/o seleccin positiva para reducir la contaminacin por clulas tumorales son costosas, y se necesitan datos adicionales para valorar la eficacia clnica de estos proce-dimientos en la reduccin de clulas tumorales. Algunos centros han comuni-cado un mejor pronstico mediante el empleo de una combinacin de ambas, depuracin y tcnicas de seleccin positiva (Clarke, 1998).

Las tcnicas de seleccin tanto positiva como negativa producen una prdi-da concomitante de hasta un 50% en el nmero original de clulas CD34+, tan-to por toxicidad de diversos agentes (quimioterpicos, complemento), atrapa-miento de complejos en esferas magnticas, o prdida durante etapas necesarias de lavado. Para solucionar este problema, el nmero de clulas CD34+ recogidas en la hemafresis inicial y en la extraccin de mdula sea debe aumentarse para contrarrestar la prdida posterior durante el procesado. Esto puede ser difcil de cumplir en pacientes que son difciles de "movilizar".

La principal desventaja de la deplecin de clulas T es el aumento resul-tante en la incidencia de recidivas. Los pacientes con formas leves de GVH parecen tener una menor incidencia de recidiva que aquellos pacientes que no muestran GVH. La presencia de la poblacin de clulas T del donante parece ser crtica en la reaccin "injerto contra leucemia", en el reconoci-miento de los antigenos del husped por las clulas del donante que genera una respuesta inmune que elimina las clulas tumorales de husped. Estu-

dios ms recientes tambin han demostrado un papel de las clulas asesinas naturales (NK) en la reaccin "injerto contra leucemia". Otros han empleado combinaciones de tcnicas como la seleccin de CD34+ y dilucin a contra-corriente para crear dos poblaciones celulares, una rica en clulas CD34+ y otra rica clulas NK con deplecin de clulas T, aprovechando el hecho de que las clulas NK parecen tener efecto antitumoral pero no contribuyen a la GVH (Skiera, 1999).

Criopreservacin de injertos hematopoyticos Los injertos de CMH de origen autognico y muchas muestras alognicas

se criopreservan y almacenan antes de su uso. El protocolo ms frecuente uti-liza DMSO al 10% como agente protector, congelacin a ritmo controlado y almacenamiento en nitrgeno liquido, tanto en fase liquida como vapor. El uso de DMSO proporciona una importante mejora en la viabilidad tras la descon-gelacin frente a agentes como el glicerol. Dado que existe una toxicidad aso-ciada con la infusin de productos de clulas madre con DMSO, otros inves-tigadores se han dirigido al uso de bajas concentraciones, adicin de hidroxietilalmidn u otros aditivos, pero el DMSO se sigue usando en la mayo-ra de los programas. Al intentar lavar los productos despus de la desconge-lacin para reducir la cantidad de DMSO presente, se produjo una prdida significativa de clulas madre. Las estrategias se dirigen en ese momento a reducir el volumen del producto antes de su congelacin, reduciendo de esta forma la cantidad necesaria de DMSO.

Reinfusin de productos de clulas madre Independientemente de la fuente del injerto de clulas madre, las CMH se

infunden al paciente de forma similar a la transfusin de cualquier producto sanguneo. Las clulas madre pluripotenciales. dotadas de un receptor de membrana nico, se dirigirn al espacio medular, reinjertndose y replicn-dose. Los productos que han sido criopreservados con DMSO, en su mayor parte son descongelados e inmediatamente remfundidos sin lavar. Las CMH recogidas por hemafresis sin procesado ulterior pueden contener gran can-tidad de eritrocitos. La criopreservacin con DMSO no conserva la integridad de la membrana del glbulo rojo, por lo que estos productos contienen una gran cantidad de hemoglobina libre cuando se recuperan. Las reacciones en el receptor oscilan desde leves caracterizadas por nusea, escalofros o cefa-lea, hasta reacciones ms graves, que pueden incluir hipotensin, sepsis, insuficiencia renal o incluso parada cardaca (Stroncek, 1991). Estas reaccio-nes se muestran en la Tabla 33-9. Los receptores de clulas madre criopre-servadas generalmente reciben premedicacin con antihistaminicos y/o antiemticos. Tambin la hidratacin y el uso de diurticos estn indicados para reducir los efectos secundarios producidos por la administracin de hemoglobina libre y el volumen de lquido infundido.

Tabla 33-9 Reacciones adversas observadas en pacientes transfundidos con productos de clulas madre criopreservadas

Frecuentes Escalofros Nuseas Vmitos Fiebre Cefalea Disnea

Inlrecucntes Insuficiencia renal Parada cardiaca Hipotensin Sepsis

Factores asociados Volumen de tejido reinfundido Tipo y cantidad de crioprotector reinlundido Volumen de eritrocitos incompatibles (productos alognicos) Contaminacin bacteriana

8 1 4 SECCIN IV HEMATOLOGA, COAGULACIN Y MEDICINA TRANSFUSIONAL

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S E C C I N V

Inmunologa e inmunopatologa Richard A. McPherson, M.D. John Bernard Henry, M.D.

C A P T U L O 3 4

" Visin general del sistema inmune y de los trastornos nmunolgicos

RICHARD A. MCPHERSON, M.D.

CLULAS LINFOIDES Linfocitos T Linfocitos B

Clulas presentadoras de antgeno Clulas NK

CLULAS NO LINFOIDES Neutrfilos y eosinfilos Basfilos y mastocitos

FACTORES HUMORALES

Inmunoglobulinas Complemento Citocmas

817

819

819

ANTGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MECANISMOS DE DAO INMUNOLGICO APLICACIONES CLNICAS DEL ANLISIS

INMUNOLGICO BIBLIOGRAFA

820

820

820 820

El sistema inmunolgico est estructurado para reconocer, responder y destruir a una amplia variedad de organismos invasores como las bacterias, virus, hongos y parsitos, que de otro modo, seran capaces de promover infecciones dainas para el cuerpo. El descubrimiento de los componentes del sistema inmune a menudo ha venido del estudio de infecciones serias y de las reacciones especficas que emplea el cuerpo para combatir los orga-nismos patgenos. En general, esta funcin inmunolgica se puede resumir como la bsqueda de antigenos extraos que no pertenecen al cuerpo y su destruccin. En este proceso, el sistema inmune mantiene una vigilancia de la aparicin de antgenos nuevos extraos en clulas tumorales y trata de destruirlas dejando ilesos los antgenos normales presentes en clulas sanas. Los estados de enfermedad pueden surgir debido a que diversos aspectos de la funcin inmunolgica se vean afectados. stos incluyen reacciones de hipersensibilidad, varias inmunodeficiencias, trasplantes alognicos de rga-nos o tejidos, la enfermedad de injerto contra husped: la bsqueda de la tole-rancia en los trasplantes contina. Este capitulo resalta los componentes del sistema inmune y sus funciones y algunas de las afecciones clnicas de la inmunidad mas significativas.

CLULAS LINFOIDES

Las clulas linfoides del cuerpo incluyen las clulas de los ganglios linfti-cos, bazo, clulas de las superficies mucosas y clulas circulantes de la san-gre. Derivan de clulas madre hematopoyticas multipotentes. que se produ-cen progresivamente desde el saco vitelino en el embrin, al hgado en el feto, y la mdula sea en el nio y durante las fases adultas (Weissman, 1994). Las diferentes clulas linfoides se identifican por la presencia de marcadores pro-teicos nicos presentes en su superficie y que permiten a esas clulas des-empear determinadas funciones.

Linfocitos T Los linfocitos T se diferencian en el timo. Tras su origen en la mdula sea,

pasan de la corteza a la mdula timica y durante este proceso sufren la madu-racin. Este proceso implica una seleccin, de modo que las clulas que reac-cionan con antgenos propios se eliminarn, mientras que se retienen otras clulas capaces de reconocer antgenos mediante interacciones con molcu-las del complejo de histocompatibilidad (MHC) (von Boehmer, 1994; Nossal. 1994). Los linfocitos T constituyen entre un 60% y un 70% de todos los linfo-citos en la sangre, y se encuentran tambin en zonas paracorticales de gan-glios linfticos y dentro de las vainas periartenolares del bazo. Durante su maduracin, sufren una programacin gentica, en la cual el gen para el receptor de antgeno de la clula T (TCR) se reordena para dar receptores proteicos que son invariantes en su especificidad antignica, durante toda la vida de ese linfocito y de sus clulas descendientes.

La mayora (>95%) de los linfocitos T tienen receptores de antgeno com-puestos por subunidades u y |5 unidas por puentes disulluro, formando un heterodmero que se encuentra en la membrana exterior asociado al comple-jo molecular CD3 (CD3 es un marcador para clulas T). Las subunidades pro-teicas

8 1 8 SECCIN V INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

gnico de su TCR, o un espectro completo de estos reordenamientos, tal y como ocurre normalmente en una poblacin linfocitaria heterognea.

El anlisis de linfocitos T mediante citometria de flujo emplea una variedad de marcadores de superficie. El CD4 se encuentra en un 60% de clulas CD3-; estos son linfocitos T cooperadores/inductores que dirigen la funcin de otras clulas del sistema inmune secretando citocinas que estimulan varias funciones. Existen dos subpoblaciones de clulas CD4+: TH1, que secreta interleucma 2 (IL-2) e interfern-y (IFN-y); y T2. que secreta IL-4 e IL-5. Las clulas T1 facilitan las actividades de los macrfagos como la hipersen-sibilidad y la produccin de anticuerpos con accin opsonizante; las clulas T,,2 dirigen la sntesis de otros anticuerpos: El marcador CD8 se encuentra en un 30% dlas clulas T (asi, la relacin de clulas CD4 y CD8 en sangre es tpicamente 2:1). Estas clulas T CD8+ presentan actividad citotxica y supre-sora en la respuesta inmune.

El mecanismo de reconocimiento antignico es diferente entre los dos sub-tipos de linfocitos T. Las molculas CD4 se unen a las molculas de MHC de clase II presentes en las clulas presentadoras de antigeno, mientras que las molculas de CD8 interaccionan con molculas de MHC de clase I. De acuer-do con esto, las clulas CD4+ reconocen antigenos slo en el contexto de MHC de clase II, y las clulas CD8+ los reconocen slo a travs de MHC de clase I.

Linfocitos B Los linfocitos B constituyen aproximadamente entre un 10% y un 20% de

los linfocitos perifricos en sangre, y adems se pueden encontrar en la mdula sea, ganglios linfticos, bazo y otros tejidos linfticos. En el bazo y ganglios se agregan para formar los folculos Imfoides. La diferenciacin de

clulas B se produce tanto en la mdula sea, donde tiene lugar una selec-cin negativa y positiva, como en localizaciones perifricas. La estimulacin antignica de las clulas B desencadena la formacin de clulas plasmticas que secretan inmunoglobulinas como base de la especificidad en la inmuni-dad humoral. El complejo receptor de antigeno de la clula B utiliza la inmu-noglobulina M (IgM) como componente de unin al antgeno. La especificidad antignica de las inmunoglobulinas deriva del proceso de reordenamiento, en el que tanto la cadena pesada como la ligera se reestructuran. La cadena pesada se divide en regin variable, de diversidad, de unin y constante, mientras que el gen de la cadena ligera tiene regiones variables, de unin y constantes. La maduracin de la respuesta mediada por anticuerpos implica el cambio de IgM a otra cadena pesada (normalmente IgG) debido a otro reor-denamiento gnico, aunque el tipo de cadena ligera de una clula B perma-nece fijado.

Las clulas B tambin presentan en su superficie receptores para el com-plemento (CD21. que es tambin el receptor para el virus de Epstein-Barr [EBV] y hace que estas clulas sean susceptibles de una infeccin por EBV) y para la regin Fe de las inmunoglobulinas: tambin presentan COI9 y CD20. que se usan a menudo para la identificacin inmunolgica de las clu-las B.

Clulas presentadoras de antgeno Los macrfagos funcionan como fagocitos mononucleares en procesos de

inflamacin, y tambin procesan los antgenos ingeridos y los presentan aso-ciados a molculas de MHC en su superficie (Fig. 34-1). Las clulas T no se activan con antgenos solubles y. por tanto, la presentacin de antgenos de este modo es necesaria para la estimulacin de clulas T y la induccin de la

Figura 34-1. Interacciones celulares del sistema inmune. Las clulas presentadoras de antigeno (APC) procesan antigenos (Ag) extemos o miemos y presentan los fragmentos peptdicos del antgeno, asociados a una molcula de MHC, a las clulas T. En la clula T, un TCR espe-cfico, junto con el correceptor CD4 o CD8. reconoce el complejo antigeno-MHC. La activacin celular tiene lugar a travs del complejo CD3 y la activacin de tirosin-cmasas (TK). El receptor de la clula B est compuesto por una molcula de Ig unida a la membrana que se encuen-tra formando un complejo con otras protenas de membrana, y el correceptor CD19/21. Cuando se produce el reconocimiento antignico. las TK celulares tambin se activan. La activacin coeslimuladora de clulas T o B la proporcionan los receptores celulares al unirse a sus ligan-dos (los ligandos B7 o B7.2 para la coestimulacin de la clula T a travs de las molculas CD28 y CTLA-4. y el ligando gp39 para la mol-cula CD40 de la clula B). (Adaptado de Paul W, Seder R: Lymphocytic responses and cytokines. Cell 1994; 76:229; y Weiss A. Littman D: Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell 1994; 76:263, con permiso).

CAPTULO 34 VISIN GENERAL DEL SISTEMA INMUNE Y DE LOS TRASTORNOS INMUNOLGICOS 8 1 9

inmunidad celular (Germain, 1994). Los macrfagos tambin secretan citoci-nas como la IL-1 para modular los procesos inflamatorios, y pueden lisar directamente clulas tumorales en su papel de inmunovigilancia. y adems, son tambin clulas efectoras en algunos tipos de inmunidad celular (por ej. la hipersensibilidad retardada).

Las clulas dendriticas (que se encuentran en tejidos linfoides y regiones intersticiales de otros rganos) y las clulas de Langerhans (presentes en la epidermis) poseen numerosas extensiones citoplasmticas enriquecidas en molculas de MHC de clase II. Por tanto, son muy eficientes en la presenta-cin antignica (aunque probablemente no sean fagocrticas) y se consideran muy importantes para esta funcin en todo el sistema inmune.

Clulas NK Las clulas NK (linlocitos citoliticos naturales) constituyen un 10%-15% de los

linfocitos en sangre perifrica. No son clulas T ni B y anteriormente se las lla-maba clulas nulas. Las clulas NK tienen la funcin de lisar otras clulas sin necesidad de una previa sensibilizacin. Pueden atacar clulas tumorales. infec-tas con virus y otras; por tanto, forman la defensa inicial frente a clulas abe-rrantes. Las clulas NK se caracterizan por los marcadores de superficie CD16 y CD56, los cuales se emplean habitualmente para su identificacin. CD16 es el receptor para la regin Fe de la IgG y por tanto las clulas NK son capaces de lisar selectivamente aquellas clulas que se encuentran recubiertas de anticuer-pos (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos [ADCC: antibody-depen-dent cell-mediated cytotoxicity], importante en algunas reacciones de hipersensi-bilidad). Las clulas NK tambin secretan cilocinas como el IFN-y. Curiosamente, las clulas NK se pueden reconocer en una preparacin de un frotis de sangre tenido, como linfocitos grandes y granulosos.

CLULAS NO LINFOIDES

Estas clulas no estn programadas genticamente para reconocer ant-genos especficos o interaccionar con clulas linfoides en la induccin de una respuesta inmune. En su lugar, son electores de reacciones inmunes desen-cadenadas por diversos factores.

Neutrfilos y eosinfilos Los neutrfilos llegan a las regiones de inflamacin por la accin de qui-

mioatrayentes; entonces vierten sustancias txicas y enzimas de sus granu-los que digieren indiscriminadamente estructuras celulares; los neutrfilos tambin ingieren restos celulares al igual que los eosinfilos. retirndolos de los tejidos.

Basfilos y mastocitos Los basfilos (y su equivalente en los tejidos, los mastocitos) presentan en

su superficie receptores que se unen a IgE. La unin de IgE en la membrana de los basfilos no es especfica del antgeno que reconoce la IgE. sino que es el resultado de la suma de la accin de la cantidad total de IgE y los bas-filos disponibles. Cuando el antgeno (o alrgeno) entra en contacto con su IgE especifica presente en la superficie del basfilo. la clula se activa y secreta sustancias como las histaminas que median algunas hipersensibilida-des. Asi, la especificidad de un basfilo est dirigida por la IgE que tiene unida a su superficie desde la sangre; tericamente, un basfilo podra tener mlti-ples molculas de IgE diferentes en su superficie y podra, por tanto, reaccio-nar con muchos alrgenos diferentes.

FACTORES HUMORALES

Inmunoglobulinas Las molculas de anticuerpo pueden estar unidas a la superficie de clu-

las B para estimular la secrecin de ms inmunoglobulinas: tambin pue-den circular por la sangre y aparecer en las superficies mucosas de los tractos respiratorio y gastrointestinal, donde es probable que entren en contacto con microorganismos patognicos. Las principales inmunoglobu-

linas en sangre son la IgM, IgG y la IgA: estos anticuerpos provienen de la exposicin continuada a multitud de antgenos extraos y pueden perma-necer durante aos mediante una secrecin continuada para sustituir a aquellas molculas que se pierden mediante la limpieza normal de prote-nas circulantes. En las superficies mucosas, el principal tipo de anticuerpo es la IgA en una forma dimrica especial que resulta de su secrecin a ese lugar (vase Captulo 37). Las otras inmunoglobulinas son la IgD (que resi-de en la superficie de clulas B donde puede estar involucrada en la trans-duccin de la seal inmunolgica. pero no adquiere concentraciones importantes como molculas libres en la sangre) y la IgE (que funciona a travs de su unin a la superficie de basfilos y estimula la secrecin de sustancias vasoactivas de esas clulas en presencia de alrgenos espec-ficos).

Las inmunoglobulinas de la sangre funcionan unindose a los antigenos invasores en la superficie de clulas extraas, bacterias, virus, etc. y facili-tando su destruccin mediante efectores inespecficos como el complemen-to y las clulas NK. La monitonzacin de enfermedades mediante el anli-sis de inmunoglobulinas incluye un anlisis cualitativo para la deteccin clo-nal frente a la policlonal (p. ej., para el diagnstico de mieloma mltiple) y anlisis cuantitativo tanto para concentraciones totales de IgM, IgG e IgA (para detectar posibles deficiencias selectivas o combinadas o la sobrepro-duccin de tipos de inmunoglobulinas) y para ttulos de anticuerpos espec-ficos frente a antigenos individuales (como las isohemaglutininas, neumo-cocos, Haemophilus. ttano, difteria u otros microorganismos)

Complemento Este conjunto de protenas que interaccionan entre si tiene el papel de des-

truir enzimticamente las dianas (p. ej.. clulas, bacterias) a las que les diri-gen los anticuerpos u otros medios (vase Captulo 38). La medida de los componentes del complemento tiene dos utilidades fundamentales en el diag-nstico clnico: detectar deficiencias congnitas (que son relativamente infre-cuentes) que pueden suponer una predisposicin a ciertas enfermedades como infecciones o la progresin hacia enfermedades autoinmunes) y para detectar reducciones adquiridas que reflejan una actividad en el momento de anlisis de una enfermedad autoinmune sistmica como puede ser el lupus eritematoso sistmico.

Citocinas Estas sustancias solubles son el medio por el que se regulan las res-

puestas inmunes celulares; son mediadores que actan a corto plazo y que son elaborados por algunas clulas y difunden a otras clulas donde act-an (Paul, 1994). Muchas citocinas son pleiotrpicas en el sentido de que pueden aduar sobre muchos tipos celulares diferentes. Pueden actuar de forma endocrina estimulando clulas a una cierta distancia; pueden actuar sobre clulas que se encuentran en el espacio inmediato (estimulacin paracrina); tambin pueden estimular a las propias clulas que las han secretado (autocrina). Las acciones especficas de las citocinas incluyen la hematopoyesis mediante los factores estimulantes de colonias (CSFs) que inducen la produccin de granulocitos y macrfagos. respuestas de inmu-nidad natural (mediante IL-1. factor de necrosis tumoral-i/ [TNF-u], inter-ferones e IL-8), estimulacin de la multiplicacin y activacin de linfocitos (mediante IL-2 y otros), y la activacin inespecifica de clulas inflamatorias (vase Captulo 39). Todava se estn descubriendo nuevas citocinas a medida que van apareciendo ms detalles sobre la comunicacin clula-clula.

El uso clnico de las citocinas incluye tanto la supresin de la respuesta inmune en el trasplante de rganos alognico mediante frmacos como la ciclosponna que inhibe la produccin de IL-2, y la estimulacin de la res-puesta inmune en terapias frente al cncer o a infecciones. Estos ltimos tra-tamientos son en su mayora experimentales, aunque trabajos recientes han demostrado que el pretratamiento con anticuerpos frente al TNF-u puede pre-venir las reacciones de Jarisch-Herxheimer que resultan del tratamiento con antibiticos de infecciones de Borrelia recurrentis en ovejas (Fekade. 1996). Este modelo probablemente presagia un conjunto de nuevas terapias median-te las cuales las respuestas inmunes se estimularn o inhibirn selectiva-mente de acuerdo con las necesidades clnicas concretas.

820 SECCIN V INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

ANTGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD

El MHC (tambin denominado complejo antignico leucocitario humano. HLA) se encuentra codificado en el cromosoma 6 e incluye molculas de la Clase I (HLA A, B y C). molculas de la Clase II (HLA DP. DQ. y DR) y las molculas de la Clase III que incluyen algunos componentes del sitema del complemento y el TNF-u y TNF-|i (vase Captulo 40). Las funciones de los antigenos de las clases I y II ya se han analizado brevemente en cuanto a su participacin en la presentacin antignica a clulas T. Estos antgenos fue-ron descubiertos y su naturaleza altamente polimrfica fue descrita en eslu-dios de tolerancia inmunolgica y en el rechazo de trasplantes de rganos alognicos. En consecuencia, una de las utilidades clnicas ms importantes del tipo HLA reside en el emparejamiento de donantes potenciales de rga-nos o tejidos con receptores que necesitan dicho trasplante. Otra aplicacin clnica significtiva es el tipo de pacientes afectados y de miembros de sus familias para establecer el riesgo de desarrollar algunas enfermededades que se encuentran asociadas a tipos de HLA concretos (p. ej., la espondilitis anquilosante con HLA B27) (vase Captulo 41). Otra aplicacin ms del tipo HLA es el suministro de plaquetas compatibles a pacientes que se han hecho refractarios a las transfusiones de plaquetas debido a la formacin de anti-cuerpos anti-HLA tras ser expuestos a mltiples donantes (p. ej., tras las transfusiones de apoyo empleadas en los casos de quimioterapia o trasplan-tes de clulas progenituras hematopoyticas (HPC) (vase Captulo 31).

MECANISMOS DE DAO INMUNOLGICO

Las respuestas inmunologas pueden daar tejidos normales adems de los organismos invasores que han desencadenado una respuesta. Estas res-puestas se clasifican en cuatro tipos de hipersensibilidad. El tipo I es de natu-raleza anafilctica o alrgica: est mediada por la IgE unida a la superficie de basfilos y mastocitos. Cuando antgenos especficos (o alrgenos) se unen a la IgE de superficie, los basfilos se estimulan y liberan la histamina y otras sustancias vasoactivas que son los mediadores inmediatos de las reacciones alrgicas. Estrategias clnicas para el tratamiento de asma y alergias han empleado distintos aspectos de la secuencia de eventos, desde contrarrestar los efectos de la histamina hasta la desensibilizacin. Un estudio reciente emple con xito un anticuerpo monoclonal humanizado frente a la IgE para el tratamiento de estos individuos (Milgrom, 1999): esta terapia podra, en el futuro, basarse en parte sobre las medidas de la concentracin de IgE en suero.

El tipo II ocurre cuando los anticuerpos se unen a antgenos presentes en la superficie celular; el dao puede ocurrir mediante la unin y activa-cin del complemento (p. ej., hemolisis inmune), mediante la citotoxicdad celular dependiente de anticuerpos (p. ej.. la lisis de clulas tumorales o de parsitos) o interferencia con funciones celulares por parte de los anti-cuerpos (p. ej., autoanticuerpos frente a los receptores de acetilcolina en la miastenia gravis).

El tipo III resulta de la formacin de inmunocomplejos, entre antgenos ex-genos como bacterias o virus y anticuerpos; o entre autoantgenos endge-nos y autoanticuerpos. El dao tisular tpico ocurre en rganos que contienen numerosos vasos sanguneos pequeos donde los inmunocomplejos circu-lantes se depositan o en lugares donde se producen de forma natural los anti-genos endgenos.

El tipo IV est mediado por clulas, tambin se denomina hipersensibilidad retardada, y depende del funcionamiento de las clulas T CD4+ o de la cito-toxicidad de clulas T CD8+. El tipo IV es la base de la reaccin inmune fren-

te a virus, hongos, protozoos, parsitos y tambin microbios intracelulares como mycobacterias. Los pacientes con el sndrome de la mmunodeficiencia adquirida (sida) son susceptibles a infecciones por estos y otros agentes oportunistas cuando pierden sus clulas T CD4+.

APLICACIONES CLNICAS DEL ANLISIS INMUNOLGICO

Las principales reas de aplicacin clnica de los ensayos inmunolgicos son las enfermedades autoinmunes, el trasplante de rganos/tejidos y su rechazo, las inmunodeficiencias y las alergias

La enfermedad autoinmune puede ser sistmica (vase Capitulo 43), estar restringida a rganos especficos (vase Captulo 45) o puede implicar vas-culitis (vase Captulo 44). Muchos de los ensayos se basan en tcnicas que emplean anticuerpos antinucleares seguido de un ensayo confirmatorio con autoantigenos especficos como puede ser el ADN de doble hebra. Otros autoanticuerpos se pueden identificar mediante ensayos de inmunofluores-cencia indirecta que emplean secciones de rganos para identificar autoanti-cuerpos especficos como aquellos que se dirigen frente al msculo liso, mito-condnas. clulas parietales y dems. Los avances tecnolgicos han propor-cionado fuentes purificadas de muchos autoantgenos importantes que for-marn parte de ensayos futuros para autoanticuerpos ms especficos y que permitan una automatizacin ms eficaz.

La terapia inmunosupresora para el rechazo de trasplantes alognicos y las mmunodeficiencias se basan en la bsqueda de subpoblaciones linfocitarias con una particular importancia de las clulas T y de las CD4+. Ademas, los estados de inmunodeficiencia congnita requieren un anlisis ms detallado de los elementos celulares y humorales del sistema inmune, comenzando generalmente con una batera de ensayos convencionales para analizar la presencia y (uncin de linfocitos. inmunoglobulinas y complemento, y pasan-do, cuando es necesario, a ensayos muy esotricos en la bsqueda de des-rdenes menos frecuentes (vanse Captulos 36 y 42).

Los trastornos alrgicos se evalan tpicamente a travs de ensayos en la piel, medida de la concentracin total de IgE en suero, y la cuantificaaon de la reactividad especfica de la IgE en suero con alrgenos comunes de la comida, el polen y otros factores ambientales (vase Capitulo 46).

A medida que surjan nuevos descubrimientos sobre las funciones inmuno-lgicas y aparezcan nuevas terapias, los laboratorios de diagnstico clnico probablemente tengan la oportunidad de ofrecer medidas de muchos mas factores y actividades, para establecer diagnsticos correctos y monitorizar y ajustar los tratamientos.

BIBLIOGRAFA Fekade D. Knox K. Hussein K, et al: Prevention ol Jansch-Herxheimer reactions Dy

treatment with antibodies against tumor necrosis lactor c. N Engl J Med 1996: 335:311.

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76:263. Weissman I: Developmental switches in the immune system Cell 1994; 76:207.

C A P T U L O 3 5

Inmunoensayos e inmunoqumica Yoshihiro Ashihara, Ph.D. Yasushi Kasahara, Ph.D., D.M.Sc. Robert M. Nakamura, M.D.

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA 821 Caractersticas generales de la reaccin

antgeno-anticuerpo Caractersticas de los antgenos Caractersticas de los anticuerpos Cintica de la reaccin antigeno-anticuerpo

VISIN GLOBAL DE LOS PRINCIPIOS GENERALES DE LOS INMUNOENSAYOS 823 Tipos de inmunoensayos Qumica de conjugacin Caractersticas de la fase slida

INMUNOENSAYOS DE PRECIPITINA Y NEFELOMTRICOS 824 Origen y principios de la reaccin de precipitina

INMUNOENSAYOS DE PARTCULAS 825 Principio de aglutinacin de partculas Resumen

RADIOINMUNOENSAYO 830 Origen Principios y mtodos del ensayo Resumen

INMUNOENSAYO ENZIMTICO 833 Origen y clasificacin Inmunoensayos enzimticos heterogneos Inmunoensayos enzimticos homogneos Resumen

INMUNOENSAYO FLUORESCENTE 839 Origen y clasificacin Inmunoensayo fluorescente heterogneo Mtodo fluoroinmunomthco

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA

Caractersticas generales de la reaccin antgeno-anticuerpo

Los ligandos inmunolgicos se basan en la afinidad entre molculas, como la enzima y el sustrato, la hormona y su receptor, el antgeno y el anticuerpo, y jue-gan un papel importante en los seres vivos. Las caractersticas de reconoci-miento especfico de los inmunoensayos (reacciones antgeno-anticuerpo) han pasado a ser ampliamente utilizadas como herramientas analticas, a pesar de la amplia gama de mtodos disponibles para el anlisis clinico en un laboratorio.

Ensayo inmunofluoromtrico por particin radial Fluoroinmunoensayo en tiempo real Inmunoensayo fluorescente homogneo Ensayo de polarizacin de la fluorescencia Inmunoensayo de transferencia de la fluorescencia

de excitacin Inmunoensayo de fluorescencia protegida

INMUNOENSAYO QUIMIOLUMINISCENTE 841 Origen Inmunoensayo quimioluminiscente usando esteres

de acridinio como marcadores Inmunoensayo electroquimioluminiscente

AUTOMATIZACIN INSTRUMENTAL Y MODULACIN DE LOS SISTEMAS DE ENSAYO 842 Sistemas de ensayo homogneos Sistemas de inmunoensayo heterogneos Secuencia prctica del inmunoensayo

en el sistema analtico Instrumentacin y puntos clave para un inmunoensayo

heterogneo Nuevos sistemas para la prxima generacin

(sistemas modulares) SISTEMAS DE ENSAYO SIMPLES Y RPIDOS PARA

SU USO EN LOS PUNTOS DE ATENCIN AL PACIENTE 845 Origen Instrumentos de ensayo de flujo (instrumentos de

ensayo por inmunofiltracin) Tiras reactivas Instrumentos inmunocromatogrficos Resumen

BIBLIOGRAFA 848

Los inmunoensayos se pueden utilizar para la deteccin tanto de anti-geno como de anticuerpos. Para la deleccin de antigenos, el anticuer-po especfico correspondiente debe prepararse como uno de los reacti-vos. Lo contrario se aplica para la deteccin de anticuerpos. La sensibi-lidad de los inmunoensayos se ha mejorado mediante el desarrollo de nuevos tipos de sistemas para la deteccin de la seal y la tecnologa de fase slida. Los inmunoensayos se han optimizado para detectar menos de 0,1 pg.'ml de antgeno presente en la sangre. Se pueden apli-car a la deteccin de haptenos como molculas pequeas: protenas y complejos proteicos como las macromolculas: y tambin para cualquie-ra de los anticuerpos frente a alrgenos, agentes infecciosos y antige-nos autlogos.

822 SECCIN V INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGIA

Caractersticas de los antigenos Los antgenos se pueden definir como cualquier sustancia que puede

representar sitios antignicos (eptopos) para producir los correspondientes anticuerpos, desde molculas pequeas como los haptenos y hormonas, hasta macromolculas como protenas, glcoprotenas, glicolipidos y otros productos naturales. Algunos compuestos qumicos artificiales tambin pue-den ser antgenos actuando como haptenos. Los antgenos deben tener al menos un epitopo. Los epitopos que pueden ser reconocidos por anticuerpos incluyen secuencias de aminocidos de peptidos presentes en protenas y estructuras proteicas de grandes dimensiones como los sitios neoantigenicos.

Caractersticas de los anticuerpos La inmunoglobulma. una protena plasmtica importante, se refiere a anti-

cuerpos en el contexto de funciones biolgicas de inmunoglobulmas especfi-cas de antgeno. Los anticuerpos, por tanto, se producen en respuesta a estimulaciones antignicas. Los anticuerpos se componen de molculas fun-cionales y heterogneas que unen antgenos mediante un dominio de unin al antigeno. Hay cinco tipos (isotipos) de inmunoglobulina: IgG, IgM. IgA. IgD e IgE. La IgG a su vez se divide en cuatro subtipos, y tanto la IgA como la IgM presentan dos subgrupos. Todas las molculas de anticuerpo conocidas pre-sentan una cadena pesada con una cadena ligera K- O /.. La estructura mole-cular de los anticuerpos se compone de regiones constantes y regiones variables. El dominio hipervarable (sitio de unin al epitopo) puede ensam-blarse para interaccionar con una amplia variedad de eptopos (determinan-tes antignicos). En un laboratorio de medicina se pueden distinguir dos cate-goras de anticuerpos: anticuerpos como reactivos o anticuerpos como anali-tos. Los anticuerpos como analitos a menudo se clasifican por los subtipos IgG. IgM o IgA. Los anticuerpos como reactivos se preparan a partir de anti-sueros obtenidos a travs de la inmunizacin con un antgeno purificado.

Anticuerpos policlonales Un anticuerpo policlonal se puede obtener mediante la inmunizacin con un

antgeno, que presenta varios eptopos. En otras palabras, se generan anti-cuerpos especficos frente a cada epitopo. La avidez de un anticuerpo poli-clonal por un antgeno complejo generalmente es mayor que la de un simple anticuerpo monoclonal. Para la inmunizacin con molculas relativamente pequeas, como los haptenos o las hormonas, pueden ser necesarias prote-nas transportadoras o carner.

Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales (Kehler. 1975) se han desarrollado emple-

ando las siguientes biotecnologas: fusin somtica de clulas, seleccin del hibridoma resultante y dilucin lmite para obtener monoclonales. Se definen como anticuerpos homogneos uniformes dirigidos a epitopos especficos. Una linea celular establecida permite la secrecin de todas las inmunoglobuli-nas especificas que reaccionan frente a un solo antgeno. Los anticuerpos monoclonales han permitido el anlisis de molculas, epitopo por epitopo. gra-cias a su estrecha especificidad. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales no tienen la habilidad de reconocer la molcula completa, en comparacin con los anticuerpos policlonales. Para los anticuerpos monoclonales. distintos ant-genos con un epitopo comn parecen el mismo antgeno. El anticuerpo CA19-9 (Magnan, 1983) como marcador tumoral puede detectar las distintas formas y tamaos moleculares que poseen epilopos comunes formados por carbohi-dratos. Los anticuerpos monoclonales permiten la identificacin de isoenzimas. subtipos, isotipos de proteina y cambios conformacionales de las molculas, puesto que pueden distinguir la mnima diferencia entre molculas.

Los anticuerpos monoclonales pueden dar reacciones cruzadas con distin-tos antgenos. Estas reacciones cruzadas se pueden explicar por la probable existencia de la misma secuencia de aminocidos, hidratos de carbono o lpi-dos en distintas molculas. La tecnologa de los anticuerpos monoclonales ha permitido el desarrollo de sistemas de inmunoensayo muy tiles y prctica-mente ideales para un laboratorio de diagnstico clnico.

Los mtodos de produccin y las aplicaciones de los anticuerpos monoclo-nales se han analizado exhaustivamente (Nakamura. 1983: Zola, 1987). Las ventajas de los anticuerpos monoclonales son las siguientes: 1. Los anticuerpos monoclonales constituyen un reactivo muy bien definido.

2. La produccin de anticuerpos monoclonales puede producir una cantidad ilimitada de reactivo homogneo con una afinidad y especificidad muy constante.

3. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante la inmuniza-cin con un antgeno sin purificar.

Los anticuerpos monoclonales presentan ciertas limitaciones para su uso. que son las siguientes:

1. Reactividad insuficiente para la precipitacin o aglutinacin debido a que la formacin del entramado del inmunocomplejo es dbil o no ocurre cuan-do se emplean anticuerpos monoclonales.

2. Los antigenos con mltiples eptopos heterogneos son ms difciles de caracterizar inmunoqumicamente con un solo anticuerpo monoclonal.

Produccin de anticuerpos mediante tecnologa recombinante

Skerra y cois. (1998) han desarrollado un sistema de expresin para el frag-mento Fv de los dominios variables de un anticuerpo especifico para la tosfo-rilcolina empleando tecnologa recombinante en Escherichia col. Esta tcnica hace posible producir un anticuerpo quimrico fusionado con una enzima.

Ha aparecido una tcnica llamada phage display (una traduccin podra ser muestra de fagos) para la produccin de anticuerpos (Wmter. 1994). En este mtodo fragmentos de anticuerpo de una especificidad de unin previamente determinada se construyen de un repertorio de genes V de anticuerpo, elimi-nando asi la necesidad de inmunizacin y generacin de hibridomas. Los genes V se pueden ensamblar in vilro. El fago seleccionado del repertorio por unin al antgeno y los fragmentos de anticuerpo se expresa en bacterias infectadas Adems, la afinidad de la unin de los anticuerpos se mejora mediante mutacin. En un futuro prximo esta tcnica permitir el uso de anti-cuerpos especficos de alia avidez.

Cintica de la reaccin antigeno-anticuerpo Determinados aspectos del equilibrio o de la ley de accin de masas de la

qumica se pueden aplicar a la reaccin antgeno-anticuerpo. La cintica de una reaccin Ag-Ab reversible es la siguiente (Steward. 1986):

K Ag + Ab AgAb

K2

Donde Ag representa el antigeno libre, Ab representa los sitios de anti-cuerpo libres. AgAb representa la concentracin del complejo antigeno-anti-cuerpo, y K' y K son las constantes de asociacin y disociacin, respectiva-mente. El ritmo de formacin del complejo antigeno-anlicuerpo se representa de la siguiente forma:

K'|Ag][Ab]-K^[AgAb|

y en el equilibrio el ritmo neto es cero. Asi.

*' _ [AgAb] K?~[Ag][Ab]~ 11

(constante de asociacin en el equilibrio o constante de afinidad). Ka es el parmetro limitado a las reacciones de sitio en sitio, a pesar de

que los antgenos y los anticuerpos a menudo poseen mltiples dominios de unin en la molcula. La constante de asociacin para mltiples reacciones antgeno-antcuerpo se puede denominar avidez en lugar de afinidad. El valor de Ka se puede obtener de las siguientes ecuaciones y de datos expe-rimentales:

[Ab] = [Ab],-[AgAb]

donde [Ab] es la concentracin del anticuerpo en el equilibrio y [Ab]. repre-senta la concentracin total de anticuerpo inicial.

CAPTULO 35 INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA 823

a"( [Ab],-B)F

donde F es el anlgeno libre o analito, y B es el antgeno unido o analito. Una representacin de Scatchard se produce cuando la cantidad de ant-

geno unido (B) se representa en eje el X y la relacin de los analitos B/F se representa en el eje Y. Dos parmetros que se pueden determinar de una representacin de Scatchard son la constante de disociacin o afinidad, de la pendiente de la lnea, y la concentracin de los sitios de unin al anticuerpo por el punto de corte de la recta con el eje X (Scatchard. 1949).

VISIN GLOBAL DE LOS PRINCIPIOS GENERALES DE LOS INMUNOENSAYOS

Tipos de inmunoensayos Una breve clasificacin y una lista de las caractersticas de vanos inmuno-

ensayos aparecen en la Tabla 35-1. Los inmunoensayos de precipitacin pro-porcionan el mtodo ms sencillo por el que los antgenos y anticuerpos reac-cionan entre ellos sin necesidad de una seal de deteccin. El complejo anti-geno-anticuerpo en un gel o en fase lquida puede observarse cualitativamente como un precipitado a simple vista, y cuantitativamente mediante un detector.

El inmunoensayo de aglutinacin de partculas (Kasahara, 1992b) emplea partculas inertes como sonda, en lugar de la precipitacin directa de los com-plejos antgeno-anticuerpo. Los anticuerpos o antgenos unidos a partculas como eritrocitos, ltex o un sol metlico reaccionan con el analito de la mues-tra. Como resultado de esta reaccin inmune, las partculas grandes presen-tan un patrn de aglutinacin significativo que puede verse a simple vista. Yalow (1959) describi el desarrollo de un RA empleando istopos radiacti-vos como sonda. Este avance permiti la deteccin cuantitativa de niveles residuales de analitos y contribuy al avance de la investigacin bsica y la medicina clnica. La insulina, por ejemplo, se cuantific mediante un RA, y sustituy al inmunoensayo de la insulina. El RA se puede preparar como un procedimiento en fase slida para una separacin fcil de la sonda libre de la unida. Desde el desarrollo de los RA, la bsqueda de sondas alternativas a los istopos radiactivos se ha intensificado, con el objetivo de desarrollar inmunoensayos no isotpicos empleando enzimas, sondas fluorescentes y otros grupos de respuesta.

El inmunoensayo enzimtico (EIA), que emplea enzimas como sondas, se desarroll al principio de la dcada 70 (Engvall. 1971; Van Weeman. 1971) y rpidamente obtuvo una gran popularidad. Las enzimas pueden amplificar las seales dependiendo de la actividad cataltica de la enzima. En un intento de mejorar los sustratos y aumentar la sensibilidad, se han introducido com-

puestos cromforos, fluorforos. y ms tarde, compuestos quimioluminiscen-tes. Dependiendo del sustrato elegido, el mtodo de ensayo se puede definir como un inmunoensayo enzimtico fluorescente o quimioluminiscente (Thorpe. 1984).

Los inmunoensayos fluorescentes (FIA) emplean fluorforos como sondas. Los fluorforos requieren de una longitud de onda ptima para que su excita-cin produzca una emisin de luz detectable. La