El ADN mitocondrial en Medicina Forense

2.4. El ADN mitocondrial en Medicina Forense Curso on line de Genetica Forense. Universidad de Zaragoza

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El ADN mitocondrial en Medicina Forense

2. 4 Fabiola Peiró Codina, Amparo Prades Sanchís, Begoña Martínez Jarreta Laboratorio de Genética Forense. Universidad de Zaragoza (España)

INDICE

1. Introducción 1 2. Técnicas de análisis del ADN mitocondrial 3 3. SNPs de ADN mitocondrial 5

Bibliografía 6

1. INTRODUCCIÓN

La mitocondria es una organela intracitoplasmática delimitada por una doble membrana con plegamientos en la más interna y cuya misión primordial es producir, transformar y almacenar energía en la célula.

En el año 1954 Casperson demostró en la mitocondria la presencia de ADN de estructura y propiedades diferentes al ADN nuclear. Barrell y cols. en 1979 y Young y Anderson en 1980, también describieron un código genético diferente en las mitocondrias (1).

La cifra media de mitocondrias en una célula varía entre 250 y 1.000, pese a que es muy difícil de determinar por variar según la especie, tipo celular, necesidades metabólicas y momento funcional (1 y 2).

El genoma mitocondrial es un fragmento circular de ADN compuesto por 16,5 kilobases con tres características especialmente significativas que lo han convertido en objetivo de estudio del estudio de muchas especialidades de la Biología y de la Medicina, dichas características son:

1. Herencia estrictamente materna (2 y 3).

2. Relación con diversas enfermedades y procesos degenerativos generalizados (4 y 5).

3. Se conoce con exactitud la secuencia de todos sus nucleótidos (6), lo que es de gran utilidad para el análisis de sus polimorfismos y posterior aplicación en genética forense (7 y 8)

Los 16.569 pb que componen el ADNmt se disponen de forma circular y cerrada, en dos cadenas complementarias y antiparalelas, que se encuentran en múltiples copias dentro de la mitocondria, en total entre 1.000 y 10.000 moléculas de ADNmt por célula (9 y 10). Por su composición bioquímica, las dos cadenas son diferentes, ya que en la secuencia nucleotídica de una prevalecen las bases púricas (adenina y guanina), por lo que es más pesada que su complementaria donde, para respetar la complementariedad, han de predominar las bases pirimidínicas (timina y citosina); en consecuencia, a la primera de las cadenas se la denomina H (Heavy o pesada), y a la otra cadena L (Light o ligera) (4).


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El ADNmt se localiza en la matriz de la mitocondria, aunque ocasionalmente se encuentra unido a la membrana mitocondrial interna. En la mitocondria se produce la fosforilación oxidativa, generándose casi todo el adenosin-trifosfato (ATP), molécula básica de intercambio de energía, que la célula necesita. Contiene su propio sistema genético y exhibe una herencia citoplasmática (1).

El ADNmt no tiene nada especial que lo diferencie del ADN nuclear en su composición química, sin embargo posee un código genético propio (1). Por otro lado, su organización es tremendamente económica ya que tan sólo un 10% de su totalidad es ADN no codificante y no contiene intrones (6 y 11), por lo que posee una relativa simplicidad en su genoma.

En los mamíferos, el espermatozoide aporta poco o nada de citoplasma al zigoto, y la mayor parte, si no todas, de las mitocondrias del embrión deben derivar de las del óvulo y no del espermatozoide. Su genoma, por tanto, es haploide debido a que su herencia es estrictamente materna (2, 3, 12 y 13), y no se encuentra sometido a procesos de recombinación, al contrario que el ADN nuclear (3).

El ADNmt se autoperpetúa por la replicación de sus cadenas, proceso que se inicia con la separación de la cadena H de la L en el nucleótido número 191 de la zona denominada asa de desdoblamiento o d-loop (displacement loop), una región de 1,1 Kb situada entre los genes de la tARNPro y tARNPhe y de la que no se conoce función codificadora alguna; tomando como molde una cadena L se forma una cadena H de unas 680 bases, conocida como 7S ADN (14, 15 y 16), continuando después la síntesis del resto de la cadena pesada.

La replicación de la cadena ligera sólo se produce cuando su lugar de origen replicativo queda expuesto como una cadena simple al elongarse la cadena pesada; para ello es necesario que transcurra cierto tiempo, ya que el punto de origen de la cadena ligera no se encuentra en el asa de desdoblamiento, sino incluido en el interior de una batería de 5 genes de tARN, aproximadamente a unos 5,7 Kb del origen de la cadena pesada (17). Por otro lado, ambas hebras del ADNmt, H y L, se transcriben completamente a partir de promotores PL y PH1, situados en la región d-loop del genoma mitocondrial (18 y 19).

La mayor variabilidad interpersonal se acumula en la denominada asa de desdoblamiento o d-loop (displacement loop), que es un fragmento de 1.112 pares de bases que no se encuentra involucrado en la codificación de ningún producto proteico, por lo que las mutaciones se acumulan con una frecuencia de 5 a 10 veces mayor que en el resto del genoma mitocondrial (20 y 21). A este fragmento también se le denomina región control y es la zona más polimórfica de todo el genoma del ADNmt humano (21, 22, 23 y 24).

Esta región se subdivide a su vez en dos subregiones de aproximadamente el mismo tamaño cada una (400 pb): la región hipervariable I (HVI) y la región hipervariable II (HVII). La mayor parte de las variaciones no están distribuidas al azar, sino que se concentran en estos dos segmentos hipervariables (3 y 25).

Con el transcurso del tiempo, las mutaciones se van produciendo, acumulando y perpetuando en las diversas personas, por lo que incluso individuos que proceden de una misma línea materna (y por lo tanto deberían tener exactamente el mismo ADNmt) aparecerán diferentes con el transcurso del tiempo, en este caso, miles de años (26).

La región control es la menos conservada entre las distintas especies (27), y más del 96% de los cambios de base son transiciones (28).


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Figura 1: Representación esquemática del ADN mitocondrial.

Región Control ~ 1100pb

16024 16365 73 3401

16.569

HVHV

Cadena pesada H

Cadena ligera L

268pb 342pb HV1 HV2

El avance de las técnicas de análisis molecular ha permitido conocer y asociar diversos tipos de patologías del ser humano con las variaciones (mutaciones, delecciones o inserciones) del ADN mitocondrial (29 y 30). Una vez superados los estudios iniciales basados en técnicas potentes, pero no lo suficientemente discriminativas, ni informativas (como la detección de variaciones por medio de alteración en los puntos de corte de enzimas de restricción), y gracias a la introducción de sistemas de secuenciación automáticos o semiautomáticos, se ha facilitado el conocimiento exacto de la estructura íntima de cada fragmento de ADNmt, así como las repercusiones que muchas de sus variaciones producen en el ser humano en forma de patología y procesos degenerativos (31).

Se ha podido demostrar que en el ADNmt se acumula un número de mutaciones superior a las que lo hacen en el ADN genómico (29 y 32). Este hecho se explica por diferentes mecanismos que intervienen paralelamente (4, 21, 23, 33 y 34):

1. El material genético mitocondrial está especialmente expuesto a la acción de moléculas reactivas en general (procesos de oxidorreducción en su interior), por lo que es muy sensible al daño oxidativo, principalmente causado por la existencia de un mayor número de radicales libres.

2. El ADNmt carece del efecto protector que las histonas otorgan al ADN nuclear.

3. Los mecanismos reparadores del ADNmt son menos efectivos que los del ADN nuclear.

La ADNmt polimerasa posee una pobre actividad proof reading si la comparamos con la polimerasa del ADN nuclear.

2. TÉCNICAS DE ANÁLISIS DEL ADN MITOCONDRIAL

El abordaje técnico del ADNmt en Genética Forense suele realizarse por secuenciación directa tras la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), técnica que facilita el análisis al amplificar la región control del ADNmt que deseamos estudiar.

La introducción de la técnica de PCR supuso un avance sin precedentes en la Medicina Forense ya que se podían analizar regiones lo bastante pequeñas como para que la degradación del ADN genómico no tuviera tanta importancia. Como aplicación inmediata


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se usó en la identificación de restos humanos (35) ya que hasta entonces se estudiaban los polimorfismos de ADN con métodos convencionales (RFLP) que no daban buenos resultados con muestras degradadas.

Entre las primeras aportaciones al análisis de ADN mitocondrial en Medicina Forense destaca la de Hopgood y cols. (36).

De esta manera obtenemos la información deseada en términos de variaciones individuales en forma de mutaciones puntuales, inserciones o delecciones (37).

Antes de ser aceptados para la práctica forense el conjunto de los polimorfismos analizables por PCR deben cumplir una serie de requisitos y pasar sucesivos controles de validación (38 y 39).

Esta región de 1112 pb puede ser amplificada de varias maneras, sin embargo los métodos más utilizados en la actualidad son: Nested-PCR (PCR anidada) y Seminested-PCR (PCR semianidada) para amplificar la región hipervariable I (HVI) (25) y la PCR simple usada en la amplificación de la región hipervariable II (HVII) (26 y 40), con la utilización de primers que acotan las zonas de la región que se va a amplificar.

La Nested PCR se realiza en dos fases, y es útil en casos en los que se dispone de poca cantidad de ADN problema, este método favorece el mayor rendimiento y la obtención de mayor cantidad de producto final amplificado. Sin embargo posee la desventaja de que es más sensible a la contaminación lo que puede llevar a la obtención de resultados falsamente positivos. El uso de PCR simples disminuye el riesgo de estar amplificando ADN ajeno a la muestra problema, pero en contraposición, genera menos cantidad del producto de PCR final lo que en ocasiones nos imposibilita la obtención de resultados (41).

Una vez amplificado el ADN mitocondrial, hay diversas formas de poner de manifiesto los polimorfismos que presente la secuencia en estudio.

Cuando analizamos una secuencia, lo que pretendemos es conocer la disposición u orden en que se encuentran los nucleótidos que componen un fragmento de ADN determinado.

En los últimos años y gracias al avance de la tecnología, las posibilidades en cuanto a métodos y procedimientos de secuenciación se han incrementado de forma beneficiosa para la comunidad científica. El uso de secuenciadores automáticos (42) y de fluorocromos ha venido a facilitar el análisis de la secuencia del ADN, que ahora es posible siguiendo estrategias muy distintas:

- Secuenciación cíclica (36, 43 y 44). - Secuenciación en fase sólida (36 y 45).

Pero además de los métodos de secuenciación existen otras alternativas a la hora de poner de manifiesto las diferencias mutacionales (existencia de variaciones nucleotídicas puntuales), que no exigen el análisis de la secuencia completa, y que pueden ser un primer método de screening o despistaje en identificación forense:

-La técnica de SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) (46, 47 y 48) como método de screening. -RE-SSCP (Restriction Enzyme-SSCP) (49 y 50) -LSSP-PCR (Low Stringency Single Specific Primer) (51) -Heteroduplex (52) -Dot-blot con sondas ASO/SSO (Sequence Specific Oligonucleotide) (8) -IR (Infrared Fluorescence) (53) -Minisecuenciación (54) -RT-PCR (55)


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3. SNPS DE ADN MITOCONDRIAL

Las mutaciones pueden tener efectos deletéreos y causar enfermedades y también, en ocasiones, pueden ser neutras o incluso beneficiosas. Sea cual sea su efecto en términos de salud, lo que sí inducen es el polimorfismo, es decir, la variación alélica entre individuos de la misma especie. Un polimorfismo es considerado como tal cuando su frecuencia en la población es superior al 1%. Hay varios tipos de polimorfismos (inserciones, delecciones, variaciones en el número de secuencias repetidas en tandem), pero los más frecuentes (el 80%) son los denominados SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) (56).

Los SNPs están distribuidos a lo largo de todo el genoma con un promedio de densidad de 1 cada 1,9 Kb (57).

El estudio de los SNPs, fundamentalmente a través del empleo de chips genéticos (58), ha adquirido un notable auge por su posible contribución a la definición de las bases moleculares de las enfermedades complejas o multigénicas, que incluyen las más frecuentes, como son el cáncer, la artritis, la diabetes, las enfermedades autoinmunes o las cardiovasculares (59).

Además de su uso como marcadores genéticos en Medicina Clínica también tienen una gran utilidad en Medicina Forense, pues pueden constituir una eficiente herramienta de identificación genética en casos criminales. Así, podríamos encontrar cuatro variedades de tipado por individuo para cada SNP según la base que estuviera mutada (A, C, G, T) y si se estudian un número suficiente de SNPs para cada muestra, tendríamos un buen perfil de discriminación e identificación.

El estudio de los SNPs ha pasado por sucesivas fases y técnicas:

- Sondas específicas de alelo (ASO: Allele Specific Oligonucleotide) (60) y dot-blot alelo-específico (61). Más recientemente se han usado sondas marcadas fluorescentes (TaqMan probes) en termocicladores de PCR a tiempo real que además permiten la cuantificación de la muestra (62)

- SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism).

- Secuenciación directa de los fragmentos de interés.

- Detección de SNPs usando microarrays de oligonucleótidos (63). Se usan primers con sitios polimórficos y con el extremo 3’ covalentemente unido al soporte. Las dianas de ADN conteniendo SNPs se generan con una PCR asimétrica. El rendimiento de los productos elongados aumenta por repetición de ciclos.

En el caso del ADN mitocondrial, la región diana para la aparición de mutaciones es la región hipervariable con un porcentaje entre 5-10 veces mayor que el ADN nuclear. Usualmente varían entre el 1-2% de las secuencias de ADN mitocondrial de individuos no relacionados en esa región hipervariable (64).

En un contexto filogenético, el análisis de SNPs, se usa para estandarizar haplogrupos del mismo modo que se hace con las variaciones que se encuentran en la región control del ADN mitocondrial (65 y 66).


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Figura 2: Contribución de los SNPs a la generación de haplotipos. Un cambio (T-C, A-G) en el primer par de bases crea un SNP y un segundo haplotipo. Un segundo cambio (A-G, T-C) crea otro SNP y un tercer haplotipo (59).

Los datos que se almacenan en el SWGDAM (Scientific Working Group on DNA Analysis Methods) sirven para inferir la rareza de los perfiles del ADN mitocondrial (haplotipos). Habría polimorfismos población-específicos que darían los perfiles de los distintos haplogrupos (67). Muchos de los polimorfismos que determinan los haplogrupos son continente-específicos (68). Se nombran con letras mayúsculas. Así, el 76% de los africanos pertenecerían al haplogrupo L (69), el 77% de los asiáticos al D (70), los nativos americanos tendrían cuatro haplogrupos (A-D) (67), mientras que los europeos se encuadrarían en alguno de los siguientes diez haplogrupos: H, I, J, K, M, T, U, V, W ó X (71). Seis de estos haplogrupos (H, I, J, K, T y W) quedan confinados a la población estrictamente europea y probablemente se originaron de los ancestros caucasoides genéticamente separados de los ancestros de las modernas Asia y Africa (72).

Dado que el estudio del ADN mitocondrial es preferencial en muestras degradadas o escasas, el avance en la investigación sobre SNPs también va a redundar en su beneficio creando bases de datos que permitan mayores y mejores identificaciones. Esto es especialmente útil en el caso de la Genética Forense donde no siempre las muestras se encuentran en las mejores condiciones ni están en la suficiente cantidad como para poder caracterizarlas con marcadores nucleares y redundaría en una mejor aportación a las principales aplicaciones medico-legales de los polimorfismos del ADN mitocondrial:

- investigación biológica de la maternidad tanto en casos rutinarios como en casos especiales como que se cuente solamente con un único progenitor vivo (73).

- criminalística: el rendimiento del estudio de ADN mitocondrial frente al nuclear en el caso de muestras difíciles es manifiestamente superior debido a su mayor cantidad y a la más elevada posibilidad de que alguna copia esté conservada.

- identificación de restos humanos (74).

- identificación de razas (75).

Los SNPs son detectados comparando la secuencia de la Región Control que interesa con la Secuencia de Referencia de Anderson (6).

Además del interés que tiene el estudio de la Región control del ADN mitocondrial para la identificación humana y la estimación de divergencias, el resto del genoma mitocondrial, es decir, la región codificante, también puede presentar SNPs que van a dar lugar a la aparición de distintas patologías (76).

Del avance en su estudio y caracterización va a depender el éxito de la terapia génica.


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El ADN mitocondrial en Medicina Forense